BR102016003292A2 - métodos, embrião criopreservado, dispositivo, pluralidade de dispositivos e método de congelamento e descongelamento de embriões - Google Patents

Abstract

resumo “métodos, embrião criopreservado, dispositivo, pluralidade de dispositivos e método de congelamento e descongelamento de embriões” são descritas tecnologias para a criopreservação de embriões de ungulados para a implantação em fêmeas receptoras.

Description

“MÉTODOS, EMBRIÃO CRIOPRESERVADO, DISPOSITIVO, PLURALIDADE DE DISPOSITIVOS E MÉTODO DE CONGELAMENTO E DESCONGELAMENTO DE EMBRIÕES” Antecedentes Da Invenção [0001 ] A produção de embriões in vitro é um importante componente na pecuária. Frequentemente, são produzidos mais embriões do que implantados. Embora taxas de concepção acima de 30% foram recentemente alcançadas na transferência de embriões (TE) com embriões produzidos in vitro vitrificados (PIV), o complexo processo de recuperação desses embriões após a vitrificação continua sendo um obstáculo para o uso comercial desta técnica. Existe a necessidade de novos e eficientes protocolos para a criopreservação de embriões de bovinos.

Descrição Resumida da Invenção [0002] A presente invenção fornece tecnologias para a criopreservação de embriões de bovinos e/ou para alcançar a fertilização com embriões criopreservados de bovinos. A presente invenção também fornece embriões criopreservados, populações de tais embriões criopreservados, sistemas de geração e/ou armazenamento de tais embriões, e etc.

[0003] Entre outras coisas, a presente invenção abrange a identificação de uma fonte de problema com determinadas tecnologias disponíveis para a transferência embrionária de embriões criopreservados, particularmente com os processos de recuperação (por exemplo, descongelamento, implantação, etc.) dos embriões criopreservados. Por exemplo, a presente divulgação aprecia que o pessoal e tempo necessários para recuperar embriões criopreservados viáveis de acordo com muitas tecnologias padrão levantam preocupações com relação à aplicabilidade comercial.

[0004] Além disso, a presente divulgação também reconhece que há uma necessidade de tecnologias de transferência para os embriões criopreservados que melhore as taxas de concepção em relação à maioria das tecnologias convencionais que utilizam embriões criopreservados, entendendo-se que essas tecnologias padrão tipicamente alcançam taxas de concepção que estão muito abaixo daquelas alcançadas com embriões frescos. Entre outras coisas, a presente divulgação fornece tecnologias que permitam atingir taxas de concepção (por exemplo, cerca de 10% ou mais) desejáveis para embriões criopreservados.

[0005] Em alguns exemplos de realização, a invenção provê métodos que compreendem as etapas de, por exemplo: obtenção de embriões de ungulados produzidos in vitro (PIV); a criopreservação dos embriões; e a transferência dos embriões para a implantação em ungulados receptores, sendo a criopreservação e a transferência realizada de modo que taxas de gravidez de pelo menos cerca de 10% são alcançadas.

[0006] Em alguns exemplos de realização, a obtenção de embriões produzidos in vitro compreende as etapas de, por exemplo: recuperação dos oócitos a partir de fêmeas; maturação in vitro dos oócitos; fertilização dos oócitos maduros com sêmen de modo que são gerados os zigotos; e desnudamento e cultivo dos zigotos.

[0007] Em alguns exemplos de realização, os sêmens utilizados são separados por gênero. Em alguns exemplos de realização, os sêmens não são separados por gênero.

[0008] Em alguns exemplos de realização, a maturação de oócitos in vitro compreende, por exemplo: a incubação dos oócitos dentro de uma faixa fisiologicamente relevante de, pelo menos, uma condição selecionada a partir do grupo consistindo de: temperatura, presença ou quantidade de gás, umidade, pH, osmolaridade, e combinações dessas condições. Em alguns exemplos de realização, a presença ou quantidade de um gás é de um gás selecionado a partir do grupo consistindo de O2 e CO2. Em alguns exemplos de realização, a etapa de maturação de oócitos in vitro compreende: a incubação de oócitos a 35-40 QC com 3-9% de C02 e umidade saturada. Em alguns exemplos de realização, a etapa de desnudamento e cultura de zigotos compreende a incubação dos zigotos a 35-40 SC com 5% de CO2 em ar, e umidade saturada. Em alguns exemplos de realização, a etapa de desnudamento e cultivo de zigotos compreende ainda a incubação dos zigotos em 5% de 02.

[0009] Em alguns exemplos de realização, a criopreservação de embriões compreende as etapas de, por exemplo: incubação dos embriões em uma solução compreendendo crioprotetor; e imersão dos embriões em nitrogênio líquido. Em alguns exemplos de realização, a etapa de criopreservação do embrião compreende as etapas de: incubação de embriões em solução de congelamento consistindo de 1,0 - 4 M de etileno glicol durante 5 - 30 minutos em uma primeira temperatura dentro de um intervalo de cerca de 10 SC a cerca de 38 SC; carregamento dos embriões em um receptáculo, em que bolhas de ar separam os embriões a partir de uma solução de descongelamento que compreende etileno glicol em um meio diluente isotônico; exposição dos embriões a uma temperatura dentro de um intervalo de cerca de -2 a cerca de -10 SC durante um período de tempo no intervalo de cerca de 1 min até cerca de 60 minutos; diminuição da temperatura a uma taxa no intervalo de cerca de -0.2 a cerca de - 0,8 SC por minuto até atingir uma segunda temperatura dentro de um intervalo de cerca de -30 a cerca de -36 eC; e imersão dos embriões em nitrogênio líquido para o armazenamento. Em alguns exemplos de realização, 0 etileno glicol está presente em uma concentração final no intervalo de cerca de 0,2 a cerca de 1,3 Molar.

[0010] Em alguns exemplos de realização, os embriões são criopreservados para transferência direta em fêmeas receptoras.

[0011] Em alguns exemplos de realização, a transferência de embriões compreende as etapas de: cultivo dos embriões em um meio suplementado com albumina de soro bovino (BSA) sob óleo mineral durante um período de tempo no intervalo de cerca de 5 a cerca de 9 dias; e transferência dos embriões em ungulados receptores. Em alguns exemplos de realização, o meio é selecionado a partir do grupo consistindo em meio C4, meio SOFa, e combinações dos mesmos.

[0012] Em alguns exemplos de realização, os embriões transferidos estão em um estágio de desenvolvimento selecionado a partir do grupo que consiste de mórula, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido.

[0013] Em alguns exemplos de realização, ungulados receptores são sincronizados. Em alguns exemplos de realização, ungulados receptores estão em estro natural. Em alguns exemplos de realização, os embriões são frescos, vitrificados, ou congelados. Em alguns exemplos de realização, ungulados são gado. Em alguns exemplos de realização, os embriões de uma espécie são selecionados a partir de Bos taurus, Bos indicus e raça cruzada Bos indicus-taurus.

[0014] Em alguns exemplos de realização, a invenção provê um embrião criopreservado produzida por um método compreendendo as etapas de, por exemplo: obtenção de embriões de ungulados produzidos in vitro (PIV); criopreservação dos embriões sob condições em que quando os embriões criopreservados são transferidos para ungulados receptores, taxas de gravidez de pelo menos cerca de 10% são alcançadas. Em alguns exemplos de realização, a obtenção de embriões produzidos in vitro compreende as etapas de, por exemplo: recuperação dos oócitos a partir de fêmeas; maturação in vitro dos oócitos; fertilização dos oócitos maduros; e desnudamento e cultivo dos zigotos. Em alguns exemplos de realização, a maturação de oócitos in vitro compreende a incubação dos oócitos dentro de uma faixa fisiologicamente relevante de pelo menos uma condição selecionada a partir do grupo consistindo de: temperatura, presença ou quantidade de gás, umidade, pH, osmolaridade, e combinações dessas condições. Em alguns exemplos de realização, a transferência de embriões compreende as etapas de: cultivo dos embriões em um meio suplementado com albumina de soro bovino (BSA) sob óleo mineral durante um período de tempo no intervalo de cerca de 5 a cerca de 9 dias; e transferência dos embriões em ungulados receptores.

[0015] Em alguns exemplos de realização, os meios utilizados de acordo com a presente invenção é, ou compreende, um meio selecionado a partir do grupo consistindo de meio C4, meio SOFa, e combinações dos mesmos.

[0016] Em alguns exemplos de realização, os embriões criopreservados e/ou transferidos de acordo com a presente divulgação estão em uma fase de desenvolvimento selecionado a partir do grupo que consiste de mórula, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido.

[0017] Em alguns exemplos de realização, a invenção provê um dispositivo que compreende: um receptáculo; um embrião criopreservado em solução de criopreservação posicionado dentro de uma primeira região do receptáculo, em que primeira região é flanqueada pela: segunda e terceira regiões e, cada uma delas contém ar, em que a segunda e terceira regiões são flanqueados pela: quarta e quinta regiões, cada um delas contendo soluções de descongelamento, em que a quarta e quinta regiões são flanqueadas pela: sexta e sétima regiões, cada uma delas contendo ar, em que a sexta e sétima regiões são flanqueadas pela: oitava e nona regiões, e cada um delas contêm soluções de descongelamento. Em alguns exemplos de realização, uma ou mais das regiões é uma câmara em que a câmara é definida por uma entidade de partição física que proporciona uma barreira entre ela e pelo menos uma outra região com a qual é adjacente. Em alguns exemplos de realização, a invenção provê uma pluralidade de dispositivos.

[0018] Em alguns exemplos de realização, a invenção provê métodos que compreendem as etapas de: criopreservação de uma pluralidade de embriões de ungulados; e transferência da pluralidade de embriões aos ungulados receptores, em que a criopreservação e a transferência são executadas de modo a que uma taxa de concepção de pelo menos 30% é alcançada. Em alguns exemplos de realização, a etapa de criopreservação compreende o posicionando de cada embrião em solução de criopreservação dentro de uma primeira região de um receptáculo, em que a primeira região é flanqueada pela: segunda e terceira regiões e, cada uma delas contém ar, em que a segunda e terceira regiões são flanqueados pela: quarta e quinta regiões, cada um delas contendo soluções de descongelamento, em que a quarta e quinta regiões são flanqueadas pela: sexta e sétima regiões, cada uma delas contendo ar, em que a sexta e sétima regiões são flanqueadas pela: oitava e nona regiões, e cada um delas contêm solução de descongelamento.

[0019] Em alguns exemplos de realização, a invenção provê métodos de congelamento de embriões, por exemplo, compreendendo: a exposição de embriões de ungulados à solução de congelamento (SC), que consiste de cerca de 1 a cerca de 4 M de etileno glicol durante 10 minutos a 35 eC; o posicionamento de cada embrião em uma solução de congelamento (SC), dentro de um receptáculo dimensionado como uma palheta, para que o embrião na solução de congelamento seja rodeado por quatro colunas de solução de descongelamento (SD), intercaladas por colunas de ar entre elas, em que a solução de descongelamento compreende cerca de 0,75 M de etileno glicol; exposição do receptáculo em condições de temperatura estabilizadas a uma temperatura no intervalo de cerca de 0 SC até cerca de -10 eC; cristalização das colunas acima e abaixo do embrião por dois minutos depois de ser colocado na máquina de congelamento; manutenção do embrião durante 1 a 60 minutos a uma temperatura no intervalo de cerca de 0 QC até cerca de -10 SC; diminuição da temperatura a uma taxa no intervalo de cerca de -0,2 SC até cerca de -0,8 SC por minuto até atingir uma segunda temperatura dentro do intervalo de cerca de -30 SC a cerca de -36 SC; e imersão dos embriões congelados em nitrogênio líquido. Em alguns exemplos de realização, o recipiente, contendo o embrião congelado, é imerso em nitrogênio líquido após atingir a segunda temperatura no intervalo de cerca de -30 SC a cerca de -36 SC.

