JP2018521056A

JP2018521056A - インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼの阻害剤

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Publication number: JP2018521056A
Application number: JP2017568056A
Authority: JP
Inventors: ミエチスラフカズミエルスキ，ウィエスラフ; ラロサ，マルタアリシアデ; サマノ，ビセンテ
Original assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Current assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2018-08-02
Anticipated expiration: 2036-06-30
Also published as: BR112017028456A2; AU2016285483B2; EP3317287B1; AU2016285483A1; RU2018101431A; KR20180022988A; WO2017002078A1; US20180298035A1; CA2990335A1; ES2752455T3; CN107709338A; EP3317287A1; US10239894B2; JP6654208B2

Abstract

式(I)の化合物及びその薬学的に許容される塩、それらの医薬組成物、それらの調製方法、並びにAIDS及び一般的免疫抑制の進行の予防を含む、HIVの予防及び/又は処置における、それらの使用のための方法が提供される。【化１】【選択図】なし

Description

ある特定のインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ阻害剤化合物を治療有効量で投与することによって、AIDS及び一般的免疫抑制の進行の予防を含めて、HIVの予防及び/又は処置のための、化合物、方法及び医薬組成物が開示される。このような化合物を調製するための方法並びに化合物及びその医薬組成物を使用する方法も開示される。

ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)は、後天性免疫不全疾患(AIDS)の罹患をもたらす。HIVの症例数は、上昇し続け、目下世界中で2,500万人がそのウイルスを患っている。現在、抗レトロウイルス薬物によるウイルス複製の長期抑制が、HIV-1感染を処置するための唯一の選択肢である。事実、米国食品医薬品局は、6つの異なる阻害剤クラスにわたる25の薬物を許可し、これらは患者の生存率及び生活の質を大きく高めることが示されている。しかしながら、限定されないが、望ましくない薬物-薬物相互作用;薬物-食品相互作用;治療に対する非遵守;酵素標的の変異による薬物耐性;及びHIV感染に起因する免疫学的損傷に関連する炎症を含めて、いくつかの課題のためにさらなる治療が依然として必要とされている。

目下、ほとんどすべてのHIV陽性患者は、高活性抗レトロウイルス治療(「HAART」)と呼ばれる、抗レトロウイルス薬物組合せの治療レジメンで処置されている。しかしながら、HAART治療は、種々の薬物の組合せが、薬物耐性HIV-1変異体の急速な出現を回避するために患者にしばしば毎日投与されなければならないために、しばしば複雑である。患者生存率に対してHAARTが肯定的に影響するにもかかわらず、薬物耐性は依然として起こり得、生存率及び生活の質は、非感染の人と比較して正常化されていない。事実、いくつかの非AIDS、例えば、心臓血管疾患、虚弱(frailty)、及び認知障害の罹患率及び死亡率の頻度は、HAART抑制されたHIV感染対象において増加している。この非AIDS罹患率/死亡率の頻度の増加は、HIV感染に起因する免疫学的損傷に関連する増加した全身性炎症において生じ、及びそれに潜在的に起因している。

したがって、薬物によるHIV-1感染患者集団の処置が持続的に成功していることから、免疫系の回復及び全身性炎症の低下を目的とした抗レトロウイルス及び/又は介入を含めた、新規な標的及び作用機構を有する新規で改善された薬物の継続した開発が必要とされている。

IDOは、単量体45kDaの肝外ヘム含有ジオキシゲナーゼであり、これは、3つの提唱される反応機構によって分子状酸素又は反応性酸素種を用いてI-TrPのN-ホルミルキヌレニンへの酸化的ピロール環切断反応を触媒する。IDOは、トリプトファン異化のキヌレニン経路における律速段階である酵素である。IDOは、トリプトファン(Trp)のインドール環の二酸化(dioxidation)を触媒し、N-ホルミル-キヌレニン(NFK)を生成させ、次いで、これは、いくつかの下流の代謝産物、例えば、キヌレニン(Kyn)及び3-ヒドロキシ-アントラニレート(HAA)に他の酵素によって代謝される。Trpの枯渇並びにKyn及びHAAの蓄積は、典型的にはT細胞活性化及び増殖の減少、制御性CD4+T細胞の豊富化、及びIL-17産生性CD4+T細胞の枯渇によって例示される、免疫調節活性を有する。したがって、IDO活性は、一般的免疫抑制性影響を有する。

IDOは、炎症に応答して発現され、長期炎症の間に側副組織が損傷されるのを予防するための重要なカウンターバランスと考えられる。IDO発現及び活性は、慢性ウイルス感染、例えば、HIV及びHCV、慢性細菌感染、並びに急性症状、例えば、敗血症の間に高められる。ヘルパーT細胞のTreg分化へのTh17のIDO介在移行は、HIV感染中の腸免疫機能不全に恐らく関与しており、観察された全身性炎症の増加及び非AID罹患率/死亡率の頻度の増加に恐らく関連している。加えて、IDO活性は、病原体及びがんの持続性にも恐らく関与しており、IDOの阻害は、クリアランス機構を改善し、潜在的にこれらの慢性疾患の治癒をもたらし得る。IDOはまた、セロトニン合成又は興奮性神経毒、例えば、キヌレニンの産生を調節することによって、神経疾患又は神経精神疾患若しくは障害、例えば、うつ病に関与し得る。したがって、IDOの薬理学的阻害は、神経学、腫瘍学、及び感染性疾患からの広範囲の用途における適用を有する。

したがって、非AIDS罹患率/死亡率の頻度を減少させるためのHIV感染における疾患修飾治療、並びに/又はHIV、HBV、HCV及び他のウイルス感染、細菌感染、真菌感染、並びに腫瘍に対する免疫応答を強化するための免疫治療として、並びに/又はうつ病若しくは他の神経/神経精神疾患の処置のために、前述の特性を有効にバランスさせるIDO阻害剤を発見することは、当技術分野における進歩である。

本発明は、式(I):

(式中:
Xは、CH₂又はC(O)であり;
R¹は、-NR²R³であり;
R²は、-H又は-CH₃であり;
R³は、

からなる群から選択される)
を有する、IDOのモジュレーターである化合物、又はその薬学的に許容される塩を提供する。

本発明はさらに、本発明の化合物、又はその薬学的に許容される塩、及び少なくとも1種の薬学的に許容される担体を含む、組成物を提供する。

一部の実施形態において、本発明の化合物は、式(II):

を有し、又はその薬学的に許容される塩。

一部の実施形態において、本発明の化合物は、式(III):

を有し、又はその薬学的に許容される塩。

一部の実施形態において、本発明の化合物は、式(IV):

を有し、又はその薬学的に許容される塩。

一部の実施形態において、本発明の化合物は、式(V):

を有し、又はその薬学的に許容される塩。

一部の実施形態において、本発明の化合物は、式(VI):

を有し、又はその薬学的に許容される塩。

一部の実施形態において、本発明の化合物は、式(VII):

を有し、又はその薬学的に許容される塩。

本出願の全体を通して、化合物、組成物、及び方法に関連して様々な実施形態に言及される。記載される様々な実施形態は、様々な例証的実施例を提供することが意味され、代替種の記載と解釈されるべきでない。むしろ、本明細書で提供される様々な実施形態の記載は、範囲が重複するものであってもよいことが留意されるべきである。本明細書で検討される実施形態は、単に例証的なものであり、本発明の範囲を限定することは意味されない。

本明細書で使用される用語法は、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、本発明の範囲を限定することは意図されないと理解されたい。本明細書及び後に続く特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義されるものとする、いくつかの用語に対する言及がなされる。

明確さのために別個の実施形態の文脈で記載される、本発明のある特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることもさらに理解される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈で記載される、本発明の様々な特徴は、別個に、又は任意の適当な副組合せ(subcombination)で提供され得る。

本発明はまた、本発明の化合物の薬学的に許容される塩を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、その親化合物が既存の酸又は塩基部分をその塩形態に変えることによって修飾される、開示された化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例には、限定されないが、塩基性残基、例えば、アミンの鉱物又は有機酸塩;酸性残基、例えば、カルボン酸のアルカリ又は有機塩;などが含まれる。本発明の薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性無機又は有機酸から形成された、親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。本発明の薬学的に許容される塩には、従来の化学的方法によって、塩基性又は酸性部分を有する親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離の酸又は塩基形態を化学量論量の適切な塩基又は酸と、水若しくは有機溶媒中、又はこれらの2つの混合物中で反応させることによって調製することができ;一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はACNのような非水性媒体が好ましい。

語句「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益/危険比に相応して、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしにヒト及び動物の組織と接触しての使用に適する、化合物、材料、組成物、及び/又は剤形を指すために本明細書で用いられる。

本発明はまた、異性体又は混合異性体を含み、これらは、定義により、同一の原子組成の、しかし、空間における原子の異なる結合配置又はそれらの原子の異なる配向を有する分子であり、すなわち、異性体は、同じ分子式を有する2種以上の異なる物質である。本発明の化合物のシス及びトランス幾何異性体が記述され、異性体の混合物として、又は別個の異性体形態として単離されてもよい。波線

又は交差線

により表される、構造図中の結合は、その構造が、シス若しくはトランス異性体、又はシス及びトランス異性体の任意の比率の混合物を表すことを示すことが意図される。臨床薬理学及び薬物治療の分野で、異性は、それらの薬物動態及び薬力学で異なることができ、これらは、既存の薬物のみならず最新の薬物のより安全でより有効な薬物代替品の導入を提供し得る。

本発明の一実施形態によれば、式(I):

からなる群から選択される)
の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩が提供される。

本発明はさらに、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び少なくとも1種の薬学的に許容される担体を含む、組成物を提供する。

本発明はさらに、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼを本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩と接触させることによって、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼの活性を調節する方法を提供する。

本発明はさらに、患者に、有効量の本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することによって、患者におけるAIDS及び一般的免疫抑制の進行を予防することを含む、HIVを予防及び/又は処置するための方法を提供する。

本発明はさらに、患者に、治療有効量の本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、患者におけるがん、ウイルス感染、細菌感染、敗血症、筋変性、
創傷、うつ病、神経変性障害、心的外傷、加齢性白内障、臓器移植拒絶、自己免疫疾患、などを処置する方法を提供する。

本発明はさらに、治療における使用のための薬剤の製造のための、本発明の化合物の使用を提供する。

本発明の別の実施形態において、式(II):

の構造を有する化合物又はその薬学的に許容される塩が提供される。

本発明の別の実施形態において、式(III):

本発明の別の実施形態において、式(IV):

本発明の別の実施形態において、式(V):

本発明の別の実施形態において、式(VI):

本発明の別の実施形態において、式(VII):

本発明のこのような化合物は、特に幾何学又は立体異性体形態で存在し得る。本発明は、本発明の範囲内に入るような、シス-及びトランス-異性体、(-)-及び(+)-エナンチオマー、(R)-及び(S)-エナンチオマー、ジアステレオマー、(D)-異性体、(L)-異性体、それらのラセミ混合物、並びにそれらの他の混合物、例えば、エナンチオマー的又はジアステレオマー的豊富化混合物を含めて、このような化合物をすべて企図する。さらなる不斉炭素原子が、置換基、例えば、アルキル基中に存在し得る。このような異性体のすべて、並びにそれらの混合物は、本発明に含まれることが意図される。

光学活性(R)-及び(S)-異性体並びにd及びl異性体は、キラルシントン若しくはキラル試薬を使用して調製され得るか、又は慣用技術を使用して分割され得る。例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが望まれる場合、それは、不斉合成、又はキラル補助体による誘導体化によって調製され得、ここで、得られたジアステレオマー混合物は分離され、補助基は切断されて、純粋な所望のエナンチオマーを与える。代わりに、分子が塩基性官能基、例えば、アミノ基、又は酸性官能基、例えば、カルボン酸を有する場合、ジアステレオマー塩が、適切な光学活性酸又は塩基を有して形成され、続いて、このように形成されたジアステレオマーを当技術分野で公知の分別結晶又はクロマトグラフィー手段によって分割し、その後、純粋なエナンチオマーを回収することができる。さらに、エナンチオマーとジアステレオマーとの分離は、任意選択で化学的誘導体化(例えば、アミンからカルバメートの形成)と組み合わせて、キラル固定相を用いるクロマトグラフィーを使用して頻繁に行われる。

本発明の別の実施形態において、式I〜式VIIの化合物が提供され、ここで、化合物又は化合物の塩は、ヒトにおける免疫抑制の処置における使用のための薬剤の製造のために使用される。

本発明の別の実施形態において、薬学的に許容される希釈剤及び治療有効量の式I〜式VIIで定義されたとおりの化合物を含む、医薬組成物が提供される。

一実施形態において、式I〜式VIIの化合物又はその塩を含有する医薬製剤は、非経口投与に適合した製剤である。別の実施形態において、製剤は、長時間作用型非経口製剤である。さらなる実施形態において、製剤は、ナノ粒子製剤である。

本発明は、免疫抑制に対する新規な処置として有用性を有する、化合物、組成物及び医薬組成物を対象とする。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、本化合物は、分子状酸素又は反応性酸素種を用いてI-TrpのN-ホルミルキヌレニンへの酸化的ピロール環切断反応を触媒する酵素を阻害することができると考えられる。

