CN107849595A - 用于蛋白水解产物的氨肽酶 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了具有氨肽酶活性的多肽和编码所述多肽的分离的核酸序列。在一些实施例中，本公开还提供了包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生所述多肽的方法。在一些实施例中，本公开还提供了用于获得可用作风味改善剂的蛋白水解产物的方法。

Description

用于蛋白水解产物的氨肽酶
相关申请的交叉引用
本申请要求以下美国临时专利申请号的优先权和权益：2015年6月26日提交的62/185503；和2015年10月1日提交的62/235937；每个临时申请标题均为“用于蛋白水解产物的新颖氨肽酶”。
通过引用并入序列表
将2016年6月10日创建并与此一道提交的、以大小为192,505字节、名称为“20160610_NB40989-PCT sequence listing prj_ST25.txt”的文件形式提供的序列表通过引用以其全文并入本文。
背景技术
不同的食物和饲料产品含有蛋白水解产物。常规地，使用化学水解来完成这种水解。然而，这样的化学水解导致水解期间获得的氨基酸的严重降解，并且还导致化学反应过程中形成了有害副产物。使用通过化学水解获得的蛋白水解产物受到越来越多的关注，这导致了酶水解过程的发展。
蛋白质材料的酶水解过程旨在获得高度的水解。具有氨肽酶活性的多肽催化从肽、多肽和蛋白质的N-末端去除一个或多个氨基酸残基。通常，需要使用肽酶活性的混合物来生产具有所需性质和高度水解的蛋白水解产物。希望提供单一组分肽酶，其具有可用于改善在食物和/或饲料产品中单独或与其他酶组合使用的蛋白水解产物的性质和水解度的活性。
本公开提供了具有改善的氨肽酶活性的新颖多肽以及用于获得具有期望质量和高水解度的蛋白水解产物的方法。
附图说明
通过参考对说明性实施例进行阐述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：
图1在顶部显示了编码pepN_2酶的合成基因的总体设计的一个实例，并且在底部显示了用于代替内源性分泌信号序列的前导序列的特写。
图2显示了在麸质水解(在水解过程中，无pH-对照)中，来自费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)的PepN 2的pH依赖性谷氨酸释放。
图3显示了在麸质水解(在水解过程中，无pH-对照)中，来自费希新萨托菌的PepN2的温度依赖性谷氨酸释放。
图4显示了不同PepN 2的谷氨酸释放。
图5显示了WHWLQLKPGQPMY(SEQ ID NO:26)的水解
图6显示了KPGQPMY的水解。(SEQ ID NO:27)
图7显示了QPMY的水解。(SEQ ID NO:28)
图8显示了将底物以及裂解产物的肽序列输入到Skyline中，并且在每个样品中计算强度。
图9显示了六个面板，即图9A-9F的空间排布，其详细描述了几种PepN 2酶的序列比对。
图10通过TRI032、TRI035、TRI063(米曲霉)以及 LAP(真菌外肽酶)对TPAAAR(SEQ ID NO:29)的水解。
具体实施方式
本公开提供了具有氨肽酶活性的多肽。本发明还涉及编码所述多肽的核酸序列并涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞以及用于产生所述多肽的方法。本公开还涉及从蛋白质底物获得水解产物的方法，所述方法包括使蛋白质材料经受单独的具有氨肽酶活性的多肽或经受与蛋白酶(例如内肽酶)结合的具有氨肽酶活性的多肽。本公开还涉及从蛋白质底物获得富含游离谷氨酸和/或肽结合谷氨酸残基的水解产物的方法，所述方法包括使底物经受具有氨肽酶活性的多肽。本公开还涉及包含具有氨肽酶活性的多肽的风味改善组合物。所述组合物可以进一步包含另外的酶活性。
在另一方面，此处所述的方法可用于与食品有关的应用(例如烘焙)，以改善风味。可替代地，可以通过添加通过本发明的方法获得的水解产物来实现食物中的风味改善。在一些实施例中，当与未处理的水解产物相比时，使用此处所述的氨肽酶产生的水解产物也可具有降低的苦味。
在一些实施例中，本发明提供了新的真菌氨肽酶(PepN)、真菌氨肽酶在生产宿主(例如里氏木霉(Trichoderma reesei))中的高产量生产、以及真菌氨肽酶用于产生蛋白水解产物，例如用于去苦和用于谷氨酸生产的用途。如实例9所示，与氨肽酶1型相比，根据本发明的氨肽酶2型显示出了改善的谷氨酸释放。初步结果表明，这些PepN对P1'中的脯氨酸耐受，这与其他已知的氨肽酶相比，是令人惊讶的。因此，教导用于本发明的脯氨酸耐受性氨肽酶能够作用于宽范围的肽和/或蛋白质底物，并且由于具有这样广泛的底物特异性而不容易被富含某些氨基酸(例如脯氨酸和/或赖氨酸和/或精氨酸和/或甘氨酸)的底物的裂解抑制。
本发明的诸位发明人惊奇地发现氨肽酶2型具有比氨肽酶1型更好的性能。此外，本发明的诸位发明人惊奇地发现了一组具有改善的性能的真菌氨肽酶2型。这组真菌氨肽酶2型在其成熟氨基酸序列中具有较长的N-末端。图9显示了几种2型氨肽酶的氨基酸序列比对。
术语“氨肽酶活性”在此处定义为肽酶活性，其催化从肽、寡肽或蛋白质的N-末端去除氨基酸。以一般方式定义，氨肽酶活性能够从肽、多肽或蛋白质的N-末端切割氨基酸X，其中X可以代表选自由以下组成的组的任何氨基酸残基：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、和Val，但至少是Leu、Glu、Gly、Ala、和/或Pro。应该理解的是，本发明所述具有氨肽酶活性的多肽对于肽、多肽底物的N-末端的待切割的氨基酸可能是非特异性的。
在一些实施例中，本发明涉及具有氨肽酶活性的分离的多肽，如图9的序列比对所示的，所述多肽具有在位置67的保守残基I/V的N-末端侧上具有多于13个残基的预测成熟序列或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。
在一些实施例中，本发明涉及分离的多肽，其具有与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述分离的多肽具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，同源性多肽具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列、成熟氨基酸序列或等位基因变体、及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。SEQ ID NO:1的片段是从所述氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一些实施例中，所述片段包含SEQ ID NO:18的序列。在一些实施例中，所述多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明涉及分离的多肽，其具有与SEQ ID NO:2的成熟氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述分离的多肽具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，同源性多肽具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、成熟氨基酸序列或等位基因变体、及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。SEQ ID NO:2的片段是从所述氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一些实施例中，所述片段包含SEQ ID NO:19的序列。在一些实施例中，所述多肽具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明涉及分离的多肽，其具有与SEQ ID NO:3的成熟氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述分离的多肽具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，同源性多肽具有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、成熟氨基酸序列或等位基因变体、及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。SEQ ID NO:3的片段是从所述氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一些实施例中，所述片段包含SEQ ID NO:20的序列。在一些实施例中，所述多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明涉及分离的多肽，其具有与SEQ ID NO:4的成熟氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述分离的多肽具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，同源性多肽具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、成熟氨基酸序列或等位基因变体、及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。SEQ ID NO:4的片段是从所述氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一些实施例中，所述片段包含SEQ ID NO:21的序列。在一些实施例中，所述多肽具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明涉及分离的多肽，其具有与SEQ ID NO:5的成熟氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述分离的多肽具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，同源性多肽具有与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、成熟氨基酸序列或等位基因变体、及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。SEQ ID NO:5的片段是从所述氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一些实施例中，所述片段包含SEQ ID NO:22的序列。在一些实施例中，所述多肽具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明涉及分离的多肽，其具有与SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述分离的多肽具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，同源性多肽具有与SEQ ID NO:6的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、成熟氨基酸序列或等位基因变体、及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。SEQ ID NO:6的片段是从所述氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一些实施例中，所述片段包含SEQ ID NO:23的序列。在一些实施例中，所述多肽具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明涉及分离的多肽，其具有与SEQ ID NO:7的成熟氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述分离的多肽具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，同源性多肽具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、成熟氨基酸序列或等位基因变体、及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。SEQ ID NO:7的片段是从所述氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一些实施例中，所述片段包含SEQ ID NO:24的序列。在一些实施例中，所述多肽具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明涉及分离的多肽，其具有与SEQ ID NO:8的成熟氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述分离的多肽具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，同源性多肽具有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、成熟氨基酸序列或等位基因变体、及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。SEQ ID NO:8的片段是从所述氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一些实施例中，所述片段包含SEQ ID NO:25的序列。在一些实施例中，所述多肽具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
优选地，片段含有至少330个氨基酸残基、更优选地至少380个氨基酸残基、和最优选地至少430个氨基酸残基。
等位基因变体表示占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变自然产生，并可能导致群体内的表型多态性。
如在此处所使用的，“亲本酶”是氨肽酶，其具有如SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ IDNO:8所示的多肽的全部氨基酸残基。就此而言，并且例如，亲本将具有变体多肽的所有修饰(其取决于变体可以是零个、一个或多个)。
在一些实施例中，本发明涉及具有氨肽酶活性的由核酸序列编码的分离的多肽，所述核酸序列在低严格条件下、更优选地在中严格条件下、和最优选地在高严格条件下与寡核苷酸探针杂交，所述寡核苷酸探针在相同的条件下与SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的核酸序列的多肽编码部分、或其互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆，实验手册]，第二版，Cold Spring Harbor[冷泉港实验室出版社]，纽约)；或多肽的等位基因变体和片段杂交，其中所述片段具有氨肽酶活性。
杂交表明核酸序列与对应于SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16所示的核酸序列的多肽编码部分的寡核苷酸探针在低严格至高严格条件下(即，分别针对低严格度、中严格度和高严格度，在42℃处在5X SSPE，0.3％SDS，200Pg/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA，以及25％、35％或50％的甲酰胺中预杂交和杂交)，遵循标准DNA印迹程序杂交。
SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8、或其部分序列的氨基酸序列可以用于设计寡核苷酸探针，或者编码本发明的多肽例如编码SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ IDNO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的部分核酸序列的多肽的核酸序列；或其子序列可用于根据本领域已知的方法从不同的属或物种的菌株中鉴定并克隆编码具有氨肽酶活性的多肽的DNA。具体地说，这类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与目的属或目的物种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因。这些探针可以比完整序列短得多，但是长度应当是至少15个、优选至少25个、且更优选至少40个核苷酸。也可以使用更长的探针。DNA和RNA探针都可以使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白标记)。
因此，可以针对与以上所描述的探针杂交并且编码具有氨肽酶活性的多肽的DNA对由这类其他生物体制备的基因组cDNA或重组的化学文库进行筛选。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术分离来自这类其他生物的基因组或其他DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移并且固定在硝酸纤维素(nitrocellulose)或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的核酸序列的多肽编码部分同源的克隆或DNA，所述载体材料用于DNA印迹中，其中载体材料最终洗涤三次，每次30分钟，每次使用2 x SSC，0.2％SDS，优选至少50℃，更优选至少55℃，更优选至少60℃，更优选至少65℃，甚至更优选至少70℃，和最优选至少75℃。使用X射线胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子。
如在此处所用的术语“修饰”(modifying和modification)是指与具有最接近的同一性的野生型氨肽酶多肽序列进行比较时的取代。通过将变体氨肽酶多肽和野生型氨肽酶两者与SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8所示的参比序列进行比对来进行比较。
同样，在此处所使用的“等效修饰”是指对位于另一氨肽酶的等效位置上的氨基酸进行相同的修饰(通常是取代)。
在一个方面，根据本发明的氨肽酶序列呈分离的形式。术语“分离的”意指该氨肽酶序列至少实质上不含与该氨肽酶序列在自然界中天然结合或者在自然界中存在的至少一种其他组分。本发明的氨肽酶序列能以实质上不含该物质原本可能与之相结合的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可能实质上不含一种或多种潜在污染的多肽和/或核酸分子。
在一个方面，根据本发明的氨肽酶序列呈纯化的形式。术语“纯化的”意指给定的组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，该氨肽酶以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来确定的。
除非上下文另有明确指示，如本文所使用的，单数“一个/一种”(a/an)和“该/所述”(the)包括复数。除非另有说明，否则分别是，核酸序列从左向右以5'到3'方向书写；并且氨基酸序列都从左向右以氨基到羧基方向书写。应当理解的是，在没有相反的指示的情况下，本公开不限于本文所述的具体方法、方案和试剂。
未定义的术语和缩写应当符合本领域中所使用的常规含义。除非本文另有定义，否则本文所使用的全部科技术语都具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非另有说明，本公开的实践涉及通常用于分子生物学、蛋白质工程和微生物学的常规技术。尽管与本文所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践，但是本文描述了一些合适的方法和材料。通过参考作为一个整体的说明书，更全面地描述下面即将定义的术语。
核苷酸序列
本发明的范围涵盖编码具有本文所定义的特定性质的氨肽酶的核苷酸序列。
在一些实施例中，核酸序列编码获得自曲霉属(Aspergillus)(例如棒曲霉(Aspergillus clavatus))的多肽。在一些实施例中，核酸序列编码从新萨托菌属(Neosartorya)(例如费希新萨托菌)获得的多肽。
在一些实施例中，本发明涉及具有氨肽酶活性的核酸编码的多肽，如图9的序列比对所示的，所述多肽具有在位置67的保守残基I/V的N-末端侧上具有多于13个残基的预测成熟序列或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸是与所示例的多核苷酸具有特定程度的核酸同源性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸包含与编码SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的部分核酸序列的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，多核苷酸包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16。在其他实施例中，本发明的多核苷酸也可具有与选自由以下组成的组的核酸序列互补的核酸序列：SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16。在一些实施例中，多核苷酸包含编码重组多肽或其活性片段的核酸序列，所述重组多肽或其活性片段包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ IDNO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8。在一些实施例中，多核苷酸包含编码重组多肽或其活性片段的核酸序列，所述重组多肽或活性片段包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8。如本文所述，同源性可以通过氨基酸序列比对例如，使用程序例如BLAST、ALIGN、或CLUSTAL来确定。
本发明还包括编码具有SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ IDNO:4、或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽的核酸序列，其通过遗传密码的简并性不同于SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8。本发明还涉及SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的子序列，其编码具有氨肽酶活性的SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8的片段。SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ IDNO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的子序列是包括在SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16之内的核酸序列，除了从5’端和/或3’端缺失一个或多个核苷酸。优选地，子序列含有至少990个核苷酸，更优选至少1140个核苷酸，并且最优选至少1290个核苷酸。
如本文所使用的，术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可为基因组起源的或者合成或重组起源的，其可以是双链的或单链的而无论是代表有义链还是反义链。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其意指DNA，更优选地，意指编码本发明的cDNA序列。
在一个优选的实施例中，当与本发明的范围本身有关以及当为本发明的范围本身所涵盖时，核苷酸序列不包括当处于其天然环境中时或当其连接至其也存在于其/它们的天然环境中的天然结合的序列时的根据本发明的天然核苷酸序列。为了易于指代，我们称该优选的实施例为“非天然核苷酸序列”。就这一点而言，术语“天然核苷酸序列”意指处于其天然环境中并且当有效地连接至其天然与之结合的整个启动子(该启动子也处于其天然环境中)时的整个核苷酸序列。然而，可以在核苷酸序列在其天然生物体中表达之后分离和/或纯化由本发明的范围所涵盖的氨基酸序列。优选地，然而，可以由在其天然生物体中的核苷酸序列表达本发明的范围所涵盖的氨基酸序列，但其中该核苷酸序列不在该生物体中与其天然结合的启动子的控制之下。
典型地，使用重组DNA技术(即重组DNA)制备由本发明的范围所涵盖的核苷酸序列。然而，在本发明的替代性实施例中，可以使用本领域所熟知的化学方法整体或部分地合成该核苷酸序列(参见Caruthers Mh等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser[核酸研究研讨会系列]，215-23以及Horn T等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser[核酸研究研讨会系列]，225-232)。
本发明还涉及与SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的核酸序列具有至少约50％、优选地约60％、优选地约70％、优选地约80％、更优选地约90％、甚至更优选地约95％、和最优选地约97％的同源性的程度的同源性的核酸序列，其编码活性多核苷酸。为了本发明的目的，两个核酸序列之间的同源性程度通过CLUSTAL方法(Higgins，1989，同上)(其具有同一性表，空位罚分为10并且空位长度罚分为10)来确定。