[0020] Em alguns exemplos de realização, a invenção provê métodos de descongelamento de embriões, por exemplo, compreendendo: Exposição de um receptáculo que contém o embrião criopreservado em solução de criopreservação posicionada dentro de uma primeira região do receptáculo, em que primeira região é flanqueada pela: segunda e terceira regiões e, cada uma delas contém ar, em que a segunda e terceira regiões são flanqueados pela: quarta e quinta regiões, cada um delas contendo soluções de descongelamento, em que a quarta e quinta regiões são flanqueadas pela: sexta e sétima regiões, cada uma delas contendo ar, em que a sexta e sétima regiões são flanqueadas pela: oitava e nona regiões, cada uma delas contendo soluções de descongelamento, ao ar em temperatura ambiente durante um primeiro período de tempo, em que o primeiro período de tempo é suficiente para iniciar o descongelamento dos embriões congelados; exposição do receptáculo a um ambiente de descongelamento caracterizado por uma temperatura de descongelamento no intervalo de cerca de 10 QC a cerca de 38 eC durante um segundo período de tempo, em que o segundo período de tempo é suficiente para descongelar a solução de congelamento; e misturando a solução de descongelamento, solução de congelamento e embrião dentro do receptáculo. Em alguns exemplos de realização, o primeiro período de tempo está em um intervalo de cerca de 10 SC a cerca de 38 SC. Em alguns exemplos de realização, o segundo período de tempo está em um intervalo de cerca de 20 SC a cerca de 38 SC. Em alguns exemplos de realização, o ambiente de descongelamento é ou compreende um banho líquido. Em alguns exemplos de realização, a temperatura de descongelamento está em um intervalo de cerca de 10 SC a cerca de 38 SC. Em alguns exemplos de realização, a etapa de mistura é obtida por meio da suave agitação do recipiente. Em alguns exemplos de realização, o método de descongelamento inclui ainda uma etapa de transferência do embrião para um ungulado receptor. Em alguns exemplos de realização, a transferência é realizada simultaneamente com ou após a etapa de exposição ou etapa de mistura. Em alguns exemplos de realização, a etapa de transferência compreende a transferência do embrião para o corno uterino do ungulado receptor.

Breve Descrição Das Figuras [0021] Figura 1: representa um esquema de carregamento para o uso de embriões congelados na transferência direta de embriões. Conforme representado nesta figura, os embriões na solução de congelamento podem ser dispostos em dispositivos (por exemplo, um embrião por dispositivo) em que as regiões de solução são separadas por regiões de ar. Por exemplo, conforme representado na Figura 1, um embrião (100) em solução de congelamento (200) está localizado dentro de uma primeira região (300) (em cinza na Figura 1) de um dispositivo cilíndrico (400) (por exemplo, uma palheta). Imediatamente flanqueando a primeira região estão duas regiões (segunda (305) e terceira (315), cada uma delas está ponteada na figura 1) contendo ar, e, em seguida, duas regiões (quarta (310) e quinta (320), cada uma delas distribuídas na Figura 1) que contém a solução de descongelamento, seguido por mais duas regiões (sexta (325) e sétima (335), cada uma delas ponteadas na Figura 1) que também contêm ar, seguido por mais duas regiões (oitava (330) e nona (340), cada uma delas distribuída na Figura 1) que também contêm a solução descongelamento. O dispositivo específico representado na Figura 1 é uma palheta de 0,25 ml_ colocada sobre uma coluna central; a solução de congelamento é 1,5 M de etileno glicol; e a solução de descongelamento é uma diluição 1:1 de solução de congelamento em DPBS, de modo que é 0,75 M de etileno glicol em DPBS.

[0022] Figuras 2A e B: (juntas compreendendo a Figura 2) descrevem uma visão geral de esquemas de congelamento (Fig. 2A) e descongelamento (Fig. 2B) tal como descrito na Exemplificação da presente divulgação.

Definições [0023] Para a presente invenção ser mais facilmente compreendida, alguns termos são definidos abaixo. Os técnicos hábeis no assunto compreenderão que as definições para determinados termos podem ser fornecidas em outras partes do relatório descritivo, e/ou serão evidentes a partir do contexto.

[0024] Aproximadamente: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “aproximadamente” ou “cerca de,” aplicado a um ou mais valores de interesse, refere-se a um valor que é semelhante a um valor de referência indicado. Em determinados exemplos de realização, os termos “aproximadamente” ou “cerca de” referem-se a um intervalo de valores que caem dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos, em ambas as direções (superior ou inferior) do referido valor referenciado exceto quando indicado de outra forma ou quando evidente a partir do contexto (exceto se tal número for superior a 100% de um valor possível).

[0025] Inseminação Artificial (IA): Tal como utilizado no presente, o termo “inseminação artificial (IA)” refere-se à introdução, pela manipulação do homem, de sêmen no útero de uma fêmea bovina para se conseguir a gravidez. Em muitos exemplos de realização, a IA é utilizada na criação, de modo que as gravidezes resultantes sejam (ou se destinam a ser) levadas até o fim. Em alguns exemplos de realização, a IA é realizada com sêmen coletado. Em alguns exemplos de realização, a IA é realizada com sêmen extraído. Em alguns exemplos de realização, a IA é realizada com sêmen que foi processado; por exemplo, em alguns exemplos de realização, o sêmen foi sexado para que ele estivesse enriquecido com o esperma de um único sexo. Os peritos hábeis no estado da técnica compreenderão que, a menos que expressamente indicado de outra forma, o termo “IA” não abrange procedimentos de transferência de embriões onde, por exemplo, o sêmen pode ser introduzido em uma vaca para gerar embriões para transferência.

[0026] Blastocisto: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “blastocisto” refere-se a uma estrutura formada no início do desenvolvimento de mamíferos. Ele possui uma massa celular interna (ICM), que subsequentemente forma o embrião. O trofoblasto é a camada externa de células do blastocisto. Esta camada circunda uma massa celular interna (que é uma fonte de células tronco embrionárias) e uma cavidade cheia de fluido conhecida como blastocele. O trofoblasto dá origem à placenta. O uso de blastocistos para a fertilização in vitro (FIV) envolve a cultura de um óvulo fertilizado antes de implantá-lo em um útero bovino.

[0027] Raça: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “raça” refere-se a um grupo de ungulados (por exemplo, gado), que tem um ancestral comum e/ou que partilha certas características distinguíveis que não são partilhadas por ungulados de outras raças. Os técnicos hábeis no assunto estão familiarizados com os padrões e/ou características de raça. Em muitos exemplos de realização, uma raça particular é produzida e/ou mantida pelo acasalamento específico de um progenitor ou progenitores identificados (por exemplo, um determinado touro com uma reprodutora particular ou com qualquer reprodutora de uma linhagem de reprodutoras particular) entre si.

[0028] Comparável: O termo “comparável” é utilizado no presente para descrever dois (ou mais) conjuntos de condições, circunstâncias, indivíduos ou populações que são suficientemente semelhantes entre si para permitir a comparação de resultados obtidos ou fenômenos observados. Em alguns exemplos de realização, os conjuntos comparáveis de condições, circunstâncias, indivíduos ou populações são caracterizados por uma variedade de características substancialmente idênticas e um ou um pequeno número de características variadas. Os técnicos hábeis no assunto compreenderão que os conjuntos de circunstâncias, indivíduos ou populações são comparáveis entre si quando caracterizados por um número e tipo suficiente de características substancialmente idênticas para garantir uma conclusão razoável de que as diferenças nos resultados obtidos ou fenômenos observados sob ou com diferentes conjuntos de circunstâncias, indivíduos ou populações são causadas por ou são indicativos da variação nas características que são diferentes. Os técnicos hábeis no assunto compreenderão que a linguagem relativa utilizada no presente (por exemplo, aumentado, ativado, reduzido, inibido, etc.) irá tipicamente se referir às comparações efetuadas sob condições comparáveis.

[0029] Raça cruzada: Conforme utilizado na presente invenção o termo “raça cruzada” refere-se a ungulados (por exemplo, gado) produzidos a partir de gametas de animais individuais que são de diferentes raças ou variedades de ungulados (por exemplo, gado). O cruzamento é frequentemente realizado na pecuária de gado leiteiro para produzir gado mais saudável, mais produtivo, em comparação com as raças parentais. O cruzamento é o acasalamento deliberado de animais de diferentes raças ou cepas; em muitos exemplos de realização o cruzamento é projetado para tirar vantagem da heterose (vigor híbrido) para características como produção, fertilidade e longevidade. Em alguns exemplos de realização, a presente invenção abrange a percepção de que os recentes desenvolvimentos em matéria de inseminação artificial e/ou fertilização in vitro, normalmente não utilizados na indústria de gado leiteiro, podem ser utilizados para ativar e/ou fornecer certas vantagens no que diz respeito à geração e/ou manutenção de linhagens mestiças (cruzada) de gado leiteiro conforme descrito na presente invenção. Tal como descrito na presente invenção, ungulados de raças cruzadas de particular interesse são híbridos, em que 50% dos cromossomos somáticos do animal são de uma cepa ou linhagem e 50% são de uma cepa ou linhagem diferente (ou seja, formada pelo cruzamento de indivíduos F0 a partir da primeira e segunda cepa/linhagem que diferem entre si. Os técnicos hábeis no assunto compreenderão, no entanto, que o termo “raça cruzada/mestiça” pode ser utilizado em alguns exemplos de realização (como é óbvio a partir do contexto) para se referir a qualquer indivíduo cujo genoma, como um resultado de passagem, não é 100% a partir de qualquer raça única. Célula diploide: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “célula diploide” refere-se a uma célula com um par homólogo de cada um de seus cromossomos autossômicos, com duas cópias (2n) de cada locus genético autossômico.

[0030] Estágio de desenvolvimento: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “estágio de desenvolvimento” refere-se às fases do desenvolvimento embrionário. Em alguns exemplos de realização, os estágios de desenvolvimento incluem: a mórula, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido.

[0031 ] Transferência Direta: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “transferência direta” refere-se a um método de criopreservação lenta de um embrião. Os embriões são incubados em solução de congelamento compreendendo agentes crioprotetores, tais como etileno glicol ou glicerol, e são expostos a temperaturas gradualmente decrescentes até que o embrião esteja congelado e subsequentemente imerso em nitrogênio líquido. Em alguns exemplos de realização, o embrião dentro da solução de congelamento é carregado em uma palheta que é exposta a temperaturas de congelamento. O método de transferência direta de criopreservação também é referido como congelamento lento.

[0032] Embrião: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “embrião” refere-se a um oócito (ovo) fertilizado preparado para a implantação imediata dentro de um ungulado fêmea ou armazenado para posterior implantação em um ungulado fêmea.

[0033] Transferência fresca: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “transferência fresca” é usado para se referir a um método de implantação de embriões em ungulados receptores (por exemplo, gado) após a fertilização - evitando a criopreservação. Em alguns exemplos de realização, os embriões são cultivados in vitro por vários dias antes de serem implantados em uma fêmea receptora.

[0034JGametas: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “gametas” é utilizado para se referir às células reprodutivas (por exemplo, espermatozóides ou óvulos) possuindo o número haploide de cromossomos, especialmente um espermatozóide maduro ou oócito capaz de se fundir com um gameta do sexo oposto para produzir um ovo fertilizado. Gametas são produzidos pelo processo da meiose.

[0035] Sêmen submetido à separação de gênero: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “sêmen submetido à separação de gênero” refere-se ao sêmen que foi manipulado para selecionar espermatócitos de apenas um gênero preferido. Em alguns exemplos de realização, o sêmen submetido à separação de gênero também é conhecido como sêmen sexuado.

