MX2013014645A - Metodos para el tratamiento de la enfermedad de parkinson mediante terapia combinada de un agonista d3 y transfeccion de bndf. - Google Patents

Abstract

La presente invención pertenece al campo de la terapia génica neurotrófica y se basa en la genómica y la nanotecnología, en combinación con una terapia farmacológica que promueve eventos mitogénicos, neurogénicos y neuritogénicos para el tratamiento de la enfermedad de Párkinson en cualquier etapa en la que se encuentre. Particularmente la invención comprende asociar la administración sistémica de un agonista dopaminérgico D3 con la transfección del gen BDNF mediante el vector macromolecular NTS-poliplex en las neuronas dopaminérgicas de la substancia nigra para promover la restauración de la vía dopaminérgica nigroestriatal para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Description

1 Métodos para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson mediante terapia combinada de un agonista D3 y transfección de BDNF Campo de la invención.

La presente invención pertenece al campo de la terapia génica neurotrófica y se basa en la genómica y la nanoteenología, en combinación con una terapia farmacológica que promueve eventos mitogénicos, neurogénicos y neuritogénicos. La presente invención comprende asociar la administración sistémica de un agonista dopaminérgico D3 con la transfección del gen BDNF mediante el vector macromolecular NTS-poliplex en las neuronas dopaminérgicas de la substancia nigra para promover restauración de la vía dopaminérgica nigroestriatal como tratamiento para la enfermedad de Parkinson.

Antecedentes de la invención.

La enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo desorden neurodegenerativo más común y el primero de los desórdenes de movimiento en el mundo. Se estima que existen entre 7 y 10 millones de personas en todo el mundo con esta enfermedad y se calcula que hay entre 3 y 4 millones más que aún no han sido diagnosticados. Tan sólo en los Estados Unidos se suman cerca de 60,000 casos por año. En México, se estima una prevalencia de entre 40 a 50 casos por cada 100,000 habitantes/año de acuerdo a los Institutos de tercer nivel de atención (Secretaría de Salud, 2010). Se ha calculado que las razas blanca e hispana presentan el doble de posibilidades de presentar esta patología que las razas negra y asiática. En los Estados Unidos el costo combinado directa e indirectamente de los pacientes con la enfermedad de Parkinson es cercano a los 25 billones de dólares al año, incluyendo tratamientos, pagos de seguro social y pérdidas de ingresos por incapacidad para trabajar (http:bwww.sactrust.org/pd_stats.htm). El cuidado de los pacientes con EP representa una pesada carga no sólo económica para los familiares, sino también moral que frecuentemente quebranta la armonía familiar.

La EP se caracteriza por ser un trastorno crónico, degenerativo, progresivo e incapacitante resultado de la pérdida selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la pars compacta de la sustancia negra (SNc) y, de manera consecuente, de la depleción del neurotransmisor dopamina en las áreas cerebrales inervadas por esas neuronas. Como una sola neurona dopaminérgica de la SNc proyecta a todos los ganglios básales, involucrados en el control motor, y a algunas áreas de la corteza cerebral, la neurodegeneración de esas neuronas da origen a alteraciones motoras y a trastornos de las funciones cerebrales superiores [1] Aún se investiga la etiología de la EP, pero se sabe que varios factores pueden ocasionar la muerte de las neuronas dopaminérgicas produciendo las alteraciones del movimiento observados en la EP; en este ámbito se tienen fuertes evidencias de que la reducción del Factor Trófico Derivado de Cerebro (BDNF, por sus siglas en ingles), un factor neurotrófico esencial para la funcionalidad de las neuromas dopaminérgicas, contribuye de manera importante a la muerte de este fenotipo neuronal, dando posiblemente lugar a lo que se le conoce como Parkinson idiopático, parkinsonismo o síndrome parkinsoniano [2] A la fecha se desconoce con exactitud cuál es el umbral para que se exprese clínicamente la disfunción dopaminérgica; se piensa que las alteraciones motoras aparecen cuando ocurre una pérdida del 70% de los niveles de dopamina en el estriado y un 50% de muerte de neuronas dopaminérgicas en la SNc [3]. Por esta razón, se ha planteado que la terapia neurotrófica restaurativa es la estrategia más adecuada para tratar el parkinsonismo, ya que ésta pretende detener el avance de la muerte de las neuronas dopaminérgicas sobrevivientes a la neurodegeneración y restablecer la inervación dopaminérgica funcional de los ganglios básales.

Es bien sabido que la EP se caracteriza por cuatro síntomas cardinales tales como acinesia, inestabilidad postural, temblor y rigidez, donde la acinesia y la inestabilidad postural son las principales causas incapacitantes en estos pacientes. Las diferentes combinaciones de hipocinesia, defectos de postura, equilibrio, acinesia y bradicinesia, resultan en una gran variedad de anormalidades en la marcha y otras actividades motoras cotidianas.

Los distintos tratamientos de la enfermedad que se utilizan actualmente retrasan pero no curan la enfermedad. Desde su introducción en 1967 por Cotzias [4], la L-Dopa ha constituido el mejor tratamiento de la enfermedad. Todo enfermo tarde o temprano llegará a usar la L-Dopa para el control de sus síntomas. El control de la enfermedad por la L-Dopa es efectivo durante 4 o 5 años, al cabo de los cuales comienzan las manifestaciones tóxicas de la droga (las que pueden ser más catastróficas que la propia enfermedad), tales como los movimientos involuntarios anormales (coreicos) conocidos como discinesias. Es por esto que no se ha cesado en la búsqueda de tratamientos alternativos. La pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas en la EP, sugiere que una estrategia que permita proteger a las neuronas de la muerte y al mismo tiempo pueda promover el crecimiento y la regeneración sería un tratamiento muy prometedor para esta patología.

Las neurotrofinas son proteínas estructuralmente relacionadas entre sí, regulan el desarrollo y función del sistema nervioso central (SNC). Entre las funciones inducidas por la unión de las neurotrofinas a sus receptores específicos destacan la supervivencia y diferenciación celular, así como el crecimiento axonal, remodelación dendrítica, la formación de sinapsis, y la expresión de proteínas cruciales para el funcionamiento neural normal [5, 6]. Además de unirse a sus receptores específicos, las neurotrofinas también poseen capacidad de unión al receptor de baja afinidad para neurotrofinas p75NTR, miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), cuya activación desencadena cascadas de señalización que activan la apoptosis [6, 7]. A esta familia pertenecen el factor de crecimiento neural (NGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y las neurotrofinas 3, 4/5, 6 y 7.

Hasta ahora no se ha utilizado el BDNF en el tratamiento de la EP, pero otros factores neurotróficos se han evaluado como posibles terapias de neuroprotección [8-11]. El GDNF es un factor implicado en la protección, en el incremento de la velocidad de disparo y de la excitabilidad de las neuronas dopaminergicas [12, 13]. Sus efectos protectores son más fuertes que los de otros factores tróficos. Sin embargo, el GDNF sé degrada rápidamente en el cuerpo humano y no cruza la barrera hematoencefálica eficientemente. La administración intracerebroventricular del GDNF no se recomienda, debido a su bajo índice de difusión del líquido céfalo-raquídeo al parénquima del cerebro, por lo que se requieren dosis altas de GDNF con potenciales efectos secundarios, tales como alteraciones de la percepción somato-sensorial, generación de anticuerpos contra el GDNF, depresión, pérdida de peso, dolor y también ha sido asociado, por razones desconocidas, con lesiones en el cerebelo [14, 15]. Es por ello que se han desarrollado diversas estrategias para la administración del GENF, tales como por ejemplo minibombas, perlas biodegradables, injertos productores de GENF y terapia génica. No obstante aún continúa el debate sobre la relativa eficiencia de cada uno de los métodos. La falta de eficacia en los ensayos clínicos y los efectos secundarios antes mencionados, han hecho que se haya detenido su uso en la clínica.

Se ha descrito como abordaje clínico controlado hecho a doble ciego la utilización de un vector adenoasociado tipo 2 (AAV2) para transfectar el gen neurotrófico de la neurturina en ambos putámenes de pacientes con EP en etapa avanzada. El argumento racional para el uso del vector AAV2-neurturina fue que éste sería internalizado por las neuronas estriatales, las cuales después expresarían y secretaría neurturina, y entonces la neurturina liberada sería transportada retrógradamente a través de las fibras remanentes en degeneración hasta el cuerpo celular de la SNc [16]. Desafortunadamente, la valoración de los pacientes 12 meses después de la transfección no mostró ninguna mejoría significativa en su motricidad, respecto a la motricidad primaria manifiesta en los pacientes sometidos a una cirugía placebo. Sin embargo, un subgrupo de pacientes transfectados con AAV2-neurturina evaluados 18 meses posteriores a la cirugía mostraron efectos benéficos modestos, pero significativos comparados con los individuos control. Como plantean los autores, una posible explicación para la falta significativa de recuperación motora a los 12 meses siguientes a la transfección con AAV2-neurturina podría ser que el transgén haya sido enviado en las etapas avanzadas de la EP; tiempo en que el curso degenerativo de la enfermedad haya avanzado al punto que únicamente quedaran unas pocas terminales dopaminérgicas restantes en el putamen capaces de recoger y transportar a la neurturina. Acorde a esta última posibilidad, el mismo equipo de investigación reportó que el putamen de 2 de los pacientes transfectados con AAV2-neurturina mostró inmunorreactividad para neurturina (aprox. 15%) a la par de una inducción dispersa de TH. Sin embargo, se encontró poca evidencia de neurturina y nulo incremento en la inmunorreactividad a TH en la SNc [16]. En contraste, un año después de la transfección con AAV2-neurturina en el caudado-putamen de monos Rhesus que poseían una inervación dopaminérgica integra en el sistema nigroestriatal, se observó inmunorreactividad incrementada de TH (marcador del fenotipo dopaminérgico), así como hipertrofia de las células TH+ en la sustancia negra [17]. Con base en la experiencia preclínica y clínica obtenida con la transfección de AAV2-neurturina, los autores consideran justificable la búsqueda de una terapia génica dirigida principalmente a las neuronas dopaminérgicas de la SNc. El BDNF es otro factor neurotrófico en exploración debido a su gran potencial para ser aplicado en la terapia neurotrófica para la EP. Es importante para la presente invención el hecho de que el BDNF y su receptor TrkB se expresen particularmente en las neuronas dopaminérgicas de la SNc de animales adultos [18-20] y de seres humanos incluyendo a pacientes parkinsonianos [21-23] Estos receptores participan en diversas funciones celulares de las neuronas dopaminérgicas: inducen su fenotipo [24], promueven su supervivencia [25], incrementan su velocidad de disparo [26], median la potenciación a largo plazo [27], promueven la generación de espinas dendríticas [28], estimulan la liberación de dopamina [29], determinan el número adecuado de neuronas dopaminérgicas en la etapa perinatal [30], y aumentan la sensibilidad de los receptores dopaminérgicos postsinápticos [31].

La unión del BDNF al receptor TrkB induce la homodimerización de los receptores TrkB y la consecuente autofosforilación en sus dominios tirosina cinasa, creando así sitios de anclaje para proteínas intracelulares. La activación de los receptores TrkB desencadena cascadas de señalización como la de fosfolipasa C (PLC-iy 1), Ras-MAPK (cinasa activada por mitógenos), CREB (elemento de respuesta a la unión de AMPc) y PI3K (Cinasa activada por fosfatidil inositol-3) [6, 32] Es de gran relevancia para la presente invención destacar que la adición de BDNF recombinante humano o BDNF purificado de cerebro porcino promueve la supervivencia de la células dopaminérgicas en cultivos disociados del mesencéfalo ventral de embriones de rata de edad E14-16 [25]. En co-cultivos de rebanadas de mesencéfalo ventral y estriado obtenidas de ratas recién nacidas, también se ha demostrado que la adición de BDNF aumenta significativamente el número de neuronas TH+ y la densidad de sus axones que proyectan a las neuronas estriatales [33, 34]. Estos resultados son de especial relevancia para la terapia neurotrófica ya que ponen de manifiesto el desarrollo de un efecto neurotrófico dual del BDNF sobre las neuronas dopaminérgicas; por un lado, el BDNF promueve la supervivencia de las neuronas y, por otro lado, estimula el crecimiento y la rearborización axonal. Es deseable una terapia neurotrófica eficaz para enfermedades neurodegenerativas que esté orientada a rescatar a las neuronas comprometidas a la muerte y, a la vez, estimular la regeneración de las fibras de proyección a los diferentes blancos de la inervación dopaminergica.

Con estos antecedentes, se han ensayado diversas estrategias preventivas y restaurativas con la finalidad de proveer BDNF exógeno en modelos in vivo de lesión del sistema nigroestriatal. La estrategia preventiva consiste en producir un incremento de los niveles de BDNF antes de practicar la lesión del sistema dopaminérgico nigroestriatal en animales de experimentación. Se ha demostrado que la infusión de BDNF en el sistema dopaminérgico previo a la lesión mecánica por axotomía [35], o el incremento de BDNF endógeno inducido por la lesión estriatal con kainato [36] previenen parcialmente la muerte de las neuronas dopaminérgicas de la SNc. Otros abordajes experimentales donde se ha probado el efecto neuroprotector del BDNF es en trasplantes de neuronas dopaminérgicas embrionarias a huéspedes hemiparkinsonianos. En estos estudios, se ha encontrado que el pre-tratamiento de los cultivos con BDNF incrementa la integración funcional del implante [34, 37, 38].