编码本发明多肽的核酸序列的修饰对于合成与该多肽基本相似的多肽可能是必需的。术语与该多肽“基本相似”是指该多肽的非天然存在形式。这些多肽可能以某种改造的方式与从其天然来源分离的多肽不同。例如，可能目的是使用例如定点诱变来合成多肽变体，其中所述变体在比活性、热稳定性、pH最佳值等方面是不同的。类似序列可基于作为SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的核酸序列的多肽编码部分出现的核酸序列，例如其子序列来构建，并且/或者通过引入不产生核酸序列编码的另一个多肽的氨基酸序列但相对于旨在生产酶的宿主生物体的密码子选择的核苷酸取代来构建，或者通过引入可能会产生不同的核酸序列的核苷酸取代来构建。关于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford等人，1991,Protein Expression and Purification[蛋白质表达和纯化]2:95-107。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，这样的取代可以在对分子功能关键的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。由本发明的分离的核酸序列编码的多肽活性所必需的氨基酸残基(并且因此优选地不经受取代)可以根据本领域已知的方法来鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见例如Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)。在后一种技术中，在分子中每个带正电荷的残基上引入突变，并测试所得突变分子的氨肽酶活性，以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也可以通过分析(通过如核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定的)三维结构来确定(参见例如de Vos等人，1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992,Journal ofMolecular Biology[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992,FEBS Letters[欧洲生物学化学会联盟通讯]309:59-64)。
组合物
在一方面，本发明还涉及包含如在此处所述的氨肽酶和氨基酸序列和/或核苷酸序列的组合物。
在一些实施例中，本发明提供了包含具有氨肽酶活性的多肽的组合物(如图9的序列比对所示的，所述多肽具有在位置67的保守残基I/V的N-末端侧上具有多于13个残基的预测成熟序列)，或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含与如下多肽具有至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％同源性的多肽：所述多肽具有氨肽酶活性，并且如图9的序列比对所示的，所述多肽具有在位置67的保守残基I/V的N-末端侧上具有多于13个残基的预测成熟序列。
在一些实施例中，本发明提供了包含至少一种氨肽酶的通用组合物，所述氨肽酶具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述通用组合物具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，所述组合物包含同源性多肽，其具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或等位基因变体；及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另一个实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨肽酶或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，本发明提供了包含至少一种氨肽酶的通用组合物，所述氨肽酶具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述通用组合物具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，所述组合物包含同源性多肽，其具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或等位基因变体；及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的氨肽酶或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，本发明提供了包含至少一种氨肽酶的通用组合物，所述氨肽酶具有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述通用组合物具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，所述组合物包含同源性多肽，其具有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或等位基因变体；及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在另一个实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的氨肽酶或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，本发明提供了包含至少一种氨肽酶的通用组合物，所述氨肽酶具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述通用组合物具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，所述组合物包含同源性多肽，其具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或等位基因变体；及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在另一个实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的氨肽酶或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，本发明提供了包含至少一种氨肽酶的通用组合物，所述氨肽酶具有与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述通用组合物具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，所述组合物包含同源性多肽，其具有与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或等位基因变体；及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在另一个实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的氨肽酶或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，本发明提供了包含至少一种氨肽酶的通用组合物，所述氨肽酶具有与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述通用组合物具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，所述组合物包含同源性多肽，其具有与SEQ ID NO:6的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或等位基因变体；及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在另一个实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的氨肽酶或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，本发明提供了包含至少一种氨肽酶的通用组合物，所述氨肽酶具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述通用组合物具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，所述组合物包含同源性多肽，其具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或等位基因变体；及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在另一个实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的氨肽酶或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，本发明提供了包含至少一种氨肽酶的通用组合物，所述氨肽酶具有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有一定程度的同一性的氨基酸序列，所述同一性为至少约50％、优选地至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％、甚至更优选地至少约90％、最优选地至少约95％、和甚至最优选地至少约97％，所述通用组合物具有氨肽酶活性(在下文中称为“同源性多肽”)。在一些实施例中，所述组合物包含同源性多肽，其具有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、和最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或等位基因变体；及其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的氨肽酶或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，所述组合物包含与示例性多核苷酸具有特定程度的核酸同源性的多核苷酸。在一些实施例中，所述组合物包含含有核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列与SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的核酸序列的多肽编码部分的核酸序列具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施例中，所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16。在其他实施例中，所述组合物包含具有与选自由以下组成的组的核酸序列互补的核酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQID NO:15、或SEQ ID NO:16。在一些实施例中，所述组合物包含了包含编码重组多肽或其活性片段的核酸序列的多核苷酸，所述重组多肽或其活性片段包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8。在一些实施例中，所述组合物包含了包含编码重组多肽或其活性片段的核酸序列的多核苷酸，所述重组多肽或活性片段包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQID NO:4、或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8。
在一些实施例中，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。额外的一种或多种酶可以通过属于曲霉属(优选地棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae))、或木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)(优选特异腐质霉(Humicola insolens))、或镰孢菌属(Fusarium)(优选杆孢状镰孢菌(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢菌(Fusarium cerealis)、克地镰孢菌(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰孢菌(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢菌(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢菌(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、接骨木镰孢菌(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢菌(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢菌(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusariumvenenaium))的微生物来生产。
在一些实施例中，本发明涉及包含具有氨肽酶活性的多肽和合适的载体的组合物。可以使用本领域已知的任何合适的载体，包括在此处所述的那些载体。在另一个实施例中，所述组合物还包含内肽酶。在一些实施例中，所述组合物还包含一种或多种非特异性作用的内肽酶和/或外肽酶。在一些实施例中，所述组合物还包含一种或多种特异性作用的内肽酶和/或外肽酶。
在一些实施例中，特异性作用的蛋白水解酶是内肽酶例如谷氨酰内肽酶(EC3.4.21.19)；赖氨酰内肽酶(EC 3.4.21.50)；亮氨酰内肽酶(EC 3.4.21.57)；甘氨酰内肽酶(EC 3.4.22.25)；脯氨酰内肽酶(EC 3.4.21.26)；胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)或胰蛋白酶样(赖氨酸/精氨酸特异性)内肽酶；或肽基-Asp金属内肽酶(EC 3.4.24.33)。
在一些实施例中，外肽酶选自由以下组成的组：三肽基氨肽酶、二肽基氨肽酶、羧肽酶和其他氨肽酶。
在一些实施例中，所述一种或多种内肽酶和/或外肽酶选自由以下组成的组：酸性真菌内肽酶、金属中性内肽酶、碱性丝氨酸内肽酶、枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、热稳定性细菌中性内肽酶、碱性丝氨酸内肽酶。
在一些实施例中，用于本发明的内肽酶和/或外肽酶可以是以下一种或多种商业产品中的一种或多种蛋白酶：
另外或者可替代地，内肽酶和/或外肽酶可包括于一种或多种以下市售产品中：KANNASETM、NOVOCARNETM Tender、和Novozym 37020、NOVO-PROTM D(全部得自诺维信公司)；BioSorb-ACDP(印度Noor Creations公司)；酸性蛋白酶(Angel Yeast Co,Ltd.,China[安琪酵母公司，中国])或 LAP(得自AB Enzymes[AB酶公司])。
在一些实施例中，本发明还提供包含至少一种此处所述的氨肽酶的饲料和/或食品添加剂组合物。
在另一个实施例中，提供了包含本发明的水解产物的组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物。合适地，这样的食品和/或饲料添加剂组合物可以进一步包含氨肽酶(任选地与内切蛋白酶组合)。
可以将材料添加到含酶的液体中以改善液体组合物的性质。这些添加剂的非限制性实例包括：盐(例如碱金属盐、碱土金属盐、另外的氯化物盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐，其中示例性的抗衡离子是钙、钾和钠)；无机矿物或粘土(例如沸石、高岭土、膨润土、滑石和/或硅酸盐)；碳水化合物(例如蔗糖和/或淀粉)；着色颜料(例如二氧化钛)；杀生物剂(例如，分散剂；消泡剂；还原剂；酸剂；碱剂；酶稳定剂(例如多元醇如甘油、丙二醇、山梨糖醇、无机盐、糖、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，及其组合)；酶抑制剂；防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸酯、山梨酸酯或其他食品认可的防腐剂)；及其组合。可用于制剂/组合物的赋形剂包括麦芽糖、蔗糖、葡萄糖(包括葡萄糖浆或干葡萄糖浆)、预煮的淀粉、糊化淀粉、L-乳酸、抗坏血酸棕榈酸酯、生育酚、卵磷脂、柠檬酸、柠檬酸盐、磷酸、磷酸盐、藻酸钠、角叉菜胶、刺槐豆胶、瓜尔胶、黄原胶、果胶、羧甲基纤维素钠、甘油单酯和甘油二酯、甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯、蔗糖酯、二氧化碳、氩气、氦气、氮气、一氧化二氮、氧气、氢气和辛基琥珀酸淀粉钠。如本文实例7所示，根据本发明的氨肽酶在包含氯化钠的组合物中可保持其酶活性。
形式
本发明的产品和/或组合物可以以任何合适的形式使用——-无论是单独的还是存在于组合物中时。同样地，本发明的氨肽酶当与例如外切蛋白酶和/或内切蛋白酶结合作为食品加工助剂或食品添加剂(即成分——例如食品成分、功能性食品成分或药物成分)可以以任何合适的形式用于食品工业中。
针对速释型、迟释型、调释型、缓释型、脉冲释放型或控制释放型应用，形式的合适的实例包括片剂、丸剂、胶囊剂、珠剂、溶液或悬浮液中的一种或多种，其可包含调味剂或染色剂。
举例来说，如果产品和/或组合物以片剂形式使用(例如用作功能成分)，那么这些片剂也可以包含以下各项中的一种或多种：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选是玉米、马铃薯、木薯淀粉)、乙醇酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；造粒粘结剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石可以包括在内。
用于制备这些形式的营养上可接受的载体的实例包括(例如)水、盐溶液、醇、硅酮、蜡类、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
用于这些形式的优选赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。
对于水性悬浮液和/或酏剂，可将本发明的氨肽酶和/或组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质或染料进行组合，与乳剂和/或悬浮剂进行组合，以及与稀释剂(例如水、乙醇、丙二醇和甘油及其组合)进行组合。
形式还可以包括明胶胶囊；纤维胶囊、纤维片剂等。
方法
在一些实施例中，本发明的多肽可用于蛋白水解产物的生产，例如用于增强水解度、蛋白水解产物的一般去苦性和增强风味发展、产生谷氨酸和/或其他用途，如在发芽或酿造期间的FAN产生。
本发明进一步涉及使用本发明的多肽与蛋白酶(例如内肽酶)组合以产生富含蛋白质的物质的高度水解的方法。该方法包括用多肽和内肽酶处理蛋白质底物。可以同时或连续地用酶处理底物。
将本发明的多肽以蛋白水解过程中常规使用的有效量添加到蛋白质底物中。在一些实施例中，将本发明的多肽以从约0.1至约100,000个氨肽酶单位/100g蛋白质，或从约1至约10,000个氨肽酶单位/100g蛋白质的范围添加至蛋白质底物中。如在此处所定义的，一个氨肽酶单位(APU)是在特定条件下从Ala-对硝基苯胺(Sigma Chemical Co.，St.LouisMO[西格玛化学公司，密苏里州圣路易斯])每分钟释放1微摩尔对硝基苯胺所需的酶量。在氨肽酶测定中，通过释放对硝基苯胺(pNA)测量肽底物H-Ala-硝基苯胺的水解。使用ELISA读数器，在405nm的波长处测定pNA的吸光度。在30℃处，反应用180μl 20mM CPB缓冲液、15μl稀释的酶和20μl底物进行。CPB缓冲液由20mM柠檬酸、20mM磷酸盐、20mM硼酸组成，并调节至pH 9.0。底物是来自BACHEM[巴赫姆公司](L-1070)的在1ml DMSO(来自SIGMA[西格玛公司](目录号D2650)的二甲基亚砜)中20mg H-Ala-pNA。
内肽酶可以从来自芽孢杆菌属(优选地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))的菌株、葡萄球菌属(优选地金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))的菌株、链霉菌属(优选地热普通链霉菌(Streptomycesthermovularis)或灰色链霉菌(Streptomyces griseus))的菌株、放线菌属菌株、曲霉属(优选地棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株，或木霉属(优选里氏木霉)菌株、或镰孢菌属(优选地镶片镰孢菌(Fusarium venenatum))菌株中获得。在一些实施例中，内肽酶选自由以下组成的组： AFP、 PAL、 PNL、碱性蛋白酶、 PXT、 PBR、 PHT、30L、和51FP。
以在蛋白水解过程中常规使用的有效量，将内肽酶添加到蛋白质底物中，优选地以从约0.05至约15 AU/100g蛋白质，更优选地以约0.1至约8AU/100g的蛋白质的范围添加。一个AU(Anson单位)被定义为在标准条件下(即25℃，pH 7.5和10分钟的反应时间)以初始速率消化血红蛋白的酶量以使得每分钟释放一定量的TCA可溶性产物，其与苯酚试剂产生与一毫当量酪氨酸相同的颜色。在一些实施例中，内肽酶可以按约10mg至约3000mg酶/kg蛋白质底物的量给药，例如，0.01g至3g酶/公吨(MT)蛋白质底物。
酶处理(即底物与酶制剂的孵育)可以在酶制剂未变得失活的任何适宜的温度下进行，优选地在从约20℃至约70℃的范围内进行。根据已确定的惯例，酶制剂可以通过将孵育混合物的温度升高至酶变得失活的温度(例如至高于约70℃)，或类似地通过将孵育混合物的pH降低至酶变得失活的点(例如低于约4.0)来适当地失活。
此外，本发明的方法导致蛋白质底物的水解度的提高。如在此处所用的，水解度(DH)是已被蛋白水解酶水解的蛋白质中氨基键总数的百分比。在一个方面，根据本发明的酶可以促进至少约5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％、22％、25％、27％、30％、35％、40％、45％或50％的蛋白质底物的DH的增加或提高。在一个实例中，增加可以相对于1型氨肽酶，尽管可以进行任何合适的比较。在一个优选的实施例中，蛋白水解产物具有增加的Leu、Gly、Glu、Ser、Asp、Asn、Pro、Cys、Ala和/或Gln的含量，例如至少1.1倍多。
在一些实施例中，蛋白水解产物具有增加的Glu含量。在一些实施例中，蛋白水解产物具有增加的Leu含量。在一些实施例中，蛋白水解产物具有增加的Gly含量。在一些实施例中，蛋白水解产物具有增加的Ser含量。在一些实施例中，蛋白水解产物具有增加的Asp含量。在一些实施例中，蛋白水解产物具有增加的Asn含量。在一些实施例中，蛋白水解产物具有增加的Pro含量。在一些实施例中，蛋白水解产物具有增加的Cys含量。在一些实施例中，蛋白水解产物具有增加的Ala含量。在另一个更优选的实施例中，蛋白水解产物具有增加的Gln含量。
根据本发明的氨肽酶可以表现出对酶促反应产物的降低的抑制作用。如本文实例8中所证明的，根据本发明的两种PepN 2酶显示出比来自米曲霉RIB40(NCBI参比序列：XP_001819545.1)的酶亮氨酸氨肽酶2更少的产物抑制，其在下文中示出为SEQ ID NO:17：
如此，在一个实施例中，本发明提供了与SEQ ID NO:17(在本文中也称为TRI063-参见例如实例)的氨肽酶相比，具有了具有降低的产物抑制的氨肽酶活性的分离的多肽。具体而言，具有氨肽酶活性的根据本发明的分离的多肽可具有大于2mM、3mM、4mM或5mM的产物抑制常数(Ki)值。在一个优选的实施例中，具有氨肽酶活性的分离的多肽是氨肽酶2型酶。在进一步优选的实施例中，氨肽酶2型酶如本文定义的SEQ ID NO:1-8中任一者所示，特别是SEQ ID NO:1或5。
根据本发明的氨肽酶能够水解如从N末端开始编号在位置2处具有脯氨酸残基的多肽。具体而言，在孵育的2小时内，根据本发明的氨肽酶够将如从N末端开始编号在位置2处具有脯氨酸残基的多肽水解超过起始浓度的一半。水解程度可以通过本领域已知的任何合适的方案测量，例如实例10中给出的方法。如实例10所示，根据本发明的两种PepN 2酶(TRI032和TRI035)能够随着时间水解TPAAAR肽在孵育2小时内至一半浓度，而TRI063(米根霉)和 LAP显示在12小时内TPAAAR没有水解。
本发明还涉及获得富含游离谷氨酸和/或肽结合的谷氨酸残基的蛋白水解产物的方法，所述方法包括：使底物经受具有氨肽酶活性的多肽的作用。本发明还涉及获得富含游离谷氨酰胺或谷氨酸和/或寡肽结合的谷氨酰胺或谷氨酸残基的蛋白水解产物的方法，所述方法包括：使底物经受具有氨肽酶活性的多肽的作用。
本发明还涉及使蛋白水解产物去苦味的方法，所述方法包括：使底物经受具有氨肽酶活性的多肽的作用。
在一些实施例中，所述方法还包括使所述底物经受脱酰胺作用过程。该脱酰胺作用过程可以在使底物经受具有氨肽酶活性的多肽的作用的同时、之前或之后进行。
在一些实施例中，本发明的方法产生具有增强的风味的蛋白水解产物，因为谷氨酸(Glu)(游离或与寡肽结合)在蛋白水解产物的风味和适口性中起重要作用。在一些实施例中，所述方法还产生具有改善的功能性，特别是改善的溶解性、改善的乳化性质、增加的水解度、和改善的发泡性质的蛋白水解产物。
通过释放氨将酰胺(谷氨酰胺或天冬酰胺)转化成荷电酸(谷氨酸或天冬氨酸)被称为脱酰胺作用。脱酰胺作用可以作为非酶促脱酰胺作用过程或酶促脱酰胺作用过程发生。
在一些实施例中，脱酰胺作用作为酶促脱酰胺过程进行，例如通过使底物经受谷氨酰胺酶、转谷氨酰胺酶和/或肽谷氨酰胺酶。
