JP2018511619A - α−シヌクレイノパチーの治療のためのアシュワガンダ抽出物の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、パーキンソン病を含むα-シヌクレイノパチーの進行を予防、治療または遅延するための、Withania somniferaの植物抽出物由来の組成物の使用に関する。

Description

本発明は、パーキンソン病を含むα-シヌクレイノパチーの進行を予防、治療、または遅延させるために、アシュワガンダ（Withania somnifera）の植物抽出物からの組成物の使用に関する。

「α-シヌクレイノパチー」という用語は、通常、α-シヌクレイン凝集物の一般的な病理学的タンパク質性蓄積を示す一群の神経変性疾患を定義するために用いられる。 これらの疾患では、α-シヌクレイン凝集体が、神経細胞およびグリア細胞の選択的に脆弱な集団に蓄積される（Goedert M（1999）Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 354：1101-1118; Spillantini MG＆Goedert M（2000）Ann NY Acad Sci 920：16-27; Trojanowski JQ＆Lee VM（2003）Ann NY Acad Sci 991：107-110）。

α-シヌクレインの凝集メカニズムは不明である。 ベータ構造が豊富な構造化された中間体が、凝集体の前駆体であり、最終的にはレビー小体であり得るという証拠がある。

臨床的な観点から、α-シヌクレイノパチーにおいては、症候的に異種の疾患が含まれ、その中には、PDなどのレビー小体関連疾患（Lewy bodies-associated diseased）、レビー小体認知症（Lewy body dementia）としても知られるレビー小体での認知症（dementia with Lewy bodies）、びまん性レビー小体病、皮質レビー小体病、およびレビータイプの老年性認知症、多系統萎縮症、レビー小体型嚥下障害ならびに脳鉄蓄積タイプIによる神経変性および純粋な自律神経不全が含まれる。レビー小体疾患は、高齢者における認知症の最も一般的な原因の1つである。認知症は、正常な活動や関係に影響を及ぼすほど重度の精神機能の喪失である。

α-シヌクレインは、主として神経組織に見られる未知の機能のタンパク質であり、脳細胞の細胞質ゾル中の全タンパク質の1％を構成する。主に新皮質、海馬、黒質、視床、および小脳で発現される。これは、主にニューロンタンパク質であるが、神経膠細胞においても見出され得る。心臓、筋肉、および他の組織にはより少量が見られる。脳において、α-シヌクレインは、シナプス前末端と呼ばれる特別な構造の神経細胞（ニューロン）の先端で主に見出される。これらの構造内で、α-シヌクレインはリン脂質およびタンパク質と相互作用する。シナプス前端末は、シナプス小胞として知られるコンパートメントから、神経伝達物質と呼ばれる化学的メッセンジャーを放出する。神経伝達物質の放出は、ニューロン間のシグナルを中継し、正常な脳機能にとって重要である。

α-シヌクレインの機能はよく理解されていないが、シナプス前末端におけるシナプス小胞の供給の維持に重要な役割を果たすことが研究によって示唆されている。 また、随意運動や不随意運動の開始および停止を制御するのに重要なタイプの神経伝達物質であるドーパミンの放出を調節するのに役立つことも可能である。

α-シヌクレインは、獲得関連のシナプス再編成の期間中、脳のシナプス前末端の個別の集団において特異的にアップレギュレートされる。 α-シヌクレインはチューブリンと有意に相互作用し、α-シヌクレインは潜在的な微小管関連タンパク質として活性を有することが示されている。

明らかに、α-シヌクレインは、認知機能の正常な発達に不可欠である。 α-シヌクレインの発現の標的化された不活性化を有するノックアウトマウスは、空間学習および作業記憶の障害を示す。

パーキンソン病（PD）は、米国で2番目に多い神経変性疾患である。

遅い動き、安静時の振戦、硬直および歩行障害を含むPDの主な運動症状は、黒質（SN）におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失によって引き起こされる。 PDの病因はまだ未知のままであるが、遺伝的要因および環境的要因の両方が役割を果たすようである(Vila, M. & Przedborski, S. (2004). Nat. Med., 10 Suppl, S58-S62).

パーキンソン病（PD）における認知機能障害は、PDにおける顕著な非運動症状であり、この疾患の罹患率および死亡率に大きく寄与する。PD患者の認知障害の病因は、異質であり、執行機能不全、思考障害を含み、患者の80％に影響を及ぼす認知症で非常に頻繁に現れる。 従って、パーキンソン病における認知症につながる構造変化さえも同等ではなく、アルツハイマー病における構造的脳変化とは明らかに異なる。

いくつかの研究は、皮質レビー小体と認知症の数との間の関連を示している(Hurtig H.I et al., 2000, Neurology 54(10):1916-1921; Aarsland, D. et al., 2005, Mov Disord 20:1255-1263).

シヌクレイノパチーを治療するための戦略には、α-シヌクレインの凝集を阻害する化合物がある。 小分子クミンアルデヒドはα-シヌクレインの線維化を阻害することが示されている。

パーキンソン病の現在の薬学的治療はドーパミン作動薬に焦点を当てており、これはドーパミンを模倣するか、または体内のドーパミンレベルを上昇させる。 最も一般的な療法は、ドーパミンの代謝前駆体であるレボドパである。 しかしながら、長期レボドパ療法は、しばしば突然の不随意運動である運動障害を伴う。

Withania somnifera、Emblica officinalisおよびBacopa monnieriの抽出物が抗血管新生活性を示すことが報告されている。 しかしながら、これらの植物の抽出物は、抽出物、特にWithania somniferaからの抽出物の入手に関連する高い毒性のために使用されなかった。

Goedert M（1999）Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 354：1101-1118 Spillantini MG＆Goedert M（2000）Ann NY Acad Sci 920：16-27 Trojanowski JQ＆Lee VM（2003）Ann NY Acad Sci 991：107-110 Vila, M. & Przedborski, S. (2004). Nat. Med., 10 Suppl, S58-S62 Hurtig H.I et al., 2000, Neurology 54(10):1916-1921 Aarsland, D. et al., 2005, Mov Disord 20:1255-1263

