JP2018518976A - タンパク質加水分解用アミノペプチダーゼ - Google Patents

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Abstract

本開示はアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド、およびポリペプチドをコードする単離核酸配列を提供する。いくつかの実施形態において、本開示はまた、核酸配列を含む核酸コンストラクト、ベクターおよび宿主細胞、ならびにポリペプチドを産生する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示はさらに、風味改善剤として有用なタンパク質加水分解物を得る方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／１８５５０３号および２０１５年１０月１日に出願された同第６２／２３５９３７号の優先権および利益を主張するものであり、各仮出願の発明の名称は「新規のタンパク質加水分解用アミノペプチダーゼ」である。
配列表の参照による組み込み
２０１６年６月１０日に作成され、本明細書とともに提出された、１９２，５０５バイトのサイズを有する「２０１６０６１０＿ＮＢ４０９８９−ＰＣＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ ｐｒｊ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名のファイルに示された配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
各種食品および餌料製品にはタンパク質加水分解物が含まれている。この加水分解は、従来、化学的加水分解により行われてきた。しかしながら、そのような化学的加水分解は、加水分解中に得られるアミノ酸を大量に分解し、また、化学反応の過程で有害な副生物を生成する。化学的加水分解により得られるタンパク質加水分解物を使用することの懸念の増大が、酵素を使用した加水分解プロセスの開発に繋がっている。
タンパク性物質の酵素による加水分解プロセスは、高い加水分解度を得ることを目標としている。アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドは、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸残基の除去を触媒する。所望の特性および高い加水分解度を有するタンパク質加水分解物を生成するには、一般に、ペプチダーゼ活性物を混合して使用する必要がある。単独で、または他の酵素と組み合わされて、食品および餌料製品に使用されるタンパク質加水分解物の特性および加水分解度の改善に有用な活性を有する単一成分のペプチダーゼ酵素を提供することが望まれる。
本開示は、アミノペプチダーゼ活性が高い新規なポリペプチド、ならびに、望ましい品質および高い加水分解度を有するタンパク質加水分解物を得る方法を提供する。
本発明の特徴および利点は、発明の原理が用いられている実施形態を記載した以下の説明、およびその添付図面を参照することにより、より深く理解できるであろう。
図１は、ｐｅｐＮ＿２酵素をコードする合成遺伝子の全体的な設計を上に示し、内因性分泌シグナル配列の代わりに使用されたリーダー配列を下にクローズアップして示す。 図２は、グルテン加水分解における、ネオサルトリア・フィッシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）由来のＰｅｐＮ ２のグルタミン酸遊離のｐＨ依存性（加水分解中のｐＨ調節なし）を示す。 図３は、グルテン加水分解における、ネオサルトリア・フィッシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）由来のＰｅｐＮ ２のグルタミン酸遊離の温度依存性（加水分解中のｐＨ調節なし）を示す。 図４は、異なるＰｅｐＮ ２のグルタミン酸遊離を示す。 図５は、ＷＨＷＬＱＬＫＰＧＱＰＭＹ（配列番号２６）の加水分解を示す。 図６は、ＫＰＧＱＰＭＹ（配列番号２７）の加水分解を示す。 図７は、ＱＰＭＹ．（配列番号２８）の加水分解を示す。 図８は、基質および開裂生成物のペプチド配列を、Ｓｋｙｌｉｎｅに入力し、それぞれの試料の強度を算出したことを示す。 図９は、いくつかのＰｅｐＮ ２酵素の配列アライメントを列挙した、図９Ａ〜９Ｆの６枚のパネルの空間的配置を示す。 図１０は、ＴＲＩ０３２、ＴＲＩ０３５、ＴＲＩ０６３（アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ））およびＣＯＲＯＬＡＳＥ（登録商標）ＬＡＰ（真菌エキソペプチダーゼ；によるＴＰＡＡＡＲ（配列番号２９）の加水分解。
本開示はアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。本発明はまた、そのポリペプチドをコードする核酸配列、その核酸配列を含む核酸コンストラクト、ベクターおよび宿主細胞、ならびに、そのポリペプチドを生成する方法に関する。本開示はまた、タンパク性基質から加水分解物を得る方法であって、タンパク性物質を、単独の、またはプロテアーゼ、例えばエンドペプチダーゼと組み合わせたアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドに曝すことを含む方法に関する。本開示はまた、タンパク性基質から、遊離グルタミン酸および／またはグルタミン酸残基を結合したペプチドに富む加水分解物を得る方法であって、基質を、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドに曝すことを含む方法に関する。本開示はさらに、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドを含む風味改善組成物に関する。組成物はさらに、追加の酵素活性を含んでもよい。
他の態様において、本明細書に記載の方法は、ベーキングなど、食品関連用途で風味を向上させるために使用され得る。あるいは、食品における風味改善は、本発明の方法によって得られる加水分解物の添加によって達成され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のアミノペプチダーゼを使用して生成される加水分解物はまた、未処理の加水分解物に比べて、苦味を低減することができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、新しい真菌アミノペプチダーゼ（ＰｅｐＮ）、産生宿主（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））におけるそれらの高収率での産生、ならびに、例えば苦味除去用、およびグルタミン酸生成用のタンパク質加水分解物を生成するためのそれらの使用を提供する。実施例９に示すように、本発明の２型アミノペプチダーゼは、１型アミノペプチダーゼと比べて、グルタミン酸の放出が向上した。初期の結果は、驚くべきことに、これらのＰｅｐＮが、他の既知のアミノペプチダーゼと比べて、Ｐ１中のプロリンに対し、耐性を有することを示唆している。したがって、本発明において使用するために教示されるプロリン耐性アミノペプチダーゼは、広範なペプチドおよび／またはタンパク質基質に作用し得、そのような広い基質特異性を有することに起因して、特定のアミノ酸（例えば、プロリンおよび／またはリジンおよび／またはアルギニンおよび／またはグリシン）に富む基質の開裂を容易には阻害されない。
驚いたことに、本発明者らは、２型アミノペプチダーゼが１型アミノペプチダーゼより優れた能力を有することを見出した。さらに、本発明者らは、驚いたことに、良好な能力を有する一群の真菌２型アミノペプチダーゼを見出した。この一群の真菌２型アミノペプチダーゼは、それらの成熟アミノ酸配列中に長いＮ末端を有している。図９は、いくつかの２型アミノペプチダーゼのアミノ酸配列のアライメントを示している。
「アミノペプチダーゼ活性」という用語は、本明細書においては、ペプチド、オリゴペプチドまたはタンパク質のＮ末端からのアミノ酸の切断を触媒するペプチダーゼ活性と定義される。一般的な定義では、アミノペプチダーゼ活性は、ペプチド、オリゴペプチドまたはタンパク質のＮ末端からアミノ酸Ｘ（ここで、Ｘは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸残基、少なくともＬｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、および／またはＰｒｏの残基であり得る）を開裂することができる。本発明のアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドが、ペプチド、ポリペプチド基質のＮ末端から開裂させるアミノ酸に関し非特異的であり得ることは理解されよう。
いくつかの実施形態において、本発明は、図９の配列アライメントに示すように、６７位の保存残基Ｉ／ＶのＮ末端側に１３を超える残基を含む予測成熟配列を有する、アミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチド、またはそのフラグメントに関し、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１の成熟アミノ酸配列に対し、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドであって、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド（以下、「相同ポリペプチド」）に関する。いくつかの実施形態において、相同ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、成熟アミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１を含む。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。配列番号１のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から１個以上のアミノ酸が削除されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、フラグメントは配列番号１８の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２の成熟アミノ酸配列に対し少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドであって、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド（以下、「相同ポリペプチド」）に関する。いくつかの実施形態において、相同ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、成熟アミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。配列番号２のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から１個以上のアミノ酸が削除されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、フラグメントは配列番号１９の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３の成熟アミノ酸配列に対し少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドであって、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド（以下、「相同ポリペプチド」）に関する。いくつかの実施形態において、相同ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列、成熟アミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。配列番号３のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から１個以上のアミノ酸が削除されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、フラグメントは配列番号２０の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号 ４の成熟アミノ酸配列に対し少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドであって、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド（以下、「相同ポリペプチド」）に関する。いくつかの実施形態において、相同ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、成熟アミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含むが、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。配列番号４のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から１個以上のアミノ酸が削除されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、フラグメントは配列番号２１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号５の成熟アミノ酸配列に対し少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドであって、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド（以下、「相同ポリペプチド」）に関する。いくつかの実施形態において、相同ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列、成熟アミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含むが、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。配列番号５のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から１個以上のアミノ酸が削除されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、フラグメントは配列番号２２の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号６の成熟アミノ酸配列に対し少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドであって、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド（以下、「相同ポリペプチド」）に関する。いくつかの実施形態において、相同ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列、成熟アミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。配列番号６のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から１個以上のアミノ酸が削除されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、フラグメントは配列番号２３の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号７の成熟アミノ酸配列に対し少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドであって、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド（以下、「相同ポリペプチド」）に関する。いくつかの実施形態において、相同ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列、成熟アミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。配列番号７のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から１個以上のアミノ酸が削除されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、フラグメントは配列番号２４の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号８の成熟アミノ酸配列に対し少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドであって、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド（以下、「相同ポリペプチド」）に関する。いくつかの実施形態において、相同ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列、成熟アミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含み、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。配列番号８のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から１個以上のアミノ酸が削除されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、フラグメントは配列番号２５の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは配列番号８のアミノ酸配列を有する。
好ましくは、フラグメントは、少なくとも３３０個のアミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも３８０個のアミノ酸残基、最も好ましくは、４３０個のアミノ酸残基を含む。
対立遺伝子変異型は、同じ染色体座位を占める遺伝子の２以上の代替形態のいずれかを示す。対立遺伝子変異は、突然変異によって自然に生じ、集団内で表現型多型をもたらし得る。
本明細書で使用される「親酵素」は、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、配列番号６、または配列番号７、または配列番号８に示すポリペプチドのアミノ酸残基の全てを有するアミノペプチダーゼである。この点に関し、例えば、親は 変異ポリペプチドの修飾（これは、変異型により、０、１もしくはそれ以上であり得る）の全てを有するであろう。
いくつかの実施形態では、本発明は、低ストリンジェンシーな条件下で、より好ましくは、中位のストリンジェンシーな条件下で、最も好ましくは、高ストリンジェンシーな条件下で、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションを行う核酸配列によってコードされる、アミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチド、またはそのポリペプチドの対立遺伝子変異型およびフラグメント（このフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する）に関し、オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６、またはその相補鎖の核酸配列のポリペチドコード化部分と同じ条件下でハイブリダイゼーションを行う（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｕｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
ハイブリダイゼーションとは、核酸配列が、配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６に示す核酸配列のポリペプチドコード化部分に対応するオリゴヌクレオチドプローブに、低〜高ストリンジェンシーな条件下（すなわち、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００Ｐｇ／ｍｌ断片処理済みの変性サケ精子ＤＮＡ、ならびに、それぞれ低、中および高ストリンジェンシーで２５、３５または５０％のホルムアミド中、４２℃でプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション）で、標準サザンブロット法にしたがいハイブリダイズすることを示す。
配列番号１、もしくは配列番号２、もしくは配列番号３、もしくは配列番号４、もしくは配列番号５、配列番号６、もしくは配列番号７、もしくは配列番号８のアミノ酸配列、またはその部分配列は、オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用され得、あるいは例えば、配列番号９、もしくは配列番号１０、もしくは配列番号１１、もしくは配列番号１２、もしくは配列番号１３、配列番号１４、もしくは配列番号１５、もしくは配列番号１６の核酸配列のポリペプチドコード化部分などの、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列、またはその部分配列は、当該技術分野でよく知られた方法にしたがい、異なる属または種の菌株からアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定またはクローン化するために使用され得る特に、そのようなプローブは、その中の対応する遺伝子を同定および単離するために、標準サザンブロット法にしたがって、目的の属または種のゲノムまたはｃＤＮＡとハイブリダイゼーションするために使用することができる。そのようなプローブは、全配列より相当に短い可能性があるが、長さが少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも４０個のヌクレオチドでなければならない。より長いプローブもまた使用することができる。ＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブの両方を使用できる。これらのプローブは、通常、対応する遺伝子を検出するために（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチンまたはアビジンを用いて）標識される。
したがって、そのような他の生物から調製されたゲノム、ｃＤＮＡまたは組み合わせ化学ライブラリーによって、上記プローブとハイブリダイズし、かつアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをスクリーニングすることができる。そのような他の生物からのゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動法、または他の分離技術によって分離することができる。ライブラリー由来のＤＮＡまたは分離ＤＮＡは、ニトロセルロースまたは他の好適な担体材料に移して固定化することができる。配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６の核酸配列のポリペプチドコード化部分と相同のクローンまたはＤＮＡを同定するために、サザンブロットにおいて担体材料が使用され、その担体材料は、３０分間に、最終的に３回、それぞれ、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを使用し、好ましくは少なくとも５０℃、より好ましくは少なくとも５５℃、より好ましくは少なくとも６０℃、より好ましくは少なくとも６５℃、より一層好ましくは少なくとも７０℃、最も好ましくは少なくとも７５℃で洗浄される。オリゴヌクレオチドプローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを使用して検出される。
本明細書で使用される「修飾している」および「修飾」という用語は、最も近い同一性の野生型アミノペプチダーゼポリペプチド配列と比較したときの置換を指す。比較は、変異体アミノペプチダーゼポリペプチドと、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、配列番号６、または配列番号７、または配列番号８として示されているレファレンス配列を有する野生型アミノペプチダーゼの２つをアライニングすることによって行われる。
同様に、本明細書で使用される「等価修飾」は、他のアミノペプチダーゼ中の等価位置にあるアミノ酸に同じ修飾（通常、置換）を行うことを指す。
一態様において、本発明のアミノペプチダーゼ配列は、単離形態である。「単離された」という用語は、アミノペプチダーゼ配列が天然で、天然に会合し、天然において見出される少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。本発明のアミノペプチダーゼ配列は、他の場合に物質が会合し得る１つ以上の汚染物質を実質的に含まない形態で提供され得る。したがって、例えば、それは、１つ以上の潜在的に汚染するポリペプチドおよび／または核酸分子を実質的に含まないことがある。
