JP2018529374A - 有蹄動物胚の凍結保存 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、2015年7月14日に出願された、米国仮特許出願第62/192,544号の優先権を主張し、その開示はその全体において本明細書に参照により組み入れられる。
本発明がより容易に理解されるために、特定の用語を下に定義する。当業者であれば、特定の用語の定義が、本明細書の別の場所で提供され得る、および/または文脈から明らかとなることを理解するだろう。
本発明は、部分的に、その受胎率が典型的には新鮮胚で達成されるものよりかなり低い、ほとんどの標準的な技術に対して、受胎率を向上させながら有蹄動物胚を凍結保存することが可能であるという発見に基づく。
インビトロ産生胚(IVP)の使用は、過去10年にわたり大幅に増加している(Hasler、2014)。この増加の多くは主にブラジルで発生した。2013年には、393,000を超えるIVP胚がレシピエントに移植され、この総数のうち、78%が南米で産生された。同年、この総移植数から、わずか8.9%のIVP胚が凍結され、インビボ胚についてのこの割合は59%であった(Perry,2013)。
畜産とは、営利目的での人間による家畜の管理および世話であり、この中では、人間にとって有益であると考えられる遺伝的な品質および挙動をさらに発達させる。この用語は、実利、スポーツ、娯楽、または研究のための動物における望ましい特性を促進するように家畜を選択的に繁殖および飼育する業務を指すことができる。
人間が動物の交配を、任意で動物の交尾(例えば、自然交配)または動物の接触すらなしに、制御および/または達成することを可能にする、様々な技術が開発され、改良されている。代表的なこうした技術としては、例えば、インビトロ受精、人工授精、配偶子または胚の凍結保存(凍結)、多排卵の誘発、胚移植、精子または胚の性決定、核移植、クローニング、等が挙げられる。
本明細書において記載されているように、本発明は、ウシ胚を凍結保存および/または凍結保存ウシ胚で受精を達成するための技術を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に従って使用される凍結保護剤は、細胞内凍結保護剤である、またはこれを含む。いくつかの実施形態では、本発明に従って使用される凍結保護剤は、細胞外凍結保護剤である、またはこれを含む。いくつかの実施形態では、例となる凍結保護剤(例えば、細胞内凍結保護剤として使用される)は、ジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセロール、ポリエチレングリコール(PEG)、およびこれらの組み合わせであり、またはこれを含み得る。いくつかの実施形態では、例となる凍結保護剤(例えば、細胞外凍結保護剤として使用される)は、スクロース、トレハロース、デキストロース、およびこれらの組み合わせであり、またはこれを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って使用される凍結保護剤は、プロピレングリコールであり、またはこれを含み得る。
いくつかの実施形態では、胚は、様々な発生段階で凍結保存され得る。いくつかの実施形態では、胚は、桑実胚、初期胚盤胞、胚盤胞、および拡張胚盤胞からなる群から選択される発生段階で凍結保存され得る。胚盤胞の形成後、胚は、子宮壁に着床することができる。いくつかの実施形態では、初期胚盤胞段階は、空洞が形成され始めたばかりであり、胚盤胞細胞がまだ判別できないと特徴付けられる。いくつかの実施形態では、拡張胚盤胞段階は、完全に形成された空洞により特徴付けられる。
本発明は、胚を凍結保存するためのデバイスを提供する。いくつかの実施形態では、デバイスは、デバイス内の第1の領域内に位置付けられた凍結保存溶液中の凍結保存胚を含み、その第1の領域の横に、各々空気からなる、第2および第3の領域が配置されており、その第2および第3の領域の横に、各々解凍溶液からなる、第4および第5の領域が配置されており、その第4および第5の領域の横に、各々空気からなる、第6および第7の領域が配置されており、その第6および第7の領域の横に、各々解凍溶液からなる、第8および第9の領域が配置されている。いくつかの実施形態では、デバイスの1つ以上の領域はチャンバである。
