JP2018532418A - 組織製造のための改善された方法 - Google Patents
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Abstract
Description
組織工学および再生医学は、治療および研究の両方の観点から大きな将来性を有する分野である。人工組織は、組織工学研究の数多くの様々な手段の中心にある。これらの組織の製作および形成を改善することができる方法はまた、インビトロおよびインビボの両方におけるそれらの機能を改善することができ、当技術分野の進歩を促進するために必要である。
一局面において、本明細書に開示されるのは、三次元人工生体組織を製造する方法であり、方法は:生きている細胞を含むバイオインクを調製する工程;バイオプリントによって表面上へバイオインクを付着させる工程;18℃以上、しかし37℃未満の温度でバイオインクをインキュベートする工程を含み、ここで、18℃以上、しかし37℃未満の温度でのインキュベーション中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない。
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明確に特に指示しない限り、複数の言及を含む。本明細書における「または」へのあらゆる言及は、特に明記のない限り、「および/または」を包含するように意図される。
現在の組織モデルおよび天然の組織と比較して、本明細書に開示されるバイオプリントプラットフォームを用いて皮膚を製作することの1つの利点は、プロセスが自動化されることである。これはより大きな再現性およびスケーラビリティを可能にする。例えば、ハイスループットスクリーニング適用を含むスクリーニング適用において使用するための6、12、24、48、96、384または1536-ウェルプレートなどのウェルプレートフォーマット中へバイオインクをプリントするために、組織ジオメトリーを小型化することが可能である。自動化されたプラットフォームの別の主な利点は、それが、組織をバイオプリントすることに加えて、毒性試験について物質を投与するために利用され得ることである。組織モデルにおける現在の試験は、組織を製作するためおよびその組織へ試験材料を適用するための両方に必要な手動アプローチによって制限され、局所投与への適用が制限される。プリントプラットフォームの柔軟性は、手動アプローチでは可能でない、適用、付着、および組織中への組み入れのための様々な方法を可能にする。例えば、試験物質は、エアロゾルスプレー技術を使用して微細なミストでスプレーされ得るか、または連続的付着モジュールを使用して真皮層中へ注入され得る。組織毒物学モデルにおけるバイオプリントの第3の主な利点は、層状構造体が作製および試験され得る時間枠である。バイオプリントアプローチは、同時にまたは遅れて細胞のシートを重ね合わせて複数の層を作ることができ、これらを次いで所定の期間の間成熟および分化させることができる。バイオプリントプラットフォームは、手動アプローチでは可能でない縦断的研究を可能にし、何故ならば、試験または治療物質が、プリントする間、組織へ曝露され得るかもしくは組織中へ組み入れられ得るか、または後の時点で成熟組織へ投与され得るためである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される三次元人工組織は、それらが、神経支配されない(例えば、神経組織を実質的に含まない)、成熟した血管を実質的に含まない、かつ/または血液成分を実質的に含まないという事実によって、ネイティブな(例えば、人工でない)組織と区別される。例えば、様々な態様において、三次元人工組織は、血漿、赤血球、血小板などおよび/または内生的に生じた血漿、赤血球、血小板などを含まない。ある態様において、組織はヘモグロビンを欠いている。いくつかの態様において、組織は、神経支配またはニューロンを欠いている。いくつかの態様において、組織は、以下のいずれかのような神経細胞マーカーを欠いている:βIIIチューブリン(Beat III tubulin)、MAP2、NeuNおよびニューロン特異性エノラーゼ。いくつかの態様において、人工組織は種キメラであり、ここで、組織の少なくとも1つの細胞または細胞タイプは、組織の別の細胞または細胞タイプとは異なる哺乳動物種に由来する。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は、インビボまたはエクスビボでの組織よりも増加した基礎代謝率によって特徴付けられる。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は、インビボまたはエクスビボ培養下の組織よりも増加した増殖速度によって特徴付けられる。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は、インビボまたはエクスビボ培養下の組織中の細胞と比較した場合に増加した細胞サイズによって特徴付けられる。
本明細書に記載される組織および方法は、生きている細胞の組成物を含有する3D組織構造体を作るためのバイオインク製剤およびバイオプリント法を伴う。プリント法は、層をもたらしネイティブな組織を模倣するジオメトリーを作るためにバイオインクを利用する。様々な態様において、プリント法は、コラーゲンなどのマトリックス支持材料で任意でコーティングされる、様々な細孔サイズを有する様々なプリント表面を利用する。いくつかの態様において、プリント表面は静的またはフレキシブルであり得る。フレキシブルなプリント表面は、プリントされた組織が、製作後に屈曲および他の非静的条件へ供されることを可能にする。いくつかの態様において、ヒドロゲルが任意で添加され、生体材料を支持するか、または細胞が存在しない省スペースの領域を構成する。