したがって、本発明の別の実施形態において、HIVの予防及び/又は処置のための方法であって、AIDS及び一般的免疫抑制の進行を予防することを含む方法が提供される。

本発明の化合物、及びそれらの塩、溶媒和物、又はそれらの他の薬学的に許容される誘導体は、単独で又は他の治療剤と組み合わせて用いられもよい。本発明の化合物及び任意の他の薬学的に許容される活性剤(複数可)は、一緒に又は別個に投与されてもよく、別個に投与される場合、投与は、同時、又は逐次的に(いずれの順序においても)行われてよい。本発明の化合物及び他の薬学的に許容される活性剤(複数可)の量、並びに投与の相対的タイミングは、所望の組み合わせ治療効果を達成するように選択される。本発明の化合物及び塩、溶媒和物、又はそれらの他の薬学的に許容される誘導体と、他の処置剤との組み合わせにおける投与は、(1)両方の化合物を含む単一医薬組成物、又は(2)それぞれが化合物の1種を含む別個の医薬組成物における併用投与による組み合わせであってもよい。代わりに、組み合わせは、1つの処理剤が第1に、及び他のものが第2に投与される、又は逆の順番で、逐次的方法で別個に投与されてもよい。このような逐次的投与は、時間的に近くても、時間的に遠くてもよい。式I〜式VIIの化合物(複数可)又はそれらの塩、及び他の薬学的に許容される活性剤(複数可)の量、並びに投与の相対的なタイミングは、所望の組み合わせ治療効果を達成するように選択される。

したがって、本発明の化合物は、HIVの予防又は処置に有用な1種以上の作用剤と組み合わせて使用されてもよい。

このような作用剤の例には、以下が含まれる:
ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、例えば、ジドブジン、ジダノシン、ラミブジン、ザルシタビン、アバカビル、スタブジン、アデフォビル、アデフォビルジピボキシル、フォジブジン、トドキシル、エムトリシタビン、アロブジン、アムドキソビル、エルブシタビン、及び同様の作用剤;
非ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤(抗酸化活性を有する作用剤、例えば、イムノカル、オルチプラズ、などを含む)、例えば、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ、ロビリデ、イムノカル、オルチプラズ、カプラビリン、レルシビリン、GSK2248761、TMC-278、TMC-125、エトラビリン、及び同様の作用剤;
プロテアーゼ阻害剤、例えば、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、フォサムプレナビル、ブレカナビル、ダルナビル(darunavir)、アタザナビル、チプラナビル、パリナビル、ラシナビル、及び同様の作用剤:
侵入、付着及び融合阻害剤、例えば、エンフビルチド(T-20)、T-1249、PRO-542、PRD-140、TNX-355、BMS-806、BMS-663068及びBMS-626529、5-ヘリックス、並びに同様の作用剤;
インテグラーゼ阻害剤、例えば、ラルテグラビル、エルビテグラビル、GSK1349572、GSK1265744、及び同様の作用剤;
変異阻害剤、例えば、PA-344及びPA-457、並びに同様の作用剤;並びに
CXCR4及び/又はCCR5阻害剤、例えば、ビクリビロク(Sch-C)、Sch-D、TAK779、マラビロク(UK427、857)、TAK449、並びに国際公開第02/74769号、PCT/US03/39644、PCT/US03/39975、PCT/US03/39619、PCT/US03/39618、PCT/US03/39740、及びPCT/US03/39732に開示されたもの、並びに同様の作用剤。

本発明の化合物が、HIVの予防又は処置に有用な1種以上の作用剤と組み合わせて使用されてもよいさらなる例は、表2に見られる。

本発明の化合物とHIV作用剤との組み合わせの範囲は、上に述べられたものに限定されないが、原則として、HIVの処置に有用な任意の医薬組成物との任意の組み合わせを含む。記載されたとおりに、このような組み合わせにおいて、本発明の化合物及び他のHIV作用剤は、別個に又は併用して投与されてもよい。さらに、ある作用剤は、他の作用剤(複数可)の投与の前、同時、又はその後であってもよい。

本発明は、薬理学的増強剤として有用な1種以上の作用剤と組み合わせて、並びにHIVの予防又は処置のための追加的化合物の有無にかかわらず、使用されてもよい。このような薬理学的増強剤(又は薬物動態ブースター)の例には、限定されないが、リトナビル、GS-9350、及びSPI-452が含まれる。

リトナビルは、10-ヒドロキシ-2-メチル-5-(1-メチルエチル)-1-1[2-(1-メチルエチル)-4-チアゾリル]-3,6-ジオキソ-8,11-ビス(フェニルメチル)-2,4,7,12-テトラアザトリデカン-13-オイック酸,5-チアゾリルメチルエステル,[5S-(5S^*,8R^*,10R^*,11R^*)]であり、Abbott Laboratories of Abbott park、Illinoisから、ノルビルとして入手可能である。リトナビルは、HIV感染の処置のための他の抗レトロウイルス剤と一緒に示されるHIVプロテアーゼ阻害剤である。リトナビルは、P-糖タンパク質(Pgp)細胞輸送システムのみならず、P450介在薬物代謝も阻害し、それにより、生物内の活性化合物の濃度の増加をもたらす。

GS-9350は、薬理学的増強剤としてカリフォルニア州フォスターシティのGilead Scienceにより開発されている化合物である。

SPI-452は、メリーランド州ゲイザースバーグのSequoia Pharmaceuticalsにより開発されている化合物である。

本発明の一実施形態において、式I〜式VIIの化合物は、リトナビルと組み合わせて使用される。一実施形態において、その組み合わせは、経口固定用量組み合わせである。別の実施形態において、式I〜式VIIの化合物は、持続性非経口注射剤として製剤化され、リトナビルは、経口組成物として製剤化される。一実施形態において、持続性非経口注射剤として製剤化された式I〜式VIIの化合物及び経口組成物として製剤化されたリトナビルを含むキットである。別の実施形態において、式I〜式VIIの化合物は、持続性非経口注射剤として製剤化され、リトナビルは、注射可能な組成物として製剤化される。一実施形態において、持続性非経口注射剤として製剤化された式I〜式VIIの化合物及び注射可能な組成物として製剤化されたリトナビルを含むキットである。

本発明の別の実施形態において、式I〜式VIIの化合物は、GS-9350と組み合わせて使用される。一実施形態において、組み合わせは、経口固定用量組み合わせである。別の実施形態において、式I〜式VIIの化合物は、持続性非経口注射剤として製剤化され、GS-9350は、経口組成物として製剤化される。一実施形態において、持続性非経口注射剤として製剤化された式I〜式VIIの化合物及び経口組成物として製剤化されたGS-9350を含むキットである。別の実施形態において、式I〜式VIIの化合物は、持続性非経口注射剤として製剤化され、GS-9350は、注射可能な組成物として製剤化される。一実施形態において、持続性非経口注射剤として製剤化された式I〜式VIIの化合物及び注射可能な組成物として製剤化されたGS-9350を含むキットが提供される。

本発明の一実施形態において、式I〜式VIIの化合物は、SPI-452と組み合わせて使用される。一実施形態において、その組み合わせは、経口固定用量組み合わせである。別の実施形態において、式I〜式VIIの化合物は、持続性非経口注射剤として製剤化され、SPI-452は、経口組成物として製剤化される。一実施形態において、持続性非経口注射剤として製剤化された式I〜式VIIの化合物及び経口組成物として製剤化されたSPI-452を含むキットである。別の実施形態において、式I〜式VIIの化合物は、持続性非経口注射剤として製剤化され、SPI-452は、注射可能な組成物として製剤化される。一実施形態において、持続性非経口注射剤として製剤化された式I〜式VIIの化合物及び注射可能な組成物として製剤化されSPI-452を含むキットである。

[実施例]
以下の実施例は、上記発明を製造及び使用する方法についてより十分に説明するために役立つ。これらの実施例は、本発明の真の範囲を限定するためには決して役立たず、むしろ、例証的目的のために提示されると理解されたい。以下の実施例及び合成スキームにおいて、以下の略語は、以下の意味を有する。略語が定義されない場合、それはその一般に受け入れられた意味を有する。

本発明の化合物は、有機合成の当業者に知られた様々な方法で調製することができる。本発明の化合物は、合成有機化学の当技術分野で知られた合成方法又はそれに基づく当業者によって理解されるとおりの変形と一緒に、以下に記載されるとおりの方法を使用して合成することができる。

本発明の化合物は、以下の一般的方法及び手順を使用して、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。典型的な又は好ましいプロセス条件(すなわち、反応温度、時間、反応物質のモル比、溶媒、圧力、など)が示される場合、特に断りのない限り、他のプロセス条件も使用することができると理解されよう。最適な反応条件は、使用される特定の反応物質又は溶媒によって変わってもよいが、このような条件は、日常的な最適化手順により当業者によって決定することができる。

中間体A
3-(4-((2-アミノエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン塩酸塩

ステップA
4-アミノ-N'-ヒドロキシ-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシイミダミド

マロノニトリル(3.2kg、50モル)を、45℃に予熱した水(70L)に添加し、5分間攪拌した。得られた溶液を氷浴中で冷却し、亜硝酸ナトリウム(3.8kg、55モル)を添加した。温度が10℃に達した時、6N塩酸(550mL)を添加した。穏やかな発熱反応が続いて起こり、温度は16℃に達した。15分後、冷浴を取り除き、反応混合物を16〜18℃で1.5時間攪拌した。反応混合物を13℃に冷却し、50%水性ヒドロキシルアミン(9.9kg、150モル)をすべて一度に添加した。温度は26℃に上昇した。発熱反応が弱った時、冷浴を取り除き、攪拌を26〜27℃で1時間続け、次いで、それをゆっくりと還流させた。還流を2時間維持し、次いで、反応混合物を一晩冷却させた。反応混合物を冷浴中で攪拌し、6N塩酸(8L)をpH7.0に40分かけて少しずつ添加した。攪拌を氷浴中5℃で続けた。沈殿物を濾過により収集し、水で十分に洗浄し、真空オーブン(50℃)中で乾燥させて、オフホワイトの固体として所望の生成物(5.6kg、78%)を得た。LCMS (M+H)⁺: m/z = 144.1. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ10.46 (s, 1H), 6.27 (s, 2H), 6.18 (s, 2H).

ステップB
4-アミノ-N-ヒドロキシ-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルビミドイルクロリド

4-アミノ-N'-ヒドロキシ-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシイミダミド(4.25kg、29.7モル)を、水(60L)、酢酸(30L)及び6N塩酸(14.75L)の混合物に添加し、この懸濁液を、完全な溶液が得られるまで42〜45℃で攪拌した。塩化ナトリウム(5.22kg、89.1モル)を添加し、この溶液を氷/水/メタノール浴中で攪拌した。亜硝酸ナトリウム(2.01kg、29.1モル)の水(7L)中溶液を、温度を0℃未満に維持しながら3.5時間にわたって滴下添加した。添加を完了した後、攪拌を氷浴中で1.5時間続け、次いで、反応混合物を15℃に加温した。沈殿物を濾過により収集し、水で十分に洗浄し、真空中で乾燥させて、オフホワイトの固体として所望の生成物(2.51kg、52%)を得た。LCMS (M+H)⁺: m/z = 163.1. ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 13.38 (s, 1H), 6.29 (s, 2H).

ステップC
4-アミノ-N'-ヒドロキシ-N-(2-メトキシエチル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシイミダミド

4-アミノ-N-ヒドロキシ-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルビミドイルクロリド(2.13kg、13.15モル)をEtOAc(13L)と混合した。0〜5℃で、攪拌しながら、2-メトキシエチルアミン(1.1kg、14.46モル)を一度に添加した。反応温度は41℃に上昇した。反応物を0〜5℃に冷却した。TEA(2.0kg、19.73モル)を添加した。5分攪拌後、反応物を水(5L)、ブライン(5L)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、茶色の油として所望の生成物(1.61kg、61%)を得た。LCMS (M+H)⁺: m/z = 202.1. ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 10.65 (s, 1H), 6.27 (s, 2H), 6.10 (t, J = 6.5Hz, 1H), 3.50 (m, 2H), 3.35 (d, J = 5. 8Hz, 2H), 3.08 (s, 3H).

ステップD
N'-ヒドロキシ4-((2-メトキシエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシイミダミド

4-アミノ-N'-ヒドロキシ-N-(2-メトキシエチル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシイミダミド(2.56kg、12.7モル)を水(10L)と混合し、水酸化カリウム(2.18kg、39モル)を添加した。反応物を100℃で一晩還流させた。反応物を室温に冷却し、EtOAc(10L×4)で抽出し、合わせた有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、オフホワイトの粗固体として所望の生成物(1.87kg、73%)を得た。LCMS (M+H)⁺: m/z = 202.1. ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 10.54 (s, 1H), 6.22(s, 2H), 6.15(t, J = 5.8Hz, 1H), 3.45(t, J = 5.3Hz, 2H), 3.35 (m, 2H), 3.22 (s, 3H).

ステップE
N-ヒドロキシ-4-((2-メトキシエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルビミドイルクロリド

室温で、N'-ヒドロキシ4-((2-メトキシエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシイミダミド(1.87kg、9.3モル)を6N塩酸水溶液(5.12L)に溶解させた。塩化ナトリウム(1.63kg、27.9モル)、続いて、水(10.2L)及びEtOAc(10.2L)を添加した。3〜5℃で、前に調製した亜硝酸ナトリウム(615g、8.8モル)の水溶液(4.3L)を1時間かけてゆっくりと添加した。反応物を3〜8℃で2時間、次いで、室温で一晩攪拌した。この反応混合物をEtOAc(10L×3)で抽出した。合わせた有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、オフホワイトの固体として所望の生成物(1.5kg、73%)を得た。LCMS (M+H)⁺: m/z = 221.1. ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 13.43 (s, 1H), 5.85 (t, J = 5.6Hz, 1H), 3.50 (t, J = 5. 6Hz, 2H), 3.37 (dd, J = 10.8, 5.6Hz, 2H), 3.25 (s, 3H).