一態様において、本発明のアミノペプチダーゼ配列は、精製された形態である。「精製された」という用語は、所与の構成成分が高レベルで存在していることを意味する。構成成分は、組成物中に存在する主要な構成成分であることが望ましい。アミノペプチダーゼは、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のレベルで存在していることが好ましく、前記レベルは、考慮される総組成物に対する乾燥重量／乾燥重量基準で測定される。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明記されない限り、複数形を含む。別途指示のない限り、核酸は５’から３’の方向に左から右へと記載し、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向に左から右へと記載する。別段の指示がない限り、本開示が本明細書に記載の特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されないことに留意されたい。
定義されていない用語および略語は、当該技術分野において使用されるそれらの通常の意味を有するものとする。本明細書において他に特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解する意味と同一の意味を有する。別途指示のない限り、本開示の実施には、分子生物学、タンパク質工学および微生物学において通常使用される従来技術が含まれる。本明細書に記載のものと類似の、または等価な方法および材料が本開示の実施に使用されるが、いくつかの好適な方法および材料を本明細書に記載する。この直下に定義した用語は、明細書全体を参照することにより、より十分に定義される。
ヌクレオチド配列
本発明の範囲は、本明細書中に定義した特定の特性を有するアミノペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列を包含する。
いくつかの実施形態では、核酸配列は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、例えばアスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）から得られるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ネオサルトリア属（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）、例えばアスペルギルス・フィッシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から得られるポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、本発明は、図９の配列アライメントに示すように、６７位の保存残基Ｉ／ＶのＮ末端側に１３を超える残基を含む予測成熟配列を有する、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド、またはそのフラグメントをコードする核酸に関し、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例示したポリヌクレオチドに対し特定の核酸相同性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６の核酸配列のポリペプチドコード化部分に対し、少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６からなる群から選択される核酸配列を含む。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６からなる群から選択される核酸配列に相補的な核酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、配列番号６、または配列番号７、または配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチドまたはその活性フラグメントをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、配列番号６、または配列番号７、または配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチドまたはその活性フラグメントをコードする核酸配列を含む。相同性は、アミノ酸配列アライメントにより、例えば、本明細書に記載のＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して決定することができる。
本発明はまた、遺伝コードの縮退によって配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、配列番号６、または配列番号７、または配列番号８と異なる、配列番号 １、または配列番号 ２、または配列番号 ３、または配列番号 ４、または配列番号 ５、配列番号 ６、または配列番号 ７、または配列番号 ８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を包含する。本発明はまた、アミノペプチダーゼ活性を有する配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、配列番号６、または配列番号７、または配列番号８のフラグメントをコードする、配列番号 ９、または配列番号 １０、または配列番号 １１、または配列番号 １２、または配列番号 １３、配列番号 １４、または配列番号１５、または配列番号 １６の部分配列に関する。配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６の部分配列は、５’末端および／または３’末端から１個以上のヌクレオチドが欠失していることを除けば、配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６によって包含される核酸配列である。部分配列は、好ましくは少なくとも９９０個、より好ましくは少なくとも１１４０個、最も好ましくは少なくとも１２９０個のヌクレオチドを含有する。
本明細書において使用される「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、ならびに、それらの変異体、相同体、フラグメントおよび誘導体（例えば、それらの一部）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノムまたは合成または組換え起源のものであり得、それは、センス鎖を表すかアンチセンス鎖を表すかにかかわらず二本鎖または一本鎖であり得る。
本発明に関する「ヌクレオチド配列」という用語には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡが含まれる。好ましくは、それは本発明をコードするＤＮＡを意味し、より好ましくは、ｃＤＮＡ配列を意味する。
好ましい実施形態において、本発明に関し、本発明それ自体の範囲により包含されるヌクレオチド配列は、その天然環境中に存在する場合、およびそれがその天然に会合する配列（それもその天然環境中に存在する）に結合している場合、本発明による天然ヌクレオチド配列を含まない。参照の容易性のため、本出願人らは、この好ましい実施形態を「非天然ヌクレオチド配列」と称する。これに関して、「天然ヌクレオチド配列」という用語は、天然環境中に存在し、天然に会合するプロモーター（プロモーターもその天然環境中に存在する）全体に作動可能に結合している場合、ヌクレオチド配列全体を意味する。しかしながら、本発明の範囲に包含されるアミノ酸配列は、その天然生物中のヌクレオチド配列の発現後に単離および／または精製することができる。しかしながら、好ましくは、本発明の範囲に包含されるアミノ酸配列は、その天然生物中のヌクレオチド配列により発現させることができるが、そのヌクレオチド配列は、それがその生物内で天然に会合するプロモーターの制御下にない。
通常、本発明の範囲に包含されるヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（すなわち、組換えＤＮＡ）を使用して調製される。しかしながら、本発明の代替的実施形態においては、ヌクレオチド配列は、当該技術分野においてよく知られる化学的方法を使用して全部または一部を合成することができる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２１５−２３、およびＨｏｒｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２２５−２３２を参照）。
本発明はまた、配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６の核酸配列に、少なくとも約５０％、好ましくは約６０％、好ましくは約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、より一層好ましくは約９５％、最も好ましくは約９７％の相同性を有する核酸配列に関する。本発明の目的のために、２つの核酸配列間の相同性の程度は、ＣＬＵＳＴＡＬ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ，１９８９，上記を参照）により、同一テーブル、ギャップペナルティ１０、およびギャップレングスペナルティ１０を用いて決定される。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の修飾は、そのポリペプチドに実質的に類似したポリペプチドの合成に必要であり得る。ポリペプチドに「実質的に類似した」という用語は、非自然発生のポリペプチドの形態を指す。これらのポリペプチドは、何らかの工学的な方法が加えられている点で、天然源から単離されたポリペプチドと相異し得る。例えば、比活性、熱安定性、最適ｐＨなどが、異なるポリペプチドの変異体を、例えば部位特異的変異誘発法によって合成することは興味深いことであり得る。類似配列は、配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６の核酸配列のポリペプチドコード化部分、例えば、その部分配列として示された核酸配列に基づき、かつ／または核酸配列によってコードされるポリペプチドの他のアミノ酸配列を生じさせないが、酵素の生成を目的とした宿主生物のコドンの使用に対応するヌクレオチド置換の導入によって、もしくは、異なるアミノ酸配列を生じさせ得るヌクレオチド置換の導入によって構築し得る。ヌクレオチド置換の概要については、例えば、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７を参照されたい。
そのような置換が分子機能に不可欠な領域外でなされ、活性ポリペプチドを依然としてもたらし得ることは、当業者には明らかであろう。本発明の単離核酸配列によってコードされ、したがって、好ましくは置換を受けることのないポリペプチドの活性に必須のアミノ酸残基は、部位特異的変異誘発法またはアラニン置換誘発法などの当該技術分野で知られる手順によって特定することができる（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５を参照）。後者の手法では、分子中の正電荷を持つ全ての残基に変異を導入し、得られた分子のアミノペプチダーゼ活性を試験して、分子の活性に不可欠なアミノ酸残基を特定する。基質と酵素との相互作用部位もまた、核磁気共鳴分析法、結晶構造解析法または光親和性標識法のような手法によって決定される三次元構造の解析によって決定される（例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０９：５９−６４を参照）。
組成物
一態様において、本発明はまた、本明細書に記載のアミノペプチダーゼ、ならびにアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
いくつかの実施形態では、本発明は、図９の配列アライメントに示すように、６７位の保存残基Ｉ／ＶのＮ末端側に１３を超える残基を含む予測成熟配列を有する、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド、またはそのフラグメントを提供し、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、図９の配列アライメントに示すように、６７位の保存残基Ｉ／ＶのＮ末端側に１３を超える残基を含む予測成熟配列を有する、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドに対し、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の相同性を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも１種のアミノペプチダーゼを含む一般組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する相同ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含むが、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は配列番号１のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するアミノペプチダーゼを含むが、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に対し、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも１種のアミノペプチダーゼを含む一般組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する相同ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２のアミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含むが、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、組成物は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するアミノペプチダーゼを含むが、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列に対し、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも１種のアミノペプチダーゼを含む一般組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する相同ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３のアミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含むが、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は配列番号３のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、組成物は、配列番号３のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するアミノペプチダーゼを含むが、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列に対し、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも１種のアミノペプチダーゼを含む一般組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号４のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する相同ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号４のアミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含むが、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は配列番号４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、組成物は、配列番号４のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するアミノペプチダーゼを含むが、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列に対し、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも１種のアミノペプチダーゼを含む一般組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号５のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する相同ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号５のアミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含むが、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は配列番号５のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、組成物は、配列番号５のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するアミノペプチダーゼを含むが、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列に対し、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも１種のアミノペプチダーゼを含む一般組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する相同ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６のアミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含むが、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は配列番号６のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、組成物は、配列番号６のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するアミノペプチダーゼを含むが、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列に対し、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも１種のアミノペプチダーゼを含む一般組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号７のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する相同ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号７のアミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含むが、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は配列番号７のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、組成物は、配列番号７のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するアミノペプチダーゼを含むが、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列に対し、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも１種のアミノペプチダーゼを含む一般組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号８のアミノ酸配列と、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、より一層好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する相同ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号８のアミノ酸配列または対立遺伝子変異型；およびそのフラグメントを含むが、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は配列番号８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、組成物は、配列番号８のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するアミノペプチダーゼを含むが、但し、そのフラグメントはアミノペプチダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、例示したポリヌクレオチドに対し特定の核酸相同性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６の核酸配列のポリペプチドコード化部分の核酸配列に対し、少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６からなる群から選択される核酸配列を含む。他の実施形態では、組成物は、配列番号９、または配列番号１０、または配列番号１１、または配列番号１２、または配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６からなる群から選択される核酸配列に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、配列番号６、または配列番号７、または配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチドまたはその活性フラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、配列番号６、または配列番号７、または配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチドまたはその活性フラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン・グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ハロペルオキダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼなどの多数の酵素活性を含み得る。さらなる酵素は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、好ましくはアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、またはフミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、好ましくはフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、またはフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、好ましくはフザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルークウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）もしくはフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｉｕｍ）に属する微生物によって産生され得る。
いくつかの実施形態では、発明は、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド、および好適な担体を含む組成物に関する。本明細書中に記載のものを含む、当該技術分野で知られる好適な担体が使用され得る。他の実施形態では、組成物は、さらにエンドペプチダーゼを含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１種以上の非特異的に作用するエンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ酵素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１種以上の特異的に作用するエンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ酵素を含む。