本明細書に開示されるのは、ある態様において、三次元の生きている組織、ならびに、細胞生存性および機能を損なうことなく製作後に細胞コンパートメントを維持するバイオプリントされた組織の製造方法である。いくつかの態様において、バイオプリンターからのバイオインクの付着または押し出しによって、細胞をバイオプリントする。いくつかの態様において、「バイオインク」は、複数の細胞を含む、液体、半固体、または固体組成物を含む。いくつかの態様において、バイオインクは、液体もしくは半固体細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮物を含む。さらなる態様において、細胞溶液、懸濁液、または濃縮物は、液体または半固体(例えば、粘着性)担体および複数の細胞を含む。なおさらなる態様において、担体は、本明細書に記載されるもののような、好適な細胞栄養培地である。いくつかの態様において、バイオインクは、バイオプリント前に多細胞集合体へ任意で密着する複数の細胞を含む。さらなる態様において、バイオインクは、複数の細胞を含み、特定の平面および/または積層ジオメトリーをもたらすようにバイオプリントされ;ここで、バイオインク内の個々の細胞の密着は、バイオプリント前、中および/または後に起こる。いくつかの態様において、バイオインクは、(1)複数の細胞を固定体積で採取することによって生成され;ここで、細胞性成分は、総体積の少なくとも約30、40、50、60、70、80、90%または100%を占める。いくつかの態様において、バイオインクは、半固体または固体多細胞集合体または多細胞体を含む。さらなる態様において、バイオインクは、(1)複数の細胞または細胞集合体および生体適合性液体またはゲルを所定の比率で混合し、バイオインクを生じさせること、ならびに(2)バイオインクを圧縮し、所望の細胞密度および粘度を有するバイオインクを生成することによって、生成される。いくつかの態様において、バイオインクの圧縮は、遠心分離、タンジェント流ろ過(「TFF」)、またはそれらの組み合わせによって達成される。いくつかの態様において、バイオインクの圧縮は、押し出し可能である組成物をもたらし、多細胞集合体または多細胞体の形成を可能にする。いくつかの態様において、「押し出し可能な」は、ノズルまたはオリフィス(例えば、1つまたは複数のホールまたはチューブ)を通して(例えば、圧力下で)押し進めることによって形作られることが可能であることを意味する。いくつかの態様において、バイオインクの圧縮は、細胞を好適な密度へ増殖させることに起因する。バイオインクに必要な細胞密度は、使用される細胞および生成される組織または器官によって異なる。いくつかの態様において、バイオインクの細胞を密着および/または接着させる。いくつかの態様において、「密着させる」、「密着した」、および「密着」は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、および/またはそれらの層を結合させる、細胞間接着特性を指す。さらなる態様において、これらの用語は、「融合する」、「融合した」、および「融合」と交換可能に使用される。いくつかの態様において、バイオインクは、支持材料、細胞培養培地(またはそのサプリメント)、細胞外マトリックス(またはその成分)、細胞接着剤、細胞死阻害剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、押し出し化合物、およびそれらの組み合わせをさらに含む。
いくつかの態様において、任意の脊椎動物細胞が、バイオインクおよび三次元人工組織中に含めるために適している。さらなる態様において、細胞は、非限定的な例として、収縮性細胞または筋細胞(例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および筋芽細胞)、結合組織細胞(例えば、骨細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、および造骨細胞へ分化する細胞、コンドロサイト、またはリンパ組織)、骨髄細胞、内皮細胞、皮膚細胞、上皮細胞、乳房細胞、血管細胞、血液細胞、リンパ細胞、神経細胞、シュワン細胞、腸細胞、胃腸細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、気管細胞、角膜細胞、尿生殖器細胞、腎細胞、生殖細胞、脂肪細胞、実質細胞、周皮細胞、中皮細胞、間質細胞、未分化細胞(例えば、胚細胞、幹細胞、および前駆細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、癌幹細胞)、内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞、疾患関連抗原を発現するかまたは疾患(例えば、癌)に関連する細胞、およびそれらの組み合わせである。ある態様において、バイオインクまたは組織は、線維芽細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、皮膚起源の線維芽細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、腎臓起源の線維芽細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、血管起源の線維芽細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、内皮細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、線維芽細胞および内皮細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、ケラチノサイトを含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、メラノサイトを含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、肝細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、星細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、表皮細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、真皮細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、上皮細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、尿細管上皮細胞を含む。