La estrategia preventiva también se ha evaluado con terapia génica tanto ex vivo como in vivo, con el propósito de proveer en una sola aplicación niveles constantes de BDNF al sistema dopaminérgico nigroestriatal lesionado. La terapia génica ex vivo se ha ensayado utilizando fibroblastos modificadas genéticamente para producir BDNF, los cuales fueron trasplantados en el estriado o en la SNc de huéspedes adultos previo al daño del sistema dopaminérgico por 6-OHDA o MPP+ [39, 40]. En ambos casos sé demostró que la implantación de fibroblastos productores de BDNF previo a la administración estriatal de 6-OHDA o MPP+ previene parcialmente la denervación y la muerte de las neuronas dopaminérgicas nigrales inducida por estos neurotóxicos [39, 40] Hasta hoy, la terapia génica in vivo sólo se ha ensayado utilizando vectores virales para llevar a cabo la transferencia del gen al BDNF al sistema nervioso central de animales de experimentación previo a la lesión inducida por 6-OHDA. Otro grupo de investigación utilizó el vector viral adenoasociado recombinante para producir bicistrónicamente, BDNF-myc y la proteína verde fluorescente (GPF), el cual fue inyectado en la SNc 6 meses antes de la administración de 6-OHDA en el estriado de ratas adultas. Aunque el BDNF-myc transgénico no tuvo efecto sobre el número de neuronas dopaminérgicas de la SNc, sí previno el desarrollo de la conducta de giro inducido por anfetamina 10 semanas posteriores a la lesión [41] Resultados similares fueron obtenidos con el vector viral basado en el virus del Herpes Simplex capaz de transducir BDNF (HSV-1). En este caso el vector HSV-1 fue inyectado en el núcleo estriado 4 semanas antes de la lesión nigroestriatal con 60HDA. Diez semanas posteriores a la lesión, los animales que recibieron terapia génica con el gen BDNF mostraron una reducción en el giro inducido por apomorfina, pero la expresión de BDNF ejerció un pobre efecto protector contra la citotoxicidad de la 6-OHDA en las neuronas dopaminérgicas [42] En resumen, estos hallazgos sostienen que el BDNF, independientemente de su fuente, protege al sistema nigroestriatal si su administración es previa al daño. Aunque exitosa en animales de experimentación, la terapia neurotrófica preventiva es improbable que sea llevada a la práctica clínica debido a la ausencia de herramientas diagnósticas que permitan predecir con precisión el tiempo de aparición de la neurodegeneración dopaminergica en la EP.

La estrategia restaurativa está orientada a producir un incremento en los niveles de BDNF tiempo después de que se ha lesionado el sistema dopaminérgico nigroestriatal en animales de experimentación. Esto debido a que se ha demostrado que la expresión de BDNF se encuentra significativamente disminuida tanto en los modelos experimentales de Parkinson como en pacientes [21, 22, 43, 44], y a que las neuronas dopaminérgicas sobrevivientes también expresan una cantidad menor de BDNF (20%) comparadas con su contraparte sana [21]. Hasta hoy, existen escasos trabajos que hayan estudiado el efecto regenerativo de BDNF posterior al daño neurotóxico. En esta línea, se han utilizado astrocitos modificados por ingeniería genética para secretar BDNF, los cuales fueron trasplantados en el núcleo estriado 15 días posteriores a la lesión estriatal con 60HDA. En este trabajo el BDNF redujo la conducta de giro inducida por anfetamina en un 45%, un mes y medio después del trasplante [45]. Recientemente, la acción restauradora del BDNF fue confirmada con la utilización de células madre mesenquimales de origen humano capaces de liberar BDNF por inducción epigenética. El trasplante de estas células en la SNc lesionada 1 semana posterior a la lesión nigroestriatal con 6-OHDA en la rata, produjo hipertrofia significativa de las células nigrales TH+, así como aumento de la inmunorreactividad a TH en el estriado y estabilización de los síntomas motores inducidos por la anfetamina [46].

En el campo de la presente invención, recientemente se ha desarrollado un primer protocolo restaurativo basado en la transferencia del gen BDNF a neuronas dopaminérgicas de la SNc a través del sistema de nanopartículas NTS-poliplex (Martinez-Fong D. solicitud de patente número MX/a/2012/010244). Los resultados de este desarrollo apuntan al posible uso del BDNF como estrategia terapéutica de la EP pero utilizando nuevas estrategias para conseguir su expresión dirigida y controlada; en este desarrollo se demuestra la recuperación bioquímica, morfológica y conductual en ratas hemiparkinsonianas lograda por la transferencia del gen BDNF-flag a neuronas dopaminérgicas nigrales a través del sistema de nanopartículas NTS-poliplex. Este procedimiento se describe en las patentes MX264932 (Martínez-Fong D., 2009) y MX287089 (Martinez-Fong D., 2011), describiéndose también un vector fusogénico que comprende poli-lisina con un peso molecular de 15,000 a 70,000 Da conjugada covalentemente a un ligando específico para un receptor celular y un péptido fusogénico, y al menos un péptido señal de direccionamiento nuclear unido al material genético a través de su unión electrostática a la poli-lisina.

Para el exito de la estrategia descrita en la solicitud de patente MX/a/2012/010244 se ha destacado el papel crucial que tiene el BDNF en el mantenimiento y supervivencia de las neuronas dopaminérgica en el cerebro adulto. Por esta razón, cuando las neuronas dopaminérgicas sufren un proceso degenerativo, como es el caso de la EP, éstas pierden su sostén neurotrófico intrínseco, el BDNF, lo que favorece aún más el proceso neurodegenerativo. En este contexto, se ha documentado que el mRNA y el BDNF se reducen a la par de la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la SNc de pacientes con EP, recalcándose el hecho de que aún las neuronas sobrevivientes son capaces de expresar BDNF [21 , 22] Estudios post morterm de hibridación in situ en pacientes parkinsonianos muestran que los niveles nigrales de trkB disminuyen de manera concomitante a la pérdida de neuronas dopaminérgicas, pero destacan que las neuronas remanentes no muestran diferencias en el nivel de mRNA expresado respecto a las neuronas de los cerebros control [20]. El hecho de que las neuronas dopaminérgicas sobrevivientes durante el proceso degenerativo expresen TrKB sugiere fuertemente que estas neuronas mantienen su capacidad de responder a la estimulación por BDNF y, en consecuencia, predice el éxito de la terapia neurotrófica encaminada a incrementar los niveles de BDNF en las neuronas dopaminérgicas de la SNc sobrevivientes en el proceso degenerativo en la EP.

Breve descripción de las figuras.

Figura.1. Se muestra un esquema cronológico de la terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF conforme a la presente invención, en ratas hemiparkinsonianas inducidas por la inyección estriatal de 6-OHDA.

Figura.2. Se muestra que la terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF conforme a la presente invención, corrige las alteraciones finas de la marcha inducidas por el parkinsonismo. (A) Registro del ángulo del tobillo (flechas) y la trayectoria de los movimientos de la cadera (línea negra gruesa) en la pata contralateral a la lesión. (B). Gráfica que muestra el curso temporal del incremento del ángulo del tobillo en diferentes condiciones experimentales. Los valores se expresan como porcentaje de los ángulos obtenidos del lado contralateral antes de la lesión (condición normal). * P<0.05 vs. sol. salina.

Figura.3. Se muestra que la terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF conforme a la presente invención, disminuye la rigidez inducida por el parkinsonismo. (A) Registros representativos de la actividad electromiografía (EMG) del músculo gastroenemio contralateral a la lesión en diferentes condiciones experimentales. B). Histograma de la actividad EMG como porcentaje de los valores de la condición normal. * P<0.05 vs. Después de la lesión.

Figura.4. Se muestra que la terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF conforme a la presente invención, restablece la coordinación motora alterada por el parkinsonismo. (A) Secuencia de gráficas comparativas, mostrando la recuperación de la coordinación motora y equilibrio inducida por cada condición experimental en la prueba del rotarod, en las diferentes etapas del protocolo experimental (B) Gráfica del curso temporal de la actividad integrada en el rotarod de las diferentes condiciones experimentales. NS = Diferencia no significativa con respecto a las ratas intactas. * = Diferencia significativa con respecto a las ratas intactas (P<0.05).

Figura.5. Se muestra la inmunorreactividad a TH en la sustancia nigra compacta después de diferentes tratamientos. (A) Micrografías representativas de la inmunorreactividad a TH en el mesencéfalo de rata. Densitometría óptica correspondiente a la SNr en cada condición terapéutica. El desplazamiento a la izquierda indica mayor inmunorreactividad de la TH. (B) Gráfica que ilustra el porcentaje de células TH+ en el lado lesionado y tratado con respecto al lado control sin tratamiento. SNc = sustancia nigra pars compacta. SNr = sustancia nigra pars reticulata. * P<0.05, **P<0.001 vs. sol. salina.

Figura.6. Se muestra que la terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF conforme a la presente invención, restablece la inmunorreactividad a TH en el área del estriado afectada por la lesión con 6-OHDA. (A) Micrografías representativas de la inmunorreactividad a TH en el sitio de inyección de la 6-OHDA después de los diferentes tratamientos. Los valores en paréntesis son los porcentajes de densidad óptica para la TH de ese lado respecto al lado intacto. TH = tirosina hidroxilasa. (B) densitometría de la inmunorreactividad contra TH a lo largo de la lesión. * P<0.01 vs. Salina.

Figura.7. Se muestra que la terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF conforme a la presente invención, restablece las espinas dendríticas de las neuronas espinosas medianas del estriado disminuidas por el parkinsonismo. (A) Micrografías de una dendrita intacta, comparada con dos lesionadas, una tratada con solución salina y la otra con la terapia combinada. (B) Gráfica del número de espinas dendríticas después de diferentes tratamientos. NS, no significativo; * P<0.05 vs. Condición normal, #P<0.001 salina vs. todas las otras condiciones.

Figura.8. Se muestra que la terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF conforme a la presente invención, restablece la innervación dopaminérgica al estriado disminuida por el parkinsonismo. (A) Micrografías confocales representativas de células en la substancia nigra que son TH+, expresan el transgén BDNF y son marcadas retrógradamente con dextrán amina rodaminado desde el estriado. (B) Gráfica que muestra el número de neuronas TH+ marcadas retrógradamente por dextrán amina rodaminado inyectado en el estriado. * P<0.05, **P<0.001 vs. sol. salina.

Descripción detallada de la invención.

La presente invención ofrece una estrategia alternativa o complementaria a la terapia neurotrófica descrita para tratar la EP, en donde el efecto neurotrófico es inducido por la transfección del BDNF en las neuronas dopaminérgicas sobrevivientes. La presente invención se basa en la combinación de esta inducción neurotrófica con la administración crónica y continua de un agonista de los receptores a dopamina del tipo D3 (por ejemplo, D3R) [47], con el propósito de potenciar la neurogénesis a partir de las células madre presentes en la SNc del cerebro adulto y eventualmente de producir su diferenciación hacia el linaje dopaminérgico.

El receptor D3 pertenece a la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G, es codificado por un gene homólogo al gene para receptores D2, y posee características farmacológicas, de localización y del sistema de transmisión que difieren tanto de las del D1 como de las del D2 [48] Se ha detectado la expresión del receptor D3 desde el día embrionario 14 (E14) en el estriado y otras partes del cerebro. En la etapa prenatal, el ARNm del receptor D3 se localiza en las células neuroepiteliales (zonas mitóticas) del estriado, amígdala, bulbo olfatorio y tectum; la mayoría de estas células pierden rápidamente la capacidad de expresar el receptor D3 durante su migración y diferenciación. Después del nacimiento y durante el desarrollo posnatal, la zona mitótica se vuelve más delgada a lo largo del ventrículo lateral y se convierte en la zona subventricular, en la cual se observa la expresión del ARNm para el receptor D3 [49] Se ha demostrado que la activación del receptor D3 también incrementa significativamente la proliferación y la neurogénesis en la zona subventricular y el estriado de la rata adulta a través de las células progenitoras amplificadoras rápidas [50, 51]. La activación de este receptor incrementa del 40 al 80% la mitogénesis [52, 53], posiblemente a través de la vía de las MAPK con ayuda de una isoforma atípica de PKC, que presenta una comunicación cruzada con la vía del fosfatidil inositol 3-cinasa (PI3-K) [54] Además el receptor D3 puede incrementar la arborización dendrítica de las neuronas mesencefálicas dopaminérgicas vía ERK [55]. En conjunto estos antecedentes han mostrado que la activación del receptor D3 no sólo estimula la neurogénesis sino que también promueve la rearborización dendrítica y axonal.