驚くべきことに、本出願人は、抽出工程と糸状真菌を用いた発酵工程を組み合わせることにより、植物Withania somniferaの抽出物の毒性に影響を及ぼすことによって、糸状真菌、PD、レビー小体認知症としても知られるレビー小体での認知症、びまん性レビー小体病、皮質レビー小体病、およびレビータイプの老年性認知症、多系統萎縮症、レビー小体型嚥下障害ならびに脳鉄蓄積タイプIによる神経変性および純粋な自律神経不全を治療するために無毒化抽出物を用いることが可能であることを発見した。

したがって、本発明の目的は、α-シヌクレイノパチーの進行を予防、治療または遅延させるために、Withania somniferaの抽出物に基づく無毒性組成物を使用することであることを発見した。

本発明の他の目的、特徴、側面および利点は、以下の説明および実施例を読むことにより明らかになるであろう。

：初代中脳培養物（primary mesencephalic culture）のTH陽性ドーパミン作動性ニューロン生存に対する、6-OHDA（異なる濃度）の1時間前のWEB-2の存在下または非存在下における6-OHDA（20μM、24時間）の効果。 データは、平均±SEM（標準誤差）（100％= 6-OHDAなし）として対照のパーセンテージとして表した。 * p <0.05対6-OHDA分散分析（一元配置ANOVA、続いてPLSD Fisher’s testである）。 ：初代中脳培養物のTH陽性ドーパミン作動性ニューロン生存に対する、6-OHDA（異なる濃度）の4時間後のWEB-2の存在下または非存在下での6-OHDA（20μM、24時間）の効果。 データは、平均±SEM（100％= 6-OHDAなし）として対照のパーセンテージとして表した。 * p <0.05対6-OHDA（一元配置ANOVA、続いてPLSD Fisher’s testである）。 ：初代中脳培養物のTH陽性ドーパミン作動性ニューロン生存に対する、6-OHDA（異なる濃度）の8時間後のWEB-2の存在下または非存在下における6-OHDA（20μM、24時間）の効果。 データは、平均±SEM（100％= 6-OHDAなし）として対照のパーセンテージとして表した。 * p <0.05対6-OHDA（一元配置ANOVA、続いてPLSD Fisher’s testである）。 初代中脳培養物のTH陽性ドーパミン作動性ニューロン生存に対する、6-OHDA（異なる濃度）の12時間後のWEB-2の存在下または非存在下における6-OHDA（20μM、24時間）の効果。 データは、平均±SEM（100％= 6-OHDAなし）として対照のパーセンテージとして表した。 * p <0.05対6-OHDA（一元配置ANOVA、続いてPLSD Fisher’s testである）。 初代中脳培養物のTH陽性ドーパミン作動性ニューロン生存に対する、植物抽出物WEB-2またはBDNF（50ng/mL）の存在下または非存在下におけるMPP ⁺（4μM、48時間）の効果。 データは、平均±SEM（100％= MPP ⁺なし）として対照のパーセンテージとして表した。# p <0.05対照対MPP ⁺群; * p <0.05対MPP ⁺（一元配置ANOVA、続いてDunnett testである）。 初代中脳培養物のTH陽性ドーパミン作動性ニューロン生存に対する、WEB-1（異なる濃度）の存在下または非存在下におけるMPP ⁺（4μM、48時間）の効果。 データは、平均±SEM（100％= MPP ⁺なし）として対照のパーセンテージとして表した。 * p <0.05対MPP ⁺条件（一元配置ANOVA、続いてPLSD Fisher’s testである）。 初代中脳培養物のTH陽性ドーパミン作動性ニューロン生存に対する、BE-2（異なる濃度）の存在下または非存在下におけるMPP ⁺（4μM、48時間）の効果。 データは、平均±SEM（100％= MPP ⁺なし）として対照のパーセンテージとして表した。 * p <0.05対MPP ⁺条件（一元配置ANOVA、続いてPLSD Fisher’s testである）。 ：初代中脳培養物のTH陽性ドーパミン作動性ニューロン生存に対する、ロテノン（異なる濃度）の1時間前のWEB-2の存在下または非存在下におけるロテノン（10nM、24時間）の効果。 データは、平均±SEM（100％=ロテノンなし）として対照のパーセンテージとして表した。 * p <0.05対ロテノン（一元配置ANOVA、続いてPLSD Fisher’s testである）。 初代中脳培養物のTH陽性ドーパミン作動性ニューロン生存に対する、ロテノン（異なる濃度）の4時間後のWEB-2の存在下または非存在下におけるロテノン（10nM、24時間）の効果。 データは、平均±SEM（100％=ロテノンなし）として対照のパーセンテージとして表した。 * p <0.05対ロテノン（一元配置ANOVA、続いてPLSD Fisher’s testである）。 初代中脳培養物のTH陽性ドーパミン作動性ニューロン生存に対する、ロテノン（異なる濃度）の8時間後のWEB-2の存在下または非存在下におけるロテノン（10nM、24時間）の効果。 データは、平均±SEM（100％=ロテノンなし）として対照のパーセンテージとして表した。 * p <0.05対ロテノン（一元配置ANOVA、続いてPLSD Fisher’s testである）。 初代中脳培養物のTH陽性ドーパミン作動性ニューロン生存に対するロテノン（異なる濃度）の12時間後のWEB-2の存在下または非存在下におけるロテノン（10nM、24時間）の効果。 データは、平均±SEM（100％=ロテノンなし）として対照のパーセンテージとして表した。 * p <0.05対ロテノン（一元配置ANOVA、続いてPLSD Fisher’s testである）。

本発明は、哺乳動物のα-シヌクレイノパチーの進行を予防、治療または遅延させるための、Withania somnifera抽出物を含有する組成物の使用に関する。 好ましくは、哺乳動物はヒトである。