[0036] Perfil genômico: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “perfil genômico” refere-se a um subconjunto representativo da totalidade de informação contida dentro de um genoma. Normalmente, um perfil genômico contém genótipos, um conjunto específico de loci polimórficos. Em alguns exemplos de realização, um perfil genômico pode correlacionar com uma característica ou traço particular, ou um conjunto dessas características, por exemplo, um animal, linhagem, raça, ou população mestiça (cruzada) particular.

[0037]Genótipo: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “genótipo” refere-se à combinação de alelos diploides em um determinado locus genético, ou um conjunto de loci relacionados, em uma determinada célula ou organismo. Um sujeito homozigótico carrega duas cópias do mesmo alelo e um sujeito heterozigótico possui dois alelos diferentes. No caso mais simples de um locus com dois alelos “A” e “a”, três genótipos podem ser formados: A/A, A/a e a/a.

[0038JGenotipagem: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “genotipagem” refere-se a um protocolo experimental, computacional, ou observacional para distinguir o genótipo de um indivíduo com um ou mais loci bem definidos. Os técnicos hábeis no assunto estarão cientes da variedade de tecnologias que podem utilmente e eficazmente realizar a genotipagem. Em alguns exemplos de realização, a genotipagem envolve a detecção direta de um ácido nucleico ou sequência de ácido nucleico. Em alguns exemplos de realização, a genotipagem envolve a detecção indireta de um ácido nucleico ou sequência de ácido nucleico, por exemplo, pela detecção ou análise de um marcador putativo ou evento que se correlaciona com a presença de ácido nucleico ou sequência de ácido nucleico.

[0039] Célula haploide: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “célula haploide” refere-se a uma célula com um único conjunto (1 n) de cromossomos - metade do número de uma célula somática.

[0040] Novilha: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “novilha/bezerra” refere-se ao gado de sexo feminino que ainda não produziu qualquer bezerro.

[0041] Híbrido: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “híbrido” refere-se a ungulados (por exemplo, gado) produzidos como resultado do cruzamento de gametas masculinos e femininos de diferentes raças ou linhagens de ungulados. Assim, tipicamente, 50% do genoma autossômico (por exemplo, genoma somático) de um híbrido são de uma primeira raça/linhagem, e 50% de uma segunda raça/linhagem. De particular interesse, tal como descrito na presente invenção, são híbridos nos quais 50% de seus cromossomos são somáticos a partir de uma primeira raça e 50% são de uma segunda raça.

[0042] Fertilização In Vitro (FIV): Conforme utilizado na presente invenção, o termo “fertilização in vitro” refere-se a um método para fertilizar um ovo fora de um animal vivo. A FIV é um processo pelo qual um ovo é fertilizado pelo esperma fora do corpo (ou seja, in vitro, que se traduz literalmente como “em vidro”, mas utilizado no estado da técnica para se referir a processos realizados, por exemplo, em um laboratório ou outro ambiente artificial). Em alguns exemplos de realização, um processo de fertilização in vitro pode envolver o acompanhamento e/ou estimulo do processo ovulatório de uma fêmea, remoção do oócito ou oócitos (ovo ou ovos) a partir dos ovários da fêmea, e/ou o contato entre os espermatozóides e oócitos em um laboratório (por exemplo, em um meio fluido) para alcançar a fertilização. Em alguns exemplos de realização, a fertilização in vitro envolve a cultura de um óvulo fertilizado (zigoto) em um meio de crescimento e/ou a implantação deste no útero de uma fêmea, ou envolve ainda o armazenamento dele para futura análise e/ou implantação. Em alguns exemplos de realização, a fertilização in vitro pode envolver a triagem de ovos fertilizados para determinados atributos desejados (por exemplo, gênero).

[0043] Linhagem: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “linhagem” refere-se a uma cepa de gado descendente de pais ancestrais comuns desenvolvida e mantida pela reprodução seletiva.

[0044] Acasalamento: O termo “acasalamento”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um processo que resulta na formação de um embrião, tipicamente a partir de dois gametas de gêneros opostos. Em alguns exemplos de realização, o acasalamento envolve a reprodução natural. Em alguns exemplos de realização, o acasalamento envolve a inseminação artificial. Em alguns exemplos de realização, o acasalamento envolve a FIV. Em muitos exemplos de realização descritos no presente pedido, o acasalamento é utilizado para gerar uma progênie híbrida. Em muitos exemplos de realização, o acasalamento é utilizado para gerar uma progênie de raça cruzada (mestiça).

[0045] Mórula: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “mórula” refere-se a uma fase do desenvolvimento embrionário. A mórula, um estágio embrionário inicial que consiste de uma esfera de células (chamada blastômero) contida no interior da zona pelúcida, é produzida a partir do zigoto unicelular por uma série de clivagens. Através da diferenciação celular e cavitação, a mórula dá origem ao blastocisto. Uma vez que uma cavidade cheia de fluido começa a se abrir na mórula, se dá inicio ao estágio de blastocisto do desenvolvimento embrionário. Durante a formação de blastocistos, as células da mórula se diferenciam em uma massa celular interna crescente no interior da blastocele e células trofoblásticas crescem no exterior.

[0046] Reprodução natural: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “reprodução natural” refere-se à reprodução tradicional do gado pelo pareamento de machos e fêmeas sem a inseminação artificial ou técnicas baseadas em fertilização in vitro.

[0047] Receptáculo: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “receptáculo” refere-se a um dispositivo para conter um ou mais embriões criopreservados. O receptáculo pode conter uma série de regiões, ou câmaras, para armazenamento: de ar, solução de descongelamento, ou embrião em solução de criopreservação. Em alguns exemplos de realização, o receptáculo é ou compreende uma palheta (cilindro).

[0048] Substancialmente: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “substancialmente” refere-se à condição qualitativa exibindo extensão ou grau total ou quase total de uma característica ou propriedade de interesse. Um profissional hábil nas técnicas biológicas compreenderá que os fenômenos biológicos e químicos raramente, se alguma vez, cumpram e/ou procedam à integralidade ou atinjam ou evitem um resultado absoluto. O termo “substancialmente” é, portanto, usado na presente invenção para capturar a potencial falta de completude inerente em muitos fenômenos biológicos e químicos.

[0049] Traço: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “traço” refere-se a um atributo detectável de um indivíduo. Tipicamente, a expressão de um traço particular pode ser totalmente ou parcialmente influenciada pela constituição genética do indivíduo. Em alguns exemplos de realização, um traço característico de um indivíduo, linhagem, raça ou híbrido em particular, por exemplo, pode ser invocado (individualmente ou como parte de um conjunto) para distinguir esse indivíduo, linhagem, raça, ou híbrido de outros.

[0050] Ungulado: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “ungulado” refere-se a um grupo diverso de grandes mamíferos que inclui equinos, bovinos/gado, porcos, cabras, búfalos, ovelhas, girafas, veados, camelos, e hipopótamos. A maioria dos ungulados terrestres utilizam as pontas de seus dedos do pé, geralmente cascos, para sustentar todo o peso do corpo enquanto em movimento. Em alguns exemplos de realização, o termo significa, em grosso modo, “sendo de cascos” ou “animais de cascos”.

[0051] Vitrificação: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “vitrificação” refere-se a um método para criopreservar células ovo (oócitos) e embriões. Em alguns exemplos de realização, os embriões são expostos a soluções de equilíbrio e de vitrificação compreendendo agentes crioprotetores, como etileno glicol ou glicerol, e imersos em nitrogênio líquido como parte do processo de criopreservação.

[0052JZigoto: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “zigoto” refere-se a uma célula formada quando duas células de gametas são unidas por meio da reprodução sexual. Este é o estágio de desenvolvimento mais precoce do embrião. Um zigoto é sintetizado a partir da união de dois gametas, e representa a primeira etapa no desenvolvimento de um organismo único. Os zigotos são produzidos por fertilização entre duas células haploides um óvulo (gameta feminino) e uma célula de esperma (gameta masculino) -que combinam para formar uma única célula diploide.

Descrição Detalhada Da Invenção [0053] A presente invenção baseia-se, em parte, na descoberta de que é possível criopreservar embriões de ungulados com melhores taxas de concepção em relação à maioria das tecnologias padrão, cujas taxas são normalmente muito abaixo das taxas de concepção obtidas com embriões frescos.

[0054] Em alguns exemplos de realização, a invenção provê métodos que compreendem as etapas de: obtenção de embriões de produzidos in vitro; a criopreservação dos embriões; e a transferência dos embriões para a implantação em ungulados receptores, sendo a criopreservação e a transferência realizadas de modo são alcançadas taxas de gravidez de cerca de pelo menos 10%. Em alguns exemplos de realização, a invenção provê embriões criopreservados através dos métodos divulgados. Em alguns exemplos de realização, a invenção provê receptáculos para congelamento, armazenamento e descongelamento de embriões criopreservados.

Embriões Produzidos In Vitro [0055) O uso de embriões produzidos in vitro (PIV) aumentou consideravelmente na última década (Hasler, 2014). Grande parte deste crescimento ocorreu principalmente no Brasil. Em 2013, mais de 393.000 embriões PIV foram transferidos para fêmeas receptoras, sendo que deste total, 78% foram produzidos na América do Sul. No mesmo ano, a partir do número total de transferências, apenas 8,9% dos embriões PIV foram congelados; para embriões in vivo, essa proporção foi de 59% (Perry, 2013).

[0056) Os embriões PIV são menos resistentes à criopreservação do que embriões in vivo e embriões em meio de cultura ao qual foi adicionado soro fetal bovino (FBS) pode proporcionar a maior acumulação de lipídeos intracitoplasmáticos nos embriões (Mucci et ai., 2006), que é um dos fatores responsáveis para o aumento da sensibilidade dos embriões PIV ao congelamento.

[0057) Atualmente, a técnica de criopreservação mais comumente utilizada para embriões PIV é a vitrificação (Dode et ai., 2013), por sua simplicidade, rapidez e baixo custo. No entanto, esta técnica utiliza altas concentrações de crioprotetores e requer pessoal treinado e estrutura de laboratório para a recuperação de embriões antes da transferência (Vajta et ai., 1998), restringindo a sua utilização no campo e em grande escala.

[0058) Por outro lado, o congelamento lento de embriões para subsequente transferência direta, apesar de ter custos de funcionamento um pouco maiores, ele permite o uso de concentrações mais baixas de agentes crioprotetores e, consequentemente, menos toxicidade aos embriões (Voelkel e Hu, 1992).

[0059] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção fornece métodos melhorados para a implantação de embriões de bovinos cultivados em soro. Gado que recebe embriões fertilizados previamente incubados em Soro Fetal Bovino (FBS) tinham taxas similares de concepção em relação ao gado que recebia embriões sem a exposição prévia ao FBS. Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é um método de criopreservação de embriões de bovinos no qual o gado receptor tem taxas de concepção semelhante às taxa obtidas quando são utilizados embriões recentemente transferidos. O gado que recebe embriões recém-fecundados teve taxas de concepção semelhantes aos de embriões vitrificados e transferência direta/embriões submetidos ao congelamento lento. Isto demonstra que a transferência direta/método de congelamento lento de criopreservação do embrião é tão viável quanto o método de vitrificação. Por conveniência, a transferência direta/congelamento lento é um substituto adequado para o método de vitrificação.

[0060] Em alguns exemplos de realização, antes da fertilização e criopreservação, os oócitos podem ser submetidos à maturação in vitro. Em alguns exemplos de realização, o oócito é incubado na presença de oxigênio (O2). Em alguns exemplos de realização, 0 oócito é incubado na presença de dióxido de carbono (CO2). Em alguns exemplos de realização, 0 oócito é incubado na presença de 3-9% de CO2. Em alguns exemplos de realização, 0 oócito é incubado na presença de 5% de C02. Em alguns exemplos de realização, 0 oócito é incubado na presença de 5% de O2.

