JP2018507205A - 改善された光線力学的処理およびそれから得られる生成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、マイクロモル以下の感光性化合物が光線力学処置のために用いられる改善された光線力学的処理に関する。得られる生成物は、凍結解凍後にさらに安定であり改善された増殖能を示す、より存続能力のある生成物である。【選択図】なし

Description

本発明は、光線力学的処理およびそれから得られる生成物に関する。具体的には、本発明は、細胞集団から特定の細胞を枯渇させるために用いられる光線力学的処理およびそれから得られる生成物に関する。

移植または同種移植は、１個体または複数の個体、すなわちドナー（複数可）から別の個体、すなわちレシピエントへの物質の提供を含む。同種移植の間、ドナー細胞はレシピエントの細胞および組織に反応する（移植片対宿主病）ことがあり、これはＨＬＡ抗原の不適合による望ましくない反応である。レシピエント細胞に反応し同細胞によって活性化されるドナー細胞、一般的にはＴリンパ球を特定し除去するためのいくつかの方法がある。混合リンパ球反応は、宿主細胞とドナー細胞の間の反応性を検討するために用いることができるｅｘ ｖｉｖｏ方法である。それは光線力学的治療法と組み合わせて、宿主細胞によって活性化されるドナー細胞を選択的に除去するために用いることができる。

アロ反応性Ｔ細胞のそのような組み合わせられた同定および除去は、宿主に対するアロ反応性Ｔ細胞を選択的に枯渇させたＴ細胞富化ドナーリンパ球調製物の製造に用いられる。これは例えば国際公開第０１／２４８２４号に記載されており、これらの調製物は、ドナー細胞の一方向ＭＬＲをレシピエントの不適合主要ＨＬＡ抗原の方向に誘導するために、ＩＬ−２の存在下でγ線照射されたレシピエント細胞をドナー細胞と混合することによって製造される。ある培養期間の後、細胞は収集され、次いですべての細胞内に蓄積する蛍光感光性ローダミン化合物、ＴＨ９４０２に曝される。続いて、ＴＨ９４０２を含まない培地中で細胞をインキュベートする期間の後、この色素は、一方向ＭＬＲで活性化された細胞、すなわちレシピエントの不適合ＨＬＡ抗原に反応したドナー細胞中で優先的に保持される。次に、この細胞は可視波長の光に曝され、ＴＨ９４０２の活性化および細胞毒性が高い活性酸素ラジカルの生成がもたらされ、それによって、レシピエントの不適合ＨＬＡ抗原に反応したドナー細胞が除去されるが他のドナー細胞は残される。Ｍｉｅｌｋｅら（２００８）Ｂｌｏｏｄ １１１：４３９２−４４０２は、抗ＣＤ３とＩｌ−２を用いて生成された増殖Ｔ細胞がＨＬＡ適合または不適合ドナー由来のレスポンダー細胞と共培養されるＭＬＲを記載している。この研究において、７．５マイクロモルのＴＨ９４０２と共にインキュベートすることで、５マイクロモルでのインキュベーションよりもかなり良好な結果が得られている。Ｐｅｒｒｕｃｉｏら（２００７）Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４０：７６−８３は、押出しステップのないＭＬＲ処理とそれに続く光線力学的処置を記載している。細胞集団の９０〜９５パーセントは、死滅する。

この方法の主な限界は、単一の処置で扱える細胞の数である。処置される細胞の濃度は、最終生成物の質を損なうことなく、押出し相中で１００万細胞／ｍＬを上回ることができない。したがって、より多くの細胞を処置するために、処理において扱える量を増加させる必要がある。しかしながら、かなりの量、例えば１リットル以上の量で作業することは、困難であり、処置のロバストネスおよび再現性に影響する。一人の患者に対し十分な細胞の光線力学的処置は、約１０台の照明装置または数ラウンドの処置を必要とする。

本発明は、
（ｉ）５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中で細胞調製物をインキュベートすること、
（ｉｉ）感光性化合物を除去するために（ｉ）の培地を押出し培地と交換すること、および
（ｉｉｉ）感光性化合物を保持している細胞を選択的に死滅させるために、押出し培地中の細胞調製物を照射すること
を含む光線力学的処理に関する。

本発明による処理の一利点は、最終生成物の質を損なうことなく、５マイクロモルを超える、例えば１０マイクロモルの感光性化合物を用いる参照処理で従来用いられるよりも少ない容積かつ高い細胞濃度を押出し相で用い得ることである。驚くべきことに、この処理によって得られる細胞生成物は、５マイクロモルを超える、例えば１０マイクロモルの感光性化合物を用いる参照処理によって得ることのできるまたは得られた参照細胞生成物と比較して改善されている。別の利点は、より多くの細胞を同じ条件下で同時に光線力学的に処置できることである。さらに別の利点は、参照細胞生成物と比較して改善されている細胞生成物を得ながら、より少ない感光性化合物を用いることができることである。すべてのこれらの利点は、標準化および取扱いの効率性と容易性に多大な影響を与える。最新の方法は、低濃度、例えば１×１０^６細胞／ｍＬでの光線力学的処置を可能にするのみである。例えば１実験当たり１００×１０^６細胞を扱うことができる照明装置が使用される場合、一人分の平均細胞量である総計１×１０^９細胞の処置には１００×１０^６細胞を１０ラウンド、または同時での１０台の照明装置の使用を必要とする。処置の各ラウンド間の処置条件はわずかに異なることがあり、したがって数ラウンドの処置は避けることが好ましい。また、一処置に対する１０台の照明装置の使用は、費用がかかりかつ場所をとるので、これも避けることが好ましい。本発明による方法を用いることによって、より高濃度でかつより小さい容積で１×１０^９細胞を処置することが可能である。結果として、照明装置の台数は１または２台へと８０％縮小され、およびすべての細胞は同時に同じ条件下で処置され得る。本発明による方法は、発色相よりも押出し相におけるより高い細胞濃度をもたらす。これは重要な培地の縮小を可能にし、スケーラビリティを容易にし、および同等の装置でより多くの細胞を処理することを可能にする。

本発明による光線力学的処理において、感光剤を用いて特定の細胞を選択的に死滅させることができる。一実施形態において、これは、感光性化合物はすべての細胞内に蓄積するが、洗浄ステップ後に特定の細胞中に優先的に保持されるために達成され、それによって特定の細胞を選択的に死滅させることが可能になる。別の実施形態において、感光性化合物は特定の細胞だけに蓄積し、それによってこれらの細胞だけを死滅させることが可能になる。

