JP2018524012A - 酵素を修飾するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、2015年7月17日に出願された米国仮特許出願第62/193,955号の優先権の恩典を主張するものである。
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって付与された助成金第R01-GM072688号および第R01-GM090324号の下、政府支援をもって成されたものである。政府は、本発明に特定の権利を所有する。
I. 発明の分野
態様は、概して、生物学、医学、およびタンパク質エンジニアリングを対象とする。
酵素は、化学品、医薬品、食品、乳製品、および繊維製品を含む多くの製造業において重要であることから、望ましい触媒特性を有する酵素のエンジニアリングは、引き続きバイオテクノロジーの主要な目標である。基本的に全ての標準的な酵素エンジニアリングアプローチ、例えば、構造誘導設計および指向性進化法は、酵素それ自体を修飾する。これらのアプローチの前提条件は、それらのより広範な用途を制限している。構造誘導設計は、標的酵素の3次元(3D)構造および触媒機構の詳細な知識を必要とし、そして、指向性進化法は、多数の突然変異酵素を生成およびスクリーニングするための効果的な戦略を必要とする。デノボ酵素設計もまた、反応機構の詳細な理解を必要とする。工業用酵素は、大腸菌(Escherichia coli)および酵母のようなタンパク質工学に好適な生物において組換え産生できないため、工業用酵素はその天然宿主から精製されることが多い。それらの3D構造はほとんど知られておらず、そして、それらのアッセイは労働集約的であることが多い。これらの特徴は、標準的なタンパク質エンジニアリングアプローチを工業用酵素に適用することを厄介な難題にしているが、それらの特性を調節することが望ましい場合が多い。したがって、とりわけ3次元構造に関してほとんど情報が入手できない酵素について、酵素の活性および/または特異性を修飾するためのより良好な方法が当技術分野において必要とされている。
酵素修飾剤を生成する能力は、生化学および製造業に用途を有する。典型的には、酵素の基質特異性を修飾することは、酵素の3次元構造に関する少なくともいくつかの情報を必要とする。しかしながら、時として、3次元構造は、入手可能でなく、かつ/または、それに到達するのは困難である。本明細書に記載されるのは、酵素の構造に関する知識が全くなくても生成することができる新規の酵素基質特異性修飾剤を開発するための方法である。また、本明細書に記載されるのは、β-ガラクトシダーゼに結合するポリペプチド、ならびにβ-ガラクトシダーゼの阻害剤および特異性修飾剤であるポリペプチドである。また、本明細書に記載されるのは、リパーゼ1に結合するポリペプチド、ならびにリパーゼ1の阻害剤および特異性修飾剤であるポリペプチドである。
いくつかの態様において、酵素結合タンパク質は、異なる結合特異性を有する酵素結合タンパク質のライブラリーから同定されるタンパク質である。いくつかの態様において、酵素結合タンパク質はCDRベースである。用語「CDRベース」は、抗体由来のCDR(相補性決定領域)と同じもしくは類似する配列および/または結合機序を採用するタンパク質を指す。いくつかの態様において、EBPは、抗体模倣体である。抗体模倣体は、抗体のように抗原に特異的に結合することができるが抗体とは構造的に関連しない、有機化合物である。抗体模倣体は、通常、約3〜20kDaのモル質量の人工ペプチドまたはタンパク質である。核酸および低分子は、時として、同じく抗体模倣体と見なされるが、人工抗体、抗体断片およびこれらから構成される融合タンパク質とは見なされない。いくつかのタイプは、抗体様ベータシート構造を有する。抗体に勝る共通の利点は、より良好な溶解性、組織透過性、熱および酵素に対する安定性、ならびに比較的低い生産コストである。いくつかの態様において、抗体よりも抗体模倣体を使用する利点は、模倣体のより小さいサイズに関係する。
いくつかの態様において、EBPは、モノボディである。アドネクチン(Adnectin)としても知られているモノボディは、抗原に結合することができる遺伝子操作されたタンパク質である(Koide et al. 1998)。それらの名称にもかかわらず、これらは抗体の区分ではなく、抗体模倣体の一種となる。モノボディは、94アミノ酸からなり、かつ、約10kDaの分子質量を有し得る。すなわち、IgG型抗体よりも15倍小さくかつ抗体の単一可変ドメインのサイズと同等である。これらは、ヒトフィブロネクチンの構造、より具体的にはその10番目の細胞外III型ドメインに基づく。
。
の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12を含むがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、EBPは、抗体である。抗体は、本明細書に記載される種々の抗体のいずれかであることができ、この非限定的な例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ベニヤ抗体(veneered antibody)、ダイアボディ(diabody)、ヒト化抗体、抗体誘導体、組換えヒト化抗体、ナノボディ、重鎖のみの抗体(例えば、ラクダ、ラマ、アルパカのようなラクダ科由来の)またはその各々の誘導体もしくは断片を含む。