En la edad adulta, el receptor D3 se encuentra distribuido principalmente en las áreas límbicas como la zona ventromedial de la corteza del núcleo accumbens, donde es expresado por las neuronas que tienen sustancia P y neurotensina que proyectan al pálido ventral, tubérculo olfatorio y las islas de Callejas [48]. Este receptor se ha observado también en las neuronas del estriado dorsal, en particular en el núcleo caudado-putamen, lo que sugiere que este receptor participa en el procesamiento motor y sensorial [56-58] En el estriado, el receptor D3 está expresado principalmente en las neuronas GABAergicas de la vía directa [59-62] El receptor D3 también participa como autoreceptor. En este caso, inhibe la síntesis y liberación de dopamina en las vías dopaminérgicas que inervan el sistema límbico, corteza y estriado [63] El mecanismo de inhibición se fundamenta en que la actividad de la enzima TH es facilitada por la fosforilación dependiente de Ca++ [64-66], Por un lado, el acople del receptor D3 a los canales de Ca++ [67] reduce la concentración intracelular de Ca++ libre [68-70] Por otro lado, la activación de este receptor con la ayuda del quinpirol, inhibe la generación del AMPc a través de la proteína Gai, suprimiendo así la fosforilación de la PKA dependiente de AMPc [71] El beneficio de la utilización de agonistas D3 en el tratamiento de la EP es doble. Por un lado, actúa como agonista dopaminérgico, mientras que por el otro ejerce efectos neuroprotectores a través de la producción de un factor autotrófico dopaminérgico [72] Se ha demostrado que la incubación de cultivos primarios mesencefálicos con agonistas D3 aumenta significativamente el número de neuronas dopaminérgicas y los niveles de GDNF y BDNF. Bloqueando los efectos del GDNF o del BDNF con anticuerpos neutralizantes, se disminuye significativamente los efectos neurotróficos de los agonistas D3 en cultivos celulares [73] El tratamiento combinado objeto de la presente invención ofrece diversas ventajas con respecto al tratamiento individual ya sea con el agonista 7-OH-DPAT o con solo la transfección del gen para el BDNF. La primera ventaja es que el tratamiento combinado produce una mayor reinervación estriatal (figura 6) asociada a la recuperación, a niveles prácticamente normales, de las espinas dendríticas de las MSNs (figura 7). El incremento de la reinervación posiblemente sea producto de una mayor inducción de neurogénesis de neuronas dopaminérgicas, sugerida por el incremento significativo del número de neuronas TH+ en la SNc (figura 8). En esta región, el tratamiento de la presente invención también produjo un incremento de las ramificaciones dendríticas en la pars reticulata lo que sugiere un incremento en la actividad dopaminérgica en la SNr (figura 5). Estos cambios neurotróficos que demuestran la regeneración del sistema nigroestriatal correlacionan directamente con una mayor recuperación de la coordinación motora tanto fina como gruesa, asociadas a un mejor equilibrio postural (figura 4). El tratamiento combinado de la presente invención también logró reducir a valores casi normales el incremento del tono muscular extensor producido por la lesión (figura 3), lo que permitió una recuperación significativa de la coordinación motora durante la marcha (figura 2). Otra ventaja del tratamiento combinado de la presente invención es que los efectos neurotróficos y conductuales fueron inducidos significativamente más rápidamente que los conseguidos por los tratamientos individuales. La ventaja mayor es que el beneficio del tratamiento combinado de la presente invención es aparentemente permanente ya que la recuperación motora persiste después de haberse suspendido la administración del agonista D3 (7-OH-DPAT) y ocurre en ratas viejas con parkinsonismo crónico. Estas ventajas del tratamiento combinado de la presente invención ofrecen una terapia alternativa eficaz para el tratamiento de la EP.

En 1995, Hubble [74] y colaboradores realizaron un estudio aleatorio, doble ciego, con cerca de 1200 pacientes con EP temprano de hasta 2.4 años de evolución, donde se utilizó la escala UPDRS II y III (Unified Parkison's Desease Rating Scale), en las que las actividades de la vida diaria se consideran (II) y la actividad motora, (III) para comparar el efecto de 4 años de tratamiento con agonistas D3 (698 pacientes) con respecto al grupo control sin tratamiento (502 pacientes). Los autores reportaron una mejora significativa comparándolos con el grupo control. El mismo resultado fue reportado en otros estudios [75-77], Comparando la efectividad del tratamiento con los agonistas D3 respecto al de la L-Dopa, en periodos hasta por 4 años, se demostró una reducción significativa en el desarrollo de complicaciones motoras en los pacientes tratados con agonistas D3 (52% vs. 74%, p<0.001). Sin embargo, el 72% de los pacientes requirió la suplementación de L-Dopa después de 4 años de tratamiento y las complicaciones motoras se presentaron poco tiempo después de iniciar el tratamiento con L-Dopa. Este hallazgo indica que los posibles cambios neurotróficos que se generaron por el tratamiento con agonistas D3 no fueron de la magnitud suficiente para restaurar el sistema dopaminérgico nigral, o bien fueron pasajeros o tal vez los efectos terapéuticos fueron ocasionados puramente por la acción farmacológica de los agonistas D3 en el humano.

Desde su aprobación en 1997 en EUA y 1998 en la mayoría de los países europeos, los agonistas para receptores dopaminérgicos del tipo D3 se han convertido en los más prescritos para el tratamiento de la EP y actualmente son indicados para el tratamiento de los signos y síntomas del Parkinson idiopático, tanto como monoterapia como en asociación con la L-Dopa, donde el pramipexole reduce significativamente los episodios “off” durante el día (45.6%), la ansiedad y apatía [78] así como la rigidez muscular [79] La asociación con L-Dopa, permite reducir la dosis del pramipexole en un 27%.

La desventaja de la monoterapia con agonistas D3 como el pramipexole son sus efectos secundarios. En pacientes con Parkinson temprano, los efectos adversos son discinesia, nausea, mareos, somnolencia, insomnio, constipación, astenia, alucinaciones, amnesia, hipertonía y confusión. En pacientes con EP avanzada, los efectos secundarios son más comunes y se presentan frecuentemente cuando el pramipexole se administra en asociación con L-Dopa [78] Además, la efectividad del tratamiento con agonistas D3 en la EP se ve reducida debido a la disminución de la densidad del receptor D3 en neuronas dopaminérgicas encontrada en los modelos animales de Parkinson y en los pacientes con esta patología [80-83] Esto se relaciona con la disminución de la respuesta a los tratamientos con agonistas dopaminérgicos [84]. La presente invención también supera esta limitante del tratamiento con los agonistas D3 ya que incrementa la densidad de receptores D3 debido a que la transfección del BDNF en las neuronas dopaminergicas sobrevivientes aumenta la densidad de estos receptores [85-88], así como de las terminales y dendritas dopaminérgicas.

El BDNF sintetizado por las neuronas dopaminérgicas es responsable de la aparición de los receptores D3 durante el desarrollo y de mantener su expresión en la edad adulta [85-88] La activación de estos receptores por agonistas específicos (pramipexole) protege a las neuronas de la degeneración inducida por MPTP en animales de experimentación. El efecto aparentemente se ejerce a través del BDNF, ya que el bloqueo de la acción del BDNF por anticuerpos neutralizantes elimina la protección [73]. Este resultado sugiere fuertemente que existe una estrecha interacción entre los receptores D3 y el BDNF. Éste estimularía la expresión de los receptores D3 cuya activación por sus agonistas selectivos ejercerían su efecto protector, y probablemente su efecto neurogenético, a través de incrementar la producción y liberación del BDNF [89].

La presente invención se basa en la existencia de un circulo virtuoso entre el BDNF y los receptores D3 y en el hallazgo de que el BDNF también induce neurogénesis a partir de células madre en el cerebro adulto [90] La presente invención comprende administrar de manera continua y crónica un agonista D3 asociándolo con la transfección no viral del gen del BDNF a las neuronas dopaminérgicas a través del NTS-poliplex. Esta combinación de tratamientos conduce al restablecimiento de la inervación nigro-estriatal y, en consecuencia, a la mejoría de la conducta motora alterada en el modelo de hemiparkinsonismo crónico producido por la lesión de la inervación nigrostriatal por 6-OHDA.

Dado que la efectividad de los tratamientos con agonistas D3 se reduce con el tiempo debido probablemente a que la densidad de estos receptores disminuye a lo largo de la EP y considerando que el BDNF es responsable del control normal de la expresión de los receptores D3 tanto durante el desarrollo como en la etapa adulta [85-88], es lógico pensar que este factor trófico es esencial para el mantenimiento de la eficacia de los tratamientos con los agonistas D3. Desafortunadamente, el BDNF también está disminuido en pacientes con Parkinson y en los modelos de EP, lo que potencia la pérdida de los receptores D3 y en consecuencia la disminución de eficacia terapéutica de los agonistas de estos receptores. Es en este punto donde la transfección no viral del gene para BDNF en la SNc jugaría un papel crucial en la eficacia terapéutica de la presente invención, ya que se induce una expresión estable del BDNF en las neuronas dopaminérgicas sobrevivientes por la transfección del gen con el NTS-poliplex. El BDNF producto de la transfección incrementará la expresión de los receptores D3 amplificando así los efectos mitogénicos, neurogénicos y el incremento de la arborización dendrítica y axonal, que tienen estos receptores al ser activados por su agonista selectivo el 7-OHDPAT; adicionalmente la activación de los receptores D3 controlará la liberación del BDNF [73], potenciándose recíprocamente en beneficio del efecto neurotrófico curativo sustentado en la presente invención.

El tratamiento que proporciona la presente invención pretende producir un efecto regenerativo en el sistema dopaminérgico nigral remanente del enfermo parkinsoniano que será más efectivo que el solo tratamiento con el agonista D3. La presente invención combina el efecto trófico de la expresión transgénica de BDNF con los efectos mitogénicos, neurogénicos y neurotrófico (crecimiento de la arborización dendrítica y axona), que ejerce la activación de los receptores D3 por su agonista selectivo 7-OHDPAT. Una ventaja adicional del tratamiento que proporciona la presente invención es que la activación de los receptores D3 incrementará la liberación del BDNF [73] y éste a su vez incrementará la expresión de los receptores El establecimiento de este círculo virtuoso potenciará el efecto neurotrófico curativo sustentado en la presente invención.

El empleo de agonistas D3 produce resultados muy favorables en pacientes con EP [75-77] Desafortunadamente, los efectos de estos agonistas sólo duran alrededor de 4 a 6 años y en los últimos años de tratamiento aparecen efectos secundarios tales como discinesia, nausea, mareos, somnolencia, insomnio, constipación, astenia, alucinaciones, amnesia, hipertonía y confusión. La disminución de la respuesta al tratamiento es muy probable que sea el resultado de la disminución de la densidad de receptores D3 en las neuronas dopaminérgicas, lo que se ha encontrado tanto en los modelos animales de Parkinson como en los pacientes con la enfermedad [80-83] Con la terapia combinada con el agonista D3 y la transfección de BDNF acorde con la presente invención, se espera retrasar la aparición de los efectos secundarios incapacitantes del agonista D3, porque al interrumpir la administración del agonista D3 permanecen los efectos meurotróficos del BDNF transgénico como resultado de una sola transfección como se demuestra en la presente invención (figuras 2, 3 y 4).

Para la validación del tratamiento combinado de la presente invención, nos sustentamos en nuestros resultados obtenidos en ratas macho Wistar viejas de 11 meses de edad a las que se indujo el hemiparkinsonismo, simulando la situación que prevalece en la EP (figura 1). La evaluación del desempeño motor de cada rata previo a la lesión estriatal (condición normal), que compara la evolución de cada animal contra sí mismo en cada etapa del protocolo, elimina las diferencias entre individuos. Este protocolo de evaluación conductual simula la evaluación clínica a la que se somete cada paciente, con la diferencia de que en este caso la evolución de las alteraciones motoras se compara con los valores de la población general sana de la misma edad. El hemiparkinsonismo se produjo unilateralmente con 10 mg/pL de la neurotoxina 6-OHDA inyectados en 2 sitios del estriado (AP +1.9, LM -2.2, DV -5.0; AP +0.8, LM -3.0, DV -4.0). Esta área del estriado de la rata representa al caudado-putamen en el humano, núcleo fuertemente afectado por la EP. El grado de lesión se juzgó por el desempeño de la rata en el rotarod a los 5 meses después de la lesión, tratando de simular un parkinsonismo crónico (figura 1). Se eliminaron las ratas que no tuvieron como mínimo una reducción del 50% en su desempeño en el rotarod para eliminar la posibilidad de una recuperación espontánea. Este modelo de hemiparkinsonismo fue muy útil para evaluar los trastornos de la marcha (figura 2), la rigidez muscular (figura 3), la inestabilidad postural, la coordinación y el equilibrio (figura 4), los cuales son síntomas cardinales de la EP. Además, este modelo permite cuantificar la disminución de la población de neuronas dopaminérgicas nigrales (figura 5) y de la denervación estriatal (figura 6) en el lado lesionado en comparación con el lado control intacto (figuras 5 y 6). Otra ventaja del modelo empleado en la presente invención es que las ratas utilizadas fueron de edad avanzada (12 meses al inicio del tratamiento y 18 meses al final del protocolo). Considerando que la expectativa de vida para una rata es de 2 años 4 meses y para el humano es de 75 años, las edades de esas ratas corresponderían aproximadamente a 40 años (al inicio del tratamiento) y 60 años (al final del protocolo) de edad en el humano, por lo que también el deterioro ocasionado por la edad sería similar al de los pacientes con EP. En el ser humano se ha determinado que la EP se inicia en entre los 43 y 66 años de edad [91].