「光線力学的処理」という用語は、感光性化合物が光線に曝されそれによって細胞傷害性である１または複数の生成物に変換される処理を指す。本発明によるこの処理において、任意の適切な感光性化合物を、例えばローダミンおよびローダミン誘導体を用いることができる。特に興味深いのは、式（Ｉ）：
（式中：
−Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、およびＲ_１０の１つはハロゲン原子を表し、残りのＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４の各々および残りのＲ_１０基の各々は独立して水素、ハロゲン原子、アミノ、アシルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アザシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアミノ、アロイルアミノ、ジアリールアミノ、アリールアルキルアミノ、アラルキルアミノ、アルキルアラルキルアミノ、アリールアラルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルチオ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、シアン、ヒドロキシスルホニル、アミドスルホニル、ジアルキルアミドスルホニル、アリールアルキルアミドスルホニル、ホルミル、アシル、アロイル、アルキル、アルキレン、アルケニル、アリール、アラルキル、ビニル、アルキニル基からなる群からおよび対応する置換基によって選択され、
−ｍ＝０〜１であり、
−ｎ＝１〜４であり、
−Ａは無、Ｏ、またはＮＨであり、
−Ｒ_９はアルキレン基を表し、
−ＺはＨ、アミノ、ジアルキルアミノ、またはトリアルキルアミノ塩であり、
−Ｘ−は陰イオンであり、ならびに
−Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８は独立してＨもしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり、またはＲ_５もしくはＲ_６との組み合わせのＲ_１、またはＲ_５もしくはＲ_６との組み合わせのＲ_２、またはＲ_７もしくはＲ_８との組み合わせのＲ_３、またはＲ_７もしくはＲ_８との組み合わせのＲ_４はアルキレンを表す）によって包含される、国際公開第０２／０７９１８３号に開示されるローダミン誘導体；ならびに欧州特許第０７７３７９４号に開示されるローダミン誘導体である。特に、ジブロモローダミン誘導体は興味深い。

適切な感光性化合物としては、２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸メチルエステルの塩；２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸エチルエステルの塩；２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸オクチルエステルの塩；２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸ｎ−ブチルエステルの塩；２−（６−エチルアミノ−３−エチルイミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸ｎ−ブチルエステルの塩；２，７−ジブロモローダミンＢメチルエステルの塩；２，７−ジブロモローダミンＢヘキシルエステルの塩；４，５−ジブロモローダミン６Ｇの塩；２’−（６−ジメチルアミノ−３−ジメチルミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）４’，５’ジクロロ−安息香酸メチルエステルの塩；４、５−ジブロモローダミン１１０ ２−（２−メトキシエトキシ）エチルエステルまたはローダミンＢ３−ブロモプロピルエステルの塩である感光性ローダミン誘導体、例えば２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸メチルエステルの臭化水素酸塩もしくは塩酸塩；２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸エチルエステルの臭化水素酸塩もしくは塩酸塩；２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸）オクチルエステルの臭化水素酸塩もしくは塩酸塩；２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸ｎ−ブチルエステルの臭化水素酸塩もしくは塩酸塩；２−（６−ジエチルアミノ−３−エチルイミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸ｎ−ブチルジステルの臭化水素酸塩もしくは塩酸塩；２，７−ジブロモローダミンＢメチルエステルの酢酸塩；２，７−ジブロモローダミンＢヘキシルエステルの酢酸塩；４，５−ジブロモローダミン６Ｇの臭化水素酸塩もしくは塩酸塩；２’−（６−ジメチルアミノ−３−ジメチルイミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）４’，５’ジクロロ−安息香酸メチルエステルの臭化水素酸塩もしくは塩酸塩；４，５−ジブロモローダミン１１０ ２−（２−メトキシエトキシ）エチルエステルの臭化水素酸塩もしくは塩酸塩およびローダミンＢ３−ブロモプロピルエステルの臭化水素酸塩もしくは塩酸塩からなる群から選択される感光性ローダミン誘導体など、およびこれらの感光性化合物の感光性誘導体が挙げられる。好ましい実施形態において、２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸メチルエステルの塩（別名４，５−ジブロモローダミン１２３メチルエステル）、例えば、２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸メチルエステルの臭化水素酸塩もしくは塩酸塩（ＴＨ９４０２とも呼ばれる）、または３，６−ジアミノ−４，５−ジブロモ−９−（２−（メトキシカルボニル）フェニル）キサンチリウムクロリド（ＣＡＳ番号１７４２３０−０５−８）が用いられる。

上述の感光性ローダミンまたはローダミン誘導体は腫瘍細胞および活性化細胞などの特定の細胞によって優先的に保持されるので、これらの感光性ローダミンまたはローダミン誘導体の光活性化により細胞を選択的に死滅させることができる。非腫瘍細胞または非活性化細胞などの他の細胞は、これらの感光性ローダミンまたはローダミン誘導体を保持せず、したがって影響を受けない。

５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中の細胞調製物は、任意の細胞調製物であってよい。細胞は、一般的に、哺乳動物由来、好ましくはヒト由来の臓器または組織に由来する。一実施形態において、細胞は、肝臓または骨髄などの固形組織または軟組織から調製される。別の実施形態において、細胞は、血液、特に末梢血などの非固形組織から調製される。本発明と関連して、「末梢血」という用語は、骨髄内または臓器内の血液ではなく、すなわち循環回路内の血液を意味する。

５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中の細胞調製物は、幹細胞を含んでもよい。一実施形態において、細胞調製物中の細胞の少なくとも６０％、細胞の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または細胞の少なくとも９９％は幹細胞である。本発明と関連して、「幹細胞」という用語は、万能性または多能性であり、主に骨髄内に存在する未分化細胞を指す。一実施形態において、細胞調製物は１００％幹細胞を含む。一実施形態において、幹細胞はいかなる種類の幹細胞であってよく、幹細胞調製物は造血幹細胞を少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％含む。別の実施形態において、幹細胞調製物は、造血幹細胞からなる。

５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中の細胞調製物は、Ｔリンパ球を含んでもよい。一実施形態において、培地中の細胞調製物内の細胞の少なくとも１０％、細胞の少なくとも２０％、細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％または細胞の少なくとも５０％、細胞の少なくとも６０％、細胞の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または細胞の少なくとも９９％は、Ｔリンパ球である。一実施形態において、細胞調製物は１００％Ｔリンパ球を含む。Ｔリンパ球は、ＣＤ３＋およびＣＤ４５＋の両方の細胞として特定でき、およびＴ細胞とも呼ばれる。

５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中の細胞調製物は、一般的に、特定の細胞から枯渇させたい細胞調製物である。一実施形態において、細胞調製物は腫瘍細胞から枯渇されて、処置された細胞の移植がレシピエント内で腫瘍形成を引き起こさないことを確実にする。

別の実施形態において、５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中の細胞調製物は、活性化細胞から、具体的には活性化白血球から、より具体的には活性化Ｔリンパ球から枯渇される。一実施形態において、細胞調製物は、レシピエント−活性化ドナー細胞から、具体的にはレシピエント−活性化ドナーＴリンパ球から枯渇される必要のある、ドナー細胞とレシピエント細胞との混合物である。

Ｔリンパ球の活性化は、特定の表面マーカーの発現上昇、例えばＩＬ−２受容体α鎖（ＣＤ２５とも呼ばれる）などの、ＩＬ−２受容体もしくはそのサブユニットの発現上昇から、または増殖、すなわち分裂および増加から明らかになり得る。増殖は、例えば、インターロイキン２など、インターロイキンなどの増殖因子または他の成長因子を必要とすることがあり、以下に述べる増殖アッセイで測定できる。