Criação de Gado Convencional [0061 ] A criação animal é a gestão e tratamento de animais de fazenda por seres humanos com fins lucrativos, na qual as qualidades genéticas e comportamentos considerados vantajosos para os seres humanos são mais desenvolvidos. O termo pode se referir a prática da reprodução seletiva e criação de gado para promover características desejáveis em animais para utilidade, esporte, lazer, ou pesquisa.

[0062] A criação animal combina a arte e a ciência da criação de animais, misturando práticas consagradas pelo tempo e o conhecimento científico moderno em um sistema que fornece o bem-estar animal e provê uma gestão e manejo seguro e eficiente dos animais. As práticas de criação animal se alteram quando cientistas, especialistas em agricultura, e outros envolvidos com os animais aprendem novas técnicas ou eliminam progressivamente aquelas que não são mais necessárias ou apropriadas. Práticas de criação animal variam desde o ato de descornar gado para evitar acidentes com os companheiros de rebanho e pecuaristas até os métodos de estabulação (alojamento do gado), fornecimento de nutrição adequada e estratégias de melhoramento.

[0063] Técnicas como a inseminação artificial e transferência de embriões foram desenvolvidas e podem ser utilizadas para facilitar o melhoramento de animais. Por exemplo, uma vez que tais tecnologias permitem que uma reprodutora carregue um embrião que não seja dela própria, elas podem ser utilizadas para assegurar que grandes números de embriões a partir de uma determinada reprodutora de alta qualidade (ou linhagem reprodutora) possam ser implantados em um substituto de qualidade inferior, aumentando assim o número de descendentes que podem ser gerados a partir da reprodutora de alta qualidade. Esta prática pode aumentar consideravelmente o número de descendentes, que podem ser produzidos por uma pequena seleção dos melhores animais progenitores de qualidade. No entanto, conforme discutido no presente, tais tecnologias não têm sido empregadas tipicamente no gado leiteiro. Entre outras coisas, elas são muitas vezes consideradas demasiadamente caras para justificar o uso com o gado leiteiro. Além disso, na medida em que elas tendem a amplificar traços genéticos específicos dentro de um rebanho, elas diminuem a diversidade genética dentro do rebanho, aumentando a severidade de certos surtos de doenças entre outros riscos. Dentre outras coisas, a presente invenção abrange o conhecimento de que tais técnicas, particularmente quando combinadas com estratégias de cruzamento, podem proporcionar vantagens significativas na criação de gado quando comparadas com as abordagens convencionais.

Tecnologias de Fertilização Embrionária [0064] Diversas técnicas foram desenvolvidas e refinadas para permitir que os seres humanos controlem e/ou afetem o acasalamento de animais opcionalmente sem o intercurso do animal (por exemplo, reprodução natural) ou mesmo contato animal. Exemplos de tais técnicas incluem, por exemplo, a fertilização in vitro, inseminação artificial, criopreservação (congelamento) de gametas ou embriões, indução de ovulações múltiplas, transferência de embriões, determinação de sexo do esperma ou de embriões, transferência nuclear, clonagem, e etc.

[0065] A produção in vitro de embriões de ruminantes é um processo de três etapas envolvendo a maturação dos oócitos, fertilização do oócito e cultura in vitro. Apenas 30-40% desses oócitos chegam ao estágio de blastocisto, na qual eles podem ser transferidos para uma fêmea receptora ou podem ser congelados para uso futuro. A qualidade do oócito pode impactar significativamente a percentagem de oócitos imaturos que formam blastocistos enquanto o ambiente de cultura pós-fertilização tem uma grande influência sobre a qualidade do blastocisto. Em alguns exemplos de realização, a utilização de esperma de um gênero específico juntamente com na produção in vitro de embriões é um meio potencialmente eficaz para se obter descendentes do sexo desejado. Preocupações a respeito do uso da tecnologia de sêmen sexado incluem a fertilidade aparente inferior do esperma separado, a sobrevivência inferior do esperma separado após a criopreservação e o número reduzido de espermatozóides que poderíam ser separados em um período de tempo especificado. Avaliação da qualidade do embrião é um desafio. A avaliação morfológica é atualmente o método mais popular para seleção de embriões antes da transferência. Outros métodos de avaliação não invasiva incluem a temporização da primeira divisão de divagem que tem sido associada à capacidade de desenvolvimento. A análise quantitativa da expressão gênica é uma valiosa ferramenta adicional para avaliar a viabilidade de embriões cultivados. Existe uma quantidade substancial de evidências que demonstram que as condições de cultura à qual o embrião é exposto, particularmente no período pós-fertilização, pode ter efeitos perturbadores sobre o padrão de expressão gênica no embrião com consequências potencialmente importantes a longo prazo.

[0066] A FIV é uma técnica na qual os oócitos são extraídos a partir de uma vaca doadora por um método de aspiração a partir do trato reprodutivo. Os oócitos selecionados são então incubados durante um período de 24 horas; isso é chamado de período de maturação. Após a maturação, os ovos são fertilizados entre 18 a 22 horas após a cocultura ser realizada. Os embriões ficam no meio até o sétimo dia, quando eles estão prontos para serem transferidos. Esta técnica tem três principais vantagens sobre a coleta de embriões in vivo convencional. Com a FIV não é necessário que seja induzida a superovulação nas vacas, nem é necessário sincronizá-las. Este é um avanço importante uma vez que as fêmeas doadoras não são expostas a hormônios que podem comprometer a solidez reprodutiva dos animais, e podem ser trabalhadas sem tempo de preparação prévio para o procedimento. A produção de embrião ocorre em média em cerca de 30% dos oócitos coletados, embora esta quantidade possa variar dependendo da raça, da vaca doadora, e também do acasalamento. Outra vantagem com a FIV é que os animais podem ser aspirado a cada 20 dias, ou invés de cada 60, como ocorre na coleta de embrião in vivo. A outra vantagem da FIV é que os animais podem ser coletados em uma idade muito jovem; isto irá criar um impacto significativo na seleção de melhoramento, uma vez que reduz o intervalo de geração entre os animais com um traço específico desejável.

[0067] A inseminação artificial (IA) foi usada para obter descendentes a partir de machos geneticamente superiores a mais de 200 anos. Métodos bem conhecidos para criopreservar (congelar) e armazenar esperma faz IA acessível a mais produtores de gado. No mesmo modo que a criopreservação do sêmen, o congelamento do embrião permite a comercialização mundial de animais com altas qualidades genéticas. Sêmen de touros é especialmente passível de congelamento e armazenamento de longo prazo. Na indústria de laticínios, onde um grande número de vacas leiteiras é intensamente manejado, a IA é simples, econômica e bem-sucedida. Mais de 60 por cento das vacas leiteiras nos Estados Unidos são criadas pela IA. Entretanto, a situação é diferente para o gado de corte, onde populações reprodutoras são normalmente mantidas em condições soltas ou no pasto. Na indústria de carne bovina dos Estados Unidos, a IA responde por menos de 5 por cento das inseminações.

[0068] O desenvolvimento de tecnologia de TE permite aos produtores obter uma progênie múltipla a partir de fêmeas geneticamente superiores. Embriões fecundados podem ser recuperados a partir de fêmeas (também chamadas de doadoras de embriões) de mérito genético superior por técnicas cirúrgicas ou não cirúrgicas. Os embriões geneticamente superiores são então transferidos para fêmeas (também chamadas receptoras de embrião) de menor valor genético. Em bovinos, técnicas eficientes podem recuperar embriões fecundados sem cirurgia, mas apenas uma ou duas vezes os embriões são produzidos durante cada ciclo reprodutivo normal. Para aumentar o número de embriões que podem ser recuperados a partir de fêmeas geneticamente superiores, o embrião doador é tratado com um regime hormonal para indução de múltiplas ovulações, ou superovulação.

[0069] A indústria de carne bovina dos Estados Unidos prefere bezerros machos, que tendem a ter pesos corporais mais elevados e maior eficiência alimentar (em comparação com bezerras ou novilhas), quando colocados em confinamento para as fases de crescimento e terminação de produção de carne. Em contraste, a indústria de laticínios prefere bezerras, o que acabará por produzir descendentes e leite para consumo humano. Assim, são necessários métodos para determinar o sexo do esperma ou embriões de modo que os produtores possam controlar o sexo da prole de seus animais.

[0070] Desde meados dos anos 80, a tecnologia foi desenvolvida para transferir o núcleo de qualquer um blastômero (células a partir embriões precoces em estágio de divagem presumivelmente indiferenciadas) ou uma célula somática (fibroblastos, pele, coração, nervos, ou outra célula do corpo) para um oócito enucleado (óvulo de fêmea não fertilizado com o núcleo removido). Esta “transferência nuclear” produz múltiplas cópias de animais que são cópias quase idênticas de outros animais (animais transgênicos, animais geneticamente superiores, ou animais que produzem elevadas quantidades de leite ou têm alguma outra característica desejável, etc). Este processo também é referido como clonagem. Até à data, a transferência de núcleos de células somáticas foi usada para clonar o gado, ovelhas, porcos, cabras, cavalos, mulas, gatos, coelhos, ratos e camundongos.

[0071] A técnica envolve a cultura de células somáticas a partir de um tecido apropriado (fibroblastos) do animal a ser clonado. Os núcleos das células somáticas em cultura são então microinjetados em um oócito enucleado obtido a partir de outro indivíduo da mesma espécie ou de uma espécie estreitamente relacionada. Através de um processo que ainda não é compreendido, o núcleo de células somáticas é reprogramado para um padrão de expressão gênica apropriada para levar ao desenvolvimento normal do embrião. Após nova cultura e desenvolvimento in vitro, os embriões são transferidos para uma fêmea receptora e, finalmente, resultam no nascimento da prole viva. A taxa de sucesso para a propagação de animais por transferência nuclear é muitas vezes inferior a 10 por cento e depende de muitos fatores, incluindo as espécies, fonte dos óvulos receptores, tipo de célula dos núcleos doadores, tratamento das células doadoras antes da transferência nuclear, técnicas usadas para a transferência nuclear, etc.

[0072] A presente divulgação demonstra a eficácia das tecnologias de criopreservação melhoradas para o congelamento e descongelamento de embriões de ungulados. A presente divulgação demonstra que tais tecnologias podem oferecer benefícios significativos para a indústria de gado leiteiro.

[0073] Em alguns exemplos de realização, os embriões preservados podem ser fornecidos para outras fazendas e empresas, por exemplo, para permitir que eles gerem descendentes e/ou rebanhos híbridos. Em alguns exemplos de realização, a presente invenção permite um método de negócio de triagem de gado híbrido e a recriação de gados híbridos de alto desempenho pela reprodução seletiva usando os gametas F0 de seus pais.

Crioprotetores [0074] Conforme cita no presente, a presente invenção fornece tecnologias para a criopreservação de embriões de bovinos e/ou para alcançar a fertilização com embriões criopreservados de bovinos. Em alguns exemplos de realização, os crioprotetores para uso de acordo com a presente invenção são ou compreendem crioprotetores intracelulares. Em alguns exemplos de realização, os crioprotetores para uso de acordo com a presente invenção são ou compreendem crioprotetores extracelulares. Em alguns exemplos de realização, os crioprotetores exemplares (por exemplo, para uso como agente crioprotetor intracelular) podem ser ou compreender: dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, polietileno glicol (PEG), e combinações dos mesmos. Em alguns exemplos de realização, os crioprotetores exemplares (por exemplo, para uso como agente crioprotetor extracelular) podem ser ou compreender: sacarose, trealose, dextrose, e combinações das mesmas. Em alguns exemplos de realização específicos, os crioprotetores para uso de acordo com a presente invenção podem ser ou compreender propileno glicol.