いくつかの態様において、EBPは、アフィボディである。アフィボディ分子は、モノクローナル抗体を模倣する、多数の標的タンパク質またはペプチドに高い親和性で結合するようにエンジニアリングされた低分子タンパク質であり、それゆえ、抗体模倣体のファミリーのメンバーである。アフィボディ分子は、それ自体または他のタンパク質パートナーとの融合を介して種々の宿主細胞において可溶性かつタンパク分解に安定な形態で発現することができる、3ヘリックスバンドルドメインに基づく。これらは、修飾を許容し、かつ、融合タンパク質へ組み込まれるときに独立に折り畳まれる。同じ特異性のアフィボディ分子の頭尾融合は、標的結合においてアビディティー効果を与えることが証明されており、そして、異なる特異性のアフィボディ分子の頭尾融合は、二重特異性または多重特異性の親和性タンパクを得ることを可能にする。他のタンパク質との融合物も作製することができる。部位特異的コンジュゲーションのための部位は、所望の位置での単一のシステインの導入によって容易になる。
いくつかの態様において、EBPは、アンチカリンである。アンチカリンは、抗原に、タンパク質または低分子のいずれかに結合することができる人工タンパク質である。これらは、抗体と構造的に関連していないために、これらは抗体模倣体の一種となる。その代わりに、これらは、天然結合タンパク質のファミリーであるヒトリポカリンに由来する。アンチカリンは、モノクローナル抗体の代わりに使用することができるが、サイズが約180アミノ酸であり質量が約20kDaで約8倍小さい。
いくつかの態様において、EBPは、Kunitzバリアントである。Kunitzドメインは、タンパク質分解酵素の機能を阻害するタンパク質の活性ドメインであるか、または、より具体的には、Kunitz型のドメインはプロテアーゼ阻害剤である。これらは、約50〜60アミノ酸長で分子量が6kDaであり比較的小さい。Kunitz型プロテアーゼ阻害剤の例は、アプロチニン(ウシ膵臓トリプシン阻害剤、BPTI)、アルツハイマー病のアミロイド前駆体タンパク質(APP)、および組織因子経路阻害剤(TFPI)である。
いくつかの態様において、EPBは、DARPinである。DARPin(設計されたアンキリンリピートタンパク質(designed ankyrin repeat protein)の頭字語)は、典型的には高度に特異的でかつ高親和性の標的タンパク質結合を示す、遺伝子操作された抗体模倣体タンパク質である。これらは、天然のアンキリンタンパク質に由来し、これらのタンパク質の少なくとも3つ、通常4つまたは5つのリピートモチーフからなる。それらの分子質量は、4つまたは5つのリピートDARPinでそれぞれ約14または18kDa(キロダルトン)である。
他のいくつかの態様では、EBPは、当技術分野において公知のものである、さらなる例は、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、およびフィノマーを含む。
特定のリガンドもしくは標的に結合しかつ/または特定の活性の修飾(例えば、基質特異性修飾剤、阻害剤など)を標的(すなわち、酵素)に付与するEBPを選択するために、ライブラリースクリーニングを実施することができる。コンビナトリアルスクリーニングは、特異的突然変異誘発(「ランダム設計」)アプローチで実行可能でない、多数のEBPを容易に生産およびスクリーニングすることができる。所望の結合能を有するEBPをインビトロで選択し、回収し、そして増幅させることができる。選択されたEBPをコードする核酸を配列決定することによって、選択されたクローンのアミノ酸配列を容易に同定することができる。
本発明は、モノボディおよび/または他の結合ポリペプチドの同定および使用に関連する方法および組成物に関係する。いくつかの態様において、結合ポリペプチドおよび/またはモノボディは、酵素結合ポリペプチド(EBP)である。本明細書において使用される場合、「モノボディ」は、別のタンパク質の特異的抗原に結合するポリペプチドである。本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」は、一般に、約10〜約1,000またはより多いアミノ酸残基のペプチド配列を指すと本明細書において定義される。
本開示の局面は、ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、かつ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかまたはそれらの類似体の任意の長さの多量体型形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、任意の3次元構造を有することができ、かつ、公知または未知の任意の機能を遂行し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子または遺伝子断片(例えば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブルの前後に付与されることができる。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分を挿入することができる。ポリヌクレオチドを、重合後、例えば標識化成分とのコンジュゲーションによってさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖および一本鎖の両方の分子を指す。他に規定のない限りまたは必要のない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の態様は、二本鎖形態と二本鎖形態を構成することが公知または予測される2つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。
本開示の特定の局面において製造または使用されるとおりのキットもまた企図される。例えば、本開示のポリペプチドまたは核酸をキットに含めることができる。キットを密閉容器に含めることができる。容器の非限定的な例は、マイクロタイタープレート、ボトル、金属チューブ、ラミネートチューブ、プラスチックチューブ、ディスペンサー、加圧容器、バリア性容器、パッケージ、コンパートメント、または他のタイプの容器、例えば、分散物もしくは組成物または所望のボトル、ディスペンサー、またはパッケージが内部に保持される射出成型またはブロー成形プラスチック容器を含む。容器の他の例は、ガラスまたはプラスチック製のバイアルまたはボトルを含む。キットおよび/または容器は、その表面に指示を含むことができる。その指示は、例えば、語、語句、略称、絵、または記号であることができる。