細胞は、当技術分野で既知の任意の方法によって活性化できる。一実施形態において、活性化は混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によってもたらされる。本発明に関連して、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、それらの少なくとも１つがＴリンパ球を含有する２つの個体からの細胞調製物が混合されて、別の個体由来の細胞（スティミュレーター）に対する１つの個体由来のＴリンパ球（レスポンダー）の増殖応答を可能にする、ｅｘ ｖｉｖｏ反応を指す。ＭＬＲは好ましくは、スティミュレーター細胞が非増殖性になるように処置される一方向ＭＬＲである。細胞を非増殖性にする適切な方法は、それらのＤＮＡ機能性を妨害すること、例えば、γ線照射またはそれらをマイトマイシンＣで処置することによる。細胞を非増殖性にする別の適切な方法は、それらの細胞を固定すること、例えばホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドによって固定することである。ＭＬＲのためのＴ細胞は、単離されていてもよく、または他の細胞型も含有する調製物中に存在してもよい。一実施形態において、ＭＬＲで用いられるＴ細胞は、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）画分中に存在する。当業者は、例えばＦｉｃｏｌｌ（登録商標）−勾配密度遠心分離によって、ＰＢＭＣ画分を調製する方法を理解している。ＭＬＲで用いられるＴ細胞は、例えば抗ＣＤ３抗体またはインターロイキン２によって予備活性化されていないのが好ましい。レスポンダーとして予備活性化Ｔ細胞を用いると、光線力学的処置の間に細胞の非選択的枯渇が起こることがあり、または光による枯渇後に残存するＴ細胞の疲弊が起こることがあり、これは好ましくない。ＭＬＲでスティミュレーターとして予備活性化Ｔ細胞を使用することも、これらの細胞が、非選択的枯渇を引き起こす活性化サイトカインの混合物を生成するので好ましくない。

ＭＬＲでは、細胞は通常、２〜７日間、好ましくは４〜５日間インキュベートされる。一実施形態において、ドナー細胞とレシピエント細胞は、一方向ＭＬＲで４日間インキュベートされる。

一実施形態において、５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中の細胞調製物は、健常なドナー由来のリンパ球とレシピエント由来の非増殖性リンパ球とを用いる一方向ＭＬＲによって得られたドナー細胞とレシピエント細胞とのＭＬＲ混合物である。別の実施形態において、５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中の細胞調製物は、健常なドナー由来のリンパ球とレシピエント由来の非増殖性リンパ球とを用いて一方向ＭＬＲによって得られたドナー細胞とレシピエント細胞のＭＬＲ混合物であり、一部のドナー細胞が、ドナーとレシピエントのＨＬＡハプロタイプが同一でなくかつドナー細胞がレシピエント細胞上の不適合ＨＬＡ抗原によって活性化されるために、活性化されている。

レシピエントは、患者、例えばドナーから移植片を受けた、または受けることになる患者であり得る。移植片は組織、臓器または細胞であり得、かつ固形または非固形であり得る。好適な実施形態において、患者は、幹細胞移植を受けた、または受けることになる患者、例えば血液がん患者もしくは鎌状赤血球貧血症患者、もしくは肉芽腫症患者、もしくは地中海貧血症患者であり、または固形臓器移植のレシピエントである。ドナーおよびレシピエントは、任意の種であってよく、好ましくは哺乳動物である。好ましくは、レシピエントはヒトであり、より好ましくはドナーおよびレシピエントは両者ともヒトである。

ドナー細胞とレシピエント細胞を含む細胞調製物は、レシピエント細胞によって活性化されるドナー細胞の特異的除去によって移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防するために、本発明による光線力学的処理において好都合に用いられ得る。本発明と関連して、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）という用語は、同種移植に関連してドナー細胞、具体的にはＴリンパ球がレシピエント細胞を攻撃する疾患を指す。ＧｖＨＤは、この疾患の症状と徴候によって分類されるように、急性または慢性であり得る。

細胞調製物は、５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中でインキュベートされる。一実施形態において、培地は、４マイクロモル以下、３マイクロモル以下、２マイクロモル以下または１マイクロモル以下の感光性化合物を含む。一実施形態において、培地は０．１〜５マイクロモルの感光性化合物を含む。別の実施形態において、培地は０．５〜５マイクロモルの感光性化合物を含む。別の実施形態において、培地は１〜５マイクロモルまたは２〜５マイクロモルの感光性化合物を含む。さらに別の実施形態において、培地は０．５〜４マイクロモル、１〜４マイクロモルまたは２〜４マイクロモルの感光性化合物を含む。さらに別の実施形態において、培地は０．１〜３マイクロモルの感光性化合物を含む。適切な感光性化合物は、上述している。一実施形態において、感光性化合物は上述のようにローダミンまたはローダミン誘導体である。

５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地の量は、感光性化合物で細胞を効果的に発色させるのに十分でなければならず、患者の体重に依存する。適切な発色量は、通常は９００〜１５００ｍＬの範囲である。５０キロの患者の場合、発色は９００〜１１００ｍＬで適切に行われ得る。一実施形態において、５０ｋｇの患者の場合、発色は約１０００ｍＬで行われる。１００ｋｇの患者の場合、発色は約１３００〜１４００ｍＬで適切に行うことができる。一実施形態において、１００ｋｇの患者の場合、発色は約１３７５ｍＬで行われる。

５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地は、血漿、血清または抗生物質などの一般的な細胞培養成分をさらに含んでもよい。一実施形態において、培地はドナー血漿を含む。用いることができる適切な培地組成物は、ゲンタマイシンとフェノールレッド（Ｌｏｎｚａ，ＵＳＡ）とを含まず、熱失活させた（ＨＩ）ドナー血漿を２．５体積％含むＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地である。

発色は、２０℃〜４０℃の範囲の温度で、好ましくは２５℃〜３８℃の範囲の温度で、より好ましくは３６．５℃〜３７．５℃の範囲の温度で行われる。ＣＯ_２濃度は、適切には約５％、すなわち４．５％〜５．５％である。一実施形態において、発色は３６．５℃〜３７．５℃の範囲の温度、および約５％のＣＯ_２濃度で行われる。

細胞調製物は、発色に必要な長さの間、すなわち感光性化合物が調製物中の少なくとも９０％の細胞に取り込まれる間、５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中でインキュベートされる。好ましくは、調製物中の細胞の少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が発色される。より好適な実施形態において、調製物中のすべての細胞は、発色される。これは通常、３０〜９０分かかる。一実施形態において、１×１０^６細胞／ｍＬが用いられる場合、細胞の少なくとも９０％は３０〜６０分以内に、好ましくは３０〜５０分以内に発色される。別の実施形態において、１×１０^６細胞／ｍＬが用いられる場合、細胞の少なくとも９５％は３０〜９０分以内に、好ましくは３０〜５０分以内に発色される。別の実施形態において、１×１０^６細胞／ｍＬが用いられる場合、細胞の少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％は３０〜９０分以内に、好ましくは３０〜５０分以内に発色される。一実施形態において、１×１０^６細胞／ｍＬが５マイクロモル以下の感光性化合物と共に４０分間インキュベートされて、調製物中の細胞の少なくとも９９％、および好ましくはすべての細胞を発色する。

