JP2018510153A - Ｃｏｐｄ及びその他の炎症状態を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、特に、医薬組成物、及び薬剤（例えば、炎症性肺疾患等の炎症用薬剤）の調製又は治療計画におけるその使用を特徴とする。前記組成物は、以下の少なくとも２つの活性薬剤を含み得る：ＰＤＥ４を阻害する第１の薬剤（例えば、ロフルミラスト）、及び１又は２以上のＰＤＥ４Ｂバリアント（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）の発現又は活性を阻害する第２の活性薬剤。該組成物及び方法は、ＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）の望ましくない上方制御を弱め、またこれにより、第１の薬剤（例えば、ロフルミラスト）による治療を改善し得る。例えば、第２の薬剤は、第１の薬剤の有効性を改善し、第１の薬剤の有効用量を減少させ、そうしなければ起こるような（例えば、ＣＯＰＤが増悪した患者において）第１の薬剤に対する耐性を緩和し、第１の薬剤により引き起こされる望ましくない副作用を低減し得るか、或いはＰＤＥ４インヒビターを含む治療計画を改善し得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年３月２０日付け出願の米国仮特許出願第６２／１３６，１１５号の優先権日の利益を主張する。この先行出願の全内容は、参照として本明細書に組み込まれる。

連邦政府資金による研究に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所より授与された助成番号ＤＣ００５８４３に基づく米国政府支援を受けて成された。米国政府は、本発明において所定の権利を有する。

本発明は、ファミリー４（ＰＤＥ４）として定義されたファミリーに属するホスホジエステラーゼを阻害する少なくとも２つの薬剤の使用を組み合わせる組成物及び方法、より具体的には、化合物、例えばロフルミラスト（roflumilast）等と、Ｂサブファミリー（すなわちＰＤＥ４Ｂ、例えばＰＤＥ４Ｂ２等）のＰＤＥ４を阻害する第２の活性薬剤とを含む併用療法に関する。該組成物及び方法は、ＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）の望ましくない上方制御を弱め、またこれにより第１の薬剤（例えば、ロフルミラスト）による治療を改善し得る。例えば、第２の薬剤は、第１の薬剤の有効性を改善し、第１の薬剤の有効用量を減少させ、そうしなければ発現するような（例えば、ＣＯＰＤが増悪した患者において）第１の薬剤に対する耐性を緩和し、第１の薬剤により引き起こされる望ましくない副作用を低減し得る、又は代わりにＰＤＥ４インヒビターの投与を含む治療計画を改善し得る。

ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ，Phosphodiesterase）は、二次情報伝達物質であるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ（それぞれ、アデノシン−３’５’−環状モノホスフェート及びグアノシン−３’５’−環状モノホスフェート）を加水分解し、これによりこれらを不活性化させるので、重要な酵素である。ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰにより媒介されるシグナルの停止に加え、ＰＤＥは、環状ヌクレオチドシグナリングの細胞内局在化においても決定的な役割を演じ、またそのような経路をその他のシグナル経路と統合する（総説については、Halpin、Intl. J. of COPD 3(4):543-561、2008を参照）。

これまでに、研究者達は、異なるクロマトグラフィー特性及び動力学的特性、並びに異なる基質特異性を有するＰＤＥを識別してきたが、ＰＤＥは、今日少なくとも１１のファミリーを含む酵素のスーパーファミリーを構成する（ＰＤＥ４〜ＰＤＥ１１; Halpin、前出）。ヒトゲノム内で、今日までに、ＰＤＥをコードする少なくとも２１個の遺伝子が識別されており、また多くの試験では、コードされたタンパク質の物理化学的特性や制御特性に重点が置かれてきた（例えば、Conti and Jin, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 63:1-38; Soderling and Beavo, Curr. Opin. Cell Biol. 12:174-179, 2000; and Francis et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 65:1-52, 2001を参照）。１１ファミリーの一部は、２以上のメンバーを含み、サブファミリーの各メンバーは、ファミリーを識別するアラビア数字の後の大文字によって識別される（例えば、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、及びＰＤＥ４Ｄ）。なおもさらに、ＰＤＥをコードするほとんどの遺伝子は、２以上のプロモーターを有し、またコーディング配列は選択的にスプライスされる。スプライスバリアントは、さらにサブファミリーの名称の後のアラビア数字により指定される。例えば、ＰＤＥ４Ｄ３は、ファミリー４、サブファミリーＤ内のＰＤＥであり、また第３のスプライスバリアントとして指定される。少なくとも１００個の異なるＰＤＥオープンリーディングフレームが存在する（Halpin、前出、Conti and Beavo、Annu. Rev. Biochem. 76:481-511、2007を参照する）。

Halpin、Intl. J. of COPD 3(4):543-561、2008 Conti and Jin, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 63:1-38 Soderling and Beavo, Curr. Opin. Cell Biol. 12:174-179, 2000 Francis et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 65:1-52, 2001 Conti and Beavo、Annu. Rev. Biochem. 76:481-511、2007

ホスホジエステラーゼ４Ｂ（ＰＤＥ４Ｂ，Phosphodiesterase 4B）は、炎症の制御において重要な役割を果たす。ＰＤＥ４選択的インヒビターであるロフルミラストは、増悪した重度の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ，chronic obstructive pulmonary disease）患者を治療するために最近承認をされた。しかし、タキフィラキシー、又はロフルミラストの反復投与に対する耐性の発現を示唆する臨床エビデンスも存在する。したがって、ロフルミラストに対する耐性の発現を緩和する改善された療法に対する必要性が存在する。

第１の態様では、本発明は、以下の２つの活性薬剤を含む医薬組成物を特徴とする；ファミリー４に属するホスホジエステラーゼを阻害する第１の薬剤（ＰＤＥ４；例えば、式Ｉに相当する化合物、例えばロフルミラスト等）、及びファミリーＢに属するＰＤＥ４（ＰＤＥ４Ｂ；例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）の発現又は活性を阻害する第２の活性薬剤。第２の活性薬剤は、ＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）の発現又は活性を直接又は間接的に阻害し得る。例えば、直接的インヒビターは、ＰＤＥ４Ｂをコードする遺伝子の発現を阻害し得る、又はＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）に直接結合する、又は代わりにＰＤＥ４Ｂと直接相互作用し得る；間接的インヒビターは、同一生化学的経路内のＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）以外の分子の発現又は活性を阻害し得る。例えば、組成物がＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）の発現又は活性を間接的に阻害する第２の活性薬剤を含む場合、当該薬剤は、ＩＫＫβ、ＩκＢα、ｐ５０、ＮＦκＢ ｐ６５、若しくはＰＫＡ−Ｃβの発現、又は発現したタンパク質の活性を阻害し得る（例えば、ｐ５０及びｐ６５を含む複合体（例えば、図１に示すＩκＢα−ｐ５０−ｐ６５複合体、又はｐ５０−ｐ６５−ＰＫＡ−Ｃβ複合体）の形成を阻害し得る）。

第１及び第２の薬剤は、独立的に、化学的化合物又は生物学的化合物であり得る（例えば、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ，peptide nucleic acid）、又はポリペプチド）。例えば、１つの実施形態では、第１の薬剤は化学的化合物であり、また第２の薬剤は核酸である；別の実施形態では、第１及び第２の薬剤の両方は化学的化合物である。例えば、本組成物は、第１の薬剤としての式Ｉの化合物（例えば、ロフルミラスト）、及びＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）の活性を阻害するアルケニルジアリールメタン（ＡＤＡＭ，alkenyldiarylmethane）化合物（例えば、ＡＤＡＭ５、又はＡＤＡＭ６）、その誘導体、又はその塩を含み得る。化学的化合物と呼ぶ際には、読みやすいように、すべての場合においても、その誘導体及び塩について明確に言及するわけではない。本明細書に記載する化合物が採用される場合、薬学的に活性なその誘導体又は塩も採用され得るものと理解される。その他の実施形態では、第２の活性薬剤は、ステロイド（例えば、グルココルチコイド、例えば、デキサメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン酢酸塩、デオキシコルチコステロン酢酸塩（ＤＯＣＡ，deoxycorticosterone acetate）及びアルドステロン等）であり得る。いくつかの実施形態では、第２の活性薬剤は、デキサメタゾン、クルクミン、又はＨＩＦ−１αインヒビターである。

下記でさらに記載するように、医薬組成物は、患者への投与を目的として、又は薬剤（例えば、治療に適する、例えば炎症性肺疾患等の炎症のための薬剤、又は本明細書に記載する任意のその他の疾患、障害、若しくは状態のための薬剤）の調製における使用を目的として、様々な方法で製剤化され得る。例えば、本組成物は、吸入により投与するための粒子として、局所投与用のクリーム、ゲル、若しくは軟膏として、経口投与用の錠剤若しくはカプセルとして、又は注射（例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下注射）用の溶液若しくは懸濁液として製剤化され得る。単位投与剤形の場合、医薬組成物は、第２の薬剤の存在なしで第１の薬剤を投与したとした場合に所与の転帰を実現するのに必要とされる第１の薬剤の量と比較して少ない量の第１の薬剤を含み得る。例えば、第１の薬剤が式Ｉに相当する化合物であり、所定の臨床的結果を実現するために、第２の薬剤の存在下で投与される当該化合物の量は、実質的に同一の結果を実現するためには、第２薬の存在なしで投与される当該化合物の量と比較してそれよりも少量であり得る。１つの実施形態では、約５００ｍｃｇの量で単位投与剤形内に存在する第１の薬剤は、式Ｉ（例えば、ロフルミラスト）の化合物である。本明細書で用いる場合、用語「約」とは、参照値、又は数値を決定するために採用されたデバイス若しくは方法に関して、その固有の誤差変動のより大きい方を含む数値の±１０％（例えば、約５００ｍｃｇのロフルミラストとは、４５０〜５５０ｍｃｇのロフルミラストである）を意味する。本明細書の方法を治療方法と記載する場合もあるが、そのような記載はいずれも、「使用」としても等しく十分に表現可能であり、また本発明は、例えば薬剤の調製、又は本明細書に記載する疾患、障害、若しくは状態を治療するための薬剤の調製（全世界を通じて、様々な特許実践法に基づく）における本明細書に記載する組成物の使用として主張され得る。

記載するように、第１及び第２の活性薬剤は、ＰＤＥ４（例えば、４Ａ又は４Ｂサブファミリーに属するＰＤＥ）の発現を選択的に阻害する、又は第２の薬剤の場合は、ＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）を選択的に阻害する核酸分子であり得る。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載する組成物を含むキットを特徴とする。キット内では、第１及び第２の薬剤（又はその複数の薬剤）は、使用説明書と共に統合され得る、又は個別に収納され得る。１つの実施形態では、本発明は、ロフルミラスト、ＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）の発現又は活性を阻害する第２の活性薬剤、使用説明書を含み、かつ、任意に、第１若しくは第２の活性薬剤を患者に投与する際に用いられる１又は２以上の希釈剤、送達デバイス、又はドレッシング材（dressing）の１又は２以上を含むキットを特徴とする。

別の態様では、本発明は、ＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）を安定的に過剰発現する単離された細胞を特徴とする。細胞は、初代細胞であり得る、又は不死化されていてもよく、樹立細胞株の１つであり得る。細胞は、ヒト細胞であり得る。これらの細胞は、とりわけ、ＰＤＥ４／ＰＤＥ４Ｂ／ＰＤＥ４Ｂ２が媒介する炎症のインヒビターを識別するスクリーニングアッセイで利用可能である。ＰＤＥ４／ＰＤＥ４Ｂ／ＰＤＥ４Ｂ２遺伝子産物は、発現ベクター、例えばウイルスベクター等、若しくはプラスミドから発現可能である、又は細胞のゲノムに組み込み可能である。いずれにせよ、過剰発現は、構成的に活性な、又は誘導性のプロモーター（例えば、本明細書に記載する疾患により影響を受けた組織内に存在する転写因子により活性化されるプロモーター（例えば、肺組織特異的プロモーター））により駆動され得る。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載するような状態（例えば、ＣＯＰＤ等の炎症性肺疾患）を有する患者を治療する方法を特徴とする。該方法は、治療上有効な量の少なくとも１つの第１の薬剤（例えば、式Ｉの化合物、例えばロフルミラスト又はロリプラム又はシロミラスト等）、及びＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）の発現又は活性を阻害する少なくとも１つの第２の薬剤を患者に投与することにより実施可能である。第１及び第２の薬剤は、単一投与剤形に統合され得る、又は同一若しくは異なる投与経路により同時に若しくは連続して投与される２つの剤形に維持され得る。例えば、第１の薬剤は、経口により投与可能であり、また第２の薬剤は、吸入により（例えば、肺に直接適用するために）、又は注射により（例えば、静脈内に）、局所投与可能である（例えば、中耳炎を治療するための耳に対する点耳薬として）。別の実施形態では、第１及び第２の薬剤の両方は、吸入により投与される（例えば、活性薬剤がリポソーム等のナノ粒子と会合している乾燥粉末製剤として）。したがって、本発明は、第１及び第２の薬剤の乾燥粉末製剤、並びに乾燥粉末、及び１又は２以上の活性薬剤がリポソーム等のナノ粒子と会合しているその他の製剤（例えば、輸液用の液体）を含む。

別の態様では、本発明は、ＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）のインヒビターを識別する方法を特徴とする。下記でさらに記載するように、ＰＤＥ４Ｂ２は、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、及びＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１１（ＣＸＣＬ１１）を含む（ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１は、グループＡケモカインと呼ばれる）、炎症促進性のケモカインの発現を、ＰＤＥ４Ｂ２の周知されている酵素活性から独立して、少なくとも部分的に制御するものと仮定する。アッセイ法は、培養細胞内又はインビトロで多様に構成され得るが、またＩＫＫβ−ＣＡにより誘発されたＮＦ−κＢプロモーター活性を抑制する能力、及び野生型ＰＤＥ４Ｂ２をトランスフェクトした細胞におけるグループＡケモカインの発現、又は酵素的に失活したＰＤＥ４Ｂ２（例えば、変異体ＰＤＥ４Ｂ２−Ｄ３９２Ａ）により潜在的ＰＤＥ４Ｂ２インヒビターを識別する。該方法は、ＮＦ−κＢレポーターベクター（例えば、検出可能なｔａｇ又はルシフェラーゼに基づく系等の検出系を含むベクター）をトランスフェクトした細胞（例えば、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞等の細胞）を提供するステップを含み得る。細胞は、ＩＫＫβ−ＣＡ、並びに野生型及び／又は変異体ＰＤＥ４Ｂ２を発現する、又は過剰発現（例えば、トランスフェクションにより）してもよい。所定の期間（例えば、１〜２４時間）後、ＮＦ−κＢ活性が測定可能であり、また細胞は、ＮＦ−κＢ又はグループＡケモカインの発現又は活性を測定する前に、潜在的インヒビターに曝露され得る（例えば、培養物中の細胞は、インヒビターに約１〜１２時間曝露され得る）。ＮＦ−κＢ又は１若しくは２以上のグループＡケモカインの発現又は活性を抑制する潜在的インヒビターは、ＰＤＥ４Ｂ２のインヒビターとしてさらに試験され得る。