いくつかの実施形態では、特異的に作用するタンパク質分解酵素は、グルタミルエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．１９）；リシルエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．５０）；ロイシルエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．５７）；グリシルエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２２．２５）；プロリルエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．２６）；トリプシン（ＥＣ ３．４．２１．４）もしくはトリプシン様（リシン／アルギニン特異性）エンドペプチダーゼ、またはペプチジル−Ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２４．３３）などのエンドペプチダーゼである。
いくつかの実施形態では、エキソペプチダーゼ酵素は、トリペプチジルアミノペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチナーゼおよび他のアミノペプチダーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、１種以上のエンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ酵素は、真菌性酸性エンドペプチダーゼ、中性メタロエンドペプチダーゼ、アルカリ性セリンエンドぺプチダーゼ、サブチリシン、ブロメライン、熱に安定な細菌性中性エンドぺプチダーゼ、アルカリ性セリンエンドぺプチダーゼ（重複）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明において使用されるエンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ酵素は、下記の１つ以上の市販品中の１種以上のプロテアーゼであってよい。
Figure 2018518976
追加的に、または選択的に、エンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ酵素は、次の商業的に入手可能な製品の１つ以上に含まれるものであってよい：ＫＡＮＮＡＳＥ（商標）、ＮＯＶＯＣＡＲＮＥＴＭ Ｔｅｎｄｅｒ，およびＮｏｖｏｚｙｍ ３７０２０、ＮＯＶＯ−ＰＲＯＴＭ Ｄ（いずれもＮｏｖｏｚｙｍｅｓから入手可能）；ＢｉｏＳｏｒｂ−ＡＣＤＰ（Ｎｏｏｒ Ｃｒｅａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｄｉａ）；ＡＮＧＥＬ（登録商標）Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ａｎｇｅｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ、Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｎａ）またはＣＯＲＯＬＡＳＥ（登録商標）ＬＡＰ（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓから）。
いくつかの実施形態では、発明はまた、本明細書に記載のアミノペプチダーゼの少なくとも１種を含む飼料添加物組成物および／または食品添加物組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明の加水分解物を含む組成物および／または飼料添加組成物および／または食品添加組成物が提供される。好適には、そのような食品添加組成物および／または飼料添加組成物は、さらにアミノペプチダーゼを（任意選択的に、エンドプロテアーゼと組み合わされて）含み得る。
酵素含有液体には、液体組成物の特性を改善する物質を添加してもよい。そのような添加剤の非限定的な例としては、塩（例えば、アルカリ塩、土類金属塩、付加的塩化物塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩（ここで、対イオンの例は、カルシウム、カリウムおよびナトリウムイオンである）、無機鉱物またはクレー（例えば、ゼオライト、カオリン、ベントナイト、タルクおよび／またはケイ酸塩）、炭水化物（例えば、スクロースおよび／またはデンプン）、着色顔料（例えば、二酸化チタン）、殺生物剤（例えば、ＲＯＤＡＬＯＮ（登録商標）、ＰＲＯＸＥＬ（登録商標））分散剤、消泡剤、還元剤、酸性剤、アルカリ性剤、酵素安定剤（グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールなどのポリオール、無機塩、糖類、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、またはホウ酸誘導体、およびこれらの組み合わせ）、酵素阻害剤、保存料（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンゾエート、ソルベート、または他の食品に認可されている保存料）、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。本調製物／組成物に使用し得る賦形剤としては、マルトース、スクロース、グルコースシロップもしくは乾燥グルコースシロップなどのグルコース、加工済みデンプン、ゼラチン化デンプン、Ｌ−乳酸、パルミチン酸アスコルビル、トコフェロール、レシチン、クエン酸、クエン酸塩、リン酸、リン酸塩、アルギン酸ナトリウム、カラゲナン、ローカストビーンガム、グアーガム、キサンタンガム、ペクチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、モノグリセリドおよびジグリセリド、モノグリセリドおよびジグリセリドのクエン酸エステル、スクロースエステル、二酸化炭素、アルゴン、ヘリウム、窒素、亜酸化窒素、酸素、水素、ならびにオクテニルコハク酸デンプンナトリウムが挙げられる。本明細書中の実施例７に示すように、本発明によるアミノペプチダーゼは、塩化ナトリウムを含む組成物中で酵素活性を保持し得る。
形態
本発明の生成物および／または組成物は、単独で使用されようと組成物中に含まれようと、任意の好適な形態で使用し得る。同様に、本発明のアミノペプチダーゼは、例えば、エキソプロテアーゼおよび／またはエンドプロテアーゼと併用した場合、食品産業において食品加工助剤または食品添加物（すなわち、食品成分、機能性食品成分または医薬品成分などの成分）として使用するのに適した任意の形態で使用し得る。
形態の好適な例としては、即時放出、遅延放出、調節放出、持続放出、パルス放出、または制御放出用途のための錠剤、丸剤、カプセル剤、オビュール剤、液剤、または懸濁剤のうちの１種以上が挙げられ、これらは香味料または着色剤を含有することができる。
一例として、本生成物および／または組成物が錠剤の形態で使用される場合（機能性成分として使用する場合など）、その錠剤はまた、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、およびグリシンなどの賦形剤；デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ、またはタピオカのデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、およびある種の複雑ケイ酸塩などの崩壊剤；ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、およびアカシアゴムなどの造粒用結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、およびタルクなどの滑沢剤の１種以上を含有することができる。
これら剤形の調製に際して使用される栄養学的に許容される担体の例としては、例えば、水、食塩水、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペトロエスラル脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
剤形用の好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。
水性懸濁剤および／またはエリキシル剤の場合、本発明のアミノペプチダーゼおよび／または組成物は、様々な甘味剤または香味剤、着色物質または染料と、また乳化剤および／または懸濁化剤と、また水、エタノール、プロピレングリコール、およびグリセリンなどの希釈剤と、ならびにこれらの組合せと併用することができる。
剤形としては、また、ゼラチンカプセル、ファイバーカプセル、ファイバー錠などが挙げられる。
方法
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、タンパク質加水分解物の生成において、例えば、加水分解度の増大のため、タンパク質加水分解物の一般的な苦味除去のため、および風味発生の増進のため、グルタミン酸塩の生成のため、ならびに／または、モルト生成もしくは醸造中のＦＡＮ生成のようなその他の目的で使用することができる。
本発明はさらに、タンパク質に富む材料の加水分解度を高めるため、本発明のポリペプチドをプロテアーゼ（例えば、エンドペプチダーゼ）と併用して使用する方法に関する。この方法は、タンパク質性基質を本ポリペプチドおよびエンドペプチダーゼで処理することを含む。基質は、それらの酵素で同時に処理してもよく連続的に処理してもよい。
本発明のポリペプチドは、タンパク質加水分解プロセスで従来使用されている有効量でタンパク質性基質に添加される。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、タンパク質性基質に、タンパク質１００ｇ当たり、約０．１〜約１００，０００アミノペプチダーゼ単位の範囲、またはタンパク質１００ｇ当たり約１〜約１０，０００アミノペプチダーゼ単位の範囲で添加される。本明細書で定義されるように、１アミノペプチダーゼ単位（ＡＰＵ）は、特定の条件下、Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）から１分当たり１マイクロモルのｐ−ニトロアニリドを放出するのに必要な酵素量である。アミノペプチダーゼアッセイでは、ペプチド基質Ｈ−Ａｌａ−ニトロアニルドの加水分解をｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）の放出によって測定する。ｐＮＡの波長４０５ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにより測定する。２０ｍＭのＣＰＢバッファー１８０μｌ、希釈酵素１５μｌおよび基質２０μｌにより、３０℃で反応を進める。ＣＰＢバッファーは２０ｍＭクエン酸、２０ｍＭリン酸塩、２０ｍＭホウ酸で構成され、ｐＨ９．０に調節される。基質は、１ｍｌのＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ製のジメチルスルホキシド（カタログ番号 Ｄ２６５０））中のＢＡＣＨＥＭ製のＨ−Ａｌａ−ｐＮＡ（Ｌ−１０７０）２０ｍｇである。
エンドぺプチダーゼは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株、好ましくはバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）株、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、好ましくはストレプトミセス・サーモバラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｖｕｌａｒｉｓ）もしくはストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）株、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株、好ましくはアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチヅス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ニドュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）株、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株、好ましくはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株、好ましくはフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）株から得ることができる。いくつかの実施形態では、エンドペプチダーゼは、ＡＬＰＨＡＬＡＳＥ（登録商標）ＡＦＰ、ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）ＰＡＬ、ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）ＰＮＬ、ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）ＡｌｋａｌｉｎｅＰｒｏｔｅａｓｅ、ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）ＰＸＴ、ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）ＰＢＲ、ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）ＰＨＴ、ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）３０Ｌ、およびＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）５１ＦＰからなる群から選択される。
本発明のエンドペプチダーゼは、タンパク質加水分解プロセスで従来使用されている有効量で、好ましくは約０．０５〜約１５ＡＵ／１００ｇタンパク質の範囲で、より好ましくは約０．１〜約８ＡＵ／１００ｇタンパク質の範囲で、タンパク質性基質に添加される。１ＡＵ（アンソン単位）は、標準条件下（すなわち、２５℃、ｐＨ７．５および反応時間１０分）、１分当たりフェノール試薬で１ミリグラム当量のチロシンと同じ色を示す量のＴＣＡ可溶性生成物を遊離するような初速度でヘモグロビンを消化する酵素の量と定義される。いくつかの実施形態では、エンドプロテアーゼは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約１０〜約３０００ｍｇの酵素、例えば、タンパク質基質１メートルトン（ＭＴ）当たり０．０１から３ｇの酵素の量で投与することができる。
酵素による処理、すなわち、酵素製剤と共にする基質のインキュベーションは、酵素製剤が不活化しない都合の良い温度、好ましくは約２０℃〜約７０℃の範囲の温度で行うことができる。通常の手順に従えば、酵素製剤は、インキュベーション混合物の温度を、酵素が不活化する温度、例えば、約７０℃超にまで上昇させることによって、またはインキュベーション混合物のｐＨを、酵素が不活化する程度、例えば、約４．０未満にまで低下させることによって、適切に不活化することができる。
さらに、本発明の方法は、タンパク質性基質の加水分解度を増大させる。本明細書で使用されるとき、加水分解度（ＤＨ）は、タンパク質分解酵素によって加水分解されたタンパク質中のアミノ結合の総数の割合である。一態様においては、本発明による酵素は、タンパク質性基質のＤＨを少なくとも約５、７、１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３５、４０、４５または５０％上昇または増大させる。一例において、この上昇は１型アミノペプチダーゼと比べてのものであるが、いかなる好適な比較も可能である。好ましい実施形態では、タンパク質加水分解物は、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｌａおよび／またはＧｌｎの含有量が、例えば１．１倍に増大する。
いくつかの実施形態では、タンパク質加水分解物は、Ｇｌｕの含有量が増大する。いくつかの実施形態では、タンパク質加水分解物は、Ｌｅｕの含有量が増大する。いくつかの実施形態では、タンパク質加水分解物は、Ｇｌｙの含有量が増大する。いくつかの実施形態では、タンパク質加水分解物は、Ｓｅｒの含有量が増大する。いくつかの実施形態では、タンパク質加水分解物は、Ａｓｐの含有量が増大する。いくつかの実施形態では、タンパク質加水分解物は、Ａｓｎの含有量が増大する。いくつかの実施形態では、タンパク質加水分解物は、Ｐｒｏの含有量が増大する。いくつかの実施形態では、タンパク質加水分解物は、Ｃｙｓの含有量が増大する。いくつかの実施形態では、タンパク質加水分解物は、Ａｌａの含有量が増大する。他のより好ましい実施形態では、タンパク質加水分解物は、Ｇｌｎの含有量が増大する。
本発明によるアミノペプチダーゼ酵素は、酵素反応生成物による阻害を減少し得る。本明細書の実施例８に示すように、本発明による２種類のＰｅｐＮ ２酵素は、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０由来のロイシンアミノペプチダーゼ２酵素（ＮＣＢＩレファレンス配列：ＸＰ＿００１８１９５４５．１）（配列番号１７として以下に示す）より、低い生成物阻害を示した。
Figure 2018518976
したがって、一実施形態では、発明は、配列番号１７（本明細書中ではＴＲＩ０６３ともいう―例えば、実施例を参照）のアミノペプチダーゼと比較して生成物阻害が低減した、アミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチドを提供する。特に、本発明によるアミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、２、３、４または５ｍＭ超の生成物阻害定数（Ｋｉ）値を有し得る。好ましい実施形態では、アミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、２型アミノペプチダーゼ酵素である。さらなる好ましい実施形態では、２型アミノペプチダーゼ酵素は、本明細書で定義される配列番号１〜８のいずれか、特に配列番号１または５に示すとおりである。
本発明によるアミノペプチダーゼ酵素は、Ｎ末端から番号を付与したときの２の位置にプロリン残基を有するポリペプチドを加水分解することができ得る。特に、本発明によるアミノペプチダーゼ酵素は、Ｎ末端から番号を付与したときの２の位置にプロリン残基を有するポリペプチドを、２時間のインキュベーションで出発濃度の半分超の濃度にまで加水分解することができ得る加水分解度は当該技術分野で知られた任意の好適なプロトコル、例えば、実施例１０で示した方法で測定することができる。実施例１０に示すように、本発明による２種類のＰｅｐＮ２酵素（ＴＲＩ０３２およびＴＲＩ０３５）は、ペプチドＴＰＡＡＡＲを徐々に加水分解して、２時間のインキュベーションで濃度を半分未満にまで低下させることができるが、ＴＲＩ０６３（アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ））およびＣＯＲＯＬＡＳＥ（登録商標）ＬＡＰは、１２時間以内にＴＰＡＡＡＲの加水分解を示すことはない。
本発明はまた、遊離グルタミン酸および／またはグルタミン酸残基を結合したペプチドに富む加水分解物を得る方法であって、基質を、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドの作用に曝すことを含む方法に関する。本発明はまた、遊離グルタミンもしくは遊離グルタミン酸および／またはグルタミンもしくはグルタミン酸残基を結合したオリゴペプチドに富む加水分解物を得る方法であって、基質を、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドの作用に曝すことを含む方法に関する。
本発明はまた、タンパク質加水分解物の苦味を除去する方法であって、基質を、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドの作用に曝すことを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、方法はさらに、基質を脱アミドプロセスに供することを含む方法に関する。脱アミドプロセスは、基質を、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドの作用に曝すのと同時に、前にまたは後に行うことができる。
いくつかの実施形態において、本発明の方法によれば、遊離したものであれ、結合したオリゴペプチドであれ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）がタンパク質加水分解物の香味および食味重要な役割を果たすため、香味が強化されたタンパク質加水分解物が生成される。いくつかの実施形態では、本方法により、機能性が向上した、特に、溶解性、乳化性が向上し、加水分解度が上昇し、かつ、起泡性が向上したタンパク質加水分解物もまた生成される。
アンモニアの放出によるアミド（グルタミンまたはアスパラギン）の荷電酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸）への変換は、脱アミドとして知られている。脱アミドは、非酵素的脱アミドプロセスとして、または酵素的脱アミドプロセスとして行い得る。
いくつかの実施形態では、脱アミドは、酵素的脱アミドプロセスとして、例えば基質をグルタミナーゼ、トランスグルタミナーゼおよび／またはペプチドグルタミナーゼに曝すことによって行われる。
いくつかの実施形態では、グルタミナーゼは、グルタミナーゼＳＤ−Ｃ１００ＳＴＭ（Ａｍａｎｏ、日本）である。
いくつかの実施形態では、グルタミナーゼは、基質タンパク質１ｇ当たり約１ｍｇ〜２０ｍｇの量で投与することができる。いくつかの実施形態では、グルタミナーゼは、基質タンパク質１ｇ当たり約５ｍｇ〜１５ｍｇの量で投与することができる。いくつかの実施形態では、グルタミナーゼは、基質タンパク質１ｇ当たり約１０ｍｇの量で投与することができる。
本発明はまた、グルタミン酸塩を生成する方法であって、タンパク質基質を、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドの作用に曝すことを含む方法に関する。
トランスグルタミナーゼは、哺乳動物などの都合のよい供給源からのもの（例えば、ＪＰ１０５０３８２およびＪＰ５０２３１８２を参照）であっても、活性化第ＸＩＩＩ因子（例えば、国際公開第９３／１５２３４号パンフレットを参照）であっても、魚由来のもの（例えば、ＥＰ５５５，６４９を参照）であっても、微生物から得られたもの（例えば、ＥＰ３７９，６０６、国際公開第９６／０６９３１号パンフレット、国際公開第９６／２２３６６号パンフレットを参照）であってもよい。いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼは、卵菌、例えば、フィトフトラ属（ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、好ましくはフィトフトラ・カクトルム（ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ）株、または、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、好ましくはピシウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）株、ピシウム・スピノサム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐ．）株、ピシウム・インテルメディアム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）株、ピシウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）株、またはピシウム・ペリイラム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｒｉｉｌｕｍ）（もしくは、ピシウム・ペリクロカム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｒｉｐｌｏｃｕｍ））株から得られる。いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼは、細菌起源のものであり、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、好ましくはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株、ストレプトベルティシリウム属（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、好ましくは、ストレプトベルティシリウム・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）株、ストレプトベルティシリウム・グリセオバーティシラタム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｅｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｍ）株、またはストレプトベルティシリウム・シンナモネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）株、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、好ましくはストレプトミセス・リディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｙｄｉｃｕｓ）株から得られる。
ペプチドグルタミナーゼは、ペプチドグルタミナーゼＩ（ペプチジル−グルタミナーゼ；ＥＣ．３．５．１．４３）、またはペプチドグルタミナーゼＩＩ（タンパク質−グルタミングルタミナーゼ；ＥＣ．３．５．１．４４）であっても、あるいはこれらの混合物であってもよい。ペプチドグルタミナーゼは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、好ましくはアスペルギルス・ヤポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）株、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、好ましくはバチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）株、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、好ましくはクリプトコッカス・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ）、またはデバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、好ましくはデバリオミセス・クロエケリ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｋｌｏｅｃｈｅｒｉ）株から得ることができる。
トランスグルタミナーゼはタンパク質性基質に、脱アミドプロセスで従来使用されている有効量で、好ましくは、基質量に対し酵素製剤約０．０１〜約５重量％の範囲で、より好ましくは、約０．１〜約１重量％の範囲で添加される。
ペプチドグルタミナーゼはタンパク質性基質に、脱アミドプロセスで従来使用されている有効量で、好ましくは、基質１００ｇに対し約０．０１〜約１００，０００ペプチドグルタミナーゼ単位の範囲で、より好ましくは、約０．１〜約１０，０００ペプチドグルタミナーゼ単位の範囲で添加される。
ペプチドグルタミナーゼ活性は、Ｃｅｄｒａｎｇｏｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９６５，Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉａ Ｖｏｌ．２９ １４３頁）の手順にしたがって測定することができる。この手順においては、１ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５に調節した酵素試料０．５ｍｌを小さな容器に投入する。その後、この容器にｐＨ１０．８のホウ酸塩緩衝液１ｍｌを加える。放出されるアンモニアを５Ｎの硫酸で吸収させ、ネスラー試薬を用いて、混合物を発色させ、４２０ｎｍで測定する。１ペプチドグルタミナーゼ単位は、これらの条件下で１分当たり１マイクロモルのアンモニアを生成することができる酵素量である。
本発明はまた、モルト生成および／または醸造中に遊離アミノ窒素（ＦＡＮ）を生成する方法であって、モルト生成および／または醸造プロセス中に、基質を、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドの作用に曝すことを含む方法に関する。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、タンパク質基質は本発明のポリペプチドに曝される。本発明のペプチドグルタミナーゼは、タンパク質性基質に、タンパク質の加水分解プロセスで従来使用されている有効量で、好ましくは約０．００１〜約０．５ＡＵ／１００ｇ基質の範囲で、より好ましくは約０．０１〜約０．１ＡＵ／１００ｇ基質の範囲で添加される。
他の実施形態において、本発明の遊離グルタミン酸および／またはグルタミン酸残基を結合したペプチドに富む加水分解物を生成する方法は、基質を、１種以上の非特異的に作用するエンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ酵素に曝すことを含む。この工程は、タンパク質基質を本発明のポリペプチドに曝す工程と同時に行ってもよく、後に行ってもよい。
より好ましい実施形態では、非特異的に作用するエンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ酵素は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株から得られる。
非特異的に作用するエンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ酵素は、タンパク質の加水分解プロセスで従来使用されている有効量で、好ましくは約 〜の範囲で、基質に添加される。
いくつかの実施形態では、エンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約５０〜約３０００ｍｇの酵素、例えば、タンパク質基質１メートルトン（ＭＴ）当たり０．０５から３ｇの酵素の量で投与することができる。
好適には、エンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼは、タンパク質基質１ＭＴ当たり約４．０ｇ未満の酵素の量で投与することができる。
他の実施形態において、エンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼは、タンパク質基質１ＭＴ当たり約０．５ｇ〜約５．０ｇの酵素で投与することができる。好適には、エンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼは、タンパク質基質１ＭＴ当たり約０．５ｇ〜約３．０ｇの酵素で投与することができる。より好適には、エンドプロテアーゼは、タンパク質基質１ＭＴ当たり約１．０ｇから約２．０ｇの酵素において投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、タンパク質基質ならびに／または食品および／もしくは飼料添加物組成物１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ〜約２ｇの酵素量で投与することができる。好適には、本発明のポリペプチドは、タンパク質基質ならびに／または食品および／もしくは飼料添加物組成物１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約２ｇの酵素量で投与することができる。より好適には、タンパク質基質ならびに／または食品および／もしくは飼料添加物組成物１ｋｇ当たり約５ｍｇ〜約１．５ｇの酵素量である。
加水分解物の調製において、本発明のポリペプチドは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ〜約２ｇの酵素量で投与することができる。好適には、本発明のポリペプチドは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約２ｇの酵素量で投与することができる。より好適には、タンパク質基質１ｋｇ当たり約５ｍｇ〜約１．５ｇの酵素量である。
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約５ｍｇ〜約５００ｍｇの酵素量で投与することができる。好適には、本発明のポリペプチドは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約５０ｍｇ〜約５００ｍｇの酵素量で投与することができる。好適には、本発明のポリペプチドは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約１００ｍｇ〜約４５０ｍｇの酵素量で投与することができる。
酵素による各処理は、酵素製剤が不活化されない温度、好ましくは、約２０℃〜約７０℃の範囲の温度で行うことができる。酵素製剤は、その後、温度を、例えば約７０℃を超える温度にまで上昇させることによって、またはｐＨを、例えば約４．０未満にまで低下させることによって不活化させることができる。
本発明の方法に使用されるタンパク質性基質は、無傷タンパク質、予め加水分解されたタンパク質（すなわち、ペプチド）、またはこれらの混合物から構成され得る。タンパク質性基質は、野菜起源のものであっても動物起源のものであってもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質性基質は、野菜起源のもの、例えば、ダイズタンパク質、穀類タンパク質、例えば小麦グルテン、トウモロコシグルテン、大麦、ライ麦、オート麦、コメ、ゼイン、ハウチワマメ、綿実タンパク質、ラッカセイ、アルファルファタンパク質、エンドウ豆タンパク質、豆類タンパク質（ｆａｂａｃｅｏｕｓ ｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ゴマタンパク質またはヒマワリ起源のものである。動物起源のタンパク質性基質は、ホエータンパク質、カゼイン、食肉タンパク質、魚タンパク質、赤血球、卵白、ゼラチン、ラクトアルブミン、毛髪タンパク質または羽毛タンパク質であり得る。
本発明はまた、これらの方法で生成されたタンパク質加水分解物に関する。
ヌクレオチド配列の調製
本明細書に定義される特定の特性を有するタンパク質、または改変に好適なタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、前記タンパク質を産生する任意の細胞または生物から同定および／または単離および／または精製することができる。当該技術分野においては、ヌクレオチド配列の同定および／または単離および／または精製に関し、様々な方法がよく知られている。
一例として、好適な配列が同定および／または単離および／または精製されたなら、より多くの配列を調製するＰＣＲ増幅技術を使用することができる。
さらなる例として、酵素を産生する生物からの染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを使用して、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。酵素のアミノ酸配列がわかれば、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いて、生物から調製されたゲノムライブラリーから酵素をコードするクローンを同定することができる。
あるいは、別の既知の酵素遺伝子と相同の配列を含有する標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、酵素をコードするクローンを同定することができる。後者の場合、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が使用される。
あるいは、酵素をコードするクローンは、プラスミドなどの発現ベクターにゲノムＤＮＡの断片を挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーにより酵素陰性細菌を形質転換し、次いで、この形質転換された細菌を、酵素用基質（すなわち、マルトース）を含有する寒天プレート上に形質転換された細菌をプレーティングし、これにより酵素を発現するクローンの同定を可能とすることにより同定することができる。
またさらなる代替例においては、酵素をコードするヌクレオチド配列は、確立された標準的方法、例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２，ｐ １８５９−１８６９に記載されるホスホラミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３，ｐ８０１−８０５に記載される方法による合成によって調製することができる。ホスホラミダイト法においては、オリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡ合成装置で合成し、精製し、アニールし、ライゲートし、そして適切なベクターにクローニングする。
ヌクレオチド配列は、標準的技術により合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源（適宜）の断片をライゲートすることにより調製される混合ゲノムおよび合成起源、混合合成およびｃＤＮＡ起源、または混合ゲノムおよびｃＤＮＡ起源のものであり得る。ライゲートされた各断片は、ヌクレオチド配列全体の種々の部分に対応する。ＤＮＡ配列はまた、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書またはＳａｉｋｉ Ｒ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐｐ４８７−４９１）に記載されるような、特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製することができる。
アミノ酸配列
本発明の範囲には、本明細書中に定義した特定の特性を有する酵素のアミノ酸配列もまた包含される。
本明細書において使用される用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および／または用語「タンパク質」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」、用語「ペプチド」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
アミノ酸配列は、好適な資源から調製／単離することができ、または、合成により作製することができ、または、組換えＤＮＡ技術の使用により調製することができる。
本発明に包含されるタンパク質は他のタンパク質、特に、プロリンエンドプロテアーゼ、トリペプチジルエキソペプチダーゼ、および他の形態のエンドプロテアーゼまたはエキソプロテアーゼと共に使用することができる。したがって、本発明はまた、タンパク質の組合せであって、本発明のアミノペプチダーゼ、および本発明の他のアミノペプチダーゼであり得る他の酵素を含む組み合わせをカバーする。この態様は、後述のセクションにおいて考察する。
好ましくは、本発明に関し、本発明それ自体の範囲に包含されるアミノ酸配列は、天然酵素ではない。これに関し、「天然酵素」という用語は、その天然環境中に存在し、その天然ヌクレオチド配列により発現された酵素全体を意味する。
配列同一性または配列相同性
本発明はまた、本明細書に定義される特定の特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の配列同一性または配列相同性を有する配列、またはそのようなポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列（以下、「相同配列」と称する）の使用を包含する。ここで、「相同体」という用語は、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列とある相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は、「同一性」と同じであると見なすことができる。
相同アミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列は、アミノペプチダーゼの機能活性を保持し、かつ／またはアミノペプチダーゼの活性を向上させるポリペプチドを提供および／またはコードするはずである。
本文脈においては、相同配列は、対象配列と少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは、少なくとも９５または９８％同一であり得るアミノ酸配列を含むと解釈される。通常、相同体は、対象アミノ酸配列と同一の活性部位などを含むであろう。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮することもできるが、本発明との関連では、配列同一性の観点から相同性を表現することが好ましい。
本文脈においては、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）と少なくとも７５、８０、８５または９０％同一、好ましくは、少なくとも９５または９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。通常、相同体は、対象配列と同じ、活性部位などをコードする配列を含むであろう。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮することもできるが、本発明との関連では、配列同一性の観点から相同性を表現することが好ましい。
相同性の比較は、目視により、またはより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを使用して行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性率を計算することができる。
相同性率は、連続配列にわたり計算することができ、すなわち、ある１つの配列を他の配列とアラインし、ある１つの配列中の各アミノ酸を他の配列中の対応するアミノ酸と１回に１残基、直接比較する。これは「ギャップなし」アライメントと称される。通常、このようなギャップなしアライメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実施される。
これは非常に簡易で一貫した方法であるが、例えば、配列の他の同一ペアにおいて、ある挿入または欠失が後続のアミノ酸残基をアライメントから外すことを考慮し得ず、したがって、グローバルアライメントを実施した場合に相同性率を大きく低下させる可能性がある。このような理由から、ほとんどの配列比較法は、全相同性スコアを過度にペナルティ化せずに、あり得る挿入および欠失を考慮する最適なアライメントを作成するように設計される。これは、配列アライメント中に「ギャップ」を挿入して局所的相同性の最大化を試みることにより達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸について、可能な限り少ないギャップを有する配列アライメント（２つの比較配列間のより高い関係性を反映する）が、多くのギャップを有するものより高いスコアを達成するように、そのアライメント中で生じる各ギャップに対して「ギャップペナルティ」を割り当てる。通常、あるギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、そのギャップ中の後続の各残基に対してより小さいペナルティを課す「アファインギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ながら、より少数のギャップを有する最適化されたアライメントを生成するであろう。大多数のアライメントプログラムは、ギャップペナルティが修飾されることを許容する。しかし、配列比較のためにそのようなソフトウエアを使用する場合には、デフォルト値を使用することが好ましい。
したがって、最大相同性率の計算には、最初にギャップペナルティを考慮して最適なアライメントを作成することが要求される。このようなアライメントの実施に好適なコンピュータプログラムは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）である。配列比較を実施し得るソフトウエアの例としては、例えば、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照）、ＢＬＡＳＴ ２（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７７（１）：１８７−８およびｔａｃｈｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、およびＡｌｉｇｎＸが挙げられるが、これらに限定されない。少なくともＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ ２およびＦＡＳＴＡは、オフラインおよびオンライン検索で入手可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９９、上記、７−５８〜７−６０頁を参照）。
最終相同性率を同一性に関して計測することができるが、アライメントプロセスそれ自体は、通常は、オールオアナッシングのペア比較に基づくものではない。代わりに、化学的類似性または進化的距離に基づきそれぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てる数値換算類似度（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）スコア行列が一般に使用される。一般に使用されるそのような行列の一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムスイートのためのデフォルト行列）である。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値、または供給されている場合にはカスタムシンボル比較表を使用する（さらなる詳細については、ユーザマニュアルを参照）。一部の用途については、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩパッケージにためのデフォルト値を使用することが好ましい。
あるいは、相同性率は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７−２４４）と類似するアルゴリズムに基づくＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）における多重アライメント特徴を使用して算出することができる。
ソフトウエアが最適なアライメントを生成すれば、相同性率、好ましくは、配列同一性率を算出することが可能である。ソフトウエアは、通常、これを配列比較の一部として実行し、数的結果を生成する。
配列同一性を決定する場合にギャップペナルティを使用するのであれば、ペアワイズアライメントに以下のパラメータを使用することが好ましい：
Figure 2018518976
一実施形態において、ＣＬＵＳＴＡＬは、上記定義のとおり設定されたギャップペナルティおよびギャップエクステンションを用いて使用することができる。
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも３０個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも４０個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも５０個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも６０個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも１００個の連続ヌクレオチドにわたり決定される。
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、全配列にわたり決定することができる。
変異体／相同体／誘導体
本発明はまた、タンパク質の任意のアミノ酸配列、またはそのようなパンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列の、変異体、相同体および誘導体の使用を包含する。
ここで、「相同体」という用語は、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列とある相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は、「同一性」と同じであると見なすことができる。
本文脈においては、相同配列は、対象配列と少なくとも７５、８０、８５または９０％同一、好ましくは、少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むと解釈される。通常、相同体は、対象アミノ酸配列と同一の活性部位などを含むであろう。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮することもできるが、本発明との関連では、配列同一性の観点から相同性を表現することが好ましい。
本文脈においては、相同配列は、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列（対象配列）と少なくとも７５、８０、８５または９０％同一、好ましくは、少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。通常、相同体は、対象配列と同じ、活性部位などをコードする配列を含むであろう。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮することもできるが、本発明との関連では、配列同一性の観点から相同性を表現することが好ましい。
相同性の比較は、目視により、またはより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを使用して行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性率を計算することができる。相同性率は、連続配列にわたり計算することができ、すなわち、ある１つの配列を他の配列とアラインし、ある１つの配列中の各アミノ酸を他の配列中の対応するアミノ酸と１回に１残基、直接比較する。これは「ギャップなし」アライメントと称される。通常、このようなギャップなしアライメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実施される。