Estágios de Desenvolvimento Embrionário [0075] Em alguns exemplos de realização, os embriões podem ser criopreservados em vários estágios de desenvolvimento. Em alguns exemplos de realização, os embriões podem ser criopreservados em uma fase de desenvolvimento selecionada a partir do grupo que consiste de: mórula, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido. Após a formação do blastocisto, o embrião está preparado para a implantação na parede uterina. Em alguns exemplos de realização, a fase de blastocisto inicial é caracterizada pelo fato de que uma cavidade está começando se formar e as células de blastocistos ainda não são distinguíveis. Em alguns exemplos de realização, a fase de blastocisto expandido é caracterizada por uma cavidade totalmente formada.

Dispositivos para a Criopreservacão [0076] A presente invenção provê dispositivos para criopreservação de embriões. Em alguns exemplos de realização, os dispositivos compreendem um embrião criopreservado em solução de criopreservação posicionado dentro de uma primeira região dentro do dispositivo, em que primeira região é flanqueada pela: segunda e terceira regiões, cada uma delas constituídas por ar, em que a segunda e terceira regiões são flanqueados pela: quarta e quinta regiões, cada um delas contendo soluções de descongelamento, em que a quarta e quinta regiões são flanqueadas pela: sexta e sétima regiões, cada uma delas constituída por ar, em que a sexta e sétima regiões são flanqueadas pela: oitava e nona regiões, e cada um delas contendo soluções de descongelamento. Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê uma pluralidade dos dispositivos de embriões para criopreservação.

[0077] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê uma pluralidade de dispositivos para a criopreservação de embriões. Em alguns exemplos de realização, cada pluralidade de dispositivos contém um embrião de um único acasalamento.

[0078] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção fornece métodos que compreendem as etapas de fazer uma pluralidade de embriões; a criopreservação da pluralidade de embriões; e a transferência dos embriões com uma taxa de concepção de cerca de 40%. Em alguns exemplos de realização, os embriões são opcionalmente armazenados por um período de tempo entre a criopreservação e transferência para o gado receptor. Em alguns exemplos de realização, o período de tempo entre a criopreservação e a transferência para o gado receptor pode ser de minutos, horas, dias, semanas, meses, anos ou mais (por exemplo, múltiplos dos mesmos). Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados por um período de tempo inferior a cerca de 40 anos, cerca de 35 anos, cerca de 30 anos, cerca de 25 anos, cerca de 20 anos, cerca de 15 anos, cerca de 10 anos, cerca de 9 anos, cerca de 8 anos, cerca de 7 anos, cerca de 6 anos, cerca de 5 anos, cerca de 4 anos, cerca de 3 anos, cerca de 2 anos, ou cerca de um ano. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 12, cerca de 11, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2, cerca de 1 mês ou menos. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 6 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 2 semanas, cerca de 1 semana, ou menos. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 7 dias, cerca de 6 dias, cerca de 5 dias, cerca de 4 dias, cerca de 3 dias, a cerca de 2 dias, ou cerca de 1 dia. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 24 horas, cerca de 20 horas, cerca de 16 horas, cerca de 12 horas, cerca de 8 horas, cerca de 4 horas, cerca de 3 horas, cerca de 2 horas, ou cerca de 1 hora. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 60 minutos, cerca de 50 minutos, cerca de 40 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 5 minutos, cerca de 4 minutos a cerca de 3 minutos, cerca de 2 minutos, ou cerca de 1 minuto.

[0079] Em alguns exemplos de realização, os embriões podem ser armazenados por minutos, dias ou anos antes de serem transferidos para o gado receptor. Em alguns exemplos de realização, o período de tempo em que os embriões podem ser armazenados pode ser de minutos, horas, dias, semanas, meses, anos ou mais (por exemplo, múltiplos dos mesmos). Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados por um período de tempo inferior a cerca de 40 anos, cerca de 35 anos, cerca de 30 anos, cerca de 25 anos, cerca de 20 anos, cerca de 15 anos, cerca de 10 anos, cerca de 9 anos, cerca de 8 anos, cerca de 7 anos, cerca de 6 anos, cerca de 5 anos, cerca de 4 anos, cerca de 3 anos, cerca de 2 anos, ou cerca de um ano. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 12, cerca de 11, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2, cerca de 1 mês ou menos. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 6 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 2 semanas, cerca de 1 semana, ou menos. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 7 dias, cerca de 6 dias, cerca de 5 dias, cerca de 4 dias, cerca de 3 dias, a cerca de 2 dias, ou cerca de 1 dia. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 24 horas, cerca de 20 horas, cerca de 16 horas, cerca de 12 horas, cerca de 8 horas, cerca de 4 horas, cerca de 3 horas, cerca de 2 horas, ou cerca de 1 hora. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 60 minutos, cerca de 50 minutos, cerca de 40 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 5 minutos, cerca de 4 minutos a cerca de 3 minutos, cerca de 2 minutos, ou cerca de 1 minuto.

[0080] Em alguns exemplos de realização, a etapa de criopreservação compreende a realização da criopreservação em um dispositivo. Os embriões podem ser criopreservados dentro de dispositivos de acordo com métodos divulgados na presente invenção. Em alguns exemplos de realização, a etapa de criopreservação compreende a criopreservação de uma pluralidade de embriões, cada um no seu próprio dispositivo, de modo a que um conjunto de dispositivos é gerado. Em alguns exemplos de realização, uma pluralidade de dispositivos é mantida durante um primeiro período de tempo. Em alguns exemplos de realização, após o primeiro período de tempo, pelo menos um embrião é transferido para o gado receptor; e, opcionalmente, os embriões restantes são mantidos durante um segundo período de tempo. Em alguns exemplos de realização, o período de tempo pode ser de até 40 anos. Em alguns exemplos de realização, os embriões podem ser armazenados por minutos, dias ou anos antes de serem transferidos para o gado receptor. Em alguns exemplos de realização, o segundo período de tempo em que os embriões podem ser armazenados pode ser de minutos, horas, dias, semanas, meses, anos ou mais (por exemplo, múltiplos dos mesmos). Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados por um período de tempo inferior a cerca de 40 anos, cerca de 35 anos, cerca de 30 anos, cerca de 25 anos, cerca de 20 anos, cerca de 15 anos, cerca de 10 anos, cerca de 9 anos, cerca de 8 anos, cerca de 7 anos, cerca de 6 anos, cerca de 5 anos, cerca de 4 anos, cerca de 3 anos, cerca de 2 anos, ou cerca de um ano. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 12, cerca de 11, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2, cerca de 1 mês ou menos. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 6 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 2 semanas, cerca de 1 semana, ou menos. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 7 dias, cerca de 6 dias, cerca de 5 dias, cerca de 4 dias, cerca de 3 dias, a cerca de 2 dias, ou cerca de 1 dia. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 24 horas, cerca de 20 horas, cerca de 16 horas, cerca de 12 horas, cerca de 8 horas, cerca de 4 horas, cerca de 3 horas, cerca de 2 horas, ou cerca de 1 hora. Em alguns exemplos de realização, os embriões são armazenados durante um período de tempo inferior a cerca de 60 minutos, cerca de 50 minutos, cerca de 40 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 5 minutos, cerca de 4 minutos a cerca de 3 minutos, cerca de 2 minutos, ou cerca de 1 minuto.

[0081] Em alguns exemplos de realização, o dispositivo compreende um receptáculo para conter um ou mais embriões criopreservados. Em alguns exemplos de realização do receptáculo compreende regiões ou câmaras para a contenção de embriões em solução flanqueadas por bolhas de ar. Em alguns exemplos de realização o receptáculo compreende regiões ou câmaras para a separação de embriões a partir de outros embriões. Em alguns exemplos de realização, o receptáculo compreende uma palheta (cilindro).

Exemplos [0082] O objetivo deste estudo foi comparar as taxas de gravidez obtida após a TE PIV de embriões bovinos frescos, vitrificados ou congelados por transferência direta. Oócitos (n=3171) recuperados pela Aspiração Folicular Ovariana (OPU) de fêmeas Girolando foram selecionados e submetidos à maturação in vitro (MIV) durante 24 horas a 38,5 SC com 5% de C02 em ar e umidade saturada. A FIV foi feita com sêmen sexado descongelado, realizada com 5 touros da raça Holstein. Após a FIV, os oócitos foram desnudados e cultivados por sete dias sob as mesmas condições de temperatura e umidade da MIV e a FIV, mas com 5% de C02 e 5% de 02. Embriões grau I em estágios de BL ou BX foram transferidos a fresco, vitrificados ou congelados para transferência direta (TD). Os embriões foram transferidos para recipientes previamente sincronizados. As taxas de concepção obtidas foram de 51,35% (133/259) em embriões frescos, 34,62% (84/234) nos vitrificados e 42,11% (96/228) nos embriões de transferência direta. O nível de probabilidade de p < 0,05 foi considerado significativo. As taxas obtidas a partir dos embriões de PIV vitrificados e de transferência direta indicam que a criopreservação de embriões PIV produz resultados semelhantes aos obtidos após a transferência de embriões PIV frescos. Isso destaca os aspectos positivos da possibilidade da criopreservação de embriões PIV com a conveniência da transferência direta.

Exemplo 1 Materiais e Métodos [0083] Exceto quando indicado de outra forma, todos os reagentes foram adquiridos a partir da Sigma (St. Louis, MO, EUA). Os procedimentos de aspiração folicular, maturação in vitro e fertilização in vitro descrito nos Exemplos 1-3 foram utilizados nos Exemplos 4 e 5.

Exemplo 2 Coleta de Oócitos e Maturação In Vitro [0084] O trabalho foi conduzido pela realização da Aspiração Folicular Ovariana guiada por ultrassom (OPU - Ovum pick-up) de 112 óvulos em 36 fêmeas doadoras 1/2 sangue do cruzamento das raças Gir e Holstein. Após a sessão de aspiração, os oócitos (n = 3171) foram lavados em meio TCM-199 (Gibco BRL, Grand Island, NY) tamponado com Hepes suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) (GIBCO BRL; Grand Island, NY), 0,20 mM de piruvato de sódio e 83,4 mg/mL de amicacina (BIOCHIMICO Institute, Rio de Janeiro, Brasil). Os oócitos foram pré-selecionados e classificados em um laboratório móvel montado na fazenda. Após a seleção dos oócitos, eles foram transportados para o laboratório em um tubo de poliestireno BD Falcon de 5 mL contendo 400 pL de meio TCM-199 suplementado com 10% de FBS, 1 mg/mL de FSH (Folltropin™, Bioniche Animal Health, Belleville, Ont., Canadá), 50 mg/mL de hCG (Profasi™, Serono, São Paulo, Brasil) e estradiol (1 mg/mL), piruvato de sódio 0,20 mM e 83,4 mg/mL de amicacina, coberto por 350 uL de óleo mineral. Os oócitos recuperados foram transportados para o laboratório localizado em Mogi Mirim/SP e mantidos no mesmo tubo de transporte com meio de maturação por 24 horas, a contar do momento em que a OPU foi realizada.