好ましくは、Withania somnifera抽出物は、適切な環境下で糸状真菌とのインキュベーションによって発酵されている。

Withania somnifera植物はインドから得られる。 この植物の根はAlp Erbo（Marseille）によって販売されている。

本発明による抽出物の製造方法は、国際公開第2014/202469号に見出すことができる。 簡潔に述べると、植物はコリ科（Cordycipitaceae）、好ましくはボウベリア（Beauveria）属の糸状真菌の存在下で発酵される。より好ましくは、糸状真菌は、Beauveria bassiana株、より詳細には参照番号ATCC 7159を有する株に由来する。

制御された発酵は、Withania Somnifera抽出物に含まれる様々な分子の一連の生体触媒、特に主に抽出物の毒性に関与する物質であるビアノリドアグリコン（withanolide aglycones）の化学的ファミリーによってこの抽出物を解毒する。

用語「解毒」は、培地中の潜在的に有毒な分子を微生物により排除すことを意味するために使用される。

好ましくは、発酵、濾過の後、培地は、植物抽出物を構成する溶液を得るために、滅菌工程、好ましくは限外濾過による滅菌工程に付される。

本発明の植物抽出物は、Withania somniferaを含有するが、以下の抽出物、インドに由来しInfrag（Bengalore）によって販売されているEmblica officinalis、Alp Erbo（Marseille）によって販売されているBacopa monnieri（India）、Punica granatum（China）（Shanghai Brightol International Co（Shanghai）、Curcuma longa（India）（Omnipharm,Chambery）、Piper longum（Thailand）（Omnipharm,Chambery）、またはCalendula officinalis（China）（Shanghai Brightol International Co（Shanghai）、同じ手順を用いる）を、前記調製物の実現に使用される各植物抽出物についての独立した抽出工程による少なくとも1つを含むこともできる。

有利には、本発明において使用される組成物は、質量で5~100g/L、好ましくは20g/LのWithania somniferaを含む。 好ましくは、この組成物は、質量で表し、以下の抽出物のいずれかも含む：
- 5〜100g/L、好ましくは15 g/LのEmblica officinalis、
- 5〜100g/L、好ましくは15g/LのBacopa monnieri、
- 5〜50g/L、好ましくは10g/LのPunica granatum、
- 5〜250g/L、好ましくは20g/LのCurcuma longa、
- 20〜50mg/L、好ましくは30mg/LのPiper longum、
- 5〜50g/L、好ましくは10g/L、Calendula officinalis。

好ましくは、本発明に使用される組成物は、植物Withania somnifera、Emblica officinalisおよびBacopa monnieriの抽出物を含む。 より好ましくは、本発明による組成物は、20g/Lの濃度のWithania somnifera、15g/Lの濃度のEmblica officinalisおよび15g/Lの濃度のBacopa monnieriを含む。

本発明の組成物は、パーキンソン病、認知症レビー小体、多系統萎縮症、レビー小体嚥下障害、神経軸索ジストロフィーおよび脳鉄蓄積タイプIによる神経変性の治療または予防に使用される。

本明細書に記載の方法に従って治療することができる運動障害（Motor impairments）または運動機能障害（impairments of motor function）には、限定されないが、一般的な運動障害、ウォーキング障害、歩行障害（例えば、歩行凍結）、歩行の望ましくない加速、姿勢の不安定、前かがみの姿勢、転倒の増加、ジストニア、ジスキネジー、振戦、硬直、動作緩慢、小字症（micrographia）、器用障害（dexterity impairment）、運動協調障害、腕の振れの減少、アカシジア、言語障害、嚥下問題、性的機能不全、痙攣およびよだれを含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される方法に従って治療される運動障害は、ジスキネジー、ジストニア、または運動変動（motor fluctuation）のいずれかである。他の実施形態においては、運動障害は、振戦、運動緩慢、または硬直のいずれかである。特定の実施形態においては、本明細書に記載される方法に従って治療される運動障害は、一般的な運動性の障害である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される運動障害または一般的な運動障害は、歩行障害である。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される歩行障害は、歩行速度の低下である。さらに別の実施形態においては、本明細書に記載される方法に従って治療される歩行障害は、歩行における望ましくない加速である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される運動障害は、転倒の増加である。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される運動障害は、姿勢不安定または姿勢不均衡などのバランス障害である。

いくつかの実施形態においては、個体におけるα-シヌクレイノパチーを治療する方法であって、被験体における前記α-シヌクレイノパチーが治療または予防されるような治療量の植物抽出組成物を個体に送達するステップを含み、 該組成物は、Withania somniferaの植物抽出物を含有する。

α-シヌクレイノパチーは、パーキンソン病、認知症レビー小体、多系統萎縮症、レビー小体嚥下障害、神経軸索ジストロフィーおよび脳鉄蓄積タイプIによる神経変性を含む。

本発明は、パーキンソン病（PD）を有する患者の治療方法を提供する。 特に、本発明は、PD患者のPDに関連する1つまたは複数の障害の治療を提供する。

いくつかの実施形態では、本方法は、治療を必要とする対象におけるPDに関連する認知症の進行を予防、治療または遅延させ、治療有効量の本発明の組成物を該対象に投与することを含む。

本発明による組成物は、経口または非経口投与のために製剤化される。

医薬製剤の当業者は、本発明の組成物および/またはサプリメントの投与のための様々な有用な形態を実施するであろう。 組成物は、液体、ゲル、エマルジョン、固体または注射可能な形態であり得る。

使用される組成物は、慣用的に使用される不活性希釈剤、および湿潤剤、甘味料、防腐剤、増粘剤、着色剤または経口投与に適した、当業者に知られている任意の他の物質、特に（ソルビン酸ナトリウム（E201）（Sigma-Aldrich）、アントシアニン（E163）（FBC Industries,USA）、メタ重亜硫酸ナトリウム（E223）（Sigma-Aldrich）、α-トコフェロール（E307）(FBC Industries, USA)を含む懸濁液、エマルジョン、シロップをさらに含み得る。