在一些实施例中，谷氨酰胺酶是谷氨酰胺酶SD-C100STM(Amano[安满能]，日本)。
在一些实施例中，可以按约1mg至20mg/g底物蛋白质的量给予谷氨酰胺酶。在一些实施例中，可以按约5mg至15mg/g底物蛋白质的量给予谷氨酰胺酶。在一些实施例中，可以按约10mg/g底物蛋白质的量给予谷氨酰胺酶。
本发明还涉及生产谷氨酸的方法，所述方法包括：使蛋白底物经受具有氨肽酶活性的多肽的作用。
谷氨酰胺酶可以是任何方便的来源，包括哺乳动物，参见例如JP 1050382和JP5023182，包括活化的因子XIII，参见例如WO 93/15234；来自鱼类的那些，参见例如EP 555,649；和从微生物获得的那些，参见例如EP 379,606、WO 96/06931和WO 96/22366。在一些实施例中，转谷氨酰胺酶获得自卵菌纲(Oomycete)，包括疫霉属(优选地恶疫霉(Phytophthora cactorum))菌株、或腐霉属(优选地，畸雌腐霉(Pythium irregulare)、腐霉菌物种(Pythium sp.)、间型腐霉(Pythium intermedium)、终极腐霉(Pythium ltimum)、或周雄腐霉(Pythium periilum)(或Pythium periplocum)菌株。在一些实施例中，转谷氨酰胺酶是细菌来源的并且从芽孢杆菌属(优选地枯草芽孢杆菌)菌株、轮枝链霉菌属(优选地茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraensis)、灰轮丝链轮丝菌(Streptoverticillium griseocarneum)、或Streptoverticillium cinnamoneum)的菌株、和链霉菌属(优选地利迪链霉菌(Streptomyces lydicus))菌株获得。
肽谷氨酰胺酶可以是肽谷氨酰胺酶I(肽基-谷氨酰胺酶；EC 3.5.1.43)、或肽谷氨酰胺酶II(蛋白质-谷氨酰胺谷氨酰胺酶；EC 3.5.1.44)、或其任何混合物。肽谷氨酰胺酶可以从曲霉菌(优选地日本曲霉)菌株、芽孢杆菌属(优选地环状芽孢杆菌)菌株、隐球菌属(优选地浅白隐球酵母)菌株、或德巴利氏酵母属(优选地克洛德巴利酵母(Debaryomyceskloecheri))菌株获得。
将转谷氨酰胺酶以在脱酰胺作用方法中常规使用的有效量添加到蛋白质底物中，优选地以从约0.01％至约5％(w/w)的范围内、和更优选地在从约0.1％至约1％(w/w)与底物量有关的酶制剂范围内添加。
将肽谷氨酰胺酶以常规用于脱酰胺作用方法的有效量添加到蛋白质底物中，优选地以从约0.01至约100,000个PGase单位/100g底物、和更优选约0.1至约10,000个PGase单位/100g底物的范围添加。
肽谷氨酰胺酶活性可根据Cedrangoro等人的方法测定(1965，Enzymologia[酶]第29卷，第143页)。按照这个程序，将0.5ml用1N NaOH调节至pH 6.5的酶样品装入小容器中。然后将1ml硼酸盐pH 10.8的缓冲溶液添加到容器中。将排出的氨用5N硫酸吸收，并且使用奈斯勒氏(Nessler)试剂，使混合物形成颜色，在420nm下测量。一个PGase单位是在这些条件下每分钟能够产生1微摩尔氨的酶量。
本发明还涉及在发芽和/或酿造期间生产游离氨基氮(FAN)的方法，所述方法包括：在发芽和/或酿造过程中使底物经受具有氨肽酶活性的多肽的作用。
在本发明的方法的一些实施例中，使蛋白质底物经受本发明的多肽。将本发明的多肽以在蛋白水解过程中常规使用的有效量添加到蛋白质底物中，优选地在约0.001 AU至约0.5 AU/100g底物的范围内，更优选地在约0.01 AU至约0.1 AU/100g的底物的范围内添加。
在另一个实施例中，本发明所述用于产生富含游离谷氨酸和/或肽结合谷氨酸残基的水解产物的方法进一步包括：使底物经受一种或多种非特异性作用的内肽酶和/或外肽酶。该步骤可以与使蛋白质底物经受本发明的多肽的步骤同时进行，或跟随在其后进行。
在一个优选的实施例中，非特异性作用的内肽酶和/或外肽酶获得自曲霉属菌株或芽孢杆菌属菌株。
以在蛋白水解过程中常规使用的有效量，将非特异性作用的内肽酶和/或外肽酶添加到底物中，优选地以从约的范围。
在一些实施例中，内肽酶和/或外肽酶可以约50mg至约3000mg酶/kg蛋白质底物，例如，0.05g至3g酶/公吨(MT)蛋白质底物的量来给予。
合适地，内肽酶和/或外肽酶可以小于约4.0g酶/MT蛋白质底物的量来给予。
在另一个实施例中，内肽酶和/或外肽酶可以约0.5g至约5.0g之间的酶/MT蛋白质底物来给予。合适地，内肽酶和/或外肽酶可以约0.5g至约3.0g之间的酶/MT蛋白质底物来给予。更合适地，内切蛋白酶可能以约1.0g至约2.0g的酶/MT蛋白质底物给药。
在一些实施例中，本发明的多肽可能以约0.5mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物和/或食品和/或饲料添加剂组合物的量来给予。合适地，本发明的多肽可能以约1mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物和/或食品和/或饲料添加剂组合物的量来给予。更合适地，以在约5mg至约1.5g之间的酶/kg蛋白质底物和/或食品和/或饲料添加剂组合物的量给药。
在水解产物的制备中，本发明的多肽可能以约0.5mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物的量来给药。合适地，本发明的多肽可能以约1mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物的量来给药。更合适地，以约5mg至约1.5g之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。
在一个实施例中，本发明的多肽可能以约5mg至约500mg之间的酶/kg蛋白质底物的量来给药。合适地，本发明的多肽可能以约50mg至约500mg之间的酶/kg蛋白质底物的量来给药。合适地，本发明的多肽可能以约100mg至约450mg之间的酶/kg蛋白质底物的量来给药。
每种酶处理可以在酶制剂未变为失活的任何温度下发生，优选地在从约20℃至约70℃的范围内发生。然后可以通过升高温度，例如升高至高于约70℃，或通过降低pH，例如降低至低于约4.0来使酶制剂失活。
用于本发明方法的蛋白质底物可以由完整蛋白、预水解蛋白质(即肽)、或其混合物组成。蛋白质底物可以是植物或动物来源的。在一些实施例中，蛋白质底物是植物来源的，例如大豆蛋白、谷物蛋白，例如小麦谷蛋白、玉米谷蛋白，大麦、黑麦、燕麦、大米、玉米蛋白、羽扇豆、棉籽蛋白、油菜籽蛋白、花生、苜蓿蛋白、豌豆蛋白、豆科豆类蛋白、芝麻蛋白或向日葵。动物来源的蛋白质底物可以是乳清蛋白、酪蛋白、肉蛋白、鱼蛋白、红细胞、蛋清、明胶、乳白蛋白、毛发蛋白或羽毛蛋白。
本发明还涉及通过这些方法生产的蛋白水解产物。
核苷酸序列的制备
编码具有如本文所定义的特定性质的蛋白质或适合于修饰的蛋白质的核苷酸序列可以从生产所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴定和/或分离和/或纯化。用于核苷酸序列的鉴定和/或分离和/或纯化的各种方法是领域内所熟知的。举例来说，一旦已鉴定和/或分离和/或纯化合适的序列就可以使用PCR扩增技术来制备更多序列。
进一步举例来说，可以使用来自生产酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的话，可合成标记寡核苷酸探针并用于从由生物体制备的基因组文库鉴别编码酶的克隆。可替代地，可将含有与另一个已知的酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴定编码酶的克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
可替代地，编码酶的克隆可以通过这样来鉴定：将基因组DNA的片段插入表达载体(例如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌涂板于含有酶的底物(即麦芽糖)的琼脂板上，从而允许表达该酶的克隆能被鉴定出。
在又进一步的替代方案中，编码该酶的核苷酸序列可以通过已建立的标准方法(例如，由Beucage S.L.等人(1981)Tetrahedron Letters[四面体快报]22，第1859-1869页，或Matthes等人(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3，第801-805页描述的亚磷酰胺方法)合成制备。在亚磷酰胺方法中，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组起源和合成起源、混合的合成起源和cDNA起源或混合的基因组起源和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成起源、基因组起源或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应于整个核苷酸序列的各个部分。也可以使用特异性引物通过聚合酶链反应(PCR)来制备DNA序列，例如在US 4,683,202或Saiki R K等人(Science[科学](1988)239，第487-491页)中所描述。
氨基酸序列
本发明的范围还涵盖具有如本文所定义的特定性质的酶的氨基酸序列。
如本文所使用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或者其可以通过合成制得或者其可以通过利用重组DNA技术制备。
包含在本发明中的蛋白质可以与其他蛋白质，特别是脯氨酸内切蛋白酶、三肽基外肽酶、和其他形式的内切或外切蛋白酶联合使用。因此，本发明还涵盖蛋白质的组合，其中该组合包含本发明的氨肽酶和另一种酶(其可以是根据本发明的另一种氨肽酶)。这个方面在后面部分讨论。
优选地，当与本发明的范围本身有关或当由本发明的范围本身所涵盖时，氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且当其已经由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。
序列同一性或序列同源性
本发明还涵盖与具有本文所定义的特定特性的多肽的一个或多个氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或编码这样的多肽的任何核苷酸序列(下文称为“一个或多个同源序列”)的用途。在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。
该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该氨肽酶的功能活性和/或增强该氨肽酶的活性的多肽。
在本发明上下文中，同源序列意在包括与主题序列可以具有至少75％、85％或90％同一性、优选至少95％或98％同一性的氨基酸序列。通常，所述同源物与主题氨基酸序列将包括相同的活性位点等。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有相似的化学特性/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。
在本发明上下文中，同源序列意在包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)具有至少75％、80％、85％或90％同一性、优选至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有相似的化学特性/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。
同源性比较可以通过眼睛，或更通常地借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的％同源性。
可以在连续序列上计算％同源性，即将一个序列与其他序列进行比对，并且将一个序列中的每个氨基酸与其他序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，此类无空位比对仅在相对短数目的多个残基上进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其没有考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而当进行全局比对时可能导致％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计来产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失，从而不会不当地减损整体同源性分值。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋予“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对-反映两个比较序列之间更高的相关性-将获得比具有许多空位的序列比对更高的分值。通常使用“仿射空位成本(affinegap cost)”，其对空位的存在索取相对高的成本，而对空位中每一个后续的残基索取较小的罚分。这是最常用的空位打分系统。当然，高的空位罚分将会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许待修饰的空位罚分。然而，优选的是当使用此类软件进行序列比较时使用默认值。
最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。进行这样的比对的适合的计算机程序是Vector NTI(英杰公司(Invitrogen))。可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于：例如BLAST程序包(参见Ausubel等人，1999，Short Protocols in Molecular Biology[简明分子生物学试验方案]，第4版-第18章)、BLAST 2(参见FEMS Microbiol Lett[FEMS微生物通讯]1999，174(2):247-50；FEMS MicrobiolLett[FEMS微生物通讯]1999，177(1):187-8；以及tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]403-410)以及AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999，同上，第7-58至7-60页)。
尽管最终的％同源性可以按照同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于全或无配对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵(scaled similarity score matrix)，该矩阵基于化学相似性或进化距离对每一成对比较赋予分值。通常使用的这样的矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(进一步的细节请参见用户手册)。对于一些应用，优选的是使用Vector NTI程序包的默认值。
可替代地，基于类似于CLUSTAL的一种算法，可以使用Vector NTI(InvitrogenCorp.[英杰公司])中的多重比对特征计算同源性百分比(Higgins DG和Sharp PM(1988)，Gene[基因]73(1)，237-244)。
一旦软件已经产生最佳比对就可以计算％同源性，优选％序列同一性。典型地，作为序列比较的一部分软件进行此计算，并且生成数值结果。
当确定序列同一性时应该使用空位罚分，然后优选地使用如下参数用于成对比对：
在一个实施例中，可使用采用上面限定的空位罚分和空位延伸组的CLUSTAL。
适合地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上、优选在至少30个连续核苷酸上、优选在至少40个连续核苷酸上、优选在至少50个连续核苷酸上、优选在至少60个连续核苷酸上、优选在至少100个连续核苷酸上确定。
适合地，关于核苷酸序列的同一性程度可以在整个序列上确定。
变体/同系物/衍生物
本发明还涵盖蛋白质的任何氨基酸序列或编码这种蛋白质的任何核苷酸序列的变体、同源物和衍生物。
在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。
在本发明上下文中，同源序列意在包括与主题序列可以具有至少75％、80％、85％或90％同一性、优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。通常，所述同源物与主题氨基酸序列将包括相同的活性位点等。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有相似的化学特性/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。
在本发明上下文中，同源序列意在包括可以与编码本发明的酶的核苷酸序列(主题序列)具有至少75％、80％、85％或90％同一性、优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有相似的化学特性/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。
同源性比较可以通过眼睛，或更通常地借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的％同源性。可以在连续序列上计算％同源性，即将一个序列与其他序列进行比对，并且将一个序列中的每个氨基酸与其他序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，此类无空位比对仅在相对短数目的多个残基上进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其没有考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而当进行全局比对时可能导致％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计来产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失，从而不会不当地减损整体同源性分值。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋予“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对-反映两个比较序列之间更高的相关性-将获得比具有许多空位的序列比对更高的分值。通常使用“仿射空位成本(affinegap cost)”，其对空位的存在索取相对高的成本，而对空位中每一个后续的残基索取较小的罚分。这是最常用的空位打分系统。当然，高的空位罚分将会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许待修饰的空位罚分。然而，优选的是当使用此类软件进行序列比较时使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时,对于氨基酸序列的默认空位罚分为：空位-12，每个空位延伸-4。
最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux等人1984Nuc.Acids Research[核酸研究]12第387页)。可进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等人，1999，同上)、FASTA(Altschul等人，1990J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]403-410)和GENEWORKS比较工具包。BLAST和FASTA都可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999，同上)。然而，对于某些应用，优选使用GCG Bestfit程序。一种称为BLAST 2 Sequences的新工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列。
尽管最终的％同源性可以按照同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于全或无配对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵(scaled similarity score matrix)，该矩阵基于化学相似性或进化距离对每一成对比较赋予分值。通常使用的这样的矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见使用手册)。对于某些应用，优选使用GCG软件包的公用默认值，或者在其他软件的情形中，使用默认矩阵，如BLOSUM62。
可替代地，基于类似于CLUSTAL的一种算法，可以使用DNASISTM(Hitachi Software[日本日立软件公司])中的多重比对功能计算同源性百分比(Higgins DG和Sharp PM(1988)，同上)。
一旦软件已经产生最佳比对就可以计算％同源性，优选％序列同一性。典型地，作为序列比较的一部分软件进行此计算，并且生成数值结果。
序列还可以具有产生沉默改变和导致功能上等价的物质的氨基酸残基的缺失、插入或取代。只要保留物质的二级结合活性，可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的含不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如根据下表，可以进行保守取代。第二列相同框中的氨基酸，优选第三列相同行的氨基酸可以彼此取代：
本发明还涵盖可能出现的同源取代(取代和替换两者在本文中用于意指现有氨基酸残基与替代性残基的互换)，即对等取代，例如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等。也可能发生非同源取代，即从一类残基至另一类氨基酸或可替代地包含非天然氨基酸例如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡喃丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯基甘氨酸。
替换也可以通过非天然氨基酸进行，包括：α*和α-二取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物例如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯基丙氨酸*、p-Br-苯基丙氨酸*、p-I-苯基丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-戊氨酸*、缬氨酸，对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物例如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(苄基)*。出于上面论述的目的(与同源性或非同源性取代相关)，符号*用于指衍生物的疏水性质，而#用于指衍生物的亲水性质，#*指两亲特性。
变体氨基酸序列可以包括适合的可插入在该序列的任何两个氨基酸残基之间的间隔基团，包括除了氨基酸间隔物(例如甘氨酸或β-丙氨酸残基)之外的烷基基团，例如甲基、乙基或丙基基团。变异的另外的形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为避免疑义，“该类肽形式”用来指代变体氨基酸残基，其中该α-碳取代基团在该残基的氮原子上，而不是在该α-碳上。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS[美国国家科学院院刊](1992)89(20),9367-9371以及Horwell DC，Trends Biotechnol.[生物技术趋势](1995)13(4),132-134。
用于本发明的核苷酸序列可在它们中包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸作出的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可以通过本领域可用的任何方法修饰。可进行此类修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列。
不与本发明的序列100％同源但属于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体(例如来自不同群体的个体)制备的DNA文库来获得。此外，可获得其他同源物并且此类同源物及其片段通常将能够选择性杂交至本文序列表中所示的序列。此类序列可通过这样获得：从其他动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格条件下用包含于随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针来探测这些文库。类似的考虑用来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用被设计来靶向变体和同源物内这样的序列的引物，所述序列编码本发明序列内的保守氨基酸序列。保守序列可例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，GCG威斯康星PileUp程序是广泛使用的。
简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置，并将在比用于以单序列引物从已知序列克隆序列的那些严格条件低的严格条件下使用。