以下の実施例は、種々の態様を説明するために与えられるものであって、決して本発明を限定することを意味するものではない。当業者であれば、本発明が、目的を達成するために、かつ、述べられた目標および利点、ならびに本明細書固有の目的、目標および利点を得るために十分に適合されることが容易に理解されよう。本実施例は、本明細書に記載される方法と共に、現時点での好ましい態様の代表であり、典型であり、そして、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって規定されるとおりの本発明の精神の中に包含されるそれらの変形および他の使用に気付くであろう。
酵素をエンジニアリングするための現行の方法は、酵素それら自体を修飾し、かつ、詳細な機構的理解またはハイスループットアッセイを必要とする。本開示の現行の方法は、未修飾酵素に指向される結合タンパク質を用いて触媒特性が調節される、新しいアプローチを記載する。この実施例は、モノボディと呼ばれる合成結合タンパク質を使用する。3次元構造が未知のβ-ガラクトシダーゼの例を使用して、その基質を制限しかつ低分子オリゴ糖プレバイオティクスの生産を選択的に増強したモノボディが同定された。
本発明者らは、代理合成結合タンパク質(モノボディと称される)が他の未修飾酵素の特異性を調節する、酵素特異性を変更するための新しい戦略を確立した。ここで、本発明者らは、この戦略をキャンディダ・ルゴサ・リパーゼ1(CRL1)に対して試験した。本発明者らは、短鎖脂質に対するCRL1の基質特異性を制限した代理モノボディを同定することに成功した。ここでのCRL1を用いた成功および先のβ-ガラクトシダーゼを用いた成功は、別個の基質結合部位のアーキテクチャを有する酵素にこの戦略が広く適用可能であることを示唆している。
Claims (77)
- 少なくとも1つの基質に結合する酵素の基質特異性を修飾する酵素結合ポリペプチド(EBP)を同定するための方法であって、
該酵素を、該酵素の異なるエピトープに結合する複数のEBPを含むポリペプチドライブラリーと接触させる工程;
該酵素と結合してEBP-酵素複合体を形成する、EBPを同定する工程;
EBP-酵素複合体の活性レベルおよび基質特異性についてアッセイする工程;ならびに
EBP-酵素複合体の状態にあるとき、複合体化していないEBPとは異なる基質特異性を有するEBPを同定することによって、該酵素の基質特異性を修飾するEBPを同定する工程
を含み;
該EBP-酵素複合体が、複合体化していない活性レベルの少なくとも50%である活性のレベルを有し、かつ/または、該EBP-酵素複合体が基質への結合性を保持している、
方法。 - 基質特異性を修飾するEBPを同定する工程が、
a)既定期間の反応後の酵素1ユニット当たりの関心対象の第1の生成物の量を低減するポリペプチドを同定する工程;および
b)既定期間の反応後の酵素1ユニット当たりの関心対象の第2の生成物の量を低減しないポリペプチドを同定する工程
を含む、請求項1記載の方法。 - 分子が低分子またはポリペプチドである、請求項2記載の方法。
- 基質特異性を修飾するEBPが、触媒作用の部位に結合しない、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 基質特異性を修飾するEBPが、酵素の活性部位の接近性を修飾するポリペプチドである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 酵素の触媒活性を阻害する分子との競合アッセイを実施する工程をさらに含む、請求項22〜27のいずれか一項記載の方法。
- 前記分子が酵素の阻害剤である、請求項7記載の方法。
- 酵素の基質特異性を修飾するEBPが、酵素への結合に関して、酵素の活性部位に結合する阻害剤と競合するEBPである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- タンパク質の3次元構造が未知である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 酵素の優性エピトープをマスクする工程をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 優性エピトープが、エピトープへの分子の結合によってマスクされる、請求項11記載の方法。
- 前記分子が、酵素の特異性または酵素活性を修飾しない、請求項12記載の方法。
- EBP-酵素複合体が、複合体化していない活性レベルの少なくとも75%である活性のレベルを有する、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
- EBP-酵素複合体が、複合体化していない活性レベルの少なくとも90%である活性のレベルを有する、請求項14記載の方法。
- EBP-酵素複合体が、複合体化していない活性レベルの少なくとも95%である活性のレベルを有する、請求項14記載の方法。
- 酵素が、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレオチドポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、トランスペプチダーゼ、トランスアミダーゼ、カルボキシラーゼ、γ-グルタミルトランスフェラーゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、リアーゼ、オキシゲナーゼ、リガーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、アミラーゼ、デアセチラーゼ、またはデメチラーゼである、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