ステップF
N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシ-4-((2-メトキシエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシイミダミド

N-ヒドロキシ-4-((2-メトキシエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルビミドイルクロリド(1.5kg、6.8モル)を水(10L)と混合した。この混合物を60℃に加熱した。3-ブロモ-4-フルオロアニリン(1.44kg、7.46モル)を添加し、10分間攪拌した。温かい炭酸水素ナトリウム(0.86kg、10モル)溶液(10Lの水)を15分にわたって添加した。この反応混合物を60℃で20分間攪拌した。反応混合物を室温に冷却し、EtOAc(10L^*2)で抽出した。合わせた有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、茶色の固体として所望の生成物(2.3kg、90%)を得た。LCMS (M + H) ⁺: m / z = 374.0, 376.0. ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 11.55 (s, 1H), 8.85 (s, 1H), 7.16 (t, J = 8. 8Hz, 1H), 7.08 (dd, J = 6.1, 2.7Hz, 1H), 6.75 (m, 1H), 6.14 (t, J = 5.8Hz, 1H), 3.48 (t, J = 5.2Hz, 2H), 3.35 (dd, J = 10.8, 5.6Hz, 2H), 3.22 (s, 3H).

ステップG
4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-3-(4-((2-メトキシエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン

N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシ-4-((2-メトキシエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシイミダミド(2.3kg、6.15モル)、CDI(1.49kg、9.2モル)、及びEtOAc(20L)の混合物を60℃に加熱し、20分間攪拌した。反応物を室温に冷却し、1N HCl(2×15L)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、茶色の固体として所望の生成物(1.95kg、80%)を得た。LCMS (M + H)⁺: m/z= 400.0, 402.0. ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ7.94 (t, J = 8.2Hz, 1H), 7.72 (dd, J = 9. 1, 2.3Hz, 1H), 7.42 (m, 1H), 6.42 (t, J = 5.7Hz, 1H), 3.46 (t, J = 5. 4Hz, 2H), 3.36 (t, J = 5.8Hz, 2H), 3.26 (s, 3H).

ステップH
4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-3-(4-((2-ヒドロキシエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,4-オキサジサゾール-5(4H)-オン

4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-3-(4-((2-メトキシエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン(650g、1.625モル)をジクロロメタン(5L)に溶解させた。-67℃で、三臭化ホウ素(313ml、3.25モル)を50分にわたって添加した。反応物を-10℃に60分で加温した。反応物を室温で1時間攪拌した。次いで、反応物を-5℃に冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(12.5L)で2時間にわたってゆっくりとクエンチした。反応温度は25℃に上昇した。反応物をEtOAc(2×4.5L)で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、茶色の固体として所望の生成物(627g、100%)を得た。LCMS (M + H)⁺: m/z= 386.0, 388.0. ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 8.08 (dd, J = 6.2, 2.5Hz, 1H), 7.70 (m, 1H), 7.68 (t, J = 8.7Hz, 1H), 6.33 (t, J = 5.6Hz, 1H), 4.85 (t, J = 5.0Hz, 1H), 3.56 (dd, J = 10.6, 5.6Hz, 2H), 3.29 (dd, J = 11.5, 5.9Hz, 2H).

ステップI
2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチルメタンスルホネート

4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-3-(4-((2-ヒドロキシエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,4-オキサジサゾール-5(4H)-オン(1.89kg、4.89モル)のEtOAc(15L)中溶液を、室温での1時間にわたるメタンスルホニルクロリド(500mL、7.4モル)の滴下添加によって処理した。トリエチルアミン(1027mL、7.4モル)を50分にわたって滴下添加し、その間の時間に、反応温度は37℃に上昇した。2時間後、反応混合物を水(6L)、ブライン(2L)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、茶色の固体として所望の生成物(2.22kg、98%)を得た。LCMS (M + Na) ⁺: m /z = 485.9, 487.9. ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 8. 08 (dd, J = 6.2, 2.5Hz, 1H), 7.72 (m, 1H), 7.58 (t, J = 8.7Hz, 1H), 6.75 (t, J = 5.7Hz, 1H), 4.36 (t, J = 5.3Hz, 2H ), 3.58 (dd, J = 11.2, 5.6Hz, 2H), 3.18 (s, 3H).

ステップJ
3-(4-((2-アジドエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン

22Lフラスコ中で攪拌している2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチルメタンスルホネート(2.22kg、4.8モル)のジメチルホルムアミド(4L)中溶液を、アジドナトリウム(400g、6.15モル)で処理した。反応物を50℃で一晩加熱した。この反応混合物を氷/水(8L)に注ぎ入れ、1:1酢酸エチル:ヘプタン(20L)で抽出した。有機層を水(5L)、及びブライン(5L)で洗浄し、溶媒を真空中で除去して、タン色の固体として所望の生成物(1.7kg、86%)を得た。LCMS (M + Na)⁺: m/z = 433.0, 435.0. ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 8.08 (dd, J = 6.2, 2.5Hz, 1H), 7.72 (m, 1H), 7. 58 (t, J = 8.7Hz, 1H), 6.75 (t, J = 5.7Hz, 1H), 3.54 (t, J = 5.3Hz, 2H), 3.45 (dd, J = 11.1, 5.2Hz, 2H).

ステップK
tert-ブチル(2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)カルバメート

ヨウ化ナトリウム(4.09kg、27.3モル)を、メタノール(23L)中3-(4-((2-アジドエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン(1.7kg、4.1モル)に添加した。この混合物を30分間攪拌し、その間の時間に穏やかな発熱が認められた。クロロトリメチルシラン(3.53L、27.8モル)をメタノール(3.5L)中溶液として、温度が35℃を超えないような速度で滴下添加し、この反応物を周囲温度で3.5時間攪拌した。反応物を、チオ硫酸ナトリウム5水和物の水(5.7L)中33重量%溶液で中和し、水(15L)で希釈し、pHを固体炭酸カリウム(1.15kg、8.33モル)で注意深く9に調整した。ジ-tert-ブチルジカーボネート(1.205kg、5.52モル)を添加し、この反応物を室温で攪拌させた。追加の炭酸カリウム(750g、5.41モル)を150gずつ4時間かけて添加して、pHが9で又はそれを超えて維持されることを確保した。室温で一晩攪拌後、固体を濾過し、水(7.8L)、次いでMTBE(6L)とともに粉砕した。次いで、固体を1:1THF:ジクロロメタン(6L、22Lの回転エバポレータフラスコ中、50℃、1時間)とともに粉砕し、濾過し、ジクロロメタン(3L)で洗浄して、オフホワイトの固体を得た。この粗材料を55℃テトラヒドロフランに溶解させ(5mL/g)、脱色炭(2重量%)及びシリカゲル(2重量%)で処理し、セライトに通して高温濾過して、オフホワイトの固体として生成物(1720g、86%)を得た。LCMS (M + Na)⁺: m/z = 506.8, 508.8. ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 8.08 (dd, J = 6.2, 2.5Hz, 1H), 7.72 (m, 1H), 7. 60 (t, J = 8.7Hz, 1H), 6.94 m, 1H), 6.52 (m, 1H), 3.30 (m, 2H), 3.18 (m, 2H), 1.38 (s, 9H).

ステップL
3-(4-((2-アミノエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン塩酸塩

22Lのフラスコに塩化水素(1.4-ジオキサン中3N溶液、4L、12モル)を投入した。tert-ブチル(2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)カルバメート(1.72kg、3.54モル)を、固体として少しずつ10分かけて添加した。このスラリーを室温で攪拌し、徐々に濃いペーストになり、これは攪拌することができなかった。室温で一晩置いた後、ペーストをEtOAc(10L)にスラリー化し、濾過し、乾燥させて、白色の固体として所望の生成物(1.38kg、93%)を得た。¹H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ8.12 (m, 4H), 7.76 (m, 1H), 7.58 (t, J = 8. 7Hz, 1H), 6.78 (t, J = 6.1Hz, 1H), 3.51 (dd, J = 11.8, 6.1Hz, 2H), 3.02 (m, 2H). LCMS (M + H)⁺: m/z = 384.9, 386.9.

ステップA
メチル3-メチル-2-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート

メチル2-ブロモ-3-メチルベンゾエート(5g、21.83ミリモル)のジオキサン(100mL)中溶液を、ビス(ピナコラト)ジボロン(6.65g、26.2ミリモル)及び酢酸カリウム(6.43g、65.5ミリモル)で処理した。この混合物をN₂で脱気し、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロリド(1.532g、2.183ミリモル)を添加し、90℃で22時間加熱した。反応物を室温に冷却後、それをセライトの短いパッドに通して濾過した。濾液を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(10%EtOAc/ヘキサン)により精製して、固体としてメチル3-メチル-2-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート(4.3g、14.01ミリモル、64.2%収率)を得た。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.44 (s, 12 H) 2.43 (s, 3 H) 3.89 (s, 3 H) 7.22 - 7.33 (m, 2 H) 7.76 (d, J=7.43 Hz, 1 H). LCMS (M + H)⁺: m/z = 277.3.

ステップB
メチル3-(ブロモメチル)-2-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート

メチル3-メチル-2-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート(4.8g、13.91ミリモル)の四塩化炭素(100.0mL)中溶液を、NBS(4.27g、24.01ミリモル)、続いて、AIBN(0.717g、4.37ミリモル)で処理した。この混合物を還流で6時間加熱した。溶媒を除去し、粗材料をシリカゲルクロマトグラフィー(20%EtOAc/ヘキサン)により精製して、固体としてメチル3-(ブロモメチル)-2-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート(5.15g、10.15ミリモル、46.5%収率、70%純度)を得た。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.47 (s, 12 H) 3.90 (s, 3 H) 4.58 (s, 2 H) 7.38 (t, J=7.72 Hz, 1 H) 7.53 - 7.58 (m, 1 H) 7.87 (d, J=7.62 Hz, 1 H).

ステップC
1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロベンゾ[c][1,2]オキサボロール-7-カルボン酸

メチル3-(ブロモメチル)-2-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート(3.9g、10.98ミリモル)のACN(10.0mL)及び水(10.0mL)の混合物中溶液を、トリフルオロ酢酸(10.09mL、131ミリモル)で処理し、70℃で16時間攪拌した。混合物のアセトニトリルの除去後、反応物を水性NaHCO₃でpH7に中和し、EtOAc(3×50mL)で抽出した。合わせた有機物を廃棄した。次いで、水層を1N HClで酸性化し、EtOAc(4×50mL)で抽出した。合わせた有機層を水、ブラインで洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、固体として1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロベンゾ[c][1,2]オキサボロール-7-カルボン酸(1.4g、7.08ミリモル、32.4%収率)を得た。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 5.09 (s, 2 H) 7.58 - 7.68 (m, 1 H) 7.69 - 7.75 (m, 1 H) 7.98 (d, J=7.43 Hz, 1 H) 8.86 (br. s., 1 H). LCMS (M + H)⁺: m/z = 179.1.

ステップA
(3-ブロモ-1,2-フェニレン)ジメタノール

CAS番号58749-33-0であるか、又は米国特許出願公開第2007049618号での調製に従って作製された、ジメチル3-ブロモフタレート(20g、73.5ミリモル)のエーテル(60mL)中溶液を0℃に冷却し、THF(140mL)中LiBH₄(6.3g、220.6ミリモル)の1時間の滴下添加により処理した。この反応混合物を室温で一晩攪拌した。この反応物を氷水に注ぎ入れ、濃HClでpH=2に酸性化した。有機層をEtOAc(3×200mL)で抽出し、Na₂SO₄上で乾燥させ、濃縮して、白色の固体として(3-ブロモ-1,2-フェニレン)ジメタノール(4.7g、30%)を得た。Rf=0.1(30%EtOAc/PE)。

ステップB
2,2'-(((3-ブロモ-1,2-フェニレン)ビス(メチレン))ビス(オキシ))ビス(テトラヒドロ-2H-ピラン)

(3-ブロモ-1,2-フェニレン)ジメタノール(15g、69.1ミリモル)のDHP(75mL)中溶液を濃HCl(0.3mL)で処理した。この反応物を室温で12時間攪拌した。次いで、反応物をEtOAc(300mL)で希釈し、水(800mL)で洗浄した。有機層をNa₂SO₄上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー(2%EtOAc/PE)により精製して、淡黄色の液体として2,2'-(((3-ブロモ-1,2-フェニレン)ビス(メチレン))ビス(オキシ))ビス(テトラヒドロ-2H-ピラン)(28g、100%)を得た。Rf=0.4(30%EtOAc/PE)。

ステップC
4-(ヒドロキシメチル)ベンゾ[c][1,2]オキサボロール-1(3H)-オール

2,2'-(((3-ブロモ-1,2-フェニレン)ビス(メチレン))ビス(オキシ))ビス(テトラヒドロ-2H-ピラン)(14g、36.5ミリモル)のTHF(186mL)中溶液を-78℃に冷却し、次いで、n-BuLi(16.4mL、40.1ミリモル)の滴下添加により処理した。この混合物を30分間攪拌し、次いで、同じ温度で(iPrO)₃B(53.6mL、219.6ミリモル)の滴下添加により処理した。次いで、反応物を室温に加温しながら一晩攪拌させた。反応物を濃HCl(84mL)で処理し、一晩攪拌した。次いで、反応物を水(200mL)で希釈し、EtOAc(2×200mL)で抽出し、次いで、飽和Na₂SO₃で塩基性化し、有機層を分離し、希HClで酸性化し(pH=2)、EtOAc(2×200mL)で抽出した。分離された有機層をNa₂SO₄上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、オフホワイトの固体として4-(ヒドロキシメチル)ベンゾ[c][1,2]オキサボロール-1(3H)-オール(2.13g、36%)を得た。Rf=0.1(5%MeOH/CHCl₃)。

ステップD
4-(ブロモメチル)ベンゾ[c][1,2]オキサボロール-1(3H)-オール

4-(ヒドロキシメチル)ベンゾ[c][1,2]オキサボロール-1(3H)-オール(1.0g、6.1ミリモル)が入っているフラスコを、水性HBr(10mL、10M)で処理した。この反応物を室温で一晩攪拌した。反応物を水で希釈し、固体を濾過し、水ですすぎ洗いし、乾燥させて、白色の固体として4-(ブロモメチル)ベンゾ[c][1,2]オキサボロール-1(3H)-オール(1.2g、87%)を得た。Rf=0.6(5%MeOH/CHCl₃)。