ｐ６５及びＰＫＡ−Ｃβを介するＮＴＨｉ及びロフルミラストによるＰＤＥ４Ｂ２の誘発を示す略図である。 ロフルミラストは、ＮＴＨｉと協働して、ＰＤＥ４Ｂ２の発現をインビトロ及びインビボで上方制御することを示唆する結果を示す図である。図２Ａ〜２Ｆでは、ＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡ発現を分析した。図２Ａは、ロフルミラスト（Ｒｏｆ；０．１μＭ）で１時間事前処理し、その後にＮＴＨｉ（２５、５０、及び１００のＭＯＩ）で１．５時間刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。各感染多重度において、ＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡは、対照と比較して、Ｒｏｆ処理、ＮＴＨｉ刺激した細胞において増加した。図２Ｂでは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、Ｒｏｆ（０．０１、０．１、及び１μＭ）で１時間事前処理し、その後にＮＴＨｉで１．５時間刺激した。Ｒｏｆの各濃度において、ＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡは、対照と比較して、Ｒｏｆ処理し、ＮＴＨｉ刺激した細胞において増加した。図２Ｃでは、一次ＮＨＢＥ細胞を、Ｒｏｆ（０．１μＭ）で１時間事前処理し、その後にＮＴＨｉで１．５時間刺激すると、対照細胞と比較して、ＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡは有意に増加した。図２Ｄでは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、転写インヒビターであるアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ，actinomycin D；５ｎｇ／ｍｌ）及びＲｏｆ（０．１μＭ）で１時間事前処理し、その後にＮＴＨｉで１．５時間刺激した。ＡｃｔＤは、ＮＴＨｉ及びロフルミラストによるＰＤＥ４Ｂの誘発を完全に阻止し、ＰＤＥ４Ｂの相乗的誘発が転写レベルで生じていることが示唆される（図２Ｄ）。図２Ｅでは、マウスにＲｏｆ（５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）を２時間イノキュレーションし、その後にＮＴＨｉを気管内イノキュレーションした（１つの肺につき５×１０^７ｃｆｕ）。５時間後、肺組織内でのＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡ発現を分析し、Ｒｏｆ処理、ＮＴＨｉ刺激した細胞において、有意な上昇を見出した。図２Ｆでは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、Ｒｏｆ（０．１μＭ）で１時間事前処理し、その後にＮＴＨｉ又はＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）で１．５時間刺激した。図２Ｇでは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、Ｒｏｆ（０．１μＭ）で１時間事前処理し、その後にＮＴＨｉで３時間刺激し、そしてＰＤＥ４Ｂ２タンパク質の発現を分析した。図２Ｈ及び２Ｉでは、Ｅに記載するように、マウスにＲｏｆ及びＮＴＨｉをイノキュレーションした。５時間後、肺組織内でのＰＤＥ４Ｂ２タンパク質の発現を分析し（Ｈ）、また肺組織をＰＤＥ４Ｂについて対比染色した（Ｉ）。倍率２００×、スケールバー１００μｍ。ＰＤＥ４Ｂ２タンパク質の相対濃度（relative density）を、α−チューブリン（Ｇ）又はβ−アクチン（Ｈ）で標準化した。Ａ〜Ｅ、Ｇ、及びＨのデータは平均値±ＳＤである（ｎ＝３）；^＊Ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．＝Ｐ＞０．０５。データは３回又は４回以上の独立した実験を代表する。ＣＯＮ、対照；ｎ．ｓ．、非有意。 ＰＤＥ４Ｂ ｓｉＲＮＡは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＰＤＥ４Ｂ２発現を顕著に枯渇させたことを示す棒グラフである；実施例２を参照；ＰＤＥ４Ｂは、炎症促進性メディエーターのＮＴＨｉ誘発型の発現に必要とされる。 ＰＤＥ４Ｂ２の発現が増加すると、ケモカインのＮＴＨｉ誘発型の発現が増強されることを示す図である。図４Ａは、模擬的にトランスフェクトした細胞、及びＰＤＥ４Ｂ２を安定的に発現する細胞におけるＰＤＥ４Ｂ２発現を示すウェスタンブロットの写真である。図４Ｂは、模擬的にトランスフェクトした細胞及びＰＤＥ４Ｂ２をトランスフェクトした細胞をＮＴＨｉ及びＲｏｆで示すように処理し、その細胞におけるサイトカインＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１の発現の増加を示す棒グラフのパネルである。細胞を、ｍＲＮＡ発現を分析する前に、Ｒｏｆで１時間事前処理し、その後にＮＴＨｉで５時間刺激した。図４Ｂのデータは、平均値±ＳＤである（ｎ＝３）；^＊Ｐ＜０．０５。 ウェスタンブロットの写真を示す図である；ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に、ＰＫＡ−Ｃα及びＰＫＡ−Ｃβを標的とするｓｉＲＮＡを４８時間トランスフェクションした後、タンパク質の発現を分析した。β−アクチンを対照として分析した。 薬物及びｓｉＲＮＡを示す概略図であり、そのいずれも、患者投与用の脂質に基づくナノ粒子と会合する、本明細書に記載するような第１又は第２の薬剤として役に立つ可能性がある。 デキサメタゾンがＮＴＨｉ及びＲｏｆによるＰＤＥ４Ｂの誘発を抑制することができるか決定することを目的とする試験から主に生成されたデータコレクションを示す図である。 ヒトＰＤＥ４ＢのｍＲＮＡ配列（配列番号１）を示す図である。 ヒトＰＤＥ４Ｂ２の核酸配列（配列番号２）を示す図である。 １１個の既知ＰＤＥファミリーに属するＰＤＥ中に存在するドメイン（Ａ；Halpinより、前出、及び Conti and Beavo, Annu. Rev. Biochem. 76:481-511, 2007により当初公表された）の略図、及びＰＤＥ４ファミリー（Ｂ）に属するスプライスバリアントを比較した図である。

本発明の組成物は、炎症（例えば、ＣＯＰＤ等の炎症性肺疾患）の治療で有用な２又は３以上の活性薬剤を含み得る製剤（例えば、医薬品又は生理学的に許容される製剤）を含む。医薬組成物／製剤は、少なくとも１つの活性薬剤を含む非天然型の組成物であると、当技術分野では理解され、またそのような組成物は、規定用量において無毒性であることから、生理学的に許容されると考えられる。本発明の組成物は、任意の特別な作用機序により所望の転帰を実現する組成物に限定されないが、該組成物は、ＰＤＥ４ファミリーメンバーの発現又は活性を阻害する第１の薬剤と、１又は２以上の「Ｂファミリー」に属するＰＤＥ（すなわち、ＰＤＥ４Ｂ２等のＰＤＥ４Ｂ）の発現又は活性を阻害する第２の薬剤とを含み得る。疑問に思われる場合、２つの薬剤が互いに異なることを示唆するために、用語「第１の薬剤」及び「第２の薬剤」が使用される。さらに、選択性が好まれる場合もあるが、第１及び第２の薬剤のそれぞれは、２以上のＰＤＥ４ファミリーメンバーを阻害する場合もあれば、また１又は２以上の同じＰＤＥ４ファミリーメンバーを阻害する場合もある。例えば、第１及び第２の薬剤の両方は、ファミリー４、サブファミリーＢに属するホスホジエステラーゼを阻害する場合もあるが、また第１及び第２の薬剤の両方は、サブファミリー内の２以上のスプライスバリアントを阻害する場合もある。例えば、第１及び第２の薬剤の両方は、ＰＤＥ４Ｂ１及びＰＤＥ４Ｂ２を阻害し得る。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の薬剤は、その他のファミリー又はサブファミリーに属するＰＤＥを除き、ファミリー４、サブファミリーＢに属するホスホジエステラーゼを阻害する。例えば、第１及び／又は第２の薬剤は、１又は２以上のＰＤＥ４Ｂのスプライスバリアントを阻害し得るが、ＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアントのいずれも阻害しない。

用語「活性（active）」及び「薬学的に活性（pharmaceutically active）」は、薬剤がインビボでその標的に影響を及ぼす（例えば、活性化させる、阻害する、上方制御する、又は下方制御する）能力を意味するために使用される。「活性」であるには、薬剤がその標的に対して有する効果は、特定の患者又は一般的に患者母集団に対して臨床的有用性を付与するのに十分でなければならない（但し、応答は個人々々で変化し得ること、及び一部の個人では有効ではない可能性があることを認識しつつ）。

用語「インヒビター（inhibitor）」、「阻害すること（inhibiting）」、「阻害する（inhibit）」等は、記載された標的（ここでは、一般的にＰＤＥ４ファミリーに属する酵素）の発現又は活性を低下させる薬剤の能力を意味するために使用される。阻害は、標的の発現又は活性を完全且つ全面的に低下させる必要はないが、低下は、特定の患者又は一般的に患者母集団に対して有用性を付与する程度に生じなければならない（但し、応答は個人々々で変化し得ること、及び一部の個人では有効ではない可能性があることを認識しつつ）。このケースでは、当該有用性は、例えば、ＰＤＥ４インヒビター、例えばロフルミラスト、シロミラスト等、又は本明細書に開示する別のＰＤＥ４インヒビターによる治療に対する反応の改善であり得る。本明細書で別途記載するように、インヒビターは、その作用を標的に対して直接（例えば、標的そのものの転写、翻訳、又は活性を阻害することにより）、又は間接的に（例えば、標的の上流又は下流に位置する細胞経路内で作用する部分を阻害することにより）発揮し得る。第１の薬剤及び第２の薬剤は、独立的に、化学的化合物（例えば、約１，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子質量を有する炭素に基づく小分子；化学的化合物は、本明細書では「薬物」と呼ばれる場合もある）、核酸（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと関係する核酸）、又はポリペプチド（例えば、抗体）であり得る。

様々な実施形態では、組成物及び方法は、２以上の種類の第１の薬剤、及び２以上の種類の第２の薬剤を含み得る。

第１の薬剤：いくつかの実施形態では、第１の薬剤は、ＰＤＥ４インヒビターであり得る。第１の薬剤は、ＰＤＥ４Ａ（例えば、ＰＤＥ４Ａ１、ＰＤＥ４Ａ５、ＰＤＥ４Ａ８、ＰＤＥ４Ａ１０、ＰＤＥ４Ａ１１、及びＰＤＥ４Ａ７）、ＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ１、ＰＤＥ４Ｂ２、ＰＤＥ４Ｂ３、及びＰＤＥ４Ｂ４）、ＰＤＥ４Ｃ（例えば、ＰＤＥ４Ｃ１）、及びＰＤＥ４Ｄ（例えば、ＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ７、ＰＤＥ４Ｄ８、及びＰＤＥ４Ｄ９）を含む、１又は２以上のＰＤＥ４アイソフォームのインヒビターであり得る。

１つの実施形態では、第１の薬剤は、米国特許第５，７１２，２９８号明細書に記載されている式Ｉに相当し得るが、

同号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。式Ｉにおいて、置換基Ｒ１及びＲ２のうちの一方は、水素、１−６Ｃ−アルコキシ、３−７Ｃ−シクロアルコキシ、３−７Ｃ−シクロアルキルメトキシ、ベンジルオキシ、又はフッ素により完全若しくは部分的に置換された１−４Ｃ−アルコキシであり、また他方は、フッ素により完全若しくは部分的に置換された１−４Ｃ−アルコキシであり；
Ｒ３は、フェニル、ピリジル、Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３により置換されたフェニル、又はＲ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、及びＲ３７により置換されたピリジルであり、
Ｒ３１は、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、カルボキシル、トリフルオロメチル、１−４Ｃ−アルキル、１−４Ｃ−アルコキシ、１−４Ｃ−アルコキシカルボニル、１−４Ｃ−アルキルカルボニル、１−４Ｃ−アルキルカルボニロキシ、アミノ、モノ−若しくはジ−１−４Ｃ−アルキルアミノ、又は１−４Ｃ−アルキルカルボニルアミノであり；
Ｒ３２は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、トリフルオロメチル、１−４Ｃ−アルキル、又は１−４Ｃ−アルコキシであり；
Ｒ３３は、水素、ハロゲン、１−４Ｃ−アルキル、又は１−４Ｃ−アルコキシであり；
Ｒ３４は、ヒドロキシル；ハロゲン、シアノ、カルボキシル、アルキル、１−４Ｃ−アルコキシ、１−４Ｃ−アルコキシカルボニル、又はアミノであり；
Ｒ３５は、水素、ハロゲン、アミノ、又は１−４Ｃ−アルキルであり；
Ｒ３６は、水素又はハロゲンであり；及び
Ｒ３７は、水素又はハロゲンであり、
これらの化合物の塩、及びピリジンのＮ−酸化物、及びその塩。

特定の実施形態では、Ｒ１は、フッ素により完全又は部分的に置換された１−４Ｃ−アルコキシである。

その他の実施形態では、Ｒ１は、フッ素により完全又は部分的に置換されたメトキシである。

特別な実施形態では、Ｒ１は、ジフルオロメトキシである。

特定の実施形態では、Ｒ２は、３−５Ｃ−シクロアルコキシ、又は３−５Ｃ−シクロアルキルメトキシである。

別の実施形態では、Ｒ２は、３−５Ｃ−シクロアルキルメトキシである。

特別な実施形態では、Ｒ２は、シクロプロピルメトキシである。

特定の実施形態では、Ｒ３は、ピリジル、又はＲ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、及びＲ３７により置換されたピリジルである。

その他の実施形態では、Ｒ３は、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、及びＲ３７により置換されたピリジルである。

特別な実施形態では、Ｒ３は、３，５−ジクロロピリド−４−イルである。

特定の実施形態では、Ｒ１は、フッ素により完全又は部分的に置換された１−４Ｃ−アルコキシであり；Ｒ２は、３−５Ｃ−シクロアルコキシ、又は３−５Ｃ−シクロアルキルメトキシであり；並びにＲ３は、ピリジル、又はＲ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、及びＲ３７により置換されたピリジルである。

その他の実施形態では、Ｒ１は、フッ素により完全又は部分的に置換されたメトキシであり；Ｒ２は、３−５Ｃ−シクロアルキルメトキシであり；並びにＲ３は、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、及びＲ３７により置換されたピリジルである。

特定の特別な実施形態では、Ｒ３４は、ハロゲン又は１−４Ｃ−アルキルであり；Ｒ３５は、水素、ハロゲンであり；Ｒ３６は、水素又はハロゲンである。

特別な実施形態では、Ｒ１は、ジフルオロメトキシであり；Ｒ２は、シクロプロピルメトキシであり；及びＲ３は、３，５−ジクロロピリド−４−イルである。

１−６Ｃ−アルコキシは、酸素原子に加えて、１〜６個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキルラジカルを含有するラジカルである。この文脈において記載され得る１〜６個の炭素原子を有するアルキルラジカルとして、例えばヘキシル、イソヘキシル（２−メチルペンチル）、ネオヘキシル（２，２−ジメチルブチル）、ペンチル、イソペンチル（３−メチルブチル）、ネオペンチル（２，２−ジメチルプロピル）、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、プロピル、イソプロピル、エチル、及びメチルラジカルが挙げられる。

３−７Ｃ−シクロアルコキシとして、例えばシクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、及びシクロヘプチルオキシが挙げられる。

３−７Ｃ−シクロアルキルメトキシとして、例えばシクロプロピルメトキシ、シクロブチルメトキシ、シクロペンチルメトキシ、シクロヘキシルメトキシ、及びシクロヘプチルメトキシが挙げられる。

フッ素により完全又は部分的に置換された１−４Ｃ−アルコキシとして、例えば１，２，２−トリフルオロエトキシ、２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロポキシ、パーフルオロエトキシ、及び特に１，１，２，２−テトラフルオロエトキシ、トリフルオロメトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、及びジフルオロメトキシラジカルが挙げられる。

本発明が意図するハロゲンは、臭素、塩素、及びフッ素である。

１−４Ｃ−アルキルは、１〜４個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキルラジカルである。例として、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、プロピル、イソプロピル、エチル、及びメチルラジカルが挙げられる。

１−４Ｃ−アルコキシは、酸素原子に加えて、上記１−４Ｃ−アルキルラジカルのうちの１つを含有するラジカルである。例として、メトキシ及びエトキシラジカルが挙げられる。

１−４Ｃ−アルコキシカルボニルは、上記１−４Ｃ−アルコキシラジカルのうちの１つが結合したカルボニル基である。例として、メトキシカルボニル（ＣＨ_３Ｏ−ＣＯ−）及びエトキシカルボニルラジカル（ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ−ＣＯ−）が挙げられる。

１−４Ｃ−アルキルカルボニルは、上記１−４Ｃ−アルキルラジカルのうちの１つが結合したカルボニル基である。例として、アセチルラジカル（ＣＨ_３ＣＯ−）が挙げられる。

１−４Ｃ−アルキルカルボニロキシラジカルは、酸素原子に加えて、上記１−４Ｃ−アルキルカルボニルラジカルのうちの１つを含む。例として、アセトキシラジカル（ＣＨ_３ＣＯ−Ｏ−）が挙げられる。