この研究の目的は、新鮮、ガラス化、または直接移植のために凍結されたIVPウシ胚ET後に得られる妊娠率を比較することであった。ジロランド雌OPUにより回収された卵母細胞(n=3171)を選択し、24時間、38.5℃、空気中5%CO2、および飽和湿度でIVMを行った。解凍された性分別精液でIVFを行い、5頭のホルスタイン牛で実施した。IVF後、予定接合子を、7日間、IVMおよびIVFの温度および湿度の同じ条件下だが、5%CO2および5%O2で、剥離および培養した。BLまたはBXの段階にあるグレードIの胚を、新鮮、ガラス化、または直接移植(DT)のために凍結移植した。胚は予め同期化されたレシピエントに移植した。得られた受胎率は、新鮮胚において51.35%(133/259)、ガラス化胚において34.62%(84/234)、直接移植胚において42.11%(96/228)であった。p<0.05の確率レベルを有意とみなした。ガラス化および直接移植IVP胚から得られた割合は、IVP胚の凍結保存が、新鮮IVP胚の移植後に得られたものと同様の結果をもたらすことを示す。直接移植の利便性を有するIVP胚の凍結保存の可能性の有用な態様が強調される。
特に記載がある場合を除き、すべての試薬をSigma(ミズーリ州セントルイス、米国)から購入した。実施例1〜3において記載されている卵胞吸引手順、インビトロ成熟、およびインビトロ受精を、実施例4および5に使用した。
ギル−ホルスタイン1/2交雑種からの36の雌ドナーにおいて超音波誘導による112の卵子吸引(OPU)の完了によって研究を行った。吸引セッション後、卵母細胞(n=3171)を、10%ウシ胎児血清(FBS)(GIBCO BRL、ニューヨーク州グランドアイランド)、0.20mMのピルビン酸ナトリウム、および83.4mg/mLのアミカシン(BIOCHIMICO Institute、リオデジャネイロ、ブラジル)が補充されたヘペスで緩衝されたTCM−199培地(GIBCO BRL、ニューヨーク州グランドアイランド)で洗浄した。卵母細胞を予め選択し、農場の移動式実験室装置において分類した。卵母細胞の選択後、それらを実験室の、350μLの鉱物油で覆われた、10%FBS、1mg/mLのFSH(Folltropin(商標)、Bioniche Animal Health、オンタリオ州ベルビル、カナダ)、50mg/mLのhCG(Profasi(商標)、Serono、ブラジル、サンパウロ)およびエラストラジオール(1mg/mL)、ピルビン酸ナトリウム0.20mm、ならびに83.4mg/mLのアミカシンが補充された400μLのTCM−199培地を含有するBD Falconチューブ5mLポリスチレン上に移した。回収された卵母細胞を、モギミリム/サンパウロに位置する実験室に移し、成熟培地を含む同じ輸送チューブに、OPU時から数えて24時間にわたって保持した。
ホルスタイン牛(n=5)雌分別精液でIVFを行った。精液を解凍(35℃で30秒)し、0.2mMのピルピン酸塩および83.4g/mLのアミカシンが補充され、10mMのヘペスで緩衝された、1mLのTALPにおいて、遠心分離(6000rpmで5分)により2回洗浄した。精液の濃度を2×106個の運動精子(sptz)/mLに調節した。授精用量は10マイクロリットル(105sptz)であり、鉱物油下、50μLのTALP−FIV(10g/mLのヘパリン、18Mのペニシラミン、10Mおよび8Mのヒポタウリン、エピネフリンが補充されたTALP)の各滴に添加した。その後、各滴に25〜30個の卵母細胞を添加した。20〜24時間、38.5℃、5%CO2、および空気中最高湿度のインキュベータでインキュベーションを行った。
インビトロ培養(IVC)胚
ジロランド牛ドナー(n=25)から、超音波誘導による卵胞吸引により、卵母細胞(n=665)を回収した。卵母細胞を群に偶然的に振り分けて、これらに同じホルスタイン牛からの性分別精液でのインビトロ受精を行った。
胚のインビトロ培養(IVC)
実施例2および3に記載されている手順に従って、予定接合子をインキュベータ(38.5℃、5%CO2、および空気中最高湿度)において、顆粒膜細胞と共培養した(各滴25個の卵母細胞の偶然的な群)。新鮮またはガラス化移植のための胚を、鉱物油下、2.5%FBS+0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)が補充されたSOF(Wells et al.、1999)の100μL液滴において培養した。IVCの3日目(D3)および5日目(D5)に、液滴の体積の50%の新しい培地での置換(「フィーディング」)を行った。「フィーディング」する培地は、初期胚発生において使用したものと同じであった。培養の3日目(D3)に卵割率を評価した。
この研究では、SANCHES et al.、2013により以前記載されているプロトコルに従ったガラス化法のために、胚を凍結保存した。
ガラス化胚の解凍のために、胚を含有するCryotopを空気に4秒間にわたって曝露した後、35℃の近似温度を有する加温溶液(TCM−ヘペス+スクロース0.3モル)中に浸漬させた。ガラス化溶液の除去は、維持培地TCM−ヘペスに移す前に、それぞれ0.3および0.15Mスクロースの勾配において2回の曝露(各5分)で行った(Vieira et al.、2002、Mezzalira et al.、2004)。