ステップE
tert-ブチル((1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロベンゾ[c][1,2]オキサボロール-4-イル)メチル)(メチル)カルバメート

n-ヘキサンで洗浄したNaH(0.42g、17.5ミリモル)が入っているフラスコを、ジオキサン(15mL)中tert-ブチルメチルカルバメート(1.15g、8.7ミリモル)で処理し、30分間攪拌した。次いで、このフラスコを、10℃で4-(ブロモメチル)ベンゾ[c][1,2]オキサボロール-1(3H)-オール(1g、4.3ミリモル)の添加により処理し、次いで、この反応物を室温で8時間攪拌した。次いで、反応物を氷冷水の添加によりクエンチし、エーテルで抽出した。有機物を除外し、水性物を1N HClで酸性化し、EtOAcで抽出し、Na₂SO₄上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、濃い液体としてtert-ブチル((1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロベンゾ[c][1,2]オキサボロール-4-イル)メチル)(メチル)カルバメート(1g、82%)を得た。

ステップF
4-((メチルアミノ)メチル)ベンゾ[c][1,2]オキサボロール-1(3H)-オール

tert-ブチル((1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロベンゾ[c][1,2]オキサボロール-4-イル)メチル)(メチル)カルバメート(1g、3.6ミリモル)が入っているフラスコを、濃HCl(10mL)で処理し、4時間攪拌した。溶媒を蒸留除去し、減圧下で乾燥させて、残渣を得た。この残渣をアセトン中で再結晶させて、茶色の固体として4-((メチルアミノ)メチル)ベンゾ[c][1,2]オキサボロール-1(3H)-オール(0.3g、48%)を得た。

[実施例1]
化合物1
N-(2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド

ステップA
メチル2-ブロモ-3-(ジブロモメチル)ベンゾエート

メチル2-ブロモ-3-メチルベンゾエート(8.0g、34.2ミリモル)の四塩化炭素(100mL)中溶液に、NBS(18.27g、103ミリモル)、続いて過酸化ベンゾイル(1.658g、6.85ミリモル)を添加し、この混合物を窒素雰囲気下75℃で3.5時間攪拌した。混合物を濃縮し、ジエチルエーテルとともに粉砕し、濾過した。濾液を1:1ジエチルエーテル/ヘキサンに溶解させ、水で洗浄した。有機相を乾燥させ(Na₂SO₄)、濃縮し、真空中で乾燥させて、黄色がかった固体としてメチル2-ブロモ-3-(ジブロモメチル)ベンゾエート(14.0g、34.8ミリモル、98%収率)を得た。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 2.79 (s, 1 H) 3.97 (s, 3 H) 7.46 - 7.52 (m, 1 H) 7.64 (dd, J=7.65, 1.63 Hz, 1 H) 8.20 (dd, J=8.03, 1.51 Hz, 1 H). LC/MS (m/z) ES⁺: 386.9, 389.0 (M+1)⁺.

ステップB
メチル2-ブロモ-3-ホルミルベンゾエート

メチル2-ブロモ-3-(ジブロモメチル)ベンゾエート(17.62g、45.5ミリモル)のアセトン(200mL)中溶液に、硝酸銀(23.21g、137ミリモル)及び水(50ml)を添加した。この懸濁液を暗所中周囲温度で1時間攪拌した。銀塩を濾過により除去し、濾液をEtOAcで希釈し、ブライン、飽和炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。有機層を乾燥させ(Na₂SO₄)、濃縮し、シリカ上(EtOAc/ヘキサン、0〜20%)で精製して、白色の固体としてメチル2-ブロモ-3-ホルミルベンゾエート(9.0g、37.0ミリモル、81%収率)を得た。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δppm 4.01 (s, 3 H) 7.52 (t, J=7.65 Hz, 1 H) 7.92 (dd, J=7.53, 1.76 Hz, 1 H) 8.04 (dd, J=7.53, 1.76 Hz, 1 H) 10.53 (s, 1 H). LC/MS (m/z) ES⁺ : 243.0, 245.1 (M+1)⁺.

ステップC
メチル2-ブロモ-3-(2-メトキシビニル)ベンゾエート

カリウムt-ブトキシド(5.73g、51.1ミリモル)のTHF(130mL)中懸濁液に窒素雰囲気下で、(メトキシメチル)トリフェニルホスホニウムクロリド(17.52g、51.1ミリモル)を添加し、この深赤色混合物を周囲温度で45分間攪拌し、次いで、メチル2-ブロモ-3-ホルミルベンゾエート(6.21g、25.5ミリモル)を一度で添加した。周囲温度での攪拌を2時間続けた。飽和NH₄Cl/水、及びEtOAcを添加し、有機相を乾燥させ(Na₂SO₄)、濃縮し、シリカゲル上(EtOAc/ヘキサン、0〜5%)で精製して、E/Z混合物としてメチル2-ブロモ-3-(2-メトキシビニル)ベンゾエート(6.53g、24.09ミリモル、94%収率)を得た。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 3.77 (s, 3 H) 3.82 (s, 3 H) 3.96 (d, J=3.51 Hz, 6 H) 5.72 (d, J=7.28 Hz, 1 H) 6.20 (d, J=12.80 Hz, 1 H) 6.32 (d, J=7.28 Hz, 1 H) 6.98 (d, J=12.80 Hz, 1 H) 7.25 - 7.34 (m, 2 H) 7.39 - 7.48 (m, 3 H) 8.14 (dd, J=7.91, 1.63 Hz, 1 H). LC/MS (m/z) ES⁺ : 271.1, 273.1 (M+1)⁺.

ステップD
メチル3-(2-メトキシビニル)-2-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート

メチル2-ブロモ-3-(2-メトキシビニル)ベンゾエート(6.5g、22.30ミリモル)、ビス(ピナコラト)ジボロン(6.23g、24.53ミリモル)、酢酸カリウム(6.56g、66.9ミリモル)、1,4-ジオキサン(170mL)、及びビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロリド(4.70g、6.69ミリモル)の混合物を、窒素の流れで10分間脱気し、密封管の中に入れ、95℃で28時間加熱した。混合物を濾過し、濾液をEtOAcと水の間に分配した。有機相を乾燥させ(Na₂SO₄)、濃縮し、(EtOAc/ヘキサン、0〜10%)を使用してシリカゲル上で精製して、E/Z混合物としてメチル3-(2-メトキシビニル)-2-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート(4.39g、13.80ミリモル、62%収率)を得た。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δppm 1.48 (d, J=3.76 Hz, 24 H) 3.72 (s, 3 H) 3.79 (s, 3 H) 3.93 (d, J=2.76 Hz, 6 H) 5.46 (d, J=7.28 Hz, 1 H) 6.06 (d, J=12.80 Hz, 1 H) 6.21 (d, J=7.28 Hz, 1 H) 6.98 (d, J=12.80 Hz, 1 H) 7.30 - 7.40 (m, 2 H) 7.48 (d, J=7.78 Hz, 1 H) 7.73 - 7.83 (m, 2 H) 8.19 (d, J=7.78 Hz, 1 H). LC/MS (m/z) ES⁺ : 341.3 (M+23)⁺.

ステップE
メチル1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキシレート

メチル3-(2-メトキシビニル)-2-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート(4.14g、12.75ミリモル)のテトラヒドロフラン(90mL)中溶液に、4N HCl/水(31.9mL、128ミリモル)を添加し、この混合物を60℃で3時間攪拌した。混合物をEtOAcと水の間に分配した。有機相を水(4×)で洗浄し、乾燥させ(Na₂SO₄)、濃縮して、浅黄色の半固体としてメチル1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキシレート(2.12g、9.56ミリモル、75.0%収率)を得た。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 4.01 (s, 3 H) 6.26 (d, J=5.27 Hz, 1 H) 7.14 (d, J=5.24 Hz, 1 H) 7.53 - 7.68 (m, 2 H) 8.18 (dd, J=7.26, 1.30 Hz, 1 H) 10.27 (s, 1 H). LC/MS (m/z) ES⁺ : 205.1 (M+1)⁺.

ステップF
メチル1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキシレート

メチル1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキシレート(2.1g、9.47ミリモル)のEtOAc(80mL)中溶液に、10%Pd-C(1.008g、0.947ミリモル)を添加し、この混合物を水素雰囲気下で周囲温度にて1時間攪拌した。混合物を、EtOAc及びMeOHで洗浄しながら濾過した。濾液を濃縮し、真空中で乾燥させて、透明な油としてメチル1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキシレート(1.99g、8.98ミリモル、95%収率)を得た。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 2.99 (s, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.09 - 4.17 (m, 2 H) 7.36 - 7.62 (m, 2 H) 7.95 (d, J=7.53 Hz, 1 H) 9.04 - 9.47 (m, 1 H). LC/MS (m/z) ES⁺ : 207.2 (M+1)⁺.

ステップG
N-(2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド

メチル1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキシレート(220mg、0.929ミリモル)、3-(4-((2-アミノエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン塩酸塩、中間体A(392mg、0.929ミリモル)、MeOH(8mL)、DIEA(0.974mL、5.57ミリモル)、及びDMAP(45.4mg、0.372ミリモル)の混合物を、窒素雰囲気下80℃で18時間攪拌した。この混合物を濃縮し、EtOAcに溶解させ、1N HCl/水で洗浄した。有機相を乾燥させ(Na₂SO₄)、濃縮し、逆相C18 HPLC(10〜60%ACN/水、0.2%ギ酸)により精製して、オフホワイトの固体としてN-(2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド(336mg、0.589ミリモル、63.4%収率)を得た。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.92 (t, J=5.65 Hz, 2 H) 3.42 - 3.60 (m, 4 H) 3.99 (t, J=5.77 Hz, 2 H) 6.60 (t, J=5.77 Hz, 1 H) 7.34 - 7.45 (m, 2 H) 7.46 - 7.53 (m, 1 H) 7.58 - 7.68 (m, 1 H) 7.74 - 7.84 (m, 1 H) 8.14 (dd, J=6.15, 2.38 Hz, 1 H) 8.68 (t, J=5.52 Hz, 1 H) 9.18 (s, 1 H). LC/MS (m/z) ES⁺ : 559.2, 561.3 (M+1)⁺.

ステップH
N-(2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド

メタノール(3mL)中N-(2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド(260mg、0.451ミリモル)に、2M NaOH/水(0.541mL、1.353ミリモル)を添加し、この混合物を周囲温度で20分間攪拌し、次いで、濃縮した。少量の水を添加し、この透明な溶液をpH約2に3N HCl/水で処理した。固体を濾過し、水で洗浄し、真空中で乾燥させて、オフホワイトの固体としてN-(2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド(220mg、0.409ミリモル、91%収率)を得た。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.91 (t, J=5.52 Hz, 2 H) 3.43 - 3.58 (m, 4 H) 4.01 (t, J=5.65 Hz, 2 H) 6.35 (t, J=5.65 Hz, 1 H) 6.72 - 6.81 (m, 1 H) 7.10 - 7.20 (m, 2 H) 7.33 - 7.52 (m, 3 H) 8.68 - 8.76 (m, 1 H) 8.94 (s, 1 H) 9.12 (br. s., 1 H) 11.40 (s, 1 H). LC/MS (m/z) ES⁺ : 533 (M+1)⁺.

[実施例2]
化合物2
N-(2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド

ステップA
N-(2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド

メチル3-(2-メトキシビニル)-2-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート(43mg、0.136ミリモル)、3-(4-((2-アミノエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン塩酸塩、中間体A(59mg、0.14ミリモル)、MeOH(2mL)、DIEA(0.105g、0.816ミリモル)、及びDMAP(3.3mg、0.027ミリモル)の混合物を、80℃に5時間加熱した。この混合物を濃縮し、残渣をTHF(2mL)に溶解させ、3N HCl/水(0.2mL、0.6ミリモル)を添加し、この混合物を50℃で1.5時間攪拌した。混合物をEtOAcと水の間に分配した。有機相を乾燥させ(Na₂SO₄)、濃縮し、逆相C18 HPLC(10〜90%ACN/水、0.05%TFA)により精製して、オフホワイトの固体としてN-(2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド(34.3mg、45%)を得た。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 3.54 (dt, J=17.94, 5.33 Hz, 4 H) 6.41 (d, J=5.52 Hz, 1 H) 6.67 (t, J=5.65 Hz, 1 H) 7.20 (d, J=5.27 Hz, 1 H) 7.53 - 7.72 (m, 4 H) 7.73 - 7.80 (m, 1 H) 8.12 (dd, J=6.15, 2.38 Hz, 1 H) 8.85 (t, J=5.27 Hz, 1 H) 9.90 (br. s., 1 H). LC/MS (m/z) ES⁺ : 557 (M+1)⁺.

ステップB
N-(2-((4-N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド

N-(2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド(32mg、0.055ミリモル)のMeOH(0.5mL)中溶液に、1M NaOH/水(0.327mL、0.327ミリモル)を添加し、この混合物を周囲温度で1時間攪拌した。混合物を逆相C18 HPLC(10〜90%ACN/水、0.05%TFA)により精製して、オフホワイトの固体としてN-(2-((4-N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-8-カルボキサミド(16.1mg、0.029ミリモル、53.3%収率)を得た。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 3.45 - 3.59 (m, 4 H) 6.31 - 6.44 (m, 2 H) 6.76 (dt, J=8.72, 3.42 Hz, 1 H) 7.07 - 7.23 (m, 3 H) 7.56 (dd, J=16.94, 7.40 Hz, 2 H) 7.63 - 7.73 (m, 1 H) 8.83 - 8.94 (m, 2 H) 9.85 (br. s., 1 H) 11.42 (s, 1 H). LC/MS (m/z) ES⁺ : 531 (M+1)⁺.