発色後、５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地は、押出し培地と交換され、これにより、非活性化細胞から感光性化合物を押出すことによって細胞が選択的に染色される。したがって押出し培地は実質的に感光性化合物を含まず、好ましくは感光性化合物を全く含まない。交換は、分離法を用いることによって成し遂げられるのが好ましい。細胞と共に適切に用いられる当技術分野で既知の任意の分離法、例えば遠心分離、濾過および透析を用いてよい。一実施形態において、５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地は、発色後に細胞調製物を遠心することによって押出し培地と交換され、ペレットと上清を得る。ペレットは、発色後の細胞を含有しており、好ましくは感光性化合物を全く含まない押出し培地中に再懸濁される。押出しによって、いずれかの残留する、過剰なまたは非結合の感光性化合物、一般的には細胞外の感光性化合物を除去できる。押出し培地は、血漿、血清または抗生物質などの、一般的な細胞培養成分をさらに含み得る。一実施形態において、押出し培地はドナー血漿を含む。用い得る適切な押出し培地組成物は、ゲンタマイシンとフェノールレッド（Ｌｏｎｚａ，ＵＳＡ）とを含まず、１０体積％のＨＩドナー血漿を含むＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地である。

押出しは、２０℃〜４０℃の範囲の温度で、好ましくは２５℃〜３８℃の範囲の温度で、より好ましくは３６．５℃〜３７．５℃の範囲の温度で行われ得る。ＣＯ_２濃度は、適切には約５％、すなわち４．５％〜５．５％である。一実施形態において、押出しは、３６．５℃〜３７．５℃の範囲の温度、および約５％のＣＯ_２濃度で行われる。

本発明の方法によれば、押出しは、取り扱いが容易であり最新方法の量よりも少ない、都合のよい量で行われてよい。したがって、押出し量は、３３０〜６００ｍＬの範囲である。一実施形態において、押出し量は、最大で５００ｍＬ、例えば３３０〜５００ｍＬである。好ましくは、押出し量は、最大で４５０ｍＬ、例えば３３０〜４００ｍＬである。このような量は標準化を容易にする。なぜなら、おそらく多少異なる条件下で数ラウンドの実験を行わなければならない代わりに、すべての細胞が一回の実験で、同時にかつ同じ条件下で処置され得るためである。押出し相での細胞濃度は、通常、発色相での細胞濃度よりも高い。一実施形態において、発色相での細胞濃度対押出し相での細胞濃度の比率は、少なくとも１：２に等しい。別の実施形態において、発色相での細胞濃度対押出し相での細胞濃度の比率は、少なくとも１：３に等しい。発色相よりも押出し相での高い細胞濃度により、重要な培地を低減し、同じ装置でより多くの細胞を処理でき、スケーラビリティが促進される。

細胞調製物は、いずれかの残留する、過剰なまたは非結合の、一般的には細胞外の、感光性化合物を除去するのに必要なだけ長い間、押出し培地中でインキュベートされる。これは、通常、６０〜１００分かかる。一実施形態において、少なくとも１×１０^６細胞／ｍＬは、最大で６００ｍＬ、例えば３３０〜６００ｍＬ、または最大で５００ｍＬ、好ましくは最大で４００ｍＬ、例えば３３０〜４００ｍＬの総量の押出し培地中で６０〜９０分間、好ましくは８０〜９０分間、インキュベートされ、いずれかの残留する、過剰なまたは非結合の、一般的には細胞外の、感光性化合物を効果的に押出す。別の実施形態において、少なくとも２×１０^６細胞／ｍＬは、最大で５００ｍＬ、例えば３３０〜５００ｍＬ、好ましくは３３０〜４００ｍＬの総量の押出し培地中で６０〜９０分間、好ましくは８０〜９０分間、インキュベートされ、いずれかの残留する、過剰なまたは非結合の、一般的には細胞外の、感光性化合物を効果的に押出す。さらに別の実施形態において、少なくとも３×１０^６細胞／ｍＬは、最大で６００ｍＬまたは最大で５００ｍＬ、例えば３３０〜５００ｍＬ、好ましくは最大４００ｍＬの総量の押出し培地中で６０〜９０分間、好ましくは８０〜９０分間、インキュベートされ、いずれかの残留する、過剰なまたは非結合の、一般的には細胞外の、感光性化合物を効果的に押出す。一実施形態において、２×１０^６細胞は、５マイクロモルの感光性化合物での発色後に、最大で４００ｍＬ、例えば３３０〜４００ｍＬの押出し培地中で押出される。別の実施形態において、３×１０^６細胞は、５マイクロモルの感光性化合物での発色後に、最大で４００ｍＬ、例えば３３０〜４００ｍＬの押出し培地中で押出される。活性化細胞からよりも非活性化細胞からより多くの色素が押出されるならば、押出しは効果的であり、活性化細胞対非活性化細胞において区別できる色素濃度をもたらす。

押出し後に、押出し培地中の細胞を照射して、感光性化合物を保持していた細胞を選択的に死滅させる。

光線力学的処理用の光は、大きな表面にわたり均一な光の照射を供給する照明装置によって照射されるのが好ましい。細胞は、好ましくは、照明装置からの光が細胞に最適に曝露されるように配置される。したがって、細胞は好ましくは、薄層中にまたは薄層として存在する。細胞の薄層は、好ましくは２０ｍｍ以下、より好ましくは１５ｍｍ以下または１０ｍｍ以下、もっとも好ましくは５ｍｍ以下、４．５ｍｍ以下、３ｍｍ以下、３．５ｍｍ以下または３．０ｍｍ以下である。一実施形態において、細胞の薄層は、１．０ｍｍと２０ｍｍの間、１．０ｍｍと１５ｍｍの間、１．０ｍｍと１０ｍｍの間または１．０ｍｍと５ｍｍの間である。別の実施形態において、細胞の薄層は、１．０ｍｍと４．５ｍｍの間、１．０ｍｍと４．０ｍｍの間、１．０ｍｍと３．５ｍｍの間、１ｍｍと３ｍｍの間、１ｍｍと２．５ｍｍの間または１ｍｍと２ｍｍの間である。さらに別の実施形態において、細胞の薄層は、２．０ｍｍと４．５ｍｍの間、２．０ｍｍと４．０ｍｍの間、２．０ｍｍと３．５ｍｍの間である。さらに別の実施形態において、細胞の薄層は、２．５ｍｍと４．５ｍｍの間、２．５ｍｍと４．０ｍｍの間、２．５ｍｍと３．５ｍｍの間または２．５ｍｍと３ｍｍの間である。

当業者は、均一な光の照射および光への細胞の最適な曝露がいくつかの方法で達成されることを理解するだろう。一実施形態において、これは、細胞が薄層状態である間にそれらを走査する照明装置を用いることにより、達成される。別の実施形態において、これは、２つの反対方向に移動し、かつ細胞が薄層状態である間にそれらを照射する走査型照明装置を用いることにより、達成される。適切な装置の一例は、２つの反対方向に移動でき、および細胞が薄層状態である間に感光性化合物を含む細胞を下から照射できる走査型照明装置である。薄層は、例えば、細胞を平らに配置することによって得ることができる。

一実施形態において、走査型装置が覆う面積は、１２００〜１８００平方ｃｍ、例えば約４０×４０ｃｍまたは３６×３４ｃｍが好ましい。適切な照明装置は、国際公開第９８／０３２２４号に記載のもの、またはＴｈｅｒａｌｕｘ（商標）装置、Ｋｉａｄｉｓ Ｐｈａｒｍａ，Ｃａｎａｄａ）である。一実施形態において、感光性化合物を含む細胞の薄層は静かに振動する。別の実施形態において、感光性化合物を含む細胞の薄層は、定常または静的であり、すなわち動いていない。