Por otro lado, hasta ahora no se ha utilizado el BDNF en el tratamiento de la EP, pero otros factores neurotróficos han sido evaluados como posibles terapias de neuroprotección [8-11]. Sin embargo, debido a problemas téenicos para lograr una correcta dosificación de estos factores tróficos, no se ha podido evitar la aparición de diversos efectos secundarios con estas terapias. Los efectos indeseables que se han reportado con el uso de GDNF, el factor neurotrófico más utilizado en el humano, son alteraciones de la percepción somato-sensorial, generación de anticuerpos contra el factor trófico, depresión, pérdida de peso, y dolor que ha sido asociado, por razones desconocidas, a lesiones en el cerebelo [14, 15]. Para superar esas inconveniencias se han desarrollado diversas estrategias para su administración, tales como por ejemplo minibombas, perlas biodegradables, injertos productores de GDNF, así como terapia génica viral. No obstante, aún continúa el debate sobre las eficiencias relativas de cada uno de los métodos. La falta de eficacia en los ensayos clínicos y los efectos secundarios antes mencionados han detenido su uso en la clínica. Es en este punto donde la transfección del gen para BDNF en la sustancia nigra compacta por el NTS-poliplex juega un papel crucial en la eficacia terapéutica de la presente invención, ya que induce una expresión estable y fisiológica del BDNF en las neuronas dopaminérgicas sobrevivientes, como se describe en la solicitud de patente MX/a/2012/010244 (Martinez-Fong D.) y en la presente invención (figura 8). El BDNF transgénico incrementaría la expresión de los receptores D, los que a través de ser activados por su agonista (7-OH-DPAT) prolongarían y amplificarían su efecto terapéutico, mitogénico, neurogénico y control del crecimiento de la arborízación dendrítica y axonal, que ejercen estos receptores al ser activados por su agonista selectivo (figura 7). Además, la activación de los receptores D3 incrementa la liberación del BDNF [73], potenciándose mutuamente en beneficio del efecto neurotrófico curativo. Es posible que este círculo virtuoso permanezca aún despues de suspender la administración del agonista D3. En este caso, la estimulación de los D3R sería mantenida por el propio agonista endógeno, la dopamina, como resultado de la regeneración del sistema dopaminérgico, y por la expresión sostenida del BDNF transgénico.

Las evaluaciones motoras y electromiográficas realizadas durante y después del tratamiento proporcionado por la presente invención fueron claves para demostrar la disminución significativa de la rigidez muscular , de los trastornos de la marcha, de la coordinación y del equilibrio (figuras 2, 3 y 4). Estos datos en su conjunto demostraron el grado de control del hemiparkinsonismo en la rata, lo cual reflejaría la misma situación terapéutica en el humano. Finalmente, al término del estudio, se utilizaron téenicas inmunohistoquímicas para correlacionar cualitativamente el grado de recuperación motora con el grado de regeneración del sistema dopaminérgico nigral (figuras 5 a 6). Además, la inmunofluorescencia doble contra TH y BDNF-flag acompañada del mareaje retrógrado con dextrán rodaminado demostraron la expresión del transgen en las neuronas dopaminérgicas que reinervaron al estriado (figura 8). El conjunto de los resultados de todas las técnicas mencionadas avalan al esquema de tratamiento expuesto en la presente invención como una estrategia prometedora para prevenir la degeneración y promover la restauración funcional de las neuronas dopaminérgicas en la EP.

Es bien sabido que en la EP, las diferentes combinaciones de hipocinesia (defectos de postura, equilibrio, acinesia y bradicinesia), resultan en una gran variedad de anormalidades en la marcha, las cuales son altamente incapacitantes para el paciente. El modelo de la enfermedad usado en la presente invención también presenta severos trastornos en la marcha (figura 2A lesión sin tratamiento). Para poder realizar esta evaluación con precisión se marcaron puntos de tinta negra en la piel rasurada de las extremidades posteriores de las ratas a nivel de cresta iliaca, cadera, tobillo y extremo distal del primer metatarsiano. Posteriormente se hicieron caminar libremente a través de un pasillo iluminado (110 cm de longitud por 15 cm de ancho por 15 cm de alto) el cual está provisto de espejos para poder observar simultáneamente ambos lados de la rata. Se colocó una cámara Ciber-Shot de Sony (modelo DSC-W110) en el centro, a 80 cm de distancia del pasillo para videograbar el evento. Se analizó el video y con la ayuda del programa Total Video Converter se convirtieron a imágenes JPG, las cuales se importaron con el software ImageJ (de N1H y disponible en http:brsb.info.nih.gov/ij/) para calcular las coordenadas de los puntos antes mencionados en cada imagen. Posteriormente se calcularon las coordenadas de la rodilla por geometría analítica considerando la longitud de los huesos tibia y fémur de cada rata en razón a la posición del tobillo y cadera en cada imagen [92] Las coordenadas encontradas con imageJ se analizaron con la ayuda de un programa especial donde se calculan los ángulos en grados de las articulaciones de la cadera, rodilla y tobillo de ambas extremidades y se comparan con la misma rata cuando era sana (figura 2A).

En los resultados ¡lustrados en la figura 2A se puede observar que el ángulo de máxima flexión del tobillo durante la fase de balanceo se incrementó notablemente despues de la lesión (16.5% en promedio) como lo indican las flechas en las fotografías de la extremidad posterior y las gráficas del desplazamiento de la extremidad contralateral a la lesión. En la figura 2A también se pueden observar otras modificaciones angulares de las demás articulaciones implicadas, lo que en conjunto altera significativamente la coordinación general del movimiento como lo demuestra la oscilación del desplazamiento de la cadera que es la resultante de la suma de los ángulos de todas articulaciones de la extremidad a lo largo del recorrido (trayectoria marcada por la línea negra). Todos los trastornos de la marcha antes mencionados ocasionados por el parkinsonismo producido por la lesión de la inervación nigrostriatal por la 6-OHDA en la rata fueron revertidos por el tratamiento combinado de la presente invención como se observa en la figura 2A.

En la figura 2B se observa el curso temporal de la recuperación de la coordinación en la marcha. Es importante remarcar que el modelo usado representa un parkinsonismo crónico debido a que el tratamiento se inició 5 meses después de la lesión, que correlacionándolo con la edad humana representaría un Parkinson de unos 15 años de evolución. Los diferentes tratamientos farmacológicos se aplicaron por un periodo de 18 semanas (la transfección de BDNF-flag se efectuó solamente una vez) durante las cuales se apreció una recuperación significativa generada únicamente por el tratamiento combinado. Esta mejoría no es el resultado de los efectos farmacológicos del agonista, ya que se mantuvo aún 8 semanas después de haberse suspendido la administración del agonista (figura 2B). Como se explicó antes, es posible que el círculo virtuoso de estimulación recíproca entre los receptores D3 y el BDNF, sea mantenido por el propio agonista endógeno de los receptores, la dopamina, como resultado de la regeneración del sistema dopaminérgico, y por la expresión sostenida del BDNF transgénico.

Se ha demostrado que la acción GABAérgica de la substancia nigra reticulata y globo pálido externo (núcleos de salida de los ganglios básales) sobre la zona locomotora mesencefálica y el núcleo pedúnculo-pontino influye de manera importante en la generación de la locomoción y el control del tono muscular, por lo que un incremento en esta salida como en el caso de la EP puede causar trastornos severos a dichas funciones motoras [93, 94]. Para determinar si la mejora observada en la coordinación de la marcha (figura 2) se acompañaba de disminución del incremento del tono muscular (rigidez) inducido por el parkinsonismo se registró el tono muscular. Para esto, se colocó en posición ventral a la rata sobre una hamaca que cubre todo su cuerpo y sólo permite la exposición de las extremidades posteriores las cuales quedan suspendidas en el aire para evitar la estimulación sensorial cutánea y muscular. El registro se hizo en un lugar controlado de luz y ruido para evitar la estimulación sensorial visual y acústica, ya que cualquiera de estos estímulos pueden modificar el grado de relajación muscular [95, 96] Posteriormente se insertaron subcutáneamente electrodos aislados de platino con la punta sin aislar (Grass) sobre la superficie del músculo gastroenemio y tibial anterior (con la finalidad de no dañar el tejido contráctil) y un quinto electrodo se insertó como referencia, donde dichos electrodos se conectan a un amplificador DAM 80 (World Precisión Instruments, filtrado 1Hz-10kHz, Ganancia 1000). La señal se registró a 100 Hz por 20 seg. con la ayuda de un osciloscopio (Agilent 54622A) y se digitalizó para mandarla a una PC en donde es rectificada e integrada. La actividad electromiográfica (EMG) se expresa como el área bajo la curva de la actividad tónica (mV/20s). Los registros se realizaron en la más completa relajación muscular del animal. Los resultados obtenidos por esta prueba, muestran que la administración del tratamiento combinado de la presente invención reduce significativamente el incremento del tono muscular inducido por el parkinsonismo (figura 3A). Es importante enfatizar que la reducción de la rigidez muscular alcanza valores semejantes a los que se tenían antes de la lesión dopaminergica al final de la administración del agonista y se mantiene hasta 8 semanas después de su suspender su administración (figura 3B). Esto sugiere, de acuerdo con hallazgos previos (Double y Crocker, 1995; Hemslcy y Crocker, 2001), que el incremento en la entrada dopaminérgica sobre la sustancia nigra reticulata (figura 5) y el estriado (figura 6) de la presente invención reduce a niveles normales la entrada inhibitoria a estos núcleos aumentada por la pérdida de la acción dopaminérgica recuperando así el tono muscular y el control de la marcha [93, 94], dos de los síntomas cardinales de la EP. Se espera que la aplicación del tratamiento en el paciente parkinsoniano también disminuya la rigidez muscular y con ello la coordinación de la marcha.

Otra característica importante que presenta el paciente parkinsoniano es el retraso en la adaptación a las estrategias de balance, propiciándose con esto inestabilidad en tareas de postura dinámica [97]. Además, se ha observado que dicha inestabilidad e imprecisión de los movimientos del paciente se incrementan cuando se le exige que haga mas rápido los movimientos [98] Es por esto, que decidimos evaluar si nuestro modelo de la enfermedad presenta también trastornos de equilibrio en las tareas de postura dinámica y si el tratamiento combinado de la presente invención es capaz de revertirlo. Para ello, se realizó la prueba de rotarod que ha demostrado ser muy sensible para evaluar los efectos terapéuticos de los tratamientos experimentales sobre el equilibrio y la coordinación gruesa [99]. La prueba consistió en colocar a los animales en un equipo automatizado de cuatro carriles con tambor de 7.5 cm de diámetro que gira a velocidades constantes a 5, 10, 15, 20 y 25 rpm durante un periodo máximo de 2 min. por velocidad. El sistema cuenta con sensores ópticos que detectan cuando el animal cae y contabiliza el tiempo de permanencia sobre el tambor. Durante el entrenamiento los animales se colocan en el rotarod durante 2 minutos en 5 y 10 rpm (tres veces en cada velocidad) por 3 días consecutivos antes de comenzar el experimento. Las medidas integradas del desempeño de cada rata sobre el rotarod se obtuvieron como el área bajo la curva de la relación tiempo contra velocidad (ORP: overall rod performance; [99]) y se compararon las ratas contra ellas mismas cuando eran sanas en cada fase del protocolo. Los resultados de esta prueba demuestran por un lado, que nuestro modelo experimental presenta trastornos de equilibrio parecidos a los propios del paciente parkinsoniano y que al igual que en estos se vuelven más severos cuando se incrementa la velocidad de ejecución. Como se puede ver en la figura 4A, el tiempo de permanencia en el rodillo es cada vez menor a medida que aumenta la velocidad de rotación del rodillo. Es importante hacer notar que el tratamiento combinado de la presente invención tambien fue capaz de producir una recuperación prácticamente total de la habilidad de la rata para permanecer en el rodillo conforme se fue incrementando la velocidad del mismo (figura 4A) y este efecto se mantuvo hasta las 8 semanas después de haber interrumpido la administración del agonista D3 (figura 4B). Este hallazgo sugiere que hubo una reducción significativa del tiempo de adaptación a las estrategias de balance, recuperando así la estabilidad en posturas dinámicas cada vez más veloces. Se espera que la aplicación del tratamiento de la presente invención en el paciente permita la recuperación del equilibrio y la eficacia en la realización de sus actividades cotidianas.

Hasta ahora no se ha utilizado el BDNF en el tratamiento de la EP, pero se han evaluado otros factores neurotróficos como posibles terapias de neuroprotecclón [8-11]. Sin embargo, debido a problemas téenicos para lograr una correcta dosificación de estos factores, no se ha podido evitar la aparición de diversos efectos secundarios con estas terapias. Recientemente nuestro grupo de investigación desarrolló el primer protocolo restaurativo basado en la transferencia del gen de BDNF bajo el control del promotor hDAT a neuronas dopaminérgicas de la SNc a través del sistema de nanopartículas NTS-poliplex (Martínez-Fong D. solicitud de patente MX/a/2012/010244).