Exemplo 3 Preparação de Sêmen e Fertilização In Vitro (FIV) [0085] A FIV foi realizada com sêmen de touros da raça Holstein (n=5) sexuado para o sexo feminino. O sêmen foi descongelado (35 QC durante 30 seg) e lavado duas vezes por centrifugação (6000 rpm durante 5 min) em 1 mL de TALP suplementado com 0,2 mM de piruvato e 83,4 g/mL de amicacina, tamponado com Hepes 10 mM. A concentração de sêmen foi ajustada para 2x106 espermatozóides (sptz) móveis/mL. A dose inseminação foi de dez microlitros (105 sptz) adicionada a cada gota de 50 uL de TALP-FIV (TALP suplementado com 10 g/mL de heparina, 18 M de penicilamina, 10 M e 8 M de hipotaurina e epinefrina) sob óleo mineral. Mais tarde, foram adicionados 25-30 oócitos em cada gota. A incubação foi feita em incubadora durante 20-24 horas ajustada a 38,5 SC com 5% de CO2 e umidade máxima no ar.

Exemplo 4 Experimento I - Embriões PIV Frescos Transferidos Após Cultura Na Presença ou Ausência de Soro Bovino Fetal (FBS) Cultura ín vitro (C\V) de embriões [0086] Oócitos (n=665) foram coletados por aspiração folicular guiada por ultrassom a partir de doadores Girolando (n = 25). Estes foram submetidos à fertilização in vitro com sêmen sexado do touro Holstein, com distribuição aleatória dos oócitos entre os grupos.

[0087] Grupo com FBS - prováveis zigotos (n = 303) foram cultivadas em gotas de 100 pL de SOF (fluido sintético do oviduto) (Wells, 1999 et ai), suplementado com 2,5% de FBS + 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) sob óleo mineral. No terceiro dia (D3) e no dia cinco (D5) da CIV a substituição de 50% do volume das gotas por um meio novo (“alimentação”) foi realizada. O mesmo meio de cultura da “alimentação” foi usado no desenvolvimento do embrião precoce.

[0088] Grupo sem FBS - prováveis zigotos (n=362) foram cultivados em 100 pL de gotas de SOF modificado sem utilizar FBS e suplementado apenas com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) + 10 μΜ de EDTA sob óleo mineral. No terceiro dia (D3) e no dia cinco (D5) da CIV a substituição de 50% do volume das gotas por um meio novo (“alimentação”) foi realizada. O mesmo meio de cultura da “alimentação” foi usado no desenvolvimento do embrião precoce.

[0089] Após 7 dias de cultura, os embriões de Grupos com FBS (n = 82) ou sem FBS (n = 88) foram transferidos a fresco em vacas receptoras previamente sincronizadas. As fêmeas foram utilizadas como receptoras no primeiro terço da lactação. Para a sincronização das receptoras, o seguinte protocolo foi utilizado: - Dia zero (D0) - 2 mg de benzoato de estradiol (Sincrodiol®) + colocação do implante intravaginal (CIDR®) - Dia sete (D7) - 5mL de Prostaglandina F2a (Lutalyse®) - Dia nove (D9) - remoção do implante e aplicação de 1 mg de cipionato de estradiol (ECP®) - Dia dezoito (D18) - Transferência de Embriões [0090] No Experimento 1, as taxas de concepção foram comparadas em embriões cultivados em dois meio diferentes, suplementados ou não com FBS. Como pode ser observado na Tabela 1, não houve diferença entre os dois grupos. Este exemplo demonstra que os embriões frescos cultivados em meio suplementado com FBS tem viabilidade e taxas de concepção semelhante aos de embriões não cultivados em FBS.

Tabela 1 Taxa de concepção de embriões frescos transferidos, cultivados com ou sem FBS. a p < 0.05 Exemplo 5 Comparação das Taxas de Concepção de Embriões PIV Transferidos a Fresco, Vitrificados ou Congelados para Transferência Direta Cultura in vitro(CN) de embriões [0091JSeguindo os procedimentos descritos nos Exemplos 2 e 3, prováveis zigotos foram cocultivados (grupos aleatórios de 25 oócitos por gota) em incubadora (38,5 SC com 5% de CO2 e umidade máxima no ar) com células da granulosa. Os embriões para transferência a fresco ou sob vitrificação foram cultivados em gotas de 100 μΙ_ de SOF (Wells et ai, 1999) suplementado com 2,5% de FBS + 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) sob óleo mineral. No terceiro dia (D3) e no dia cinco (D5) da CIV a substituição de 50% do volume das gotas por um meio novo (“alimentação”) foi realizada. O mesmo meio de cultura da “alimentação” foi usado no desenvolvimento do embrião precoce. A taxa de divagem foi avaliada no terceiro dia de cultura (D3).

[0092] Embriões para transferência direta foram cultivados em 100 pl_ de SOF modificado sem FBS e suplementado apenas com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) + 10 μΜ de EDTA sob óleo mineral. No terceiro dia (D3) e no dia cinco (D5) da CIV a substituição de 50% do volume das gotas por um meio novo (“alimentação”) foi realizada. O mesmo meio de cultura da “alimentação” foi usado no desenvolvimento do embrião precoce. A taxa de divagem foi avaliada no terceiro dia de cultura (D3).

[0093] Ao final do período de cultura (D7), os blastocistos expandidos classificados como grau 1 foram carregados e transferidos a fresco para receptoras previamente sincronizadas. Na ausência de receptoras disponíveis para todos os embriões produzidos, os embriões excedentes foram vitrificados, seguindo 0 protocolo descrito em Sanches et al. (2013) ou congelados para posterior transferência direta.

VlTRIFICACÃO DO EMBRIÃO

[0094] Neste trabalho, os embriões foram criopreservados para o método de vitrificação de acordo com o protocolo descrito anteriormente por Sanches et ai, 2013.

[0095] Resumidamente, embriões (Bx, n=234) foram expostos durante 1 min a uma solução de equilíbrio (SE = 10% EG) + 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e em seguida 20 segundos em solução de vitrificação (VS = 20% EG + 20% DMSO). Durante os 20 segundos de exposição à solução de vitrificação, os embriões foram alojados em Cryotop® (Kitazato - Shizuoka - Japão), três a cinco embriões por Cryotop e imediatamente colocados em nitrogênio líquido. A vitrificação do embrião foi baseada na técnica Cryotop, descrita por Kuwayama et ai (2005). Esta metodologia utiliza o conceito de volume mínimo, em que os embriões são colocados em um filme de plástico muito fino anexado a uma vareta de plástico usada para facilitar o manuseio. As soluções de vitrificação utilizadas foram preparadas em placas de quatro poços (NUNC S/A, Roskilde, Dinamarca). O meio TCM-HEPES (TCM-199 + Hepes 25 mM + 10% de FBS) foi a base para a preparação de soluções contendo EG e DMSO, e estes foram acrescentados somente no momento da utilização. Em ambos os grupos, a solução de equilíbrio (ES) foi suplementada com 20% FBS e solução de vitrificação (VS) foi adicionada a 0,5 M de sacarose. Em primeiro lugar, os embriões foram colocados em meio de manutenção (TCM-HEPES), onde foram removidos (três a cinco cada) e passados para o poço 1 contendo o ES. Nesta solução, os embriões foram mantidos durante um minuto e logo depois foram transferidos para o poço 2, contendo a VS, que foram expostas durante 20 segundos. Assim, os embriões foram imediatamente pipetados e alojados na película de plástico na ponta do Cryotop e a amostra foi imersa em nitrogênio líquido.

Descongelamento de embriões vitrificados [0096] Para o descongelamento de embriões vitrificados, Cryotops contendo os embriões foram expostos ao ar durante quatro segundos e, em seguida, mergulhados durante a solução de aquecimento (TCM-Hepes + sacarose 0,3 molar) a uma temperatura aproximada de 35 SC. A remoção da solução de vitrificação foi feita com dois tempos de exposição (5 minutos cada) em gradientes de 0,3 M e 0,15M de sacarose, respectivamente, antes de passar para o meio de manutenção TCM-Hepes (Vieira et ai, 2002; Mezzalira et ai, 2004).

Congelamento lento de embriões [0097] No total, os embriões (n = 228) foram criopreservados pelo método de congelamento lento anteriormente descrito para os embriões obtidos in vivo (Voelkel e Hu, 1992). Blastocisto e blastocisto expandido foram expostos à solução de congelamento (SC - Solução de congelamento), que consiste em 1,5 M de etileno glicol durante 10 minutos. A placa com a SC e os embriões permaneceram na placa aquecida a 35 QC durante este período. Os embriões foram carregados em palhetas de 0,25 ml_, e o embrião foi colocado sobre uma coluna central, consistindo de uma solução 1,5 M de etileno glicol, flanqueada por quatro colunas de solução de descongelamento (SD - Solução de Descongelamento), intercaladas com colunas entre elas (Figura 1). A solução de descongelamento (SD) era composta por 0,75 M de EG. O EG 1,5 M foi diluído em DPBS (Nutricell - Campinas - Brasil) na proporção 1:1. Após ser carregado, os embriões foram colocados na máquina de congelamento (TK 1000® - Uberaba - Brasil), previamente estabilizada a -6 QC. Dois minutos após ter sido colocado na máquina, foi feita a cristalização (“seeding”) das colunas imediatamente acima e abaixo da coluna do embrião. Os embriões foram mantidos durante 10 minutos a -6 QC.

[0098] A curva de congelamento foi iniciada baixando a temperatura a 0,5 sC/minuto até atingir um nível de -32 SC. Ao final da curva de congelamento os embriões foram imersos diretamente em nitrogênio líquido, onde foram armazenados antes de serem transferidos para a receptora. Vide também a Fig. 2A para uma visão geral.

Descongelamento e transferência direta [0099] No momento da transferência dos embriões criopreservados para transferência direta, os embriões foram removidos do nitrogênio líquido, expostos ao ar em temperatura ambiente durante 10 segundos e, em seguida, imersos em água quente a 35 SC durante 30 segundos. A palheta foi seca com toalhas de papel e agitada suavemente até que as 5 colunas no interior estivessem misturadas. O objetivo era de que as 4 colunas com solução de descongelamento fossem misturadas com a solução da coluna de congelamento, para a reidratação já ter início dentro da palheta. Após misturar as colunas, o embrião foi transferido para o corno uterino da receptora. Vide também a Fig. 2B para uma visão geral.

[00100] As fêmeas usadas como receptoras para embriões frescos, vitrificados ou transferência direta estavam no primeiro terço da lactação. O protocolo de sincronização foi o mesmo utilizado no Exemplo 4.

Análise estatística [0100] As taxas de Concepção aos 30 e 60 dias foram analisadas por regressão logística binomial do programa IBM SPSS Statistics versão 22 (IBM Inc., Armonk, NY), considerando as variáveis do protocolo de sincronização, idade da receptora, categoria animal (lactante ou seca) e touro utilizado na fertilização in vitro como efeitos fixos. O nível de probabilidade p < 0,05 foi considerado significativo.

Resultados [0101 ] No Exemplo 5, as taxas de concepção foram comparadas nos dias 30 e 60 de embriões frescos transferidos, vitrificados ou congelados para transferência direta (Tabela 2). Neste caso, havia uma diferença entre a taxa de concepção de embriões transferidos a fresco 51,35% (133/259) em comparação com ambos os grupos com embriões criopreservados. Entretanto, não houve diferença (p <0,05) nas taxas de concepção de embriões vitrificados 34,62% (84/234) em comparação com embriões de transferência direta 42,11% (96/228).

[0102] Tabela 2. Comparação entre a taxa de concepção nos dias 30 e 60 de embriões PIV transferidos a fresco, vitrificados ou congelados para transferência direta e a porcentagem de perdas fetais ocorridas nos 3 grupos no mesmo período.

Tabela 2 a b p < 0,05 Discussão [0103] Comparações das taxas de concepção de embriões PIV transferidos a fresco, vitrificados ou congelados para transferência direta estão detalhadas. Este é o primeiro estudo desse tipo, especialmente quanto ao número consistente de embriões transferidos em gado indicus-taurus.