[実施例3]
化合物3
N-(2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキサミド

ステップA
メチル3-ブロモ-4-(ジブロモメチル)ベンゾエート

メチル3-ブロモ-4-メチルベンゾエート(15.0g、65.5ミリモル)のCCl4(100mL)中溶液に、NBS(24.5g、138.0ミリモル)、続いて過酸化ベンゾイル(1.6g、6.6ミリモル)を添加した。この混合物を窒素下75℃で6時間攪拌し、濾過し、濾液を濃縮し、ジエチルエーテル中で粉砕し、濾過し、濾液を濃縮して、メチル3-ブロモ-4-(ジブロモメチル)ベンゾエート(32g、65.3ミリモル、定量的)を得た。さらに精製することなく次のステップに使用した。LC/MS(m/z)ES⁺:386.9、388.9[M+1]⁺。

ステップB
メチル3-ブロモ-4-ホルミルベンゾエート

メチル3-ブロモ-4-(ジブロモメチル)ベンゾエート(32.0g、65.3ミリモル)のアセトン(400mL)中溶液に、硝酸銀(33.3g、196ミリモル)及び水(100mL)を添加した。この懸濁液を暗所中周囲温度で1時間攪拌した。銀塩を濾過により除去し、濾液をEtOAcで希釈し、ブライン、飽和炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。有機層を乾燥させ(Na₂SO₄)、濃縮し、シリカ上(EtOAc/ヘキサン、0〜20%)で精製して、白色の固体としてメチル3-ブロモ-4-ホルミルベンゾエート(12.9g、52.0ミリモル、80%収率)を得た。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ ppm 10.26 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.08 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.97 (d, J=8.0 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H); LC/MS (m/z) ES⁺ : 243 (M+1)⁺

ステップC
メチル3-ブロモ-4-(2-メトキシビニル)ベンゾエート

カリウムt-ブトキシド(3.4g、28.8ミリモル)のTHF(100mL)中懸濁液に、(メトキシメチル)トリフェニルホスホニウムクロリド(11.20g、31.7ミリモル)を添加した。この反応混合物を周囲温度で30分間攪拌し、この赤色の溶液を、メチル3-ブロモ-4-ホルミルベンゾエート(3.5g、14.40ミリモル)が入っている密閉フラスコ中に注射器によって移し、周囲温度で1時間攪拌した。この反応混合物を飽和塩化アンモニウムでクエンチし、EtOAcと水の間に分配した。水層をEtOAcで再度抽出し、合わせた有機層を乾燥させ(Na₂SO₄)、真空中で濃縮し、シリカ上(EtOAc/ヘキサン、0〜5%)で精製して、白色の固体としてメチル3-ブロモ-4-(2-メトキシビニル)ベンゾエート(3.5g、12.26ミリモル、85%収率、E及びZ異性体の混合物)を得た。LC/MS (m/z) ES⁺: 271 (M+1)⁺.

ステップD
メチル4-(2-メトキシビニル)-3-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート

メチル3-ブロモ-4-(2-メトキシビニル)ベンゾエート(11.7g、43.2ミリモル)、ビス(ピナコラト)ジボロン(13.15g、51.8ミリモル)、及び酢酸カリウム(12.71g、129ミリモル)の1,4-ジオキサン(200mL)中混合物にN₂下で、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロリド(3.03g、4.32ミリモル)を添加し、この反応物を95℃で23時間攪拌した。この反応混合物を冷却し、濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲル上(EtOAc/ヘキサン、0〜5%)で精製して、メチル4-(2-メトキシビニル)-3-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート(11.72g、34.3ミリモル、79%収率、E及びZ異性体の混合物)を得た。LC/MS (m/z) ES⁺: 319 (M+1)⁺.

ステップE
メチル1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキシレート

メチル4-(2-メトキシビニル)-3-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート(6.7g、21.06ミリモル)のTHF(211mL)中溶液に、4N HCl/水(52.6mL、211ミリモル)を添加し、70℃に1.5時間加熱した。この混合物をEtOAcと水の間に分配した。有機層を乾燥させ(Na₂SO₄)、真空中で濃縮し、シリカ上(EtOAc/ヘキサン、0〜30%)で精製して、白色の固体としてメチル1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキシレート(2.86g、13.60ミリモル、64.6%収率)を得た。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ ppm 9.51 (s, 1H), 8.66 (d, J=1.4 Hz, 1H), 8.12 (dd, J=1.8, 8.2 Hz, 1H), 7.54 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.28 (d, J=5.4 Hz, 1H), 6.44 (d, J=5.5 Hz, 1H), 3.32 (s, 3H). LC/MS (m/z) ES⁺: 205 (M+1)⁺.

ステップF
1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボン酸

メチル1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキシレート(2.8g、13.73ミリモル)のMeOH(100mL)中懸濁液に、1N水酸化リチウム/水(137mL)を添加し、この混合物を50℃で2時間攪拌した。メタノールをストリッピングし、この混合物を、濃HClを滴下添加することによって酸性化して、白色の沈殿物を形成した。この混合物を濾過し、固体を乾燥させて、白色の固体(1.6g)を得た。濾液をEtOAcで抽出し、乾燥させ(Na₂SO₄)、溶媒を真空中で除去して、別の白色の固体(695mg、87%合わせた収率)を得た。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ ppm 12.91 (br, s, 1H), 9.45 (br, s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.10 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.51 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.26 (d, J=5.4 Hz, 1H), 6.43 (d, J = 5.4 Hz, 1H). LC/MS (m/z) ES⁺: 191 (M+1)⁺.

ステップG
N-(2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキサミド

DMF(5mL)中1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボン酸(1.0g、5.26ミリモル)に、HATU(2.202g、5.79ミリモル)及びDIEA(2.69mL、15.79ミリモル)を添加し、この混合物を10分間攪拌し、続いて、3-(4-((2-アミノエチル)アミノ-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン塩酸塩、中間体A(2.219g、5.26ミリモル)を添加した。この混合物を1時間攪拌し、エチルEtOAcで希釈し、0.5N HCl及び水で洗浄した。有機層を濃縮し、真空中で乾燥させて、N-(2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキサミド(3.13g、5.62ミリモル、定量的)を得た。LC/MS (m/z) ES⁺: 557 (M+1)⁺

ステップH
N-(2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキサミド

N-(2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキサミド(4.4g、7.90ミリモル)のMeOH(40mL)中溶液に、1N NaOH/水(23.69mL)を添加した。この混合物を周囲温度で30分間攪拌した。メタノールを除去し、この混合物を1N HClで酸性化して(pH約2)、沈殿物を形成し、これを濾過して、黄色の固体を得た。この固体を逆相C18 HPLC(0〜90%ACN/水、0.05%TFA)により精製して、白色の固体(1.78g、3.07ミリモル、38.8%収率)を得た。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ ppm 11.42 (s, 1H), 9.35 (br, s, 1H), 8.88 (s, 1H), 8.67 (t, J = 8.2Hz, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.03 (dd, J = 4 Hz, 8.2 Hz 1H), 7.48 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.22 (d, J=5.5 Hz, 1H), 7.13 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.80 - 6.68 (m, 1H), 6.40 (d, J=5.5 Hz, 1H), 6.34 (s, 1H), 3.50 (s, 2H), 3.46 - 3.41 (m, 2H). LC/MS (m/z) ES⁺: 531 (M+1)⁺.

[実施例4]
化合物4
N-(2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7カルボキサミド

ステップA
メチル1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキシレート

メチル1-ヒドロキシ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキシレート(1.3g、6.37ミリモル)のEtOAc(50mL)中溶液に、炭素上10%パラジウム(1.35g、1.27ミリモル)を添加し、この混合物を水素下で6時間攪拌した。混合物を濾過し、濾液を濃縮して、無色の油としてメチル1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキシレート(1.03g、4.50ミリモル、70.6%収率)を得た。これを、さらに精製することなく次のステップに使用した。¹H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δppm 8.43 (d, J=1.6 Hz, 1H), 8.12 - 8.00 (m, 1H), 7.32 - 7.16 (m, 1H), 4.24 (t, J=6.0 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.01 (t, J=6.0 Hz, 2H). LC/MS (m/z) ES⁺: 207 (M+1)⁺.

ステップB
1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボン酸

メチル1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボキシレート(1g、4.85ミリモル)のMeOH(50mL)中懸濁液に、1N水酸化リチウム/水(49.5mL)を添加した。メタノールを真空中で除去し、1N HCl/水をpH約1に添加した。形成された沈殿物を濾過して、白色の固体(460mg)を得た。濾液をEtOAcで抽出し、乾燥させ(Na₂SO₄)、溶媒を真空中で除去して、別の白色の固体270mg(64%合わせた収率)を得た。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ ppm 12.82 (br, s, 1H) 8.63 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.94 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.33 (d, J=7.8 Hz, 1H), 4.09 (t, J=6.0 Hz, 2H), 2.93 (t, J=6.0 Hz, 2H). LC/MS (m/z) ES⁺: 193 (M+1)⁺.

ステップC
N-(2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c](1,2]オキサボリニン-7-カルボキサミド

DMF(5mL)中1-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1H-ベンゾ[c][1,2]オキサボリニン-7-カルボン酸(101mg、0.474ミリモル)に、HATU(198mg、0.522ミリモル)及びDIEA(0.242mL、1.4323ミリモル)を添加した。この混合物を10分間攪拌し、次いで、3-(4-((2-アミノエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン塩酸塩、中間体A(200mg、0.474ミリモル)を添加し、20分間攪拌した。1N NaOH/水(2mL)を添加し、攪拌を2時間続けた。この混合物を逆相C18 HPLC(0〜90%ACN/水、0.05%TFA)により精製して、白色の固体(88mg、0.136ミリモル、28.7%収率)を得た。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ ppm 11.43 (s, 1H), 8.88 (s, 1H), 8.59 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 8.16 (s, 1H), 7.85 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.29 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.18 - 7.09 (m, 2H), 6.80 - 6.70 (m, 1H), 6.32 (s, 1H), 4.08 (t, J=6.0 Hz, 2H), 3.42 (br. s., 3H), 2.91 ((t, J=6.0 Hz, 2H). LC/MS (m/z) ES⁺: 533 (M+1)⁺.

[実施例5]
化合物5
2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)-N-((1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロベンゾ[c][1,2]オキサボロール-4-イル)メチル)-N-メチルアセトアミド2,2,2-トリフルオロアセテート

ステップA
N-(4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-2,2,2-トリフルオロアセトアミド

3-(4-アミノ-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン(1.026g、3.00ミリモル)のDCM(12mL)中溶液を0℃で、2,2,2-トリフルオロ酢酸無水物(0.834mL、6.00ミリモル)及びピリジン(0.485mL、6.00ミリモル)で処理した。この反応混合物を室温で10分間攪拌した。次いで、反応混合物を0℃に冷却し、水(2mL)でクエンチし、EtOAc(30mL)で希釈し、層を分離させた。有機物を1M HCl溶液(10mL)、水(2×10mL)、ブライン(10mL)で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させた。シリカゲル(2g)を添加し、溶媒を蒸発させて、シリカゲルプラグを得た。この生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(10%及び20%EtOAc/ヘキサン)により精製して、白色の固体としてN-(4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(1.14g、2.52ミリモル、84%収率)を得た。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ7.94 - 7.89 (m, 1H), 7.56 - 7.51 (m, 2H). LC/MS (m/z) ES^-: 436.2, 438.2 (M-1)^-.

ステップB
tert-ブチル2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)アセテート

トリフェニルホスフィン(1527mg、5.82ミリモル)、tert-ブチル2-ヒドロキシアセテート(769mg、5.82ミリモル)、及びN-(4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(850mg、1.940ミリモル)のTHF(8mL)中溶液を、0℃に冷却し、(E)-ジイソプロピルジアゼン-1,2-ジカルボキシレート(1.146mL、5.82ミリモル)で処理した。この反応物を室温で24時間攪拌した。シリカゲル(5g)を添加し、溶媒を蒸発させた。シリカゲルブラグを、シリカゲルクロマトグラフィー(20%EtOAc/ヘキサン)を使用して精製して、半固体残渣を得た。MeOHを添加して、白色の結晶としてtert-ブチル2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)アセテート(445mg、0.925ミリモル、47.7%収率)を得た。¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ8.12 (dd, J=2.5, 6.2 Hz, 1H), 7.75 (ddd, J=2.5, 4.4, 8.8 Hz, 1H), 7.64 - 7.57 (m, 1H), 6.83 (t, J=6.2 Hz, 1H), 3.95 (d, J=6.2 Hz, 2H), 1.41 (s, 9H). LC/MS (m/z) ES^-: 454.2, 456.2 (M-1)^-.

ステップC
2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)酢酸

tert-ブチル2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)アセテート(550mg、1.206ミリモル)をTHF(10mL)に溶解させ、HCl、ジオキサン中4M(6.03mL、24.11ミリモル)で処理した。この反応物を室温で17時間攪拌した。反応物をさらなるHCl、ジオキサン中4M(6.03mL、24.1ミリモル)で処理し、室温でさらに22時間攪拌した。この反応物をさらなるHCl、ジオキサン中4M(6.03mL、24.1ミリモル)で処理し、室温で4時間攪拌し、次いで、48時間冷蔵した。この反応物を室温に戻し、さらなるHCl、ジオキサン中4M(4mL)で処理し、さらに8時間攪拌した。次いで、溶媒を蒸発させて、油を得、これをMeOHに溶解させ、逆相クロマトグラフィー(ACN/水10〜90%、0.05%TFA、20分)を使用して精製して、白色の固体として2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)酢酸(170mg、0.425ミリモル、35.2%収率)を得た。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ 12.73 - 13.40 (1 H, m), 8.12 (dd, J=2.5, 6.2 Hz, 1H), 7.76 (td, J=2.2, 4.4 Hz, 1H), 7.63 - 7.57 (m, 1H), 6.79 (t, J=6.1 Hz, 1H), 3.98 (d, J=6.1 Hz, 2H). LC/MS (m/z) ES^-: 398.1, 400.2 (M-1)^-.