全体として、インビボで得られた胚について以前記載されている緩慢凍結法(Voelkel and Hu、1992)により、胚(n=228)を凍結保存した。胚盤胞および拡張胚盤胞を、1.5Mのエチレングリコールからなる凍結溶液(SC−solucao de congelacao)に10分間にわたって曝露した。この期間中、SCおよび胚を含有する皿を35℃に加熱したプレート上に残した。胚を0.25mlストロー中に装填し、胚を、空気カラムを挿入して互いを離した4つの解凍溶液(SD−solucao de descongelacao)カラムに囲まれた、エチレングリコールの1.5M溶液からなる、中央カラム上に配置した(図1)。解凍溶液(SD)は0.75MのEGからなり、EG1.5MはDPBS(Nutricell、カンピーナス、ブラジル)に1:1の比で希釈した。装填後、胚を、−6℃で予め安定させた凍結装置(TK1000(登録商標)、ウベラバ、ブラジル)に入れた。装置に入れた2分後、胚カラムのすぐ上および下にあるカラムの結晶化(「シーディング」)を行った。胚を10分間−6℃で維持した。
直接移植のための凍結保存胚の移植時、胚を液体窒素容器から取り出し、室温の空気に10秒間にわたって曝露した後、35℃の温水中に30秒間にわたって浸漬させた。ストローをペーパータオルで乾燥させ、内部の5つのカラムが混合されるまで穏やかに撹拌した。その目的は、4つの解凍溶液カラムを、ストロー内で既に開始された再水和まで、凍結溶液カラムと混合することであった。カラムの混合後、胚をレシピエントの子宮角に移植した。概要については図2Bも参照されたい。
30および60日での受胎率を、同期化プロトコル変数、レシピエントの年齢、動物カテゴリー(授乳期または非授乳期)、およびIVFに使用される雄ウシを固定効果として考慮しながら、IBM SPSS Statisticsバージョン22(IBM Inc.、ニューヨーク州アーモンク)の二項ロジスティック回帰により分析した。確率レベルp<0.05を有意とみなした。
実施例5では、新鮮、ガラス化、または直接移植のための凍結移植胚の、30および60日での受胎率を比較した(表2)。この例では、凍結保存胚での両群と比較して、新鮮移植胚の受胎率51.35%(133/259)との間に差があった。しかしながら、直接移植胚42.11%(96/228)と比較して、ガラス化胚34.62%(84/234)についての受胎率には差はなかった(p<0.05)。
新鮮、ガラス化、または直接移植のための凍結移植IVP胚の受胎率の比較について詳述する。これは、特にインディカス−タウラス牛における移植胚の一貫性のある数ついての、初めての研究である。
当業者であれば、本明細書において記載されている本発明の特定の実施形態の多くの同等物を、認識する、またはごく日常的な実験を用いて確認することができるだろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図しておらず、むしろ下記の特許請求の範囲に記載のとおりである。
Claims (42)
- インビトロ産生(IVP)有蹄動物胚を得るステップと、
前記胚を凍結保存するステップと、
レシピエント有蹄動物における着床のために胚を移植するステップと、を含む、方法であって、前記凍結保存および前記移植が、少なくとも約10%の妊娠率が達成されるように行われる、方法。 - インビトロ産生胚を得る前記ステップが、
雌から卵母細胞を回収するステップと、
卵母細胞をインビトロで成熟させるステップと、
接合子が産生されるように成熟卵母細胞を精液で受精させるステップと、
前記接合子を剥離および培養するステップと、を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記精液が性選別されている、請求項2に記載の方法。
- 前記精液が性選別されていない、請求項2に記載の方法。
- 卵母細胞をインビトロで成熟させる前記ステップが、
卵母細胞を、温度、気体の存在または量、湿度、pH、オスモル濃度、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つの条件について、生理学的に適切な範囲内でインキュベートすることを含む、請求項2に記載の方法。 - 気体の前記存在または前記量がO2およびCO2からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 卵母細胞をインビトロで成熟させる前記ステップが、卵母細胞を35〜40℃、3〜9%CO2、および飽和湿度でインキュベートすることを含む、請求項2に記載の方法。