- 酵素がβ-ガラクトシダーゼである、請求項18記載の方法。
- ポリペプチドライブラリーが、抗体、アフィボディ、アンチカリン、Kunitzバリアント、モノボディ、またはDARPinのライブラリーである、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
- ポリペプチドライブラリーが、100kDa未満であるポリペプチドのライブラリーである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- ポリペプチドライブラリーが、50kDa未満であるポリペプチドのライブラリーである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- ポリペプチドライブラリーが、25kDa未満であるポリペプチドのライブラリーである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- ポリペプチドライブラリーが、15kDa未満であるポリペプチドのライブラリーである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- ポリペプチドライブラリーが、モノボディのライブラリーである、請求項20記載の方法。
- モノボディライブラリーが、野生型(SEQ ID NO:78)と比較して、ベータ鎖C、ベータ鎖D、ベータ鎖F、および/またはベータ鎖Gの1つまたは複数に1つまたは複数の変更を含むバリアントフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを有する複数のポリペプチドを含む、請求項25記載の方法。
- バリアントアミノ酸の1つまたは複数が、SEQ ID NO:91の位置30、31、33、49、47、75、76、84、および/または85に対応する、請求項26記載の方法。
- バリアントFN3ドメインが、FN3の少なくとも1つのループ領域内に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25のアミノ酸の挿入または欠失をさらに含む、請求項26記載の方法。
- バリアントFN3ドメインが、ループFG内にアミノ酸挿入を含む、請求項28記載の方法。
- ポリペプチドライブラリーが、SEQ ID NO:91のアミノ酸位置31、33、47、49、73、および/または75に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換を含む複数のFN3ドメインポリペプチドを含む、請求項20〜24のいずれか一項記載の方法。
- FN3ドメインポリペプチドが、SEQ ID NO:91のアミノ酸位置30、41、42、43、44、45、76、77、78、79、80、81、82、83、84、および/または85に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項30記載の方法。
- FN3ドメインポリペプチドが、SEQ ID NO:91のアミノ酸位置15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、32、34、35、36、37、38、39、40、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、72、74、75、86、87、88、89、90、91、92、93、および/または94に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項30または31記載の方法。
- FN3ドメインポリペプチドが、SEQ ID NO:91と少なくとも50%、60%、70%、80%、または90%同一である、請求項30記載の方法。
- 請求項1〜33のいずれか一項記載の方法に従って同定された、酵素の基質特異性を修飾するポリペプチド。
- EBP-酵素複合体の特異性が酵素とは異なり、該EBP-酵素複合体が複合体化していない活性レベルの少なくとも50%である活性のレベルを有し、かつ/または、基質への結合性を保持している、EBP-酵素複合体。
- 請求項34または35記載のポリペプチドをコードする、ヌクレオチド。
- 酵素を請求項34または35記載のポリペプチドと接触させる工程を含む、該酵素の特異性を修飾するための方法。
- 酵素をEBPと接触させる工程を含む、該酵素の特異性を修飾するための方法。
- SEQ ID NO:1〜90から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- β-ガラクトシダーゼに結合する、請求項39記載のポリペプチド。
- β-ガラクトシダーゼの不活性結合剤である、請求項40記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1、8、14、23、26、30、38、39、47、52、62、67、69、70、75、または76と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項39または41記載のポリペプチド。
- β-ガラクトシダーゼの阻害剤である、請求項40記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:73、74、77、または83と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項39または43記載のポリペプチド。
- β-ガラクトシダーゼの特異性修飾剤である、請求項40記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:78、81、86、87、または88と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項39または45記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:87を含むポリペプチド。
