JP2018526984A - Ets転写因子を発現する改変内皮細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年7月20日に出願された米国仮特許出願第62/194,466号の優先権を主張し、該仮特許出願の内容は、参照によりその全体が本書に組み込まれる。
参照による組み込みが認められる管轄のためには、本開示で引用される参照文献は全て、それらの全体が参照により本書に組み込まれる。さらに、本書中で引用または言及する製品についての製造者の指示書またはカタログはいずれも、参照により本書に組み込まれる。参照により本書に組み込まれる文書、またはその中の任意の教示は、本発明の実施において使用され得る。米国特許第8,465,732号に示される一般的な教示の多くを、本発明に関連して用いることができるか、または本発明に用いるために適応させることができる。したがって、米国特許第8,465,732号の全内容が、参照により本出願に明らかに組み込まれる。
ETV2(Lee et al., Cell stem cell, 2: 497-507 (2008)、Sumanas et al., Blood, 111: 4500-4510 (2008))、FLI1(Liu et al., Current Bio. 18: 1234-1240 (2008))およびERG(McLaughlin et al., Blood, 98: 3332-3339 (2001))を含む、E−26ファミリーあるいは「ETS」ファミリーの転写因子(TF)の成員は、血管発生および血管形成の調節に関連付けられている(De Val et al., Dev Cell, 16: 180-195 (2009);Sato et al., Cell Struct Funct, 26: 19-24 (2001))。これらのTFは、内皮細胞(EC)の発生および機能に関連する遺伝子の発現を直接的に調節する。成体ECは、FLI1、ERG(アイソフォーム1および2)、ETSJ、ETS2、Elfl、Elkl、VEZFおよびETV6などの幾つかのETS因子を構成的に発現するが、ETV2は、胚発生中に一過的に発現され、成体ECには存在しない(Kataoka et al., Blood, 118: 6975-6986 (2011);Lelievre et al., The International Journal Of Biochemistry & Cell Biology, 33: 391-407 (2001))。発生中の血管の特異化において重要な役割を果たす(Liu et al., Circ Res, 103: 1147-1154 (2008);Pham et al., Dev Biol, 303: 772-783 (2007))他に、これらのTFの幾つかの一過的な発現は、多能性幹細胞を内皮細胞へ再プログラミングすることができるか、または他の(非多能性)細胞型を内皮細胞へ再プログラミング/分化転換することができることも示されている(例えば、Choi et al., Stem Cells 27, 559-567 (2009)、James et al., Nat. Biotech. 28, 161-166 (2010)、Prasain et al., Nat. Biotech. 32, 1151-1157 (2014)、Morita et al., PNAS, 112, 160-165 (2015)、Kurian et al., Nat. Methods 10, 77-83 (2013)、およびGinsberg et al., Cell, 151: 559-575を参照)。しかしながら、本発明者らが知る限りでは、本発明より前には、ETSファミリーの転写因子、特にETV2転写因子は、分化した内皮細胞、またはすでに内皮細胞系列への分化が方向付けられた内皮細胞に対して作用するとは考えられていなかった。同じく本発明より前には、本発明者らが知る限りでは、かかる因子を発現する内皮細胞が、幹細胞および前駆細胞などの他の細胞型の増殖を支持する能力に関して高められた性質を有し得るとの予測もなされていなかった。