可替代地，此类多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中，这可能是有用的。其他序列改变可能是希望的以便引入限制性酶识别位点，或以便改变多核苷酸编码的多肽的特性或功能。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、替代性的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记上显示标记(revealing label)的探针)，或者可将多核苷酸克隆进载体中。此类引物、探针和其他片段的长度将为至少15个，优选至少20个，例如至少25个、30个或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明多核苷酸所涵盖。
根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。
一般地，引物可以通过合成方法制备，包括一次一个核苷酸地逐步制备希望的核酸序列。利用自动化技术完成这些工艺的技术是本领域轻易获得的。
较长的多核苷酸通常将用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。引物可被设计为含有适合的限制性酶识别位点，使得可将扩增的DNA克隆进适合的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或能够杂交至本发明的序列或杂交至与本发明序列互补的序列的序列。
如本文所使用的，术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。
本发明还涵盖能杂交至与本文给出的序列互补的序列的核苷酸序列或其任何片段或衍生物的用途。
术语“变体”还涵盖与能够杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。
优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在中严格条件(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
更优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在高严格条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
本发明还涉及可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的核苷酸序列。
本发明还涉及这样的核苷酸序列，该核苷酸序列与可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的序列互补。
也包括在本发明范围内的是能够在中等到最大严格条件下与本文提供的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。
在一个优选的方面，本发明涵盖在严格条件下(例如50℃和0.2xSSC)可与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
在一个更优选的方面，本发明涵盖在高严格条件下(例如65℃和0.1xSSC)可与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
分子进化
作为非限制性实例，可以在体内或体外产生许多位点定向或随机突变到核苷酸序列中，并随后通过各种方式筛选编码多肽的改善的功能。
此外，多核苷酸序列的突变或天然变体可以与野生型或其他突变或天然变体重组以产生新的变体。也可以筛选此类新变体以改善编码的多肽的功能。新的优选变体的生产可以通过本领域已建立好的各种方法来实现，例如错误阈值诱变(WO 92/18645)、寡核苷酸介导的随机诱变(US 5,723,323)、DNA改组(US 5,605,793)、外显子介导的基因组装WO 00/58517。这些和类似的随机定向分子进化方法的应用允许鉴定和选择具有优选特征的本发明的酶的变体，而没有蛋白质结构或功能的任何先验知识，并且允许产生不可预测但有益的突变或变体。在本领域中有许多用于优化或改变酶活性的分子进化的应用的实例，这样的实例包括但不限于以下的一个或多个：
在宿主细胞中或体外优化的表达和/或活性、
增加的酶活性、改变的底物和/或产物特异性、
增加或降低的酶或结构稳定性、
在优选的环境条件下(例如温度、pH、底物)改变的酶活性/特异性。
定点诱变
一旦已经分离出编码蛋白质的核苷酸序列，或者已经鉴定了推定的编码蛋白质的核苷酸序列，就可能希望突变该序列以制备本发明的蛋白质。
可以使用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸包括侧接希望突变的位点的核苷酸序列。
Morinaga等人(Biotechnology[生物技术](1984)2，第646-649页)公开了一种合适的方法。在Nelson和Long(Analytical Biochemistry[分析生物化学](1989)，180，第147-151页)中描述了将突变引入编码酶的核苷酸序列的另一种方法。
重组
在一个方面，用于本发明的序列是重组序列-即使用重组DNA技术已经制备的序列。
这些重组DNA技术在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术解释在文献中，例如，J.Sambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验室手册]，第2版，第1-3册，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]中。
合成的
在一个方面，用于本发明的序列是合成序列-即通过体外化学或酶促合成已经制备的序列。它包括但不限于用宿主生物体的最佳密码子使用产生的序列，例如甲基营养酵母毕赤酵母和汉逊酵母。
表达
酶的表达
可将用于本发明的核苷酸序列掺入重组体复制型载体中。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或从相容宿主细胞复制和表达核苷酸序列(以蛋白质/酶形式)。
可用控制序列(例如调控序列)控制表达。
由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列产生的蛋白质可被分泌或者可包含在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。编码序列可被设计具有信号序列，该信号序列引导编码该物质的序列穿过特定的原核或真核细胞膜分泌。
表达载体
术语“表达载体”意指能够在体内或体外进行表达的构建体。
优选地，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组中。术语“掺入”优选涵盖基因组中的稳定掺入。
本发明的核苷酸序列可存在于载体中，在该载体中该核苷酸序列有效地连接到调控序列，该调控序列能够在由合适的宿主生物体表达该核苷酸序列中发挥作用。
可将用于本发明的载体转化进如下文所述的合适宿主细胞中以提供本发明的多肽的表达。
载体(例如质粒、粘粒或噬菌体载体)的选择将通常取决于待将其引入的宿主细胞。
用于本发明的载体可含有一种或多种可选标记基因-如赋予抗生素抗性，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。可替代地，该选择可通过共转化来完成(如WO 91/17243中所描述的)。
载体可在体外用于例如产生RNA或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因而，在进一步的实施例中，本发明提供通过如下步骤制备本发明的核苷酸序列的方法：将本发明的核苷酸序列引入复制型载体内，将该载体引入相容的宿主细胞内，并在引起该载体复制的条件下培养该宿主细胞。
该载体可另外包含使得该载体能在所考虑的宿主细胞中复制的核苷酸序列。此类序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
调控序列
在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列有效地连接到调控序列，该调控序列能够提供核苷酸序列的表达，例如通过所选择的宿主细胞表达。举例来说，本发明涵盖包含有效地连接到这样的一种调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即该载体是表达载体。
术语“有效地连接”指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。调控序列“有效地连接”至编码序列是以使得该编码序列的表达能在与该控制序列相容的条件下实现的方式连接。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其他表达调节信号。
术语“启动子”是以本领域的标准意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
编码本发明的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源调控区(例如，启动子、分泌前导区和终止子区)来实现。
优选地，根据本发明的核苷酸序列有效地连接到至少一个启动子。
其他启动子还可用于引导本发明的多肽的表达。
适用于引导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的示例是本领域所熟知的。
启动子可额外包括用于确保或用于增加在合适宿主中的表达的特征物。例如，所述特征物可以是保守区，例如Pribnow盒或TATA盒。
构建体
术语“构建体”-其与术语例如“结合物”、“盒”和“杂交体”同义-包括直接或间接附接至启动子的用于根据本发明的用途的核苷酸序列。
间接附接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列中间提供合适的间隔基团例如内含子序列，例如Sh1-内含子或ADH内含子。与本发明相关的术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接附接。在一些情况下，该术语不涵盖这样的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合：其通常与野生型基因启动子相关联并且当它们二者均处于其天然环境中时。
构建体可甚至含有或表达标记，该标记允许该遗传构建体的选择。
对于某些应用，优选的是，本发明的构建体至少包含有效地连接到启动子的本发明的核苷酸序列。
宿主细胞
与本发明有关的术语“宿主细胞”包括含有该核苷酸序列或表达载体并用于重组产生具有本文所定义的特定性质的蛋白质的任何细胞。
因而，本发明的另一个实施例提供用表达本发明的蛋白质的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。可以对细胞进行选择以便和所述载体相容，这些细胞可以是例如原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。
合适的细菌宿主生物体的示例是革兰氏阳性细菌物种或革兰氏阴性细菌物种。
取决于编码本发明多肽的核苷酸序列的性质和/或进一步加工表达的蛋白质的需要，可以优选真核宿主例如酵母或其他真菌。一般地，酵母比真菌细胞更为优选，这是因为它们更易于操作。然而，一些蛋白质从酵母分泌不佳，或在某些情况下不能适当地加工(例如在酵母中过度糖基化)。在这些情况下，应当选择不同的真菌宿主微生物。
合适宿主细胞-例如酵母、真菌和植物宿主细胞-的使用可提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，可能需要这些用于给本发明的重组表达产物赋予最佳的生物学活性。
宿主细胞可以是氨肽酶缺陷型或氨肽酶负性菌株。本发明还涉及生产亲本细胞的突变细胞的方法，其包括破坏或缺失编码多肽的核酸序列或其控制序列，其导致突变细胞比亲本细胞产生更少的多肽。
具有降低的氨肽酶活性的菌株的构建可以方便地通过修饰或灭活在细胞中表达具有氨肽酶活性的多肽所必需的核酸序列来完成。
生物体
与本发明有关的术语“生物体”包括任何生物体，其可包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，并且/或者其中启动子可允许当存在于该生物体中时根据本发明的核苷酸序列表达。
合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
与本发明有关的术语“转基因生物体”包括任何生物体，其包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，并且/或者其中启动子可允许根据本发明的核苷酸序列在该生物体内表达。优选地，所述核苷酸序列掺入生物体的基因组中。
术语“转基因生物体”不涵盖处于其天然环境中且当它们处于它们的天然启动子(也处于其天然环境中)的控制之下时的天然核苷酸编码序列。
因而，本发明的转基因生物体包括包含如下中的任一种或如下的组合的生物体：编码根据本发明的多肽的核苷酸序列、根据本发明的构建体、根据本发明的载体、根据本发明的质粒、根据本发明的细胞、根据本发明的组织或它们的产物。
例如，转基因生物体可还包含处于异源启动子的控制下的编码本发明的多肽的核苷酸序列。
宿主细胞/生物体的转化
如较早指出的，宿主生物体可以是原核或真核生物体。适宜的原核宿主的实例包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
关于原核宿主转化的教导在本领域中有充分的记载，例如参见Sambrook等人(同上)。如果使用原核生物宿主，则该核苷酸序列可能需要适当地进行修饰后再进行转化，例如通过去除内含子来进行修饰。
可用本领域已知的多种方法转化丝状真菌细胞-例如涉及原生质体形成和原生质体转化以及随后的以已知的方式再生细胞壁的方法。使用曲霉属作为宿主微生物描述在EP0 238 023中。
另一种宿主生物可以是植物。用于转化植物的通用技术的综述可以在Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[植物生理学和植物分子生物学年鉴]),1991,42:205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech[农业食品工业高科技]1994年3月/4月，17-27)的文章中找到。关于植物转化的进一步的教导可以在EP-A-0449375中找到。
关于真菌、酵母和植物的转化的通用教导在以下部分中提供。
转化的真菌
宿主生物体可以是真菌例如霉菌。适合的这样的宿主的实例包括属于嗜热真菌属、支顶孢属、曲霉属、青霉属、毛霉属、脉孢菌属、木霉属等属的任何成员。
在一个实施例中，宿主生物体可以是丝状真菌。
在US-A-5741665中讨论了转化丝状真菌，其中说明用于转化丝状真菌和培养真菌的标准技术是本领域熟知的。发现适用于粗糙脉孢菌(N.crassa)的技术的广泛综述，例如在Davies和de Serres，Methods Enzymol[酶学方法](1971)17A:79-143中。
也可用于转化丝状真菌的进一步的教导在US-A-5674707中进行了综述。
此外，丝状真菌中的基因表达在Punt等人(2002)Trends Biotechnol[生物技术趋势]2002年5月；20(5):200-6，Archer和Peberdy,Crit Rev Biotechnol[生物技术关键评论](1997)17(4):273-306中教导。
本发明涵盖使用这些标准技术制备的根据本发明的转基因的丝状真菌的生产。
在一个方面，宿主生物体可以属于曲霉属，例如黑曲霉(Aspergillus niger)。
根据本发明的转基因的曲霉菌也可以通过以下例如Turner G.1994(Vectors forgenetic manipulation[用于遗传操作的载体]，在：Martinelli S.D.,Kinghorn J.R.(编辑)Aspergillus:50 years on.Progress in industrial microbio-logy[曲霉属：在工业微生物学中的进展的50年]，第29卷，阿姆斯特丹爱思唯尔(Elsevier)1994.第641-666页)的教导来制备。
一方面，宿主生物体可以是木霉属(Trichoderma)的，例如里氏木霉(TrichodermaReesei)。
转化的酵母
在另一个实施例中，转基因的生物体可以是酵母。
在例如分子生物学方法(Methods Mol Biol)(1995)，49:341-54和生物技术新见(Curr Opin Biotechnol)(1997)10月；8(5):554-60中提供了酵母中异源基因表达的原理的综述。
在这方面，酵母-例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见FEMS Microbiol Rev[FEMS微生物评论](2000，24(1):45-66)可用作异源基因表达的运载体。
在酿酒酵母中的异源基因表达的原理和基因产物分泌的综述由E Hinchcliffe、EKenny(1993，“Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes[酵母作为异源基因表达的运载体]”，Yeasts[酵母]，第5卷，Anthony H Rose和J StuartHarrison，编辑，第2版，Academic Press Ltd.[学术出版社])给出。
对于酵母的转化，已经开发了若干种转化方案。例如，根据本发明的转基因的酵母菌可以通过以下教导来制备：Hinnen等人(1978，PNAS USA[美国国家科学院院刊]75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature[自然]，275，104)；和Ito,H等人(1983，J Bacteriology[细菌学杂志]153,163-168)。
转化的酵母细胞可以使用各种选择性标记(例如营养缺陷型标记显性抗生素抗性标记)来选择。
培养和生产
用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可在有利于产生所编码的多肽并且有利于从细胞和/或培养基回收所述多肽的条件下培养。
用于培养细胞的培养基可以是适合于培养所考虑的宿主细胞和获得所述多肽的表达的任何常规培养基。
由重组细胞产生的蛋白质可呈现在细胞的表面。
蛋白质可从宿主细胞分泌并且可方便地用熟知的工序从培养基回收。
分泌
通常，期望蛋白质从表达宿主分泌进培养基中，从培养基可更容易回收蛋白质。根据本发明，可根据所需的表达宿主选择分泌前导序列。杂交体信号序列也可用于本发明的上下文中。
异源分泌前导序列的典型实例是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(例如来自曲霉属的glaA-，18个和24个氨基酸型两者)、α-因子基因(酵母例如酵母属、克鲁维酵母属和汉逊酵母属)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的那些。
举例来说，在Methods Enzymol[酶学方法](1990)182:132-43中综述了异源蛋白质在大肠杆菌中的分泌。
检测
用于检测和测量氨基酸序列表达的各种方案在本领域中是已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)以及荧光激活细胞分选术(FACS)。
大量不同的标记和缀合技术是本领域技术人员已知的，并且可以用于不同的核酸和氨基酸测定中。
许多公司，例如Pharmacia Biotech(新泽西州皮斯卡塔韦)，威斯康辛州麦迪逊普洛麦格公司(Promega，Madison，WI)和俄亥俄州克利夫兰美国生物化学公司(BiochemicalCorp，Cleveland，OH)提供用于这些程序的商业试剂盒和试验方案。
合适的报告分子或标记包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光或显色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。教导使用此类的标记的专利包括US 3,817,837；US，850,752；US 3,939,350；US 3,996,345；US 4,277,437；US 4,275,149和US 4,366,241。
而且，可以如US 4,816,567所示制备重组免疫球蛋白。
融合蛋白
根据本发明使用的氨基酸序列可以作为融合蛋白产生，例如有助于提取和纯化。融合蛋白伴侣的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和(β-半乳糖苷酶)。还可方便地在融合蛋白伴侣和目的蛋白序列之间包括进蛋白水解切割位点，以允许除去融合蛋白序列。
优选地，融合蛋白将不妨碍蛋白序列的活性。
在大肠杆菌中的基因融合表达系统已经在生物技术新见(Curr OpinBiotechnol)(1995)6(5):501-6中进行了综述。
在本发明的另一个实施例中，氨基酸序列可以连接到异源序列以编码融合蛋白。例如，为了筛选能够影响物质活性的试剂的肽文库，编码表达由可商购的抗体识别的异源表位的嵌合物质可能是有用的。
额外的目的蛋白质(POI)
根据本发明使用的序列还可以与一种或多种额外的目的蛋白质(POI)或目的核苷酸序列(NOI)结合使用。
POI的非限制性实例包括：淀粉代谢中涉及的蛋白质或酶；糖原代谢中涉及的蛋白质或酶；乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、三肽基外肽酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、脯氨酸内切蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、外切蛋白酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、氨肽酶、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC1.1.3.5)、或其组合。NOI甚至可以是任何这些序列的反义序列。
POI甚至可以是融合蛋白，例如以帮助提取和纯化。
POI甚至可以与分泌序列融合。
其他序列也可以促进分泌或提高分泌的POI的产量。这样的序列可以编码伴侣蛋白，例如英国专利申请9821198.0中所述的黑曲霉cyp B基因的产物。
可以改造NOI以改变其活性的原因有很多，包括但不限于改变其表达产物的加工和/或表达的改变。通过进一步的实例，也可以修改NOI以优化特定宿主细胞中的表达。为了引入限制酶识别位点，可能需要其他序列的改变。
NOI中可以包括合成的或修饰的核苷酸-例如甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架。
NOI可以被修饰以增加细胞内稳定性和半衰期。可能的修饰包括但不限于在分子的骨架内添加分子的5'和/或3'端的侧翼序列或使用硫代磷酸酯或2'O-甲基而不是磷酸二酯酶键。
一般的重组DNA方法技术
除非另外指明，否则本发明采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力之内。这些技术在文献中进行了解释。参见，例如，J.Sambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验室手册]，第2版，第1-3册，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]；Ausubel,F.M.等人(1995和定期补充；Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法]，第9、13和16章，John Wiley and Sons，Inc.，NY[约翰威利父子公司,纽约州])；B.Roe、J.Crabtree、A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques[DNA分离和测序：基本技术]，John Wiley&Sons[约翰威利父子公司])；M.J.Gait(编辑)，1984年，Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach[寡核苷酸合成：实用方法]，Irl出版社；以及，D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and PhysicalAnalysis of DNA[酶学方法：DNA结构，部分A：DNA的合成和物理分析]，Methods in Enzymology[酶学方法]，Academic Press[学术出版社]。这些一般性文本中的每一个以引用方式并入本文。
实例
本公开在以下实例中进一步详细描述，所述实例不意欲以任何方式限制本公开所要求保护的范围。附图意在被考虑为本公开说明书和描述的组成分。提供下列实例以说明但不限制所要求保护的公开内容。
实例1-TRI031、TRI032、TRI033、TRI034、TRI035、TRI036、TRI037、TRI038的克隆和转化
编码真菌氨肽酶-2型(pepN_2，属于Merops家族M28.008.；merops.sanger.ac.uk/)的合成基因(TRI031、TRI032、TRI033、TRI034、TRI035、TRI036、TRI037、TRI038)是从Geneart(Life Technologies[生命技术公司])订购作为用于在里氏木霉中表达的密码子优化的基因。TRI031对应于来自费希新萨托菌NRRL 181的NCBI登录号：XP_001258675；TRI032对应于来自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)42464的NCBI登录号：XP_003667354；TRI033对应于来自尖孢镰孢菌Fo5176的NCBI登录号：EGU74500；TRI034对应于来自尖孢镰孢菌古巴专化型1号生理小种(Fusariumoxysporum f.sp.cubense race 1)的NCBI登录号：ENH69875；TRI035对应于来自棒曲霉NRRL 1的NCBI登录号：XP_001273779；TRI036对应于NCBI登录号：EGS23402嗜热毛壳菌嗜热变种菌DSM 1495；TRI037对应于来自土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624的NCBI登录号：XP_001217759；并且TRI038对应于来自构巢曲霉FGSC A4的NCBI登录号：XP_681714。