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、単一の細胞タイプから本質的になる。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、2つの細胞タイプから本質的になる。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、3つの細胞タイプから本質的になる。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、4つの細胞タイプから本質的になる。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、ヒト細胞から本質的になる。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、ヒト初代細胞から本質的になる。
いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、いかなる予め形成されたスキャフォールドをも含まないかまたは実質的に含まない人工組織である。さらなる態様において、「スキャフォールド」は、合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲル、非合成スキャフォールド、例えば、予め形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および無細胞化組織、ならびに人工組織および/または器官の物理的構造体にとって不可欠でありかつ組織および/または器官から除去されない任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドを指す。なおさらなる態様において、無細胞化組織スキャフォールドは、無細胞化ネイティブ組織、または任意の方法で培養細胞によって生成された無細胞化細胞材料;例えば、生きている間に産生したECMを残して、死滅させられるかまたは無細胞化される細胞層を含む。
ある態様において、組織を、バイオプリント後、一定期間、24℃を下回る温度での「低温ホールド」においてインキュベートするかまたは置く。ある態様において、この温度は0℃を超える。ある態様において、この温度は24℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ24℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ20℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ18℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ16℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ14℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ12℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ10℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ8℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ8℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ10℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ12℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ8℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ14℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ16℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ6℃未満である。ある態様において、この温度は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24℃である。
ある態様において、組織を、バイオプリント後、単一の低い温度でまたは低い温度の組み合わせで、「成熟させる」またはインキュベートする。低い温度は、37℃を下回る任意の温度である。ある態様において、この段階は前述の低温ホールドとは無関係である。ある態様において、この段階は前述の低温ホールド後に生じる。ある態様において、この段階は前述の低温ホールド無しで生じる。ある態様において、この温度は、18℃超しかし37℃未満であり得る。ある態様において、この温度は、約24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36℃である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約19℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約20℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約21℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約22℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約23℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約24℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし36℃未満である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし35℃未満である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし34℃未満である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし33℃未満である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし32℃未満である。ある態様において、この温度は、約28℃超、しかし32℃未満である。