ステップD
2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)-N-((1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロベンゾ[c][1,2]オキサボロール-4-イル)メチル)-N-メチルアセトアミド2,2,2-トリフルオロアセテート

2-((4-(4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)酢酸(50mg、0.125ミリモル)及び4-((メチルアミノ)メチル)ベンゾ[c][1,2]オキサボロール-1(3H)-オール塩酸塩、中間体C(53.4mg、0.250ミリモル)のDMF(1mL)中溶液を、N-エチル-N-イソプロピルプロパン-2-アミン(0.109mL、0.625ミリモル)及びHATU(52.3mg、0.137ミリモル)で処理した。この混合物を室温で30分間攪拌した。この反応物を、次いで、1N NaOH(0.7mL)で処理した場合、室温で1.5時間攪拌した。次いで、反応物を1N NaOH(0.7mL)で処理し、1時間攪拌した。この反応混合物を、逆相クロマトグラフィー(ACN/水10〜90%、0.05%TFA、20分)を使用して精製して、白色の固体として2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)-N-((1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロベンゾ[c][1,2]オキサボロール-4-イル)メチル)-N-メチルアセトアミド, 0.5トリフルオロ酢酸塩(44mg、0.074ミリモル、59.1%収率)を得た。¹H NMR (シス/トランスアミドによる2組のシグナル) (400MHz, メタノール-d4) δ 7.61 (d, J=4.3 Hz, 1H (2組)), 7.43 - 7.27 (m, 2H (2組)), 7.16 (dd, J=2.7, 5.9 Hz, 1H (2組)), 7.08-7.01(m, 1H (2組)), 6.91 - 6.83 (m, 1H (2組)), 5.13及び5.07 (s, 0.50+1.50H), 4.67及び4.63 (s, 1.5+0.5H), 4.25及び4.21 (s, 1.5+0.5H), 2.98 (s, 3H). LC/MS (m/z) ES⁺: 533.3, 535.2 (M+1)⁺.

[実施例6]
化合物6
N-(2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロベンゾ[c][1,2]オキサボロール-7-カルボキサミド

1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロベンゾ[c][1,2]オキサボロール-7-カルボン酸、中間体B(295mg、1.660ミリモル)及び3-(4-((2-アミノエチル)アミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-4-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5(4H)-オン塩酸塩、中間体A(700mg、1.660ミリモル)のDMF(10mL)中溶液を、DIPEA(0.870mL、4.98ミリモル)、続いてHATU(694mg、1.826ミリモル)で処理した。この反応混合物を室温で45分間攪拌した。次いで、この反応物を1N NaOH(5mL)のゆっくりとした滴下添加により処理し、次いで、40分間攪拌した。次いで、反応物を1N NaOH(2mL)で処理し、1.5時間攪拌した。この反応物を冷蔵庫に一晩保存し、取り出し、さらなる1N NaOH(5mL)で処理し、3.5時間攪拌した。この反応混合物を、逆相クロマトグラフィー(ACN/水10〜90%、0.05%TFA、15分)を使用して精製して、白色の固体としてN-(2-((4-(N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバミミドイル)-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)アミノ)エチル)-1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロベンゾ[c][1,2]オキサボロール-7-カルボキサミド, 0.2トリフルオロ酢酸塩(380mg、0.680ミリモル、41.0%収率)を得た。¹H NMR (400MHz, MeOH-d₄) δ 7.90 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.66 - 7.49 (m, 2H), 7.15 - 6.96 (m, 2H), 6.86 - 6.77 (m, 1H), 4.98 (br. s., 2H), 3.83 - 3.75 (m, 2H), 3.61 (d, J=6.0 Hz, 2H). LC/MS (m/z) ES⁺: 519.2, 521.2 (M+1)⁺.

投与及び製剤
別の実施形態において、薬学的に許容される希釈剤、及び治療有効量の式I〜式VIIの化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物が提供される。

本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形態で供給され得る。用語「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容される無機又は有機の酸及び塩基から調製された塩を指す。したがって、「化合物又はその薬学的に許容される塩」の文脈における語「又は」は、化合物若しくはその薬学的に許容される塩(代わりの)、又は化合物及びその薬学的に許容される塩(組み合わせての)のいずれかを指すことが理解される。

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、又は他の問題若しくは合併症なしにヒト及び動物の組織と接触しての使用に適する、化合物、材料、組成物、及び剤形を指す。当業者は、式I〜式VIIによる化合物の薬学的に許容される塩が調製されてもよいことを理解する。これらの薬学的に許容される塩は、化合物の最終の単離及び精製の間にその場で、又はその遊離の酸若しくは遊離の塩基形態の精製された化合物を、それぞれ、適当な塩基若しくは酸と別個に反応させることによって調製されてもよい。

本発明の化合物の例証的な薬学的に許容される酸性塩は、以下の、限定しないが、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、安息香酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、イソクエン酸、トリフルオロ酢酸、パモン酸、プロピオン酸、アントラニル酸、メシル酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、p-ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸(パモン酸)、メタンスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、硫酸、サリチル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルゲン酸、β-ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸、及びガラクツロン酸を含む、酸から調製され得る。好ましい薬学的に許容される塩には、塩酸及びトリフルオロ酢酸の塩が含まれる。

本発明の化合物の例証的な薬学的に許容される無機塩基塩には、金属イオンが含まれる。より好ましい金属イオンには、限定されないが、適切なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、及び他の生理学的に許容される金属イオンが含まれる。無機塩基に由来する塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛、など、及びそれらの通常の原子価におけるものが含まれる。例示的な塩基塩には、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、及び亜鉛が含まれる。他の例示的な塩基塩には、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、及びナトリウムの塩が含まれる。さらに他の例示的な塩基塩には、例えば、NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃、NaH、及びカリウムt-ブトキシドを含む、水酸化物、炭酸塩、水素化物、及びアルコキシドが含まれる。

薬学的に許容される有機の非毒性塩基に由来する塩には、一部において、トリメチルアミン、ジエチルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン(N-メチルグルカミン)及びプロカイン;置換アミン(天然に存在する置換アミンを含む);環状アミン;第四級アンモニウムカチオン;並びに塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、N,N-ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、2-ジエチルアミノエタノール、2-ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、N-エチルモルホリン、N-エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン、などを含めて、第一級、第二級、及び第三級アミンの塩が含まれる。

上記塩のすべては、本発明の対応する化合物から慣用手段により当業者によって調製され得る。例えば、本発明の薬学的に許容される塩は、塩基性又は酸性部分を有する親化合物から、慣用的な化学的方法によって合成され得る。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離の酸又は塩基形態を化学量的量の適切な塩基又は酸と、水中若しくは有機溶媒中、又はこれら2種の混合物中で反応させることによって調製され得;一般には、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。塩は、溶液から沈殿し、濾過により収集されてもよいか、又は溶媒の蒸発により回収されてもよい。塩におけるイオン化の程度は、完全イオン化からほとんど非イオン化まで変わってもよい。適当な塩の一覧は、Remigton's Pharmaceutical Science、第17版、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、1985年、1418頁に見られ、その開示は、適当な塩の一覧に関してのみ参照により本明細書によって組み込まれる。

本発明の化合物は、非溶媒和と溶媒和形態の両方で存在してもよい。用語「溶媒和物」は、本発明の化合物及び1種以上の薬学的に許容される溶媒分子、例えば、エタノールを含む分子複合体を記述するために本明細書で使用される。用語「水和物」は、前記溶媒が水である場合に用いられる。薬学的に許容される溶媒和物には、結晶化の溶媒が同位体的に置換されていてもよい、例えば、D₂O、d₆-アセトン、d₆-DMSOであってもよい、水和物及び他の溶媒和物が含まれる。

1個以上の不斉炭素原子を有する式I〜式VIIの化合物は、2つ以上の立体異性体として存在し得る。式I〜式VIIの化合物がアミドオキシム又はアルケニル若しくはアルケニレン基又はシクロアルキル基を有する場合、幾何シス/トランス(又はZ/E)異性体が可能である。化合物が、例えば、ケト若しくはオキシム基、又は芳香族部分を有する場合、互換異性の異性(tautomeric isomerism)(「互変異性(tautomerism)」)が生じ得る。その結果として、単一化合物は、2つ以上の型の異性を示してもよいことになる。

本発明における特許請求される化合物の一部の実施形態又は代わりの実施形態における範囲内に、2つ以上の型の異性を示す化合物、及びそれらの1つ以上の混合物を含めて、式I〜式VIIの化合物の、立体異性体のすべて、幾何異性体及び互変異性形態が含まれる。その対イオンが光学活性である酸付加塩又は塩基塩、例えば、D-乳酸塩若しくはL-リシン、又はラセミ体の、例えば、DL-酒石酸塩若しくはDL-アルギニンも含まれる。

シス/トランス異性体は、当業者に周知の慣用技術、例えば、クロマトグラフィー及び分別結晶化によって分離されてもよい。

個別のエナンチオマーの調製/単離のための慣用技術には、適当な光学的に純粋な前駆体からのキラル合成、又は例えば、キラル高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用してのラセミ体(又は塩若しくは誘導体のラセミ体)の分割が含まれる。

代わりに、ラセミ体(又はラセミ体前駆体)は、適当な光学活性化合物、例えば、アルコールと反応されてもよいか、又は一部の実施形態若しくは代わりの実施形態における場合、式I〜式VIIの化合物は、酸性若しくは塩基性部分、酸若しくは塩基、例えば、酒石酸若しくは1-フェニルエチルアミンを有してもよい。得られたジアステレオマー混合物は、クロマトグラフィー及び/若しくは分別結晶化によって分離されてもよく、ジアステレオマーの一方若しくは両方は、当業者に周知の手段によって対応する純粋エナンチオマー(複数可)に変換されてもよい。

本発明のキラル化合物(及びそのキラル前駆体)は、不斉固定相及び0〜50%、典型的には2〜20%のイソプロパノール、及び0〜5%のアルキルアミン、典型的には0.1%のジエチルアミンを含有する、炭化水素、典型的にはヘプタン又はヘキサンからなる移動相を有する樹脂上で、クロマトグラフィー、典型的にはHPLCを使用してエナンチオマー豊富化形態で得られてもよい。その溶離液の濃度は、豊富化混合物を与える。

立体異性体の混合物は、当業者に公知の慣用技術によって分離されてもよい。[例えば、E L Elielによる「Stereochemistry of Organic Compounds」(Wiley、New York、1994年)参照。]

本発明は、1個以上の原子が、同じ原子番号を有するが、通常自然に見出される原子質量又は質量数と異なる原子質量又は質量数を有する原子で置き換えられている、式I〜式VIIの薬学的に許容される同位体標識化合物のすべてを含む。

本発明の化合物中に含まれることに適する同位体の例には、水素、例えば、²H及び³H、炭素、例えば、¹¹C、¹³C及び¹⁴C、塩素、例えば、³⁶Cl、フッ素、例えば、¹⁸F、ヨウ素、例えば、¹²³I及び¹²⁵I、窒素、例えば、¹³N及び¹⁵N、酸素、例えば、¹⁵O、¹⁷O及び¹⁸O、リン、例えば、³²P、並びに硫黄、例えば、³⁵Sの同位体が含まれる。

式I〜式VIIのある特定の同位体標識化合物、例えば、放射性同位体を組み込むものは、薬物及び/又は基質組織分布の研究に有用である。放射性同位体トリチウム、すなわち、³H、及び炭素-14、すなわち、¹⁴Cは、それらの組み込みの容易さ及び直ぐ使える検出手段の点でこの目的に特に有用である。

より重い同位体、例えば、重水素、すなわち、²Hによる置換は、より大きな代謝安定性、例えば、インビトロでの半減期の増加又は投与量要求の減少に起因するある特定の治療利益を与え得、したがって、一部の状況において好ましくあり得る。

式I〜式VIIの同位体標識化合物は、一般に、当業者に公知の慣用技術によって、又は前に用いられた非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用して添付の実施例及び調製に記載されたものに類似のプロセスによって調製することができる。

本発明の化合物は、プロドラッグとして投与されてもよい。したがって、薬理学的活性をそれ自体でほとんど又はまったく有し得ない、式I〜式VIIの化合物のある特定の誘導体は、身体の中に又は上に投与される場合、「プロドラッグ」として式Iの化合物に変換することができる。

本発明の化学物質の投与は、限定されないが、経口、舌下、皮下、静脈内、鼻腔内、局所、経皮、腹腔内、筋内、肺内、膣、直腸、又は眼内的に、を含めて、同様の有用性に役立つ、作用剤のための投与の許容された様式のいずれかによることができる。

医薬組成物又は製剤には、固体、半固体、液体及びエアロゾル剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁液剤、坐剤、エアロゾル剤などが含まれる。化学物質は、所定の速度での長期及び/又は時限の、パルス投与のための、デポー注射剤、浸透圧ポンプ、丸剤、経皮(電気輸送を含む)パッチ剤、などを含む、持続又は制御型放出剤形で投与することもできる。ある特定の実施形態において、組成物は、正確な用量の単回投与に適した単位剤形で与えられる。

本発明の化学物質は、単独で又はより典型的には慣用の薬学的担体、賦形剤など(例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、クロスカロメロースナトリウム、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム、など)と組み合わせて投与され得る。必要に応じて、医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、pH緩衝剤など(例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンアセテート、トリエタノールアミンオレエートなど)を含み得る。一般に、投与の意図された様式に応じて、医薬組成物は、約0.005重量%〜95重量%;ある特定の実施形態において、約0.5重量%〜50重量%の化学物質を含む。このような剤形を調製する実際の方法は、公知であるか、又は当業者に明らかであり;例えば、Remington's Pharmaceutical Science、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvaniaを参照されたい。