本発明は、一つには、ETS転写因子ETV2は、内皮細胞において発現されると、特にアデノウイルスE4ORF1ポリペプチドと同時発現されると、ある予測されなかった効果を示す、という発見に基づく。E4ORF1発現内皮細胞は、血清の非存在下でさえ、培養中に長期間維持することができること、および造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)などの他の細胞型の培養の支持のために使用できることがすでに知られていたが(Kobayashi et al., Nature Cell Biology 12, 1046-1056 (2010);Butler et al., Blood 120, 1344-1347 (2012)を参照)、ここでは、E4ORF1およびETV2の両方を発現する改変内皮細胞(即ち、E4ORF1+ETV2+改変内皮細胞)もまた、HSPC増殖を支持できること、さらに、HSPCをE4ORF1+ETV2+内皮細胞と同時培養すると、E4ORF1+内皮細胞またはETV2+内皮細胞のいずれかを使用する場合と比較して、より原始的なHSPC集団の選択的増殖がもたらされ得ることが発見された。これらの発見に基づき、本発明は、E4ORF1+ETV2+改変内皮細胞、該細胞を含む組成物、ならびに該細胞を生成および使用する様々な方法を提供する。
本特許開示の「発明の概要」、「図面」、「図面の簡単な説明」、「実施例」および「特許請求の範囲」のセクションは、本発明の主な実施形態の幾つかについて説明するものである。本「詳細な説明」のセクションは、本発明の組成物および方法に関するある特定のさらなる説明を提供するものであり、本特許開示の全ての他のセクションと併せて読まれることが意図される。さらに、当業者に明らかであるように、本特許開示全体にわたって記載される種々の実施形態は、多様な方法で組み合わせることができるか、または組み合わせられることが意図される。本明細書中に記載する特定の実施形態のかかる組み合わせは、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
ある特定の定義を以下に提供する。他の用語は、本特許開示の他の箇所で定義されるか、それらが使用される文脈から明確な意味を有するか、または当該技術分野におけるそれらの通常の意味に従って使用される。
本明細書中に記載する本発明の実施形態の幾つかは、E4ORF1+、ETS+、および/またはETV2+である改変内皮細胞を含む。E4ORF1+細胞は、アデノウイルスE4ORF1ポリペプチドを発現する。ETS+細胞は、ETS転写因子ポリペプチド(ETV2転写因子ポリペプチドなど)を発現する。ETV2+細胞は、ETV2転写因子ポリペプチドを発現する。これらのポリペプチドは、本明細書中ではまとめて「本発明のポリペプチド」と称される。
幾つかの実施形態では、本発明は、E4ORF1+ETV2+改変内皮細胞などの「改変内皮細胞」を提供する。改変内皮細胞は、当該技術分野で公知の内皮細胞の任意の適切な供給源に由来し得る。例えば、幾つかの実施形態では、内皮細胞は、血管内皮細胞である。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、初代内皮細胞である。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、ヒトもしくは非ヒト霊長類細胞、またはウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタもしくは他の哺乳動物細胞などの、哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、初代ヒト内皮細胞である。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)などの臍帯静脈内皮細胞(UVEC)である。使用し得る他の適切な内皮細胞は、米国特許第8,465,732号(その内容を引用により本明細書の一部とする)に、E4ORF1発現に適していると記載されているものを包含する。
本発明の改変内皮細胞は、多種多様な用途に使用することができる。同様に、かかる改変内皮細胞を作製するための本発明が提供する方法は、多種多様な状況において使用することができる。概して、本発明が提供する改変内皮細胞は、未改変内皮細胞が現在使用されているかもしくは使用され得る任意の用途、またはE4ORF1発現内皮細胞が現在使用されているかもしくは使用され得る任意の用途、例えば米国特許第8,465,732号(その内容を引用により本明細書の一部とする)に記載される用途に使用することができる。例えば、改変内皮細胞は、研究目的で、および/または処置目的で、例えば、内皮細胞の投与が望ましい可能性がある疾患、障害または状態(例えば心筋虚血などの虚血状態)、あるいは血管新生の増加が有益であり得るかまたはそれによって軽減され得る他の状態(例えば創傷治癒)の治療または予防のために使用し得る。心筋虚血の処置の場合、細胞を、心臓に直接、または心臓の近傍に投与し得る。創傷の処置の場合、細胞を、創傷の部位(例えば皮膚創傷の場合は、皮膚)へ直接、または創傷の部位の近傍に投与し得る。細胞は、単回用量または複数回用量で投与し得る。当業者は、所望の用途に応じて、適切な投与方法を選択することができる。