[0104] Os dados apresentados por Perry (2014) para o ano de 2013 mostraram que apenas 8,9% dos embriões PIV transferidos em todo o mundo eram criopreservados. Sem a pretensão de se limitar a qualquer teoria específica, propomos que esta baixa taxa pode ser devido a uma maior sensibilidade e/ou viabilidade inferior (por exemplo, quando expostos a revitalização do embrião e/ou tecnologias de transferência) destes embriões criopreservados em comparação com os embriões frescos; esta baixa taxa é um aspecto limitante no uso desta tecnologia para a maioria dos laboratórios comerciais (George, 2008). No entanto, devido ao crescente número de embriões PIV produzidos, tornou-se crucial encontrar estratégias adequadas para a criopreservação de embriões in vitro.

[0105] O mundo dispõe de mais de 90% dos embriões produzidos in vitro (Perry, 2014), o que reflete uma perda mais ampla, ao considerar o material genético, suprimentos, materiais e mão de obra. Além disso, as logísticas de administração de embriões para os receptores tornam-se mais críticas quando há uma exigência em se trabalhar apenas com embriões frescos. Por todas estas desvantagens, o descarte de embriões excedentes aumenta o custo da técnica e o torna menos rentável e competitivo. De acordo com PONTES, (2013), a In Vitro Brazil Company dispensou cerca de 25.000 embriões PIV, entre os anos de 2002 a 2008, porque não havia um protocolo de criopreservação bem estabelecido.

[0106] Além dos desafios associados com a criopreservação e/ou utilização de embriões criopreservados, parece haver também uma considerável lacuna nas técnicas adaptadas a diferentes tipos de raça bovina. Sabe-se que há diversas diferenças reprodutivas entre os animais taurus e indicus. Por exemplo, uma diferença são as características das organelas. Trabalhando com embriões in vivo, Visintin et al. (2002) demonstraram características específicas entre embriões de Bos indicus e Bos taurus, especialmente na quantidade de lipídio intracitoplasmático. Considerando as condições climáticas e geográficas do Brasil, o objetivo desse estudo foi realizado usando embriões provenientes de uma manada leiteira taurus-indicus, composta por doador Girolando. Essa raça cruzada é responsável por 80% da produção de leite no Brasil, devido à sua boa adaptação para a produção de leite em pasto e com menor custo (Girolando, 2015).

[0107] O interesse na produção de embriões de fêmeas Girolando resultou em várias publicações nos últimos anos. Pontes et al. (2010) compararam a produção de embriões em aspirações foliculares realizadas no doador Holstein, Gir e Gir. Neste estudo, observou-se uma maior produção de embriões/aspiração em vacas da raça Gir do que na Holstein (3,2 vs. 2,2, respectivamente). No entanto, a produção de embriões em média duas vezes mais alta (5,5 blastocistos) na Girolando quando comparada com as outras duas raças. A presente revelação reconhece que tais desempenhos superiores em embriões PIV de taurus indicus permite o desenvolvimento de melhores tecnologias de criopreservação embrionárias, por exemplo, à luz da abundância de amostras em experimentos de viabilidade e obtenção de gravidez.

[0108] Embriões PIV são menos crio-tolerantes quando comparados com embriões in vivo (Abe et al., 2002) e as causas desse aumento da sensibilidade foram atribuídas principalmente a uma maior acumulação de lipídios intracelulares encontrados no citoplasma de embriões PIV (Abe et al, 2002; Rizos et al, 2002; Sudano et al., 2011). Neste contexto, o soro bovino fetal (FBS), como um suplemento para o meio utilizado na cultura, foi identificado como o responsável pela sobrevivência embrionária inferior após o congelamento (Diez et al, 2001; Abe et al, 2002; Lonergan et al., 2003). Entretanto, a maior concentração de gotículas lipídicas intracitoplamáticas não pode ser considerada como único fator prejudicial à criopreservação, o problema é multifatorial, e envolve o rigoroso controle de qualidade em todas as fases da PIV na obtenção de um embrião de qualidade com o objetivo de ser criopreservado (Sudano et ai, 2013).

[0109] No Exemplo 4, aspirações foliculares foram realizadas no mesmo grupo de doadores e os embriões foram cultivados na ausência ou presença de FBS. O objetivo foi comparar as taxas de gravidez em ambos os grupos (com ou sem FBS) em embriões transferidos a fresco. Existem algumas divulgações (George et al., 2008) de maior alongamento do feto e disco embrionário mais evidente nos embriões PIV cultivados com BSA, em comparação com os embriões cultivados com FCS (soro fetal de vitela).

[0110] Comparações diretas entre esses trabalhos foram valiosas, por exemplo, pelo fato de que a maioria dos outros trabalhos avaliam apenas as taxas de reexpansão e eclosão dos embriões, não abordando a transferência dos embriões produzidos. Além disso, existem várias diferenças entre a composição do meio de cultura e condições de cultura em cada um destes estudos.

[0111] Nos estudos descritos no Exemplo 4, não foi observada diferença na gravidez (P <0,05) entre os grupos, o que permitiu-nos concluir que a dispensa do FBS para o cultivo in vitro resultou em um número de gravidez consistente com a não utilização de FBS.

[0112] A presente divulgação aprecia que, além da consideração do FBS e condições de cultura, há outro aspecto importante a ser considerado: o crioprotetor. Protocolos de criopreservação devem evitar a formação de cristais de gelo intracelulares e tentar minimizar o estresse tóxico e osmótico para as células durante o congelamento (Campos-Chillón et al., 2006). Assim, muitos dos agentes crioprotetores, tais como glicerol e etileno glicol (EG) são tóxicos para os embriões (Dochi et al., 1988). A diminuição do tempo em que o embrião é exposto a estes agentes crioprotetores antes do congelamento e após o descongelamento, pode reduzir os efeitos tóxicos, conseguindo-se assim maior viabilidade do embrião pós-descongelamento (Sommerfield e Niemann, 1999).

[0113] No início dos anos 1990, Voelkel e Hu (1992) demonstraram que a utilização de etileno glicol como um agente crioprotetor pode ser uma alternativa para a transferência direta de embriões congelados e descongelados, com taxas de concepção ligeiramente mais baixas do que aquelas alcançadas com embriões frescos (Voelkel Hu, 1992, Leibo e Mapletoft, 1998). O método de transferência direta permite a etapa de reidratação em células embrionárias após o descongelamento, podendo ser simplificada e desse modo tornando o método mais acessível e fácil de ser realizado no campo. Então, uma vez que a transferência direta tem sido amplamente aceita para o congelamento de embriões produzidos in vivo, coletados a partir de doadores superovulados.

[0114] Entretanto, para os embriões PIV, o método mais utilizado para o congelamento de embriões PIV é a vitrificação (Morató e Mogas, 2014), principalmente devido à velocidade de congelamento e baixo custo. Isto torna a transferência do embrião uma tecnologia muito mais eficiente, não mais dependendo da disponibilidade de receptoras sincronizadas. Qualquer que seja o método de congelamento, vitrificação ou transferência direta, as taxas de concepção são menores do que as obtidas com embriões frescos (Leibo e Mapletoft, 1998). A desvantagem da vitrificação é a necessidade de um embriologista qualificado para desempenhar o reaquecimento dos embriões, que está além da estrutura mínima necessária para um laboratório - o que complica ainda mais a sua aplicação no campo e em grande escala (Morató e Mogas, 2014).

[0115] No presente estudo, foi utilizado o protocolo de congelamento lento (transferência direta) de embriões com 1,5 M de etileno glicol como crioprotetor para os embriões. No entanto, em experimentos realizados anteriormente por nosso grupo, descobrimos que quando os embriões foram congelados na coluna central em 1,5 M de etileno glicol e as colunas laterais eram compostas apenas de DPBS, os embriões tiveram menores taxas de eclosão após o descongelamento. Não pretendendo se limitar por qualquer teoria específica, propomos que uma das explicações para as nossas observações foi de que os embriões estavam sendo reidratados muito rapidamente quando em contato direto com o DPBS pós-descongelamento.

[0116] Nós escolhemos examinar a utilização de uma solução de descongelamento composta de 0,75 M de etileno glicol, dispostas em quatro colunas em ambos os lados do embrião. Desta forma, o influxo de água para as células embrionárias poderia ocorrer mais lentamente, mantendo a sua integridade. Uma estratégia semelhante foi apresentada para o congelamento de embriões in vivo, utilizando colunas laterais para o embrião, consistindo de uma solução chamada de “meio de manutenção”, composta de 0,37 M de etileno glicol (Voekel e Hu, 1992). Neste trabalho, a taxa de gravidez para o grupo experimental foi a mesma que para o grupo controle (50%). Apesar das taxas de gravidez serem relativamente baixas, em torno de 40%, é importante considerar que embriões in vivo suportam níveis de estresse mais baixos para seus desenvolvimento e proporcionam maiores taxas de gravidez. A estratégia de embalar embriões de taurus indicus produzidos in vitro pode, portanto, ser considerada bem sucedida.

[0117] Outro ponto importante observado nesses estudos foi a menor taxa de sobrevivência embrionária após o congelamento quando os embriões PIV foram criopreservados em fase de mórula compacta, em comparação com embriões classificados como blastocisto e blastocisto expandido. Resultados semelhantes foram encontrados por autores que avaliaram a taxa de eclosão nos estágios de mórula e blastocisto, como um indicador de sobrevivência embrionária após a criopreservação pelo método lento (Pollard e Leibo, 1993), mas não há consenso sobre qual a melhor fase para a criopreservação de embriões (Saragusty e Arav, 2011).

[0118] A taxa de concepção aos 30 dias de embriões PIV transferidos a fresco (51,4%) foi maior (P> 0,05) do que a obtida com embriões PIV criopreservados por vitrificação (34,6%) e de transferência direta (40,19%). Estes resultados foram superiores aos obtidos por Lim et al. (2008), que transferiram embriões PIV cultivados na ausência de FBS e criopreservados por congelamento lento (22,9%) e também mais elevada do que os embriões PIV criopreservados por vitrificação usando a técnica de vitrificação em palhetas abertas estendidas (OPS - Open Pulled Straw) (Vajta etal., 1998).

[0119] Não pretendendo se limitar a qualquer teoria específica, propomos que uma combinação do cultivo sem FBS juntamente com uma estratégia de carregamento para o posicionamento de embriões dentro de dispositivos de palheta pode ser a razão pela qual nosso protocolo foi bem sucedido. A taxa de concepção aos 60 dias de gestação também foi avaliada, com resultados maiores (P > 0,05) nos embriões transferidos a fresco (43,2%) e foram semelhantes quando comparados aos resultados publicados por Hasler et al. (1995), que obtiveram taxa de 42% de embriões PIV de taurus transferidos no dia 7 após a fertilização.

[0120] Estes achados demonstram a superioridade de certas metodologias de transferência direta (por exemplo, congelamento lento), em comparação com a de vitrificação, tal como realizado na presente invenção. Em alguns exemplos de realização da presente invenção, pode ser desejável fazer um banco de embriões (por exemplo, utilizando as tecnologias de transferência direta/congelamento lento), por exemplo, que pode ser mantido em um primeiro local (por exemplo, onde foi produzido). Em alguns exemplos de realização, a transferência de tais embriões mantidos pode se revelar mais prática do que o uso das tecnologias de vitrificação.

[0121] Em alguns exemplos de realização, as tecnologias descritas na presente invenção utilizam sêmen submetido à separação de gênero; a PIV é geralmente considerada o método que permite a maior eficiência de uso de sêmen submetido à separação de gênero, particularmente valioso na pecuária leiteira.