- 接合子を剥離および培養する前記ステップが、前記接合子を35〜40℃、空気中5%CO2、および飽和湿度でインキュベートすることを含む、請求項2に記載の方法。
- 接合子を剥離および培養する前記ステップが、前記接合子を5%O2でインキュベートすることをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 胚を凍結保存する前記ステップが、
胚を、凍結保護剤を含む溶液中でインキュベートするステップと、
前記胚を液体窒素中に浸漬させるステップと、を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記胚を凍結保存する前記ステップが、
胚を、1.0〜4Mのエチレングリコールからなる凍結溶液中で、5〜30分間にわたって、約10℃〜約38℃の範囲内の第1の温度でインキュベートするステップと、
前記胚を容器に装填するステップであって、気泡が、胚を、等張希釈剤培地中のエチレングリコールを含む解凍溶液から分離する、装填するステップと、
前記胚を、約−2〜約−10℃の範囲内の温度に、約1分間〜約60分間の範囲内の期間にわたって曝露するステップと、
前記温度を、約−30〜約−36℃の範囲内の第2の温度に到達するまで、毎分約−0.2〜約−0.8℃の範囲内の速度で低下させるステップと、
前記胚を保存のために液体窒素中に浸漬させるステップと、を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記エチレングリコールが、約0.2〜約1.3モルの範囲内の最終濃度で存在する、請求項11に記載の方法。
- 胚がレシピエント雌への直接移植のために凍結保存される、請求項10に記載の方法。
- 胚を移植することが、
胚を、鉱物油下、ウシ血清アルブミン(BSA)が補充された培地中で、約5〜約9日間の範囲内の期間にわたって培養するステップと、
前記胚をレシピエント有蹄動物に移植するステップと、を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記培地が、C4培地、SOF培地、SOFaa培地、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記胚が、桑実胚、初期胚盤胞、胚盤胞、および拡張胚盤胞からなる群から選択される発生段階にある、請求項14に記載の方法。
- 前記レシピエント有蹄動物が同期化される、請求項1に記載の方法。
- 前記レシピエント有蹄動物が自然発情期にある、請求項1に記載の方法。
- 前記胚が新鮮なもの、ガラス化されたもの、または凍結されたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記有蹄動物がウシである、請求項1に記載の方法。
- 前記胚が、ボス・タウラス(Bos Taurus)、ボス・インディカス(Bos indicus)、および交雑種ボス・インディカス−タウラス(Bos indicus−taurus)を含むウシの種から選択される、請求項20に記載の方法。
- 凍結保存胚であって、
インビトロ産生(IVP)有蹄動物胚を得るステップと、
前記胚を、前記凍結保存胚がレシピエント有蹄動物に移植される場合、少なくとも約10%の妊娠率が達成されるような条件下で凍結保存するステップと、を含む、方法により産生される、凍結保存胚。 - インビトロ産生胚を得ることが、
雌から卵母細胞を回収するステップと、
卵母細胞をインビトロで成熟させるステップと、
成熟卵母細胞を精液で受精させるステップと、
接合子を剥離および培養するステップと、を含む、請求項22に記載の胚。 - 卵母細胞をインビトロで成熟させることが、卵母細胞を、温度、気体の存在または量、湿度、pH、オスモル濃度、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つの条件について、生理学的に適切な範囲内でインキュベートすることを含む、請求項23に記載の胚。
- 胚を移植することが、
胚を、鉱物油下、ウシ血清アルブミン(BSA)が補充された培地中で、約5〜約9日間の範囲内の期間にわたって培養するステップと、
前記胚をレシピエント有蹄動物に移植するステップと、を含む、請求項22に記載の胚。 - 前記培地が、C4培地、SOF培地、SOFaa培地、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項25に記載の胚。
- 前記胚が、桑実胚、初期胚盤胞、胚盤胞、および拡張胚盤胞からなる群から選択される発生段階にある、請求項25に記載の胚。
- 容器を含むデバイスであって、
容器と、
前記容器の第1の領域内に位置付けられた凍結保存溶液中の凍結保存胚と、を備えるデバイスであって、
前記第1の領域の横に、各々空気を含有する、第2および第3の領域が配置されており、