細胞を培養する方法は、当該技術分野において周知であり、任意の適切な細胞培養方法を使用することができる。例えば、本発明の改変内皮細胞は、他の内皮細胞を培養するのに有用であることが知られている方法、または例えば米国特許第8,465,732号(その内容を引用により本明細書の一部とする)に記載されるような、E4ORF1発現内皮細胞の培養に有用であることが知られている方法を使用して培養することができる。幾つかの実施形態では、本発明の改変内皮細胞は、血清の非存在下で、または外因性増殖因子の非存在下で、または血清および外因性増殖因子の両方の非存在下で培養し得る。また、本発明の改変内皮細胞は、冷凍保存し得る。R. Ian FreshneyによるCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition (2000)(「Freshney」)(その内容を引用により本明細書の一部とする)に記載される方法などの、細胞培養および細胞冷凍保存のための様々な方法が当業者に公知である。
本発明はまた、本明細書中に記載する様々な方法を実施するための、または本発明が提供する改変内皮細胞を製造するためのキットを提供する。かかるキットは、ヌクレオチド配列(例えば、ベクター中の)、内皮細胞、改変内皮細胞の集団、対照の非改変内皮細胞、試料/標準の改変内皮細胞、改変内皮細胞またはその中で発現されるタンパク質もしくは核酸分子の検出のための手段または組成物(例えば、核酸プローブ、抗体等)、改変内皮細胞を維持もしくは増殖するのに有用な培地または組成物、改変内皮細胞によって馴化した培地、改変内皮細胞を対象に投与するための手段または組成物、またはそれらの任意の組み合わせを包含するがそれらに限定されない、本明細書中に記載する構成成分のいずれかを含有し得る。かかるキットはいずれも、使用説明書、容器、培養容器等を含んでもよい。キットにラベルを付けることができ、ラベルは、キットの内容物の使用に関する説明または他の情報を提供する任意の文書または記録物[電子的またはコンピューターが読める形態(例えば、ディスク、光ディスク、メモリーチップまたはテープ)であり得る]を含み得る。
E4ORF1+ETV2+内皮細胞の生成および使用
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、(a)E4ORF1単独(E4ORF1+ETV2−)、(b)ETV2単独(E4ORF1−ETV2+)、または(c)E4ORF1およびETV2の両方(E4ORF1+ETV2+)のいずれかを発現するように改変した。Seandel et al., PNAS, 2008;105(49): pp.19288-93(その内容を引用により本明細書の一部とする)に記載されるようにして、アデノウイルスE4ORF1をコードする核酸分子を、レンチウイルスベクターによりHUVECに導入した。ヒトETV2をコードする核酸分子(Genbank受託番号NM_01429)を、同じレンチウイルス系を使用して導入した(1つはE4ORF1用、1つはETV2用の、2つの別個のレンチウイルスコンストラクトを使用した)。レンチウイルスを1〜5の感染多重度(MOI)にてデリバリーした。ETV2発現は、PCRによって確認した。E4ORF1発現は、表現型で確認した(報告されているように、E4ORF1+内皮細胞は無血清培地中で生存できるのに対して、E4ORF1−内皮細胞は無血清条件で死滅する)。改変内皮細胞を、抗生物質、HEPES、FGF2サイトカイン、ヘパリンおよびGlutamaxを伴う血清含有M199培地(10%FBS)中で培養し、2〜15回の継代数で維持した。細胞が、少なくとも48〜72時間継代されず単一フラスコ中に存在した場合、培養培地を交換した。E4ORF1−ETV2+内皮細胞(即ち、ETV2を発現するが、E4ORF1は発現しないもの)は、多回の継代において培養が維持され得ず、むしろ培養中に老化し始め内皮細胞表現型を失い始めたという点で、非形質導入(E4ORF1−ETV2−)内皮細胞と同様に挙動することがわかった。