光線力学的処置は、エネルギー線量が４〜５Ｊ／ｃｍ^２の範囲で押出し培地中の細胞に照射されると、停止される。押出し培地中の細胞に４〜５Ｊ／ｃｍ^２が照射されるまでに要する時間は、光源に依存する。一実施形態において、押出し培地中の細胞調製物に５Ｊ／ｃｍ^２を照射するために、光曝露は３５〜４５分間継続される。光曝露の後、細胞は収集され、遠心されて培地を除去する。

本発明による光線力学的処理で用いられる光は、可視波長の波長を有する電磁放射線である。電磁放射線は、４００〜７００ｎｍの範囲の、好ましくは緑色のスペクトルで、すなわち５００〜５８０ｎｍの範囲、より好ましくは５１０〜５５０ｎｍの範囲、もっとも好ましくは５１０〜５２０ｎｍの範囲の波長を有する。一実施形態において、５１２〜５１４ｎｍの範囲の波長を有する電磁放射線を、感光性化合物を活性化するために用いて細胞傷害性生成物、例えば細胞傷害性一重項酸素を生成する。

光への曝露は、任意の適切な方法でよく、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏであってよい。好適な実施形態において、光への曝露はｅｘ ｖｉｖｏである。

本発明による光線力学的処置過程において、具体的には押出しと照射の間に、同時に同じ条件下で処置され得る細胞の総数は、１億５０００万〜１．８×１０^９細胞である。一実施形態において、少なくとも１×１０^８細胞または少なくとも１×１０^９細胞が同時に同じ条件下で処置される。別の実施形態において、１．２×１０^９細胞が同時に同じ条件下で処置される。これは、最新の処理で可能であるよりもはるかに多い。これらの細胞は、少なくとも１×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも２×１０^６細胞／ｍＬの濃度で存在し得る。一実施形態において、細胞は少なくとも３×１０^６細胞／ｍＬの濃度で存在する。その結果、関与する量は、取り扱いが容易である。

感光性化合物を保持する細胞の少なくとも８０％が死滅する場合、光線力学的処置は効果的である。一実施形態において、感光性化合物を保持する細胞の少なくとも８５％が死滅する。さらに別の実施形態において、感光性化合物を保持する細胞の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が死滅する。好ましくは、感光性化合物を保持する細胞のすべてが死滅する。本発明による光線力学的処理を用いて得られる細胞生成物は、１０マイクロモルの感光性化合物を用いる参照処理によって得られる細胞生成物と比較して、関連特性に関して改善されている。

したがって、別の態様において、本発明は、本発明による光線力学的処理を用いることによって得られた細胞調製物に関する。

一実施形態において、細胞生成物は、癌細胞を枯渇させた細胞の集団、特に癌細胞を枯渇させた細胞の集団であり、それによってこの細胞の集団はレシピエント中に移植されることになる。

別の実施形態において、細胞生成物は、レシピエント反応性Ｔリンパ球を枯渇させた宿主−レシピエントリンパ球調製物である。そのような細胞生成物は、例えば同種移植に関連して得られ、開始細胞調製物が健常なドナー由来のリンパ球とレシピエント由来の非増殖性リンパ球とを用いる一方向ＭＬＲによって得られたドナーおよびレシピエント細胞のＭＬＲ混合物であるならば、ドナーとレシピエントが非同一のＨＬＡハプロタイプでありかつドナー細胞がレシピエント細胞上の不適合ＨＬＡ抗原によって活性化されるために、一部のドナー細胞が活性化されている。そのような細胞生成物は、アロ反応性Ｔ細胞が選択的に枯渇されたＴ細胞富化ドナーリンパ球調製物と呼ばれることもある。そのような細胞生成物は、１０マイクロモルの感光性化合物を用いる参照処理によって調製された細胞調製物と比較して、凍結解凍後のＷＢＣ回収率、ＷＢＣ生存率、生存Ｔ細胞含有量、２日間のＴ細胞生存および増殖の１つまたは複数に関して改善されている。一実施形態において、本発明による光線力学的処理を用いて調製されるレシピエント反応性Ｔリンパ球を枯渇させたリンパ球調製物は、１０マイクロモルの感光性化合物を用いる参照処理によって調製された細胞調製物と比較して、凍結解凍後のＷＢＣ回収率、ＷＢＣ生存率、生存Ｔ細胞含有量、２日間のＴ細胞生存および増殖に関して改善されている。適切な感光性化合物としては、ローダミンおよびローダミン誘導体、具体的にはジブロモローダミン誘導体、例えば２−（４、５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸メチルエステル塩（別名４、５−ジブロモローダミン１２３メチルエステル、およびＴＨ９４０２とも呼ばれる）が挙げられる。他の適切な感光性化合物は、上述のように光線力学的処理用である。

改善されたＷＢＣ回収率は、回収されるＷＢＣのより高いパーセンテージに反映され、それによって凍結前のＷＢＣの濃度が１００％とされる。

改善されたＷＢＣ生存率は、細胞生成物の細胞／ｍＬでのより高い生存ＷＢＣ濃度に反映される。

改善された生存Ｔ細胞含有量は、細胞生成物の細胞／ｍＬでのより高い生存Ｔリンパ球濃度に反映される。

改善された２日間のＴ細胞生存は、解凍から２日後の細胞生成物中に生存しているＴリンパ球のより高いパーセンテージに反映され、それによって解凍後の細胞／ｍＬの生存Ｔ細胞濃度が１００％とされる。

改善された増殖曲線は、レシピエント細胞に対する同程度のもしくはより低い増殖と、または第三者細胞に対する同程度のもしくはより高い増殖と組み合わせた自己細胞に対する同程度のもしくはより低い増殖に反映される。一実施形態において、改善された増殖曲線は、レシピエント細胞に対する同程度の増殖と、第三者細胞に対するより高い増殖との組み合わせで自己細胞に対する同程度の増殖に反映される。別の実施形態において、改善された増殖曲線は、自己細胞に対するより低い増殖とレシピエント細胞に対するより低い増殖、および第三者細胞に対するより高い増殖の両方に反映される。

本発明の処理によって得られるこの改善された細胞生成物は、癌を予防または処置するための方法、または移植片対宿主病を予防または処置するための方法で用いることができる。好ましくは、細胞生成物は医薬用途のために調製される。細胞生成物は、当業者に既知の適切な任意の形態で調製されてよい。一実施形態において、細胞生成物は、液剤として、好ましくは注射による単回投与用の液剤として調製される。

得られた細胞生成物の増殖曲線は、増殖アッセイで決定できる。任意の適切な増殖アッセイが用いられてよい。一実施形態において、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）を加えた細胞を使用して、およびプールした１０％熱失活したヒト血漿を含むＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地中１ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２の存在下で５日間、異なる増殖誘導刺激を加えることによって細胞培養が開始される、増殖アッセイが用いられる。細胞の増殖（すなわちＣＦＳＥの希釈）は、アッセイ中にわたる細胞数の増加を反映する増殖指数（ＰＩ）を答えるＭｏｄｆｉｔ ＬＴ（商標）ソフトウェアを使用して分析されてよい。１．０のＰＩは、増殖がないことを表す。