モノ−又はジ−１−４Ｃ−アルキルアミノラジカルは、例えばメチルアミノ、ジメチルアミノ、及びジエチルアミノラジカルである。

１−４Ｃ−アルキルカルボニルアミノラジカルは、例えばアセタミドラジカル（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_３）である。

Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３により置換された代表的なフェニルラジカルとして、２−アセチルフェニル、２−アミノフェニル、２−ブロモフェニル、２−クロロフェニル、２，３−ジクロロフェニル、２，４−ジクロロフェニル、４−ジエチルアミノ−２−メチルフェニル、４−ブロモ−２−トリフルオロメチルフェニル、２−カルボキシ−５−クロロフェニル、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシフェニル、２−ブロモ−４−カルボキシ−５−ヒドロキシフェニル、２，６−ジクロロフェニル、２，５−ジクロロフェニル、２，４，６−トリクロロフェニル、２，４，６−トリフルオロフェニル、２，６−ジブロモフェニル、２−シアノフェニル、４−シアノ−２−フルオロフェニル、２−フルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，６−ジフルオロフェニル、２−クロロ−６−フルオロフェニル、２−ヒドロキシフェニル、２−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル、２，４−ジヒドロキシフェニル、２−メトキシフェニル、２，３−ジメトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、２，６−ジメトキシフェニル、２−ジメチルアミノフェニル、２−メチルフェニル、２−クロロ−６−メチルフェノール、２，４−ジメチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、２，３−ジメチルフェニル、２−メトキシカルボニルフェニル、２−トリフルオロメチルフェニル、２，６−ジクロロ−４−メトキシフェニル、２，６−ジクロロ−４−シアノフェニル、２，６−ジクロロ−４−アミノフェニル、２，６−ジクロロ−４−メトキシカルボニルフェニル、４−アセチルアミノ−２，６−ジクロロフェニル、及び２，６−ジクロロ−４−エトキシカルボニルフェニルの各ラジカルが挙げられる。

Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、及びＲ３７により置換された代表的なピリジルラジカルとして、３，５−ジクロロピリド−４−イル、２，６−ジアミノピリド−３−イル、４−アミノピリド−３−イル、３−メチルピリド−２−イル、４−メチルピリド−２−イル、５−ヒドロキシピリド−２−イル、４−クロロピリド−３−イル、３−クロロピリド−２−イル、３−クロロピリド−４−イル、２−クロロピリド−３−イル、２，３，５，６−テトラフルオロピリド−４−イル、３，５−ジクロロ−２，６−ジフルオロピリド−４−イル、３，５−ジブロモピリド−２−イル、３，５−ジブロモピリド−４−イル、３，５−ジクロロピリド−４−イル、２，６−ジクロロピリド−３−イル、３，５−ジメチルピリド−４−イル、３−クロロ−２，５，６−トリフルオロピリド−４−イル、及び２，３，５−トリフルオロピリド−４−イルの各ラジカルが挙げられる。

本明細書に記載する化合物（例えば、式Ｉの化合物）の適する塩は、置換に応じて、すべての酸付加塩であるが、但し特にすべての塩基との塩である。特に、塩は、薬理学的に許容される、薬局で通常使用される無機又は有機の酸と塩基であり得る。例えば工業スケールでの化合物の調製期間中に、プロセス生成物として取得され得る薬理学的に許容されない塩は、当業者にとって公知のプロセスにより薬理学的に許容される塩に変換される。適する塩として、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、酢酸、クエン酸、Ｄ−グルコン酸、安息香酸、２−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、酪酸、スルホサリチル酸、マレイン酸、ラウリン酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、シュウ酸、酒石酸、エンボン酸、ステアリン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、及び３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸等の酸との水溶性及び水不溶性の酸付加塩が挙げられ、酸は、塩の調製において、等モル量比で、又は一塩基酸若しくは多塩基酸のいずれが関係するかに応じて、及びどの塩が望ましいかに応じてそれとは異なる量比で利用される。その他の適する塩は、塩基との塩である。塩基との塩の例として、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、チタン、アンモニウム、メグルミン、トロメタミン、又はグアニジニウムの塩が挙げられる。塩基との塩の調製で利用される塩基は、等モル量比又はそれとは異なる量比で存在し得る。

１つの実施形態では、第１の薬剤は、ロフルミラスト又はその塩である：

１つの実施形態では、第１の薬剤は、ロリプラム又はその塩である：

本発明の組成物及び方法で有用な化学的化合物は、購入され得る、又は当技術分野において公知の方法により合成、単離、若しくは精製され得る。第１の薬剤として利用され得るその他の化合物として、シロミラスト（GlaxoSmithKline社により開発された；Christensen et al., J. Med. Chem. 41:821-835, 1998を参照）；ＢＡＹ１９−８００４（Bayer PLC社により開発された；Grootendorst et al., Pulm. Pharmacol. Ther. 16:341-347, 2003を参照）；ＡＷＤ１２−２８１（Elbion AG／GlaxoSmithKline社により開発された；Gutke et al., Curr. Opin. Investig. Drugs 6:1149-1158, 2005を参照）；シパムフィリン、ＦＲＬ−６１０６３（Leo Pharmaceuticals社により開発された；Kucharekova et al., Arch. Dermatol. Res. 295:29-32, 2003を参照）；メソプラム、ＳＨ−６３６（Schering AG社により開発された；Loher et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 305:549-556, 2003を参照）；ＣＣ−１０００４（Celgene社により開発された；Baumer et al., Inflamm. Allergy Drug Targets 6:17-26, 2007を参照）；オグレミラスト、ＧＲＣ−３８８６（Glenmark社により開発された；Enefer, Inflammation 2005 - Seventh World Congress. Highlights I. IDrugs, 8:788-790, 2005を参照）、テトミラスト、ＯＰＣ−６５３５（Otsuka社により開発された；Chihiro et al., J. Med. Chem. 38:353-358, 1995を参照）；トフィミラスト、ＣＰ−３２５３６６（Pfizer社により開発された；Duplantier et al., J. Med. Chem. 50:344-349, 2007を参照）；ＯＮＯ−６１２６（Ono Pharmaceuticals社により開発された；Furuie et al., Eur. Respir. J. 22(Suppl 45):395s, 2003を参照）；ＣＩ−１０４４（Pfizer社により開発された；Ouagued et al., Pulm. Pharmacol. Ther. 18:49-54, 2005を参照）；ＨＴ−０７１２（Inflazyme/Helicon社により開発された；MacDonald et al., Neurorehabil. Neural Repair 21:486-496, 2007を参照）；イブジラスト（Merck-Frosst社により開発された；Huang et al., Life. Sci. 78:2663-2668, 2006を参照）；ＭＫ−０８７３（Merck社により開発された； Boot et al., Pulm. Pharmacol. Ther. 2008を参照）；アロフィリン、ＬＡＳ−３１０２５（Almirall社により開発された；Beleta et al., Third International Conference on Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: From Genes to Therapies, Glasgow, 1996を参照）；ＣＩ−１０１８（Pfizer社により開発された；Burnouf et al., J. Med. Chem. 43:4850-4867, 2000を参照）；Ｔ−２５８５（Tanabe社により開発された； Ukita et al., J. Med. Chem. 42:1088-1099, 1999を参照）；ＹＭ−９７６（Yamanouchi社により開発された；Aoki et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 295:255-260, 2000を参照）；Ｖ−１１２９４Ａ（Napp社により開発された；Gale et al., Br. J. Clin. Pharmacol. 54:478-484, 2002を参照）；ピクラミラスト、ＲＰ−７３４０１（Rohne-Poulenc-Rorer社により開発された；Chen et al., Acta Pharmacol. Sin. 25:1171-1175, 2004を参照）；アチゾラム、ＣＰ−８０６３３（Pfizer社により開発された；Wright et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 75:1001-1008, 1997を参照）；フィラミナスト、ＷＡＹ−ＰＤＡ−６４１（Wyeth-Ayerst社により開発された；Heaslip et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 268:888-896, 1994を参照）；ＳＣＨ３５１５９１（Schering-Plough社により開発された；Billah et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 302:127-137, 2002を参照）；ＩＣ−４８５（ICOS Corporation社により開発された）；リリミラスト、ＢＡＹ−１９−８００４（Bayer社により開発された；Sturton and Fitzgerald, Chest 121:192S-196S, 2002を参照）、Ｄ４４１８（Celltech/Schering-Plough社により開発された；Buckley et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2137-2140, 2000を参照）；ＣＤＰ−８４０（Celltech/Merck-Frosst社により開発された；Alexander et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:1451-1456, 2002を参照）；Ｌ−８２６，１４１（Celltech/Merck-Frosst社により開発された；Claveau et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 310:752-760, 2004を参照）；ＡＮ２７２８（Anacor Pharmaceuticals社にて開発中）；アプレミラスト（Celgene社により開発された）；ジアゼパム（Hoffmann-La Roche社により１９６３年に開発された）；ルテオリン（ＩＧＦ−１特性も有する、ピーナッツから抽出されたサプリメント）；及びメセンブレノン（ハーブであるスケレチウム・トルトゥオスム（Sceletium tortuosum）由来のアルカロイド）が挙げられる。

特定の実施形態では、第１の薬剤は、それ自体、又は生物学的環境内でその他の因子と呼応して、ＰＤＥ４Ｂアイソフォームを含む１又は２以上のＰＤＥ４アイソフォームの発現を上方制御し得る、又はその活性を高め得る。ＰＤＥ４Ｂアイソフォームは、ＰＤＥ４Ｂ１、ＰＤＥ４Ｂ２、ＰＤＥ４Ｂ３、又はＰＤＥ４Ｂ４であり得、また生物学的環境内の因子として、１又は２以上の環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ，cyclic adenosine monophosphate）エレベーター、リポ多糖類（ＬＰＥ，lipopolysaccharide）、又は細菌を挙げることができる。細菌は、無莢膜型インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）（ＮＴＨｉ）であり得る。

第２の薬剤：本明細書に記載する第１の薬剤のいずれも、ＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）の発現又は活性を直接又は間接的に阻害する１又は２以上の第２の薬剤と共に製剤化、包装、又は投与され得る。特定の実施形態では、第２の薬剤は、ＰＤＥ４Ｂ２に替わる又はＰＤＥ４Ｂ２に付加する１又は２以上のその他のＰＤＥ４Ｂアイソフォームを阻害し得る。上記のように、第２の薬剤は、ＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアントのすべてを阻害するのではなく、ＰＤＥ４Ｂのスプライスバリアントのうちの１又は２以上を阻害し得る。

第２の薬剤は、ＰＤＥ４Ｂアイソフォーム（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）の発現を上方制御し得る１又は２以上の遺伝子及び／又は酵素を阻害し得る。例えば、第２の薬剤は、ＩκＢキナーゼβ（ＩＫＫβ，IκB kinase β）、ＩκＢα、転写因子の核内因子−κβ（ＮＦκＢ）、又はそのサブユニット（例えば、ｐ５０若しくはｐ６５）、又はプロテインキナーゼＡ−Ｃβ（ＰＫＡ−Ｃβ，protein kinase A-Cβ）の発現、或いは発現したタンパク質の活性を阻害し得る（例えば、ｐ５０及びｐ６５を含む複合体（例えば、図１に示すＩκＢα−ｐ５０−ｐ６５複合体又はｐ５０−ｐ６５−ＰＫＡ−Ｃβ複合体）の形成を阻害し得る）。

第２の薬剤は、ＰＤＥ４Ｂ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）が上方制御し得る１又は２以上の細胞経路を阻害し得る。該経路は、酵素活性に依存して、又は酵素活性に依存しないで機能している可能性がある。

第２の薬剤は、グルココルチコイド、例えば、デキサメタゾン又は生物学的に活性なその誘導体であり得る：

その他の有用なグルココルチコイドとして、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾンアセテート、デオキシコルチコステロンアセテート（ＤＯＣＡ，deoxycorticosterone acetate）、アルドステロン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、及び薬学的に許容されるその塩が挙げられる。

第２の薬剤は、ＨＩＦ−１αインヒビターでもあり得る。例えば、第２の薬剤は、低酸素誘導因子−１αインヒビター、ジメチルオキサロイルグリシン（ＤＭＯＧ，dimethyloxaloylglycine）、クリシン、ケトミン、ＹＣ−１、ジメチル−ビスフェノールＡ、２−メトキシエストラジオール、ＩＯＸ２、ＢＡＹ８７−２２４３、ＰＸ−４７８ ２ＨＣＩ、ＦＧ−２２６１、ＫＣ７Ｆ２、クリプトタンシノン、ＥＦ−２４、ＦＭ１９Ｇ１１、又はＰＸ１２であり得る。特定の実施形態では、第２の薬剤は、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＤＭＡＧ，17-dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin）、又はその誘導体若しくは塩であり得る：

第２の薬剤は、クルクミン（すなわち、（１Ｅ，６Ｅ）−１，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン）又はその誘導体又は塩でもあり得る：

第２の薬剤は、ＡＤＡＭ５又はＡＤＡＭ６（Cullen et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18:1530-1533, 2008）、又は薬学的に活性なその誘導体又は塩であり得る、又はそれを含み得る：

第２の薬剤は、化合物３３又は薬学的に活性なその誘導体又は塩を含む、Naganuma et al.が記載するリード化合物である２−アリールピリミジン誘導体から開発された化合物Ａ−３３でもあり得る、又はそれも含み得る（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19(12):3174-3176, 2009）：

トリアジン誘導体も、ＰＤＥ４Ｂの強力なインヒビターであることが公知であり、また本発明の様々な実施形態で第２の薬剤として利用可能である（Hagen et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 24(16):4031-4034, 2014）。当技術分野において公知の構造解析により、強力で選択的なＰＤＥ４Ｂインヒビターは、ＣＲ３（コントロール領域３，Control Region 3、触媒ドメインのカルボキシル側に位置する）に結合し、これにより閉じた立体構造に酵素をロックすることが実証された。ＰＤＥ４Ｂの選択性は、活性部位上に接近したときに、ドメインのヘリカルレジストレーションを選択するＣＲ３内の単一アミノ酸多型に起因すると考えられている。ＰＤＥ４Ｂ ＣＲ３のロイシンが、ＰＤＥ４Ｄのグルタミンと交換すると、インヒビター選択性において７０〜８０倍の変化が生ずる。これを踏まえ、Hagen et al（前出）は、ＣＲ３に同様に結合し、これによりＰＤＥ４Ｂ特異性を引き起こす一連のトリアジンアナログについて記載する（Hagen et al、前出）。

第２の薬剤は式IIに相当し得る：

式IIでは、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６のそれぞれは、水素、ハロゲン、シアノ、カルボキシル、アルキル、アリール、又はヘテロ環であり、また１又は２以上のハロゲン、シアノ、カルボキシル、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル）、アリール、又はヘテロ環で置換されていてもよい。

特定の実施形態では、Ｒ４は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はシクロプロピルであり得る。Ｒ５は、ハロゲン（例えば、Ｆ又はＣｌ）で置換されていてもよいアリール、又はハロゲン（例えば、Ｆ若しくはＣｌ）で置換されていてもよいヘテロ環（例えば、フラン若しくはチオフラン）であり得る。Ｒ６は、カルボン酸、アルキルカルボン酸（例えば、ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ、ＣＨ_２（ＣＨ_３）ＣＯ_２Ｈ、ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２ＣＯ_２Ｈ）、ハロゲン（例えば、Ｆ又はＣｌ）、ヘテロ環（例えば、ピペリジノン、イミダゾリジノン、テトラゾール）、シアノ、アルキルシアノ（例えば、ＣＨ_２ＣＮ）、アルキルヘテロ環、スルホンアミド、若しくはアミノスルホンアミド、又はそれらの誘導体で置換されていてもよいアリールであり得る。

第２の薬剤として有用なその他の化合物として、Donnell et al.が記載する置換型ピリダジノ［４，５−ｂ］インドリジンが挙げられる（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20(7):2163-2167, 2010）。例えば、下記の化合物：