一方、E4ORF1+ETV2+内皮細胞は、無血清条件下でさえ、老化することなく、より多くの継代数で培養することができ、内皮細胞表現型を失うことなく活発に増殖し続けた。図1は、E4ORF1+ETV2−(図1A)、E4ORF1−ETV2+(図1B)、およびE4ORF1+ETV2+(図1C)改変内皮細胞の、継代数8(レンチウイルス形質導入後に7回継代)における顕微鏡写真を示す。E4ORF1−ETV2+内皮細胞が老化しているように見えるのに対して、E4ORF1+ETV2−およびE4ORF1+ETV2+内皮は、健常で老化していないように見えることがわかる。E4ORF1−ETV2+細胞は、ナイーブE4ORF1−ETV2−内皮細胞との比較において、増殖の差を示さなかった。E4ORF1−ETV2+内皮細胞は、最初の2〜3回の継代においてE4ORF1+ETV2−細胞とほぼ同じ速度で増殖し、その後、増殖が低下して、継代数およそ8〜10において最終的な老化に至った。
Claims (56)
- E4ORF1+ETV2+改変内皮細胞の集団。
- 細胞が、ETV2ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む、請求項1に記載の改変内皮細胞の集団。
- 細胞が、アデノウイルスE4ORF1ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む、請求項1に記載の改変内皮細胞の集団。
- 核酸分子が、プラスミドベクターの形態で存在する、請求項2または3に記載の集団。
- 核酸分子が、改変内皮細胞のゲノムDNAに組み込まれない、請求項2または3に記載の集団。
- 核酸分子が、改変内皮細胞のゲノムDNAに組み込まれる、請求項2または3に記載の集団。
- 内皮細胞が、分化した内皮細胞に由来する、請求項1に記載の集団。
- 内皮細胞が、成体内皮細胞に由来する、請求項1に記載の集団。
- 内皮細胞が、胚内皮細胞ではない、請求項1に記載の集団。
- 内皮細胞が、ヒト内皮細胞である、請求項1に記載の改変内皮細胞の集団。
- 内皮細胞が、初代内皮細胞に由来する、請求項1に記載の改変内皮細胞の集団。
- 内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に由来する、請求項1に記載の改変内皮細胞の集団。
- 請求項1に記載の改変内皮細胞の集団を含む組成物。
- 担体溶液をさらに含む、請求項13に記載の組成物。
- 担体溶液が、生理食塩水である、請求項14に記載の組成物。
- 幹細胞または前駆細胞をさらに含む、請求項13に記載の組成物。
- 幹細胞または前駆細胞が、造血幹細胞または前駆細胞(HSPC)である、請求項16に記載の組成物。
- 請求項1に記載の改変内皮細胞の集団、および対象への投与に適する担体溶液、を含む処置用組成物。
- 担体溶液が、生理食塩水である、請求項18に記載の処置用組成物。
- 幹細胞または前駆細胞をさらに含む、請求項18に記載の処置用組成物。
- 幹細胞または前駆細胞が、HSPCである、請求項20に記載の処置用組成物。
- HSPCが、骨髄から得られるかまたは骨髄に由来する、請求項17に記載の組成物または請求項21に記載の処置用組成物。
- HSPCが、末梢血から得られるかまたは末梢血に由来する、請求項17に記載の組成物または請求項21に記載の処置用組成物。
- HSPCが、羊水から得られるかまたは羊水に由来する、請求項17に記載の組成物または請求項21に記載の処置用組成物。
- HSPCが、臍帯血から得られる、請求項17に記載の組成物または請求項21に記載の処置用組成物。
- 細胞移植術における使用のための、請求項18に記載の処置用組成物。
- HSPC移植術における使用のための、請求項18に記載の処置用組成物。
- 培養において内皮細胞を維持するかまたは増殖させる方法であって、ETV2ポリペプチドをコードする核酸分子、およびE4ORF1ポリペプチドをコードする核酸分子を、内皮細胞へ導入して、E4ORF1+ETV2+改変内皮細胞を作ることを含み、ここで、該改変内皮細胞は、培養において維持するかまたは増殖させることができる、方法。
- 改変内皮細胞を培養することをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 血清の非存在下で改変内皮細胞を培養することをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 外因性増殖因子の非存在下で改変内皮細胞を培養することをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 導入を、トランスフェクションによって行う、請求項28に記載の方法。