使用される組成物はまた、溶媒または水、プロピレングリコール、植物油若しくは他の適切な有機溶媒のような他の賦形剤を含み得る。

用語「賦形剤」は、本発明による組成物の生物学的活性の有効性を妨げず、投与される宿主に対して毒性でない任意の化合物を意味するために使用される。

使用される組成物はまた、湿潤剤、アイソトニング剤、乳化剤、塩または当業者に公知の他の物質のようなアジュバント（ポリジメチルシロキサン、ポリビニルアルコール（PVA）、ヒドロゲル（Carbopol）、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）、ポロキサマー188、EDTA、クロロブタノール）(Lubrizol, France, Dow Corning, USA)を含むことができる。

有利には、組成物は、ビタミン、ミネラル塩、薬学的に許容されるベクター、安定剤、酸化防止剤、または当業者に知られている、薬物に組み込まれることを意図した他の物質などの他の物質を含むことができる。

好ましくは、組成物は液体であり、経口投与可能であり、少なくとも、Whitania somniferaの非毒性抽出物、いくつかの防腐剤、ビタミン、水および塩を含有する。

より好ましくは、防腐剤は、ソルビン酸カリウムまたは安息香酸カリウムである。 ビタミンはリボフラビン（ビタミンB2）であってもよい。

本発明の方法において使用される治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中で投与される。

「薬学的に許容されるビヒクル」という用語は、本発明の組成物の生物学的活性の有効性を妨げず、かつそれが投与される宿主に対して毒性でないビヒクルを意味するために使用される。

得られた組成物は、α-シヌクレイノパチーに関連する障害または疾患および特にPDの治療または予防を助けるために、哺乳動物、より詳細にはヒトのための医薬品として使用可能である。

「医薬品」という用語は、欧州指令65/65 / ECに従って正確な用量の前記製剤を含有する製品、すなわちヒトまたは動物の疾患に関して治療または予防特性を有すると記載されているいずれかの物質または組成物を意味する。 例えば、前記製剤を治療用量で含有する医薬品は、カプセルまたは錠剤として経口投与され得るか、または有益な効果をもたらす他の経路を介して注入され得る。

治療組成物の適切な投与量は、患者の体重、患者の身体状態などの典型的な要因と共に、本明細書に記載される知見を考慮して、当業者によって決定され得る。 投与量は、PDを含むα-シヌクレイノパチーの治療に有効な量の治療用組成物を含むべきである。

この薬物を、毎日、毎週、または間欠的に投与することができる。 例えば、薬物は、当業者によって決定され得るように、3ヶ月間投与、続いて1ヶ月間非投与、または1ヶ月間投与、続いて1週間非投与、または他の投与スケジュールで投与され得る。

選択される特定の用量は、選択された投与様式（mode）および投薬レジメンに依存する。 1つの好ましいスケジュールは、1日1回の経口投与スケジュールである。 各適用（静脈（i.v）投与の場合に典型的に）の合間に長い期間が規定される場合、各単位用量は、1日用量が提供される場合よりも大きくなり得る。

使用される組成物の1日用量は、患者の症状の必要性および重症度並びに経路に応じて変動し得る。 典型的には、1日用量は、発酵後の溶液10mg/mL〜300mg/mLである。

好ましくは、成人の1日用量は、発酵後の溶液30〜100mg/mLである。

本発明は、添付の図面を参照して以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に説明される。 以下の方法を、方法の記載に従う実施例に記載の実験において用いた。

実施例1：発酵前の組成物WEB-1
組成物WEB-1は、20g/Lの濃度のWithania Somnifera、15g/Lの濃度のEmblica officinalis、15g/Lの濃度のBacopa monnieriの市販抽出物を含む。

100mLの溶液を水において調製する。 凍結乾燥後、3.8gのベージュ色の粉末が得られる。

実施例2：糸状真菌Beauveria bassianaの菌株
Beauvaria Bassiana株（参照ATCC 7159）を、0.5g/LのKH₂PO₄ ; 1 g/L KH₂PO₄ ; 1 g/L MgSO₄ ; 2 g/L NaNO₃ ; 0.5 g/L KCl ; 0.02 g/L FeSO₄ ; 30 g/L グルコース (すべての試薬はSigma-Aldrich, Franceからである)および10 g/Lコーンスティープリカー（Roquette、France）を含む培地で培養した。

次に培養物を200回転/分で27℃で72時間攪拌した。 その後、濾紙上で非滅菌法により濾過して真菌バイオマスを培地から分離した。 次いで、真菌バイオマスを水で十分に洗浄した。

実施例3：本発明に用いられる組成物WEB-2
実施例1の組成物WEB-1を、50gのグルコースを含有する1リットルの組成物WEB-1当たり、60gのバイオマスを用いて、実施例2の新鮮な真菌バイオマスに添加する。

インキュベーション後、この播種した組成物（seeded composition）を27℃の温度で5日間200rpmで撹拌した。

5日後、インキュベーション培地を濾紙上で濾過し、HPLCアッセイ用のサンプルを0.45ミクロンフィルター(Ait-France, 参照: SFNY 013045N)も用いて濾過した。

得られた褐色の溶液を次に5日間凍結乾燥して乾燥ベージュ粉末を生成した。

実施例4：本発明に用いられる組成物WE-2
組成物WE-1は、濃度20g/LのWithania Somniferaおよび濃度15g/LのEmblica officinalisの市販抽出物を含有する。

このような溶液100mLに、グルコース5gおよび実施例2のバイオマス6gを添加する。

実施例3のように溶液を処理し、凍結乾燥した後、4.13gのベージュ色の粉末が得られる。

組成物WE-2において同定されたマーカーは、ビラノシドIV、ビラノシドVIおよび没食子酸であった。

実施例5：本発明に用いられる組成物WB-2
組成物WB-1は、濃度20g/LのWithania Somniferaおよび濃度15g/LのBacopa Monnieriの抽出物を含む。

このような溶液100mLに、グルコース5gおよび実施例2のバイオマス6gを添加する。
実施例3のように溶液を処理し、凍結乾燥した後、ベージュ色の粉末2,62gが得られる。