[0122] Em alguns exemplos de realização, uma ou mais variações ou aperfeiçoamentos podem ser empregadas, por exemplo, para reduzir as taxas de perda embrionárias precoces observadas em certos estudos descritos no presente (por exemplo, quando se comparam gravidezes nos dias 30 e 60).

[0123] Entre outras coisas, a presente divulgação provê conquistas e avanços na obtenção de gravidez através da criopreservação de embriões PIV. Concluímos que embriões de taurus-indicus produzidos in vitro podem fornecer taxas de gravidez em torno de 40% após a criopreservação por vitrificação ou métodos de congelamento lento/transferência direta. Os técnicos hábeis no assunto, pela leitura da presente divulgação, compreenderão que pela aplicação dos seus ensinamentos a diferentes contextos (por exemplo, diferentes raças, diferentes espécies, diferentes subespécies, diferentes cruzamentos e/ou híbridos, etc.) será razoavelmente esperado que consigam taxas de gravidez de pelo menos cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, ou cerca de 50%, em cada caso, substancialmente mais elevadas do que aquelas observadas normalmente (por exemplo, cerca de 9%) com as atuais tecnologias.

[0124] É particularmente interessante notar que as tecnologias descritas na presente invenção, especialmente para melhorar e/ou capacitar (por exemplo, permitir a realização de taxas de gravidez de pelo menos 30%) estratégias eficazes de congelamento lento/transferência direta, representam um importante passo para que a produção in vitro de embriões se torne uma biotecnologia de utilização mais ampla na pecuária.

Equivalentes [0125] Os técnicos hábeis no assunto irão reconhecer, ou serão capazes de verificar pelo uso de não mais do que a experimentação de rotina, que existem muitos equivalentes para os exemplos de realizações específicos da presente invenção. O escopo da presente invenção deve ser limitado à descrição acima, ao invés disso é definido conforme estabelecido nas reivindicações a seguir.

Reivindicações

Claims (42)

1. MÉTODO, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - obtenção de embriões de ungulados produzidos in vitro (PIV) - criopreservação dos embriões; e - transferência dos embriões para a implantação em ungulados receptores, sendo a criopreservação e a transferência realizadas de modo a sejam alcançadas taxas de gravidez de cerca de pelo menos 10%.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de obtenção de embriões produzidos in vitro compreende as etapas de: - recuperação de oócitos a partir de fêmeas; - maturação in vitro dos oócitos; - fertilização dos oócitos maduros com sêmen de modo que zigotos são gerados; e - desnudamento e cultivo dos zigotos.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o sêmen é sêmen submetido à separação de gênero.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o sêmen não é um sêmen submetido à separação de gênero.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de maturação in vitro de oócitos compreende: - a incubação dos oócitos dentro de uma faixa fisiologicamente relevante de, pelo menos, uma condição selecionada a partir do grupo consistindo de: temperatura, presença ou quantidade de gás, umidade, pH, osmolaridade, e combinações dessas condições.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a presença ou quantidade de um gás é de um gás selecionado a partir do grupo consistindo de 02 e C02.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de maturação in vitro de oócitos compreende: a incubação de oócitos a 35-40 2C com 3-9% de C02 e umidade saturada.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de desnudamento e cultivo de zigotos compreende a incubação dos zigotos a 35-40 SC com 5% de C02 em ar, e umidade saturada.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a etapa de desnudamento e cultivo de zigotos compreende ainda a incubação dos zigotos em 5% de 02.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de criopreservação dos embriões compreende as etapas de: - incubação dos embriões em uma solução compreendendo crioprotetor; e - imersão dos embriões em nitrogênio líquido.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de criopreservação dos embriões compreende as etapas de: - incubação de embriões em solução de congelamento consistindo de 1,0 - 4 M de etileno glicol durante 5 - 30 minutos em uma primeira temperatura dentro de um intervalo de cerca de 10 QC a cerca de 38 eC; - carregamento dos embriões em um receptáculo, em que bolhas de ar separam os embriões a partir de uma solução de descongelamento que compreende etileno glicol em um meio diluente isotônico; - exposição dos embriões a uma temperatura dentro de um intervalo de cerca de -2 a cerca de -10 SC durante um período de tempo no intervalo de cerca de 1 min até cerca de 60 minutos; - diminuição da temperatura a uma taxa no intervalo de cerca de -0.2 a cerca de - 0,8 9C por minuto até atingir uma segunda temperatura dentro de um intervalo de cerca de -30 a cerca de -36 SC; e - imersão dos embriões em nitrogênio líquido para o armazenamento.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o etileno glicol está presente em uma concentração final no intervalo de cerca de 0,2 a cerca de 1,3 Molar.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os embriões são criopreservados para transferência direta em fêmeas receptoras.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a transferência de embriões compreende as etapas de: - cultivo dos embriões em um meio suplementado com albumina de soro bovino (BSA) sob óleo mineral durante um período de tempo no intervalo de cerca de 5 a cerca de 9 dias; e - transferência dos embriões em ungulados receptores.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o meio é selecionado a partir do grupo consistindo em meio C4, meio SOFa, e combinações dos mesmos.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que os embriões transferidos estão em um estágio de desenvolvimento selecionado a partir do grupo que consiste de mórula, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ungulados fêmeas receptoras são sincronizadas.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ungulados fêmeas receptoras estão em estro natural.

19. mÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os embriões são frescos, vitrificados ou congelados.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ungulados são gado.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os embriões são selecionados a partir de espécies de gado compreendendo Bos taurus, Bos indicus e raça cruzada Bos indicus-taurus.

22. EMBRIÃO CRIOPRESERVADO, produzido por um método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - obtenção de embriões de ungulados produzidos in vitro (PIV); - criopreservação dos embriões sob condições em que quando os embriões criopreservados são transferidos para ungulados receptores, são alcançadas taxas de gravidez de pelo menos cerca de 10%.

23. EMBRIÃO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a obtenção de embriões produzidos in vitro compreende as etapas de: - recuperação de oócitos a partir de fêmeas; - maturação in vitro dos oócitos; - fertilização de oócitos maduros com sêmen; e - desnudamento e cultivo de zigotos.

24. EMBRIÃO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a maturação de oócitos in vitro compreende a incubação dos oócitos dentro de uma faixa fisiologicamente relevante de pelo menos uma condição selecionada a partir do grupo consistindo de: temperatura, presença ou quantidade de gás, umidade, pH, osmolaridade, e combinações dessas condições.

25. EMBRIÃO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a transferência de embriões compreende as etapas de: - cultivo dos embriões em um meio suplementado com albumina de soro bovino (BSA) sob óleo mineral durante um período de tempo no intervalo de cerca de 5 a cerca de 9 dias; e - transferência dos embriões em ungulados receptores.

26. EMBRIÃO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o meio é selecionado a partir do grupo consistindo em meio C4, meio SOFa, e combinações dos mesmos.

27. EMBRIÃO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o embrião transferido está em um estágio de desenvolvimento selecionado a partir do grupo que consiste de mórula, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido.

28. DISPOSITIVO, caracterizado pelo fato de compreender: - um receptáculo; - um embrião criopreservado em solução de criopreservação posicionado dentro de uma primeira região do receptáculo, em que primeira região é flanqueada pela: segunda e terceira regiões e, cada uma delas contém ar, em que a segunda e terceira regiões são flanqueados pela: quarta e quinta regiões, cada um delas contendo soluções de descongelamento, em que a quarta e quinta regiões são flanqueadas pela: sexta e sétima regiões, cada uma delas contendo ar, em que a sexta e sétima regiões são flanqueadas pela: oitava e nona regiões, e cada um delas contêm soluções de descongelamento.

29. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das regiões é uma câmara em que a câmara é definida por uma entidade de partição física que proporciona uma barreira entre ela e pelo menos uma outra região com a qual é adjacente.

30. PLURALIDADE DE DISPOSITIVOS, caracterizado pelo fato de ser de acordo com a reivindicação 28.

31. MÉTODO, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - criopreservação de uma pluralidade de embriões de ungulados; e - transferência da pluralidade de embriões em ungulados receptores, em que a criopreservação e a transferência são executadas de modo a que uma taxa de concepção de pelo menos 30% é alcançada.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a etapa de criopreservação compreende o posicionando de cada embrião em solução de criopreservação dentro de uma primeira região de um receptáculo, em que a primeira região é flanqueada pela: segunda e terceira regiões e, cada uma delas contém ar, em que a segunda e terceira regiões são flanqueados pela: quarta e quinta regiões, cada um delas contendo soluções de descongelamento, em que a quarta e quinta regiões são flanqueadas pela: sexta e sétima regiões, cada uma delas contendo ar, em que a sexta e sétima regiões são flanqueadas pela: oitava e nona regiões, e cada um delas contêm solução de descongelamento.

33. MÉTODO DE CONGELAMENTO DE EMBRIÕES, caracterizado pelo fato de compreender: - a exposição de embriões de ungulados à solução de congelamento (SC), que consiste de cerca de 1 - 4 M de etileno glicol durante 10 minutos a 35 QC; - posicionamento de cada embrião em uma solução de congelamento (SC), dentro de um receptáculo dimensionado como uma palheta, para que o embrião na solução de congelamento seja rodeado por quatro colunas de solução de descongelamento (SD), intercaladas por colunas de ar entre elas, em que a solução de descongelamento compreende cerca de 0,75 M de etileno glicol; - exposição do receptáculo a condições de temperatura estabilizadas em uma temperatura no intervalo de cerca de 0 SC até cerca de -10 SC; - cristalização das colunas acima e abaixo do embrião por dois minutos depois de ser colocado na máquina de congelamento; - manutenção do embrião durante 1 a 60 minutos em uma temperatura no intervalo de cerca de 0 8C até cerca de -10 SC; - diminuição da temperatura a uma taxa no intervalo de cerca de -0.2 a cerca de - 0,8 SC por minuto até atingir uma segunda temperatura dentro de um intervalo de cerca de -30 a cerca de -36 SC; - imersão dos embriões congelados em nitrogênio líquido.

34. MÉTODO DE DESCONGELAMENTO DE EMBRIÕES, compreendendo: - a exposição de um receptáculo que contém o embrião criopreservado em solução de criopreservação posicionada dentro de uma primeira região do receptáculo, em que primeira região é flanqueada pela: segunda e terceira regiões e, cada uma delas contém ar, em que a segunda e terceira regiões são flanqueados pela: quarta e quinta regiões, cada um delas contendo soluções de descongelamento, em que a quarta e quinta regiões são flanqueadas pela: sexta e sétima regiões, cada uma delas contendo ar, em que a sexta e sétima regiões são flanqueadas pela: oitava e nona regiões, cada uma delas contendo soluções de descongelamento, ao ar em temperatura ambiente durante um primeiro período de tempo, em que o primeiro período de tempo é suficiente para iniciar o descongelamento dos embriões congelados; - exposição do receptáculo a um ambiente de descongelamento caracterizado por uma temperatura de descongelamento no intervalo de cerca de 10 SC a cerca de 38 9C durante um segundo período de tempo, em que o segundo período de tempo é suficiente para descongelar a solução de congelamento; e - mistura da solução de descongelamento, solução de congelamento e embrião dentro do receptáculo.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o primeiro período de tempo está em um intervalo de cerca de 10 QC a cerca de 38 SC.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que o segundo período de tempo está em um intervalo de cerca de 20 SC a cerca de 38 SC.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o ambiente de descongelamento é ou compreende um banho líquido.

38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a temperatura de descongelamento está no intervalo de cerca de 10 SC a cerca de 38 SC.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a etapa de mistura é obtida pela agitação suave do recipiente.

40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda uma etapa de transferência do embrião para um ungulado receptor.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a transferência é realizada simultaneamente com ou após a etapa de exposição ou etapa de mistura.

42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a etapa de transferência compreende a transferência para o corno uterino do ungulado receptor.