又は薬学的に活性なその誘導体若しくは塩を利用することができる。

第２の薬剤が核酸である場合、同薬剤は、ＰＤＥ４Ｂ２又は本明細書に記載する別の標的、例えばＰＫＡ−Ｃβ等の発現を標的とし、阻害することによりＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）と関係する核酸であり得る。その他の有用な核酸に基づくインヒビターとして、マイクロＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。阻害性のＲＮＡ分子を生成するための関連する配列及び方法は、当技術分野において公知である。参照の便を図り、ヒトＰＤＥ４ＢのｍＲＮＡ配列を図８に示す。様々なＰＤＥ４Ｂアイソフォームの生成に有用なプライマー、及び配列比較を含む、１．６ｋｂの部分的なＰＤＥ４Ｂ ｃＤＮＡに関する情報が、ヒトＰＤＥ４Ｂ３のクローニングに関する報告に、必要に応じて見出され得る（Huston et al., Biochem. J., 328:549-558, 1997; Bolger et al., Mol. Cell. Biol., 136558-6571, 1993; McLaughlin et al., J. Biol. Chem., 268:6470-6476, 1993; 及び Obernolte et al., Gene, 129:239-247, 1993も参照）。ＰＤＥ４Ｂ２を標的とする際には、選択された薬剤（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２を阻害するｓｉＲＮＡ）は、選択的に（すなわち、薬剤は、その他のＰＤＥ４Ｂバリアント又はその他のＰＤＥ４ファミリーメンバーを除き、ＰＤＥ４Ｂ２のみの発現を阻害し得る）、又は非選択的に（すなわち、薬剤は、ＰＤＥ４Ｂ２、並びにその他のＰＤＥ４Ｂバリアント又はその他のＰＤＥ４ファミリーメンバーを阻害し得る）そうすることができる。ＰＫＡ−ＣβのｍＲＮＡ配列は、例えばＮＣＢＩ「ＧｅｎＢａｎｋ」ウェブサイトを通じて入手可能である（例えば、受託番号ＮＭ−００２７３１、及びTaylor et al., Annu. Rev. Biochem., 59:971-1005, 1990を参照）。

高度に選択的なＰＤＥ４Ｂインヒビターが、活性部位外の配列差異を利用することにより設計可能であることが、当技術分野において明らかにされている（Fox et al., Cellular Signalling 26:657-663, 2014を参照）。特に、ＰＤＥ４Ｂの選択性は、ｃＡＭＰによるアクセスを阻止する立体構造において、ＣＲ３（コントロール領域３）と呼ばれるＣ末端制御ヘリックスを、活性部位を含めて確保することにより達成され得る。

ＰＫＡ−ＣβのｍＲＮＡ配列は、例えばＮＣＢＩ「ＧｅｎＢａｎｋ」ウェブサイトを通じて入手可能である（例えば、受託番号ＮＭ−００２７３１、及びTaylor et al., Annu. Rev. Biochem., 59:971-1005, 1990を参照）。

第２の薬剤は、ｓｉＲＮＡ又はその断片であり得る。第２の薬剤として有用なｓｉＲＮＡ（すなわち、ＰＤＥ４Ｂ２の発現又は活性を直接又は間接的に阻害する薬剤）が、例えば、Santa Cruz Biotechnology, Inc.社（現行カタログ番号ｓｃ−４１５９９）、及びGE HealthCare社から市販されている。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの場合長さ１９〜２１個のヌクレオチドであり、当技術分野において公知の方法に基づき合成し、阻害される標的の配列に基づき望むようにカスタマイズし得る。第２の薬剤が、阻害性のＲＮＡである場合、すべての薬剤は、単一の配列を有し得る、又は異なる配列のプールであり得る（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２、ＰＫＡ−Ｃβ、又は本明細書に記載する別の標的の発現を阻害する３〜７個のｓｉＲＮＡからなるプール）。

第２の薬剤は、ポリペプチド又はその断片であり得る。第１又は第２の薬剤として有用なポリペプチドとして、本明細書に記載する、標的と特異的に結合する抗体が挙げられ、また標的がＰＫＡ−Ｃβである場合は、ポリペプチドは、ＴＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ（配列番号３）、又はその活性断片若しくはその他のバリアントであり得る。

下記の実施例に記載するように、ＩＫＫβインヒビターは、ＮＴＨｉ及びロフルミラストによるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発を顕著に阻害したが、ロフルミラスト単独によるＰＤＥ４Ｂ２の誘発には影響を及ぼさなかった。したがって、ＮＴＨｉ感染により、又はそれと関連してＣＯＰＤが増悪した患者では、治療は、例えばロフルミラストとＩＫＫβインヒビターを用いて実施され得る。

製剤：様々な実施形態では、第１の薬剤及び第２の薬剤は、同時に又は分離して投与するように製剤化され得る。第１の薬剤及び／又は第２の薬剤は、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、パレット、懸濁液、注射液、輸液、坐薬、連続送達系、シロップ、チンキ剤、軟膏、クリーム、点眼薬、点耳薬、フラッシュ、ラバージュ、低速吸収性デポ、ドレッシング材、ロゼンジ、若しくは任意の薬学的に許容されるアプリケーションの形態で、又は栄養補助食品として製剤化され得る。

第１の薬剤及び／又は第２の薬剤は、本明細書に開示するように、治療の対象となる状態に適する任意の経路により投与され得る。適する経路として、経口、吸入、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内、及び硬膜外を含む）、直腸、鼻腔、局所的、膣腔等の経路を挙げることができる。

経口投与用として用いられるとき、製剤は、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性若しくは油性の懸濁液、分散性の粉末若しくは顆粒、エマルジョン、ハード若しくはソフトカプセル、シロップ、又はエリキシル剤であり得る。

吸入投与用として用いられるとき、製剤は、小粒子を含むエアゾール又は乾燥粉末を含み得る。また製剤は、懸濁液（例えば、液化噴霧剤に懸濁された第１及び／又は第２の薬剤粒子）、又は溶液（例えば、液化噴霧剤に溶解した第１及び／又は第２の薬剤）でもあり得る。粒径は約１０μｍ以下であり得る。好ましくは、粒径は、５μｍ未満であり得る（例えば、２〜３μｍ）。製剤は、従来法に基づき調製され得るが、またその他の治療薬と共に送達され得る。製剤は、１又は２以上のＨＦＡ噴霧剤、界面活性剤共溶媒、及び／又は賦形剤をさらに含み得る。

非経口投与用として用いられるとき、製剤は、抗酸化剤、バッファー、静菌薬、及び製剤を意図するレシピエントの血液と等張にせしめる溶質を含有し得る水性及び非水性の無菌注射溶液；及び懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液を含み得る。注射用として用いられるとき、第１の薬剤及び／又は第２の薬剤の医薬組成物は、無菌の注射用調製物（例えば、無菌の水性又は油性の注射用懸濁液）の形態であり得る。また無菌の注射用調製物は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌の注射液又は懸濁液でもあり得る（例えば、１，３−ブタン−ジオールに溶解した溶液、又は凍結乾燥粉末として調製される）。

キット：本発明のキットは、すぐに投与できる、又はさらに操作を行った後（例えば、稀釈若しくは再懸濁した後）に投与可能な製剤中に、本明細書に記載する第１及び第２の薬剤を含有する医薬組成物を含め、本明細書に記載する任意の１又は２以上の組成物を含み得る。いくつかの実施形態では、第１の薬剤及び第２の薬剤は、分離した容器内にあり、またキット内に共に包装される。任意の実施形態では、キットは、使用説明書を含み得る（例えば、文書化された書類、ウェブアドレスの開示、又はオーディオ若しくはビジュアルプレゼンテーション）。任意の実施形態では、キットは、キットに収納された組成物を投与するのに有用な付属品（例えば、針、シリンジ、チューブ、滅菌剤、手袋、マスク、ネブライザー、点滴器、ガーゼ、テープ、又はドレッシング材）を含み得る。キットは、１又は２以上の吸入デバイス、例えば、アトマイザー、ネブライザー、ベーパライザー、定量吸入器（ＭＤＩ，metered dose inhaler）、乾燥粉末吸入器等を含み得る。

治療に適する状態：本発明の組成物は、治療薬としてヒトの医学及び獣医学で採用され得るが、例えば下記の疾患を治療及び予防するために利用可能である：様々な起源を有する急性及び慢性（特に炎症性及びアレルゲン誘発性の）気道障害（気管支炎、アレルギー性気管支炎、気管支喘息）；皮膚疾患（特に増殖性、炎症性、及びアレルギー性のタイプ）、例えば乾癬（尋常性の）、毒性及びアレルギー性の接触性湿疹、アトピー性湿疹、脂漏性湿疹、単純苔癬、日焼け、肛門生殖器部位の掻痒、円形脱毛症、肥厚性瘢痕、円板状エリテマトーデス、濾胞性及び広汎性の膿皮症、内因性及び外因性の痛み、酒土性座瘡、及びその他の増殖性、炎症性、及びアレルギー性皮膚障害等；ＴＮＦ（例えば、ＴＮＦα）及びロイコトリエンの過剰放出に基づく障害、例えば関節炎型の障害（リウマチ性関節炎、リウマチ性脊椎炎、骨関節炎、及びその他の関節炎の状態、及び関節の炎症）、免疫系の障害（ＡＩＤＳ）、ショックのタイプ（敗血症性のショック、内毒素ショック、グラム陰性セプシス、毒素ショック症候群、及びＡＲＤＳ（成人呼吸窮迫症候群，adult respiratory distress syndrome））、及び胃腸領域の広汎性の炎症（クローン病及び潰瘍性大腸炎）；上気道領域（咽頭、鼻）、及び隣接領域（副鼻腔、眼）内のアレルギー性及び／又は慢性の免疫学的誤反応に基づく障害、例えばアレルギー性鼻炎／副鼻腔炎、慢性鼻炎／副鼻腔炎、アレルギー性結膜炎、及び鼻ポリープ等；中耳炎、及びその他の耳や副鼻腔の感染症；さらにＰＤＥインヒビターにより治療され得る心臓の障害、例えば心不全等、又はＰＤＥインヒビターの組織弛緩作用により治療され得る障害、例えば腎臓結石と関連する腎臓及び尿管の疝痛等。眼及び眼の周囲を取り巻き、それに影響を及ぼす組織の炎症も治療され得る。本発明は、何らかの特別な分子機構に起因する状態の治療に限定されないが、治療可能な状態は、ヒスタミン、血小板活性化因子（ＰＡＦ，platelet-activating factor）、アラキドン酸誘導体、例えばロイコトリエンやプロスタグランジン等、サイトカイン、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１２のいずれか、アルファ−、ベータ−、又はガンマー−インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，tumor necrosis factor）等の誤発現（例えば、過剰発現）、又は酸素フリーラジカル、及びプロテアーゼと関連しているものと認識され得る。呼吸器系（鼻から肺胞にわたる呼吸器管の任意の部分を含む）、耳、又は洞に影響を及ぼす状態では、治療の対象となる状態は、粘液が過剰産生される状態であり得る。

第１の薬剤がロフルミラストである実施形態：ロフルミラストは、肺の炎症状態（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎と関連したＣＯＰＤ、及びＣＯＰＤの増悪）を治療する際に有用である。インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）は、ＣＯＰＤ増悪における細菌性の主要原因である。したがって、本発明の組成物及び方法は、慢性気管支炎、増悪の履歴、及びＮＴＨｉによる感染と関連した重度のＣＯＰＤを有する患者を対象として、ＣＯＰＤ増悪のリスクを低減するために、ロフルミラストを含み得る。治療は、中等度〜重度の肝臓障害（チャイルド・ピュー分類Ｂ又はＣ）を有する患者では禁忌であり得る。

本明細書に記載する併用療法は、ロフルミラスト治療に関係して報告された１又は２以上の副作用を改善し得る（例えば、胃腸の問題、例えば、腹痛、下痢、悪心等；関連する兆候、例えば体重減少及び食欲不振等；頭痛；背部痛；インフルエンザ；浮動性めまい；不眠症；不安、鬱病、自殺念慮、又はその他の気分変動；鼻炎及び副鼻腔炎；並びに尿路感染症）。

ＣＯＰＤ患者に対するロフルミラストの現在推奨される投薬量は、食物を摂取しながら又は摂取しないで１日当たり５００ｍｃｇ錠剤１錠である。この用量は、本発明の組成物及び方法において維持、増量、減量され得る（例えば、４５０〜４９９ｍｃｇ／日；４００〜４５０ｍｃｇ／日；３００〜４００ｍｃｇ／日；又は３００ｍｃｇ／日未満（例えば、１００〜３００ｍｃｇ／日））。その他の実施形態では、皮膚疾患治療用の局所適用形態（例えば、軟膏等）は、例えば、０．１〜９９％の濃度で第１及び／又は第２の活性薬剤を含み得る。吸入投与用の用量は、通常０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇである。全身療法の場合の通常の用量は、１日当たり０．０５〜２ｍｇである。

補助的な薬剤も含まれる場合があり、本発明の組成物は、１又は２以上の溶媒、ゲル形成剤、軟膏ベース、及びその他の活性化合物の賦形剤（例えば、酸化防止剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、可溶化剤、又は浸透プロモーター）、又はこれらの任意の組合せと共に製剤化され得る。適する不活性化成分として、ラクトース一水和物、コーンスターチ、ポビドン、及びステアリン酸マグネシウムが挙げられる。適する医薬製剤として、例えば、粉末、エマルジョン、懸濁液、スプレー、油、軟膏、脂肪性の軟膏、クリーム、ペースト、ゲル、錠剤、丸薬、カプセル、及び溶液が挙げられる。

本明細書に記載する第１及び第２の薬剤の一方又は両方は、炎症部位に直接送達されるように製剤化され得る。例えば、患者が呼吸器系内の炎症（例えば、肺の炎症）と関連した疾患に罹患している場合、第１及び／又は第２の薬剤は、吸入により送達される多孔性の粒子として製剤化され得る。例えば、薬剤は、粉末として（好ましくは微粒子化した形態で）直接、又はその粉末を含む溶液又は懸濁液を噴霧することにより投与され得る。第１及び／又は第２の薬剤は、エアゾールとして製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本発明の薬剤は、Aradigm社により現在販売されているAERx Essence（登録商標）肺送達デバイス及びＡＥＲｘ（登録商標）システムにより送達され得る。

本明細書に記載する第１及び第２の薬剤の一方又は両方は、送達プロファイル及び標的特異的組織、例えば肺組織等を改善し得るナノ粒子（例えば、治療用ナノ粒子）に組み込み可能である。ナノ粒子は、Sung et al.（Trends Biotechnol., 25(12):563-570, 2007）、又はAzarmi et al.（Advanced Drug Delivery Reviews, 60(8):863-876, 2008）に記載されているようなミクロンスケール乾燥粉末及びナノ粒子の形態であり得るが、また脂質ベース（例えば、リポソーム又はミセル）、又は非脂質ベースであり得る。リポソーム及びミセルに加え、第１及び第２の薬剤は、（例えば、共有結合した、又は非共有結合した）メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ，mesoporous silica nanoparticle）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ，poly propyleneimine）、量子ドット、及びポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）とも会合させ得る。本明細書に記載する第１及び第２の薬剤を含むこれら送達媒体のそれぞれは、本発明の範囲内にあり、また本明細書に記載する治療方法は、任意のそのような送達媒体と会合させた第１及び／又は第２の薬剤の投与を利用し得る。ナノ粒子を調製及び投与する方法は、当技術分野において周知されている（例えば、Garbuzenko et al., Cancer Biol. Med., 11(1):44-55, 2014を参照）。

本明細書では、病気を記載するのに用語「疾患」を使用する傾向があり、また本明細書で用いる場合、用語「疾患」には、疾病、状態、障害、感染、症候群等として文献により頻繁に記載され得る様々な病気が含まれる。