- トランスフェクションを、リポソームによるトランスフェクション、ポリブレンによるトランスフェクション、DEAEデキストランによるトランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、および微粒子銃からなる群から選択される方法を使用して行う、請求項32に記載の方法。
- 導入を、ウイルスによる形質導入によって行う、請求項28に記載の方法。
- ウイルスによる形質導入を、レンチウイルスによる形質導入、アデノウイルスによる形質導入、レトロウイルスによる形質導入、アデノ随伴ウイルスによる形質導入、およびヘルペスウイルスによる形質導入からなる群から選択される方法を使用して行う、請求項29に記載の方法。
- 内皮細胞が、初代内皮細胞である、請求項28に記載の方法。
- 内皮細胞が、ヒト内皮細胞である、請求項28に記載の方法。
- 内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)である、請求項28に記載の方法。
- 培養において目的の細胞の集団を維持するかまたは増殖させる方法であって、(a)請求項1に記載のE4ORF1+ETV2+改変内皮細胞の集団を得るかまたは生成すること、および(b)該改変内皮細胞を、目的の細胞の集団とともに同じ培養容器中で培養すること、を含む方法。
- 改変内皮細胞が、培養容器の表面上にフィーダー細胞層を形成する、請求項39に記載の方法。
- 目的の細胞が、がん細胞、幹細胞、前駆細胞またはハイブリドーマ細胞である、請求項39に記載の方法。
- 目的の細胞が、HSPCである、請求項39に記載の方法。
- 目的の細胞が、HSPCであり、培養が、CD45RA−HSPCの選択的増殖をもたらす、請求項39に記載の方法。
- 目的の細胞が、HSPCであり、培養が、CD34+High,CD45RA−HSPCの選択的増殖をもたらす、請求項39に記載の方法。
- 目的の細胞が、HSPCであり、培養が、CD45RA−であるHSPCの割合の増加をもたらす、請求項39に記載の方法。
- 目的の細胞が、HSPCであり、培養が、CD34+High,CD45RA−であるHSPCの割合の増加をもたらす、請求項39に記載の方法。
- 工程(b)の培養を、血清の非存在下で行う、請求項39に記載の方法。
- 工程(b)の培養を、外因性増殖因子の非存在下で行う、請求項39に記載の方法。
- 目的の細胞の集団を維持するかまたは増殖させる方法であって、(a)請求項1に記載のE4ORF1+ETV2+改変内皮細胞の集団の培養から馴化培地を得ること、および(b)目的の細胞を、該馴化培地と接触させること、を含む方法。
- 目的の細胞の集団を維持するかまたは増殖させる方法であって、(a)請求項1に記載のE4ORF1+ETV2+改変内皮細胞の集団を得るかまたは生成すること、(b)培養容器中で該改変内皮細胞を培養すること、(c)該培養容器から馴化培地を収集すること、および(d)目的の細胞を、該馴化培地と接触させること、を含む方法。
- 目的の細胞を培養することをさらに含む、請求項49または50に記載の方法。
- 請求項1に記載のE4ORF1+ETV2+改変内皮細胞の培養から得る、馴化細胞培養培地。
- (a)ETV2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および(b)E4ORF1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む核酸ベクター。
- 発現ベクターである、請求項53に記載の核酸ベクター。
- ETV2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびE4ORF1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、別個のプロモーターの制御下にある、請求項53に記載の核酸ベクター。
- ETV2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびE4ORF1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、同じプロモーターの制御下にある、請求項53に記載の核酸ベクター。
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