ある特定の実施形態において、組成物は、丸剤又は錠剤の形態を取り、したがって、組成物は、活性成分と一緒に、希釈剤、例えば、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなど;滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムなど;及び結合剤、例えば、デンプン、アカシアゴム、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、セルロース、セルロース誘導体などを含む。別の固体剤形において、散剤、マルメ(marume)、溶液剤又は懸濁液剤(例えば、プロピレンカーボネート、植物油又はトリグリセリド中)は、ゼラチンカプセルにカプセル化される。

液体の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、少なくとも1種の化学物質及び任意選択の薬学的アジュバントを担体(例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノールなど)に溶解、分散などさせて、溶液又は懸濁液を形成することによって調製され得る。注射剤は、慣用的な形態で、液体の溶液若しくは懸濁液として、エマルションとして、又は注射前に液体に溶解若しくは懸濁させるために適した固体形態のいずれかで調製され得る。このような非経口組成物に含まれる化学物質のパーセントは、その具体的な性質、並びに化学物質の活性及び対象の必要性に非常に依存する。しかしながら、溶液中0.01%〜10%の活性成分のパーセントは使用可能であり、組成物がその後に上記パーセントに希釈される固体である場合は、より高い。ある特定の実施形態において、組成物は、溶液中に約0.2%〜約2%の活性剤を含む。

本発明の化学物質の医薬組成物はまた、単独で又は不活性担体、例えば、ラクトースと組み合わせて、ネブライザのためのエアロゾル若しくは溶液として、又は吹送のための超微細粉末として呼吸器に投与されてもよい。このような場合、医薬組成物の粒子は、50ミクロン未満、ある特定の実施形態において、10ミクロン未満の直径を有する。

一般に、提供される化学物質は、同様の有用性に役立つ作用剤のための投与の許容様式のいずれかによって治療有効量で投与される。化学物質、すなわち、活性成分の実際の量は、多くの要因、例えば、処置される疾患の重症度、対象の年齢及び相対的健康、使用される化学物質の効能、投与の経路及び形態、並びに他の要因に依存する。薬物は、1日1回超、例えば、1日1回又は2回投与され得る。

本発明の化学物質の治療有効量は、1日当たり受容者の体重1kg当たりおよそ0.01〜200mg、例えば、約0.01〜100mg/kg/日、例えば、約0.1〜50mg/kg/日の範囲であってもよい。したがって、70kgの人への投与の場合、投与量範囲は、1日当たり約7〜3500mgであってもよい。

一般に、化学物質は、以下の経路:経口、全身(例えば、経皮、鼻腔内、又は坐剤による)、又は非経口(例えば、筋内、静脈内、又は皮下)投与のいずれか一つによって医薬組成物として投与される。ある特定の実施形態において、苦痛の程度に応じて調整され得る都合のよい1日投与量レジメンによる経口投与が使用されてもよい。組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、半固体剤、散剤、持続型放出製剤、溶液剤、懸濁液剤、エリキシル剤、エアロゾル剤、又は任意の適切な組成物の形態を取り得る。提供される化学物質を投与するための別の方法は、吸入である。

製剤の選択は、様々な要因、例えば、薬物投与の様式及び薬物物質の生物学的利用能に依存する。吸入による送達の場合、化学物質は、液体溶液、懸濁液、エアロゾル噴射剤又は乾燥粉末として製剤化され、投与のための適当なディスペンサに充填され得る。いくつかのタイプの医薬吸入デバイス-ネブライザ吸入器、定量吸入器(MDI)、及び乾燥粉末吸入器(DPI)がある。ネブライザデバイスは、治療剤(これは、液体形態で製剤化される)を、患者の呼吸器中に運ばれるミストとして噴霧させる、高速度空気の流れを発生させる。MDIは、典型的には圧縮ガスでパッケージされた製剤である。作動後、デバイスは、圧縮ガスにより一定量の治療剤を吐出し、したがって、設定量の作用剤を投与する信頼できる方法を与える。DPIは、治療剤を自由流動性粉末の形態で分配し、これは、デバイスによる呼吸の間に患者の呼気空気流に分散され得る。自由流動性粉末を達成するために、治療剤は、賦形剤、例えば、ラクトースと一緒に製剤化される。一定量の治療剤は、カプセル形態で保存され、それぞれの作動によって分配される。

最近、生物学的利用能が、表面積を増加させる、すなわち、粒子サイズを減少させることによって増加され得るという原理に基づいて不十分な生物学的利用能を示す薬物について、医薬組成物が開発されている。例えば、米国特許第4,107,288号には、活性材料が巨大分子の架橋マトリックス上に支持される、10〜1,000nmのサイズ範囲の粒子を有する医薬製剤が記載されている。米国特許第5,145,684号には、薬物物質が表面改質剤の存在下でナノ粒子(400nmの平均粒子サイズ)に粉砕され、次いで、液体媒体に分散されて、顕著に高い生物学的利用能を示す医薬製剤を与える、医薬製剤の製造が記載されている。

組成物は、一般に、本発明の少なくとも1種の化学物質を、少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む。許容される賦形剤は、非毒性の補助投与であり、本発明の少なくとも1種の化学物質の治療利益に悪影響を与えない。このような賦形剤は、任意の固体、液体、半固体、又はエアロゾル組成物の場合、一般に当業者にとって入手可能である気体状賦形剤であってもよい。

固体薬学的賦形剤には、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルクなどが含まれる。液体及び半固体賦形剤は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、及び様々な油(石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む)から選択されてもよい。注射可能な溶液のための、液体担体には、水、生理食塩水、水性デキストロース、及びグリコール類が含まれる。

圧縮ガスは、本発明の化学物質をエアロゾル形態に分散させるために使用されてもよい。この目的に適した不活性ガスは、窒素、二酸化炭素などである。他の適当な医薬賦形剤及びそれらの製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences、E.W.Martin編(Mack Publishing Company、第18版、1990年)に記載されている。

組成物中の化学物質の量は、当業者によって用いられるすべての範囲内で変わり得る。典型的には、組成物は、重量パーセント(wt%)基準で、全組成物に基づいて約0.01〜99.99重量%の本発明の少なくとも1種の化学物質を含み、残余は、1種以上の適当な薬学的賦形剤である。ある特定の実施形態において、本発明の少なくとも1種の化学物質は、約1〜80重量%のレベルで存在する。

化合物データ
ヒトのインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)酵素及び細胞データ、並びにラット及びマウスのクリアランスデータを、以下の表2に提示する。グラフ1は、時間に対する薬物濃度としてラット経口薬物動態(PK)を示す。酵素及び細胞アッセイ、並びにラットのためのインビボ薬物動態方法の簡潔な記載は、以下に、表及びグラフに続く。

以下の構造の、化合物7、8、9及び10は、社内で作製した。合成は、ここで示されないが、有機合成の当業者に公知の様々な方法で調製することができる。まとめると、それらは、IDO活性化合物のすべてが、良好なラットクリアランスを有するとは限らないことを例証するために役立つ。

化合物11は、以下の構造を有し、国際公開第2010/005958号で言及されている。

IDOi酵素アッセイ:本発明の化合物を、インドールアミン2,3ジオキシゲナーゼ(IDO1)に対して吸光度読み出しアッセイで試験した。IDO1は、基質としてL-又はD-トリプトファン及び分子状酸素を使用してトリプトファン酸化を触媒して、N-ホルミルキヌレニン(NFK)を形成する。NFKは、320nmの近くに吸光度ピークを有し、これは、反応進行を320nmでの吸光度増加によって分光光度法でモニターすることを可能にする。NFK生成物形成によって観察される吸光度の増加の抑制は、IDO1活性の抑制と解釈される。大腸菌(E.coli)で発現されている組み換えヒトIDO1を、これらの実験に使用した。

アッセイのための準備において、試験化合物を5mMの典型的な最大濃度からDMSOに連続的に3倍希釈し、384-ウェル、UV-Star、平底プレート(Greiner Bio-One、Kremsmunster、Austria)に0.5μでプレーティングして、11点用量応答曲線を生成した。低い対照ウェル(100%阻害、0%NFK)は、IDO1の非存在下で0.5μLのDMSOを含有し、高い対照ウェル(0%阻害、100%NFK)は、酵素の存在下で0.5μLのDMSOを含んだ。

アッセイを始めるために、100mMのリン酸カリウム(pH7.2)、1mMのCHAPS、40mMのL-アスコルビン酸、2μMのメチレンブルー、1%v/vのカタラーゼ(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)及び100nMのIDO1の組成物と一緒の25μLの2×酵素溶液を、低い対照ウェルを除いて、384-ウェル化合物プレートのすべてのウェルに添加した。低い対照ウェルは、IDO1酵素を欠く25μLの同様の2×溶液を受けた。基質のプレートへの添加前に、酵素溶液及び化合物を室温で30分間予備インキュベートさせた。

予備インキュベーションに続いて、100mMのリン酸カリウム(pH7.2)、1mMのCHAPS、及び4mMのD-トリプトファン(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)の組成物と一緒の25μLの2×基質溶液を、384-ウェル化合物プレートのすべてのウェルに添加した。プレート中の最終アッセイ組成物は、100mMのリン酸カリウム(pH7.2)、1mMのCHAPS、20mMのL-アスコルビン酸、1μMのメチレンブルー、0.5%v/vのカタラーゼ、+/-50nMのIDO1、及び2mMのD-トリプトファンであった。

320nmでの2つの吸光度読み取りを、EnVision(登録商標) Multilabel Reader(PerkinElmer Inc.、Waltham、MA)を使用してそれぞれのウェルについて保存した。第1の読み取りは、2×基質溶液の添加5分後に取得し、第2の読み取りは、55分後に取得した。データ分析目的のために、最初の読み取りを、第2の読み取りから引いて、試験化合物吸光度による高い吸光度バックグラウンドを有するウェルについて計算する。

用量応答についてのデータは、式100-(100^*((U-C2)/(C1-C2)))(ここで、Uは、未知の値であり、C1は、高い(100%NFK;0%阻害)対照ウェルの平均であり、C2は、低い(0%NFK;100%阻害)対照ウェルの平均である)を使用して正規化後の化合物濃度に対するIDO1阻害%としてプロットした。

曲線フィッティングは、等式Y=A+((B-A)/(1+(10^X/10^C)^D)(ここで、Aは、最小応答であり、Bは、最大応答であり、Cは、log(×C₅₀)であり、Dは、Hill勾配である)によって行った。それぞれの試験化合物についての結果は、pIC50値(上記等式中の-C)として記録した。

HeLa IDOiアッセイ:本発明の化合物を、質量分析法によるキヌレニン及び終点としての細胞毒性の検出を用いて、高スループット細胞アッセイによって試験した。質量分析法及び細胞毒性アッセイについて、ヒト上皮HeLa細胞(CCL-2;ATCC(登録商標)、Manassas、VA)をヒトインターフェロン-γ(IFN-γ)(Sigma-Aldrich Corporation、St.Louis、MO)で刺激して、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO1)の発現を誘導した。IDO1阻害特性を有する化合物は、トリプトファン異化経路によって細胞により産生されるキヌレニンの量を減少させた。化合物処置の効果による細胞毒性は、CellTiter-Glo(登録商標)試薬(CTG)(Promega Corporation、Madison、WI)を使用して測定し、これは、代謝活性細胞の指標である、ATPのルミネッセント検出に基づく。

アッセイのための準備において、試験化合物を5mMの典型的な最大濃度からDMSOに連続的に3倍希釈し、384-ウェル、ポリスチレン、透明底の、組織培養処理された、蓋付きプレート(Greiner Bio-One、Kremsmunster、Austria)に0.5μLでプレーティングして、11点用量応答曲線を生成した。低い対照ウェル(0%キヌレニン又は100%細胞毒性)は、質量分析法アッセイのために未刺激(-IFN-γ)HeLa細胞の存在下で0.5μLのDMSO、又は細胞毒性アッセイのために細胞の非存在下で0.5μLのDMSO、のいずれかを含有し、高い対照ウェル(100%キヌレニン又は0%細胞毒性)は、質量分析法と細胞毒性アッセイの両方のために刺激(+IFN-γ)HeLa細胞の存在下で0.5μLのDMSOを含有した。

HeLa細胞の凍結ストックを洗浄し、10%v/v認定ウシ胎児血清(FBS)(Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、MA)、及び1×ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質溶液(Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、MA)を補充したHEPES(Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、MA)を有するDMEM高グルコース培地に回収した。細胞を、補充DMEM培地に100,000個細胞/mLに希釈した。質量分析法アッセイのために、50μLの細胞懸濁液、又は細胞毒性アッセイのために、50μlの培地単独、のいずれかを、前に調製した384-ウェル化合物プレート上で、低い対照ウェルに添加し、それぞれ、5,000個細胞/ウェル又は0個細胞/ウェルをもたらした。IFN-γを、残存する細胞懸濁液に10nMの最終濃度で添加し、50μLの刺激細胞を、384-ウェル化合物プレート上で残存するウェルのすべてに添加した。次いで、蓋付きのプレートを、37℃、5%CO₂加湿インキュベータに2日間入れた。