ある態様において、本開示の方法によって製造される組織はヒドロゲルを利用し、例としては、コラーゲン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、多糖類、フィブリノーゲン/トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン/ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(GAG)およびプロテオグリカン(これは、例えば、コンドロイチン硫酸(chrondroitin sulfate)、フィブロネクチン、ケラチン硫酸、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、デコリン、アグレカン、パールカンを含有し得る)およびそれらの組み合わせから誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。他の態様において、好適なヒドロゲルは合成ポリマーである。さらなる態様において、好適なヒドロゲルとしては、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびその共重合体、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ならびにそれらの組み合わせから誘導されるものが挙げられる。様々な具体的な態様において、ヒドロゲル、NovoGel(商標)、アガロース、アルギナート、ゼラチン、Matrigel(商標)、ヒアルロナン、ポロキサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ(イソプロピルn-ポリアクリルアミド)、ポリエチレングリコールジアクリラート(PEG-DA)、ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ(乳酸)、シリコン(silicon)、シルク、またはそれらの組み合わせである。
ある態様において、本開示の方法によって製造される組織は、コンパートメント化された組織を形成するためにいかなる架橋も必要としない。ある態様において、組織は、化学的架橋、非限定的な例として、グルテルアルデヒド(gluteraldehyde)またはビスエポキシドを必要としない。ある態様において、組織は、イオン性架橋剤による架橋を必要としない。ある態様において、組織は、いかなるカチオン性またはアニオン性架橋剤による架橋も必要としない。ある態様において、組織は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、アルギナート、またはそれらの任意の組み合わせによる架橋を必要としない。ある態様において、組織は、酵素的架橋剤よる架橋を必要としない。ある態様において、細胞は、物理的架橋を必要としない。ある態様において、組織は、光架橋を必要としない。ある態様において、組織は、紫外線もしくは可視光を含む、光架橋または放射線架橋を必要としない。
ある態様において、バイオプリントされた組織、バイオインク、および細胞を、生理的レベルを超えないカルシウムなどの二価カチオン性架橋化合物へ曝露する。この目的のための生理的レベルは、イオン性カルシウムについては1〜1.5 mMであり、総カルシウムについては2〜3 mMである。ある態様において、組織またはバイオインクを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mMを超える総カルシウムへ曝露する。ある態様において、組織またはバイオインクを、5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50 mMを超える総カルシウムへ曝露する。カルシウムは、塩化カルシウムまたはリン酸カルシウムを含むが、これらに限定されない、カルシウムの全てのイオン種を含む。ある態様において、組織またはバイオインクを、ストロンチウム、マグネシウム、バリウムのような他の二価カチオン性架橋化合物、または銅、アルミニウム、もしくは鉄を含み得る他の多価イオンへ曝露しない。ある態様において、組織またはバイオインクを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10 mMを超えるイオン性架橋剤へ曝露する。ある態様において、組織またはバイオインクを、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100 mMを超えるイオン性架橋剤へ曝露する。
ある態様において、本開示の方法によって製造されるバイオプリントされた組織は、本開示の方法によってバイオプリントされないバイオプリントされた組織と比較した場合、バイオプリントされた組織中のアポトーシスを低減させる。ある態様において、アポトーシスは、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、またはそれ以上低減される。ある態様において、アポトーシスは10%以上低減される。ある態様において、アポトーシスは25%以上低減される。ある態様において、アポトーシスは30%以上低減される。ある態様において、アポトーシスは50%以上低減される。ある態様において、アポトーシスは70%以上低減される。ある態様において、アポトーシスは90%以上低減される。ある態様において、アポトーシスの低減は、アポトーシスの分子マーカーの変化によって測定され;非限定的な例としては、DNA断片化、TUNEL染色、活性化カスパーゼの変化、カスパーゼ切断産物の変化、総カスパーゼの変化、アポトーシスの減少または増加と一致するmRNAレベルの変化、アポトーシスの細胞表面マーカーの変化(非限定的な例として、アネキシンV)が挙げられる。分子マーカーの変化は、免疫組織化学(IHC)、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、リアルタイムPCRを含むPCR、または市販されているものを含む任意のホモジニアスカスパーゼアッセイによって測定することができる。