En la presente invención se logró potenciar los efectos neurotróficos de la transferencia del gen BDNF-flag a través del NTS-poliplex asociándolo a la activación de receptores D3 con el 7-OHDPAT. Para evaluar los efectos del tratamiento combinado sobre el número de neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra y la reinervación estriatal, las ratas fueron perfundidas transcardiacamente con paraformaldehído al 4%. Los cerebros fueron removidos y crioprotegidos con Sacarosa al 30% a 4°C. Se cortaron un total de 35 a 40 rebanadas coronales (50 pm) del mesencéfalo de cada rata abarcando la totalidad de la sustancia nigra compacta y el estriado con la ayuda de un microtomo de deslizamiento (Leica; Heidelberg, Germany). Las rebanadas fueron colectadas en PBS a pH 7.4. El conteo de neuronas se realizó después de la tinción para TH por ¡nmunohistoquímica cada 4 rebanadas (7 a 8 rebanadas por rata). Para depletar la peroxidasa endógena, las rebanadas fueron incubadas en una solución peroxido-metanol (0.3%-10% en PBS) por 30 min. a temperatura ambiente (TA) y despues con PBS-Tritón X-100 al 0.3% con 5% de suero normal de cabra por 30 min. a TA. Posteriormente las rebanadas fueron incubadas con el anticuerpo anti-TH policlonal de conejo (dilución 1:1000; Chemicon International; Temecula, CA, USA) por 48 h a 4°C. Después se lavó 3 veces con PBS y se incubaron con IgG de cabra anticonejo biotinilado (dilución 1:200; Vector Laboratories; Burlingame, CA, USA) por 2 hrs. a TA. La detección enzimática de la peroxidasa se realizó con diaminobenzidina usando VectaStain Elite kit (Vector Laboratories). Las células TH+ se examinaron con un microscopio Leica con objetivo 10x y se fotografiaron con una cámara digital (Leica; Cambridge, UK). Las imágenes digitales de la SNc se proyectaron en un monitor para el conteo semiautomático de las células TH+ usando el Qwin Pro Program (Leica Imaging System Ltd.; Cambridge, UK). Con el tratamiento combinado de la presente invención se consiguió la recuperación de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra SNc (figura 5), así como el restablecimiento de la inervación dopaminérgica al estriado y a la sustancia nigra reticulata (figuras 5 y 6) lo que conlleva a la recuperación de la dopamina en estos núcleos. Es esta recuperación dopaminérgica integral lo que explica la recuperación de la conducta motora prácticamente (figuras 2, 3 y 4).

A la fecha, se desconoce con exactitud cuál es el umbral para que se exprese clínicamente la disfunción dopaminérgica; se piensa que las alteraciones motoras aparecen cuando ocurre una pérdida del 70% de la inervación dopaminérgica en el estriado y un 50% de muerte de neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra [3] Por esta razón, se ha planteado que la terapia neurotrófica restaurativa es la estrategia más adecuada para tratar el parkinsonismo, ya que ésta pretende detener el avance de la muerte de las neuronas dopaminérgicas sobrevivientes así como regenerar las neuronas y restablecer la reinervación funcional a los núcleos de los ganglios básales. Los resultados de la presente invención apoyan fuertemente el uso del tratamiento combinado de BDNF y la activación del receptor D3 esperando que dicho tratamiento cause una regeneración funcional de la vía dopaminérgica nigral en el enfermo con EP. La recuperación de los niveles de dopamina en los núcleos blancos de inervación de las neuronas nigrales que sucede en la terapia neurotrófica mediante el NST-poliplex ([100], Martínez-Fong D. solicitud de patente MX/a/2012/010244; Martinez-Fong et al., Nanomedicine) recuperaría la actividad del círculo virtuoso de estimulación recíproca entre el BDNF y los receptores D3, que persiste aún después de interrumpir la administración del agonista D3.

Tanto en la EP como en los modelos de la enfermedad se ha demostrado que la pérdida de dopamina conduce a un decremento rápido, profundo y selectivo de la longitud y arborización dendrítica de las neuronas espinosas medianas del estriado [101-106]. Estos decrementos están acompañados de la perdida de sinapsis glutamatérgicas y de la densidad de espinas dendríticas [107] de las neuronas estriato-palidales debido a la desinhibición de los canales intraespinales de calcio Cav 1.3 tipo L [108, 109], como resultado de la pérdida de los receptores dopaminérgicos D2 [110, 111]. El resultado de esta desconexión entre las neuronas del caudado-putamen y el globo pálido puede ser la causa, en parte, de la aparición de la sintomatología de la enfermedad [108]. Es por ello, que la recuperación de las espinas dendríticas debe ser una condición necesaria tanto para la recuperación de las sinapsis glutamatérgicas de las terminales corticales sobre las neuronas espinosas medianas, como para la modulación de esta entrada por la dopamina. Con la finalidad de observar si el tratamiento combinado de la presente invención es capaz de recuperar también las espinas dendríticas explicando así las recuperaciones observadas en la marcha, tono muscular y equilibrio, se cortaron bloques de 4 mm de espesor de tejido de estriado, los cuales fueron procesados por el método rápido de Golgi. Este método consiste en la inmersión del bloque en la solución de Golgi (dicromato de potasio al 2.7% y osmio al 0.3%) por 7 días, después se cambia la solución por una de nitrato de plata al 0.75% por 2 días. En seguida se cortan secciones de 100 mm y se deshidratan rápidamente en etanol al 96% y 100%, se aclara con eugenol y xilol y se montan en Enthalan. El análisis consiste en el conteo del número de espinas dendríticas en una longitud de 10 pm en 5 dendritas secundarias, en 10 neuronas piramidales de cada rata [112, 113]. Esta prueba demuestra que la reinervación inducida por la combinación promueve un grado de regeneración de las espinas dendríticas significativamente mayor que los tratamientos individuales al final del estudio como se ilustra en la figura 7. Las dendritas rehabilitadas por el tratamiento combinado de la presente invención después de ser lesionadas con 6-OHDA, no presentan diferencias significativas en el número de espinas comparadas con las muestras no lesionadas (figura 7). Por otro lado, los tratamientos individuales incrementaron significativamente el número de espinas dendríticas con respecto al tratamiento con la solución salina, pero este incremento fue significativamente menor que el producido por el tratamiento combinado de la presente invención (figura 7B). El hallazgo de la recuperación de las espinas dendríticas por el tratamiento combinado de la presente invención sugiere la formación de sinapsis funcionales, las cuales pueden rehabilitar los circuitos neuronales, explicando así la recuperación motora mostrada en las figuras 2, 3, y 4. Con la finalidad de confirmar si la recuperación de espinas dendríticas estriatales fuera consecuencia de la reinervación estriatal de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra transfectadas previamente con el gen que codifica para BDNF-Flag, se utilizaron rebanadas coronales del mesencéfalo para ser procesadas por doble inmunofluorescencia contra TH y flag después de haber inyectado el marcador de transporte retrógrado Dextran-amina rodaminado. Para este fin, las rebanadas se lavaron 3 veces con PBS 1x, se permeabilizaron en PBS-Tritón al 0.5% por 30 min a TA, y se incubaron en PBS-SDS al 0.5% por 5 min. a TA para la recuperación del antígeno. En seguida se procedió al bloqueo de sitios inespecíficos incubando las rebanadas en una solución de BSA al 10% en PBS 1x por 30 min a 37°C. Despues de lavar con PBS 1x por 5 min a TA, las rebanadas se incubaron por 2 hrs. con el anticuerpo monoclonal anti-flag M2 F1804 hecho en ratón (1:300) y el anticuerpo policlonal anti-TH hecho en conejo (1:1000). Después de lavar 3 veces con PBS, se añadieron los anticuerpos secundarios que fueron IgG de oveja antiratón marcado con FITC (1:120) e IgG de cabra anti-conejo CY5 (1:200). Después de una incubación de 45 min., las rebanadas se lavaron, se montaron en cubreobjetos y se cubrieron con Vectashield. Por otro lado, siete días antes de ser sacrificados, los animales fueron inyectados en el estriado con el marcador retrogrado fluorescente dextran-amina conjugado con tetrametilrodamina (RDA) (10,000 MW; Molecular Probes; Eugene, OR, USA) en un volumen total de 1 ml_. La fluorescencia en la SNc fue detectada con un microscopio confocal (Leica Confocal Systems, TCS SP2) utilizando un objetivo 63X, a las longitudes de excitación-emisión de onda de 488-522 nm para FITC (verde), 568-585 nm rodamina y 650-670 nm para CY5. Las imágenes digitales de las células marcadas de la SNc fueron escaneadas serialmente y proyectadas en un monitor con la ayuda del programa de asistencia confocal (Leica Confocal Systems, TCS SP2) y el número de células positivas a TH y al marcador fluorescente fue contado manualmente. La figura 8A muestra la presencia de células con las tres marcas fluorescentes (señaladas por flechas), lo que indica que son células dopaminérgicas que expresaron BDNF-flag y que enviaron sus terminales al estriado. El análisis cuantitativo demostró que el grupo que recibió el tratamiento combinado de la presente invención fue el que presentó el mayor número de neuronas dopaminérgicas (TH+) que proyectaron al estriado (figura 8B). Interesantemente, el grupo que recibió 7-OH-DPAT también mostró un incremento significativo del número de células con doble marca para TH y rodamina, aunque el incremento fue menor que el del tratamiento combinado (figura 8B). Esta evidencia demuestra que el tratamiento combinado de la presente invención produce nuevas proyecciones axonales que reinervan el estriado en la rata, por lo se espera que dicho tratamiento conduzca a una regeneración funcional de la vía dopaminérgica nigral en el enfermo de Parkinson. Por otro lado, la presencia del BDNF-flag en las neuronas dopaminérgicas nigrales hasta el final del estudio (11.5 meses) demuestra la permanecía de la expresión del BDNF transgénico aún después de haber interrumpido el tratamiento farmacológico. Este hallazgo sugiere fuertemente que el BDNF es importante para el mantenimiento de la restauración funcional del sistema dopaminérgico nigroestriatal que produce el tratamiento combinado.

En la presente invención hemos comparado los efectos de la monoterapia con un agonista selectivo para D3R (7-OHDPAT), con la monoterapia de la transfección no viral del gen que codifica para BDNF y la asociación de ambos para probar el beneficio de la potenciación mutua. Los resultados presentados en la presente invención demuestran que los efectos de la combinación sobre el deficit motor ocasionado por la lesión unilateral estriatal con 6-OHDA, son significativamente superiores a los conseguidos con las monoterapias. Esto es evidenciado por una mejoría superior en la coordinación de la marcha (figura 2), la desaparición del incremento del tono muscular (figura 3) y la mejora en la coordinación gruesa y el equilibrio medidos en el rotarod (figura 3). El tratamiento combinado de la presente invención también produjo una mayor reinervación dopaminérgica de la sustancia nigra reticulata (figura 5) y el estriado (figura 6), esta última acompañada de un incremento significativo en el número de espinas dendríticas en las neuronas estriatales (figura 7). En general, aun cuando los tratamientos individuales consiguieron mejoras sustanciales en algunos de los aspectos evaluados, la combinación de la presente invención demostró ser significativamente superior en todos ellos. El tratamiento con la transfección no viral genera una expresión fisiológica de BDNF, y de acuerdo con hallazgos previos para BDNF, esto controlará la expresión de los receptores D3 [85-88], por lo que producirá efectos más duraderos de los que se registran con las monoterapias con agonistas selectivos para esos receptores, como el pramipexole, sin presentar los efectos indeseables de las transfecciones virales o de las aplicaciones no fisiológicas de BDNF. Por otro lado, la activación selectiva de los receptores D3 asociada a la expresión fisiológica de BDNF prolongará el tiempo útil de la terapia retrasando así la utilización de la L-dopa y con ello de la aparición de discinesias. Aún más, la larga duración de la expresión de BDNF después de haber interrumpido el tratamiento farmacológico favorece el mantenimiento de la restauración funcional del sistema dopaminérgico nigroestriatal ocasionado por el tratamiento combinado. Todo esto, apoya al tratamiento combinado de la presente invención como una estrategia prometedora para prevenir la degeneración y regenerar las neuronas dopaminérgicas sobrevivientes, restaurando la vía nigroestriatal y la función dopaminérgica en el estriado, la sustancia nigra reticulata y en los otros núcleos de los ganglios básales.

Para efectos de la presente invención, el agonista de receptores D3 (por ejemplo 7-hidroxi-A/,A/-di-/7-propil-2-aminotetralina ó 7-OH-DPAT) puede ser administrado de 0.1 a 0.9 mg/Kg de peso corporal/día, por ejemplo y sin limitarse, mediante una bomba osmótica (marca Alzet modelo 2006) con capacidad de 200 mI y flujo de 0.15 mI/hr, la cual se implantó i.p. Esta concentración permite la activación de los receptores D3 sin activar los receptores D2 (Chagas-Martinich et al, 2007), reemplazándose 3 bombas en cada rata (para el caso de administración en el modelo animal utilizado en la presente invención) para un total de 18 semanas de tratamiento. Mientras que para el caso del NTS-poliplex descrito aquí, éste puede ser administrado en una cantidad de 2 mL de una solución phDAT-BDNF-Flag/acarreador NTS donde los índices óptimos de molaridad de sus componentes son por ejemplo, 30 nM pDNA, 30 mM PK y 1.17 mM del acarreador NTS, donde dicho NTS-poliplex puede ser administrado vía parenteral mediante inyección lenta (0.1 mL/min) en las siguientes coordenadas del modelo animal utilizado en la presente invención: AP, -5.0; ML, +1.9, DV -7 (González-Barrios et al, 2006).

El objetivo principal de la presente invención es proporcionar la combinación de un agonista de los receptores dopaminergicos D3 como componente (A) y del agente para terapia génica NTS-poliplex-gen BDNF como componente (B), en proporción adecuada para producir un efecto terapéutico que promueva la restauración de la vía dopaminérgica nigroestriatal y la reinervación funcional. .