適切な増殖誘導刺激は枯渇される細胞に依存するが、以下を含むこともある。
１．「フィーダー効果」をもたらすことができる細胞を加えることによってベースライン増殖を決定するための、照射された自家ドナー細胞。フィーダー細胞は栄養素を放出して、基質支持を提供する。
２．レシピエントに対する（保持されている）反応性を決定するための、照射されたレシピエント細胞。反応性は存在しないかベースラインに近いことが好ましい。
３．非血縁ＨＬＡ抗原に対する反応性（保持されている）を決定するための、照射された第三者細胞。上の２に記載のように、反応性は保持されており、いずれにせよレシピエントに対する保持された反応性の少なくとも２倍であるのが好ましい。

一実施形態においてこの比率は少なくとも３または少なくとも４である。別の実施形態において、比率は４と５の間である。

生存ＷＢＣ濃度は、当業者に既知の任意の方法によって、例えば血球計算器およびトリパンブルー染色法を用いることによって決定できる。当業者は、どのようにトリパンブルー染色を行うか、例えば、適切に希釈した細胞調製物を０．４％トリパンブルー溶液と３〜３０分間混合させて血球計数器上に適用し、次いでトリパンブルー陰性細胞の数とトリパンブルー陽性細胞の数をそれぞれ決定することによって生存細胞と非生存細胞の数を顕微鏡で計数することを理解している。あるいは、生存ＷＢＣ濃度は、メーカーの説明書に従って、フローサイトメトリー、自動細胞計数器またはその他によって決定できる。

細胞生成物中の生存Ｔ細胞の濃度は、当業者に既知の任意の方法によって決定されてよい。一実施形態において、濃度は、ＷＢＣ画分中の生存Ｔ細胞の比率を決定することによって算出される。これは、１ＩＵ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン−２を補充した血漿中で、３×１０^６／ｍＬの生存ＷＢＣ濃度で３連培養を開始することによって算出できる。培養開始から２４時間後に、ＷＢＣ濃度は、血液分析装置、例えばＡＢＸ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓ ＥＳ６０（Ｈｏｒｉｂａ Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）または任意の他の血液分析装置を用いて決定され、および生存Ｔ細胞のパーセンテージは、適切な抗体パネルを用いて画分中の細胞を染色することによって決定される。適切な抗体パネルは、Ｔ細胞、白血球の検出と決定のため、および非生存細胞の排除のため、それぞれ抗ＣＤ３、抗ＣＤ４５および７−アミノーアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）を含んでよい。生存Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ４５陽性細胞内の、ＣＤ３陽性であるが７ＡＡＤ陰性の細胞のパーセンテージを分析することによって決定できる。Ｔ細胞のこのパーセンテージを、血液分析装置を用いて決定されたＷＢＣ濃度で乗じると、細胞／ｍＬで生存Ｔ細胞の濃度を得る。

別の態様において、本発明は、処置の方法における本発明による光線力学的処理の使用に関する。光線力学的処理に関する上述のすべての実施形態はこの態様にも適用できる。

一実施形態において、本発明は、移植片対宿主病、具体的には同種幹細胞移植に関連した移植片対宿主病を、レシピエント細胞によって活性化されるドナー細胞を特異的に除去することにより、軽減または予防するための方法における本発明による光線力学的処理の使用に関する。一実施形態において、本発明による光線力学的処理は、（ｉ）ドナー細胞が活性化するのに十分な時間にわたり健常ドナー由来のドナー細胞を患者由来の非増殖レシピエント細胞と混合することによってドナー由来のリンパ球を活性化する、（ｉｉ）５マイクロモル以下の感光性化合物を使用する光線力学的治療法を用いて（ｉ）のステップの活性化リンパ球を選択的に死滅させる、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた混合物を患者に注入するｅｘ ｖｉｖｏステップを含む、移植片対宿主病を軽減または予防するための方法において使用される。リンパ球は、好ましくはＴリンパ球である。そのような注入は、患者に成熟Ｔリンパ球を早急に提供するために、一般的に幹細胞移植から４〜５週後に患者に投与される。さもなければ成熟Ｔリンパ球を形成するのに数ヵ月かかることになる。

別の実施形態において、本発明は、非癌細胞も含む細胞集団内、特にレシピエントに移植されることになる細胞集団内の癌細胞を死滅させる方法において本発明による光線力学的処理の使用に関する。一実施形態において、本発明による光線力学的処理は、骨髄内、特に自家幹細胞移植のための骨髄内癌細胞を死滅させるために用いられる。一実施形態において、本発明による光線力学的処理は、（ｉ）患者の骨髄を採取する、（ｉｉ）５マイクロモル以下の感光性化合物を使用する光線力学的治療法を用いて患者の骨髄内の癌細胞を選択的に死滅させる、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）の処置した骨髄を用いて自家幹細胞移植を行うｅｘ ｖｉｖｏステップを含む、癌患者を処置する方法において用いられる。

別の態様において、本発明は、本発明による細胞生成物と、医薬担体とを含む医薬組成物に関する。一実施形態において、医薬組成物は癌を予防または処置するための方法で使用される。別の実施形態において、医薬組成物は急性移植片対宿主病を予防または処置するための方法で使用される。さらに別の実施形態において、医薬組成物は、慢性移植片対宿主病を予防または処置するための医薬組成物である。

別の態様において、本発明は細胞のｅｘ ｖｉｖｏ処置の方法に関し、この方法は、（ｉ）健常ドナー由来のドナー細胞と患者由来の非増殖レシピエント細胞とをドナー細胞が活性化するのに十分な時間にわたり混合すること、（ｉｉ）５マイクロモル以下の感光性化合物を使用する光線力学的治療法を用いて（ｉ）のステップで活性化したリンパ球を選択的に死滅させること、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた混合物を患者に注入することによりドナー由来のリンパ球を活性化することのｅｘ ｖｉｖｏｓテップを含む。好ましくは、（ｉｉ）での選択的に死滅させることは、押出し培地中で細胞をインキュベートすることを含み、これにより活性化ドナーリンパ球が選択的に染色される。リンパ球は、好ましくはＴリンパ球である。

別の態様において、本発明は、細胞のｅｘ ｖｉｖｏ処置の方法に関し、この方法は（ｉ）５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中で細胞調製物をインキュベートする、（ｉｉ）感光性化合物を除去するために（ｉ）の培地を押出し培地と交換する、および（ｉｉｉ）感光性化合物を保持した細胞を選択的に死滅させるために押出し培地中の細胞調製物を照射するｅｘ ｖｉｖｏステップを含む。

別の態様において、本発明は、本発明による処理または方法における使用に適切なキットに関し、このキットは、（ｉ）照射による細胞のｅｘ ｖｉｖｏ処置のために５マイクロモル以下の濃度で用いるための感光性化合物と、（ｉｉ）細胞の選択的染色をもたらす感光性化合物の除去のための押出し培地とを含む。一実施形態において、キットは照明装置をさらに含む。適切な押出し培地は上記の本発明の他の態様に記載されており、およびいずれかの残留する、過剰なまたは非結合の、一般的には細胞外の、細胞の選択的染色をもたらす感光性化合物を除去するために用いられる。好ましくは、押出し培地は感光性化合物を実質的に含まない。より好ましくは、押出し培地は、感光性化合物をまったく含まない。一実施形態において、感光性化合物は感光性のローダミンまたはローダミン誘導体である。適切なローダミンおよびローダミン誘導体は上述されており、具体的にはジブロモローダミン誘導体、例えば２−（４、５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸メチルエステル塩（別名４、５−ジブロモローダミン１２３メチルエステル、およびＴＨ９４０２とも呼ばれる）を含む。