该基因与编码区侧翼的Gateway特异性重组位点(attB1和attB2)(LifeTechnologies[生命技术公司])一起订购，并作为pDonr221Gateway载体(LifeTechnologies[生命技术公司])中的质粒贮液递送。TRI031、TRI032、TRI033、TRI034、TRI035、TRI036、TRI037、TRI038氨基酸序列具有预测的分泌信号序列(SignalP 4.0：鉴别来自跨膜区的信号肽,Thomas Nordahl Petersen、 Brunak、Gunnar von Heijne和Henrik Nielsen.Nature Methods[自然方法]，8:785-786,2011)并且这些同源信号序列被含有Kozak序列的前导序列(即来自里氏木霉酸性真菌蛋白酶(AFP)的分泌信号序列)和来自里氏木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA1)的内含子替换(参见图1)。
使用LR CLONASETM酶混合物(Life Technologies[生命技术公司])将pDonr221载体中的合成基因重组进目的载体pTrex8gM，得到表达载体pTrex8gM_TRI031(SEQ ID NO:9)、pTrex8gM_TRI032(SEQ ID NO:10)、pTrex8gM_TRI033(SEQ ID NO:11)、pTrex8gM_TRI034(SEQ ID NO:12)、pTrex8gM_TRI035(SEQ ID NO:13)、pTrex8gM_TRI036(SEQ ID NO:14)、pTrex8gM_TRI037(SEQ ID NO:15)、和pTrex8gM_TRI038(SEQ ID NO:16)。
基本上如(US 8,592,194B2)中所述，使用PEG介导的原生质体转化将1.5μg-17μg表达载体单独转化到里氏木霉菌株CellulightTM中。如所示，使用具有轻微修饰的PEG-原生质体方法进行转化。对于原生质体制备，孢子在26℃处在具有10mM尿苷的木霉属萌发培养基中生长约18小时以补充pyr营养缺陷型。(木霉属萌发培养基：40ml 50％葡萄糖，2g/L蛋白胨，15g/L KH2PO4，5g/L(NH4)2SO4，2.4ml 1M MgSO4，4.1ml 1M CaCl2，1ml 400X里氏木霉微量元素溶液(200g/L FeSO4x 7H2O，16g/L ZnSO4x 7H2O，1.4g/L MnSO4x H2O，3.2g/LCuSO4x 5H2O，0.8g/L H3BO3，175g/L柠檬酸))以200rpm的摇床转速进行。将发芽孢子通过离心收获，洗涤并用45mg/ml的裂解酶溶液(哈茨木霉(Trichoderma harzianum，西格玛公司目录号L1412))处理以裂解真菌细胞壁。通过标准方法对原生质体进行进一步制备，如通过等人(基因(Gene)61(1987)155-164)所述的。
通常，将含有1.5μg-17μg DNA和约5×107原生质体的总体积为200μL的转化混合物用2mL 25％PEG溶液处理，用2体积的1.2M山梨醇/10mM Tris，pH 7.5/10mM CaCl2溶液稀释，与3％选择性顶层琼脂糖，1M山梨醇，10mM NH4Cl，1×MM溶液(2×MM溶液：30g/L KH2PO4，20mL1M乙酰胺，20ml 1M CsCl，6ml 20％MgSO4×7H2O，6ml 20％CaCl2×2H2O，2ml里氏木霉微量元素溶液(400×)，80ml 50％葡萄糖，补充至1升，pH 4.5)混合，并倒入含有10mMNH4Cl的MM平板上(MM平板2％琼脂，1x MM溶液)。选择转化体用于在MM平板(缺乏尿苷)上的原养型生长。平板在28℃处孵育5至7天，直到发生孢子形成。将稳定寻找的转化体转移至具有10mM NH4Cl的新的MM平板以更好地形成孢子。当孢子形成时，使用0.85％NaCl，0.015％80的溶液收获孢子。使用孢子悬浮液以24孔微量滴定板格式(用于筛选)或摇瓶(用于验证研究)接种液体培养物。在3mL YEG培养基(5g/L酵母提取物，22g/L葡萄糖，H2O)中预培养，在以下生产培养基中主培养：(生产培养基：35g/L 61％葡萄糖/槐糖混合物，9g/L酪蛋白氨基酸，5g/L(NH4)2SO4，4.5g/L KH2PO4，1g/L CaCl2x 2H2O，1g/L MgSO4x 7H2O，33g/L PIPPS缓冲液，pH 5.5，2.5mL/L的400X里氏木霉微量元素(175g/L柠檬酸，200g/L FeSO4x7H2O，16g/L ZnSO4x 7H2O，3.2g/L CuSO4x 5H2O，1.4g/L MnSO4x H2O，0.8g/L硼酸)pH 5.5。添加3ml生产培养基，以在24孔微量滴定板中产生变体。对于摇瓶而言，按比例放大体积。
将培养物在28℃和80％湿度下生长7天，并在180rpm下振摇。通过真空过滤收集培养上清液，并使用培养上清液测定它们的性能以及表达水平。
下面描述了pepN_2酶的氨基酸和核苷酸序列：
SEQ ID NO:1＝TRI031的氨基酸序列。图1中描述的前导序列编码的分泌信号加了下划线：
MQTFGAFLVSFLAASGLAAANGPGWDWKPPVHPKVLPQMIHLWDLMHGAQKLEDFAYAYPERNRVFGGPAHEDTVNYLYRELKKTGYYDVYKQPQVHQWTRADQALTVDGKSYVATTMTYSPSVNVTAPLAVVNNLGCVESDYPADLKGKIALVSRGECPFATKSVLSAKAGAAAALVYNNIEGSMAGTLGGPTSELGPYAPIAGISLADGQALIQMIQAGTVTANLWIDSKVENRTTYNVIAQTKGGDPNNVVALGGHTDSVEAGPGINDDGSGIISNLVVAKALTRFSVKNAVRFCFWTAEEFGLLGSSYYVNSLNATEKAKIRLYLNFDMIASPNYALMIYDGDGSAFNLTGPAGSAQIERLFEDYYKSIRKPFVPTEFNGRSDYEAFILNGIPAGGIFTGAEAIKTEEQAKLFGGQAGVALDANYHAKGDNMTNLNREAFLINSKATAFAVATYANSLDSIPSRNMSTVVKRSQLEQAKKSTPHTHTGGTGCYKDRVEQ(Seq ID no 1)
不含有加下划线的前导序列的序列是指示的SEQ ID NO:18。
SEQ ID NO:2＝TRI032的氨基酸序列。图1中描述的前导序列编码的分泌信号加了下划线。
MQTFGAFLVSFLAASGLAAAGGHGGSSGLGCDSQRPLVSSEKLQSLIKKEDLLAGSQELQDIATAHGGHRAFGSSGHNATVDFLYYTLKALDYYNVTKQPFKEIFSSGTGSLTVDGEDIEAETLTYTPSGSATDKPVVVVANVGCDAADYPAEVAGNIALIKRGTCTFSQKSVNAKAAGAVAAIIYNNAEGKLSGTLGQPFLDYAPVLGITLEAGEALLAKLAGGPVTATLQIDALVEERVTYNVIAETKEGDHSNVLVLGGHTDSVPAGPGINDDGSGTIGMLTVAKALTKFRVKNAVRFAFWSAEEYGLLGSYAYIKSINSSAAELSKIRAYLNFDMIASPNYIYGIYDGDGNAFNLTGPAGSDVIERNFENFFKRKHTPSVPTEFSGRSDYAAFIENGIPSGGLFTGAEVLKTEREAELFGGRAGVAYDVNYHQAGDTVDNLALDAFLLNTKAIADSVATYALSFDGLPRVDGKKRRWDAHRARMLKRSAGSHGHAHLHSGPCGGGASI(Seq ID no 2)
不含有加下划线的前导序列的序列是指示的SEQ ID NO:19。
SEQ ID NO:3＝TRI033的氨基酸序列。图1中描述的前导序列编码的分泌信号加了下划线。
MQTFGAFLVSFLAASGLAAATKKPLVNELKLQKDINIKDLMAGAQKLQDIAEANGNTRVFGGAGHNATVDYLYKTLKATGYYNVKKQPFTELYSAGTASLKVDGDDITAAIMTYTPAGEATGPLVVAENLGCEASDFPAESEGKVVLVLRGECPFSQKSTNGKTAGAAAVIVYNNVPGELAGTLGEPFGEFAPIVGISQEDGQAILAKTKAGEVTVDLKVDATVENRVTFNVIAETKEGDHDNVLVVGGHSDSVAAGPGINDDGSGIIGILKVAQALTKYRVKNAVRFGFWSAEEFGLLGSYAYMKSINGSDAEVAKIRAYLNFDMIASPNYVYGIYDGDGSAFNLTGPAGSDAIEKDFERFFKTKRLGYVPSEFSGRSDYAAFIENGIPSGGLFTGAEQLKTEEEAKKFGGEAGVAYDINYHKIGDDINNLNKEAFLVNTQAIANSVARYAKTWKSLPKVTHNTRRWDAEVASVLKRSSGHSHAGGPCGSVSV(Seq ID no 3)不含有加下划线的前导序列的序列是指示的SEQ ID NO:20。
SEQ ID NO:4＝TRI034的氨基酸序列。图1中描述的前导序列编码的分泌信号加了下划线。
MQTFGAFLVSFLAASGLAAALQIPLNLQVPKLSWNLFGDDLPLVDTKELQKSIKPENLEARAKDLYEIAKNGEEEYGHPTRVIGSEGHLGTLSYIHAELAKLGGYYSVSNQQFPAVSGNVFESRLVIGDSVPKQASPMGLTPPTKNKEPVHGTLVLVDNEGCDASDYPEAVKGNIALILRGTCPFGTKSGNAGKAGAVAAVVYNYEKDEVHGTLGTPSPDHVATFGLGGEEGKAVAKKLKDGEKVDAIAYIDAEVKTISTTNIIAQTRGGDPDNCVMLGGHSDSVAEGPGINDDGSGSISVLEVAVQLTKYRVNNCVRFAWWAAEEEGLLGSDHYVSVLPEDENRKIRLFMDYDMMASPNFAYQIYNATNAENPKGSEELRDLYVNWYEEQGLNYTFIPFDGRSDYDGFIRGGIPAGGIATGAEGVKTEDEVEMFGGEAGVWYDKNYHQIGDDLTNVNYTAWEVNTKLIAHSVATYAKSFKGFPEREIETSVQTYSDKTKYHGSKLFI(Seq ID no 4)
不含有加下划线的前导序列的序列是指示的SEQ ID NO:21。
SEQ ID NO:5＝TRI035的氨基酸序列。图1中描述的前导序列编码的分泌信号加了下划线。
MQTFGAFLVSFLAASGLAAANAPGGPGGHGRKLPVNPKTFPNEIRLKDLLHGSQKLEDFAYAYPERNRVFGGQAHLDTVNYLYRELKKTGYYDVYKQPQVHQWTRADQSLTLGGDSIQASTMTYSPSVNVTAPLSLVSKLGCAEGDYSADVKGKIALVSRGECSFAQKSVLSAKAGAVATIVYNNVDGSLAGTLGGATSELGPYSPIIGITLAAGQDLVARLQAAPTEVSLWIDSKVENRTTYNVIAQTKGGDPNNVVALGGHTDSVENGPGINDDGSGVISNLVVAKALTRYSVKNAVRFCFWTAEEFGLLGSNYYVDNLSPAELAKIRLYLNFDMIASPNYALMIYDGDGSAFNLTGPPGSAQIESLFENYYKSIKQGFVPTAFDGRSDYEGFILKGIPAGGVFTGAESLKTEEQARLFGGQAGVALDANYHAKGDNMTNLNHKAFLINSRATAFAVATYANNLSSIPPRNATVVKRESMKWTKREEPHTHGADTGCFASRVKE(Seq ID no 5)
不含有加下划线的前导序列的序列是指示的SEQ ID NO:22。
SEQ ID NO:6＝TRI036的氨基酸序列。图1中描述的前导序列编码的分泌信号加了下划线。
MQTFGAFLVSFLAASGLAAAGGPHGFGLPKIDLRPMVSSNRLQSMITLKDLMDGAKKLQDIATKNGGNRAFGGAGHNATVDYLYKTLTSLGGYYTVKKQPFKEIFSSGSGSLIVDGQGIDAGIMTYTPGGSATANLVQVANLGCEDEDYPAEVAGNIALISRGSCTFSSKSLKAKAAGAVGAIVYNNVPGELSGTLGTPFLDYAPIVGISQEDGQVILEKLAAGPVTATLNIDAIVEERTTYNVIAETKEGDHNNVLIVGGHSDSVAAGPGINDDGSGTIGILTVAKALAKANVRIKNAVRFAFWSAEEFGLLGSYAYMKSLNESEAEVAKIRAYLNFDMIASPNYIYGIYDGDGNAFNLTGPAGSDIIEKDFEDFFKKKKTPSVPTEFSGRSDYAAFIENGIPSGGLFTGAEVLKTEEEAKLFGGKAGVAYDVNYHKAGDTVDNLAKDAFLLNTKAIANSVAKYAASWAGFPKPSAVRRRYDADMAQLLKRSGGVHGHGPHTHSGPCGGGDLL(Seq ID no 6)
不含有加下划线的前导序列的序列是指示的SEQ ID NO:23。
SEQ ID NO:7＝TRI037的氨基酸序列。图1中描述的前导序列编码的分泌信号加了下划线。
MQTFGAFLVSFLAASGLAAAEGLGNHGRKLDPNKFTKDIKLKDLLKGSQKLEDFAYAYPERNRVFGGKAHQDTVNWIYNELKKTGYYDVYKQPQVHLWSNAEQSLTVDGEAIDATTMTYSPSLKETTAEVVVVPGLGCTAADYPADVAGKIALIQRGSCTFGEKSVYAAAANAAAAIVYNNVDGSLSGTLGAATSELGPYAPIVGISLADGQNLVSLAQAGPLTVDLYINSQMENRTTHNVIAKSKGGDPNNVIVIGGHSDAVNQGPGVNDDGSGIISNLVIAKALTKYSLKNSVTWAFWTAEEFGLLGSEFYVNSLSAAEKDKIKLYLNFDMIASPNYALMIYDGDGSTFNMTGPAGSAEIEHLFEDYYKSRGLSYIPTAFDGRSDYEAFILNGIPAGGLFTGAEQIKTEEQVAMFGGQAGVAYDPNYHAAGDNMTNLSEEAFLINSKATAFAVATYANSLESIPPRNATMSIQTRSASRRAAAHRRAAKPHSHSGGTGCWHTRVEL(Seq ID no 7)
不含有加下划线的前导序列的序列是指示的SEQ ID NO:24。
SEQ ID NO:8＝TRI038的氨基酸序列。图1中描述的前导序列编码的分泌信号加了下划线。
MQTFGAFLVSFLAASGLAAAGKHKPLVTPEALQDLITLDDLLAGSQQLQDFAYAYPERNRVFGGRAHDDTVNWLYRELKRTGYYHVYKQPQVHLYSNAEESLTVNGEAIEATTMTYSPSANASAELAVISGLGCSPADFASDVAGKVVLVQRGNCTFGEKSVYAAAADAAATIVYNNVEGSLSGTLGAAQSEQGPYSGIVGISLADGEALLALAEEGPVHVDLWIDSVMENRTTYNVIAQTKGGDPDNVVTLGGHSDSVEAGPGINDDGSGIISNLVIARALTKFSTKHAVRFFFWTAEEFGLLGSDYYVSSLSPAELAKIRLYLNFDMIASPNYGLLLYDGDGSAFNLTGPAGSDAIEKLFYDYFQSIGQATVETEFDGRSDYEAFILNGIPAGGVFTGAEEIKSEEEVALWGGEAGVAYDANYHQVGDTIDNLNTEAYLLNSKATAFAVATYANDLSTIPKREMTTAVKRANVNGHMHRRTMPKKRQTAHRHAAKGCFHSRVEQ(Seq ID no 8)
不含有加下划线的前导序列的序列是指示的SEQ ID NO:25。
SEQ ID NO:9＝pTrex8gM_TRI031表达构建体的核苷酸序列。
CTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGGTAAGTTGGCCTTGATGAACCATATCATATATCGCCGAGAAGTGGACCGCGTGCTGAGACTGAGACAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGGACCTGGATGGGATTGGAAGCCCCCCGTCCACCCCAAGGTCCTCCCCCAGATGATCCACCTCTGGGACCTCATGCACGGCGCCCAGAAGCTCGAAGATTTCGCCTACGCCTACCCCGAGCGCAACCGCGTCTTTGGCGGCCCTGCCCACGAGGACACCGTCAACTACCTCTACCGCGAGCTGAAGAAGACCGGCTACTACGACGTCTACAAGCAGCCCCAGGTCCACCAGTGGACCCGAGCCGATCAGGCCCTCACCGTCGACGGCAAGAGCTACGTCGCCACCACCATGACCTACAGCCCCAGCGTCAACGTCACCGCCCCTCTCGCCGTCGTCAACAACCTCGGCTGCGTCGAGAGCGACTACCCCGCCGACCTCAAGGGCAAGATCGCCCTCGTTTCTCGCGGCGAGTGCCCCTTCGCCACCAAGTCTGTCCTCAGCGCCAAGGCTGGCGCCGCTGCCGCTCTCGTCTACAACAACATCGAGGGCAGCATGGCCGGCACCCTCGGCGGACCTACTTCTGAGCTGGGCCCCTACGCCCCCATTGCCGGCATTTCTCTCGCCGACGGCCAGGCCCTCATCCAGATGATTCAGGCCGGCACCGTCACCGCCAACCTCTGGATCGACAGCAAGGTCGAGAACCGCACCACCTACAACGTCATTGCCCAGACCAAGGGCGGCGACCCCAACAACGTCGTCGCTCTCGGCGGCCACACCGACTCTGTTGAGGCTGGCCCTGGCATCAACGACGACGGCAGCGGCATCATCAGCAACCTCGTCGTCGCCAAGGCCCTCACCCGCTTCAGCGTCAAGAACGCCGTCCGCTTCTGCTTCTGGACCGCCGAAGAGTTCGGCCTCCTCGGCAGCAGCTACTACGTCAACAGCCTCAACGCCACCGAGAAGGCCAAGATCCGCCTCTACCTCAACTTCGACATGATCGCCAGCCCCAACTACGCCCTCATGATCTACGACGGCGACGGCAGCGCCTTCAACCTCACTGGCCCTGCTGGCAGCGCCCAGATCGAGCGCCTCTTCGAGGACTACTACAAGAGCATCCGCAAGCCCTTCGTCCCCACCGAGTTCAACGGCCGCAGCGACTACGAGGCCTTCATCCTCAACGGCATCCCCGCTGGCGGCATCTTCACTGGCGCCGAGGCCATCAAGACCGAGGAACAGGCCAAGCTGTTCGGCGGCCAGGCTGGCGTCGCCCTCGATGCCAACTACCACGCCAAGGGCGACAACATGACCAACCTCAACCGCGAGGCCTTCCTCATCAACAGCAAGGCCACCGCCTTCGCCGTCGCCACCTACGCCAACTCCCTCGACAGCATCCCCAGCCGCAACATGAGCACCGTCGTCAAGCGCAGCCAGCTTGAGCAGGCCAAGAAGTCCACCCCCCACACCCACACTGGCGGCACCGGCTGCTACAAGGACCGCGTCGAACAGTAAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGGCTAGCTAGTTACGCTTGTTTATTTACGACAAGATCTAGAAGATTCGAGATAGAATAATAATAATAACAACAATTTGCCTCTTCTTTCCACCTTTTCAGTCTTACTCTCCCTTCTGACATTGAACGCCTCAATCAGTCAGTCGCCTTGTACTTGGCACGGTAATCCTCCGTGTTCTTGATATCCTCAGGGGTAGCAAAGCCCTTCATGCCATCGATAATGTCATCCAGAGTGAGGATGGCAAAGATGGGGATGCCGTACTCCTTCCTCAGCTCGCCAATGGCACTCGGTCCAGGCTTGGAGTCGTCGCCATCCGCAGCGGGGAGCTTCTCCATGCGGTCCAGGGCCACGACGATGCCGGCGACGATGCCGCCCTCCTTGGTGATCTTCTCAATGGCGTCCCTCTTGGCGGTGCCGGCGGTGATGACGTCGTCGACAATCAGGACCCTCTTGCCCTTGAGCGAAGCGCCGACGATGTTGCCGCCCTCGCCGTGGTCCTTGGCCTCCTTGCGGTCAAACGAGTAGGAGACGCGGTCCAGGTTCTGGGGCGCCAGCTCGCCGAGCTTGATGGTGATGGCGGAGCACAGCGGGATGCCCTTGTAGGCCGGGCCGAAGACGATGTCGAACTCTAGGCCGGCCTTCTCCTGGGCCTCGATGATGGTCTTTGCAAAGGCGGAGGCGATGGCGCCGGCGAGGCGCGCCGTGTGGAATTCGCCCGCGTTGAAGAAGTAGGGGGATATCCGCTTGGACTTGAGCTCGAAGCTGCCAAACTTGAGGACGCCGCCGTCGATGGCGGATTTGAGGAAGTCCTGCTTGTAGGCAGGCAGCTGGGAGGTGGTAGCCATTCTGTTGGATTTGGATAGTGTCCTTATTCTCTGATTTGAACAGTAGATCAGGACGAGTGAGAGGGATGCAGAGGTTGGATTGGAGTGGTTGAGCTATAAAATTTAGAGGCGCGCCGTATCGAGTTTTCACATGGAAGTCAAAGCGTACAGTGCGAGCTTGTACGTTGGTCTTAGTATCCCACAAGCTTCTGTCTAGGTATGATGATGGCTATAAGTCACCCAAGGCAGAACTCATCTTGAAGATTGTCTAGAGTGATTTTACCGCTGATGAAATGACTGGACTCCCTCCTCCTGCTCTTATACGAAAAATTGCCTGACTCTGCAAAGGTTGTTTGTCTTGGAAGATGATGTGCCCCCCCATCGCTCTTATCTCATACCCCGCCATCTTTCTAGATTCTCATCTTCAACAAGAGGGGCAATCCATGATCTGCGATCCAGATGTGCTTCTGGCCTCATACTCTGCCTTCAGGTTGATGTTCACTTAATTGGTGACGAATTCAGCTGATTTGCTGCAGTATGCTTTGTGTTGGTTCTTTCCAGGCTTGTGCCAGCCATGAGCGCTTTGAGAGCATGTTGTCACCTATAAACTCGAGTAACGGCCACATATTGTTCACTACTTGAATCACATACCTAATTTTGATAGAATTGACATGTTTAAAGAGCTGAGGTAGCTTTAATGCCTCTGAAGTATTGTGACACAG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ID no 9)
SEQ ID NO:10＝pTrex8gM_TRI032表达构建体的核苷酸序列。
CTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGGTAAGTTGGCCTTGATGAACCATATCATATATCGCCGAGAAGTGGACCGCGTGCTGAGACTGAGACAGCGGCCTGGCCGCGGCCGGTGGACATGGTGGATCTTCAGGCCTCGGCTGCGACAGCCAGCGCCCTCTTGTCAGCAGCGAGAAGCTCCAGAGCCTGATCAAGAAGGAAGATCTCCTCGCCGGCAGCCAAGAGCTTCAGGACATTGCCACTGCCCACGGCGGCCACCGAGCCTTTGGAAGCTCTGGCCACAACGCCACCGTCGACTTTCTCTACTACACCCTCAAGGCCCTCGACTACTACAACGTCACCAAGCAGCCCTTCAAGGAAATCTTCAGCAGCGGCACCGGCAGCCTCACCGTGGACGGCGAGGACATCGAGGCCGAGACTCTCACCTACACCCCCAGCGGCAGCGCCACCGACAAGCCTGTCGTCGTCGTCGCCAACGTCGGCTGCGACGCCGCCGATTACCCTGCTGAGGTCGCCGGCAACATTGCCCTCATCAAGCGCGGCACGTGCACCTTCAGCCAGAAGTCCGTCAACGCCAAGGCCGCTGGCGCCGTCGCCGCCATCATCTACAACAACGCCGAGGGCAAGCTCAGCGGAACCCTCGGCCAGCCCTTCCTCGACTACGCTCCCGTCCTCGGCATCACCCTTGAGGCCGGCGAGGCCCTCCTCGCCAAGCTCGCTGGTGGCCCTGTCACCGCCACCCTCCAGATTGACGCCCTCGTCGAGGAACGCGTCACCTACAACGTCATTGCCGAGACTAAGGAAGGCGACCACAGCAACGTCCTCGTCCTCGGCGGCCACACCGATAGCGTCCCTGCTGGCCCTGGCATCAACGACGACGGCAGCGGCACCATCGGCATGCTCACTGTCGCCAAGGCCCTCACCAAGTTCCGCGTCAAGAACGCCGTCCGCTTCGCCTTCTGGTCCGCCGAGGAATACGGCCTCCTCGGCAGCTACGCCTACATCAAGAGCATCAACAGCTCTGCCGCCGAGCTGAGCAAGATCCGCGCCTACCTCAACTTCGACATGATCGCCAGCCCCAACTACATCTACGGCATCTACGACGGCGACGGCAACGCCTTCAACCTCACTGGCCCTGCCGGCAGCGACGTCATCGAGCGCAACTTCGAGAACTTCTTCAAGCGCAAGCACACCCCCTCCGTCCCCACCGAGTTTAGCGGCCGATCTGACTACGCCGCCTTCATCGAGAACGGCATCCCCAGCGGCGGACTCTTCACTGGCGCCGAGGTCCTCAAGACCGAGCGCGAGGCTGAGCTGTTTGGCGGCCGAGCTGGCGTCGCCTACGACGTCAACTACCACCAGGCCGGCGACACCGTCGACAACCTCGCCCTCGACGCCTTCCTGCTCAACACCAAGGCCATTGCCGACAGCGTCGCCACCTACGCCCTCAGCTTTGACGGCCTCCCTCGCGTCGACGGCAAGAAGCGACGTTGGGACGCTCACCGAGCCCGCATGCTCAAGCGATCTGCTGGCTCTCACGGCCACGCCCACCTTCACTCTGGCCCTTGTGGCGGCGGAGCCAGCATCTAAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGGCTAGCTAGTTACGCTTGTTTATTTACGACAAGATCTAGAAGATTCGAGATAGAATAATAATAATAACAACAATTTGCCTCTTCTTTCCACCTTTTCAGTCTTACTCTCCCTTCTGACATTGAACGCCTCAATCAGTCAGTCGCCTTGTACTTGGCACGGTAATCCTCCGTGTTCTTGATATCCTCAGGGGTAGCAAAGCCCTTCATGCCATCGATAATGTCATCCAGAGTGAGGATGGCAAAGATGGGGATGCCGTACTCCTTCCTCAGCTCGCCAATGGCACTCGGTCCAGGCTTGGAGTCGTCGCCATCCGCAGCGGGGAGCTTCTCCATGCGGTCCAGGGCCACGACGATGCCGGCGACGATGCCGCCCTCCTTGGTGATCTTCTCAATGGCGTCCCTCTTGGCGGTGCCGGCGGTGATGACGTCGTCGACAATCAGGACCCTCTTGCCCTTGAGCGAAGCGCCGACGATGTTGCCGCCCTCGCCGTGGTCCTTGGCCTCCTTGCGGTCAAACGAGTAGGAGACGCGGTCCAGGTTCTGGGGCGCCAGCTCGCCGAGCTTGATGGTGATGGCGGAGCACAGCGGGATGCCCTTGTAGGCCGGGCCGAAGACGATGTCGAACTCTAGGCCGGCCTTCTCCTGGGCCTCGATGATGGTCTTTGCAAAGGCGGAGGCGATGGCGCCGGCGAGGCGCGCCGTGTGGAATTCGCCCGCGTTGAAGAAGTAGGGGGATATCCGCTTGGACTTGAGCTCGAAGCTGCCAAACTTGAGGACGCCGCCGTCGATGGCGGATTTGAGGAAGTCCTGCTTGTAGGCAGGCAGCTGGGAGGTGGTAGCCATTCTGTTGGATTTGGATAGTGTCCTTATTCTCTGATTTGAACAGTAGATCAGGACGAGTGAGAGGGATGCAGAGGTTGGATTGGAGTGGTTGAGCTATAAAATTTAGAGGCGCGCCGTATCGAGTTTTCACATGGAAGTCAAAGCGTACAGTGCGAGCTTGTACGTTGGTCTTAGTATCCCACAAGCTTCTGTCTAGGTATGATGATGGCTATAAGTCACCCAAGGCAGAACTCATCTTGAAGATTGTCTAGAGTGATTTTACCGCTGATGAAATGACTGGACTCCCTCCTCCTGCTCTTATACGAAAAATTGCCTGACTCTGCAAAGGTTGTTTGTCTTGGAAGATGATGTGCCCCCCCATCGCTCTTATCTCATACCCCGCCATCTTTCTAGATTCTCATCTTCAACAAGAGGGGCAATCCATGATCTGCGATCCAGATGTGCTTCTGGCCTCATACTCTGCCTTCAGGTTGATGTTCACTTAATTGGTGACGAATTCAGCTGATTTGCTGCAGTATGCTTTGTGTTGGTTCTTTCCAGGCTTGTGCCAGCCATGAGCGCTTTGAGAGCATGTTGTCACCTATAAACTCGAGTAACGGCCACATATTGTTCACTACTTGAATCACATACCTAATTTTGATAGAATTGACATGTTTAAAGAGCTGAGGTAGCTTTAATGCCTCTGAAGTATTGTGACACAGCTTCTCACAGAGTGAGAATGAAAAGTTGGACTCCCCCTAATGAAGTAAAAGTTTCGTCTCTGAACGGTGAAGAGCATAGATCCGGCATCAACTACCTGGCTAGACTACGACGTCAATTCTGCGGCCTTTTGACCTTTATATATGTCCATTAATGCAATAGATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCAATTTCGCAGATCAAAGTGGACGTTATAGCATCATAACTAAGCTCAGTTGCTGAGGGAAGCCGTCTACTACCTTAGCCCATCCATCCAGCTCCATACCTTGATACTTTAGACGTGAAGCAATTCACACTGTACGTCTCGCAGCTCTCCTTCCCGCTCTTGCTTCCCCACTGGGGTCCATGGTGCGTGTATCGTCCCCTCCTTAATTAAGGCCATTTAGGCCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGCCTGCAGGGCCGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGGCCATTTAGGCCT(Seq ID no 10)
SEQ ID NO:11＝pTrex8gM_TRI033表达构建体的核苷酸序列。
CTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGGTAAGTTGGCCTTGATGAACCATATCATATATCGCCGAGAAGTGGACCGCGTGCTGAGACTGAGACAGCGGCCTGGCCGCGGCCACCAAGAAGCCCCTCGTCAACGAGCTGAAGCTCCAGAAGGACATCAACATCAAGGACCTCATGGCTGGCGCCCAGAAGCTCCAGGACATTGCCGAGGCCAACGGCAACACCCGCGTCTTTGGCGGCGCTGGCCACAACGCCACCGTCGACTACCTCTACAAGACCCTCAAGGCCACCGGCTACTACAACGTCAAGAAGCAGCCCTTCACCGAGCTGTACAGCGCCGGCACCGCCAGCCTCAAGGTCGACGGCGACGACATCACCGCCGCCATCATGACCTACACCCCTGCCGGCGAGGCCACCGGCCCTCTTGTCGTCGCTGAGAACCTTGGCTGCGAGGCCAGCGACTTCCCCGCTGAGTCTGAGGGCAAGGTCGTCCTCGTCCTCCGCGGCGAGTGCCCCTTCAGCCAGAAGTCCACCAACGGCAAGACTGCCGGCGCTGCCGCCGTCATCGTCTACAACAACGTCCCCGGCGAGCTGGCCGGCACTCTCGGCGAACCCTTTGGCGAGTTCGCCCCCATCGTCGGCATCAGCCAAGAGGACGGCCAGGCCATCCTCGCCAAGACCAAGGCCGGCGAGGTCACGGTCGACCTGAAGGTCGACGCCACGGTCGAGAACCGCGTCACCTTCAACGTCATTGCCGAGACTAAGGAAGGCGACCACGACAACGTCCTCGTCGTCGGCGGCCACTCTGATAGCGTCGCTGCCGGCCCTGGCATCAACGACGACGGCAGCGGCATCATCGGCATCCTCAAGGTCGCCCAGGCCCTCACCAAGTACCGCGTCAAGAACGCCGTCCGCTTCGGCTTCTGGTCCGCCGAAGAGTTCGGCCTCCTCGGCAGCTACGCCTACATGAAGTCGATCAACGGCTCCGACGCCGAGGTCGCCAAGATCCGCGCCTACCTCAACTTCGACATGATCGCCAGCCCCAACTACGTCTACGGCATCTACGACGGCGACGGCAGCGCCTTCAACCTCACTGGCCCTGCCGGCTCGGACGCCATCGAGAAGGACTTCGAGCGCTTCTTCAAGACCAAGCGCCTCGGCTACGTCCCCAGCGAGTTTAGCGGCCGCTCTGACTACGCCGCCTTCATCGAGAACGGCATCCCCAGCGGCGGACTCTTCACTGGCGCCGAGCAGCTCAAGACCGAGGAAGAGGCCAAGAAGTTCGGCGGCGAGGCCGGCGTCGCCTACGACATCAACTACCACAAGATCGGCGACGATATCAACAACCTCAACAAGGAAGCCTTCCTCGTCAACACCCAGGCCATTGCCAACAGCGTCGCCCGCTACGCCAAGACCTGGAAGTCCCTGCCCAAGGTCACCCACAACACCCGCCGATGGGACGCCGAGGTTGCCTCCGTCCTCAAGCGAAGCAGCGGCCACTCTCACGCTGGCGGCCCTTGTGGCTCTGTCAGCGTCTAAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGGCTAGCTAGTTACGCTTGTTTATTTACGACAAGATCTAGAAGATTCGAGATAGAATAATAATAATAACAACAATTTGCCTCTTCTTTCCACCTTTTCAGTCTTACTCTCCCTTCTGACATTGAACGCCTCAATCAGTCAGTCGCCTTGTACTTGGCACGGTAATCCTCCGTGTTCTTGATATCCTCAGGGGTAGCAAAGCCCTTCATGCCATCGATAATGTCATCCAGAGTGAGGATGGCAAAGATGGGGATGCCGTACTCCTTCCTCAGCTCGCCAATGGCACTCGGTCCAGGCTTGGAGTCGTCGCCATCCGCAGCGGGGAGCTTCTCCATGCGGTCCAGGGCCACGACGATGCCGGCGACGATGCCGCCCTCCTTGGTGATCTTCTCAATGGCGTCCCTCTTGGCGGTGCCGGCGGTGATGACGTCGTCGACAATCAGGACCCTCTTGCCCTTGAGCGAAGCGCCGACGATGTTGCCGCCCTCGCCGTGGTCCTTGGCCTCCTTGCGGTCAAACGAGTAGGAGACGCGGTCCAGGTTCTGGGGCGCCAGCTCGCCGAGCTTGATGGTGATGGCGGAGCACAGCGGGATGCCCTTGTAGGCCGGGCCGAAGACGATGTCGAACTCTAGGCCGGCCTTCTCCTGGGCCTCGATGATGGTCTTTGCAAAGGCGGAGGCGATGGCGCCGGCGAGGCGCGCCGTGTGGAATTCGCCCGCGTTGAAGAAGTAGGGGGATATCCGCTTGGACTTGAGCTCGAAGCTGCCAAACTTGAGGACGCCGCCGTCGATGGCGGATTTGAGGAAGTCCTGCTTGTAGGCAGGCAGCTGGGAGGTGGTAGCCATTCTGTTGGATTTGGATAGTGTCCTTATTCTCTGATTTGAACAGTAGATCAGGACGAGTGAGAGGGATGCAGAGGTTGGATTGGAGTGGTTGAGCTATAAAATTTAGAGGCGCGCCGTATCGAGTTTTCACATGGAAGTCAAAGCGTACAGTGCGAGCTTGTACGTTGGTCTTAGTATCCCACAAGCTTCTGTCTAGGTATGATGATGGCTATAAGTCACCCAAGGCAGAACTCATCTTGAAGATTGTCTAGAGTGATTTTACCGCTGATGAAATGACTGGACTCCCTCCTCCTGCTCTTATACGAAAAATTGCCTGACTCTGCAAAGGTTGTTTGTCTTGGAAGATGATGTGCCCCCCCATCGCTCTTATCTCATACCCCGCCATCTTTCTAGATTCTCATCTTCAACAAGAGGGGCAATCCATGATCTGCGATCCAGATGTGCTTCTGGCCTCATACTCTGCCTTCAGGTTGATGTTCACTTAATTGGTGACGAATTCAGCTGATTTGCTGCAGTATGCTTTGTGTTGGTTCTTTCCAGGCTTGTGCCAGCCATGAGCGCTTTGAGAGCATGTTGTCACCTATAAACTCGAGTAACGGCCACATATTGTTCACTACTTGAATCACATACCTAATTTTGATAGAATTGACATGTTTAAAGAGCTGAGGTAGCTTTAATGCCTCTGAAGTATTGTGACACAGCTTCTCACAGAGTGAGAATGAAAAGTT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ID no 11)
SEQ ID NO:12＝pTrex8gM_TRI034表达构建体的核苷酸序列。
CTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGGTAAGTTGGCCTTGATGAACCATATCATATATCGCCGAGAAGTGGACCGCGTGCTGAGACTGAGACAGCGGCCTGGCCGCGGCCCTCCAGATTCCTCTCAACCTCCAGGTCCCCAAGCTCAGCTGGAACCTCTTCGGCGACGACCTCCCCCTGGTCGACACCAAGGAACTCCAGAAGTCCATCAAGCCCGAGAACCTTGAGGCCCGAGCCAAGGACCTCTACGAGATCGCCAAGAACGGCGAGGAAGAGTACGGCCACCCCACCCGCGTCATTGGCTCTGAGGGCCACCTCGGCACCCTCAGCTACATCCACGCCGAGCTGGCTAAGCTCGGCGGCTACTACAGCGTCAGCAACCAGCAGTTCCCCGCCGTCAGCGGCAACGTCTTTGAGAGCCGCCTCGTCATCGGCGACAGCGTCCCTAAGCAGGCCAGCCCTATGGGCCTCACCCCCCCCACCAAGAACAAGGAACCCGTCCACGGCACCCTCGTCCTCGTCGACAACGAGGGCTGCGACGCCAGCGACTACCCCGAGGCTGTCAAGGGCAACATTGCCCTCATCCTCCGCGGCACGTGCCCCTTCGGCACCAAGTCTGGCAACGCCGGCAAGGCTGGCGCCGTCGCTGCTGTCGTCTACAACTACGAGAAGGACGAGGTCCACGGCACGCTGGGCACCCCTAGCCCTGATCACGTCGCCACCTTTGGCCTCGGCGGCGAAGAGGGCAAGGCCGTCGCCAAGAAGCTCAAGGACGGCGAGAAGGTCGACGCCATTGCCTACATTGACGCCGAGGTCAAGACCATCAGCACCACCAACATCATTGCCCAGACCCGAGGCGGCGACCCCGACAACTGCGTTATGCTTGGCGGCCACAGCGACAGCGTCGCTGAGGGCCCTGGCATCAACGACGATGGCAGCGGCAGCATCAGCGTCCTTGAGGTCGCCGTCCAGCTCACCAAGTACCGCGTCAACAACTGCGTCCGCTTCGCCTGGTGGGCCGCTGAGGAAGAGGGCCTCCTTGGCAGCGACCACTACGTCAGCGTCCTCCCCGAGGACGAGAACCGCAAGATCCGCCTCTTCATGGACTACGACATGATGGCCAGCCCCAACTTCGCCTACCAGATCTACAACGCCACCAACGCCGAGAACCCCAAGGGCAGCGAGGAACTCCGCGACCTCTACGTCAACTGGTACGAGGAACAGGGCCTCAACTACACCTTCATTCCCTTCGACGGCCGCAGCGACTACGACGGCTTTATCCGAGGCGGCATCCCCGCTGGCGGCATTGCTACTGGCGCTGAGGGCGTCAAGACCGAGGACGAGGTCGAGATGTTCGGCGGCGAGGCCGGCGTCTGGTACGACAAGAACTACCACCAGATTGGCGACGACCTGACCAACGTCAACTACACCGCCTGGGAGGTCAACACCAAGCTGATCGCCCACAGCGTCGCCACCTACGCCAAGAGCTTCAAGGGCTTCCCCGAGCGCGAGATCGAGACTAGCGTCCAGACCTACAGCGACAAGACCAAGTACCACGGCAGCAAGCTGTTCATCTAAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGGCTAGCTAGTTACGCTTGTTTATTTACGACAAGATCTAGAAGATTCGAGATAGAATAATAATAATAACAACAATTTGCCTCTTCTTTCCACCTTTTCAGTCTTACTCTCCCTTCTGACATTGAACGCCTCAATCAGTCAGTCGCCTTGTACTTGGCACGGTAATCCTCCGTGTTCTTGATATCCTCAGGGGTAGCAAAGCCCTTCATGCCATCGATAATGTCATCCAGAGTGAGGATGGCAAAGATGGGGATGCCGTACTCCTTCCTCAGCTCGCCAATGGCACTCGGTCCAGGCTTGGAGTCGTCGCCATCCGCAGCGGGGAGCTTCTCCATGCGGTCCAGGGCCACGACGATGCCGGCGACGATGCCGCCCTCCTTGGTGATCTTCTCAATGGCGTCCCTCTTGGCGGTGCCGGCGGTGATGACGTCGTCGACAATCAGGACCCTCTTGCCCTTGAGCGAAGCGCCGACGATGTTGCCGCCCTCGCCGTGGTCCTTGGCCTCCTTGCGGTCAAACGAGTAGGAGACGCGGTCCAGGTTCTGGGGCGCCAGCTCGCCGAGCTTGATGGTGATGGCGGAGCACAGCGGGATGCCCTTGTAGGCCGGGCCGAAGACGATGTCGAACTCTAGGCCGGCCTTCTCCTGGGCCTCGATGATGGTCTTTGCAAAGGCGGAGGCGATGGCGCCGGCGAGGCGCGCCGTGTGGAATTCGCCCGCGTTGAAGAAGTAGGGGGATATCCGCTTGGACTTGAGCTCGAAGCTGCCAAACTTGAGGACGCCGCCGTCGATGGCGGATTTGAGGAAGTCCTGCTTGTAGGCAGGCAGCTGGGAGGTGGTAGCCATTCTGTTGGATTTGGATAGTGTCCTTATTCTCTGATTTGAACAGTAGATCAGGACGAGTGAGAGGGATGCAGAGGTTGGATTGGAGTGGTTGAGCTATAAAATTTAGAGGCGCGCCGTATCGAGTTTTCACATGGAAGTCAAAGCGTACAGTGCGAGCTTGTACGTTGGTCTTAGTATCCCACAAGCTTCTGTCTAGGTATGATGATGGCTATAAGTCACCCAAGGCAGAACTCATCTTGAAGATTGTCTAGAGTGATTTTACCGCTGATGAAATGACTGGACTCCCTCCTCCTGCTCTTATACGAAAAATTGCCTGACTCTGCAAAGGTTGTTTGTCTTGGAAGATGATGTGCCCCCCCATCGCTCTTATCTCATACCCCGCCATCTTTCTAGATTCTCATCTTCAACAAGAGGGGCAATCCATGATCTGCGATCCAGATGTGCTTCTGGCCTCATACTCTGCCTTCAGGTTGATGTTCACTTAATTGGTGACGAATTCAGCTGATTTGCTGCAGTATGCTTTGTGTTGGTTCTTTCCAGGCTTGTGCCAGCCATGAGCGCTTTGAGAGCATGTTGTCACCTATAAACTCGAGTAACGGCCACATATTGTTCACTACTTGAATCACATACCTAATTTTGATAGAATTGACATGTTTAAAGAGCTGAGGTAGCTTTAATGCCTCTGAAGTATTGTGACACAGCTTCTCACAGAGTGAGAATGAAAAGTTGGACTCCCCCTAATGAAGTAAAAGTTTCGTCTCTGAACGGTGAAGAGCATAGATCCGGCATCAACTACCTGGCTAGACTACGACGTCAATTCTGCGGCCTTTTGACCTTTATATATGTCCATTAATGCAATAGATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCAATTTCGCAGATCAAAGTGGACGTTATAGCATCATAACTAAGCTCAGTTGCTGAGGGAAGCCGTCTACTACCTTAGCCCATCCATCCAGCTCCATACCTTGATACTTTAGACGTGAAGCAATTCACACTGTACGTCTCGCAGCTCTCCTTCCCGCTCTTGCTTCCCCACTGGGGTCCATGGTGCGTGTATCGTCCCCTCCTTAATTAAGGCCATTTAGGCCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGCCTGCAGGGCCGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGGCCATTTAGGCCT(Seq IDno 12)
SEQ ID NO:13＝pTrex8gM_TRI035表达构建体的核苷酸序列。
CTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGGTAAGTTGGCCTTGATGAACCATATCATATATCGCCGAGAAGTGGACCGCGTGCTGAGACTGAGACAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGCTCCTGGTGGACCTGGTGGTCACGGCCGCAAGCTCCCCGTCAACCCCAAGACCTTCCCCAACGAGATCCGCCTCAAGGACCTCCTCCACGGCAGCCAGAAGCTCGAAGATTTCGCCTACGCCTACCCCGAGCGCAACCGCGTCTTTGGCGGCCAGGCCCACCTCGACACCGTCAACTACCTCTACCGCGAGCTGAAGAAGACCGGCTACTACGACGTCTACAAGCAGCCCCAGGTGCACCAGTGGACCCGAGCCGACCAGTCTCTCACTCTCGGCGGCGACAGCATCCAGGCCAGCACCATGACCTACAGCCCCAGCGTCAACGTCACCGCCCCTCTCAGCCTCGTCAGCAAGCTCGGCTGCGCCGAGGGCGACTACAGCGCCGATGTCAAGGGCAAGATCGCCCTCGTCAGCCGAGGCGAGTGCAGCTTCGCCCAGAAGTCCGTCCTCAGCGCCAAGGCTGGCGCCGTCGCCACCATCGTCTACAACAACGTCGACGGCAGCCTCGCCGGCACCCTTGGCGGAGCTACTTCTGAGCTGGGCCCCTACTCCCCCATCATCGGCATCACTCTCGCCGCTGGCCAGGACCTCGTCGCCCGACTTCAGGCCGCTCCTACCGAGGTCAGCCTCTGGATCGACAGCAAGGTCGAGAACCGCACCACCTACAACGTCATTGCCCAGACCAAGGGCGGCGACCCCAACAACGTCGTCGCTCTCGGCGGCCACACCGACAGCGTTGAGAACGGCCCTGGCATCAACGACGACGGCTCCGGCGTCATCAGCAACCTCGTCGTCGCCAAGGCCCTCACCCGCTACAGCGTCAAGAACGCCGTCCGCTTCTGCTTCTGGACCGCCGAAGAGTTCGGCCTCCTCGGCAGCAACTACTACGTCGACAACCTCAGCCCTGCCGAGCTGGCCAAGATCCGCCTCTACCTCAACTTCGACATGATCGCCAGCCCCAACTACGCCCTCATGATCTACGACGGCGACGGCAGCGCCTTCAACCTCACTGGACCCCCTGGCAGCGCCCAGATCGAGAGCCTCTTCGAGAACTACTACAAGAGCATCAAGCAGGGCTTCGTCCCCACCGCCTTCGACGGCCGATCTGACTACGAGGGCTTCATCCTCAAGGGCATCCCCGCTGGCGGCGTCTTTACTGGCGCCGAGAGCCTCAAGACCGAGGAACAGGCCCGCCTGTTCGGCGGCCAGGCTGGCGTTGCTCTCGACGCCAACTACCACGCCAAGGGCGACAACATGACCAACCTCAACCACAAGGCCTTTCTCATCAACAGCCGCGCCACGGCCTTCGCCGTCGCTACCTACGCCAACAACCTCAGCAGCATCCCCCCTCGCAACGCCACCGTCGTCAAGCGCGAGAGCATGAAGTGGACCAAGCGCGAGGAACCCCACACCCACGGCGCCGACACTGGCTGCTTTGCCAGCCGCGTCAAGGAGTAAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGGCTAGCTAGTTACGCTTGTTTATTTACGACAAGATCTAGAAGATTCGAGATAGAATAATAATAATAACAACAATTTGCCTCTTCTTTCCACCTTTTCAGTCTTACTCTCCCTTCTGACATTGAACGCCTCAATCAGTCAGTCGCCTTGTACTTGGCACGGTAATCCTCCGTGTTCTTGATATCCTCAGGGGTAGCAAAGCCCTTCATGCCATCGATAATGTCATCCAGAGTGAGGATGGCAAAGATGGGGATGCCGTACTCCTTCCTCAGCTCGCCAATGGCACTCGGTCCAGGCTTGGAGTCGTCGCCATCCGCAGCGGGGAGCTTCTCCATGCGGTCCAGGGCCACGACGATGCCGGCGACGATGCCGCCCTCCTTGGTGATCTTCTCAATGGCGTCCCTCTTGGCGGTGCCGGCGGTGATGACGTCGTCGACAATCAGGACCCTCTTGCCCTTGAGCGAAGCGCCGACGATGTTGCCGCCCTCGCCGTGGTCCTTGGCCTCCTTGCGGTCAAACGAGTAGGAGACGCGGTCCAGGTTCTGGGGCGCCAGCTCGCCGAGCTTGATGGTGATGGCGGAGCACAGCGGGATGCCCTTGTAGGCCGGGCCGAAGACGATGTCGAACTCTAGGCCGGCCTTCTCCTGGGCCTCGATGATGGTCTTTGCAAAGGCGGAGGCGATGGCGCCGGCGAGGCGCGCCGTGTGGAATTCGCCCGCGTTGAAGAAGTAGGGGGATATCCGCTTGGACTTGAGCTCGAAGCTGCCAAACTTGAGGACGCCGCCGTCGATGGCGGATTTGAGGAAGTCCTGCTTGTAGGCAGGCAGCTGGGAGGTGGTAGCCATTCTGTTGGATTTGGATAGTGTCCTTATTCTCTGATTTGAACAGTAGATCAGGACGAGTGAGAGGGATGCAGAGGTTGGATTGGAGTGGTTGAGCTATAAAATTTAGAGGCGCGCCGTATCGAGTTTTCACATGGAAGTCAAAGCGTACAGTGCGAGCTTGTACGTTGGTCTTAGTATCCCACAAGCTTCTGTCTAGGTATGATGATGGCTATAAGTCACCCAAGGCAGAACTCATCTTGAAGATTGTCTAGAGTGATTTTACCGCTGATGAAATGACTGGACTCCCTCCTCCTGCTCTTATACGAAAAATTGCCTGACTCTGCAAAGGTTGTTTGTCTTGGAAGATGATGTGCCCCCCCATCGCTCTTATCTCATACCCCGCCATCTTTCTAGATTCTCATCTTCAACAAGAGGGGCAATCCATGATCTGCGATCCAGATGTGCTTCTGGCCTCATACTCTGCCTTCAGGTTGATGTTCACTTAATTGGTGACGAATTCAGCTGATTTGCTGCAGTATGCTTTGTGTTGGTTCTTTCCAGGCTTGTGCCAGCCATGAGCGCTTTGAGAGCATGTTGTCACCTATAAACTCGAGTAACGGCCACATATTGTTCACTACTTGAATCACATACCTAATTTTGATAGAATTGACATGTTTAAAGAGCTGAGGTAGCTTTAATGCCTCTGAAGTATT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ID no 13)
SEQ ID NO:14＝pTrex8gM_TRI036表达构建体的核苷酸序列。
CTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGGTAAGTTGGCCTTGATGAACCATATCATATATCGCCGAGAAGTGGACCGCGTGCTGAGACTGAGACAGCGGCCTGGCCGCGGCCGGTGGCCCTCATGGATTTGGCCTCCCCAAGATCGACCTCCGCCCTATGGTCAGCAGCAACCGCCTCCAGAGCATGATCACCCTCAAGGACCTCATGGACGGCGCCAAGAAGCTCCAGGACATTGCCACCAAGAACGGCGGCAACCGCGCCTTTGGCGGCGCTGGCCACAACGCCACTGTCGACTACCTCTACAAGACCCTCACCAGCCTCGGCGGCTACTACACCGTCAAGAAGCAGCCCTTCAAGGAAATCTTCAGCAGCGGCAGCGGCAGCCTCATCGTCGACGGCCAGGGCATCGACGCCGGCATCATGACCTATACCCCTGGCGGCAGCGCCACCGCCAACCTCGTCCAGGTTGCTAACCTCGGCTGCGAGGACGAGGACTACCCTGCCGAGGTCGCCGGCAACATTGCCCTCATTAGCCGCGGCAGCTGCACCTTCAGCAGCAAGAGCCTCAAGGCCAAGGCCGCTGGCGCCGTCGGCGCTATCGTCTACAACAACGTCCCCGGCGAGCTGAGCGGAACCCTCGGCACCCCCTTTCTCGACTACGCCCCCATCGTCGGCATCAGCCAAGAGGACGGCCAGGTCATCCTTGAGAAGCTCGCCGCTGGCCCCGTCACCGCCACCCTCAACATCGACGCCATCGTCGAGGAACGCACCACCTACAACGTCATTGCCGAGACTAAGGAAGGCGACCACAACAACGTGCTCATTGTCGGCGGCCACAGCGACAGCGTTGCTGCCGGCCCTGGCATCAACGACGACGGCTCTGGCACCATCGGCATCCTCACCGTCGCCAAGGCCCTCGCCAAGGCCAACGTCCGCATCAAGAACGCCGTCCGCTTCGCCTTCTGGTCCGCCGAAGAGTTCGGCCTCCTCGGCAGCTACGCCTACATGAAGTCCCTCAACGAGAGCGAGGCCGAGGTGGCCAAGATCCGCGCCTACCTCAACTTCGACATGATCGCCAGCCCCAACTACATCTACGGCATCTACGACGGCGACGGCAACGCCTTCAACCTCACTGGCCCTGCCGGCAGCGACATCATCGAGAAGGACTTCGAGGACTTCTTCAAGAAGAAGAAGACCCCCAGCGTCCCCACCGAGTTCAGCGGCCGATCTGACTACGCCGCCTTCATCGAGAACGGCATCCCCAGCGGCGGACTCTTCACTGGCGCCGAGGTCCTCAAGACCGAGGAAGAGGCCAAGCTGTTCGGCGGCAAGGCCGGCGTCGCCTACGACGTCAACTACCACAAGGCCGGCGACACCGTCGACAACCTCGCCAAGGACGCCTTCCTGCTCAACACCAAGGCCATTGCCAACAGCGTCGCCAAGTACGCCGCCAGCTGGGCCGGCTTTCCTAAGCCTTCTGCCGTCCGCCGACGCTACGACGCCGATATGGCCCAGCTCCTCAAGCGCTCTGGCGGCGTTCATGGCCACGGCCCTCACACTCATAGCGGCCCTTGTGGCGGCGGTGACCTCCTCTAAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGGCTAGCTAGTTACGCTTGTTTATTTACGACAAGATCTAGAAGATTCGAGATAGAATAATAATAATAACAACAATTTGCCTCTTCTTTCCACCTTTTCAGTCTTACTCTCCCTTCTGACATTGAACGCCTCAATCAGTCAGTCGCCTTGTACTTGGCACGGTAATCCTCCGTGTTCTTGATATCCTCAGGGGTAGCAAAGCCCTTCATGCCATCGATAATGTCATCCAGAGTGAGGATGGCAAAGATGGGGATGCCGTACTCCTTCCTCAGCTCGCCAATGGCACTCGGTCCAGGCTTGGAGTCGTCGCCATCCGCAGCGGGGAGCTTCTCCATGCGGTCCAGGGCCACGACGATGCCGGCGACGATGCCGCCCTCCTTGGTGATCTTCTCAATGGCGTCCCTCTTGGCGGTGCCGGCGGTGATGACGTCGTCGACAATCAGGACCCTCTTGCCCTTGAGCGAAGCGCCGACGATGTTGCCGCCCTCGCCGTGGTCCTTGGCCTCCTTGCGGTCAAACGAGTAGGAGACGCGGTCCAGGTTCTGGGGCGCCAGCTCGCCGAGCTTGATGGTGATGGCGGAGCACAGCGGGATGCCCTTGTAGGCCGGGCCGAAGACGATGTCGAACTCTAGGCCGGCCTTCTCCTGGGCCTCGATGATGGTCTTTGCAAAGGCGGAGGCGATGGCGCCGGCGAGGCGCGCCGTGTGGAATTCGCCCGCGTTGAAGAAGTAGGGGGATATCCGCTTGGACTTGAGCTCGAAGCTGCCAAACTTGAGGACGCCGCCGTCGATGGCGGATTTGAGGAAGTCCTGCTTGTAGGCAGGCAGCTGGGAGGTGGTAGCCATTCTGTTGGATTTGGATAGTGTCCTTATTCTCTGATTTGAACAGTAGATCAGGACGAGTGAGAGGGATGCAGAGGTTGGATTGGAGTGGTTGAGCTATAAAATTTAGAGGCGCGCCGTATCGAGTTTTCACATGGAAGTCAAAGCGTACAGTGCGAGCTTGTACGTTGGTCTTAGTATCCCACAAGCTTCTGTCTAGGTATGATGATGGCTATAAGTCACCCAAGGCAGAACTCATCTTGAAGATTGTCTAGAGTGATTTTACCGCTGATGAAATGACTGGACTCCCTCCTCCTGCTCTTATACGAAAAATTGCCTGACTCTGCAAAGGTTGTTTGTCTTGGAAGATGATGTGCCCCCCCATCGCTCTTATCTCATACCCCGCCATCTTTCTAGATTCTCATCTTCAACAAGAGGGGCAATCCATGATCTGCGATCCAGATGTGCTTCTGGCCTCATACTCTGCCTTCAGGTTGATGTTCACTTAATTGGTGACGAATTCAGCTGATTTGCTGCAGTATGCTTTGTGTTGGTTCTTTCCAGGCTTGTGCCAGCCATGAGCGCTTTGAGAGCATGTTGTCACCTATAAACTCGAGTAACGGCCACATATTGTTCACTACTTGAATCACATACCTAATTTTGATAGAATTGACATGTTTAAAGAGCTGAGG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ID no 14)
SEQ ID NO:15＝pTrex8gM_TRI037表达构建体的核苷酸序列。
CTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGGTAAGTTGGCCTTGATGAACCATATCATATATCGCCGAGAAGTGGACCGCGTGCTGAGACTGAGACAGCGGCCTGGCCGCGGCCGAGGGACTTGGAAACCACGGCCGAAAGCTCGACCCCAACAAGTTCACCAAGGATATCAAGCTCAAGGACCTCCTCAAGGGCAGCCAGAAGCTCGAAGATTTCGCCTACGCCTACCCCGAGCGCAACCGCGTCTTTGGCGGCAAGGCCCACCAGGACACCGTCAACTGGATCTACAACGAGCTGAAGAAGACCGGCTACTACGACGTCTACAAGCAGCCCCAGGTCCACCTCTGGTCCAACGCCGAGCAGAGCCTCACCGTCGATGGCGAGGCCATCGACGCCACCACCATGACCTACAGCCCCAGCCTCAAGGAAACCACCGCCGAGGTCGTCGTCGTCCCTGGCCTTGGCTGCACTGCCGCCGACTACCCTGCTGACGTCGCCGGCAAGATCGCCCTCATTCAGCGCGGCAGCTGCACCTTCGGCGAGAAGTCCGTCTACGCCGCTGCCGCCAACGCCGCTGCTGCCATCGTCTACAACAACGTCGACGGCAGCCTCAGCGGCACCCTCGGCGCTGCTACTTCTGAGCTGGGCCCCTACGCCCCCATCGTCGGCATTTCTCTCGCCGACGGCCAGAACCTCGTCAGCCTCGCTCAGGCTGGCCCCCTGACCGTCGACCTCTACATCAACAGCCAGATGGAAAACCGCACCACCCACAACGTCATTGCCAAGAGCAAGGGCGGCGACCCTAACAACGTCATCGTCATCGGCGGCCACAGCGACGCCGTCAACCAGGGACCTGGCGTCAACGATGACGGCAGCGGCATCATCAGCAACCTCGTGATCGCCAAGGCCCTCACCAAGTACAGCCTCAAGAACAGCGTCACCTGGGCCTTTTGGACCGCCGAAGAGTTCGGCCTCCTCGGCAGCGAGTTCTACGTCAACAGCCTCTCTGCCGCCGAGAAGGACAAGATCAAGCTCTACCTCAACTTCGACATGATCGCCAGCCCCAACTACGCCCTCATGATCTACGACGGCGACGGCAGCACCTTCAACATGACCGGCCCTGCCGGCTCCGCCGAGATCGAGCACCTCTTCGAGGACTACTACAAGTCTCGCGGCCTCAGCTACATCCCCACCGCCTTTGACGGCCGCAGCGACTACGAGGCCTTCATCCTCAACGGCATCCCCGCTGGCGGCCTCTTCACTGGCGCCGAGCAGATCAAGACCGAGGAACAGGTCGCCATGTTCGGCGGCCAGGCTGGCGTCGCCTACGACCCCAACTATCACGCCGCTGGCGACAACATGACCAACCTCAGCGAGGAAGCCTTCCTCATCAACAGCAAGGCCACCGCCTTCGCCGTCGCCACCTACGCCAACAGCCTTGAGAGCATCCCCCCTCGCAACGCCACCATGAGCATCCAGACCCGCTCTGCCTCTCGCCGAGCCGCTGCTCATCGACGAGCCGCCAAGCCTCACTCTCACTCTGGCGGCACTGGCTGCTGGCACACCCGAGTCGAGCTGTAAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGGCTAGCTAGTTACGCTTGTTTATTTACGACAAGATCTAGAAGATTCGAGATAGAATAATAATAATAACAACAATTTGCCTCTTCTTTCCACCTTTTCAGTCTTACTCTCCCTTCTGACATTGAACGCCTCAATCAGTCAGTCGCCTTGTACTTGGCACGGTAATCCTCCGTGTTCTTGATATCCTCAGGGGTAGCAAAGCCCTTCATGCCATCGATAATGTCATCCAGAGTGAGGATGGCAAAGATGGGGATGCCGTACTCCTTCCTCAGCTCGCCAATGGCACTCGGTCCAGGCTTGGAGTCGTCGCCATCCGCAGCGGGGAGCTTCTCCATGCGGTCCAGGGCCACGACGATGCCGGCGACGATGCCGCCCTCCTTGGTGATCTTCTCAATGGCGTCCCTCTTGGCGGTGCCGGCGGTGATGACGTCGTCGACAATCAGGACCCTCTTGCCCTTGAGCGAAGCGCCGACGATGTTGCCGCCCTCGCCGTGGTCCTTGGCCTCCTTGCGGTCAAACGAGTAGGAGACGCGGTCCAGGTTCTGGGGCGCCAGCTCGCCGAGCTTGATGGTGATGGCGGAGCACAGCGGGATGCCCTTGTAGGCCGGGCCGAAGACGATGTCGAACTCTAGGCCGGCCTTCTCCTGGGCCTCGATGATGGTCTTTGCAAAGGCGGAGGCGATGGCGCCGGCGAGGCGCGCCGTGTGGAATTCGCCCGCGTTGAAGAAGTAGGGGGATATCCGCTTGGACTTGAGCTCGAAGCTGCCAAACTTGAGGACGCCGCCGTCGATGGCGGATTTGAGGAAGTCCTGCTTGTAGGCAGGCAGCTGGGAGGTGGTAGCCATTCTGTTGGATTTGGATAGTGTCCTTATTCTCTGATTTGAACAGTAGATCAGGACGAGTGAGAGGGATGCAGAGGTTGGATTGGAGTGGTTGAGCTATAAAATTTAGAGGCGCGCCGTATCGAGTTTTCACATGGAAGTCAAAGCGTACAGTGCGAGCTTGTACGTTGGTCTTAGTATCCCACAAGCTTCTGTCTAGGTATGATGATGGCTATAAGTCACCCAAGGCAGAACTCATCTTGAAGATTGTCTAGAGTGATTTTACCGCTGATGAAATGACTGGACTCCCTCCTCCTGCTCTTATACGAAAAATTGCCTGACTCTGCAAAGGTTGTTTGTCTTGGAAGATGATGTGCCCCCCCATCGCTCTTATCTCATACCCCGCCATCTTTCTAGATTCTCATCTTCAACAAGAGGGGCAATCCATGATCTGCGATCCAGATGTGCTTCTGGCCTCATACTCTGCCTTCAGGTTGATGTTCACTTAATTGGTGACGAATTCAGCTGATTTGCTGCAGTATGCTTTGTGTTGGTTCTTTCCAGGCTTGTGCCAGCCATGAGCGCTTTGAGAGCATGTTGTCACCTATAAACTCGAGTAACGGCCACATATTGTTCACTACTTGAATCACATACCTAATTTTGATAGAATTGACATGTTTAAAGAGCTGAGGTAGCTTTAATGCCTCTGA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IDno 15)
SEQ ID NO:16＝pTrex8gM_TRI038表达构建体的核苷酸序列。
CTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGGTAAGTTGGCCTTGATGAACCATATCATATATCGCCGAGAAGTGGACCGCGTGCTGAGACTGAGACAGCGGCCTGGCCGCGGCCGGCAAGCACAAGCCTCTTGTCACCCCTGAGGCCCTCCAGGACCTGATTACCCTCGACGACCTCCTCGCCGGCAGCCAGCAGCTCCAGGACTTCGCCTACGCCTACCCCGAGCGCAACCGCGTCTTTGGCGGCCGAGCCCACGACGACACCGTCAACTGGCTCTACCGCGAGCTGAAGCGCACCGGCTACTACCACGTCTACAAGCAGCCCCAGGTCCACCTCTACAGCAACGCCGAGGAAAGCCTCACCGTCAACGGCGAGGCCATCGAGGCCACCACCATGACCTACAGCCCCAGCGCCAACGCCTCTGCCGAGCTGGCTGTCATCAGCGGCCTTGGCTGCTCTCCCGCCGACTTCGCCTCTGACGTCGCCGGCAAGGTCGTCCTCGTCCAGCGAGGCAACTGCACCTTCGGCGAGAAGTCCGTCTACGCCGCTGCCGCCGATGCCGCCGCTACGATCGTCTACAACAACGTCGAGGGCAGCCTCAGCGGCACCCTCGGCGCTGCTCAGTCTGAGCAAGGCCCCTACAGCGGCATCGTCGGCATCAGCCTCGCTGACGGCGAGGCCCTCCTCGCCCTTGCTGAGGAAGGCCCTGTCCACGTCGACCTCTGGATCGACAGCGTCATGGAAAACCGCACCACCTACAACGTCATTGCCCAGACCAAGGGCGGCGACCCCGACAACGTCGTCACTCTTGGCGGCCACAGCGACAGCGTCGAGGCTGGCCCTGGCATCAACGACGACGGCAGCGGCATCATCAGCAACCTCGTCATTGCCCGAGCCCTCACCAAGTTCAGCACCAAGCACGCCGTCCGCTTTTTCTTCTGGACCGCCGAAGAGTTCGGCCTCCTCGGCAGCGACTACTACGTCAGCAGCCTCAGCCCCGCTGAGCTGGCCAAGATCCGCCTCTACCTCAACTTCGACATGATCGCCAGCCCCAACTACGGCCTCCTCCTCTACGATGGCGACGGCAGCGCCTTCAACCTCACTGGCCCTGCTGGCAGCGACGCCATCGAGAAGCTGTTCTACGACTACTTCCAGAGCATCGGCCAGGCCACCGTCGAGACTGAGTTCGACGGCCGCAGCGACTACGAGGCCTTCATCCTCAACGGCATCCCCGCTGGCGGCGTCTTTACTGGCGCCGAGGAAATCAAGAGCGAGGAAGAGGTCGCCCTCTGGGGCGGAGAGGCTGGCGTCGCCTACGACGCCAACTACCACCAGGTCGGCGACACCATCGACAACCTCAACACCGAGGCCTACCTGCTCAACAGCAAGGCCACCGCCTTCGCCGTCGCCACCTACGCCAACGACCTCAGCACCATCCCCAAGCGCGAGATGACCACCGCCGTCAAGCGAGCCAACGTCAACGGCCACATGCACCGCCGCACCATGCCCAAGAAGCGCCAGACTGCCCACCGCCACGCTGCCAAGGGCTGCTTTCACAGCCGCGTCGAGCAGTAAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGGCTAGCTAGTTACGCTTGTTTATTTACGACAAGATCTAGAAGATTCGAGATAGAATAATAATAATAACAACAATTTGCCTCTTCTTTCCACCTTTTCAGTCTTACTCTCCCTTCTGACATTGAACGCCTCAATCAGTCAGTCGCCTTGTACTTGGCACGGTAATCCTCCGTGTTCTTGATATCCTCAGGGGTAGCAAAGCCCTTCATGCCATCGATAATGTCATCCAGAGTGAGGATGGCAAAGATGGGGATGCCGTACTCCTTCCTCAGCTCGCCAATGGCACTCGGTCCAGGCTTGGAGTCGTCGCCATCCGCAGCGGGGAGCTTCTCCATGCGGTCCAGGGCCACGACGATGCCGGCGACGATGCCGCCCTCCTTGGTGATCTTCTCAATGGCGTCCCTCTTGGCGGTGCCGGCGGTGATGACGTCGTCGACAATCAGGACCCTCTTGCCCTTGAGCGAAGCGCCGACGATGTTGCCGCCCTCGCCGTGGTCCTTGGCCTCCTTGCGGTCAAACGAGTAGGAGACGCGGTCCAGGTTCTGGGGCGCCAGCTCGCCGAGCTTGATGGTGATGGCGGAGCACAGCGGGATGCCCTTGTAGGCCGGGCCGAAGACGATGTCGAACTCTAGGCCGGCCTTCTCCTGGGCCTCGATGATGGTCTTTGCAAAGGCGGAGGCGATGGCGCCGGCGAGGCGCGCCGTGTGGAATTCGCCCGCGTTGAAGAAGTAGGGGGATATCCGCTTGGACTTGAGCTCGAAGCTGCCAAACTTGAGGACGCCGCCGTCGATGGCGGATTTGAGGAAGTCCTGCTTGTAGGCAGGCAGCTGGGAGGTGGTAGCCATTCTGTTGGATTTGGATAGTGTCCTTATTCTCTGATTTGAACAGTAGATCAGGACGAGTGAGAGGGATGCAGAGGTTGGATTGGAGTGGTTGAGCTATAAAATTTAGAGGCGCGCCGTATCGAGTTTTCACATGGAAGTCAAAGCGTACAGTGCGAGCTTGTACGTTGGTCTTAGTATCCCACAAGCTTCTGTCTAGGTATGATGATGGCTATAAGTCACCCAAGGCAGAACTCATCTTGAAGATTGTCTAGAGTGATTTTACCGCTGATGAAATGACTGGACTCCCTCCTCCTGCTCTTATACGAAAAATTGCCTGACTCTGCAAAGGTTGTTTGTCTTGGAAGATGATGTGCCCCCCCATCGCTCTTATCTCATACCCCGCCATCTTTCTAGATTCTCATCTTCAACAAGAGGGGCAATCCATGATCTGCGATCCAGATGTGCTTCTGGCCTCATACTCTGCCTTCAGGTTGATGTTCACTTAATTGGTGACGAATTCAGCTGATTTGCTGCAGTATGCTTTGTGTTGGTTCTTTCCAGGCTTGTGCCAGCCATGAGCGCTTTGAGAGCATGTTGTCACCTATAAACTCGAGTAACGGCCACATATTGTTCACTACTTGAATCACATACCTAATTTTGATAGAATTGACATGTTTAAAGAGCTGAGGTAGCTTTAATGCCTCTGAAGTATT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ID no 16)
实例2-在麸质水解中来自费希新萨托菌(TRI031)的PepN 2的最适操作pH和温度