Queda comprendida en esta modalidad principal la estrategia de terapia génica combinada con terapia farmacológica, donde la terapia génica se basa en el uso del complejo macromolecular el cual es un vector fusogénico que comprende poli-lisina con un peso molecular de 15,000 a 70,000 Da y que va conjugada covalentemente a un ligando específico para un receptor celular y un péptido fusogénico, al menos un péptido señal de direccionamiento nuclear unido al material genético y unido electrostáticamente a la poli-lisina. En este caso utilizamos como tal vector fusogénico al poliplex de neurotensina (NTS-poliplex) para el envío dirigido del transgen BDNF en la sustancia nigra para tratar la EP experimental.

Queda comprendida como modalidad de la presente invención la posibilidad de que con esta terapia combinada se puedan eliminar los síntomas de la enfermedad, y del parkinsonismo en general una vez que se haya manifestado el proceso neurodegenerativo en el paciente en cualquier etapa de la EP en la que se encuentre, aún con niveles de dopamina en el estriado disminuidos hasta en un 80%, en tanto permanezca un porcentaje mínimo de las neuronas en la sustancia nigra, de preferencia en etapas tempranas de la enfermedad donde aún se encuentran de un 50 a un 60% de las neuronas en la sustancia nigra y un 20% de inervación dopaminérgica en el putamen.

Un objetivo más de la presente invención se refiere al uso del poliplex de neurotensina para transfectar a la neuronas dopaminérgicas sobrevivientes en la sustancia nigra en pacientes con EP en etapas tempranas a intermedias de la enfermedad y consecuentemente restaurar la expresión de la neurotrofina BDNF, combinando el uso de un agonista D3 en cualquier etapa de la enfermedad, con la eliminación posterior de los síntomas del parkinsonismo.

Queda comprendido dentro de las modalidades de la presente invención el proporcionar los elementos para hacer las combinaciones o formulaciones farmacéuticas posibles que contengan NTS-poliplex que expresa BDNF como componente (A) y un agonista D3 como componente (B), siendo estos componentes (A) y (B) los principios activos de la combinación, así como su uso por el médico tratante en las dosis y tiempos que determine como experto en su campo y dependiendo de los requerimientos del paciente; así mismo queda comprendido dentro del alcance de la invención, el uso no simultáneo sino secuencial de estos componentes (A) y (B) en cualquier orden, y esquema de duración, en un paciente con riesgo de presentar la EP en cualquier etapa de la enfermedad, siendo este uso de conformidad con lo que el medico determine para su caso en particular.

Es una modalidad más de la presente invención proporcionar la promoción de una regeneración funcional del sistema dopaminérgico nigral que persista después de haber interrumpido la administración con un agonista de los receptores D3 ya sea por causa de la tolerancia farmacológica o por la aparición de efectos secundarios incapacitantes.

Una modalidad más de la presente invención se refiere al set, kit o equipo de medicamentos caracterizados por contener a los principios activos (A) y (B) que en conjunción tienen el objetivo de restaurar la vía dopaminérgica estriatal en pacientes con alguna etapa de la EP.

Se establece como modalidad de la presente invención proporcionar una estrategia basada en el uso del complejo macromolecular denominado poliplex de neurotensina para el envío dirigido del transgen BDNF en la sustancia nigra en condiciones experimentales (en animales no humanos, preferentemente en rata), combinando el efecto de al menos un agonista D3; con la consecuente disminución del hemiparkinsonismo temprano causado por un daño significativo de las neuronas dopaminérgicas con 6-OHDA que se ha manifestado plenamente a través de alteraciones motoras severas y evidentes, quedando delimitado este uso del método combinado solo para tales fines experimentales e independientemente del objetivo que se busque al abordar tal modelo in vivo.

Se establece como modalidad de la presente invención proporcionar una estrategia de terapia combinada basada en el uso del complejo macromolecular denominado poliplex de neurotensina para el envío dirigido del transgen BDNF en la sustancia nigra y de al menos un agonista D3, en condiciones experimentales (en animales no humanos), con la consecuente disminución del parkinsonismo ocasionado por la inducción de la destrucción selectiva de las neuronas dopaminérgicas nigroestriatales, por la administración sistémica de la neurotoxina 1 -metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) usado como modelo de la EP (Luquin, et al. 1991).

Dentro de las modalidades de la invención se define al vector fusogénico NTS-poliplex como uno de los componentes activos a la macromolécula que se constituye del ligando neurotensina (NTS) unida al péptido fusogénico (PF) que puede ser el derivado de la hemaglutinina H2A del virus de la influenza (modificado) con la secuencia de aminoácidos GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCAKKK, mediante el entrecruzador poli-L-lisina (PLL) que se une a un plásmido (pDNA) que codifica para el gen BDNF, por ejemplo el plásmido phDAT-BDNF-flag (10.511 Kpb) descrito en la solicitud de patente MX/a/2012/010244 (Martínez-Fong D.) en el cual el gen que codifica para el BDNF está bajo control del promotor hDAT (transportador de dopamina); y puede además incluir un péptido cariofílico (PK) como señal de localización nuclear el cual puede ser el de la proteína principal de la cápside del virus 40 de simio (SV40) con la secuencia de aminoácidos MAPTKRKGSCPGAAPNKPK el cual está unido de manera electrostática al pDNA. La relación molar óptima de pDNA, PK y NTS-entrecruzador-PLL que puede ser estimada mediante ensayos de retención y retardamiento, queda como una modalidad de la presente invención, siendo por ejemplo 30 nM pDNA, 30 mM PK, 1.17 mM de NTS-entrecruzador-PLL (Martinez-Fong, et al 2012, doi: 10.1016/j. nano). El complejo NTS-poliplex mencionado se obtiene mediante la metodología descrita en la patente MX264932 (Martínez Fong, D., 2009), la cual se incluye como referencia. Quedan dentro del alcance de la invención los metodos para estudiar en modelos experimentales in vitro o in vivo los mecanismos de regulación de la expresión de la neurotrofina BDNF o bien eventos celulares relacionados con el neurotrofismo, junto con los efectos de un agonista D3, mediante la transfección de neuronas que poseen el receptor de internalización para neurotensina con el transgen que codifica para el BDNF utilizando como acarreador al NT-poliplex de la invención, administrado por inyección de manera parenteral, o bien en el líquido cefaloraquídeo o in situ a nivel de ganglios básales del cerebro; con la aplicación consecuente de métodos de evaluación adecuados de las respuestas esperadas por la expresión del transgen BDNF. Las respuestas asociadas al neurotrofismo por efecto del BDNF y/o de la neurogénesis ocasionadas por el agonista D3, pueden incluir pero no limitarse a las siguientes: mecanismos celulares y moleculares de la regeneración axonal, el metabolismo neuronal, la bioenergética neuronal, actividad de neurotransmisores y señalización, eventos de apoptosis o efecto de polimorfismos de dichas proteínas.

Queda dentro de las modalidades de la invención la posibilidad de diseñar modelos experimentales tanto in vitro como in vivo para la EP, en tanto se basen en el uso de la combinación de un agonista D3 y de la transfección de BDNF mediante NST-poliplex tal y como está implícito dentro del espíritu de la presente solicitud.

Los siguientes ejemplos no son limitativos del alcance de la invención, ya que solo pretenden ilustrar el desempeño de la misma y conforman parte del soporte experimental que se requiere en el campo teenológico de la invención.

Ejemplo 1. Estrategia de aplicación de la terapia combinada de la invención con un agonista D3 y transfección de BDNF en ratas hemiparkinsonianas.

La invención comprende promover una regeneración funcional de la inervación funcional de los ganglios básales que persista por ejemplo después de haber interrumpido el tratamiento convencional con un agonista de los receptores D3 ya sea por causa de la tolerancia farmacológica o por la aparición de efectos secundarios incapacitantes. Normalmente los enfermos con EP son tratados con un agonista D3 cuando las discinesias producidas por la levodopa superan al efecto terapéutico. Es en este momento cuando se plantea asociar la transfección del gen que codifica para el BDNF en las neuronas dopaminergicas sobrevivientes con el propósito de potenciar los efectos mitogénicos, neurogénicos y neuritogénicos (crecimiento y arborización dendrítica y axonal) que producen los receptores D3 al ser activados por su agonista selectivo 7-OHDPAT. Esta estrategia tiene la ventaja adicional de que la activación de los receptores D3 estimulará la producción y liberación del BDNF endógeno [73] Aún más, el BDNF endógeno y el transgénico incrementarán la expresión del receptor D3 [85-88], prolongando y amplificando así los efectos terapéuticos.

La invención se validó en ratas macho Wistar viejas de 11 meses de edad a las que se indujo el hemiparkinsonismo (figura 1). El hemiparkinsonismo se indujo unilateralmente con 10 mg/pL de la neurotoxina 6-OHDA inyectados en 2 sitios del estriado (AP +1.9, LM -2.2, DV -5.0; AP +0.8, LM -3.0, DV -4.0). Posteriormente, se dejan a los animales lesionados sin ningún tratamiento por un periodo de 5 meses simulando el desarrollo crónico de la EP. En este periodo se realizan sólo pruebas en el rotarod a los 4.5 meses de evolución del hemiparkinsonismo para documentar el grado de lesión juzgado por el desempeño motor de la rata (figura 1). Los valores se comparan con los registrados previo a la lesión estriatal (condición normal) en el mismo animal para evitar las diferencias entre individuos. Este protocolo de evaluación conductual simula la evaluación clínica a la que se somete cada paciente para establecer el diagnóstico, con la excepción de que en este caso la evolución de las alteraciones motoras se compara con los valores de la población general sana de la misma edad. Se seleccionan las ratas que tuvieron una reducción mayor al 50% en su desempeño en el rotarod para evitar recuperación espontánea. Al quinto mes de evolución del hemiparkinsonismo, se transfecta una sola dosis del gen BDNF-flag en la substancia nigra utilizando el sistema de nanopartículas NTS-poliplex descritas por Martinez-Fong en la solicitud de patente MX/a/2012/010244 y se inicia el tratamiento con el 7-OHDPAT administrado a través de minibombas de perfusión osmótica para suplir concentraciones constantes del medicamento (figura 1). Después de 4 meses de tratamiento (mes 9 de evolución del protocolo) se suspende la administración del 7-OH-DPAT y se registra nuevamente el desempeño en el rotarod (figura 1). Posteriormente se realiza la prueba del rotarod un mes después (mes 10 de evolución del protocolo) y al final del protocolo experimental (mes 11 de evolución del protocolo). En este tiempo también se evalúan los trastornos de la marcha (figura 2) y la rigidez muscular (figura 3), que junto con la inestabilidad postural, la coordinación y el equilibrio (figura 4), constituyen los síntomas cardinales de la EP. Es en este punto donde la transfección no viral del gene para BDNF en la SNc juega un papel crucial en la eficacia terapéutica de nuestra invención, ya que induce una expresión estable y fisiológica del BDNF en las neuronas dopaminérgicas sobrevivientes por la transfección del gen con el sistema NTS-poliplex, como se describe por Martinez-Fong en la solicitud de patente MX/a/2012/010244.. Para demostrar la transfección estable del BDNF-flag en las neuronas dopaminérgias, los animales son sacrificados para realizar ensayos de doble inmunofluorescencia contra TH y flag (BDNF transgénico) en cortes coronales de la substancia nigra (figura 8). Adicionalmente se demuestra el aumento en la sobrevida de las neuronas dopaminérgicas de la substancia nigra y el restablecimiento de la inervación estriatal por la inmunohistoquímica contra TH (figuras 5 y 6). Esta última es demostrada también con el uso del marcador de transporte retrógrado combinado con la doble inmunofluorescencia contra TH y flag (figura 8). Utilizando el método rápido de Golgi, se demuestra el restablecimiento de las espinas dendríticas de las neuronas espinosas medianas en el estriado del lado lesionado (figura 7). Este resultado constituye una fuerte evidencia del restablecimiento de la conectividad sináptica a nivel del estriado.

El conjunto de evidencias presentadas aquí demuestran que el esquema de tratamiento mixto de la presente invención promete detener la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la EP y promover la restauración funcional y duradera de sus proyecciones sinápticas a los núcleos de inervación como el estriado.

Ejemplo 2. La terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF corrige las alteraciones finas de la marcha inducidas por el parkinsonismo.