本発明の一態様のための上述のすべての実施形態は、本発明の他の態様にも適用できる。

実施例
物質および方法
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のために、ドナー由来およびレシピエント由来の単核細胞をメーカーの説明書に従ってＦｉｃｏｌｌ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）−密度勾配遠心により単離した。次に、健常なドナー由来の単核細胞をレシピエント由来のγ線照射された単核細胞と混合した。このＭＬＲ混合物を、外来性ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を５０ＩＵ／ｍＬ含有するＭＬＲ培地（ゲンタマイシンおよびフェノールレッド（Ｌｏｎｚａ，ＵＳＡ）を含まず、熱失活した（ＨＩ）ドナー血漿を２％加えたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地）中の生存ドナー白血球１×１０^６／ｍＬおよび生存レシピエント白血球１×１０^６／ｍＬを含むバルクで調製した。ＭＬＲ細胞を複数のＴＣ−１７５培養フラスコ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に分配し、各フラスコにはＭＬＲ懸濁液７０ｍＬが入った。フラスコを静止位置で３７℃、５％ＣＯ_２にて４日間インキュベートした。

発色反応
４日後に、ポストＭＬＲ細胞を遠心した。得られたペレットをプールして、これを、ゲンタマイシンとフェノールレッド（Ｌｏｎｚａ，ＵＳＡ）を含まず２．５％ＨＩドナー血漿を加えたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地（発色培地）中に再懸濁した。この細胞懸濁液の生存白血球（ＷＢＣ）濃度を、トリパンブルー手動カウント（０．４％トリパンブルー；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；細胞をトリパンブルーと最小で３分間、最大で３０分間混合する）と共に血液分析装置（Ｈｏｒｉｂａ Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）で決定した。ポストＭＬＲ細胞混合物を１．１１×１０^６細胞／ｍＬの生存ＷＢＣ濃度に発色培地中で希釈した。次に、１．１１×１０^６細胞／ｍＬの生存ＷＢＣ濃度のこの希釈ＭＬＲ混合物を、２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸メチルエステルであるジボロモローダミン誘導体ＴＨ９４０２（Ｋｉａｄｉｓ Ｐｈａｒｍａ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と１：１０の比率で 発色培地中で混合し、ゲンタマイシンとフェノールレッド（Ｌｏｎｚａ，ＵＳＡ）とを含まず、２．５％ＨＩドナー血漿と、１．０×１０^６生存ＷＢＣ／ｍＬと、所望濃度のＴＨ９４０２とを加えたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地を含有する発色混合物を得た。この発色混合物をＴＣ−１７５（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）フラスコ中で３７℃、５％ＣＯ_２で静的にインキュベートした。４０分間の発色後に、細胞を収集し、遠心してＴＨ９４０２含有培地を除去した。

押出し反応
次に、この細胞ペレットを、プールしたポストＭＬＲ細胞で行った細胞カウントに基づく所望の最終生存ＷＢＣ濃度に押出し培地（ゲンタマイシンとフェノールレッド（Ｌｏｎｚａ，ＵＳＡ）とを含まず、１０％ＨＩドナー血漿を加えたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地）中で再懸濁した。押出し培地中の細胞をＴＣ−１７５フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）にそれぞれ１０ｍＬまたは５０ｍＬ移し、３７℃、５％ＣＯ_２で、フラスコを横に寝かせて静的にインキュベートした。９０分間の押出し後に、押出し培地中に細胞を含有するフラスコを直ちに光線力学的治療法にかけた。

光線力学的処置（ＰＤＴ）
光線力学的処理のために、押出し培地中の細胞を含有するフラスコを光線力学的処置用の照明装置（Ｔｈｅｒａｌｕｘ（商標）装置、Ｋｉａｄｉｓ Ｐｈａｒｍａ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上に横に寝かせて並べ、静かに振盪させながら、５１４ｎｍ波長（緑色スペクトル）の光に曝した。装置から５Ｊ／ｃｍ^２のエネルギー線量が照射された時に処置を停止した。これは３５分かかった。光曝露の後で、細胞を収集し、遠心して押出し培地を除去した。

ＰＤＴ後の細胞洗浄
次に、細胞ペレットを洗浄培地（０．９％ＮａＣｌ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、１０％ドナー血漿）中にプールし、次いで総ＷＢＣ集団中の生存Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（商標），Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）で決定した。２回目の洗浄の後に、ＷＢＣ濃度を血液分析装置（ＡＢＸ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓ ＥＳ６０，Ｈｏｒｉｂａ Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）で決定した。二つの測定値（生存Ｔ細胞パーセンテージとＷＢＣ濃度）から、この画分中の生存Ｔ細胞濃度を算出した。

保存
ポストＰＤＴ細胞画分からの７．５×１０^６／ｍＬに相当する量の生存Ｔ細胞を遠心して、細胞ペレットを凍結培地Ａ（２０％ドナーＨＩ血漿を含有する生理食塩水）中に再懸濁した。次に、等量の事前に冷却した（２〜８℃）ＤＭＳＯ含有培地（凍結培地Ｂ：４０％ドナーＨＩ血漿と２０％ＤＭＳＯとを含有する生理食塩水）を凍結培地Ａ細胞懸濁液に加え、この混合物を試料バイアルに分配した。これらの試料バイアルを、標準ＰＢＭＣ凍結プログラムを用いて定速度フリーザー中で直ちに凍結した。増殖曲線などのさらなる実験を行うまで、これらの試料を気相の液体Ｎ_２蒸気中に保存した。

ＷＢＣ画分内の生存Ｔ細胞のパーセンテージの決定
ＷＢＣ画分中の生存Ｔ細胞の比率を、１ＩＵ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン−２を補充した血漿中で３×１０^６／ｍＬの生存ＷＢＣ濃度にて３連培養を開始することによって決定した。生存ＷＢＣ濃度を、血球計算盤（Ｌａｂｏｒ Ｏｐｔｉｋ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて決定した。培養開始から２４時間または４８時間後に、ＷＢＣ濃度を、血液分析装置（ＡＢＸ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓ ＥＳ６０，Ｈｏｒｉｂａ Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）を用いて決定し、および生存Ｔ細胞のパーセンテージを、Ｔ細胞、白血球および生存率の検出と決定のためにそれぞれ抗ＣＤ３（Ｖ５００結合マウスＩｇＧ１、クローンＵＣＨＴ１、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）、ＣＤ４５（Ｖ４５０結合マウスＩｇＧ１、クローンＨＩ３０、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）および７ＡＡＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）を含む抗体パネルで画分中の細胞を染色することによって決定した。生存Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ４５陽性細胞内でのＣＤ３陽性であるが７ＡＡＤ陰性の細胞のパーセンテージを分析することによって決定した。Ｔ細胞のこのパーセンテージを、血液分析装置を用いて決定したＷＢＣ濃度で乗じることによって、ＷＢＣ画分内の生存Ｔ細胞の濃度を得た。