本発明の組成物及び方法は、第３の薬剤、例えばチトクロームＰ４５０酵素誘導物質（例えば、リファンピシン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、及びフェニトイン）、ＣＹＰ３Ａ４のインヒビター、又はＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ１Ａ２のデュアルインヒビター（例えば、エリスロマイシン、ケトコナゾール、フルボキサミン、エノキサシン、及びシメチジン）等を組み込むことができる。慣習的に、これらの薬剤は、ロフルミラストへの患者の全身的曝露を増加させ、したがって、有害反応の増加を引き起こすと考えられているので、そのような薬剤とロフルミラストとの併用は避けられている。但し、そのような同時使用と関連したリスクは、組成物及び治療がＰＤＥ４Ｂ２のインヒビターを含むような本発明の文脈において低下している。

［実施例］
複雑な病因及びＣＯＰＤの薬物治療の文脈において、ＰＤＥ４Ｂがどのように上方制御されているのか、並びにこの上方制御を抑えれば、ロフルミラストの有効性を改善し、またおそらくはロフルミラストに対する耐性を緩和するのに役立つ可能性があるかより深く理解したいと考えた。下記の研究において、ロフルミラストは、ＣＯＰＤ増悪における細菌性の主要原因である無莢膜型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）と協働して、ヒト気道上皮細胞内のＰＤＥ４Ｂ２発現をインビトロ及びインビボで上方制御することを示す。上方制御されたＰＤＥ４Ｂ２は、酵素活性に依存する様式及び依存しない様式の両方で、ある種の重要なケモカインの誘発に寄与する。またプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットβ（ＰＫＡ−Ｃβ）及び核内因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）ｐ６５サブユニットが、ＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発に必要とされることも見出した。ＰＫＡ−Ｃβは、ｃＡＭＰに依存してｐ６５をリン酸化する。さらに、ｐ６５のＳｅｒ２７６は、ＰＫＡ−Ｃβに誘発されたｐ６５のリン酸化及びＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発との関わりにおいて重要である。まとめとして、本発明のデータは、ＰＫＡ−Ｃβ及びｐ６５間の相互応答を介したＰＤＥ４Ｂ２の相乗的上方制御の基礎をなす新規の機構を明らかにし、またＰＤＥ４インヒビター、例えばロフルミラスト等の有効性を改善する新規治療戦略の開発根拠を提供する（図１を参照）。

下記の材料及び方法が、以下に記載する実施例で採用された。

試薬及び抗体。アクチノマイシンＤ及びプロテアーゼインヒビターカクテル（ＰＩＣ，protease inhibitor cocktail）を、Sigma-Aldrich社からを購入した。ミリストイル化ＰＫＡインヒビター及びＩＫＫβインヒビターIVをEMD Millipore社から購入した。ロフルミラストを、Santa Cruz Biotechnology社から購入した。Ｎ^６−フェニル−ｃＡＭＰ（６−Ｐｈｅ−ｃＡＭＰ）、８−ｐＣＰＴ−２’−Ｏ−Ｍｅ−ｃＡＭＰ、及びＲｐ−８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰＳを、BioLog社から購入した。ホルスコリンを、Enzo Life Sciences社から購入した。Ｐｈｏｓ−ｔａｇアクリルアミドを、Wako Chemicals USA社から購入した。組換えｐ６５タンパク質を、Active Motif社から購入した。組換えＰＫＡ−Ｃβタンパク質を、R&D systems社から購入した。ＰＫＡ−Ｃβ（ｓｃ−９０４）、ｐ６５（ｓｃ−８００８）、β−アクチン（ｓｃ−８４３２）、α−チューブリン（ｓｃ−６９９６９）、ＰＤＥ４Ｂ（ｓｃ−２５８１２）、及びＴＦＩＩＢ（ｓｃ−２２５）に対する抗体を、Santa Cruz Biotechnology社から購入し、またＰＫＡ−Ｃβ（＃４７８２）及びｃ−Ｒｅｌ（＃４７２７）に対する抗体を、Cell Signaling社から購入した。

菌株及び培養条件。ＮＴＨｉ株１２の臨床分離株を、本研究で用いた（Ishinaga et al., EMBO J., 26(4):1150-1162, 2007）。細菌をチョコレート寒天プレート上、３７℃にて、５％ＣＯ_２の大気中、一晩増殖させ、そしてその後、３．５μｇ／ｍＬのＮＡＤ及びヘモグロビンが補充されたブレーンハートインフュージョン（ＢＨＩ，brain heart infusion）ブロス（BD Biosciences社）内でイノキュレーションした。一晩インキュベーションした後、細菌を、新鮮なブロス内で継代培養し、そして対数期の細菌を、光学濃度（ＯＤ，optical density）値を測定することによりモニタリングし、インビトロ細胞実験用としてそれをＤＭＥＭで洗浄、懸濁し、またインビボ動物実験用として等張性の生理食塩水中に懸濁した。用量依存性実験を除くすべてのインビトロ実験では、ＮＴＨｉによる処理は、感染多重度（ＭＯＩ，multiplicity of infection）５０で行った。

細胞培養。以下に記載するすべての培地には、１０％ウシ胎仔血清（Sigma-Aldrich社）が補充された。ヒト気管支上皮ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、ＲＰＭＩ培地（Life technologies社）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９６０９（商標））内で維持した。ヒト一次気管支上皮ＮＨＢＥ（Lonza社）細胞を、BEGM SingleQuotsが補充された気管支上皮増殖培地（ＢＥＧＭ，bronchial epithelial growth media）内で維持した（Jono et al., J. Biol. Chem. 277(47):45547-45557, 2002）。ヒトＰＤＥ４Ｂ２を安定的に発現するＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（ＰＤＥ４Ｂ２−安定細胞）を、ジェネテシン選択（３００μｇ／ｍＬ）後のプラスミドトランスフェクションにより取得した。細胞を加湿された５％ＣＯ_２の大気中、３７℃で培養した。

リアルタイム定量及び半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。全ＲＮＡを、TRIzol試薬（Life technologies社）を用いて、製造業者の指示に従い単離した。逆転写反応では、TaqMan逆転写試薬（Life technologies社）を、これまでの記載のとおり用いた。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析では、ＰＣＲ増幅を、SYBR Green Universal Master Mix（Life technologies社）を用いて実施した。要するに、２×Universal Master Mix、１μＬのテンプレートｃＤＮＡ、及び５００ｎＭのプライマーを含む、最終容積１２．５μＬ中で、反応を３回実施し、そして反応を、９６穴光学反応プレート（USA Scientific社）内で分析した。StepOnePlus Real-Time PCRシステム、及び製造業者の対応するソフトウェア（StepOnePlusソフトウェアｖ２．３；Life technologies社）を用いて、反応を増幅及び定量化した。比較Ｃｔ法を用いて、ｍＲＮＡの相対量を取得し、そして内在性コントロールとしてヒトシクロフィリン又はマウスグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を用いて標準化した。半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析では、PrimeSTAR Maxポリメラーゼ（Takara社）を用いて、製造業者の指示に従いＰＣＲ増幅を実施した。用いたプライマー配列を下記の表に記載する。

プラスミド、トランスフェクション、及びルシフェラーゼアッセイ。発現プラスミド、構成的活性型のＩＫＫα（ＩＫＫα−ＣＡ、Ｓ１７６Ｅ／Ｓ１８０Ｅ）、及びＩＫＫβ（ＩＫＫβ−ＣＡ、Ｓ１７７Ｅ／Ｓ１８１Ｅ）、及びドミナントネガティブ型のＩκＢα（ＩκＢα−ＤＮ、Ｓ３２Ａ／Ｓ３６Ａ）は、これまでに記載されている（Shuto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(15):8774-8779, 2001; Ishinaga et al.、前出）。ＮＦ−κＢ（ｐＧＬ４．３２）のルシフェラーゼレポーター構築物を、Promega社から購入した。ヒトＰＤＥ４Ｂ２、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、及びＰＫＡ−Ｃβ１／２ｃＤＮＡ配列を作製し、そしてｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓ（−）ベクターのBamHI及びHindIII部位に挿入した。PrimeSTAR Max（Takara社）を用いて、変異体ｐ６５及びＰＤＥ４Ｂ２−Ｄ３９２Ａを作製した。空ベクターを対照として用い、また必要な場合には、インプットＤＮＡの量が等しいことを保証するために追加した。すべての一過性トランスフェクションを、TransIT-LT1試薬（Mirus社）を用いて、製造業者の指示に従い、３回実施した。

ｓｉＲＮＡにより媒介されたノックダウン。ヒトの妥当性確認されたｓｉＲＮＡオリゴを、GE Healthcare社から取得した（陰性対照、Ｄ００１８１０−１０；ＰＤＥ４Ｂ、Ｌ００７６４８−０１；ＰＫＡ−Ｃα、Ｍ００４６４９−０１；ＰＫＡ−Ｃβ、Ｍ００４６５０−００；ｐ６５、Ｌ００３５３３−００；ｃ−Ｒｅｌ、Ｌ００４７６８−００）。DharmaFECT-4（Thermo Scientific社）を用いて、細胞に５０ｎＭのｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、そして４８時間後に収集又は処理した。ＤＮＡと共にｓｉＲＮＡを共トランスフェクトする際には、Lipofectamine 3000（Life technologies社）を用いて、細胞に１０ｎＭのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。

細胞成分分画。細胞を２回洗浄し、氷冷ＰＢＳで矯正し、そして３，０００×ｇで５分間遠心分離した。次に、細胞をバッファーＡ（１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４及びＰＩＣが補充された１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ）に懸濁し、そして氷上で１０分間インキュベーションした（Schreiber et al., Nucleic Acids Res. 17(15):6419, 1989）。ＮＰ４０（０．５％）を添加し、１５秒間ボルテックス処理することにより細胞を溶解し、次に、３，０００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去した（サイトゾル画分）。析出物を、バッファーＢ（１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４及びＰＩＣが補充された２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁し、そして氷上で１０分間インキュベーションした後、ボルテックス処理し、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した（核画分）。

ウェスタンブロット。全細胞抽出物及びマウス肺組織抽出物を、溶解バッファー（１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４及びＰＩＣが補充された５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％のＮＰ４０、０．２５％のデオキシコール酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａＦ）を用いて回収した。ＰＤＥ４Ｂタンパク質では、細胞抽出物を、上記バッファーＡを用いて回収した。細胞又は組織抽出物を８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そして二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ，polyvinylidene difluoride）膜（GE Healthcare Life Sciences社）に転写した。膜を、０．１％のツイーン２０（ＴＢＳ−Ｔ）及び５％の脱脂粉乳を含有するＴＢＳ溶液でブロックした。次に、一次抗体を５％のＢＳＡ−ＴＢＳ−Ｔで１：１，０００〜１：２，０００に稀釈した中で、膜をインキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後（×３）、対応する二次抗体を２．５％の脱脂粉乳−ＴＢＳ−Ｔで１：５，０００に稀釈して、膜をインキュベーションした。Amersham ECL Prime Regent（GE Healthcare Life Sciences社）を用いて、各タンパク質を可視化した。

免疫沈降法。細胞抽出物を、一次抗体１μｇと共に、４℃、一晩インキュベーションし、その後、プロテインＧ ＰＬＵＳ−アガロースビーズ（Santa Cruz Biotechnology社）と共に２時間インキュベーションした。次に、免疫沈降物を試料バッファーに懸濁し、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そして上記のようにイムノブロット分析法により検出した。

ＰＤＥ４活性。ＰＤＥ４Ｂ２構築物をトランスフェクトした細胞から得られた全細胞抽出物のＰＤＥ４活性を、環状ヌクレオチドＰＤＥアッセイキット（Enzo Life Sciences社）を用い、製造業者の指示に従って測定した。総ＰＤＥ活性及びロフルミラスト耐性ＰＤＥ活性間の差異から、ＰＤＥ４活性を見積もった。

Ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＰＡＧＥ。ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡを用いないで回収した組換えｐ６５タンパク質又は核抽出物を、製造業者の指示に従い、５０μＭのＭｎ^２＋−Ｐｈｏｓ−ｔａｇアクリルアミドを含有する６％のゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてＰＶＤＦ膜に転写した（Kinoshita et al., Mol. Cell. Proteomics 5(4):749-757, 2006）。

インビトロキナーゼアッセイ。組換えｐ６５タンパク質（７０ｎｇ）及び組換えＰＫＡ−Ｃβ（５０ｎｇ）を、キナーゼアッセイバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＡＴＰ）中で混合し、そして３０℃で０．５時間インキュベーションした。４×ＳＤＳ試料バッファー（０．２４Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４０％のグリセロール、８％のＳＤＳ、２０％の２−メルカプトエタノール、０．０４％のブロモフェノールブルー）を添加して反応を停止した。

マウス及び動物実験。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（７週齢）におけるＮＴＨｉ誘発型の炎症では、麻酔下のマウスの気管内に、マウス１匹当たり５×１０^７ＣＦＵの濃度でＮＴＨｉをイノキュレーションし、また対照として生理食塩水をイノキュレーションした。次に、ＮＴＨｉイノキュレーション後５時間経過して、イノキュレーションされたマウスを屠殺した。阻害試験では、ＮＴＨｉイノキュレーション前２時間において、マウスの腹腔内にロフルミラストで事前処理を行った。すべての動物実験は、ジョージア州立大学の動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ，Institutional Animal Care and Use Committee）より承認を受けた。

免疫蛍光染色。ホルマリン固定、パラフィン包埋されたマウス肺組織を切片化し（４μｍ）、そしてＰＤＥ４Ｂタンパク質を、ウサギ抗ＰＤＥ４Ｂ及びＦＩＴＣ結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Santa Cruz Biotechnology社）を用いて検出した。次に、染色した切片を画像化し、そして光学及び蛍光−顕微鏡検査システム（AxioVert 40 CFL、AxioCam MRC、及びAxioVision LE Image system、Carl Zeiss社）の下で画像を記録した。

統計分析。すべての実験を少なくとも３回反復して一貫した結果を得た。データは、平均値±ＳＤとして示した。統計分析を不対の両側スチューデントのｔ検定により実施し、ｐ＜０．０５は、統計的に有意とみなした。

実施例１：ロフルミラストは、ＮＴＨｉと協働して、インビトロ及びインビボでＰＤＥ４Ｂ２の発現を上方制御する。ＰＤＥ４アイソフォームの発現は、ＰＤＥ４インヒビターにより誘発され（Campos-Toimil et al., Br. J. Pharmacol. 154(1):82-92, 2008; Dlaboga et al., Brain Res., 1096(1):104-112, 2006; Giorgi et al., Behav. Brain Res. 154(1);99-106, 2004）、またＰＤＥ４ＢもＮＴＨｉにより誘発されるので（Komatsu et al., Nat. Commun. 4:1684, 2013）、ロフルミラストは、ＮＴＨｉと協働して、ヒト気道上皮細胞（ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞）内でＰＤＥ４Ｂの発現を誘発するかどうか、その解明を試みた。図２Ａ及びＢに示すように、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）分析により評価されたとおり、ロフルミラストは、確かにＮＴＨｉと協働して、ヒト気管支上皮ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞において、ｍＲＮＡレベルで、ＰＤＥ４Ｂの発現を用量に依存して上方制御した。類似した結果を、一次の正常ヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ，normal human bronchial epithelial）細胞においても確認した（図２Ｃ）。その他のＰＤＥ４ファミリーメンバーの発現についても、同一条件下で分析し、ＰＤＥ４Ａ及び４Ｃは、ＮＴＨｉ又はロフルミラストにより上方制御されないことを見出した。ＰＤＥ４Ｄは、ＮＴＨｉ又はロフルミラストにより上方制御されたが、有意な相乗的効果は認められなかった。これから、ＰＤＥ４Ｂが特にＮＴＨｉ及びロフルミラストによって相乗的に制御されることが示唆される。ＰＤＥ４Ｂの相乗的誘発が転写レベルで生ずるかさらに決定するために、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、転写インヒビターであるアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）で処理した（転写開始複合体のＤＮＡに結合し、そしてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡの伸長を阻止することにより転写を阻害すると考えられている；Sobell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(16):5328-5331, 1985）。ＡｃｔＤは、ＮＴＨｉ及びロフルミラストによるＰＤＥ４Ｂの誘発を完全に阻止し、ＰＤＥ４Ｂの相乗的誘発が転写レベルで生ずることが示唆される（図２Ｄ）。次に、ロフルミラストが、ＮＴＨｉと協働してＰＤＥ４Ｂの発現をインビボで上方制御するか確認した。インビトロでの結果と整合して、ロフルミラストは、マウス肺において、ＮＴＨｉ誘発型のＰＤＥ４Ｂ発現を、ｍＲＮＡレベルで相乗的に増強した（図２Ｅ）。