手順
1ミリリットル当たり1億5000万個の細胞の濃度で、6%ゼラチン (Novogel(登録商標)2.0)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。
第12日での皮膚組織のH&E染色は別個の層状構造を示す(図2および3)。真皮層中の線維芽細胞は底部(紫色)で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部(桃色)に観察される。このアプローチでの予想外の知見は、観察された層状構造の程度である。特に、界面で観察され得る別個の形態を有する細胞の層が存在する(矢印)。この層はCK14に対して特異的に染色され、これは、付着されたペースト中のケラチノサイト細胞が基底層へ配置されたことを示している。
手順
1ミリリットル当たり1億個の細胞の濃度で、8%ゼラチン(Novogel(登録商標))中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。細胞:ゼラチン比率を変更し、真皮シートの細胞密度を減らし、ネイティブな皮膚中の真皮組織をよりよく模倣した。
トランスウェル表面上に直接プリントされる場合に対して、真皮シートの上部にプリントされたペーストの表皮層パターニングを比較するためのその後の組織学的解析は、予想外の知見をもたらした(図7AおよびB)。第12日での皮膚組織のH&E染色は、表皮ペーストが真皮層の上部にプリントされた構造体においてのみ、別個の層状構造を示す(図7CおよびD対FおよびG、図8A)。真皮層中の線維芽細胞は底部(紫色)で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部(桃色)に観察される。特に、界面で観察され得る別個の形態を有する細胞の層が存在する。分化ケラチノサイトの別個の層は、基底細胞マーカーCK5(緑色)およびインボルクリン(IVL、赤色)[顆粒および角化ケラチノサイトの後期分化マーカー]に対して同時に染色されることによって可視化される(図7E対H、図8B)。別個の緑色層は、付着されたペースト中のケラチノサイト細胞が基底層へ配置され、より分化したIVL陽性細胞の層は上部に配置されたことを示している。通常のヒト皮膚と同様に、形態の差異が見られ、何故ならば、基底細胞は別個の立方体様形態を有するようであり、一方、上部における分化ケラチノサイトはより平らに見えるためである。
腎臓近位尿細管モデルの間質層は、Novogel(登録商標)中の腎臓線維芽細胞およびHUVECから構成される。間質層の厚みおよび細胞性を低減させるために、細胞比を50%線維芽細胞/50% HUVECへ変更し、細胞の濃度は1億2500万個の細胞/mLとした。これらの細胞比を使用して組織を製作する試みは、組織の「玉になる(ball up)」傾向によって阻止され、理想的である薄く広がった間質層の種類を妨げた。バイオプリント後の構築物形状の維持を助けるために、プリント後3日間、組織を30℃でインキュベートし、Novogel(登録商標)消失速度を遅くした。
本明細書に開示される方法を使用して製作される組織は、量的および質的改善を示す。図16を参照して、5日間の30℃インキュベーション段階を伴う4℃ホールドを使用して製作された皮膚組織は、これらの技術を用いずに製作された組織(図16A)と比較した場合、TUNEL染色によって示されるように、低減したアポトーシスを示す(図16B)。同様に、組織を遺伝子発現分化マーカーについてアッセイすると、IVL、CK10、CK5およびColla1は、5日間の30℃インキュベーション段階を伴う4℃ホールドを使用して製作された組織(図17E、F、G、およびH)において、これらの技術を用いずに製作された組織(図17A、B、C、およびD)と比較した場合、上昇する。まとめると、図16および図17は、低温ホールドおよび37℃を下回るインキュベーションを使用して製作された組織は、増加した生存性および分化を有する組織をもたらすことを示している。
初代ヒト肝細胞、内皮細胞、および星細胞を含む肝臓組織を、バイオプリントし、直ちに様々な温度(18.2℃、30.2℃、32.0℃、および36.9℃)下でインキュベータ中に置き、画像化した。
Claims (30)
- a.生きている細胞を含むバイオインクを調製する工程;
b.押し出しバイオプリントによって表面上へ該バイオインクを付着させる工程;
c.18℃以上、しかし37℃未満の温度で該バイオインクをインキュベートする工程
を含む、三次元人工生体組織を製造する方法であって、
18℃以上、しかし37℃未満の温度での該インキュベーション中に、該バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない、方法。 - バイオプリントされた組織中のアポトーシスが、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される、請求項1記載の方法。
- バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の低温(hypothermic)ホールドへバイオインクを曝露する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない、請求項3記載の方法。
- バイオプリントされた組織中のアポトーシスが、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される、請求項3記載の方法。