これは非常に簡易で一貫した方法であるが、例えば、配列の他の同一ペアにおいて、ある挿入または欠失が後続のアミノ酸残基をアライメントから外すことを考慮し得ず、したがって、グローバルアライメントを実施した場合に相同性率を大きく低下させる可能性がある。このような理由から、ほとんどの配列比較法は、全相同性スコアを過度にペナルティ化せずに、あり得る挿入および欠失を考慮する最適なアライメントを作成するように設計される。これは、配列アライメント中に「ギャップ」を挿入して局所的相同性の最大化を試みることにより達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸について、可能な限り少ないギャップを有する配列アライメント（２つの比較配列間のより高い関係性を反映する）が、多くのギャップを有するものより高いスコアを達成するように、そのアライメント中で生じる各ギャップに対して「ギャップペナルティ」を割り当てる。通常、あるギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、そのギャップ中の後続の各残基に対してより小さいペナルティを課す「アファインギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ながら、より少数のギャップを有する最適化されたアライメントを生成するであろう。大多数のアライメントプログラムは、ギャップペナルティが修飾されることを許容する。しかし、配列比較のためにそのようなソフトウエアを使用する場合には、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のためのギャップペナルティのデフォルトは、ギャップが−１２および各エクステンションが−４である。
したがって、最大相同性率の計算には、最初にギャップペナルティを考慮して最適なアライメントを作成することが要求される。このようなアライメントの実施に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ １９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）である。配列比較を実施し得る他のソフトウエアの例としては、例えば、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，上記を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両者は、オフラインおよびオンライン検索で入手可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９、上記を参照）。しかしながら、一部の用途では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと称する新しいツールもまた、タンパク質およびヌクレオチド配列の比較に利用可能である。
最終相同性率を同一性に関して計測することができるが、アライメントプロセスそれ自体は、通常は、オールオアナッシングのペア比較に基づくものではない。代わりに、化学的類似性または進化的距離に基づきそれぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てる数値換算類似度（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）スコア行列が一般に使用される。一般に使用されるそのような行列の一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムスイートのためのデフォルト行列）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値、または供給されている場合にはカスタムシンボル比較表を使用する（さらなる詳細については、ユーザマニュアルを参照）。一部の用途では、ＧＣＧパッケージのためのパブリックデフォルト値、または他のソフトウエアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。
あるいは、相同性率は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８）、上記を参照）と類似するアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における多重アライメント特徴を使用して算出することができる。
ソフトウエアが最適なアライメントを生成すれば、相同性率、好ましくは、配列同一性率を算出することが可能である。ソフトウエアは、通常、これを配列比較の一部として実行し、数的結果を生成する。
配列は、サイレント変化を生成し、機能的に同等の物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換も有し得る。意図的なアミノ酸置換は、その物質の二次的結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負荷電アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正荷電アミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられ；また、類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を持つアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。
保存的置換は、例えば、以下の表にしたがってすることができる。第２列の同一ブロックの、好ましくは、第３列の同一行のアミノ酸を互いに置換することができる：
Figure 2018518976
本発明はまた、起こり得る相同置換（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）および取り換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ））はいずれも、本明細書中では、既存のアミノ酸残基を代替の残基と置き換えることを意味するのに使用される）、すなわち、塩基性のものと塩基性のもの、酸性のものと酸性のもの、極性のものと極性のものなどの同種置換を包含する。非相同置換、すなわち、ある分類の残基から他の分類の残基へ、または、オルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の混入を伴う置換もまた起こり得る。
取り換えはまた、非天然アミノ酸によりすることができ、そのようなアミノ酸としては、アルファ＊およびアルファ二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン化誘導体、例えば、トリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば、４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊が挙げられる。記号＊は、誘導体の疎水性を示すために上記考察の目的（相同または非相同置換に関する）に利用されており、一方、＃は、誘導体の親水性を示すために利用されており、＃＊は、両親媒性を示す。
変異アミノ酸配列は、配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入することができる好適なスペーサー基、例として、アルキル基、例えばメチル基、エチル基またはプロピル基を、アミノ酸スペーサー、例えばグリシンまたはβ−アラニン残基に加えて含み得る。変異のさらなる形態は、ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在を含むが、当業者には十分に理解されよう。疑義を回避するため、「ペプトイド形態」は、α炭素置換基がα炭素ではなく残基の窒素原子上に存在する変異アミノ酸残基を指すために使用される。ペプトイド形態のペプチドを調製する方法は当該技術分野、例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１、およびＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４において知られている。
本発明において使用されるヌクレオチド配列は、それらの範囲内に、合成または修飾ヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの修飾が、当該技術分野において知られている。これらとしては、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、ならびに／または分子の３’および／もしくは５’末端におけるアクリジンもしくはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的のため、本明細書に記載のヌクレオチド配列が当該技術分野において利用可能な任意の方法により修飾し得ることを理解すべきである。このような修飾は、本発明のヌクレオチド配列のインビボ活性または寿命を向上させるように実施することができる。
本発明はまた、本明細書に提示される配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその任意の誘導体、断片もしくは誘導体の使用を包含する。配列がその断片に相補的である場合、その配列をプローブとして使用して他の生物における類似のコード配列を同定するなどのことが可能である。
本発明の配列と１００％相同でないが、本発明の範囲内であるポリヌクレオチドは、多数の手法で得ることができる。本明細書に記載の配列の他の変異体は、例えば、一連の個体、例えば、異なる集団からの個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプロービングすることにより得ることができる。さらに、他の相同体を得ることができ、そのような相同体およびその断片は、一般に、本明細書の配列表に示す配列に選択的にハイブリダイズし得る。このような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリー、または他の動物種からのゲノムＤＮＡライブラリーをプロービングし、中〜高ストリンジェンシーの条件下で付属の配列表の配列のいずれか１つの全部または一部を含むプローブによりそのようなライブラリーをプロービングすることにより得ることができる。類似の考察は、本発明のポリペプチドまたはヌクレオチド配列の種相同体および対立遺伝子変異体を得ることにも適用される。
変異体および株／種相同体はまた、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードする変異体および相同体内の配列を標的とするように設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを使用して得ることができる。保存配列は、例えば、いくつかの変異体／相同体からのアミノ酸配列をアラインすることにより予測することができる。配列アライメントは、当該技術分野で知られるコンピュータソフトウエアを使用して実施することができる。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く使用される。
縮重ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含有し、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いる配列のクローニングに使用されるものよりも低いストリンジェンシー条件において使用される。
あるいは、このようなポリヌクレオチドは、特徴付けされた配列の部位特異的突然変異誘発により得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現する特定の宿主細胞についてのコドン選好性を最適化するためにサイレントコドン配列変化が要求される場合に有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するため、またはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性もしくは機能を変更するために他の配列変化が望まれることがある。
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー、代替増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば、放射性もしくは非放射性標識を使用する慣用の手段による顕示標識で標識されたものを産生するために使用することができ、またはポリヌクレオチドをベクター中にクローニングすることができる。このようなプライマー、プローブおよび他の断片は、少なくとも１５、好ましくは、少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチド長であり、これらもまた、本明細書において使用されるポリヌクレオチドという用語に包含される。
本発明によるＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブなどのポリヌクレオチドは、組換えにより、合成により、または当業者に利用可能な任意の手段により産生することができる。これらはまた、標準的手法によりクローニングすることもできる。
一般に、プライマーは、所望の核酸配列の１回１ヌクレオチドの段階的製造を含む合成手段により産生される。自動化技術を使用してこれらを達成するための技術は、当該技術分野において容易に利用可能である。
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段を使用して、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使用して産生される。プライマーは、増幅されたＤＮＡを好適なクローニングベクター中にクローニングすることができるように、好適な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。
ハイブリダイゼーション
本発明はまた、本発明の核酸配列に相補的な配列、または本発明の配列もしくは本発明の配列に相補的な配列にハイブリダイズすることができる配列を包含する。
本明細書において使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合するプロセス」、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において実施される増幅のプロセスを含む。
本発明はまた、本明細書に提示される配列に相補的な配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、またはその任意の誘導体、断片もしくは誘導体の使用を包含する。
「変異体」という用語は、本明細書に提示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る配列に相補的な配列も包含する。
好ましくは、「変異体」という用語は、本明細書に提示されるヌクレオチド配列にストリンジェンシーな条件（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３ ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズし得る配列に相補的な配列を包含する。
より好ましくは、「変異体」という用語は、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に高ストリンジェンシーな条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３ ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズし得る配列に相補的な配列を包含する。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示される配列に相補的な配列を含む）にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列に関する。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示される配列に相補的な配列を含む）にハイブリダイズし得る配列に相補的なヌクレオチド配列に関する。
中位〜最大のストリンジェンシー条件下で本明細書に提示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列もまた本発明の範囲内に含まれる。
好ましい態様においては、本発明は、ストリンジェンシーな条件（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ）下で本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、またはその相補体をカバーする。
より好ましい態様においては、本発明は、高ストリンジェンシーな条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ）下で本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、またはその相補体をカバーする。
分子進化
非限定的な例として、インビボまたはインビトロでヌクレオチド配列中に多数の部位特異的またはランダムな変異を産生すること、および、続いて種々の手段によりコードされるポリペプチドの改善された機能性についてスクリーニングすることが可能である。
さらに、ポリヌクレオチド配列の変異または天然変異体を、野生型、または他の変異もしくは天然変異体により組換えて、新たな変異体を産生することができる。このような新たな変異体もまた、コードされるポリペプチドの改善された機能性についてスクリーニングされ得る。新たな好ましい変異体の産生は、当該技術分野において十分に確立された種々の方法、例えば、エラー閾値変異誘発（Ｅｒｒｏｒ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（国際公開第９２／１８６４５号パンフレット）、オリゴヌクレオチド媒介ランダム変異誘発（米国特許第５，７２３，３２３号明細書）、ＤＮＡシャッフリング（米国特許第５，６０５，７９３号明細書）、エキソ媒介遺伝子アセンブリ、国際公開第００／５８５１７号パンフレットにより達成することができる。これらおよび類似のランダム指向分子進化法の適用により、タンパク質の構造または機能のいかなる予備知識もなしで好ましい特徴を有する本発明の酵素の変異体の同定および選択が可能となり、予測可能でないが、有益な変異または変異体の産生が可能となる。当該技術分野において、酵素活性の最適化または改変のための分子進化の適用例が数多くあり、そのような例として、限定はされないが、以下の１つ以上が挙げられる：
宿主細胞またはインビトロにおける発現および／または活性の最適化、
酵素活性の増大、基質および／または生成物特異性の改変、
酵素安定性または構造安定性の増大または低減、好ましい環境条件、例えば温度、ｐＨ、基質における酵素の活性／特異性の改変。
部位特異的変異誘発
タンパク質コードヌクレオチド配列を単離したなら、または推定タンパク質コードヌクレオチド配列を同定したなら、本発明のタンパク質を調製するために配列を変異させることが望ましい場合がある。
変異は、合成オリゴヌクレオチドを使用して導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位をフランキングするヌクレオチド配列を含有する。
好適な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２，ｐ６４６−６４９）に開示されている。酵素コードヌクレオチド配列中に突然変異を導入する他の方法は、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９），１８０，ｐ１４７−１５１）に記載されている。
組換え体
一態様において、本発明において使用される配列は、組換え配列、すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して調製された配列である。
これらの組換えＤＮＡ技術は、当業者の技能の範囲内である。そのような技術は、文献、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに説明されている。
合成物
一態様において、本発明において使用される配列は、合成配列、すなわち、インビトロ化学または酵素的合成により調製された配列である。これとしては、限定されるものではないが、宿主生物、例えば、メチロトローフ酵母のピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）およびハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）に最適なコドン使用頻度を用いて作製された配列が挙げられる。
発現
酵素の発現
本発明において使用されるヌクレオチド配列は、組換え複製ベクター中に取り込むことができる。ベクターは、ヌクレオチド配列を複製し、タンパク質／酵素形態で、適合性の宿主細胞中で、および／または適合性の宿主細胞から発現させるために使用することができる。
発現は、制御配列、例えば、調節配列を使用して制御することができる。
ヌクレオチド配列の発現により宿主組換え細胞により産生されるタンパク質は、使用される配列および／またはベクターに応じて、分泌、または、細胞内に含有させることができる。コード配列は、特定の原核または真核細胞膜を介する物質コード配列の分泌を指示するシグナル配列を用いて設計することができる。
発現ベクター
「発現ベクター」という用語は、インビボまたはインビトロで発現し得るコンストラクトを意味する。
好ましくは、発現ベクターは、好適な宿主生物のゲノム中に取り込まれる。「取り込まれる」という用語は、好ましくは、ゲノム中への安定した取り込みをカバーする。
本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が、好適な宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を提供し得る調節配列に作動可能に結合しているベクター中に存在し得る。
本発明において使用されるベクターは、本発明のポリペプチドの発現を提供するように下記の好適な宿主細胞中に形質転換することができる。
ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、またはファージベクターの選択は、それを導入すべき宿主細胞に依存することが多い。
本発明において使用されるベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含有し得る。あるいは、選択は、同時形質転換（国際公開第９１／１７２４３号パンフレットに記載）により達成することができる。
ベクターは、例えばＲＮＡの産生にインビトロで使用することができ、または宿主細胞を形質移入し、形質転換し、形質導入し、または感染させるために使用することができる。
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、複製ベクター中に本発明のヌクレオチド配列を導入し、適合性の宿主細胞中にベクターを導入し、ベクターの複製を生じさせる条件下で宿主細胞を増殖させることにより、本発明のヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
ベクターは、当該宿主細胞中のベクターの複製を可能とするヌクレオチド配列をさらに含み得る。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１およびｐＩＪ７０２の複製起源である。
調節配列
一部の適用では、本発明において使用されるヌクレオチド配列は、例えば、選択された宿主細胞によるヌクレオチド配列の発現を提供し得る調節配列に作動可能に結合している。例として、本発明は、そのような調節配列に作動可能に結合している本発明のヌクレオチド配列を含むベクターをカバーする。すなわち、ベクターは発現ベクターである。
「作動可能に結合している」という用語は、記載の構成成分が、それらの意図した態様でそれらを機能させる関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に結合している」調節配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような手法でライゲートされる。
「調節配列」という用語は、プロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の発現調節シグナルを含む。
「プロモーター」という用語は、当該技術分野における通常の意味で使用され、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の発現の向上はまた、異種調節領域、例えば、プロモーター、分泌リーダーおよびターミネーター領域の選択により達成することができる。
好ましくは、本発明によるヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動可能に結合している。
他のプロモーターを使用して、本発明のポリペプチドの発現を指向させることもできる。
細菌、真菌または酵母宿主中のヌクレオチド配列の転写の指向に好適なプロモーターの例は、当該技術分野においてよく知られている。
プロモーターは、好適な宿主中における発現を確保または増加させるための特徴部をさらに含むことができる。例えば、特徴部は、プリブノーボックスまたはＴＡＴＡボックスなどの保存領域であり得る。
コンストラクト
「コンストラクト」という用語（「コンジュゲート」、「カセット」および「ハイブリッド」などの用語と同義である）は、プロモーターに直接または間接的に付着している本発明により使用されるヌクレオチド配列を含む。
間接的付着の一例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列との間の、イントロン配列、例えばＳｈ１−イントロンまたはＡＤＨイントロンなどの、好適なスペーサー群の提供である。同じことが、直接または間接的付着を含む、本発明に関連する「融合している」という用語にも当てはまる。一部の場合において、これらの用語は、野生型遺伝子プロモーターと通常会合するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組合せを、それらがいずれも天然環境に存在する場合には、カバーしない。