前記第2および第3の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第4および第5の領域が配置されており、
前記第4および第5の領域の横に、各々空気を含有する、第6および第7の領域が配置されており、
前記第6および第7の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第8および第9の領域が配置されている、デバイス。 - 前記領域のうちの1つ以上がチャンバであり、前記チャンバが、前記チャンバと少なくとも1つの隣接する他の領域との間に障壁を提供する物理的区画実体により画定される、請求項28に記載のデバイス。
- 複数の請求項28に記載のデバイス。
- 複数の有蹄動物胚を凍結保存するステップと、
前記複数の胚をレシピエント有蹄動物に移植するステップと、を含む方法であって、前記凍結保存および前記移植が、少なくとも30%の受胎率が達成されるように行われる、方法。 - 前記凍結保存ステップが、容器の第1の領域内に凍結保存溶液中の各胚を位置付け、
前記第1の領域の横に、各々空気を含有する、第2および第3の領域が配置されており、
前記第2および第3の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第4および第5の領域が配置されており、
前記第4および第5の領域の横に、 各々空気を含有する、第6および第7の領域が配置されており、
前記第6および第7の領域の横に、 各々解凍溶液を含有する、第8および第9の領域が配置されている、請求項31に記載の方法。 - 胚を凍結する方法であって、
有蹄動物胚を、1.0〜4Mのエチレングリコールからなる凍結溶液(SC)に、10分間にわたって35℃で曝露することと、
解凍溶液(SD)の4つのカラムに取り囲まれた凍結溶液中の各胚がそれらの間に空気のカラムによって交互配置されるように、凍結溶液(SC)中の前記胚を、ストローのように外形形成された容器内に位置付けることであって、前記解凍溶液が0.75Mのエチレングリコールを含む、位置付けることと、
前記容器を、約0℃〜約−10℃の範囲内の温度で安定した温度条件に曝露することと、
前記胚の上および下の前記カラムを、前記凍結装置内に設置された2分後に結晶化することと、
前記胚を、1〜60分間にわたって、約0℃〜約−10℃の範囲内の温度で維持することと、
前記温度を、約−30〜約−36℃の範囲内の第2の温度に到達するまで、毎分約−0.2〜約−0.8℃の範囲内の速度で低下させることと、
前記凍結胚を液体窒素中に浸漬させることと、を含む、方法。 - 胚を解凍する方法であって、
容器の第1の領域内に位置付けられた凍結保存溶液中の凍結保存胚を収容する前記容器を、室温空気に、前記凍結胚の解凍を開始するのに十分な第1の期間にわたって曝露することであって、
前記第1の領域の横に、各々空気を含有する、第2および第3の領域が配置されており、
前記第2および第3の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第4および第5の領域が配置されており、
前記第4および第5の領域の横に、各々空気を含有する、第6および第7の領域が配置されており、
前記第6および第7の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第8および第9の領域が配置されている、曝露することと、
前記容器を、約10℃〜約38℃の範囲内の解凍温度を特徴とする解凍環境に、前記凍結溶液を解凍するのに十分な第2の期間にわたって曝露することと、
前記容器内で前記解凍溶液、前記凍結溶液、および前記胚を混合することと、を含む、方法。 - 前記第1の期間が約10℃〜約38℃の範囲内である、請求項34に記載の方法。
- 前記第2の期間が約20℃〜約38℃の範囲内である、請求項34または請求項35に記載の方法。
- 前記解凍環境が液体浴であるか、またはそれを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記解凍温度が約10℃〜約38℃の範囲内である、請求項34に記載の方法。
- 前記混合ステップが、前記容器の穏やかな撹拌により達成される、請求項34に記載の方法。
- 前記胚をレシピエント有蹄動物に移植するステップをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 前記移植が、前記曝露ステップもしくは前記混合ステップと同時に、またはその後に行われる、請求項40に記載の方法。
- 前記移植ステップが、前記レシピエント有蹄動物の子宮角を移植することを含む、請求項40に記載の方法。
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