- バイオインクが試験物質をさらに含み、該試験物質が、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項1記載の方法。
- バイオインクをエアロゾルスプレー技術によって付着させない、請求項1記載の方法。
- バイオインクが単一のヒト細胞タイプから本質的になる、請求項1記載の方法。
- a.生きている細胞を含む複数のバイオインクを調製する工程;
b.押し出しバイオプリントによって表面上へ第1のバイオインクを付着させる工程;
c.18℃以上、しかし37℃未満の温度で第1のバイオインクをインキュベートする工程;
d.押し出しバイオプリントによって表面上へ第2のバイオインクを付着させる工程;および
e.18℃以上、しかし37℃未満の温度で複数のバイオインクをインキュベートする工程
を含む、三次元人工生体組織を製造する方法であって、
18℃以上、しかし37℃未満の温度での第1のバイオインク、第2のバイオインク、または両方のバイオインクの曝露中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない、方法。 - バイオプリントされた組織中のアポトーシスが、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される、請求項9記載の方法。
- バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の温度へ第1のバイオインク、第2のバイオインク、または両方のバイオインクを曝露する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
- バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない、請求項11記載の方法。
- バイオプリントされた組織中のアポトーシスが、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される、請求項11記載の方法。
- 第1もしくは第2のバイオインクのうちの少なくとも1つまたは両方のバイオインクが試験物質を含み、該試験物質が、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項9記載の方法。
- 第1または第2のバイオインクをエアロゾルスプレー技術によって付着させない、請求項9記載の方法。
- a.生きている細胞を含むバイオインクを調製すること;
b.押し出しバイオプリントによって表面上へ該バイオインクを付着させること;
c.18℃以上、しかし37℃未満の温度で該バイオインクをインキュベートすること;
d.18℃以上、しかし37℃未満の温度での該インキュベーション中に、組織をいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しないこと
によって操作された、三次元人工生体組織であって、
37℃以上でインキュベートされた組織よりも低いアポトーシスレベルを示す、組織。 - バイオインクが、バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の温度へ曝露された、請求項16記載の組織。
- バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクがいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露されなかった、請求項17記載の組織。
- バイオインクが試験物質をさらに含み、該試験物質が、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項16記載の組織。
- バイオインクがエアロゾルスプレー技術によって付着されなかった、請求項16記載の組織。
- バイオインクが単一のヒト細胞タイプから本質的になる、請求項16記載の組織。
- 灌流可能な血管を有さない、請求項16記載の組織。
- 単一のヒト細胞タイプから本質的になる、請求項16記載の組織。
- a.生きている細胞を含む複数のバイオインクを調製すること;
b.押し出しバイオプリントによって表面上へ第1のバイオインクを付着させること;
c.18℃以上、しかし37℃未満の温度で第1のバイオインクをインキュベートすること;
d.押し出しバイオプリントによって表面上へ第2のバイオインクを付着させること;および
e.18℃以上、しかし37℃未満の温度で複数のバイオインクをインキュベートすること;
f.18℃以上、しかし37℃未満の温度での第1のバイオインク、第2のバイオインク、または両方のバイオインクの曝露中に、いかなるバイオインクをもいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しないこと
によって操作された、三次元人工生体組織であって、
37℃以上でインキュベートされた組織よりも低いアポトーシスレベルを示す、組織。 - バイオインクが、バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の温度へ曝露された、請求項24記載の組織。
- バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクがいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露されなかった、請求項25記載の組織。
- 複数のバイオインクのうちの少なくとも1つが試験物質をさらに含み、該試験物質が、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項24記載の組織。
- 第1または第2のバイオインクがエアロゾルスプレー技術によって付着されなかった、請求項24記載の組織。
- 灌流可能な血管を有さない、請求項24記載の組織。
- 第1または第2のバイオインクのいずれかが単一のヒト細胞タイプから本質的になる、請求項24記載の組織。
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