コンストラクトは、遺伝子コンストラクトの選択を可能とするマーカーも含有または発現し得る。
一部の適用では、好ましくは、本発明のコンストラクトは、少なくとも、プロモーターに作動可能に結合している本発明のヌクレオチド配列を含む。
宿主細胞
「宿主細胞」という用語は、本発明との関連では、上記のヌクレオチド配列または発現ベクターを含み、本明細書に定義される特定の特性を有するタンパク質の組換え産生に使用される任意の細胞を含む。
したがって、本発明のさらなる実施形態は、本発明のタンパク質を発現するヌクレオチド配列により形質転換または形質移入された宿主細胞を提供する。細胞は、前記ベクターと適合するように選択され、例えば、原核（例えば、細菌）、真菌、酵母または植物細胞であり得る。
好適な細菌宿主生物の例は、グラム陽性またはグラム陰性細菌種である。
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の性質、および／または発現タンパク質のさらなるプロセシングについての所望度に応じて、酵母または他の真菌などの真核宿主が好ましいことがある。一般に、酵母細胞は、操作がより容易なため、真菌細胞よりも好ましい。しかしながら、タンパク質のなかには、酵母細胞からの分泌が乏しかったり、一部の場合、適切にプロセシングされなかったりする（例えば、酵母の超グリコシル化）ものがある。これらの例においては、異なる真菌宿主生物を選択すべきである。
好適な宿主細胞、例えば、酵母、真菌および植物宿主細胞の使用は、本発明の組換え発現産物に最適な生物学的活性を付与することが必要であり得る場合に、翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、脂質化、およびチロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化）を提供し得る。
宿主細胞は、アミノペプチダーゼ欠損株またはアミノペプチダーゼマイナス株であってもよい。本発明はまた、親細胞の変異細胞を産生する方法であって、ポリペプチドをコードする核酸配列、またはその制御配列を破壊または欠失させ、それにより変異細胞中のポリペプチドの産生量を親細胞より減少させることを含む方法に関する。
アミノペプチダーゼ活性が低下した株の構築は、細胞中のアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドの発現に必要な核酸配列を修飾または不活化することによって首尾よく行うことができる。
生物
「生物」という用語は、本発明との関連では、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および／もしくはそれから得られた産物を含み得、かつ／またはプロモーターが生物中に存在する場合に本発明によるヌクレオチド配列の発現を可能とし得る任意の生物を含む。
好適な生物としては、原核、真菌、酵母または植物を挙げることができる。
「トランスジェニック生物」という用語は、本発明との関連では、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および／もしくはそれから得られた産物を含み、かつ／またはプロモーターが生物内の本発明によるヌクレオチド配列の発現を可能とし得る任意の生物を含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中に取り込まれる。
「トランスジェニック生物」という用語は、天然ヌクレオチドコード配列がその天然プロモーター（これもその天然環境中に存在する）の制御下にある場合、天然環境中の天然ヌクレオチドコード配列をカバーしない。
したがって、本発明のトランスジェニック生物は、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本発明によるコンストラクト、本発明によるベクター、本発明によるプラスミド、本発明による細胞、本発明による組織、またはそれらの産物の１つ、または組合せを含む生物を含む。
例えば、トランスジェニック生物はまた、異種プロモーターの制御下で本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
宿主細胞／生物の形質転換
上記のとおり、宿主生物は、原核または真核生物であり得る。好適な原核宿主の例としては、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブティルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。
原核宿主の形質転換に関する技術は、当該技術分野でよく報告されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（上記を参照）を参照されたい。原核宿主を使用する場合、ヌクレオチド配列は、形質転換前に、イントロンの除去などにより、好適に改変する必要があり得る。
糸状菌細胞は、当該技術分野で知られた種々の方法、例えば、知られた方法でのプロトプラスト形成およびプロトプラストの形質転換、そしてそれに続く細胞壁の再生を含む方法により形質転換することができる。宿主微生物としてのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の使用が、欧州特許第０２３８０２３号明細書に記載されている。
他の宿主生物は、植物であり得る。植物の形質転換に使用される一般的技術の概要は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ［１９９１］４２：２０５−２２５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９４ １７−２７）の論文に見出すことができる。植物形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許第０４４９３７５号明細書に見出すことができる。
真菌、酵母および植物の形質転換に関する一般的教示は、以下のセクションに提示する。
形質転換される真菌
宿主生物は、真菌、例えばカビであり得る。好適なそのような宿主の例としては、サーモミセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリニウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ムコル属（Ｍｕｃｏｒ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などに属するメンバーが挙げられる。
一実施形態では、宿主生物は、糸状菌であり得る。
糸状菌の形質転換は、糸状菌の形質転換の標準的技術を記載した米国特許第５７４１６６５号明細書で考察されており、真菌の培養は、当該技術分野においてよく知られている。アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）に適用される技術の広範な概説は、例えば、Ｄａｖｉｓ ａｎｄ ｄｅ Ｓｅｒｒｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９７１）１７Ａ：７９−１４３に見出される。
糸状菌の形質転換にも利用することができるさらなる教示は、米国特許第５６７４７０７号明細書に概説されている。
さらに、糸状菌における遺伝子発現は、Ｐｕｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２ Ｍａｙ；２０（５）：２００−６，Ａｒｃｈｅｒ ＆ Ｐｅｂｅｒｄｙ、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）１７（４）：２７３−３０６に教示されている。
本発明は、これらの標準的技術の使用により調製される本発明によるトランスジェニック糸状菌の生産を包含する。
一態様において、宿主生物は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）であり得る。
本発明によるトランスジェニックアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）はまた、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ，Ｇ．１９９４（Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ Ｓ．Ｄ．，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ Ｊ．Ｒ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０ ｙｅａｒｓ ｏｎ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ ２９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９９４．ｐｐ．６４１−６６６）の教示にしたがって調製することができる。
一態様において、宿主生物は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、例えばトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ Ｒｅｅｓｅｉ）であり得る。
形質転換される酵母
他の実施形態において、トランスジェニック生物は、酵母であり得る。
酵母中の異種遺伝子発現の原理の概説は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９５），４９：３４１−５４、およびＣｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）Ｏｃｔ；８（５）：５５４−６０で提供される。
これに関して、酵母、例えば、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ（２０００ ２４（１）：４５−６６を参照）の種は、異種遺伝子発現のためのビヒクルとして使用することができる。
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の異種遺伝子発現および遺伝子産物の分泌の原理の概説は、Ｅ Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ Ｅ Ｋｅｎｎｙ（１９９３，“Ｙｅａｓｔ ａｓ ａ ｖｅｈｉｃｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ”，Ｙｅａｓｔｓ，Ｖｏｌ ５，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｈ Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｊ Ｓｔｕａｒｔ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ｅｄｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．）に示されている。
酵母の形質転換のため、いくつかの形質転換プロトコルが開発されている。例えば、本発明によるトランスジェニックサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７８，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５，１９２９）；Ｂｅｇｇｓ，Ｊ Ｄ（１９７８，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，１０４）；およびＩｔｏ，Ｈ ｅｔ ａｌ（１９８３，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３，１６３−１６８）の教示にしたがって調製することができる。
形質転換された酵母細胞は、種々の選択マーカー、例えば、栄養要求性マーカー、ドミナント抗生物質耐性マーカーを使用して選択することができる。
培養および産生
本発明のヌクレオチド配列により形質転換された宿主細胞は、コードされるポリペプチドの産生をもたらし、細胞および／または培養培地からのポリペプチドの回収を容易にする条件下で培養することができる。
細胞を培養するために使用される培地は、当該宿主細胞の増殖およびポリペプチドの発現の取得に好適な従来の任意の培地であってよい。
組換え細胞により産生されたタンパク質は、細胞の表面上でディスプレイすることができる。
タンパク質は、宿主細胞から分泌させることができ、よく知られた手順で培養培地から簡便に回収することができる。
分泌
タンパク質は、発現宿主から、タンパク質をより容易に回収することができる培養培地中に分泌されることが望ましいことが多い。本発明によれば、分泌リーダー配列を所望の発現宿主に基づき選択することができる。ハイブリッドシグナル配列も、本発明に関連して使用することができる。
異種分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ−例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からの１８アミノ酸型および２４アミノ酸型の両方）、ａ因子遺伝子（酵母、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ））、またはα−アミラーゼ遺伝子（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））に由来するものである。
例として、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の異種タンパク質の分泌は、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：１３２−４３に概説されている。
検出
アミノ酸配列の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該技術分野において知られている。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
広範な標識およびコンジュゲーション技術が当業者により知られており、種々の核酸およびアミノ酸アッセイにおいて使用することができる。
多数の会社、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）が市販のキットおよびそれらの手順についてのプロトコルを供給している。
好適なレポーター分子または標識としては、それらの放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤または発色剤、ならびに、基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；米国特許第８５０，７５２号；米国特許第３，９３９，３５０号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，２７７，４３７号；米国特許第４，２７５，１４９号および米国特許第ＵＳ４，３６６，２４１号が挙げられる。
また、組換え免疫グロブリンは、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に示されるように産生することができる。
融合タンパク質
本発明において使用されるアミノ酸配列は、例えば、抽出および精製を補助する融合タンパク質として産生することができる。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）および（β−ガラクトシダーゼ）が挙げられる。融合タンパク質パートナーおよび目的タンパク質配列間にタンパク質分解開裂部位を含めて融合タンパク質配列の取り出しを可能とすることも好都合であり得る。
好ましくは、融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨害しない。
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の遺伝子融合発現系は、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９５）６（５）：５０１−６に概説されている。
本発明の他の実施形態においては、アミノ酸配列を、異種配列にライゲートして融合タンパク質をコードさせることができる。例えば、物質活性に影響し得る薬剤についてのペプチドライブラリーのスクリーニングのため、市販の抗体により認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコードさせることが有用であり得る。
追加の目的タンパク質（ＰＯＩ）
本発明において使用される配列はまた、１種以上の追加の目的タンパク質（ＰＯＩ）または目的ヌクレオチド配列（ＮＯＩ）と併用してもよい。
ＰＯＩの非限定的な例としては、デンプンの代謝に関与するタンパク質または酵素、グリコーゲンの代謝に関与するタンパク質または酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、トリペプチジルエキソペプチダーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロリンエンドプロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、エキソプロテアーゼ、トランスポートタンパク質、トランスグルタミナーゼ、アミノペプチダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１．３．５）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。ＮＯＩは、それらの配列のいずれかのアンチセンス配列であってさえもよい。
ＰＯＩは、例えば、抽出および精製を補助する融合タンパク質であってさえもよい。
ＰＯＩは分泌配列に融合させることさえも可能である。
他の配列はまた、分泌を促進、または分泌ＰＯＩの収量を増大させることができる。そのような配列は、例えば、英国特許出願第９８２１１９８．０号明細書に記載されるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ｃｙｐＢ遺伝子の産物としてのシャペロンタンパク質をコードすることができる。
ＮＯＩは、例えば、限定はされないが、その発現産物のプロセッシングおよび／または発現を変える改変などの多くの理由から、その活性を改変するために操作することができる。さらなる例として、ＮＯＩはまた、特定の宿主細胞における発現を最適化するために修飾され得る。他の配列の変化は、制限酵素認識部位を導入するために所望され得る。
ＮＯＩには、合成または修飾ヌクレオチド、例えば、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格をその中に含み得る。
ＮＯＩは、細胞内の安定性および半減期を向上させるために修飾し得る。可能な修飾としては、限定はされないが、分子の５’および／または３’末端のフランキング配列の付加、または分子骨格におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用が挙げられる。
一般的組換えＤＮＡ方法の技術
本発明は、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内である化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用技術を用いる。このような技術は、文献に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ，１６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ，Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ，Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；およびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ，ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。これらのテキスト全般はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例で本開示をさらに詳しく説明するが、それらの実施例は、本開示の請求の範囲を決して限定するものではない。添付の図面は、本開示の明細および説明に組込まれたそれらの一部と見なされるべきである。以下の実施例は、請求の範囲に記載の開示を説明するために提示されたものであって、その開示を限定するものではない。
実施例１−ＴＲＩ０３１、ＴＲＩ０３２、ＴＲＩ０３３、ＴＲＩ０３４、ＴＲＩ０３５、ＴＲＩ０３６、ＴＲＩ０３７、ＴＲＩ０３８のクローニングおよび形質転換
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）での発現のためのコドン最適化遺伝子として、真菌２型アミノペプチダーゼ（ｐｅｐＮ＿２、ＭｅｒｏｐｓファミリーＭ２８．００８．に属する；ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）をコードする合成遺伝子（ＴＲＩ０３１、ＴＲＩ０３２、ＴＲＩ０３３、ＴＲＩ０３４、ＴＲＩ０３５、ＴＲＩ０３６、ＴＲＩ０３７、ＴＲＩ０３８）を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から受注した。ＴＲＩ０３１は、ネオサルトリア・フィッシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ＮＲＲＬ１８１由来のＮＣＢＩアクセッション番号：ＸＰ＿００１２５８６７５に対応し；ＴＲＩ０３２は、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＡＴＣＣ（登録商標）４２４６４由来のＮＣＢＩアクセッション番号：ＸＰ＿００３６６７３５４に対応し；ＴＲＩ０３３はフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）Ｆｏ５１７６由来のＮＣＢＩアクセッション番号：ＥＧＵ７４５００に対応し；ＴＲＩ０３４はフザリウム・オキシスポルム分化型クベンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｃｕｂｅｎｓｅ）レース１由来のＮＣＢＩアクセッション番号：ＥＮＨ６９８７５に対応し；ＴＲＩ０３５はアスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）ＮＲＲＬ１由来のＮＣＢＩアクセッション番号：ＸＰ＿００１２７３７７９に対応する；ＴＲＩ０３６はケトミウム・テルモフィルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）変種テルモフィルム（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＳＭ１４９５からのＮＣＢＩアクセッション番号：ＥＧＳ２３４０２に対応し；ＴＲＩ０３７はアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）ＮＩＨ２６２４由来のＮＣＢＩアクセッション番号：ＸＰ＿００１２１７７５９に対応し；かつＴＲＩ０３８はアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＦＧＳＣ Ａ４由来のＮＣＢＩアクセッション番号：ＸＰ＿６８１７１４に対応する。
遺伝子は、コード領域にフランキングするＧａｔｅｗａｙ−特異的組換え部位（ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するように発注し、ｐＤｏｎｒ２２１ Ｇａｔｅｗａｙベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のプラスミドストックとして納品された。ＴＲＩ０３１、ＴＲＩ０３２、ＴＲＩ０３３、ＴＲＩ０３４、ＴＲＩ０３５、ＴＲＩ０３６、ＴＲＩ０３７、ＴＲＩ０３８のアミノ酸配列は、予測分泌シグナル配列（ＳｉｇｎａｌＰ ４．０：膜貫通領域からシグナルペプチドを区別する。Ｔｈｏｍａｓ Ｎｏｒｄａｈｌ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｓｏｒｅｎ Ｂｒｕｎａｋ， Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ＆ Ｈｅｎｒｉｋ Ｎｉｅｌｓｅｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６，２０１１）を有しており、これらの内因性シグナル配列を、コザック配列を含有するリーダー配列、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）酸性真菌プロテアーゼ（ＡＦＰ）からの分泌シグナル配列およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ遺伝子（ＴｒＧＡ１）からのイントロンで置き換えた（図１を参照）。
ＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ（商標）酵素ミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｐＤｏｎｒ２２１ベクター中の合成遺伝子をｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＴｒｅｘ８ｇＭに組み換え、発現ベクターｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３１（配列番号：９）、ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３２（配列番号１０）、ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３３（配列番号１１）、ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３４（配列番号１２）、ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３５（配列番号１３）、ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３６（配列番号１４）、ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３７（配列番号１５）、およびｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３８（配列番号１６）を得た。
基本的には（米国特許第８，５９２，１９４Ｂ２号明細書）に記載のように、ＰＥＧ仲介プロトプラスト形質転換法を使用し、１．５−１７μｇの発現ベクターでトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株Ｃｅｌｌｕｌｉｇｈｔ（商標）を個々に形質転換した。記載のように、形質転換には、僅かに変更したＰＥＧ−プロトプラスト法を用いた。プロトプラストの調製には、１０ｍＭウリジンでｐｙｒ栄養要求性を補完したトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発芽培地により、胞子を２６℃で約１８時間成長させた。（トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））発芽培地：４０ｍｌの５０％グルコース、２ｇ／Ｌのペプトン、１５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．４ｍｌの１Ｍ ＭｇＳＯ４、４．１ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ２、１ｍｌの４００×トリコデルマ・リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素溶液｛２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、１７５ｇ／Ｌのクエン酸｝）振盪速度２００ｒｐｍで。発芽胞子を遠心分離により回収し、洗浄し、４５ｍｇ／ｍｌの溶解酵素溶液（トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｌ１４１２）により処理して真菌細胞壁を溶解させた。さらに、Ｐｅｎｔｔｉｌａｅら（Ｇｅｎｅ ６１（１９８７）１５５−１６４）の記載のように、標準法によりプロトプラストを調製した。
一般に、２００μＬの全容量中に１．５−１７μｇのＤＮＡおよび約５×１０７のプロトプラストを含有する形質転換混合物は、２ｍＬの２５％ＰＥＧ溶液で処理し、２容量の１．２Ｍのソルビトール／１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５／１０ｍＭのＣａＣｌ２溶液で希釈し、３％の選択的トップアガロース、１Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１×ＭＭ溶液（２×ＭＭ溶液：３０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＬの１Ｍアセトアミド、２０ｍｌの１Ｍ ＣｓＣｌ、６ｍｌの２０％ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、６ｍｌの２０％ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、２ｍＬのトリコデルマ・リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素溶液（４００×）、８０ｍＬの５０％グルコース、全量を１リットルとし、ｐＨ４．５）と混合し、１０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含むＭＭプレート（ＭＭプレート ２％寒天、１×ＭＭ溶液）に注ぎ入れた。形質転換体は、ＭＭプレート（ウリジン欠失）で原栄養成長するものを選択した。胞子が形成されるまで２８℃で５〜７日間、プレートをインキュベートした。より良好な胞子形成のために、安定に見える形質転換体を１０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含む新しいＭＭプレートに移した。胞子が形成されたなら、０．８５％ＮａＣｌ、０．０１５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の溶液を使用して胞子を採取した。液体培養物を２４ウェルＭＴＰフォーマット（スクリーニング用）、または振盪フラスコ（有効性確認試験用）に植菌するために胞子懸濁液を使用した。前培養は３ｍＬのＹＥＧ培地（５ｇ／Ｌの酵母エキス、２２ｇ／Ｌのグルコース、Ｈ２Ｏ）中。本培養は次の生産培地中（生産培地：３５ｇ／Ｌの６１％グルコース／ソホロース混合物、９ｇ／Ｌのカザミノ酸、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、３３ｇ／ＬのＰＩＰＰＳバッファー、ｐＨ５．５、２．５ｍＬ／Ｌの４００×トリコデルマ・リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素（１７５ｇ／Ｌのクエン酸、２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／Ｌのホウ酸）ｐＨ５．５。変異体を生成するために、３ｍＬの生産培地を２４ウェルＭＴＰに加えた。振盪フラスコでは、容量をスケールアップした。
培養物を、２８℃および８０％の湿度で、１８０ｒｐｍで振盪しながら７日間増殖させた。真空ろ過により培養上清を採取し、それらのパフォーマンスおよび発現レベルを試験するために使用した。
ｐｅｐＮ＿２酵素のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を以下に示す：
配列番号１＝ＴＲＩ０３１のアミノ酸配列。図１に記載のリーダー配列によりコードされる分泌シグナルには、アンダーラインが付されている：
Figure 2018518976
 アンダーラインが付されたリーダー配列が存在しない配列は、配列番号１８である。
配列番号２＝ＴＲＩ０３２のアミノ酸配列。図１に記載のリーダー配列によりコードされる分泌シグナルには、アンダーラインが付されている。
Figure 2018518976
 アンダーラインが付されたリーダー配列が存在しない配列は、配列番号１９である。
配列番号３＝ＴＲＩ０３３のアミノ酸配列。図１に記載のリーダー配列によりコードされる分泌シグナルには、アンダーラインが付されている。
Figure 2018518976
 アンダーラインが付されたリーダー配列が存在しない配列は、配列番号２０である。
配列番号４＝ＴＲＩ０３４のアミノ酸配列。図１に記載のリーダー配列によりコードされる分泌シグナルには、アンダーラインが付されている。
Figure 2018518976
 アンダーラインが付されたリーダー配列が存在しない配列は、配列番号２１である。
配列番号５＝ＴＲＩ０３５のアミノ酸配列。図１に記載のリーダー配列によりコードされる分泌シグナルには、アンダーラインが付されている。
Figure 2018518976
 アンダーラインが付されたリーダー配列が存在しない配列は、配列番号２２である。
配列番号６＝ＴＲＩ０３６のアミノ酸配列。図１に記載のリーダー配列によりコードされる分泌シグナルには、アンダーラインが付されている。
Figure 2018518976
 アンダーラインが付されたリーダー配列が存在しない配列は、配列番号２３である。
配列番号７＝ＴＲＩ０３７のアミノ酸配列。図１に記載のリーダー配列によりコードされる分泌シグナルには、アンダーラインが付されている。
Figure 2018518976
 アンダーラインが付されたリーダー配列が存在しない配列は、配列番号２４である。
配列番号８＝ＴＲＩ０３８のアミノ酸配列。図１に記載のリーダー配列によりコードされる分泌シグナルには、アンダーラインが付されている。
Figure 2018518976
 アンダーラインが付されたリーダー配列が存在しない配列は、配列番号２５である。
配列番号９＝ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３１発現コンストラクトのヌクレオチド配列。
Figure 2018518976
Figure 2018518976
Figure 2018518976
配列番号１０＝ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３２発現コンストラクトのヌクレオチド配列。
Figure 2018518976
Figure 2018518976
Figure 2018518976
配列番号１１＝ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３３発現コンストラクトのヌクレオチド配列。
Figure 2018518976
Figure 2018518976
Figure 2018518976
配列番号１２＝ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３４発現コンストラクトのヌクレオチド配列。
Figure 2018518976
Figure 2018518976
Figure 2018518976
配列番号１３＝ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３５発現コンストラクトのヌクレオチド配列。
Figure 2018518976
Figure 2018518976
Figure 2018518976
配列番号１４＝ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３６発現コンストラクトのヌクレオチド配列。
Figure 2018518976
Figure 2018518976
Figure 2018518976
配列番号１５＝ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３７発現コンストラクトのヌクレオチド配列。
Figure 2018518976
Figure 2018518976
Figure 2018518976
配列番号１６＝ｐＴｒｅｘ８ｇＭ＿ＴＲＩ０３８発現コンストラクトのヌクレオチド配列。
Figure 2018518976
Figure 2018518976
実施例２−グルテン加水分解における、ネオサルトリア・フィッシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）由来のＰｅｐＮ ２（ＴＲＩ０３１）の作動ｐＨおよび温度の最適値
グルタミン酸の遊離は、ダイズまたはグルテンの加水分解などの、野菜タンパク質の加水分解における重要な品質パラメータである。遊離したグルタミン酸は、いわゆる「旨味フレーバー」と捉えられ得る。グルタミン酸およびグルタミンの遊離の観点から、グルテンの加水分解に最初に適用したｐＨの影響を調べるために、１５〜３０分でグルテンを液化し、その直後に１ＭのＨＣｌでグルテン加水分解の初期ｐＨを調節した。グルテンをグルタミナーゼ（Ａｍａｎｏ、日本）で処理した。さらに、グルテンを、ＦｏｏｄＰｒｏ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＦｏｏｄＰｒｏ ＰＮＬおよびＰｅｐＮ ２（ネオサルトリア・フィッシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ））で処理した。２０時間後、限外ろ過により加水分解を停止させた（カットオフ１０ｋＤａ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。酵素によるグルタミン酸分析に透過性を使用した（酵素によるＬ−グルタミン酸分析キット、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。図２に示すように、ＰｅｐＮ ２はｐＨ６．０と比較してｐＨ範囲７．０〜９．０でより高い効率を示した。
グルタミン酸およびグルタミンの遊離の観点から、グルテンの加水分解に適用した温度の影響を調べるために、グルテン懸濁液を１５〜３０分で液化し、その直後に１ＭのＨＣｌでグルテン加水分解の初期ｐＨをｐＨ７．０に調節した。図３に示すように、４０〜６０℃の温度範囲を使用した。グルテンをグルタミナーゼ（Ａｍａｎｏ、日本）と混合した。さらに、グルテンをＦｏｏｄＰｒｏ（登録商標） Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＦｏｏｄＰｒｏ（登録商標） ＰＮＬおよびＰｅｐＮ ２（ネオサルトリア・フィッシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ））と混合した。加水分解を始めて２０時間後、限外ろ過により加水分解を停止させた（カットオフ１０ｋＤａ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｕｍ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。酵素によるグルタミン酸分析に透過性を使用した（酵素によるＬ−グルタミン酸分析キット、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ネオサルトリア・フィッシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）由来のＰｅｐＮ ２は、６０℃で最も高い効率を示した。
実施例３−加水分解度の観点からの、ネオサルトリア・フィッシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）由来のＰｅｐＮ ２（ＴＲＩ０３１）と、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）由来のＰｅｐＮ ２（ＴＲＩ０３５）との比較
加水分解度（ＤＨ）は、同量のタンパク質について、例えば、６ＭのＨＣｌ中、約１２０℃で約２４時間行った酸加水分解と比較して、開裂したペプチド結合の相対量を表す。したがって、ＰｅｐＮ １型またはＰｅｐＮ ２型などの一般的なＰｅｐＮのアミノ酸遊離効率の評価には、ＤＨがより高いことが適用され得る。無細胞培養ブロスを濃縮し（カットオフ１０ｋＤａ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、製造業者の説明通り使い捨て脱塩カラム（ＰＤ１０、ＧＥ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して脱塩した。基質として、予備加水分解した１０％（ｗ／ｗ）Ｎａ−カゼイン塩（ＤＭＫ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ホエータンパク質分離物（ＷＰＩ；Ａｒｌａ、Ｖｉｂｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ダイズタンパク質分離物（ＳＰＩ；ＳＵＰＲＯ（登録商標）７６０、ＤｕＰｏｎｔ、Ｂｒａｂｒａｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）およびグルテン懸濁液を使用した。予備加水分解は、Ｎａ−カゼイン塩、ＷＰＩおよびＳＰＩ懸濁液に対し、１％（ｗ／ｗタンパク質）のＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ、１％（ｗ／ｗタンパク質）のＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）ＰＮＬを用いて行った。予備加水分解は全て５５℃で１８時間行い、その後、９５℃で２０分間不活化処理を行った。使用した各ＰｅｐＮ ２は、培養ブロスから最終加水分解へのアミノ酸のキャリーオーバー除去の対照として、また、使用したエンドペプチダーゼを十分に不活化するために、９５℃で１５分間不活化した。加水分解は、９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマット中で行い、下記表１に示すように、５０μＬのＰｅｐＮ ２原液と混合した１５０μＬの予備加水分解タンパク質懸濁液から構成された。加水分解は５０℃で２０時間行い、その後、２０μＬの２Ｍ ＴＣＡ（トリクロロ酢酸、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の添加により加水分解を停止させた。ネオサルトリア・フィッシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）およびアスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）由来のＰｅｐＮ ２型のアミノ酸遊離効率を表１（Ｂ）および（Ａ）に示す。特に、Ｎａ−カゼイン塩、ＷＰＩおよびＳＰＩの基質では、ネオサルトリア・フィッシェリ（Ｎ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ）およびアスペルギルス・クラバタス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）由来のＰｅｐＮ ２型を使用すると、非常に高いＤＨが達成された。さらに、ＰｅｐＮ ２型原液濃度で達成されたＤＨは、著しい増加であると考えられる。グルテンの加水分解では、０．０２〜０．３ｍｇ／ｍＬ ＰｅｐＮ ２のタンパク質範囲でＤＨが増加することがわかった。
Figure 2018518976
実施例４−２種のエンドペプチダーゼを、ＰｅｐＮ ２の候補のＴＲＩ０３２、ＴＲＩ０３３、ＴＲＩ０３４、ＴＲＩ０３５、ＴＲＩ０３７およびＴＲＩ０３８と組み合わせて使用したグルテンの加水分解
ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＦＰＡＰ）およびＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）ＰＮＬ（ＦＰＰＮＬ）の添加によって予備加水分解したグルテンの懸濁液を調製した。加水分解は５５℃で行った。約１８時間後、９０℃に１０分間加熱することにより、加水分解を停止させた。５０℃に冷却後、グルテンにグルタミナーゼを使用した。その後、１５０μＬの予備加水分解したグルテンを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移した。５０μＬ（タンパク質濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）のＴＲＩ０３２、ＴＲＩ０３３、ＴＲＩ０３４、ＴＲＩ０３５、ＴＲＩ０３７およびＴＲＩ０３８を使用してグルタミン酸の遊離を行った。加水分解は１８時間行い、２０μＬの２Ｍ ＴＣＡの添加により停止させた。停止させた加水分解物をろ過（０．２２ｍｍ）し、酵素によるグルタミン酸分析キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりさらに分析した。遊離したグルタミン酸の濃度を図４に示す。
実施例５−プロリン含有ペプチドの加水分解
ペプチドＷＨＷＬＱＬＫＰＧＱＰＭＹをＴＲＩ０３１およびＴＲＩ０３５で加水分解した。２０ｍＭのＣＰＢ−バッファー（２０ｍＭクエン酸、２０ｍＭリン酸塩、２０ｍＭホウ酸）中、５５℃で、１μｇ／ｍＬのアミノペプチダーゼと共に、ペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートした。示された時点で５０μｌの５％ＴＦＡでアリコット（５０μＬ）を停止させ、ＬＣ−ＭＳ分析に供した。
この結果は、ＴＲＩ０３１およびＴＲＩ０３５が、ペプチドＷＨＷＬＱＬＫＰＧＱＰＭＹ（図５）をＫＰＧＱＰＭＹ（図６）へと、さらにＱＰＭＹ（図７）へと加水分解できることを示している。これはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＰｅｐＮ ２について以前に記載されていること（Ａ．Ｍ．Ｂｌｉｎｋｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１４８０（２０００）１７１−１８１、そこでは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＰｅｐＮ ２は、ペプチドＷＨＷＬＱＬＫＰＧＱＰＭＹのものを含め、調査したいかなるＸ−Ｐｒｏ結合も加水分解しないと主張された。）とは対照的である。しかしながら、我々はまた、それらの酵素がペプチドをＱＰＭＹに開裂することを見出している（図７）。
データ収集：ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と接続したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してキャピラリーＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。試料を１５ｃｍのＰｈｅｎｏｍｅｎｉｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ４μ Ｐｒｏｔｅｏ ９０Ａ、Ｃ４分析用カラムに注入した。ＩＯＮＭＡＸ（登録商標）イオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）への流量１６μＬ／ｍｉｎで、１０分間の０〜４０％溶媒Ｂ Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＨＣＯＯＨ（５０／９５０／０．６５、ｖ／ｖ／ｖ）の勾配を使用して分離した。ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃ装置をデータ依存ＭＳ／ＭＳモードで操作した。ペプチド質量をＯｒｂｉｔｒａｐ（ＭＳのスキャンは、ｍ／ｚ４００において６００００の分解能で行った）により測定し、最大強度ペプチドのｍ／ｚを２つまで選択し、リニアイオントラップ（ＬＴＱ）中でＣＩＤを使用して断片化に供した。動的排除は、５００質量のリストサイズ、４０秒の持続時間、およびリスト上の質量に対して±１０ｐｐｍの排除質量幅により有効とした。
無標識定量：クロマトグラムを構築するためにＭＳ１強度を使用する、プログラムＳｋｙｌｉｎｅ ２．６．０．７１７６（ＭａｃＬｅａｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｓｋｙｌｉｎｅ：ａｎ ｏｐｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｄｏｃｕｍｅｎｔ ｅｄｉｔｏｒ ｆｏｒ ｃｒｅａｔｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ」，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１０，２６（７）：ｐ．９６６−８）を用いて生のファイルにアクセスした（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｐｌａｔｆｏｒｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ＭＳ１ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｉｎ ｓｋｙｌｉｎｅ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ」，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１２．１１（５）：ｐ．２０２−１４）。プレカーサー同位体インポートフィルターを分解能６０，０００の３つのカウント（Ｍ、Ｍ＋１およびＭ＋２）に設定し、最大強度の電荷状態を使用した。基質および開裂生成物のペプチド配列を、Ｓｋｙｌｉｎｅに入力し、それぞれの試料の強度を計算した。図はプログラムから直接コピーした（図８を参照）。
実施例６：アスペルギルス・クラバタス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）由来のＰｅｐＮ ２の加水分解度の、アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）およびラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１２０４６由来のＰｅｐＮの加水分解度との比較
Ｓｔｒｅｓｓｌｅｒ，Ｅｉｓｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３、下記）にしたがって、ＰｅｐＮ １ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１２０４６、ＰｅｐＮ １アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、およびアスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）（ＴＲＩ０３５）由来のＰｅｐＮ ２の酵素活性を測定した。ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）からＰｅｐＮ １を発現させ、Ｓｔｒｅｓｓｌｅｒ、Ｅｉｓｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３、下記）に記載のように精製した。
アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来のＰｅｐＮ １を、ＦＬＡＶＯＵＲＺＹＭＥ（登録商標）５００Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から、２０ｍＭのビス−トリス、ｐＨ６．５で平衡化したＰＤ１０カラムで脱塩した後、精製した。アニオン交換クロマトグラフィーにより、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ１５、ＸＫ２６／１５（ＳＱ１５）カラム（ＧＥ−Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して試料を精製し、２０ｍＭのビス／トリス、ｐＨ６．５（バッファーＡ）で平衡化させた。流量７ｍＬ／ｍｉｎで試料（３０ｍＬ）をカラムに注入した。カラムをバッファーＡで洗浄し、結合したタンパク質を、０〜０．５ＭのＮａＣｌ（２０ｍＭ Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）中）の直線勾配により溶出させた（５０分間）。全操作期間中に約１３ｍＬの画分を回収し、氷上に保管した。アミノペプチダーゼ活性が最も高い画分をまとめて、ＰＤ１０（２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）中）で脱塩し、２０ｍＭのＢｉｓ／Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．０（バッファーＡ）により平衡化したＰｏｒｏｓ Ｑ２０ ＨＲ２６／１０、ＸＫ２６／１０カラム（ＧＥ−Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）による２回目の精製に供した。流量４ｍＬ／ｍｉｎでＰｅｐＮ１試料をカラムに注入した。カラムをバッファーＡで洗浄し、結合したタンパク質を、０〜０．２５ＭのＮａＣｌ（２０ｍＭ Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）中）の直線勾配により溶出させた（３０分間）。全操作期間中に約８ｍＬの画分を回収し、氷上に保管した。精製したアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来のＰｅｐＮ １は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により約４０ｋＤａの分子量を有することがわかった。
ＰｅｐＮ １およびＰｅｐＮ ２アミノペプチダーゼを２．５−２００ｎｋａｔ＊ｍＬ−１の活性化範囲に標準化した。タンパク質の加水分解のために、１％（ｗ／ｗＷＰＩ）ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＤｕＰｏｎｔ、Ｂｒａｂｒａｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）および１％（ｗ／ｗＷＰＩ）ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）ＰＮＬ（ＤｕＰｏｎｔ、Ｂｒａｂｒａｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、初期ｐＨ７．０でホエー乳漿タンパク質分離物懸濁液（ＷＰＩ；ＬＡＣＰＲＯＤＡＮ（登録商標）９２２４、Ａｒｌａ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ、Ｖｉｂｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に加えた。エンドペプチダーゼの添加後、ＷＰＩを加え、２００μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移した。その後、表２に示すように、５μＬのＰｅｐＮ溶液を加えた。加水分解を５０℃、ｐＨ無制御で行い、１８時間後に２０μＬの２Ｍ ＴＣＡを添加して停止させた。ＤＨの測定（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１、下記）に先立って、全試料を０．２２μｍでろ過した。
アスペルギルス・クラバタス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）由来のＰｅｐＮ ２は、アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来のＰｅｐＮ １より、全ての用量で高いＤＨを示し、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）由来のＰｅｐＮ １より、試験した４つの最大活性用量で高いＤＨを示すことがわかった。そして、２つの最大用量で、アスペルギルス・クラバタス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）由来のＰｅｐＮ ２は、ＰｅｐＮ １アミノペプチダーゼより、少なくとも２５％高いＤＨを示した。
Figure 2018518976
実施例７：ダイズおよびグルテンの加水分解における、グルタミン酸の遊離に対する塩化ナトリウムの影響
食品工業では、タンパク質の加水分解時の微生物による汚染のリスクを減じるために、しばしば塩化ナトリウムを使用する。１％（ｗ／ｗタンパク質）ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＤｕＰｏｎｔ、Ｂｒａｂｒａｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）および１％（ｗ／ｗタンパク質）ＦＯＯＤＰＲＯ（登録商標）ＰＮＬ（ＤｕＰｏｎｔ、Ｂｒａｂｒａｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を添加することにより、予備加水分解した１０％（ｗ／ｗ）ダイズ（ＳｕＰｒｏ（登録商標）７６０、ＤｕＰｏｎｔ、Ｂｒａｂｒａｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）およびグルテン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を調製した。加水分解を、５０℃、ｐＨ７．０（ｐＨ無制御）で１８時間行った（１８時間後、熱による不活化；９０℃；１０分）。その後、加水分解物を、塩化ナトリウム含有（１８５ｍＭ）加水分分解物と塩非含有加水分解物に分割した。予備加水分解した各タンパク質懸濁液１５０μＬを、表３に示すように、異なる方法で標準化したアスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）ＰｅｐＮ ２と混合した。５０℃、ｐＨ無制御で加水分解を行い、１８時間後に２０μＬの２Ｍ ＴＣＡを添加して停止させた。ＤＨの測定（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１、下記）に先立って、全試料を０．２２μｍでろ過した。表３に示すように、１８５ｍＭのＮａＣｌの添加は、ダイズおよびグルテンの加水分解における加水分解度の測定値に全く影響しなかった。
Figure 2018518976
Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６６（５）：６４２−６４６。
Ｓｔｒｅｓｓｌｅｒ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３），ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（７）。
実施例８：ＰｅｐＮ２ ＴＲＩ０３１およびＴＲＩ０３５対ＴＲＩ０６３（アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ））の生成物による阻害
この試験では、基質Ｈ−Ａｌａ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）の加水分解により酵素活性を測定した。放出されたｐＮＡの波長４０５ｎｍにおける吸光度を、マイクロタイタープレートリーダーを使用して経時的に測定した。
これらの物質のバッファーとして、２０ｍＭのＣＰＢバッファー（２０ｍＭのＮａ−クエン酸塩、Ｎａ−リン酸塩およびＮａ−ホウ酸塩）ｐＨ９．０を使用した。酵素試料としてＰｅｐＮ ２ ＴＲＩ０３１およびＴＲＩ０３５を使用した。２０ｍｇのＨ−Ａｌａ−ｐＮＡ基質（ＢＡＣＨＥＭ、Ｌ−１０７０）を１ｍＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド；Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｄ２６５０）中で可溶化した。９６ウェルプレートのＣｏｓｔａｒ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ ９０１７（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ）を使用し、これらのプレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓのＶＥＲＳＡＭＡＸ（登録商標）リーダーで読み取った。阻害試験用に、各アミノ酸、すなわちリシン、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、プロリン、グリシン、セリン、アスパラギン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸の２０ｍｇ／ｍＬ溶液１０ｍＬを調製した。トリプトファンおよびプロリンはＤＭＳＯに溶解した。他のアミノ酸は全て、バッファーに溶解した。５００μＬの各アミノ酸溶液を混合して、最終の阻害混合物を調製した。
９６ウェルプレートを氷上に置き、１８０μＬのバッファー、１５μＬの希釈した酵素、および２０μＬの阻害混合物をプレートのウェルに加え、混合した。各プレートには、０．０１７、０．０８５、０．１２８、０．１７０、０．４２６、０．８５１、１．７０２、２．５５３ｍｇ／ｍＬの阻害混合物濃度で、４種の酵素を全て含有させた。２０μＬの基質を添加することにより、反応を開始させた。１つのプレートに、１つの基質濃度を使用した。反応開始後、３０℃に設定したマイクロプレートリーダーにできるだけ早くプレートを入れ、４０５ｎｍにおける吸光度を３０秒間隔で３０分間測定した。各プレートに１つの基質濃度（０．０１７、０．１７０、０．４２６、０．８５１、１．７０２、２．５５３ｍｇ／ｍＬのいずれか）とした６枚のプレートについて測定した。見かけの阻害定数（Ｋｉ）を決定するために、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにエクスポートし、これにより阻害物質の濃度毎にミカエリス・メンテン曲線にフィッティングし、これに基づいて、Ｋｉをｍｇ／ｍｌの単位で算出した。阻害物質の平均分子量１３３．９ｇ／ｍｏｌを使用して、単位をｍＭに変換した。異なる酵素についての、生成物による阻害のみかけのＫｉ値、およびそれぞれの標準偏差（ＳＤ）を表４に記す。
Figure 2018518976
表４から、ＰｅｐＮ ２ ＴＲＩ０３１およびＴＲＩ０３５は、生成物による阻害に対し、最大の見かけのＫｉ値を有していることがわかる。それは、アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来のＴＲＩ０６３と比較して、それらが生成物によって阻害されにくいことを意味している。
実施例９：Ｇｌｕ−ｐＮＡおよびＧｌｎ−ｐＮＡ基質に対するＰｅｐＮ２およびＰｅｐＮ１の活性
基質としてＨ−Ｇｌｕ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）およびＨ−Ｇｌｎ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）を使用し、ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）の放出を４０５ｎｍにおける吸光度により測定した。バッファーとして２０ｍＭのＣＰＢ−バッファー（２０ｍＭのクエン酸、２０ｍＭのＮａ−リン酸塩、２０ｍＭのホウ酸）ｐＨ９．０を使用した。１０ｍｇのＨ−Ｇｌｕ−ｐＮＡおよびＨ−Ｇｌｎ−ｐＮＡ（ＢＡＣＨＥＭまたはＳｃｈａｆｅｒ Ｎ；Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋから）を１ｍｌのＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ製のジメチルスルホキシド；カタログ番号Ｄ２６５０）に溶解した。
試験を実施するために、Ｃｏｓｔａｒ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ ９０１７（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）中の、８０μＬのバッファー、１０μＬのＨ−Ｇｌｕ−ｐＮＡまたはＨ−Ｇｌｎ−ｐＮＡ基質、および１０μＬの適切に希釈したＰｅｐＮ ２を４５℃でインキュベートし、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ５．４．１ソフトウエアで稼働するＶＥＲＳＡＭＡＸ（登録商標）マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、３０秒毎に３０分間、４０５ｎｍで測定した。１０の時点から求めた曲線における直線部分の最大傾斜として、活性を決定した。
試験は、ＰｅｐＮ ２ ＴＲＩ０３１およびＴＲＩ０３５の精製試料、ならびに精製ＰｅｐＮ １ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）（Ｓｔｒｅｓｓｌｅｒ、Ｅｉｓｅｌｅ ｅｔ ａｌ．、上記）、さらに、非精製ＰｅｐＮ １アスペルギルス・ソイエ（Ａ．ｓｏｊａｅ）（ＣＯＲＯＬＡＳＥ（登録商標）ＬＡＰ、ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ）について行ったが、これらは、Ａｌａ−ｐＮＡまたはＬｅｕ−ｐＮＡについては全て同等の活性を有した（実施例ＨのＡｌａ−ｐＮＡについての記載と同様ではあるが、阻害物非存在下で行った）。表５に示すように、２種のＰｅｐＮ ２アミノペプチダーゼは、有意な活性を示さなかった２種のＰｅｐＮ １酵素とは対照的に、Ｇｌｕ−ｐＮＡおよびＧｌｎ−ｐＮＡに対して活性を示した。これは、ＰｅｐＮ ２アミノペプチダーゼが、ＧｌｕおよびＧｌｎの放出に関して、ＰｅｐＮ １アミノペプチダーゼよりはるかに有効であることを示している。
Figure 2018518976
実施例１０−２位にプロリンを有するペプチドの加水分解
ペプチドライブラリーＸＰＡＡＡＲ（Ｘは全てシステイン以外のアミノ酸）を酵素試料ＴＲＩ０３２、ＴＲＩ０３５、ＴＲＩ０６３（アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ））およびＣＯＲＯＬＡＳＥ（登録商標）ＬＡＰで加水分解した。３×２０ｍＭのＣＰＢ−バッファー（２０ｍＭクエン酸、２０ｍＭリン酸塩、２０ｍＭホウ酸）中、５５℃で１μｇ／ｍＬのアミノペプチダーゼと共に、ペプチドライブラリーＸＰＡＡＡＲ（１ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートした。示された時点で５０μｌの５％ＴＦＡで５０μＬのアリコットを停止させ、ＬＣ−ＭＳ分析に供した。
データ収集：ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と接続したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してキャピラリーＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。試料を１５ｃｍのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ４μ Ｐｒｏｔｅｏ ９０Ａ、Ｃ４分析用カラムに注入した。ＩＯＮＭＡＸ（登録商標）イオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）への流量１６μＬ／ｍｉｎで、１０分間の０〜４０％溶媒Ｂ Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＨＣＯＯＨ（５０／９５０／０．６５、ｖ／ｖ／ｖ）の勾配を使用して分離した。ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃ装置をデータ依存ＭＳ／ＭＳモードで操作した。ペプチド質量をＯｒｂｉｔｒａｐ（ＭＳのスキャンは、ｍ／ｚ４００において６００００の分解能で行った）により測定し、最大強度ペプチドのｍ／ｚを２つまで選択し、リニアイオントラップ（ＬＴＱ）中でＣＩＤを使用して断片化に供した。動的排除は、５００質量のリストサイズ、４０秒の持続時間、およびリスト上の質量に対して±１０ｐｐｍの排除質量幅により有効とした。
無標識定量：クロマトグラムを構築するためにＭＳ１強度を使用する、プログラムＳｋｙｌｉｎｅ２．６．０．７１７６（ＭａｃＬｅａｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．、上記）を用いて生のファイルにアクセスした（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．、上記を参照）。プレカーサー同位体インポートフィルターを分解能６０，０００の３つのカウント（Ｍ、Ｍ＋１およびＭ＋２）に設定し、最大強度の電荷状態を使用した。基質および開裂生成物のペプチド配列を、Ｓｋｙｌｉｎｅに入力し、それぞれの試料の強度を計算した。３種の同位体（Ｍ、Ｍ＋１、およびＭ＋２）のピーク面積の合計を基に図１０を作成した。基質標準曲線（Ｓｔｄ３．１２５からＳｔｄ５０へ連続して２倍の濃度増加）を含めており、これは基質濃度とピーク面積に直線関係があることを示している。
ＬＣ−ＭＳの結果（図１０）は、ＴＲＩ０３２およびＴＲＩ０３５では、ペプチドＴＰＡＡＡＲを時間とともに加水分解し、２時間のインキュベーションで濃度を半分未満にまで低下させることができるが、ＴＲＩ０６３（アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ））およびＣＯＲＯＬＡＳＥ（登録商標）ＬＡＰでは、１２時間でＴＰＡＡＡＲの加水分解を引き起こさないことを示している。
本明細書中に、本発明の好ましい実施形態を示し、説明してきたが、当業者であれば、そのような実施形態が例示のためにのみ提供されていることは明らかであろう。今や当業者には、本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更および置換が想起されるであろう。本発明を実施するにあたり、本明細書に記載の本発明の実施形態に対し、様々な代替を使用し得ることは理解されるべきである。以下の請求項が本発明の範囲を定義し、また、これらの請求項の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの等価物が本発明の範囲によりカバーされることを意図している。

Claims (29)

  1. （ａ）配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；および
    （ｂ）（ａ）の断片であって、アミノペプチダーゼ活性を有する断片
    からなる群から選択されるアミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチド。
  2. 配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８のアミノ酸配列、あるいはそのフラグメントを含む請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８のアミノ酸配列を含む請求項３に記載のポリペプチド。
  5. 前記フラグメントは、配列番号１８〜２５のいずれか１つを含む請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 図９の配列アライメントに示すように、６７位の保存残基Ｉ／ＶのＮ末端側に１３を超える残基を含む予測成熟配列を有する、アミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、前記フラグメントがアミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチド。
  7. アミノペプチダーゼ活性を有し、かつ配列番号１７のアミノペプチダーゼに比べて低い生成物阻害を有する単離ポリペプチド。
  8. 前記ポリペプチドは、請求項１〜６のいずれか一項に定義された通りのものである請求項７に記載の単離ポリペプチド。
  9. アミノペプチダーゼ活性を有し、かつＮ末端から番号を付与したときの２の位置にプロリン残基を有するポリペプチドを加水分解することができる単離ポリペプチド。
  10. Ｎ末端から番号を付与したときの２の位置にプロリン残基を有するポリペプチドを、２時間のインキュベーションで出発濃度の半分未満の濃度にまで加水分解することができる請求項９に記載の単離ポリペプチド。
  11. 前記単離ポリペプチドは、請求項１〜８のいずれか一項に定義された通りのものである請求項９または１０に記載の単離ポリペプチド。
  12. 請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸配列。
  13. 好適な発現宿主中で前記ポリペプチドの産生を指示する１つ以上の制御配列に作動可能に結合している請求項１２に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクト。
  14. 請求項１３に記載の核酸コンストラクト、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む組換え発現ベクター。
  15. 請求項１３に記載の核酸コンストラクトを含む組換え宿主細胞。
  16. 前記宿主細胞が、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞、好ましくはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞である請求項１５に記載の組換え宿主細胞。
  17. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）菌株を培養して前記ポリペプチドを含む上清を生成する工程；および（ｂ）前記ポリペプチドを回収する工程を含む方法。
  18. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの産生に好適な条件下で請求項１５または１６に記載の宿主細胞を培養する工程；および（ｂ）前記ポリペプチドを回収する工程を含む方法。
  19. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドをコードする内在性核酸配列の第２のエクソンに作動可能に結合した、調節配列、エクソンおよび／またはスプライスドナー部位を含む新しい転写単位を内部に取り込んだ相同組換え細胞を、前記ポリペプチドの産生を促進する条件下で培養する工程；および（ｂ）前記ポリペプチドを回収する工程を含む方法。
  20. 前記宿主細胞が、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞、好ましくはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞である請求項１９に記載の方法。
  21. タンパク質性基質を請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドに曝すことを含むタンパク質加水分解物の生成方法。
  22. 前記タンパク質性基質をエンドペプチダーゼに曝すことをさらに含む請求項２１に記載の方法。
  23. 前記加水分解物はＬｅｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｌａおよび／またはＧｌｎに富んでいる請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 前記加水分解物はＧｌｕおよび／またはＧｌｎに富んでいる請求項２３に記載の方法。
  25. タンパク性基質から、遊離グルタミン酸および／またはグルタミン酸残基を結合したペプチドに富むタンパク質加水分解物を得る方法であって、前記基質を脱アミドプロセスに供し、かつ請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドに曝すことを含む方法。
  26. 前記基質を１種以上の非特異的に作用するエンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ酵素に曝すことをさらに含む請求項２５に記載の方法。
  27. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、および好適な担体を含む組成物。
  28. ａ）穀物を準備する工程、
    ｂ）モルト生成プロセス中に前記穀物に請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効量添加する工程、および
    ｃ）モルト化された穀物を得る工程
    を含むモルト化穀物の製造方法。
  29. 醸造中に遊離アミノ態窒素（ＦＡＮ）を生成する方法であって、醸造プロセス中に請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効量添加する工程を含む方法。
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