インキュベーション後、384-ウェルプレートをインキュベータから取り出し、室温に30分間平衡化させた。細胞毒性アッセイのために、CellTiter-Glo(登録商標)を製造業者の使用説明書に従って準備し、10μLを各プレートウェルに添加した。室温で20分のインキュベーション後、ルミネッセンスをEnVision(登録商標)Multilabelリーダ(PerkinElmer Inc. Waltham、MA)で読み取った。質量分析法アッセイのために、化合物で処理したプレートの各ウェルからの10μLの上清を、384-ウェル、ポリプロピレン、V底プレート(Greiner Bio-One、Kremsmunster、Austria)中、正規化のための10μMの内部標準を含む、40μLのアセトニトリルに添加して、有機分析物を抽出した。2000rpmで10分間の遠心分離に続いて、アセトニトリル抽出プレートの各ウェルから10μLを、RapidFire 300(Agilent Technologies、Santa Clara、CA)及び4000 QTRAP MS(SCIEX、Framingham、MA)上でキヌレニン及び内部標準の分析のための384-ウェル、ポリプロピレン、V底プレート中の90μLの滅菌蒸留H₂Oに添加した。MSデータは、Agilent TechnologiesのRapidFire Integratorソフトウェアを使用して積分し、データを、キヌレニンと内部標準との比として分析のために正規化した。

質量分析法アッセイにおける用量応答についてのデータは、式100-(100^*((U-C2)/(C1-C2)))(ここで、Uは、未知の値であり、C1は、高い(100%キヌレニン;0%阻害)対照ウェルの平均であり、C2は、低い(0%キヌレニン;100%阻害)対照ウェルの平均である)を使用して正規化後の化合物濃度に対するIDO1阻害%としてプロットした。細胞毒性アッセイにおける用量応答についてのデータは、式100-(100^*((U-C2)/(C1-C2)))(ここで、Uは、未知の値であり、C1は、高い(0%細胞毒性)対照ウェルの平均であり、C2は、低い(100%細胞毒性)対照ウェルの平均である)を使用して正規化後の化合物濃度に対する細胞毒性%としてプロットした。

曲線フィッティングは、等式Y=A+((B-A)/(1+(10^X/10^C)^D))(ここで、Aは、最小応答であり、Bは、最大応答であり、Cは、log(×C₅₀)であり、Dは、Hill勾配である)によって行った。それぞれの試験化合物についての結果は、質量分析法アッセイについてのpIC50値として、及び細胞毒性アッセイについてのpCC50値(上記等式中の-C)として記録した。

PBMC IDOiアッセイ:本発明の化合物を、質量分析法によるキヌレニン及び終点としての細胞毒性の検出を用いて、高スループット細胞アッセイによって試験した。質量分析法及び細胞毒性アッセイについて、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)(PBOO3F;AllCells(登録商標)、Alameda、CA)を、ヒトインターフェロン-γ(IFN-γ)(Sigma-Aldrich Corporation、St.Louis、MO)及びサルモネラミネソタ(Salmonella minnsota)由来のリポ多糖(LPS)(Invivogen、San Diego、CA)で刺激して、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO1)の発現を誘導した。IDO1阻害特性を有する化合物は、トリプトファン異化経路によって細胞により産生されるキヌレニンの量を減少させた。化合物処置の効果による細胞毒性は、CellTiter-Glo(登録商標)試薬(CTG)(Promega Corporation、Madison、WI)を使用して測定し、これは、代謝活性細胞の指標である、ATPのルミネッセント検出に基づく。

アッセイのための準備において、試験化合物を5mMの典型的な最大濃度からDMSOに連続的に3倍希釈し、384-ウェル、ポリスチレン、透明底の、組織培養処理された、蓋付きプレート(Greiner Bio-One、Kremsmunster、Austria)に0.5μでプレーティングして、11点用量応答曲線を生成した。低い対照ウェル(0%キヌレニン又は100%細胞毒性)は、質量分析法アッセイのために未刺激(-IFN-γ/-LPS)PBMCの存在下で0.5μLのDMSO、又は細胞毒性アッセイのために細胞の非存在下で0.5μLのDMSO、のいずれかを含有し、高い対照ウェル(100%キヌレニン又は0%細胞毒性)は、質量分析法と細胞毒性アッセイの両方のために刺激(+IFN-γ/+LPS)PBMCの存在下で0.5μLのDMSOを含有した。

PBMCの凍結ストックを洗浄し、10%v/v熱失活ウシ胎児血清(FBS)(Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、MA)、及び1×ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質溶液(Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、MA)を補充したRPMI 1640培地(Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、MA)に回収した。細胞を、補充RPMI 1640培地に1,000,000個細胞/mLに希釈した。質量分析法アッセイのために、50μLの細胞懸濁液、又は細胞毒性アッセイのために、50μlの培地単独、のいずれかを、前に準備した384-ウェル化合物プレート上で、低い対照ウェルに添加し、それぞれ、50,000個細胞/ウェル又は0個細胞/ウェルをもたらした。IFN-γ及びLPSを、残存する細胞懸濁液に、それぞれ、100ng/mL及び50ng/mLの最終濃度で添加し、50μLの刺激細胞を、384-ウェル化合物プレート上で残存するウェルのすべてに添加した。次いで、蓋付きのプレートを、37℃、5%CO₂加湿インキュベータに2日間入れた。

インキュベーション後、384-ウェルプレートをインキュベータから取り出し、室温に30分間平衡化させた。細胞毒性アッセイのために、CellTiter-Glo(登録商標)を製造業者の使用説明書に従って準備し、40μLを各プレートウェルに添加した。室温で20分のインキュベーション後、ルミネッセンスをEnVision(登録商標)Multilabelリーダ(PerkinElmer Inc. Waltham、MA)で読み取った。質量分析法アッセイのために、化合物で処理したプレートの各ウェルからの10μLの上清を、384-ウェル、ポリプロピレン、V底プレート(Greiner Bio-One、Kremsmunster、Austria)中、正規化のための10μMの内部標準を含む、40μLのアセトニトリルに添加して、有機分析物を抽出した。2000rpmで10分間の遠心分離に続いて、アセトニトリル抽出プレートの各ウェルから10μLを、RapidFire 300(Agilent Technologies、Santa Clara、CA)及び4000 QTRAP MS(SCIEX、Framingham、MA)上でキヌレニン及び内部標準の分析のための384-ウェル、ポリプロピレン、V底プレート中の90μLの滅菌蒸留H₂Oに添加した。MSデータは、Agilent TechnologiesのRapidFire Integratorソフトウェアを使用して積分し、データを、キヌレニンと内部標準との比として分析のために正規化した。

IDOi MDDCアッセイ:本発明の化合物を、質量分析法によるキヌレニンの検出を用いて、高スループット細胞アッセイによって試験した。ヒト単球由来樹状細胞(MDDC)(AllCells(登録商標)、Alameda、CA)を、ヒトインターフェロン-γ(IFN-γ)(Sigma-Aldrich Corporation、St.Louis、MO)及びサルモネラミネソタ(Salmonella minnsota)由来のリポ多糖(LPS)(Invivogen、San Diego、CA)で刺激して、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO1)の発現を誘導した。IDO1阻害特性を有する化合物は、トリプトファン異化経路によって細胞により産生されるキヌレニンの量を減少させた。

アッセイのための準備において、試験化合物を5mMの典型的な最大濃度からDMSOに連続的に3倍希釈し、384-ウェル、ポリスチレン、透明底の、組織培養処理された、蓋付きプレート(Greiner Bio-One、Kremsmunster、Austria)に0.5μでプレーティングして、11点用量応答曲線を生成した。低い対照ウェル(0%キヌレニン)は、未刺激(-IFN-γ/-LPS)MDDCの存在下で0.5μLのDMSOを含有し、高い対照ウェル(100%キヌレニン)は、刺激(+IFN-γ/+LPS)MDDCの存在下で0.5μLのDMSOを含有した。

MDDCの凍結ストックを洗浄し、10%v/v熱失活ウシ胎児血清(FBS)(Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、MA)、及び1×ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質溶液(Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、MA)を補充したRPMI 1640培地(Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、MA)に回収した。細胞を、補充RPMI 1640培地に1,000,000個細胞/mLに希釈した。50μLの細胞懸濁液を、前に準備した384-ウェル化合物プレート上で、低い対照ウェルに添加し、50,000個細胞/ウェルをもたらした。IFN-γ及びLPSを、残存する細胞懸濁液に、それぞれ、100ng/mL及び50ng/mLの最終濃度で添加し、50μLの刺激細胞を、384-ウェル化合物プレート上で残存するウェルのすべてに添加した。次いで、蓋付きのプレートを、37℃、5%CO₂加湿インキュベータに2日間入れた。

インキュベーション後、384-ウェルプレートをインキュベータから取り出し、室温に30分間平衡化させた。化合物処理されたプレートの各ウェルからの10μLの上清を、384-ウェル、ポリプロピレン、V底プレート(Greiner Bio-One、Kremsmunster、Austria)中、正規化のための10μMの内部標準を含む、40μLのアセトニトリルに添加して、有機分析物を抽出した。2000rpmで10分間の遠心分離に続いて、アセトニトリル抽出プレートの各ウェルから10μLを、RapidFire 300(Agilent Technologies、Santa Clara、CA)及び4000 QTRAP MS(SCIEX、Framingham、MA)上でキヌレニン及び内部標準の分析のための384-ウェル、ポリプロピレン、V底プレート中の90μLの滅菌蒸留H₂Oに添加した。MSデータは、Agilent TechnologiesのRapidFire Integratorソフトウェアを使用して積分し、データを、キヌレニンと内部標準との比として分析のために正規化した。

質量分析法アッセイにおける用量応答についてのデータは、式100-(100^*((U-C2)/(C1-C2)))(ここで、Uは、未知の値であり、C1は、高い(100%キヌレニン;0%阻害)対照ウェルの平均であり、C2は、低い(0%キヌレニン;100%阻害)対照ウェルの平均である)を使用して正規化後の化合物濃度に対するIDO1阻害%としてプロットした。

曲線フィッティングは、等式Y=A+((B-A)/(1+(10^X/10^C)^D))(ここで、Aは、最小応答であり、Bは、最大応答であり、Cは、log(×C₅₀)であり、Dは、Hill勾配である)によって行った。それぞれの試験化合物についての結果は、pIC50値(上記等式中の-C)として記録した。

インビボ薬物動態方法、ラット:雄非飢餓Wistar Hanラット(n=3)が、DMSO/solutol/10%ヒドロキシル-プロピルβシクロデキストリン(10:10:80)投与ビヒクル中に製剤化された1mg/kg i.v.(1mL/kg)及び5mg/kg p.o.(5ml/kg)の用量で試験物を受けた。動物すべてについて、食餌及び水は自由に与えた。用量投与後の24時間の間に時限間隔で外科的に移植された静脈カニューレから血液試料を抜き取り、EDTAで処理し、遠心分離機にかけて、LC/MS/MS分析のための血漿を取得した。個別のラットについての血漿濃度-時間データを、Phoenix(商標)WinNonlin(登録商標)(バージョン6.2.1、Pharsight Corp.、St.Louis、MO)ソフトウェアを使用してノンコンパートメント解析により分析し、薬物動態パラメータ推定値を生成させた。

本発明を、一部の実施形態を参照して上記に示し、説明してきたが、当業者は、詳述された具体的実験は、本発明の単に例証するものに過ぎないことを容易に認識するだろう。様々な変更が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。

例えば、特許請求の範囲の構築において、以後に示される特許請求の範囲は、その文字通りの言語よりも狭く決して解釈されることが意図されておらず、したがって、明細書からの例示的な実施形態が、特許請求の範囲に読み取られることは意図されない。したがって、本発明は、例証によって、及び特許請求の範囲の範囲に対する限定によってではなく、説明されてきたことが理解されるべきである。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。本出願に引用された、刊行物、発行特許、特許出願、書籍及び論文のすべては、それぞれ、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

参考文献
Lohse N, Hansen AB, Pedersen G, Kronborg G, Gerstoft J, Sorensen HT, Vaeth M, Obel N. Survival of persons with and without HIV infection in Denmark, 1995-2005. Ann Intern Med. 2007 Jan 16;146(2):87-95.

Deeks SG. HIV infection, inflammation, immunosenescence, and aging. Annu Rev Med. 2011;62:141-55.

Hunt PW, Sinclair E, Rodriguez B, Shive C, Clagett B, Funderburg N, Robinson J, Huang Y, Epling L, Martin JN, Deeks SG, Meinert CL, Van Natta ML, Jabs DA, Lederman MM. Gut epithelial barrier dysfunction and innate immune activation predict mortality in treated HIV infection. J Infect Dis. 2014 Oct 15; 210(8):1228-38.

Tenorio AR, Zheng Y, Bosch RJ, Krishnan S, Rodriguez B, Hunt PW, Plants J, Seth A, Wilson CC, Deeks SG, Lederman MM, Landay AL. Soluble markers of inflammation and coagulation but not T-cell activation predict non-AIDS-defining morbid events during suppressive antiretroviral treatment. J Infect Dis. 2014 Oct 15; 210(8):1248-59.

Byakwaga H, Boum Y 2nd, Huang Y, Muzoora C, Kembabazi A, Weiser SD, Bennett J, Cao H, Haberer JE, Deeks SG, Bangsberg DR, McCune JM, Martin JN, Hunt PW. The kynurenine pathway of tryptophan catabolism, CD4+ T-cell recovery, and mortality among HIV-infected Ugandans initiating antiretroviral therapy. J Infect Dis. 2014 Aug 1; 210(3):383-91.

Pearson JT, Siu S, Meininger DP, Wienkers LC, Rock DA. In vitro modulation of cytochrome P450 reductase supportedindoleamine 2,3-dioxygenase activity by allosteric effectors cytochrome b(5) and methylene blue. Biochemistry 49, 2647-2656 (2010)

Claims

式(I):
(式中:
Xは、CH₂又はC(O)であり;
R¹は、-NR²R³であり;
R²は、-H又は-CH₃であり;
R³は、
からなる群から選択される)
の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩。
式(II):
の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩。
式(III):
の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩。
式(IV):
の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩。
式(V):
の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩。
式(VI):
の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩。
式(VII):
の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩。
対象におけるAIDS及び一般的免疫抑制の進行の予防を含む、HIVの予防及び/又は処置の方法であって、対象に請求項1〜7の化合物を投与することを含む方法。