Las anormalidades en la marcha, las cuales son altamente incapacitantes en la EP se manifiestan en la rata principalmente por la oscilación del desplazamiento de la cadera y el incremento del ángulo de máxima flexión del tobillo durante la fase de balanceo (figura 2). Para determinar estas dos variables, se video grabaron durante el caminar libre a través de un pasillo iluminado (110 cm de longitud por 12 cm de ancho por 15 cm de alto) los puntos de tinta negra previamente pintados sobre la piel a nivel de cresta iliaca, cadera, tobillo y extremo distal del primer metatarsiano. Ese pasillo está provisto de espejos para poder videograbar ambos lados de la rata simultáneamente con una cámara Ciber-Shot de Sony (modelo DSC-W110) colocada al centro del pasillo a 80 cm de distancia. El video se convierte cuadro por cuadro a imágenes JPG con la ayuda del programa Total Video Converter, para calcular las coordenadas de los puntos antes mencionados con el software ImageJ (de NIH y disponible en http:brsb.info.nih.gov/ii/) en cada imagen. Posteriormente las coordenadas de la rodilla se calculan por geometría analítica considerando la longitud de los huesos tibia y fémur de cada rata en razón a la posición del tobillo y cadera en cada imagen [92]. Las coordenadas encontradas con imageJ se analizaron con la ayuda de un programa especial donde se calculan los ángulos en grados de las articulaciones de la cadera, rodilla y tobillo de ambas extremidades y se comparan con la misma rata cuando era sana (figura 2). Este análisis permitió demostrar que, al igual que en la EP, el parkinsonismo inducido en la rata causa severos trastornos a la marcha (figura 2A). Se puede notar el incremento notable (16.5% en promedio) en el ángulo de máxima flexión del tobillo durante la fase de balanceo de la rata hemiparkinsoniana como lo indican las flechas en las fotografías de la extremidad posterior de la rata y las gráficas del desplazamiento de la extremidad contralateral a la lesión (figura 2A). En la rata hemiparkinsoniana también aparecen otras modificaciones angulares de las demás articulaciones implicadas, que en su conjunto alteran significativamente la coordinación general del movimiento a lo largo del recorrido. Esta alteración consiste en la oscilación del desplazamiento de la cadera, la cual se hace evidente por la línea negra gruesa que marca la trayectoria del (figura 2A). Nótese que la trayectoria del desplazamiento en la rata sana es casi horizontal. Todos los trastornos de la marcha antes mencionados ocasionados por el parkinsonismo inducido en la rata se revierten casi a la normalidad después del tratamiento combinado de la presente invención (figura 2A) y permanecen hasta 8 semanas después de haber interrumpido el tratamiento con 70HDAT (fin del estudio), como lo muestra la figura 2B. Los diferentes tratamientos farmacológicos se aplicaron por un periodo de 18 semanas (la transfección de BDNF-flag se efectuó solamente una vez) durante las cuales se aprecia una recuperación significativa generada únicamente por la combinación conforme a la presente invención. Como se explica en el cuerpo de la invención, es posible que el círculo virtuoso de estimulación recíproca entre los receptores D3 y el BDNF, sea mantenido por el propio agonista endógeno, la dopamina, cuyos niveles se incrementaron como resultado de la regeneración del sistema dopaminérgico, y por la expresión sostenida del BDNF transgénico.

Ejemplo 3. La terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF disminuye la rigidez inducida por el parkinsonismo.

La rigidez muscular es un signo constante en la EP y se mide tanto en la clínica como en la experimentación por EMG [114]. La importancia clínica para cuantificar la rigidez radica en que esta anormalidad es la que altera el desempeño motor y la coordinación motora en la EP. El incremento de la actividad EMG indica que la EP empeora, en tanto que la disminución indica objetivamente el grado de curación de la enfermedad. Para determinar ambos fenómenos en el modelo experimental de rata utilizado en la presente invención, se efectuaron registros electromiográficos del músculo gastroenemio contralateral e ipsilateral a la lesión, y en el músculo y tibial anterior, ya que estos músculos son empleados de manera muy importante durante la ejecución de la zancada, principalmente durante las fases de impulso y apoyo, por lo que un incremento en el tono muscular del gastrocnemio o el tibial anterior, es capaz de generar trastornos severos a la coordinación de la marcha. Para esto, se colocó a la rata en posición ventral sobre una hamaca que sólo permitía la exposición de las extremidades posteriores las cuales quedan suspendidas en el aire para evitar la estimulación sensorial cutánea y muscular. También para evitar cualquier interferencia en el registro por estímulos visual y acústico, el registro 1 29 se hizo en un lugar controlado de luz y ruido [95, 96]. Los registros se realizaron con electrodos aislados de platino con la punta sin aislar (Grass) insertados subcutáneamente sobre la superficie de los músculos de interes con la finalidad de no dañar el tejido contráctil y un quinto electrodo se insertó como referencia. Los electrodos se conectan a un amplificador DAM 80 (World Precisión Instruments, filtrado 1Hz-10kHz, Ganancia 1000). La señal se registra a 100 Hz por 20 seg. con la ayuda de un osciloscopio (Agilent 54622A) y se exporta para su digitalización al programa computación Excel (Microsoft), para ser rectificada e integrada. La EMG se expresa como el área bajo la curva de la actividad tónica ( V/20s). A semejanza de la EP, la inyección con 6-OHDA incrementa el tono muscular (rigidez) en el músculo gastroenemio contralateral a la lesión (figura 3). De manera interesante, el tratamiento combinado de la invención con 7-OH-DPAT y transfección con BDNF-flag redujo considerable este incremento del tono muscular producido por el parkinsonismo (figura 3) y se mantiene hasta 8 semanas después de la interrupción de la administración del 7-OH-DPAT (figura 3B). Este resultado muestra que el control del tono muscular ésta asociado a la corrección de la marcha (figura 2) posiblemente debido al incremento en la entrada dopaminérgica sobre la sustancia nigra reticulata (figura 5) y el estriado (figura 6) [93, 94, 115, 116].

Ejemplo 4. La terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF restablece la coordinación motora alterada por el parkinsonismo.

La rigidez muscular en los pacientes con EP también retrasa su capacidad de adaptación a las estrategias de balance, propiciándose con esto inestabilidad en tareas de postura dinámica [97] que se incrementan por la exigencia de ejecutar movimientos más rápido [98]. Es por esto, que se implemento la prueba de rotarod para evaluar los trastornos de equilibrio en las tareas de postura dinámica y los efectos terapéuticos, ya que esta prueba es muy sensible para evaluar los efectos de los tratamientos experimentales sobre el equilibrio y la coordinación gruesa [99] El rotarod es un equipo automatizado provisto de un tambor de 7.5 cm de diámetro que gira a velocidades constantes (5, 10, 12, 15, 20 y 25 rpm durante 2 min por velocidad) y de sensores ópticos que detectan cuando el animal cae y contabilizan el tiempo de estancia sobre el tambor. Los animales se someten a un periodo de entrenamiento en el rotarod durante 2 minutos en 5 y 10 rpm (tres veces en cada velocidad) por 3 días consecutivos antes de comenzar el experimento. Los valores corresponden al área bajo la curva de la integración del desempeño (permanencia en el rotarod) en función de la velocidad (ORP: overall rod performance; [99]), los cuales se normalizan contra los valores obtenidos para cada rata cuando era sana. La figura 4A muestra el tiempo de permanencia en el rotarod, expresado como porcentaje del tiempo en la condición sana de la misma rata, en función de la velocidad del tambor en los cuatro registros que se efectuaron durante el estudio (después de la lesión, a las 12 y 18 semanas de tratamiento y a las 8 semanas de después del tratamiento). La figura 4B muestra el cambio en la actividad integrada para cada una de los cuatro registros en función del tiempo. Los resultados de esta prueba muestran que el desempeño en el rotarod también disminuye en una rata sana conforme avanza la edad. Este resultado apoya la sensibilidad del rotarod pues es capaz de detectar la disminución fisiológica de la actividad motora que sucede durante el envejecimiento. A semejanza de la EP, los resultados de esta prueba revelan los trastornos de equilibrio en las ratas hemiparkinsonianas que se vuelven más severos cuando se incrementa la velocidad de ejecución (figura 4A). Es importante hacer notar que el tratamiento combinado acorde a la presente invención también produce la recuperación de la habilidad de la rata para permanecer en el rodillo aún a las velocidades más altas del mismo (figura 4A). Este hallazgo sugiere que hubo una reducción significativa del tiempo de adaptación a las estrategias de balance que explican la estabilidad en posturas dinámicas cada vez más rápidas. Esta habilidad motora recuperada se mantuvo hasta las 8 semanas (fin del estudio) después de haber interrumpido la administración del agonista D3 (figura 4B), por lo que dicha recuperación no puede ser atribuida a efectos farmacológicos. Estos resultados son muy alentadores considerando que se ha observado que la inestabilidad e imprecisión de los movimientos del paciente con Parkinson se vuelven más severos cuando se les pide que hagan los movimientos más rápido [98], Con base en estos resultados, se espera que la aplicación del tratamiento de la presente invención en el paciente con EP recupere el equilibrio y la eficacia en la realización de actividades dinámicas.

Ejemplo 5. La terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF incrementa el número de neuronas ??+ en la substancia nigra y la densidad de sus proyecciones en el área del estriado y SNr afectada por la lesión con 6-OHDA.

Hasta ahora, los tratamientos farmacológicos para la EP solamente suplen la función de la dopamina, pero no detienen el avance de la neurodegeneración, por lo que terminan siendo inefectivos e indeseables por los efectos colaterales incapacitantes. Cuando un medicamento antiparkinsoniano es suspendido por su inoperancia, desafortunadamente la enfermedad ya avanzó y el medicamento suplente encuentra un sustrato dopaminérgico escaso para ejercer una acción terapéutica eficiente. Para que una terapia antiparkinsoniana sea efectiva y permanente se requiere que rescate a las neuronas dopaminérgicas comprometidas a la muerte y promueva regeneración estable y funcional de sus proyecciones sinápticas en los sitios de inervación. Estos dos objetivos se cumplen con la terapia combinada de la presente invención con el agonista D3 y la transfección con BDNF-flag, como este ejemplo demuestra a través de la téenica de inmunohistoquímica para TH ensayada a nivel del mesencéfalo y núcleo estriado.

Despues de la fijación de los cerebros por perfusión transcardiaca de paraformaldehído al 4% y crioprotección en sacarosa al 30% a 4°C, se obtuvieron un total de 35 a 40 rebanadas coronales (50 pm) del mesencéfalo abarcando la totalidad de la SNc y la mayor parte del estriado con la ayuda de un microtomo de deslizamiento (Leica; Heidelberg, Germany). Las rebanadas fueron procesadas con la téenica de inmunohistoquímica para TH después de eliminar la peroxidasa endógena con una solución peróxido-metanol (0.3%-10% en PBS; 30 min de incubación a temperatura ambiente (TA)) y haber permeabilizado con PBS-Tritón X-100 al 0.3%. Las rebanadas se incubaron con 5% de suero normal de cabra por 30 min. a TA para bloquear los sitios inespecíficos de unión al anticuerpo. Posteriormente las rebanadas fueron incubadas con anti-TH policlonal de conejo (dilución 1:1000; Chemicon International; Temecula, CA, USA) por 48 h a 4°C. Después se lavó 3 veces con PBS y se incubaron con IgG de cabra anti-conejo biotinilado (dilución 1 :200; Vector Laboratories; Burlingame, CA, USA) por 2 hrs. a TA. La detección enzimática de la peroxidasa se realizó con diaminobenzidina usando VectaStain Elite kit (Vector Laboratories). Las células y fibras inmuno teñidas con TH se fotografiaron con una cámara digital adaptada a un microscopio Leica (Leica; Cambridge, UK). El conteo de neuronas TH+ en la SNc se realizó en cada 4 rebanadas (7 a 8 rebanadas por rata) utilizando el Qwin Pro Program (Leica Imaging System Ltd.; Cambridge, UK). Se cuantificó la densidad de las fibras TH+ en la SNr y el estriado para demostrar la recuperación de la reinervación dopaminérgica en dos ejemplos de núcleos blanco de inervación dopaminérgica nigral.

Los estudios de conteo neuronal realizados al final del estudio (11.5 meses) determinaron que la lesión con 6-OHDA disminuyó a un 50% la población celular TH+ en la SNc de las ratas no tratadas (figura 5B). La población celular TH+ en las ratas tratadas con 7-OH-DPTA y la transfección de BDNF-flag fue del 80%, lo que indica que el tratamiento combinado de la invención aumentó el número de neuronas dopaminérgicas en la SNc por un mecanismo que pudiera ser la neurogénesis como lo sugieren resultados preliminares de nuestro grupo de investigación. La recuperación de la población celular TH+ causada por el solo tratamiento con 7-OH-DPAT, aunque significativa, no fue tan importe como en el caso del tratamiento combinado de la invención (figura 5B). Interesantemente, la sola transfección con BDNF-flag logró la recuperación completa de la población dopaminérgica (figura 5B). Sin embargo, la densidad de la inmuno-reactividad a TH en la SNr (figura 5A) y en el estriado (figura 6B) fue mayor en el grupo de ratas hemiparkinsonianas que recibió el tratamiento combinado. Los estudios de densitometría en el estriado demostraron que la recuperación de la inmuno-reactividad a TH se extendió hasta 600 mm a partir del sitio de inyección (0 pm). Este resultado sugiere fuertemente que la reinervación dopaminérgica cubre un área extensa del estriado, lo que fundamenta la eficacia del tratamiento combinado. Es importante hacer notar que el efecto benéfico sobre la población neuronal y la inervación a 2 núcleos de proyección de las neuronas nigrales se observa hasta 8 semanas después de haber suspendido la administración con 7-OH-DPAT (fin del estudio).