組成物WB-2において同定されたマーカーは、ビラノシドIV、ビラノシドVI、バコサイドA3、バコパシドXおよびバコパサポニンCであった。

実施例6：本発明で使用する組成物BE-2
組成物BE-2は、濃度15g/LのBacopa Monnieriおよび濃度15g/LのEmblica officinalisの抽出物を含む。

このような溶液100mLに、グルコース5gおよび実施例2のバイオマス6gを添加する。

実施例3のように溶液を処理し、凍結乾燥した後、ベージュ色の粉末2.62gが得られる。

組成物BE-2において同定されたマーカーは、バコパシドX、バコパサポニンCおよび没食子酸であった。

実施例7：本発明による組成物WEB-4
組成物WBE-4は、濃度40g/LのWithania Somnifera、濃度15g/LのBacopa Monnieri、および濃度15g/LのEmblica officinalisの抽出物を含む。

このような溶液100mLに、グルコース5gおよび実施例2のバイオマス6gを添加する。

実施例3のように溶液を処理し、凍結乾燥した後、4.23gのベージュ色の粉末が得られる。

実施例8：本発明に用いられる組成物WEB-6
組成物WEB-6は、濃度20g/LのWithania Somnifera、濃度15g/LのBacopa Monnieri、および濃度30g/LのEmblica officinalisの抽出物を含む。

このような溶液100mLに、グルコース5gおよび実施例2のバイオマス6gを添加する。

実施例3のように溶液を処理し、凍結乾燥した後、4.22gのベージュ色の粉末が得られる。

実施例9：本発明に用いられる組成物WEB-8
組成物WEB-8は、濃度20g/LのWithania Somnifera、濃度30g/LのBacopa Monnieri、および濃度15g/LのEmblica officinalisの抽出物を含む。

このような溶液100mLに、実施例2のグルコース5gおよびバイオマス6gを添加する。

実施例3のように溶液を処理し、凍結乾燥した後、3.76gのベージュ色の粉末が得られる。

実施例10：6-OHDAへの暴露後の神経保護効果

この研究は、6-OHDAへの暴露後のラット初代中脳培養物（rat primary mesencephalic cultures）に対する本発明の植物抽出物の神経保護効果を調べた。

疫学研究は、殺虫剤の使用が、黒質（substantia nigra）のミトコンドリア呼吸鎖における複合体Iの活性の低下を介してPDのリスクを増加させ、PDの病因をもたらす可能性があることを示唆している。 パーキンソン病に冒された脳に蓄積する6-ヒドロキシドパミン（6-OHDA）、H ₂ O ₂酸化促進剤、天然のドーパミン作動性代謝産物がこの病理に強く寄与しているようである(Giordano S, et al., PLoS One. 2012; 7(9))。

a） 中脳ニューロンの培養
ラットドーパミン作動性ニューロンは、Schinelliら、1988 (Visanji et al., 2008 FASEB J. 2008; 22(7):2488-97)記載されているように培養した。簡潔に述べると、15日齢のラット胚（Janvier Labs,France）から得た中脳を顕微鏡下で解剖した。胚中脳を除去し、2％のペニシリン - ストレプトマイシン（(PS, Batch 1451013, Pan Biotech)および1％のウシ血清アルブミン(BSA, Batch K030913, Pan Biotech)を含有するLeibovitz（(L15, Batch 4290114, Pan Biotech, Germany)の氷冷培地中に配置した。ドーパミン作動性ニューロンに富む発生中の脳の領域である中脳屈曲部の腹側部分を細胞調製に使用した。

中脳を37℃で20分間トリプシン処理（trypsinisation）することにより解離させた(Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% (Batch 7310713, PanBiotech))。反応は、DNAase IグレードII (0.1 mg/mL, Batch H131108, PanBiotech) および10％のウシ胎仔血清(FCS, Batch 41Q7218K, Gibco)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Batch 9710913, PanBiotech) の添加によって停止された。次いで、細胞を10mLのピペットに3回通して機械的に解離させた。次に細胞をL15培地中のBSA（3.5％）の層において+ 4℃で10分間180×gで遠心分離した。上清を捨て、2％のB27(Batch 1589889, Invitrogen)、2mMのL-グルタミン(Batch 8150713, PanBiotech) 、2％のPS溶液、10ng/mLの脳由来神経栄養因子 (Batch H140108, PanBiotech) および1ng/mLのグリア由来神経栄養因子 (Batch H130917, Pan Biotech)を補充したNeurobasal (Batch 1576979, Invitrogen, France)からなる規定の培地に細胞ペレットを再懸濁した。トリパンブルー排除試験を用いて、Neubauerサイトメーターで生存細胞を計数した。細胞を、ポリ-L-リジン(Batch 3102256, Corning Biocoat)で予めコーティングした96ウェルプレート中補充した神経細胞培地に40000細胞/ウェルの密度で播種し、5％CO₂/95％空気雰囲気中37℃で加湿インキュベーター中で維持した。 2日ごとに新鮮培地で培地の半分を交換した。

培養6日目に、培地を除去し、対照培地で希釈した20μMの6-OHDA(Sigma, Batch: 083M4624V)を用いずにまたはそれを用いて、新鮮な培地を添加し、１条件あたり6ウェルを評価した。

b）6-OHDA暴露
培養6日目に、実施例1のWEB-2植物抽出物（50、5mg/mL、500、50、5μg/mLおよび500ng/mL）を培地で希釈し、次いで6-OHDA適用前に、または6-OHDA適用の4、8または12時間後に、中脳ニューロンと1時間プレインキュベートした。 6-OHDA溶液を、対照培地で希釈した20μMの最終濃度まで添加した。

c）免疫染色
24時間後、室温で20分間、PBS (Batch 7560414, PanBiotech)、pH = 7.3中の4％パラホルムアルデヒド(Batch SLBF7274V, Sigma)溶液で細胞を固定した。 細胞を再びPBSで2回洗浄し、透過性にし、0.1％サポニン(Batch BCBJ8417V, Sigma, France)および1％FCSを含むPBSの溶液を用いて、非特異的部位を室温で15分間ブロックした。 次に、細胞を、1％FCS、0.1％サポニンを含有するPBS中1/10000の希釈率で、マウスで作製したモノクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体(Batch 101M4796, Sigma)と共に室温で2時間インキュベートした。 この抗体は、室温で1時間、1％FCS、0.1％サポニンを含有するPBS中の1/800に希釈したAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG (Batch 1397999, Molecular probe, France)で明らかにした。