どのＰＤＥ４ＢアイソフォームがＮＴＨｉ及びロフルミラストにより上方制御されるか決定するために、半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析も実施した。ヒトＰＤＥ４Ｂ遺伝子は、いくつかの異なるアイソフォーム、いわゆる長尺型のＰＤＥ４Ｂ１及びＰＤＥ４Ｂ３、短尺型のＰＤＥ４Ｂ２、及び超短尺型のＰＤＥ４Ｂ５をコードする（Huston et al., Biochem. J. 328(Pt 2):549-558, 1997; Cheung et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 322(2):600-609, 2007; Bolger et al., Mol. Cell Biol. 13(10):6558-6571, 1993; Colicelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(10):3599-3603, 1989; Zhang, Curr. Pharm. Des. 15(14):1688-1698, 2009）。別の長尺型のＰＤＥ４Ｂ４については、そのｃＤＮＡはラットでのみクローン化されており、このアイソフォームは、ヒトゲノムによりコードされていないと思われるので、検討することはできなかった（Shepherd et al., Biochem. J., 370(Pt 2):429-438, 2003）。図２Ｆに示すとおり、ＰＤＥ４Ｂ２の発現は、ロフルミラスト及びＮＴＨｉ又はＴＮＦ−αにより相乗的に上方制御された。ＰＤＥ４Ｂ１、ＰＤＥ４Ｂ３、及びＰＤＥ４Ｂ５については、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞内で４０サイクルの増幅を行った後でさえも、増幅後のＰＣＲバンドは検出されなかった。

ＰＤＥ４Ｂ２発現の相乗的誘発は、タンパク質レベルでも、インビトロ及びインビボで確認された（図２Ｇ〜Ｉ）。気道上皮細胞抽出物及びマウス肺組織抽出物のウェスタンブロット分析により、ＮＴＨｉ及びロフルミラストは、過剰発現したヒトＰＤＥ４Ｂ２タンパク質と共に泳動される約７０ｋＤａのＰＤＥ４Ｂアイソフォームの増加を誘発することが判明した（図２Ｇ及び２Ｈ）（Huston et al., Biochem. J. 328(Pt 2):549-558, 1997; Marquette et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 18(5):584-591, 2011; Millar et al., Science, 310(5751):1187-1191, 2005; Yougbare et al., Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 301(4):L441-L450）。免疫蛍光染色は、高強度のＰＤＥ４Ｂ免疫蛍光シグナルが、マウス肺組織の気管支上皮に主として検出されたことを示した（図２Ｉ、矢印）。やはり、ロフルミラスト及びＮＴＨｉにより引き起こされたＰＤＥ４Ｂ２タンパク質発現の上方制御に起因して、ＰＤＥ４Ｂの酵素活性も増加した。総じて、本発明のデータから、ロフルミラストは、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方において、インビトロ及びインビボで、ＮＴＨｉと協働して、ＰＤＥ４Ｂ２の発現を特異的に上方制御することが示唆される。

実施例２：ＰＤＥ４Ｂ２は、炎症促進性メディエーターのＮＴＨｉ誘発型の発現に必要とされる。次に、ヒト気道上皮細胞に生ずるＮＴＨｉ誘発型の炎症反応において、ＰＤＥ４Ｂ２の発現が果たす役割について、その解明を試みた。サイトカイン及びケモカインを含む炎症促進性メディエーターは、気道の炎症性疾患において、白血球が循環系から肺に導入され、そして活性化される際に、重要な役割を演ずる（Donnelly and Barnes, Trends Pharmacol. Sci., 27(10):546-553, 2006; Le et al., Cell Mol. Immunol., 1(2):95-104, 2004; Quint and Wedzicha, J. Allergy Clin. Immunol., 119(5):1065-1071, 2007）。気道上皮細胞は、病原性微生物により誘発された炎症促進性メディエーターの重要な供給源である（Hallstrand et al., Clin. Immunol., 161(1):1-15, 2014）。したがって、ＮＴＨｉは、ＣＯＰＤの病因において重要であることが明らかにされているいくつかの重要な炎症促進性メディエーターの発現を誘発するか、最初に確認した。ＮＴＨｉは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞において、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターロイキン−８（ＩＬ−８，Interleukin-8／ＣＸＣＬ８）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ，granulocyte-macrophage colony-stimulating factor）、及びＴＮＦ−αの発現を有意に上方制御することを見出した。興味深いことに、ロフルミラストは、これらの炎症促進性メディエーターのＮＴＨｉ誘発型発現を、様々な程度で阻害した。ロフルミラストは、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦの誘発を顕著に阻害したが、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、及びＩＬ−８の誘発に対しては、中程度に抑制した。対照的に、ロフルミラストは、より高濃度であっても、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１の誘発に対しては阻害効果をほとんど示さなかった。このような興味深い結果から、これらの炎症促進性メディエーターの抑制において、ロフルミラストの有効性は低い又は限定的であるが、それはＮＴＨｉの存在下で、ロフルミラストはＰＤＥ４Ｂ２の発現を上方制御することに起因し得るという仮説が導かれる。したがって、ＰＤＥ４Ｂ ｓｉＲＮＡを用いて、ＮＴＨｉによるこれらの炎症促進性メディエーターの誘発に対するＰＤＥ４Ｂ２枯渇の効果を評価することによりＰＤＥ４Ｂ２の寄付を決定した。予期したとおり、ＰＤＥ４Ｂ ｓｉＲＮＡは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＰＤＥ４Ｂ２発現を顕著に枯渇させた（図３）。ＰＤＥ４Ｂ２の枯渇は、ロフルミラスト単独によって中程度又は最低限度で阻害されたＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１（グループＡ）の誘発をさらに有意に阻害した。対照的に、ＰＤＥ４Ｂ２の枯渇は、ロフルミラスト単独によって中程度又は顕著に阻害されたＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ−α（グループＢ）の誘発に対しては最低限度で影響を及ぼすに過ぎなかった。

ＰＤＥ４Ｄは、ＮＴＨｉ及びロフルミラストによっても上方制御されたが、また過去の研究では、ＰＤＥ４Ｄは、ＰＤＥ４Ｂとは異なる、非冗長的な役割を有することが示唆された（Ariga et al., J. Immunol., 173(12):753107538, 2004; Blackman et al., J. Biol. Chem., 286(14):12590-12601, 2011）。したがって、炎症促進性メディエーターのＮＴＨｉ誘発型発現に対するＰＤＥ４Ｄの枯渇の効果についても評価した。グループＡに属するケモカインの誘発は、ＰＤＥ４Ｄの枯渇により弱められるが、その程度はＰＤＥ４Ｂの枯渇と比較してかなり小さい。グループＢに属するケモカイン及びサイトカインの誘発は、ＰＤＥ４Ｄの枯渇により影響を受けなかった、又はわずかながらも増強された。まとめとして、これらの結果から、炎症促進性メディエーターが異なれば、ＰＤＥ４Ｂ及び４Ｄによる制御も異なり、そしてＰＤＥ４Ｂの発現は、気管支上皮細胞内で生ずるＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１のＮＴＨｉ誘発型発現においてより重要な役割を演ずることが示唆される。

ケモカインのＮＴＨｉ誘発型発現におけるＰＤＥ４Ｂ２の上方制御の役割をさらに確認するために、野生型ＰＤＥ４Ｂ２を安定的に過剰発現する細胞を開発した（ＰＤＥ４Ｂ２−安定細胞）。ＰＤＥ４Ｂ２−安定細胞におけるＰＤＥ４Ｂ２の発現は、模擬的にトランスフェクトされた（模擬的）細胞と比較してそれよりも高かった（図４Ａ）。ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１のＮＴＨｉ誘発型発現は、模擬的細胞と比較して、ＰＤＥ４Ｂ２−安定細胞において有意に増強された（図４Ｂ）。興味深いことに、ロフルミラストは、試験した最高濃度（１０μＭ）であっても、ＰＤＥ４Ｂ２−安定細胞において、これらケモカインのＮＴＨｉ誘発型発現を完全に阻害することはできなかった。とりわけ、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１のＮＴＨｉ誘発型の発現は、ＰＤＥ４Ｂ２−安定細胞において、低用量のロフルミラスト（１μＭ未満）により、わずかにではあるが増強された（図４Ｂ）。ＰＤＥ４Ｂの枯渇から得られた結果と整合して、ＰＤＥ４Ｂ２が過剰発現しても、ロフルミラストの存在下でＮＴＨｉにより誘発されたＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ−αの発現は顕著に増加しなかった。総じて、これらの結果から、ＰＤＥ４Ｂ２は、ＮＴＨｉ及びロフルミラストにより相乗的に上方制御されるが、気管支上皮細胞内で生ずるＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１の誘発抑制において、ロフルミラストの有効性低下に、少なくとも部分的に寄与する可能性があることが示唆される。

ＰＤＥ４の酵素活性は、炎症反応を制御するのに重要であることが、これまでに明らかにされている（Bender and Beavo, Pharmacol. Rev., 58(3):488-520, 2006; Lipworth, Lancet, 365(9454):167-175, 2005; Karlsson et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 107(1-3):426-426, 1995; Michalski et al., Clin. Pharmacol. Ther., 91(1):134-142, 2012）。但し、本発明のデータより、上方制御されたＰＤＥ４Ｂ２は、高用量のロフルミラストによっても克服することができないような方式で（最大１０μＭ；ＩＣ_５０は１ｎＭ未満と見積もられているので、この薬物においては非常に高レベル）、特定の炎症促進性メディエーターを誘発することが判明した（Bender and Beavo、前出）。これらの非常に興味深いが、かなり予期せぬ結果から、したがって、ＰＤＥ４Ｂ２は、その良く知られた酵素活性とは独立に、例えばアダプタータンパク質として作用することにより、これらケモカインの発現を少なくともある程度制御し得るという仮説が導かれる。この仮説を検証するために、野生型ＰＤＥ４Ｂ２（ＰＤＥ４Ｂ２−ＷＴ）及び触媒的に不活性化型のＰＤＥ４Ｂ２（ＰＤＥ４Ｂ２−Ｄ３９２Ａ）の発現が、ＮＦ−κＢ依存性プロモーター活性及びケモカイン誘発に与える効果を比較した（Mongillo et al., Circ. Res., 95(1):67-75, 2004; Xu et al., Science, 288(5472):1822-1825, 2000）。ＰＤＥ４Ｂ２−ＷＴ及びＰＤＥ４Ｂ２−Ｄ３９２Ａの両方は、トランスフェクトされたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞内で同じように発現されたが、ＰＤＥ４活性は、ＰＤＥ４Ｂ２−Ｄ３９２Ａ変異体をトランスフェクトした細胞では、ＰＤＥ４Ｂ２−ＷＴをトランスフェクトした細胞よりも有意に低かった。ＰＤＥ４Ｂ２−ＷＴは、ＮＦ−κＢ（ＩκＢ）キナーゼβ（ＩＫＫβ−ＣＡ）の構成的活性型インヒビターにより誘発されたＮＦ−κＢプロモーターの活性を、用量依存的に顕著に増強し、またＩＫＫβ−ＣＡにより誘発されたグループＡ−ケモカインの発現も増強したことが見出された。興味深いことに、ＰＤＥ４Ｂ２−Ｄ３９２Ａは、ＩＫＫβ−ＣＡにより誘発されたＮＦ−κＢプロモーター活性及びケモカインの発現を、ＰＤＥ４Ｂ２−ＷＴと比較して程度こそ小さいものの増強した。さらに、ロフルミラスト（最大１０μＭ）は、ＰＤＥ４Ｂ２−Ｄ３９２Ａをトランスフェクトした細胞内で、ＩＫＫβ−ＣＡにより誘発されたＮＦ−κＢプロモーターの活性、及びグループＡ−ケモカインの発現を完全に阻害することはできなかった。総じて、これらの結果から、ＰＤＥ４Ｂ２は、ＰＤＥ酵素活性に依存する様式及び依存しない様式の両方で炎症反応を増強し、ロフルミラストに対する耐性に寄与している可能性があることが示唆される。

実施例３：ＰＫＡ−ＣαではなくＰＫＡ−Ｃβが、ＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発に必要とされる。ＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発の基礎をなす機構を調べるために、ロフルミラストによって増加するｃＡＭＰがＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発に関与するかどうか最初に検討した。強力なｃＡＭＰエレベーターであるホルスコリン（ＦＳＫ）は、ＮＴＨｉと協働してＰＤＥ４Ｂ２の発現を上方制御した。これから、ｃＡＭＰがＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発に関与していることが示唆される。したがって、普遍的に発現した２つの細胞内ｃＡＭＰエフェクター、すなわちＰＫＡ及びｃＡＭＰにより直接活性化される交換タンパク質（Ｅｐａｃ，exchange protein directly activated by cAMP）の関与についてさらに調べた。特異的ＰＫＡインヒビター（ＰＫＩ，PKA inhibitor）は、ＮＴＨｉ及びロフルミラストによるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発を有意に抑制した。ポリペプチドＴＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ（配列番号３）であるこのインヒビターは容易に合成可能であるが、またSanta Cruz Biotechnologies社からも入手可能である。ＰＫＩ及びその活性断片又は変異体（例えば、それと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、又は９５％）同一であるポリペプチド）は、ＰＫＡ−Ｃβを阻害する本発明の組成物及び方法で利用可能である。この結果と整合して、Ｅｐａｃを活性化させないＰＫＡ−選択的活性化因子６−Ｐｈｅ−ｃＡＭＰは、ＮＴＨｉ誘発型のＰＤＥ４Ｂ２発現を相乗的に増強した。対照的に、Ｅｐａｃ−選択的活性化因子８−ｐＣＰＴ−２’−Ｏ−Ｍｅ−ｃＡＭＰは、ＰＤＥ４Ｂ２の発現を誘発するのに、ＮＴＨｉとそれほど顕著に協働することはなかった。これらの結果から、ＥｐａｃではなくＰＫＡのｃＡＭＰ依存性の活性化が、気管支上皮細胞におけるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発に必要とされることが示唆される。

ＰＫＡは、２つの触媒（Ｃ）サブユニットと２つの制御（Ｒ）サブユニットからなる四量体酵素である。ｃＡＭＰがＲサブユニットと結合すると、ＣサブユニットのＲサブユニットによる阻害が緩和され、そして多種多様なタンパク質基質がリン酸化される（Krebs and Beavo, Annu. Rev. Biochem., 48:923-959, 1979; Levitan, Annu. Rev. Physiol., 56:193-212, 1994; Montminy et al., Trends Neurosci., 13(5):184-188, 1990; Gamm et al., J. Biol. Chem., 271(26):15736-15742, 1996; Padmanabhan et al., J. Biol. Chem., 288(20):14158-14169, 2013）。３つのＣサブユニットアイソフォーム、ＰＫＡ−Ｃα、−Ｃβ、及び−Ｃγは、ヒトにおいて識別されたが、但し、Ｃγは精巣特異的である（Beebe et al., Mol. Endocrinol., 4(3):465-475, 1990）。次に、特異的ｓｉＲＮＡを用いてＰＫＡ−Ｃα及び−Ｃβを枯渇させることにより、どのＰＫＡアイソフォームがＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発に関与するかを決定した。ウェスタンブロット解析により、ＰＫＡ−Ｃα及びＣβのタンパク質発現が、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞において、効果的且つ選択的にそれぞれ減少したことが判明した（図５）。興味深いことに、ＮＴＨｉ及びロフルミラストによるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発は、ＰＫＡ−Ｃβの枯渇により有意に弱められたが、一方ＰＫＡ−Ｃα枯渇細胞では、わずかながらも抑制が認められた。次に、ロフルミラストの存在下でＮＴＨｉにより誘発される、炎症促進性メディエーターの上方制御に対するＰＫＡ−Ｃβ枯渇の効果を決定した。炎症促進性メディエーターの発現に対するＰＫＡ−Ｃβ枯渇の阻害効果は、ＰＤＥ４Ｂ２枯渇効果ときわめて整合するが、但し、ＰＫＡ−Ｃβの枯渇は、ＣＣＬ７及びＧＭ−ＣＳＦの上方制御を弱めたが、その程度はＰＤＥ４Ｂ２枯渇よりも大きかった点を除く。これらの結果から、ＰＫＡ−Ｃβは、ＮＴＨｉ及びロフルミラストにより誘発されたＰＤＥ４Ｂ２及び炎症促進性メディエーターの相乗的上方制御において、重要なポジティブレギュレーターとして作用することが示唆される。ＮＴＨｉ誘発型の炎症促進性メディエーターの一部は、ＰＫＡ−Ｃαの枯渇により増加さえしたが、それは、その他の細胞型で報告されたＰＫＡ−Ｃαの抗炎症効果と整合する（Ollivier et al., J. Biol. Chem., 271(34):20828-20835, 1996）。

ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ，cAMP response element）は、ラットニューロン内で生ずるＰＤＥ４Ｂ２発現の上方制御において特に重要な役割を演じていることが明らかにされているので（D’Sa et al., J. Neurochem., 81(4):745-757, 2002）、普遍的に発現した２つのＰＫＡ依存性転写因子であるＣＲＥ結合タンパク質（ＣＲＥＢ，CRE-binding protein）、及び活性化転写因子１（ＡＴＦ１、activating transcription factor 1）（Mayr and Montminy, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2(8):599-609, 2001）について、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞内で生ずるＮＴＨｉ及びロフルミラストによるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発に対するその関与を検討した。興味深いことに、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１が枯渇すると、ＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発が低下したが、その程度はＰＫＡ−Ｃβの枯渇と比較してかなり小さかった。これらの結果から、ＰＫＡ−Ｃβのその他の下流分子が、気管支上皮細胞内で生ずるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発においてより重要な役割を演じている可能性があることが示唆される。それにもかかわらず、本発明のデータは、ＰＫＡ−ＣαではなくＰＫＡ−Ｃβが、ＮＴＨｉ及びロフルミラストによるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発において重要であることを示唆する。

実施例４：ｃ−ＲｅｌではなくＩＫＫβ−ｐ６５が、ＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発に必要とされる。ＮＴＨｉは、ＩＫＫβの強力な活性化因子として公知（ＩＫＫ２としても公知）であり、ＮＦ−κＢ依存性の炎症反応の活性化を引き起こすので（Shuto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(15):8774-8779, 2001; Oeckinghaus and Ghosh, Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 1(4):a000034, 2009; Chen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 324(3):1087-1094, 2004）、ＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発におけるＩＫＫβ−ＮＦ−κＢシグナリングの必要性について検討した。ＩＫＫβの役割について最初に評価した。ＩＫＫβインヒビターは、ＮＴＨｉ及びロフルミラストによるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発を有意に阻害したが、ロフルミラスト単独によるＰＤＥ４Ｂ２の誘発には影響を及ぼさなかった。ＩＫＫβが活性化すると、その活性化がロフルミラストと相乗的に作用してＰＤＥ４Ｂ２の相乗的上方制御を確かに誘発するか、さらに決定するために、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に、構成的に活性型のＩＫＫα（ＩＫＫα−ＣＡ）及びＩＫＫβ（ＩＫＫβ−ＣＡ）をトランスフェクトした。ＰＤＥ４Ｂ２の発現は、ＩＫＫα−ＣＡ−トランスフェクト細胞ではなくＩＫＫβ−ＣＡ−トランスフェクト細胞において、ロフルミラスト又はＰＫＡ活性化因子６−Ｐｈｅ−ｃＡＭＰにより相乗的に増強されることが見出された。さらに、ＩＫＫβの下流分子であるＩκＢαのドミナントネガティブ変異体（ＩκＢα−ＤＮ，dominant-negative mutant of IκBα）が発現すると、ＩＫＫβ−ＣＡ−トランスフェクト細胞において、ＩＫＫβ−ＣＡにより誘発されたＰＤＥ４Ｂ２の発現、及びロフルミラストによるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発が完全にブロックされることも実証された。これらの結果から、ＩＫＫβ−ＩκＢαシグナリング経路が、ＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発に必要とされることが示唆される。

ＩκＢαは、ｐ６５及びｃ−Ｒｅｌを含むＮＦ−κＢ複合体の活性化及び核移行を阻止するが、ＮＦ−κＢ複合体は、ＰＫＡ−Ｃα及びＰＫＡ−Ｃβによりそれぞれ活性化されることがこれまでに知られている（Gerlo et al., Cell Mol. Life Sci., 68(23):3823-3841, 2011; Yu et al., J. Mol. Med. (Berl.), 82(9):621-628, 2004; Zhong et al., Cell, 89(3);413-424, 1997; Zhong et al., Mol. Cell., 1(5):661-671, 1998）。したがって、ＮＴＨｉがｐ６５及びｃ−Ｒｅｌの核移行を誘発するかどうか、最初に調べた。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞において、ｐ６５及びｃ−Ｒｅｌの両方が、ＮＴＨｉ処理後６０分以内に、核に移行することを見出した。これらの結果から、ｓｉＲＮＡを用いてｐ６５又はｃ−Ｒｅｌを選択的に枯渇させることにより、ＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発に対するｐ６５及びｃ−Ｒｅｌの必要性をさらに決定することにした。ｃ−Ｒｅｌではなくｐ６５の枯渇が、ＮＴＨｉ及びロフルミラストの両方によるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発、又はロフルミラスト単独によるのではなく、ＮＴＨｉ単独によるＰＤＥ４Ｂ２の誘発を有意に阻害することが見出されたが、これによりＮＴＨｉ誘発型のＰＤＥ４Ｂ２発現におけるｐ６５の重要な役割が示唆される。ｐ６５の過剰発現が、ロフルミラストと協働してＰＤＥ４Ｂ２を誘発するかどうかさらに決定した。ロフルミラストは、ｐ６５−トランスフェクト細胞において確かにＰＤＥ４Ｂ２の発現を相乗的に増強した。まとめとして、本発明のデータから、ＩＫＫβ−ＩκＢα−ｐ６５シグナリング経路が、気管支上皮細胞内で生ずるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発に必要であることが実証される。

実施例５：ＰＫＡ−Ｃβはｐ６５をリン酸化する。ＰＫＡ−Ｃβがｐ６５とどのように相互作用し、またこれらの分子がどのように協働してＰＤＥ４Ｂ２の発現を上方制御するかさらに決定するために、最初に、共免疫沈降実験を実施してｐ６５がＰＫＡ−Ｃβと物理的に会合しているか調べた。ｐ６５及びＰＫＡ−Ｃβは、ｐ６５及びＰＫＡ−Ｃβの両方をトランスフェクトしたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞において、物理的に相互に会合していることを見出した。さらに、そのような相互作用は、ＮＴＨｉと共にロフルミラストで同時処理することにより増強された。ロフルミラストは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞において、ｐ６５又はＰＫＡ−Ｃβの核発現レベルに影響を及ぼさないことを見出した。したがって、次に、ＰＫＡ−Ｃβがｐ６５のリン酸化に影響を及ぼすかどうか検討した。ｐ６５の複数の残基におけるリン酸化は、ｐ６５の様々な機能、例えばＤＮＡ結合及び転写活性等を制御することが明らかにされている（Huang et al., Cell Signal, 22(9):1282-1290, 2010; Chaturvedi et al., Oncogene, 30(14):1615-1630, 2011）。但し、ｐ６５のリン酸化を制御する際のＰＫＡ−Ｃβの役割は、なおも不明のままである。ｐ６５のリン酸化を評価するために、リン酸結合型のｔａｇに基づく新規方法であるリン酸アフィニティー（Ｐｈｏｓ−ｔａｇ）ＰＡＧＥを実施したが、同方法は、リン酸化されたタンパク質が、リン酸化されないタンパク質から分離可能となるように、リン酸化されたタンパク質の移動スピードが特に低下するように開発された（Kinoshita et al., Mol. Cell. Proteomics, 5(4):749-757, 2006）。ＮＴＨｉと共にロフルミラストで同時処理すると、ｐ６５のリン酸化を誘発したが、それはｃＡＭＰ依存性のＰＫＡ活性化の特異的インヒビターであるＲｐ−８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰＳにより阻害された。ＰＫＡ−Ｃβの枯渇又はＨ８９処理は、類似した阻害効果を示した。これらの結果と整合して、ｃＡＭＰ依存性のＰＫＡ選択的活性化因子６−Ｐｈｅ−ｃＡＭＰも、このリン酸化を誘発した。とりわけ、ＮＴＨｉ単独では、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞において類似したリン酸化は誘発されなかった。これから、ｃＡＭＰによるＰＫＡ−Ｃβの活性化が、ｐ６５のリン酸化に必要とされることが示唆される。また、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞内のＣβの主要なサブタイプであるＰＫＡ−Ｃβ１が過剰発現すると、ｐ６５のリン酸化が誘発されたが、その誘発は、ｐ３８インヒビター（ＳＢ２０３５８０）でも、またＥＲＫインヒビター（ＰＤ９８０５９）でもなく、Ｈ８９により阻害されことも見出された。これらの結果から、ＰＫＡ−Ｃβ１は、ｐ３８、ＥＲＫ、又はｐ６５をリン酸化することが明らかにされているその下流キナーゼＭＳＫ１（マイトジェン活性化及びストレス活性化キナーゼ１，mitogen- and stress-activated kinase 1）の活性化とは独立に、ｐ６５を直接リン酸化することが示唆される（Gerits et al., Cellular Signalling, 20(9):1592-1607, 2008; Joo and Jetten, J. Biol. Chem., 283(24):16391-16399, 2008; Reber et al., PloS one 4(2):e4393, 2009）。ＰＫＡコンセンサスリン酸化配列（ＲＲＸＳ／Ｔ）について調査すると、セリン第２７６番残基（Ｓｅｒ２７６）が、潜在的ＰＫＡリン酸化部位であることが判明し（Songyang et al., Curr. Biol., 4(11):973-982, 1994）、ＰＫＡ−ＣαはＳｅｒ第２７６番残基でｐ６５をリン酸化することを示した過去の試験成績と整合する（Zhong et al., 1998 and Zhong et al., 1998、前出）。ｐ６５が、ＰＫＡ−ＣβによってもＳｅｒ２７６においてリン酸化されるか決定するために、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞にｐ６５のリン酸化欠損変異体（Ｓ２７６Ａ）をトランスフェクトし、そしてＰｈｏｓ−ｔａｇ ＰＡＧＥにより分析した。その他のキナーゼによりリン酸化されることが公知の、その他のセリン残基が突然変異したｐ６５構築物（Ｓ４６８Ａ、Ｓ５２９Ａ、及びＳ５３６Ａ）についても分析した。ＰＫＡ−Ｃβにより誘発されたリン酸化の強度比は、野生型ｐ６５−トランスフェクト細胞と比較して、Ｓ２７６Ａ−及びＳ５３６Ａ−トランスフェクト細胞で低下した。ＰＤＥ４Ｂ２を誘発する際の、これら残基におけるｐ６５のリン酸化について、その機能的関与をさらに決定するために、異なるこれらのｐ６５リン酸化部位変異体をトランスフェクトした細胞内で生ずるＰＤＥ４Ｂ２の発現について検討した。ロフルミラスト及びＮＴＨｉは、ｐ６５変異体Ｓ２７６Ａではなく、Ｓ４６８Ａ、Ｓ５２９Ａ、及びＳ５３６Ａをトランスフェクトした細胞内で、ＰＤＥ４Ｂ２の発現を相乗的に増強した。次に、ｐ６５の転写活性に対する、ＰＫＡ−ＣβによるＳｅｒ２７６のリン酸化の効果を、ＮＦ−κＢプロモーター活性分析を実施することにより決定した。ＰＫＡ−Ｃβ１と共に共トランスフェクトすると、ｐ６５により誘発されたＮＦ−κＢプロモーター活性が有意に増強したが、ｐ６５のＳ２７６Ａ変異体を同時発現させることにより阻止された。総じて、これらの結果から、ロフルミラスト及びＮＴＨｉは、ＰＫＡ−Ｃβとｐ６５との物理的相互作用を高め、それは次にＳｅｒ２７６におけるｐ６５のリン酸化、そしてその後、ｐ６５依存性の転写活性の上方制御を引き起こすことが示唆される。

実施例６：デキサメタゾンは、ＮＴＨｉ及びＲｏｆによるＰＤＥ４Ｂの誘発を抑制し、またインビトロでの肺上皮細胞及びマウス肺におけるＮＴＨｉ誘発型の炎症を抑制する際のＲｏｆの有効性を改善する。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、Ｒｏｆ（１μＭ）、ＦＳＫ（１μＭ）、Ｉｓｏ（０．１μＭ）、及びＤＥＸ（１０ｎＭ）で１時間事前処理し、その後にＮＴＨｉで１．５時間刺激し、そしてＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡ発現をＱ−ＰＣＲにより分析した（図７Ａ及び７Ｂ）。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞も、Ｒｏｆ（０．１μＭ）及びＤＥＸ（６．５ｎＭ）で１時間事前処理し、その後にＮＴＨｉで１．５時間刺激し、そしてＰＤＥ４Ｂ２ ｍＲＮＡ発現を、半定量ＲＴ−ＰＣＲにより分析した（図７Ｃ）。タンパク質の発現を評価するために、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、Ｒｏｆ（０．１μＭ）及びＤＥＸ（１００ｎＭ）で１時間事前処理し、その後にＮＴＨｉで５時間刺激し、そしてＰＤＥ４Ｂタンパク質の発現を、免疫ブロットにより分析した（図７Ｄ）。各標的データをＮＴＨｉ処理で標準化した。データは、平均値±ＳＤである（ｎ＝３）；^＊ｐ＜０．０５、但しＮＴＨｉに対する；^†ｐ＜０．０５、但しＲｏｆ＋ＮＴＨｉに対する。マウスに、Ｒｏｆ（５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）及び／又はＤＥＸ（２ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）を２時間イノキュレーションし、その後ＮＴＨｉ（５×１０^７ＣＦＵ／肺）を気管内にイノキュレーションした（図７Ｅ及び７Ｇ）。５時間後、ＰＤＥ４Ｂ又は様々な炎症促進性メディエーターの発現を評価するために、肺組織内のｍＲＮＡ発現をＱ−ＰＣＲにより分析し、また肺組織をＰＤＥ４Ｂについて対比染色し（倍率×２００、スケールバー、１００μｍ）（図７Ｆ）、そしてＨ＆Ｅ染色法を用いて炎症を評価した（図７Ｈ）。