Estos resultados constituyen una sólida evidencia de que la terapia combinada de la invención promovió una recuperación duradera del sistema dopaminérgico nigral, a diferencia de los tratamiento farmacológicos actuales que sólo suplen la acción de la dopamina. El incremento en la inmuno tinción a la TH se debe al incremento en los niveles de esa enzima, lo que conlleva también al incremento en los niveles de dopamina [100] La recuperación de los niveles del neurotransmisor, la dopamina, explica la reducción de la conducta motora alterada que se muestra en los ejemplos anteriores (figuras 2, 3 y 4). A la fecha se desconoce con exactitud cuál es el umbral para que se exprese clínicamente la disfunción dopaminérgica; se piensa que las alteraciones motoras aparecen cuando ocurre una pérdida del 70% de los niveles de dopamina en el estriado y un 50% de muerte de neuronas dopaminérgicas en la SNc [3]. Por esta razón, se ha planteado que la terapia neurotrófica restaurativa es la estrategia más adecuada para tratar el parkinsonismo, ya que ésta pretende detener el avance de la muerte de las neuronas dopaminérgicas sobrevivientes a la neurodegeneración y restablecer la reinervación funcional a los núcleos de proyección sináptica como se demuestra en la presente invención. Estos ejemplos de recuperación morfológica apoyan fuertemente el uso del tratamiento combinado de BDNF y D3R de la presente invención en la terapia restaurativa para la EP.

Ejemplo 6: La terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF restablece las espinas dendríticas de las neuronas espinosas medianas del estriado disminuidas por el parkinsonismo.

En la EP, al igual que en otras enfermedades neurodegenerativas, sucede un fenómeno de atrofia de los elementos postsinápticos por carencia de estímulos de los elementos presináticos (que son los que degeneran por la enfermedad). En consecuencia, la depleción de dopamina produce atrofia en las dendritas de las neuronas espinosas medianas del estriado (caudado-putamen en el humano) que se manifiesta por disminución en el número de espinas dendríticas [101-106]. En estas espinas es donde se establece la sinapsis de las terminales glutamatérgicas que provienen de la corteza cerebral y sinapsis dopaminérgicas nigrales. El resultado de esta desconexión entre las neuronas del caudado-putamen y el globo pálido puede ser la causa, en parte, de la aparición de la sintomatología de la EP [108] Es por ello, que la recuperación de las espinas dendríticas debe ser una condición necesaria tanto para la recuperación de las sinapsis glutamatérgicas de las terminales corticales sobre las neuronas espinosas medianas, como para la modulación de esta entrada por la dopamina (plasticidad funcional).

Por lo tanto, se determinó la densidad de las espinas dendríticas en cortes de 100 mm de espesor que se procesaron con el metodo rápido de Golgi. Este método consiste en la inmersión del bloque de 4 mm del estriado en la solución de Golgi (dicromato de potasio al 2.7% y osmio al 0.3%) por 7 días, después se cambia la solución por una de nitrato de plata al 0.75% por 2 días. En seguida se cortan secciones de 100 pm y se deshidratan rápidamente en etanol al 96% y 100%, se aclara con eugenol y xilol y se montan en Entellan. El análisis consiste en el conteo del número de espinas dendríticas en una longitud de 10 pm en 5 dendritas secundarias, en 10 neuronas piramidales de cada rata [112, 113]. La figura 7A muestra las espinas en una dendrita normal y la atrofia de ellas en una dendrita del estriado del lado lesionado con 6-OHDA al final del estudio (11.5 meses). Además, ilustra cualitativamente la recuperación de la densidad dendrítica inducido por el tratamiento combinado de la invención. La figura 7B muestra que la densidad de espinas en una longitud de 10 pm de las dendritas rehabilitadas por el tratamiento combinado de la invención después de ser lesionadas con 6-OHDA, no presentan diferencias significativas en comparación con la densidad dendrítica determinada en estriados de ratas sanas (figura 7B). Los tratamientos individuales también incrementan la densidad dendrítica pero no alcanzan los valores de la condición sana (figura 7B). El hallazgo de la recuperación de las espinas dendríticas causada por el tratamiento combinado de la invención aún después de haberse interrumpido la administración del 7-OH-DPTA es una evidencia de que dicho tratamiento desarrolla plasticidad sináptica en el estriado y que es funcional como lo demuestran los ejemplos de las figuras 2, 3 y 4. Sobre esta base, se espera que el tratamiento combinado de la invención rehabilite anatómica y funcionalmente los circuitos neuronales en los enfermos con EP.

Ejemplo 7. La terapia combinada con un agonista D3 y transfección de BDNF restablece la innervación dopaminérgica al estriado.

Para demostrar una evidencia neurotrófica de la participación de BDNF transgénico en el restablecimiento de la inervación dopaminérgica al estriado como sustento para explicar la plasticidad dendrítica se realizaron experimentos de doble inmunomarcaje fluorescente contra TH y flag (BDNF transgénico) combinados con mareaje retrogrado inyectando Dextran-amino fluorescente en el estriado al final del estudio (11.5 meses). La estrategia de este experimento es demostrar que las neuronas dopaminérgicas (TH+) transfectadas con BDNF (flag+) presentan marca de Dextran-amino fluorescente. Con este propósito, se inyectó en el estriado 1 mL de dextran-amino conjugado con tetrametilrodamina (RDA) (10,000 MW, lysine fixable; Molecular Probes; Eugene, OR, USA), marcador de transporte retrogrado, siete días antes de ser sacrificados. El día del sacrificio de los animales, se fijó el cerebro perfundiendo trascardialmente 200 mL de paraformaldehído al 4% en PBS. Posterior a la crioprotección en sacarosa al 30% a 4°C, se obtuvieron cortes coronales (50 miti) del mesencéfalo para ser procesadas con la téenica de inmunofluorescencia doble contra TH y flag. Las rebanadas se lavaron 3 veces con PBS 1x, se permeabilizaron en PBS-Tritón al 0.5% por 30 min a TA, y se incubaron en PBS-SDS al 0.5% por 5 min. a TA para la recuperación del antigeno. En seguida se procedió al bloqueo de sitios inespecíficos incubando las rebanadas en una solución de BSA al 10% en PBS 1x por 30 min a 37°C. Después de lavar con PBS 1x por 5 min a TA, las rebanadas se incubaron por 2 hrs. con el anticuerpo monoclonal anti-flag M2 F1804 hecho en ratón (1:300) y el anticuerpo policlonal anti-TH hecho en conejo (1:1000). Después de lavar 3 veces con PBS, se añadieron los anticuerpos secundarios que fueron IgG de oveja anti-ratón marcado con FITC (1:120) e IgG de cabra anticonejo CY5 (1:200) y se incubaron por 45 min. La fluorescencia en la SNc fue detectada con un microscopio confocal (Leica Confocal Systems, TCS SP2) utilizando un objetivo 63X, a las longitudes de excitación-emisión de onda de 488-522 nm para FITC (verde), 568-585 nm para rodamina y 650-670 nm para CY5. Las imágenes digitales de las células marcadas de la SNc fueron proyectadas en un monitor con la ayuda del programa de asistencia confocal (Leica Confocal Systems, TCS SP2) y el número de células positivas a TH y al marcador fluorescente fue contado manualmente. La figura 8A muestra la presencia de células con las tres marcas fluorescentes (señaladas por flechas), lo que indica que son células dopaminérgicas que expresaron BDNF-flag y que enviaron proyecciones axónicas al estriado. El análisis cuantitativo demostró que el grupo que recibió el tratamiento combinado de la invención fue el que presentó el mayor número de neuronas dopaminérgicas (TH+) que proyectaron al estriado (figura 8B). Interesantemente, el grupo que recibió 7-OH-DPAT también mostró un incremento significativo del número de células con doble marca para TH y rodamina, aunque el incremento fue menor que el del tratamiento combinado acorde con la presente invención (figura 8B). Esta evidencia demuestra que el tratamiento combinado de la invención produce nuevas proyecciones axonales que reinervan el estriado en la rata, por lo se espera que dicho tratamiento cause una regeneración funcional de la vía dopaminérgica nigral en el enfermo con EP. Por otro lado, la presencia del BDNF-flag en las neuronas dopaminérgicas nigrales hasta el final del estudio (11.5 meses) demuestra la permanecía de la expresión del BDNF transgénico aún después de haber interrumpido el tratamiento farmacológico. Este hallazgo sugiere fuertemente que el BDNF sea importante para la restauración correcta y mantenimiento funcional del sistema dopaminérgico nigroestriatal.

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Claims (16)

Reivindicaciones.

1. La combinación de un componente (A) que comprende un agente para terapia genica NTS- poliplex-pDNA que expresa al gen BDNF y un componente (B) que comprende un agonista de los D3R, donde los componentes (A) y (B) se presentan en proporciones adecuadas para producir eventos neurotróficos, mitogénicos, neurogénicos y neuritogénicos resultando en la regeneración funcional del sistema dopaminérgico nigral en la enfermedad de Parkinson.

2. La combinación de acuerdo con la reivindicación 1 para usarse en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

3. La combinación de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para usarse cuando se requiera la regeneración funcional del sistema dopaminérgico nigral que persista después de haber interrumpido el tratamiento convencional con un agonista de los D3R en pacientes con enfermedad de Parkinson.

4. La combinación de acuerdo con la reivindicación 1 , 2, ó 3 para usarse en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson donde el agonista de D3R es 7-OHDPAT.

5. La combinación de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3 ó 4 donde los componentes actúan conjuntamente potenciando la regeneración funcional del sistema dopaminérgico nigral en la enfermedad de Parkinson debido al estímulo de producción y liberación del BDNF endógeno mediante la activación de los D3R y a la expresión incrementada del BDNF transgénico incrementar a su vez la expresión del D3R.

6. La combinación de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5 donde el complejo nanomolecular NTS-poliplex identificado como componente (A) además de comprender pDNA que codifica y expresa al gen BDNF, también comprende poli-L-lisina , neurotensina (NTS) , un péptido fusogénico y un péptido cariofílico.

7. Un set de medicamentos que comprende una composición farmacéutica (A) cuyo componente activo es el agente de terapia génica NTS-poliplex-pDNA que expresa al gen BDNF, y una composición farmacéutica (B) cuyo componente activo es un agonista de D3R.

8. Un set de medicamentos de conformidad con la reivindicación 7 donde el complejo nanomolecular NTS-poliplex identificado como componente (A) además de comprender pDNA que codifica y expresa al gen BDNF, también comprende poli-L-lisina , neurotensina (NTS) , un péptido fusogénico, un péptido cariofílico.

9. Un set de medicamentos de conformidad con la reivindicación 7 u 8, donde el agonista de D3R es 7-OHDPAT.

10. El uso de dos componentes (A) y (B) para preparar medicamentos para tratar la enfermedad de Parkinson en donde: a) un componente (A) comprende un complejo nanomolecular NTS-poliplex-pDNA como agente de terapia genica donde el pDNA codifica y expresa al gen BDNF, y b)un componente (B) que comprende un agonista de D3R.

11. El uso de dos componentes (A) y (B) para preparar medicamentos para tratar la enfermedad de Parkinson de conformidad con la reivindicación 4 en donde el complejo nanomolecular NTS-poliplex identificado como componente (A) además de comprender pDNA que codifica y expresa al gen BDNF, también comprende poli-L-lisina , neurotensina (NTS) , un péptido fusogénico, un péptido cariofílico.

12. El uso de dos componentes (A) y (B) para preparar medicamentos de conformidad con la reivindicación 10 u 11 donde el agonista de D3R es 7-OHDPAT.

13. Un método para estudiar en modelos experimentales in vitro eventos celulares relacionados con neurotrofismo, mitosis, neurogénesis, neuritogénesis, mecanismos celulares y moleculares de la regeneración axonal, el metabolismo neuronal, la bioenergética neuronal, actividad de neurotransmisores y señalización, eventos de apoptosis, y eventos asociados con la enfermedad de Parkinson, mediante la expresión de la neurotrofina BDNF en conjunción con la administración de una antagonista de D3R caracterizado, porque comprende: a) transfectar neuronas en cultivo que poseen el receptor de internalización para Neurotensina con el transgen que codifica para el BDNF mediante la aplicación de una cantidad efectiva del complejo nanomolecular NST-poliplex que contiene: a) poli-L-lisina, b) neurotensina (NT), c) un péptido fusogénico y d) pDNA que codifique para el gen BDNF, b) administrar al cultivo un antagonista del receptor D3R, y c) aplicar métodos de evaluación de las respuestas.

14. Un método no quirúrgico para estudiar en modelos experimentales ¡n vivo neurotrofismo, mitosis, neurogénesis, neuritogénesis, mecanismos celulares y moleculares de la regeneración axonal, el metabolismo neuronal, la bioenergética neuronal, actividad de neurotransmisores y señalización, eventos de apoptosis, y eventos asociados con la enfermedad de Parkinson, mediante la expresión de la neurotrofina BDNF en conjunción con la administración de una antagonista de D3R caracterizado, porque comprende: a. transfectar neuronas que poseen el receptor de internalización para Neurotensina, mediante la administración por inyección a un animal no humano una cantidad efectiva del complejo nanomolecular NST-poliplex que contiene: a) poli-L-lisina, b) neurotensina (NT), c) un péptido fusogénico y d) pDNA que codifique para el gen BDNF, b. administrar al animal un antagonista del receptor D3R, y c. aplicar métodos de evaluación de las respuestas.

15. Un metodo para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson que comprende la administración de una combinación de un componente (A) que comprende un agente para terapia génica NTS-poliplex-pDNA que expresa al gen BDNF y un componente (B) que comprende un agonista de los D3R.

16. El método de la reivindicación 15, donde el agonista de D3R es 7-OHDPAT.