チロシンヒドロキシラーゼ（TH）は、フェニルアラニンのドーパミンへの変換に関与する。 カテコールアミンの合成における律速酵素として、チロシンヒドロキシラーゼは、アドレナリン作動性ニューロン（adrenergic neurons）の生理学において重要な役割を有し、ドーパミン作動性ニューロンのマーカーとして通常使用されている。

d 結果
免疫標識した培養物を、x10倍率のLEDを備えたImageXpress (Molecular Devices, United Kingdom)で自動的に調べた。各条件（6つの培養ウェル）について、1ウェルあたり20個の自動フィールド（ウェルの全表面の約80％に相当する）を分析した。 THニューロンの総数は、MetaXpressソフトウェア（Molecular Devices）を用いて分析した。

MPP ⁺損傷を表示するために、データを対照条件のパーセンテージ（MPP ⁺なし = 100％）で表した。 異なる条件についての統計学的分析を用いて6ウェルの平均+/- SEM（s.e.平均）として表した（許容される場合は、GraphPad Prismソフトウェアを用いてDunnett testを行った）。

6-OHDA（20μM-24時間）は有意な細胞死を誘導した（> 25％）。 6-OHDA適用前に1時間プレインキュベートしたWEB-2では、500ng/mLの用量で完全な有意な保護効果が観察された（100％生存）。 最高用量（1μg/mL）は、保護効果を有意に誘導した（86％で）。 この効果は、最高濃度（500μg/mL）でWEB-2が毒性になり、用量とともに徐々に消失した。 最低用量（100ng/mL）は、TH陽性ニューロンに何の影響も示さなかった（図1）。

6-OHDA適用4時間後に添加されたWEB-2は、6-OHDA（5μg/mL）の有害な効果を完全に逆転させ、有意な防御効果が観察された（約100％生存）。 100および500μg/mLのWEB-2の用量は毒性がある。 最も低い濃度（100ng/mL〜1μg/mLの間）は、いかなる保護効果も示さなかった（図2）。

毒素適用の8時間後に添加されたWEB-2は、保護効果（5μg/mLで約100％の生存）を示し、10μg/mLは効率的であった。 2つの最高用量は有毒であった（図3）。

6-OHDA適用の12時間後に、WEB-2はまだニューロンを死から保護することができた（なお5μg/mL）。 この手順（6-OHDA適用後12時間）では、最高用量のみが毒性（500μg/mL）を示した。 他の全ての用量は不活性であった（図4）。

e）結論
・初代中脳培養物に6-OHDA（20μM〜24時間）を適用すると、有意なTH陽性ニューロン（ドーパミン作動性ニューロン）の死が誘導された。
・WEB-2は活性であり、6-OHDAによって誘導された損傷からドーパミン作動性ニューロンを保護する。
・プレインキュベーションで添加した場合のWEB-2は、500 ng/mLおよび1μg/mLの濃度でニューロンを保護し、最高用量（500μg/mL）で毒性を示した。
・対照的に、6-OHDAの数時間後に加え、毒素がミトコンドリアへの毒性効果を示し始めた場合、WEB-2は最高用量5μg/mLで損傷を取り返した。
・WEB-2の最も活性な用量の範囲は、500μg/mL（予防の際に添加）から開始し、損傷発生後に添加した場合は5μg/mLであるとみなされる。

実施例11：MPP⁺に曝露した後の神経保護効果
この研究は、1-メチル-4-フェニルピリジニウム（MPP ⁺）に曝露した後のラット初代中脳培養物に対する本発明の植物抽出物の神経保護効果を調べた。

神経毒性1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP）は、特定のドーパミン作動性ニューロン毒素である。 MPTPはアストログリアによってMPP⁺に変換され、次いでSNにおいて特異的なドーパミン作動性ニューロンの死を引き起こし、したがってヒト、霊長類およびマウスにおけるPDの臨床症状をもたらす(Visanji et al., 2008 FASEB J. 2008; 22(7):2488-97, Giordano S, et al., PLoS One. 2012; 7(9))。 MPP⁺は、ドーパミントランスポーターを介して選択的にドーパミンニューロンに入り、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体Iもブロックする。

そのようなアッセイでは、脳由来成長因子（BDNF）を標準分子として用いた。

a）中脳ニューロンの培養
中脳ニューロンを先の例のように培養した。
培養の6日目に、培地を除去し、対照培地で4μMに希釈したMPP⁺ (Batch 092M4729V, Sigma, France)を用いずに、またはそれを用いて新鮮な培地を加えた。 1条件あたり6ウェルを評価した。

b）MPP⁺暴露
培養6日目に、WEB-2植物抽出物（500ng/mL、1,5,10,50,100,500μg/mLおよび1mg/mL）を培地に溶解し、次いで、 MPP⁺適用前に、初代中脳ニューロンと1時間プレインキュベートした。 MPP⁺溶液を、WEB-2の存在下で対照培地において希釈した4μMの最終濃度まで添加し、96ウェルプレート（1条件あたり6ウェル）中の1次培養物（primary culture）で48時間後に試験した。

a）免疫染色
細胞を固定し、洗浄し、透過性にし、非特異的部位をブロックした。 次いで、細胞をモノクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼと共にインキュベートし、実施例10と同様にAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGで明らかにした。

b）結果
免疫標識した培養物を、x10倍率のLEDを備えたImageXpress (Molecular Devices, United Kingdom)で自動的に調べた。 各条件（6つの培養ウェル）について、1ウェルあたり20個の自動フィールド（ウェルの全表面の約80％に相当する）を分析した。 THニューロンの総数は、MetaXpressソフトウェア（Molecular Devices）を用いて自動的に分析した。