谷氨酸的释放是植物蛋白质水解(例如大豆或麸质水解)中的重要质量参数。释放的谷氨酸可以被认为是所谓的“鲜味”。为了确定麸质水解中最初应用的pH在谷氨酸和谷氨酰胺的释放方面的效果，在15至30分钟之后的麸质液化后立即用1M HCl调节麸质水解的起始pH。用谷氨酰胺酶(Amano[安满能]，日本)处理麸质。此外，麸质用FoodPro碱性蛋白酶、FoodPro PNL以及PepN 2(费希新萨托菌)进行处理。20小时后，使用超滤(10kDa截止值，Sartorius Stedium Biotech[赛多利斯司特蒂姆生物工艺公司]，德国哥廷根)终止水解。将渗透物应用于酶法谷氨酸测定(enzymatic L-glutamic acid analysis kit[酶法左旋谷氨酸分析试剂盒]，Roche[罗氏公司]，德国曼海姆)。如图2所示，与pH 6.0相比，PepN 2在7.0-9.0的pH范围内更有效地进行。
为了确定麸质水解过程中施加的温度在谷氨酸和谷氨酰胺释放方面的影响，在15至30分钟之后的麸质悬浮液液化之后立即用1M HCl将起始pH调节至pH 7.0。如图3所示应用40℃-60℃范围的温度。将麸质与谷氨酰胺酶(Amano[安满能]，日本)合并。此外，将麸质与碱性蛋白酶、 PNL以及PepN 2(费希新萨托菌)合并。水解20小时后，使用超滤(10kDa截止值，Sartorius Stedium[赛多利斯司特蒂姆生物工艺公司]，德国哥廷根)终止水解。将渗透物应用于酶法谷氨酸测定(enzymatic L-glutamic acidanalysis kit[酶法左旋谷氨酸分析试剂盒]，Roche[罗氏公司]，德国曼海姆)。来自费希新萨托菌的PepN 2在60℃处进行效率最高。
实例3-在水解度方面比较来自费希新萨托菌(TRI031)和棒曲霉(TRI035)的PepN2
水解度(DH)描述与例如在约120℃处在6M HCl中进行24小时的相同量蛋白质的酸水解相比，切割的肽键的相对量。因此，较高的DH可用于评估总体PepN例如PepN1或PepN2型的氨基酸释放的效率。将无细胞培养液浓缩(10kDa截止值，Sartorius[赛多利斯司特蒂姆生物工艺公司]，德国哥廷根)，并应用处置脱盐柱(PD10，GE[GE医疗集团]，德国慕尼黑)如制造商所述进行脱盐。在底物预水解的同时，施加10％(w/w)酪蛋白酸钠(DMK，德国)、乳清蛋白分离物(WPI；Arla[阿尔拉公司]，丹麦维比(Viby))、大豆蛋白分离物(SPI；760，DuPont[杜邦公司]，丹麦Brabrand[布拉布兰])和麸质悬浮液。使用1％(w/w蛋白质)的碱性蛋白酶、1％(w/w蛋白质)的 PNL对于酪蛋白酸钠、WPI以及SPI悬浮液进行预水解。所有预水解在55℃处进行18小时，随后在95℃处进行灭活步骤20分钟。每个应用的PepN 2已经在95℃处灭活15分钟，作为从培养液到最终水解的氨基酸的任何残留物(carryover)的消除以及所应用的内肽酶的充分失活的对照。水解以96孔微量滴定板格式进行，并且由150μL预先水解的蛋白质悬浮液结合50μL的PepN 2储备溶液组成，如下表1所示。水解在50℃处进行20小时，然后通过添加20μL 2M TCA(三氯乙酸，Sigma-Aldrich[西格玛-奥德里奇公司]，德国施内尔多尔夫)终止水解。表1(B)和(A)中可以看出费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)和棒曲霉(Aspergillus clavatus)的PepN 2型氨基酸释放的效率。具体而言，对于底物、酪蛋白酸钠、WPI和SPI，在应用来自费希新萨托菌和棒曲霉的PepN2型后，获得了显著更高的DH。另外，在PepN 2储备溶液浓度下获得的DH可以显著增加。对于麸质水解，在从0.02mg/mL至0.3mg/mL PepN2的蛋白质范围内注意到了增加的DH。
表1：来自费希新萨托菌和棒曲霉的PepN 2型的水解度的比较。
实例4-应用与PepN 2候选物TRI032、TRI033、TRI034、TRI035、TRI037和TRI038组合的两种内肽酶的麸质水解
通过添加碱性蛋白酶(FPAP)和 PNL(FPPNL)制备预水解的麸质悬浮液。水解在55℃处进行。约18小时后，通过加热至90℃处10分钟来终止水解。冷却至50℃后，将谷氨酰胺酶施用于麸质。随后，将150μL预水解的麸质转移到96孔微量滴定板的每个孔中。应用50μL的TRI032、TRI033、TRI034、TRI035、TRI037和TRI038(蛋白质浓度：0.5mg/mL)进行谷氨酸释放。水解进行18小时，并通过添加20μL 2M TCA终止水解。将终止的水解过滤(0.22mm)并用酶法谷氨酸分析试剂盒(Roche[罗氏公司]，德国曼海姆)进一步分析。释放的谷氨酸浓度如图4所示。
实例5-含脯氨酸肽的水解
用TRI031和TRI035水解肽WHWLQLKPGQPMY。将肽(1mg/mL)用在20mM CPB缓冲液(20mM柠檬酸、20mM磷酸盐、20mM硼酸)中的1μg/ml氨肽酶在55℃处孵育。在指定的时间点用50μl 5％TFA终止等分试样(50μL)并进行LC-MS分析。
目前的结果表明，TRI031和TRI035可以将肽WHWLQLKPGQPMY(图5)水解成KPGQPMY(图6)，并进一步水解成QPMY(图7)。那与先前针对米曲霉PepN 2(AM Blinkovsky等人，Biochimica et Biophysica Acta[生物化学与生物物理学报]，1480(2000)171-181，其中声称米曲霉PepN 2不水解任一检查的X-Pro键包括肽WHWLQLKPGQPMY的那些)所描述的内容形成对比。然而，我们也发现它们的酶将肽切割成QPMY(图7)。
数据采集：毛细管LC-MS/MS分析使用衔接到Agilent 1100 LC系统(AgilentTechnologies[安捷伦科技公司])的LTQ Orbitrap Classic杂交质谱仪(ThermoScientific[赛默科技公司]，德国不来梅)进行。将样品加载到15 cm Phenomenix Jupiter4μ Proteo 90A，C4分析柱上。使用0-40％溶剂B H2O/CH3CN/HCOOH(50/950/0.65v/v/v)的10min梯度，以16μL/min的流速进行分离,以进入离子源(Thermo Scientific[赛默科技公司]，圣何塞)。LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行。通过轨道阱(在m/z 400下以60 000的分辨率获得MS扫描)测量肽质量，并且选择多达2个最强的肽m/z，并使用线性离子阱(LTQ)中的CID对其进行片段化。启动动态排除，列表大小为500个质量，持续时间为40s，并且相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm。
无标记定量检测：RAW文件使用Skyline 2.6.0.7176程序(MacLean,B.,等人，“Skyline:an open source document editor for creating and analyzing targetedproteomics experiments[Skyline：用于创建和分析有针对性的蛋白质组学实验的开放源文件编辑器]”，Bioinformatics[生物信息学]，2010,26(7):p.966-8)访问，其可以使用MS1强度来构建色谱图(Schilling,B.，等人，“Platform-independent and label-freequantitation of proteomic data using MS1 extracted ion chromatograms inskyline:application to protein acetylation and phosphorylation[使用MS1提取在skyline中的离子色谱图的蛋白质组学数据的平台独立和无标记定量：在蛋白质乙酰化和磷酸化中的应用]”，Mol Cell Proteomics[分子与细胞蛋白质组学]，2012.11(5):p.202-14)。将前体同位素导入过滤器设置为3个(M、M+1和M+2)计数，分辨率为60,000，并且使用最强的电荷状态。将底物以及裂解产物的肽序列输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。数字直接从程序中复制(见图8)。
实例6：比较来自棒曲霉的PepN2与来自米曲霉和瑞士乳杆菌ATCC 12046的PepN的水解度
PepN 1瑞士乳杆菌12046、PepN 1米曲霉和来自棒曲霉(TRI035)的PepN 2的酶活性根据Stressler，Eisele等人(2013，见下文)来测定。来自瑞士乳杆菌的PepN1如Stressler，Eisele等人(2013，见下文)所述进行表达和纯化。
在用20mM Bis-Tris，pH 6.5平衡的PD10柱上脱盐后，将来自米曲霉的PepN 1从500L(Sigma-Aldrich[西格玛-奥德里奇公司]，德国施内尔多尔夫)中纯化。将样品在源Q15，XK26/15(SQ15)柱(GE-Lifesciences[GE-生命科学公司]，美国)上通过阴离子交换层析纯化，并用20mM Bis/Tris，pH 6.5(缓冲液A)平衡。将样品(30mL)以7mL/min的流速加载到柱上。用缓冲液A洗涤柱，并且用在20mM Bis/Tris，pH 6.5(50分钟)中的0M-0.5M NaCl的线性梯度洗脱结合的蛋白质。在整个运行过程中，收集大约13mL级分并保持在冰上。将具有最高氨肽酶活性的级分合并，在20mM Bis-Tris、pH 6.0中的PD10上脱盐，并在用20mM Bis/Tris，pH 6.0(缓冲液A)平衡的Poros Q20 HR26/10，XK26/10柱(GE-Lifesciences[GE-生命科学公司]，美国)上经受第二次运行。将PepN1样品以4ml/min的流速加载到柱上。用缓冲液A洗涤柱，并且用在20mM Bis/Tris，pH 6.0(30分钟)中的0M-0.25MNaCl的线性梯度洗脱结合的蛋白质。在整个运行过程中，收集大约8mL级分并保持在冰上。根据SDS-PAGE电泳发现来自米曲霉的纯化的PepN 1具有约40kDa的分子量。
将PepN 1和2氨肽酶标准化至2.5-200nkat*mL-1的活性范围。为了蛋白质水解，以初始pH为7.0，将1％(w/wWPI)碱性蛋白酶(DuPont[杜邦公司]，丹麦布拉布兰(Brabrand))和1％(w/wWPI) PNL(DuPont[杜邦公司]，丹麦布拉布兰(Brabrand))添加到乳清蛋白分离物悬浮液中(WPI；9224,ArlaIngredients[阿尔拉成分公司]，丹麦维比(Viby))。添加内肽酶后，将WPI混合，并将200μL转移至96孔微量滴定板的每个孔中。随后，如表2中所示添加5μL的PepN溶液。在没有pH控制的情况下在50℃处进行水解，并且通过添加20μL的2M TCA在18小时后终止水解。在确定DH(Nielsen，Peterson等人，2001，见下文)之前，将所有样品过滤0.22μm。
据发现，在所有剂量下，来自棒曲霉的PepN 2比来自米曲霉的PepN 1实现了更高的DH，并且在测试的四种最高活性剂量下比来自瑞士乳杆菌的PepN 1实现了更高的DH。并且在两个最高剂量下，来自棒曲霉的PepN 2产生的DH比PepN 1氨肽酶高至少25％。
表2：来自棒曲霉的PepN 2与来自瑞士乳杆菌和米曲霉的PepN 1的水解度的比较
实例7：氯化钠浓度对大豆和麸质水解中谷氨酸释放的影响
氯化钠经常用于食品工业，以降低蛋白质水解中的微生物污染风险。预先水解的10％(w/w)大豆760，杜邦公司，丹麦布拉布兰(Brabrand))和麸质(Sigma-Aldrich[西格玛-奥德里奇]，德国施内尔多尔夫)通过添加1％(w/w蛋白质)碱性蛋白酶(杜邦公司，丹麦布拉布兰(Brabrand))和1％(w/w蛋白质) PNL(杜邦公司，丹麦布拉布兰(Brabrand))来制备。水解在50℃处，在pH 7.0(无pH控制)处进行18小时(18小时后热灭活，90℃，10分钟)。随后，将水解产物在含有氯化钠(185mM)的水解产物和无盐水解产物中分开。如表3所示，将150μL每种预水解的蛋白质悬浮液与不同标准化的棒曲霉PepN 2组合。在没有pH控制的情况下在50℃处进行水解，并且通过添加20μL的2M TCA在18小时后终止水解。在确定DH(Nielsen，Peterson等人，2001，见下文)之前，将所有样品过滤0.22μm。如表3所示，185mM NaCl的添加不影响大豆和麸质水解的确定的水解度。
表3：185mM NaCl对大豆和麸质水解的水解度的影响
Nielson,P.M.等人(2001),Journal of Food Science[食品科学杂志]66(5):642-646。
Stressler,T.等人(2013),PloS ONE[公共科学图书馆期刊]8(7)。
实例8：PepN2 TRI031和TRI035对比TRI063(米曲霉)的产物抑制
在该测定中，酶活性通过底物H-Ala-硝基苯胺(pNA)的水解来确定。释放的pNA的吸光度使用微量滴定板读数器在405nm波长处随时间测定。
作为材料缓冲液，使用20mM CPB缓冲液(20mM的柠檬酸钠、磷酸钠和硼酸钠)pH9.0。使用PepN 2TRI031和TRI035的酶样品。将20mg H-Ala-pNA底物(BACHEM[巴赫姆公司]，L-1070)溶于1mL DMSO(二甲基亚砜；Sigma目录号D2650)中。应用96孔板Costar测定板9017(Corning Inc[康宁股份有限公司])，并在来自Molecular Devices[美国分子仪器公司]的读数器中读数。对于抑制研究，从每种氨基酸：赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、色氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中制成10毫升的20毫克/毫升的溶液。将色氨酸和脯氨酸溶于DMSO中。将所有其他的氨基酸溶解在缓冲液中。通过合并500μL的每种氨基酸溶液来制备最终的抑制剂混合物。
将96孔板置于冰上并添加180μL缓冲液、15μL稀释的酶和20μL抑制剂混合物至板上的孔中并混合。每个平板含有抑制剂混合物浓度为0.017mg/ml、0.085mg/ml、0.128mg/ml、0.170mg/ml、0.426mg/ml、0.851mg/ml、1.702mg/ml、2.553mg/ml的所有四种酶。通过添加20μL底物开始反应。每个板只使用一种底物浓度。开始反应后，将板尽可能快地放置在酶标仪中，设置在30℃处，并以30秒的时间间隔测量405nm处的吸光度30分钟。在每个平板上以一个底物浓度运行六个平板(0.017mg/mL、0.170mg/mL、0.426mg/mL、0.851mg/mL、1.702mg/mL、或2.553mg/mL)。为了确定表观抑制常数(Ki)，将数据输出到GraphPad Prism，其对每个抑制剂浓度拟合Michaelis-Menten曲线，并基于此计算的以mg/ml计的Ki。通过使用133.9g/mol的平均抑制剂分子量将单位转化为mM。产物抑制的表观Ki值和不同酶的相应标准偏差(SD)列出于表4中。
表4
从表4可以看出，PepN 2TRI031和TRI035对于产物抑制具有最高的表观Ki值，这意味着与来自米曲霉的TRI063相比，它们受到产物较少的抑制。
实例9：对Glu-pNA和Gln-pNA底物的PepN2和PepN1活性
使用H-Glu-硝基苯胺(pNA)和H-Gln-硝基苯胺(pNA)作为底物，并通过在405nm处的吸光度测量对硝基苯胺(pNA)的释放。作为缓冲液，使用20mM CPB缓冲液(20mM柠檬酸、20mM磷酸钠、20mM硼酸)pH 9.0。将10mg H-Glu-pNA和H-Gln-pNA(来自BACHEM[巴赫姆公司]或Schafer N，丹麦哥本哈根)溶于1ml DMSO(二甲基亚砜来自SIGMA[西格玛公司]；目录号D2650)中。
为了运行测定，将80μL缓冲液、10μL H-Glu-pNA或H-Gln-pNA底物和10μL适当稀释的PepN 2在Costar测定板9017(Corning Inc.[康宁股份有限公司])中在45℃处孵育，并在405nm处使用SoftMaxPro 5.4.1软件运行的酶标仪(Molecular Devices[美国分子仪器公司])中，每30秒钟测量30分钟。活性被确定为在10个时间点确定的曲线的线性部分的最大斜率。
对于纯化的PepN 2TRI031和TRI035样品以及纯化的PepN 1瑞士乳杆菌(Stressler，Eisele等人，同上)和未纯化的PepN 1酱油曲霉( LAP，AB酶)运行测定，上述全部对Ala-pNA或Leu-pNA具有相当的活性(按照实例H中Ala-pNA的描述进行，但没有抑制剂)。如表5所示，两种PepN 2氨肽酶对Glu-和Gln-pNA显示出活性，而作为对比，两种PepN 1酶没有显示出显著的活性。这表明PepN 2氨肽酶在Glu和Gln释放方面比PepN 1氨肽酶更有效。
表5.PepN 2和PepN 1对Glu-pNA和Gln-pNA底物的活性
实例10-在位置2处用脯氨酸水解肽
用TRI032、TRI035、TRI063(米曲霉)以及 LAP的酶样品水解肽文库XPAAAR(X是除半胱氨酸以外的全部氨基酸)。将肽文库XPAAAR(1mg/mL)用在3x 20mM CPB缓冲液(20mM柠檬酸、20mM磷酸盐、20mM硼酸)中的1μg/ml氨肽酶在55℃处孵育。在指定的时间点用50μl 5％TFA终止50μL等分试样并进行LC-MS分析。
数据采集：毛细管LC-MS/MS分析使用衔接到Agilent 1100 LC系统(AgilentTechnologies[安捷伦科技公司])的LTQ Orbitrap Classic杂交质谱仪(ThermoScientific[赛默科技公司]，德国不来梅)进行。将样品加载到15cm Phenomenex Jupiter4μProteo 90A，C4分析柱上。使用0-40％溶剂B H2O/CH3CN/HCOOH(50/950/0.65v/v/v)的10min梯度，以16μL/min的流速进行分离，以进入离子源(Thermo Scientific[赛默科技公司]，圣何塞)。LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行。通过轨道阱(在m/z 400下以60 000的分辨率获得MS扫描)测量肽质量，并且选择多达2个最强的肽m/z，并使用线性离子阱(LTQ)中的CID对其进行片段化。启动动态排除，列表大小为500个质量，持续时间为40s，并且相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm。
无标记定量检测：使用程序Skyline 2.6.0.7176(MacLean，B.等人，同上)访问RAW文件，其使用MS1强度来构建色谱图(Schilling，B.等人，同上)。将前体同位素导入过滤器设置为3个(M、M+1和M+2)计数，分辨率为60,000，并且使用最强的电荷状态。将底物以及裂解产物的肽序列输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。图10是根据三个同位素(M，M+1和M+2)的峰面积之和生成的。包括了底物标准曲线(从标准3.125至标准50的浓度连续增加2倍)，并显示了底物浓度与峰面积之间的线性关系。
LC-MS结果(图10)显示TRI032和TRI035可在两小时的孵育中随时间水解肽TPAAAR至小于一半的浓度，而TRI063(米曲霉)和 LAP在12小时内不显示TPAAAR的水解。
虽然已经在此示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见的是这样的实施例仅以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下，许多变化、改变和替换将是本领域的技术人员能想到的。应该理解的是，在此说明的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实施本发明。旨在按照以下权利要求限定本发明的范围，并且在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也包括在本发明的范围内。

Claims (29)

1.一种具有氨肽酶活性的分离的多肽，所述多肽选自由以下组成的组：
(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQID NO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少80％的同一性；和
(b)(a)的片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。
2.如权利要求1所述的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ IDNO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ IDNO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其片段。
4.如权利要求3所述的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ IDNO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
5.如权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO:18至25中的任一个。
6.一种具有氨肽酶活性的分离的多肽，如图9的序列比对所示的，所述多肽具有在位置67的保守残基I/V的N-末端侧上具有多于13个残基的预测成熟序列或其片段，其中所述片段具有氨肽酶活性。
7.一种分离的多肽，所述多肽具有氨肽酶活性并且与SEQ ID NO:17的氨肽酶相比具有降低的产物抑制。
8.如权利要求7所述的分离的多肽，其中所述多肽如在权利要求1至6中任一项所定义。
9.一种分离的多肽，所述多肽具有氨肽酶活性并且所述多肽能够水解如从N末端开始编号在位置2处具有脯氨酸残基的多肽。
10.如权利要求9所述的分离的多肽，在孵育的2小时内，所述多肽能够将如从N末端开始编号在位置2处具有脯氨酸残基的多肽水解至低于起始浓度的一半。
11.如权利要求9或10所述的分离的多肽，其中所述分离的多肽如在权利要求1至8中任一项所定义。
12.一种分离的核酸序列，所述核酸序列包含编码如权利要求1至8中任一项所述的多肽的核酸序列。
13.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含如权利要求12所述的核酸序列，所述核酸序列有效地连接到一个或多个控制序列上，所述控制序列指导所述多肽在合适的表达宿主中的产生。
14.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如权利要求13所述的核酸构建体、启动子、以及转录和翻译终止信号。
15.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含如权利要求13所述的核酸构建体。
16.如权利要求15所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是木霉属(Trichoderma)细胞，优选地是里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞。
17.一种用于产生如权利要求1至11中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括(a)培养菌株以产生包含所述多肽的上清液；以及(b)回收所述多肽。
18.一种用于产生如权利要求1至11中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括(a)在适于产生所述多肽的条件下培养如权利要求15或16所述的宿主细胞；以及(b)回收所述多肽。
19.一种用于产生如权利要求1至11中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括(a)在有利于产生所述多肽的条件下培养同源重组细胞，所述同源重组细胞中掺入了新的转录单位，所述转录单位包含调节序列、外显子和/或与编码所述多肽的内源核酸序列的第二个外显子有效地连接的剪接供体位点；以及(b)回收所述多肽。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述宿主细胞是木霉属细胞，优选地是里氏木霉细胞。
21.一种用于产生蛋白水解产物的方法，所述方法包括使蛋白质底物经受如权利要求1至11中任一项所述的多肽。
22.如权利要求21所述的方法，所述方法还包括使所述蛋白质底物经受内肽酶。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述水解产物富含Leu、Gly、Glu、Ser、Asp、Asn、Pro、Cys、Ala、和/或Gln。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述水解产物富含Glu和/或Gln。
25.一种从蛋白质底物获得富含游离谷氨酸和/或肽结合的谷氨酸残基的蛋白水解产物的方法，所述方法包括使所述底物经受脱酰胺作用过程和如权利要求1至11中任一项所述的多肽。
26.如权利要求25所述的方法，所述方法还包括使所述底物经受一种或多种非特异性作用的内肽酶和/或外肽酶。
27.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至11中任一项所述的多肽以及合适的载体。
28.一种产生发芽的谷物的方法，所述方法包括：
a)提供谷物颗粒，
b)在发芽过程中向所述谷物中添加有效量的如权利要求1至11中任一项所述的多肽；以及
c)获得发芽的谷物。
29.一种用于在酿造过程中产生游离氨基氮(FAN)的方法，所述方法包括在酿造过程中添加有效量的如权利要求1至11中任一项所述的多肽。
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