注釈：ＰＤＥ４Ｂは、様々な炎症性の刺激により上方制御されることが明らかにされており、炎症反応の媒介において重要な役割を演ずる（Gobejishvili et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 294(4):G718-G724, 2008; Gobejishvili et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 337(2):433-443, 2011; Jin and Conti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(11):7628-7633, 2002; Ma et al., Mol. Pharmacol., 55(1):50-57, 1999; Cohen et al., J. Biol. Chem., 275(15):11181-11190, 2000; Borysiewicz et al., Metab. Brain Dis., 24(3):481-491, 2009; Christiansen et al., Neurochem. Int., 59(6):837-846, 2011）。ＰＤＥ４ＢはバクテリアＮＴＨｉにより誘発されることも最近見出された（Komatsu et al., Nat. Commun., 41684, 2013）。ＰＤＥ４アイソフォームの発現レベルは、ＰＤＥ４インヒビターそのものを含む、ｃＡＭＰエレベーターにより誘発されることも公知であり（Jin and Conti, 前出; Mehats et al., Endorinology, 140(7):3228-3237, 1999; Campos-Toimil et al., Br. J. Pharmacol., 154(1):82-92, 2008; D’Sa, 前出; Dlaboga et al., Brain Res., 1096(1):104-112, 2006; Giorgi et al., Behav. Brain Res., 154(1):99-106, 2004）、ｃＡＭＰシグナリングのネガティブフィードバック制御において重要と考えられている。但し、ＰＤＥ４がどのように病原性微生物及びｃＡＭＰエレベーターの両方が存在する下で制御を受けるのか、その様式についてはなおも不明確なままである。この研究では、ロフルミラスト（ＣＯＰＤ増悪について臨床承認されたＰＤＥ４インヒビター）が、複雑な病因及びＣＯＰＤの薬物治療の文脈において、ｃＡＭＰ／ＰＫＡ−Ｃβ及びｐ６５間の相互応答を介して、ＮＴＨｉ（ＣＯＰＤ増悪の主要な細菌性の原因）と協働することにより、ＰＤＥ４Ｂ２の発現を誘発することを初めて示した（図１）。ＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発は、その他の炎症性の刺激、例えばＴＮＦ−αやＩＬ−１β、及びｃＡＭＰエレベーター等が存在した場合にも認められた。ＰＤＥ４Ｂ２の発現は、ケモカインＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１のＮＴＨｉ誘発型発現において重要な役割を演じており、ＣＯＰＤ増悪の病因において重要であることがこれまでに明らかにされている。これらのケモカインは、ＣＯＰＤ患者の誘発喀痰、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、又は末梢気道において増加しており（Saetta et al., Am. J. Resp & Crit. Care Med., 165(10):1404-1409, 2002; Fujimoto et al., Eur. Respiratory J., 25(4):640-646, 2005; Costa et al., Chest, 133(1):26-33, 2008; Hacievliyagil et al., Respiratory Med., 100(5):846-854, 2006; Frankenberger et al., Mol. Med., 17(7-8):762-770, 2011）、またマクロファージ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、好酸球、及び好中球の気道管腔への導入において重要な役割を演じている（Donnelly and Barnes, Trends Pharmacol Sci., 27(10):546-553, 2006; Le et al., Cell Mol. Immunol., 1(2):95-104, 2004; Quint and Wedzicha, J. Allergy Clin. Immunol., 119(5):1065-1071, 2007; Michalec et al., J. Immunol., 168(2):846-852, 2002; Gross, Chest, 142(5):1300-1307, 2012）。

この研究の第２の重要所見は、ＰＤＥ４Ｂ２は、酵素活性に依存する様式及び依存しない様式の両方で特定のケモカインの発現を制御することである。これは、相乗的に上方制御されたＰＤＥ４Ｂ２に起因する特定の臨床状態の下で炎症を抑制する際に、ロフルミラストの有効性を低下させる可能性がある。例えば、気管支上皮細胞内では、ＮＴＨｉ誘発型のＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１（グループＡ−ケモカインと命名される）の抑制におけるロフルミラストの効果は、いくつかのその他の炎症促進性メディエーター、例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−α等の抑制におけるその効果よりも低いことが観察された。さらに、ロフルミラストは、ＰＤＥ４Ｄ枯渇細胞ではなく、ＰＤＥ４Ｂ枯渇細胞内のグループＡ−ケモカインの抑制においてより有効となった。これらの結果と整合して、ロフルミラスト（１０μＭであっても）は、ＰＤＥ４Ｂ２を過剰発現する安定細胞株では、グループＡ−ケモカインのＮＴＨｉ誘発型の発現を完全に阻害することはできなかった。さらに、ＰＤＥ４Ｂ２−Ｄ３９２Ａが、ＮＦ−κＢの活性化及びケモカインの発現を増強する程度は、ＰＤＥ４Ｂ２−ＷＴと比較してそれより小さいものの、ＰＤＥ４Ｂ２−ＷＴ及びＰＤＥ４Ｂ２−Ｄ３９２Ａ（酵素活性を有さない変異体）のいずれも、ＮＦ−κＢプロモーターの活性及びグループＡ−ケモカインの発現を顕著に増強した。ロフルミラスト（最大１０μＭ）は、ＰＤＥ４Ｂ２−ＷＴ又はＰＤＥ４Ｂ２−Ｄ３９２Ａを過剰発現する細胞において、ＩＫＫβ−ＣＡにより誘発されたＮＦ−κＢプロモーター活性及びグループＡ−ケモカインの発現を完全に阻害することはできなかった点にも留意すべきである。総じて、これらの結果から、上方制御されたＰＤＥ４Ｂ２は、酵素活性に依存する様式及び依存しない様式の両方でこれらのケモカインの上方制御に寄与する可能性があることが実証され、これにより、炎症反応の制御において、ＰＤＥ４Ｂ２は非酵素的アダプタータンパク質として作用し得る、というエビデンスが初めて提供される。将来的な試験が、基礎となる機構をさらに明らかにするために正当化される。

本研究の第３の重要所見は、ＰＫＡ−ＣαではなくＰＫＡ−Ｃβが、ＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発、及びその結果生じたヒト気道上皮細胞における炎症反応との関わりにおいて特に必要とされることである。これまでに、ＰＫＡ−Ｃαは、ｃＡＭＰとは独立して、ｐ６５をＳｅｒ２７６でリン酸化することにより、ＮＦ−κＢシグナリングを活性化させることが明らかにされている（Zhong et al., Cell, 89(3):413-424, 1997）。ＰＫＡ−Ｃαは、ＩκＢ複合体と会合することにより、不活性状態に維持されていることが明らかにされている。ＩκＢの分解を引き起こすシグナルは、ＰＫＡ−Ｃαの活性化、及び後続するｐ６５のＳｅｒ２７６におけるリン酸化を引き起こす。これまでのこのような研究は、ｃＡＭＰに依存しないＰＫＡ活性化機構は、炎症性の刺激、例えばＬＰＳ、マイトジェン、サイトカイン、及びウイルス等に応答して生ずるＮＦ−κＢの活性化及び炎症に関与することを示唆する。本研究では、病原性微生物及びｃＡＭＰ上昇剤の両方が存在する文脈において、ＰＫＡ−ＣαではなくＰＫＡ−Ｃβにより媒介されるｐ６５のＳｅｒ２７６におけるリン酸化を通じて、ｃＡＭＰがＮＦ−κＢシグナリングと協働してＰＤＥ４Ｂ２を上方制御する新規の異なる機構を報告した。ＰＫＡ−Ｃα及びＰＫＡ−Ｃβが、ｐ６５リン酸化のｃＡＭＰ非依存性及びｃＡＭＰ依存性の制御についてそれぞれ特異的に媒介するか、さらに決定する将来的な研究が必要とされる。

ＰＤＥ４Ｂ２の発現制御におけるＰＫＡ−Ｃα及びＰＫＡ−Ｃβの異なる役割に加え、ＰＫＡ−Ｃα及びＰＫＡ−Ｃβは、炎症促進性メディエーターの発現を差次的に調節しているとも考えられる。例えば、ＮＴＨｉ誘発型の炎症促進性メディエーターの一部は、ＰＫＡ−Ｃαをノックダウンすると増加することが見出されたが、それは、その他の細胞型でこれまでに報告されたＰＫＡ−Ｃαの抗炎症的役割と整合する（Ollivier et al., J. Biol. Chem., 271(34):20828-20835, 1996）。炎症反応に関わるＰＫＡ−Ｃβの役割は、なおもほとんど不明確なままである。この研究では、ＰＫＡ−Ｃβをノックダウンすることにより、炎症促進性メディエーターの発現が低下したことが見出され、ＰＫＡ−Ｃβの炎症促進的役割が示唆される。これらのデータは、ＰＫＡ−Ｃβの選択的阻害は、ＰＫＡ−Ｃαにより媒介される抗炎症効果を損なわずに炎症促進性メディエーターを抑制する有望な戦略を代表し得ることを示唆する。ＰＤＥ４Ｂ２及び炎症促進性メディエーターの制御におけるＰＫＡ−Ｃα及びＣβの異なる役割を前提とすれば、ＰＫＡは、生理学的及び病理学的な応答制御において、アイソフォーム特異的に関与し得る可能性が高い（Padmanabhan et al., J. Biol. Chem., 288(20):14158-14169, 2013）。したがって、ＰＫＡの関与を決定することを目的する試験では、ＰＫＡの様々なアイソフォームの役割に対して特別な注意を払う必要がある。

ＮＦ−κＢシグナリング制御におけるＰＫＡの役割及びその基礎となる機構は、かなり複雑にみえる。いくつかのモデル系では、ＰＫＡが活性化すると、ＮＦ−κＢの核移行が阻害される。例えば、ＴＮＦ−αにより媒介されるｐ６５の核移行は、ＨｅＬａ細胞において、ｓｉＲＮＡを用いたＰＫＡの枯渇により増強される（King et al., PloS ONE, 6(4):e18713, 2011）。ホルスコリンは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ−リンパ球においてｐ６５の核移行を妨害する（Neumann et al., EMBO J., 14(9):1991-2004, 1995）。ＮＦ−κＢの核移行とは独立した機構も存在する。例えば、ヒト単球及び内皮細胞では、ｃＡＭＰは、ＮＦ−κＢ複合体の核移行を妨害しないでＮＦ−κＢにより媒介される転写を阻害する。むしろ、ｃＡＭＰ／ＰＫＡが、ＣＲＥＢのリン酸化によりＮＦ−κＢ依存性の転写活性を阻害するが、ＣＲＥＢは、限定量のＮＦ−κＢ活性化補助因子であるＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ，CREB-binding protein）に対してｐ６５と競合する（Parry and Mackman, J. Immunol., 159(11):5450-5456, 1997）。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ−リンパ球内のＮＦ−κＢの転写活性に対するｃＡＭＰ／ＰＫＡ経路の阻害作用は、ｐ６５のＣ末端トランスアクチベーションドメインの直接又は間接的修飾により発揮され、ＣＲＥＢ及びＳｅｒ２７６におけるｐ６５のリン酸化とは独立していることも明らかにされている（Takahashi et al., Eur. J. Biochem., 269(18):4559-4565, 2002）。上記研究のいずれも、ＮＦ−κＢ転写活性に対するｃＡＭＰ／ＰＫＡの阻害効果についてエビデンスを提供する。しかし、ＰＫＡは、ＮＦ−κＢシグナリングを活性化させることができるというエビデンスも存在し、その場合、Ｓｅｒ２７６におけるｐ６５のリン酸化は重要に思える。例えば、ＰＫＡによるＮＦ−κＢのＳｅｒ２７６におけるリン酸化は、ＮＦ−κＢの活性化補助因子ＣＢＰ／ｐ３００との相互作用を促進することにより、ＮＦ−κＢの転写活性を刺激する（Zhong et al., 1998、前出）。ＰＫＡによるＮＦ−κＢ ｐ６５のＳｅｒ２７６におけるリン酸化は、ＮＦ−κＢを活性化し、また頭部及び頸部のがんの悪性表現型に寄与する（Arun et al., Clin. Cancer Res., 15(19):5974-5984, 2009）。ＰＫＡ−Ｃαは、Ｓｅｒ２７６においてｐ６５をリン酸化することにより、ＩＫＫβに依存して、但しｃＡＭＰには依存しないでＮＦ−κＢシグナリングを活性化させることも明らかにされている（Zhong et al., 1997、前出）。本研究では、ＰＫＡ−Ｃβも、Ｓｅｒ２７６においてｐ６５を、但しｃＡＭＰに依存してリン酸化することが明らかにされるが、これは気管支上皮細胞におけるＮＴＨｉ及びロフルミラストによるＰＤＥ４Ｂ２の相乗的誘発にとって重要である。これらを総じて考慮すると、これらの一連の実験的エビデンスは、ｃＡＭＰ及び／又はＰＫＡは、ＮＦ−κＢの活性化／不活性化について、様々な機構を経由して調節可能であることを示唆するが、これは、細胞型及びｃＡＭＰ及びＰＫＡの供給源、並びに異なるシグナリング複合体中に存在するＮＦ−κＢサブユニットに依存し得る。さらに、様々な細胞型又は状態におけるＡキナーゼ相互作用タンパク質１（ＡＫＩＰ１，A kinase-interacting protein 1）の発現レベルも、ＮＦ−κＢ活性に対するＰＫＡの効果に関して重要と思われる。ＡＫＩＰ１のレベルが低い細胞では、ＰＫＡ活性化剤は、ＮＦ−κＢ転写活性を阻害することが明らかにされている。対照的に、ＡＫＩＰ１のレベルが高い細胞では、ＰＫＡの活性化は、Ｓｅｒ２７６におけるｐ６５のリン酸化を増加させ、ＮＦ−κＢの活性化と協働して作用する（Gao et al., J. Biol. Chem., 285(36):28097-28104, 2010）。

まとめとして、本発明者らの研究は、複雑な病因及びＣＯＰＤの薬物治療の文脈において、ＰＤＥ４Ｂ２発現の相乗的誘発の基礎となる分子機構のみならず、ｃＡＭＰに依存したＰＫＡ−Ｃβ及びｐ６５間のシグナリング相互応答についても新たな見識を提供する。また、本発明者らの結果は、ＰＤＥ４Ｂ２は、炎症反応の制御において、少なくとも部分的に、非酵素的アダプタータンパク質として作用し得るというエビデンスを初めて提供する。ロフルミラストとＰＫＡ−Ｃβ選択的インヒビター（及び／又は本明細書に記載するその他のインヒビター）を併用投与すれば、ＰＤＥ４Ｂ２の望ましくない上方制御を弱め、これにより、有効性を改善し、有効用量を減少させ、そしておそらくはＣＯＰＤが増悪した患者のＰＤＥ４インヒビターに対する耐性を緩和する有望な治療戦略を提示するのに役立つ可能性がある。

Claims (17)

1. 第１の活性薬剤と、第２の活性薬剤とを含む医薬組成物であって、前記第１の活性薬剤が、ロフルミラストであり、前記第２の活性薬剤が、ＰＤＥ４Ｂ２の発現又は活性を阻害する、前記医薬組成物。
2. 第２の活性薬剤が、ＰＤＥ４Ｂ２の活性を阻害するアルケニルジアリールメタン（ＡＤＡＭ）化合物、又はその誘導体である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ＡＤＡＭ化合物が、ＡＤＡＭ５又はＡＤＡＭ６である、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 第２の活性薬剤が、デキサメタゾン、クルクミン、又はＨＩＦ−１αインヒビターである、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 第２の活性薬剤が、ＰＤＥ４Ｂ２の発現を選択的に阻害する核酸分子である、請求項１に記載の組成物。
6. 第２の活性薬剤が、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットβ（ＰＫＡ−Ｃβ）の発現若しくは活性、又はＰＫＡ−ＣβのＮＦκＢ ｐ６５との相互作用を阻害する、請求項５に記載の組成物。
7. ５００ｍｃｇ未満のロフルミラストが、単位投与剤形に含まれる、請求項１に記載の組成物。
8. ロフルミラスト、ＰＤＥ４Ｂ２の発現又は活性を阻害する第２の活性薬剤、使用説明書を含み、かつ、
   任意に、第１の活性薬剤若しくは第２の活性薬剤を患者に投与する際に用いられる希釈剤、送達デバイス、又はドレッシング材の１又は２以上を含む
   キット。
9. ＰＤＥ４Ｂ２を安定的に過剰発現する、単離された細胞。
10. 樹立細胞株の細胞である、請求項９に記載の単離された細胞。
11. ヒト細胞である、請求項１０に記載の単離された細胞。
12. 炎症性肺疾患を有する患者を治療する方法であって、治療上有効な量のロフルミラストと、ＰＤＥ４Ｂ２の発現又は活性を阻害する第２の薬剤とを、前記患者に投与するステップを含む、前記方法。
13. 炎症性肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、請求項１２に記載の方法。
14. 第１及び第２の薬剤が、単一投与剤形に統合されている、請求項１２に記載の方法。
15. 第１及び第２の薬剤が、同一又は異なる投与経路により、同時に又は連続して投与される、請求項１２に記載の方法。
16. 第１の薬剤が、経口投与され、かつ第２の薬剤が、肺に直接投与される、請求項１５に記載の方法。
17. 第２の薬剤が、吸入により肺に直接投与されるように、乾燥粉末として製剤化されている、請求項１６に記載の方法。