MPP⁺損傷を表示するために、データを対照条件のパーセンテージ（MPP⁺なし= 100％）で表した。 全ての値を、異なる条件についての統計学的分析を用いて6ウェルの平均+/-SEM（s.e.平均）として表した（許容される場合は、ANOVAに続いて、GraphPad Prismソフトウェアを用いてDunnett testを行った）。

結果は、MPP⁺（4μM〜48時間）が有意な細胞死（> 35％）を誘導したことを示す。 WEB-2組成物（50μg/mL）の存在下で、重大な有意な保護効果が観察された（93％生存）（図5）。

参照化合物として使用されるBNDF（50ng/mL）は、有意にMPP⁺誘導される損傷から細胞を保護することが可能であったが、興味深いことに、この神経保護効果は、BDNFの治療で観察されたものよりも高かったです。さらに、この効果は最低用量（5μg/mLおよび500ng/mL）で依然として観察された。

2つの最高濃度（50および5mg/mL）では、WEB-2組成物は有毒であった。 それゆえ、活性濃度の範囲は500μg/mLの用量付近のように見えた。

e）結論
・初代中脳培養に適用したMPP⁺（4μM - 48h）は、有意なTH陽性ニューロン（ドーパミン作動性ニューロン）の死を誘導した。
・50μg/mLで試験したWEB-2抽出物は、50ng/mLのBDNFで観察された効果よりも重要な、MPP⁺誘発損傷に対する重要かつ有意な神経保護効果を示した。
・WEB-2抽出物の最も活性な用量の範囲は500μg/mLから開始し、50μg/mLで最大効果を示したようであった。

実施例12：異なる植物抽出物の試験
この研究の目的は、異なる濃度（500ng/mL、1,5,10,50,100,500μg/mLおよび1mg/mL）の異なる2つの抽出物（WEB-1およびBE-2）をMPP⁺損傷後のTH陽性のニューロン生存に対しテストすることであった。

a）中脳ニューロンの培養
中脳ニューロンを先の例のように培養した。
培養の6日目に、培地を除去し、対照培地で4μMに希釈したMPP⁺(Batch 092M4729V, Sigma, France)を用いずに、またはそれを用いて新鮮な培地を加えた。 1条件あたり6ウェルを評価した。

b）MPP⁺暴露
培養6日目に、植物抽出物（500ng/mL、1,5,10,50,100,500μg/mLおよび1mg/mL）を培養培地に溶解し、次いで、MPP⁺適用の前に１時間、初代中脳ニューロンでプレインキュベートした。MPP⁺溶液を、植物抽出物の存在下で対照培地で希釈した4μMの最終濃度まで添加した。

c）免疫染色
細胞を固定し、洗浄し、透過性にし、非特異的部位をブロックした。 次いで、細胞をモノクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼと共にインキュベートし、実施例11のようにAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGで明らかにした。

d）結果
免疫標識した培養物を、x10倍率のLEDを備えたImageXpress (Molecular Devices, United Kingdom)で自動的に調べた。 各条件（6つの培養ウェル）について、1ウェルあたり20個の自動フィールド（ウェルの全表面の約80％に相当する）を分析した。 THニューロンの総数は、MetaXpressソフトウェア（Molecular Devices）を用いて自動的に分析した。

MPP⁺損傷を表示するために、データを対照条件のパーセンテージ（MPP⁺なし= 100％）で表した。 全ての値を、異なる条件についての統計学的分析を用いて6ウェルの平均+/-SEM（s.e.平均）として表した（許容される場合は、ANOVAに続いて、GraphPad Prismソフトウェアを用いてDunnett testを行った）。

MPP⁺（4μM〜48時間）は有意な細胞死を誘発した（> 30％）。

WEB-1（5μg/mLおよび最高濃度）の存在下で、大きくかつ有意な毒性効果が観察された。 2つの最低用量（500ng/mLおよび1μg/mL）のみが不活性であった（図6）。

BE-2との1時間のプレインキュベーションは、1,5および10μg/mL用量のMPP⁺誘導損傷に対する有意な保護効果を誘導した。 対照的に、最も低い濃度は不活性（500ng/mL）であり、50μg/mLを超える場合、BE-2はMPP⁺の毒性を増加させた。

BE-2の神経保護効果は用量とともに増加し、50μg/mLの濃度から毒性となった（図7）。

c）結論
・初代中脳培養に適用したMPP⁺（4μM − 48時間）は、有意なTH陽性ニューロン（ドーパミン作動性ニューロン）の死を誘導した。
・WEB-1は、最低濃度で不活性であったか、またはTHドーパミン作動性ニューロンに対して毒性であった。
・BE-2は、1〜10μg/mLの範囲の活性を有するMPP⁺によって誘発された損傷に対して保護的であった。

例13：ロテノンに暴露した後の神経保護効果
この研究は、インビトロ（in vitro）PDモデルである、ロテノン（10nM、24時間）に曝露した後のラット初代中脳培養物に対する本発明WEB-2（前処置および復帰適用）の植物抽出物の神経保護効果を調べた。

c）中脳ニューロンの培養
中脳ニューロンは先の例のように培養した。

培養の6日目に、培地を除去し、対照培地で希釈した10nMのロテノン(Batch: 021M2227V, Sigma)を用いずに、またはそれを用いて新鮮培地を添加し、１条件あたり6ウェルを評価した。

d）ロテノン暴露
培養6日目に、WEB-2植物抽出物（500ng/mL、1,5,10,50,100,500μg/mLおよび1mg/mL）を培地に溶解し、次いで、ロテノンの適用の前1時間または適用後の4,8または12時間に中脳ニューロンとプレインキュベートした。 ロテノン溶液を、WEB-2の存在下で対照培地で希釈した10nMの最終濃度に加え、96ウェルプレート（１条件当たり6ウェル）で試験した。

e）免疫染色
細胞を固定し、洗浄し、透過性にし、非特異的部位をブロックした。 次いで、細胞をモノクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼと共にインキュベートし、実施例10と同様にAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGで明らかにした。