- 修飾をさらに含む、請求項39〜47のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 修飾がグリコシル化である、請求項48記載のポリペプチド。
- 修飾が検出可能標識へのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
- 修飾が診断剤へのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
- 修飾が、蛍光物質、発光物質、または生物発光物質へのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
- 修飾が放射性物質へのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
- 修飾が治療剤へのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
- 修飾が第2のポリペプチドへのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
- 第2のポリペプチドが、Avi、カルモジュリン、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアルギニン、E、FLAG、HA、His、Myc、ポリヒスチジン、GST、MBP、S、SBP、Softag 1、Softag3、Strep、TC、V5、VSV、レクチン、ビオチン、ストレプトアビジン、SUMO、HaloTag、SiTag、またはExpressポリペプチドである、請求項55記載のポリペプチド。
- 請求項39〜56のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項39〜56のいずれか一項記載のポリペプチドを製造するための方法であって、請求項57記載のポリヌクレオチドを細胞中で発現させる工程を含む、方法。
- 請求項57記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
- SEQ ID NO:93〜112または114〜117から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)リパーゼ1(CRL1)に結合する、請求項60記載のポリペプチド。
- CRL1の不活性結合剤である、請求項61記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:93、94、96、または97と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項62記載のポリペプチド。
- CRL1の阻害剤である、請求項61項記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:107、116、または117と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項64記載のポリペプチド。
- CRL1の特異性修飾剤である、請求項61記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:115または109と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項66記載のポリペプチド。
- 修飾をさらに含む、請求項60〜67のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 修飾がグリコシル化である、請求項68記載のポリペプチド。
- 修飾が検出可能標識へのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
- 修飾が診断剤へのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
- 修飾が、蛍光物質、発光物質、または生物発光物質へのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
- 修飾が放射性物質へのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
- 修飾が治療剤へのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
- 修飾が第2のポリペプチドへのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
- 第2のポリペプチドが、Avi、カルモジュリン、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアルギニン、E、FLAG、HA、His、Myc、ポリヒスチジン、GST、MBP、S、SBP、Softag 1、Softag3、Strep、TC、V5、VSV、レクチン、ビオチン、ストレプトアビジン、SUMO、HaloTag、SiTag、またはExpressポリペプチドである、請求項75記載のポリペプチド。
- 請求項60〜76のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項60〜76のいずれか一項記載のポリペプチドを製造するための方法であって、請求項77記載のポリヌクレオチドを細胞中で発現させる工程を含む、方法。
- 請求項19記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
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