チロシンヒドロキシラーゼは、フェニルアラニンのドーパミンへの変換に関与している。 カテコールアミンの合成における律速酵素として、チロシンヒドロキシラーゼは、アドレナリン作動性ニューロン（adrenergic neurons）の生理学において重要な役割を果たす。 チロシンヒドロキシラーゼはドーパミン作動性ニューロンのマーカーとして通常使用されており、これは特にパーキンソン病の研究に関係している。

f）結果
免疫標識した培養物を、x10倍率のLEDを備えたImageXpress（Molecular Devices）で自動的に調べた。 各条件（6つの培養ウェル）について、1ウェルあたり20個の自動的なフィールド（ウェルの全表面の約80％に相当する）を分析した。 THニューロンの総数は、MetaXpressソフトウェア（Molecular Devices）を用いて自動的に分析した。

データを、ロテノン傷害を表示するために、対照条件のパーセンテージ（中毒なし、ロテノンなし= 100％）で表した。 すべての値を6ウェルの平均+/-SEM（s.e.平均）として表した。 Neuro-Sysは、異なる条件でグラフおよび統計学的分析を行った（許容される場合は、ANOVAに続いて、GraphPad Prismソフトウェアを用いて、Dunnett testを行った）。

ロテノン（10nM、24時間）は有意な細胞死（約40％）を誘導した。 ロテノン適用の1時間前にWEB-2とプレインキュベートし、10μg/mLの用量で完全な有意な保護効果が観察された（約100％生存）。同様に、1,5および50μg/mLで有意な保護効果が観察された（図8）。

2つの最高用量（100μg/mLおよび500ng/mL）は、TH陽性ニューロンに何の影響も示さなかった。

ロテノン適用の4時間後に加えられたWEB-2は、THニューロンの生存に影響を与えなかった。 最高用量（500μg/mL）のWEB-2は毒性があった（図9）。

同様に、毒素適用の8時間後に加えられるWEB-2は、生存に影響を与えなかった（図10）。 最高用量は毒性であった。 ロテノンの適用の12時間後に添加されたWEB-2は、最高用量（500μg/mL）で毒性を示す（図11）。

他の全ての用量は不活性であった。

g）結論
・初代中脳培養物（primary mesencephalic culture）に適用されたロテノン（10nM〜24時間）は、有意なTH陽性ニューロン（ドーパミン作動性ニューロン）の死を誘導した。
・WEB-2は、保護処置に適用された（毒素適用の1時間前）場合、ロテノン損傷からTH陽性ニューロンを有意に保護することができ、それに対し、ロテノンの適用後に加えられた場合、何の効果は観察されなかった。
・WEB-2は、ロテノンの毒性からニューロンを保護することができたが、毒素によって誘発された損傷を逆転または停止することができなかった。

Claims (14)

1. 哺乳類、好ましくはヒトにおいてα-シヌクレイノパチーの治療または予防において使用するための、適切な環境下で糸状真菌とのインキュベーションにより発酵されたアシュワガンダ（Withania somnifera）抽出物を含有する組成物。
2. 発酵が、
   1512000623045_0
   （Cordycipitaceae）の糸状真菌、好ましくは ボーベリア（Beauveria）属、より具体的にはボーベリア・バッシアナ（Beauveria bassiana）由来である、請求項1に記載の組成物。
3. 以下の植物からの少なくとも1つの抽出物をさらに含有する、請求項1または2に記載の組成物：エンブリカ・オフィシナリス（Emblica officinalis）、オトメアゼナ（Bacopa monnieri）、ザクロ（Punica granatum）、ウコン（Curcuma longa）、
   1512000623045_1
   （Piper longum）またはキンセンカ（Calendula officinalis）。
4. エンブリカ・オフィシナリス（Emblica officinalis）の抽出物およびオトメアゼナ（Bacopa monnieri）の抽出物をさらに含む、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
5. 5〜100g/Lの重量のアシュワガンダ（Withania somnifera）、好ましくは20g/Lの重量のアシュワガンダ（Withania somnifera）を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の組成物。
6. 20g/Lの濃度のアシュワガンダ（Withania somnifera）、15g/Lの濃度のエンブリカ・オフィシナリス（Emblica officinalis）、15g/Lの濃度のオトメアゼナ（Bacopa monnieri）を含む請求項1〜5のいずれかに記載の組成物。
7. パーキンソン病、レビー体認知症(dementia lewis bodies)、多系統萎縮、レビー小体嚥下障害(Lewis bodies dysphagia)、神経軸索ジストロフィーおよび脳鉄蓄積タイプIを伴う神経変性の治療用または予防用の、請求項1〜6のいずれかに記載の組成物。
8. 被験体におけるα-シヌクレイノパチーの進行を予防、治療または遅延させる方法であって、被験体における前記α-シヌクレイノパチーが治療または予防されるように治療量の植物抽出物組成物を被験体に投与し、且つ組成物が請求項1〜7のいずれか1項記載のアシュワガンダ（Withania somnifera）の植物抽出物を含有する、方法。
9. 前記疾患が、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、レビー小体型嚥下障害、脳鉄蓄積タイプIを伴う神経変性および純粋な自律神経障害である、請求項8に記載の方法。
10. 前記対象がヒトである、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
11. PD患者のPDに関連する1つ以上の障害の進行を予防、治療または遅延させる、請求項1~10のいずれかに記載の方法。
12. そのような治療を必要とする被験体におけるPDに関連する認知症の進行を予防、治療または遅延させる方法であって、該被験体に、治療上有効な量の請求項1~7のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、請求項1~11のいずれかに記載の方法。
13. 前記治療用化合物が、経口または静脈内投与される、請求項8~11のいずれか1項に記載の方法。
14. 前記治療化合物が、薬学的に許容されるビヒクル中で投与される、請求項8~12のいずれか一項に記載の方法。