Ｔ細胞生存パーセンテージの決定
試料の解凍後の生存Ｔ細胞濃度を１００％として設定した。
４８時間の培養後に測定した生存Ｔ細胞濃度を解凍直後の生存Ｔ細胞濃度で割って、１００％を掛け、Ｔ細胞生存（％）を得た。

生存ＷＢＣ濃度の決定
生存ＷＢＣ濃度を、血球計算器（Ｌａｂｏｒ Ｏｐｔｉｋ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）または血液分析装置（ＡＢＸ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓ ＥＳ６０，Ｈｏｒｉｂａ Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）をそれぞれメーカーの説明書に従って使用して、凍結前と解凍後に決定した。

細胞生成物中の生存Ｔ細胞濃度の算出
試料の生存Ｔ細胞濃度を、ＷＢＣ画分中の生存Ｔ細胞のパーセンテージに生存ＷＢＣ濃度を掛けることによって算出した。

ＷＢＣ回収率の決定
試料の解凍後のＷＢＣ濃度を試料の凍結前のＷＢＣ濃度で割り、１００％を掛けて、ＷＢＣ回収率（％）を得た。

比較実施例１
混合リンパ球反応を、ＭＬＲ培地中の１×１０^６生存ドナー白血球／ｍＬと１×１０^６生存レシピエント白血球／ｍＬで行った。ＭＬＲ細胞を複数のＴＣ−１７５培養フラスコ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に分配し、各フラスコにはＭＬＲ懸濁液７０ｍＬが入った。これらのフラスコを３７℃、５％ＣＯ_２にて、静止位置で４日間インキュベートし、続いてＴＣ−１７５フラスコの内容物を収集して、遠心した。ペレットを発色培地中で１．１１×１０^６細胞／ｍＬの生存ＷＢＣ濃度に再懸濁し、発色培地中で１００μＭのＴＨ９４０２と混合して、１０μＭのＴＨ９４０２と１．０×１０^６生存ＷＢＣ／ｍＬとを含有する発色混合物を得た。この発色混合物をＴＣ−１７５（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）フラスコ中で、３７℃、５％ＣＯ_２で静的にインキュベートした。４０分間の発色反応後に、細胞を収集し遠心してＴＨ９４０２含有培地を除去した。次に、細胞ペレットを、総量１２００ｍＬ（１フラスコ当たり１０ｍＬ）中１×１０^６／ｍＬの最終生存ＷＢＣ濃度へと押出し培地中に再懸濁した。全１．２×１０^９細胞を処置するために、１２０個のフラスコを要した。使用した照明装置（Ｔｈｅｒａｌｕｘ（商標），Ｋｉａｄｉｓ Ｐｈａｒｍａ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は各１０ｍＬの細胞を含有するフラスコを１０個保持でき、全ての細胞を処置するために３台の照明装置と４ラウンドの処置が必要であった。９０分間の押出し後に、押出し培地中の細胞を含有するフラスコを横に寝かせて、Ｔｈｅｒａｌｕｘ（商標）ＰＤＴ装置（Ｋｉａｄｉｓ Ｐｈａｒｍａ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用する５１４ｎｍでの光線力学的治療法に直ちにかけた。５Ｊ／ｃｍ２の総エネルギーが３５分間で照射された。光曝露後に、細胞を収集し遠心して押出し培地を除去した。１回目の洗浄後に、総ＷＢＣ集団中の生存Ｔ細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（商標），Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）で上述のように決定した。２回目の洗浄後に、ＷＢＣの濃度を血液分析装置（ＡＢＸ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓ ＥＳ６０，Ｈｏｒｉｂａ Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）を使用して決定し、生成物中の生存Ｔ細胞濃度を算出した。結果を表１にまとめる。

比較実施例２
押出し相で扱う量を縮小するために、１×１０^６生存ドナー白血球／ｍＬおよび１×１０^６生存レシピエント白血球／ｍＬを用いる混合白血球反応を実施例１に記載のようにＭＬＲ培地中で行った。これに続いて実施例１に記載の発色ステップを実施した。しかし、発色後の細胞ペレットは、実施例１での濃度よりも３倍濃縮された最終生存ＷＢＣ濃度、すなわち３×１０^６／ｍＬに押出し培地中で再懸濁し、およびより大きなフラスコを使用した（１フラスコ当たり５０ｍＬ）。処置される総量は４００ｍＬであった。これで、全１．２×１０^９細胞を処置するために、８個のフラスコのみを必要とした。９０分間の押出しの後に、実施例１でのように細胞を処置し、ＷＢＣの濃度を決定し、生成物中の生存Ｔ細胞濃度を算出した。臨床目的のために有用であるために、生成物中の生存Ｔ細胞の濃度が実施例１と同程度であることが重要であった。しかし、表１にまとめた結果は、量を縮小することが生成物の質に影響を及ぼしたことを示している。生成物中の生存Ｔ細胞の濃度が大幅に低下し、これは最終生成物の投与製剤としては不適格である。

実施例３
本発明による条件下の実験では、１×１０^６生存ドナー白血球／ｍＬおよび１×１０^６生存レシピエント白血球／ｍＬを用いる混合白血球反応を実施例１に記載のようにＭＬＲ培地中で行った。３７℃、５％ＣＯ_２で４日後に、ＴＣ−１７５フラスコの内容物を収集して、遠心した。ペレットを発色培地中で１．１１×１０^６細胞／ｍＬの生存ＷＢＣ濃度に再懸濁し、次いで発色培地中で１００μＭの代わりに５０μＭのＴＨ９４０２と混合して、５μＭのＴＨ９４０２と１．０×１０^６生存ＷＢＣ／ｍＬとを含有する発色混合物を得た。この発色混合物をＴＣ−１７５（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）フラスコ中で、３７℃、５％ＣＯ_２にて静的にインキュベートした。４０分間の発色後に、細胞を収集し遠心してＴＨ９４０２含有培地を除去した。次に、細胞ペレットを総量４００ｍＬ（１フラスコ当たり５０ｍＬ）中３×１０^６／ｍＬの最終生存ＷＢＣ濃度に押出し培地中で再懸濁した。全１．２×１０^９細胞を処置するために、８個のフラスコのみを必要とした。９０分間の押出しの後に、実施例１に記載のように細胞を処置した。ＷＢＣの濃度を決定し、生成物中の生存Ｔ細胞濃度を算出した。

本発明による処理により得られた細胞生成物の特性、例えば生存Ｔ細胞濃度を表１に示す。驚くべきことに、より少ない光活性化合物を使用することにより、より多くの細胞を同時に同じ条件下で処置することが可能になる。それは容積を低減させ、その一方で、実施例１で得られた参照生成物に匹敵し最終生成物の投与製剤に適した生存Ｔ細胞の濃度を維持する（１×１０^６／ｍＬ；１０μＭ）。これは、より少量の感光性化合物の使用はより小さい容積の使用を可能にするが、同等の結果を与えることを意味する。増殖曲線測定を実施するまで、細胞生成物を凍結保存した。

実施例４ 得られた生成物の増殖曲線
この実施例において、本発明による光線力学的処理により得られた生成物の増殖特性を、実施例１で得られた参照生成物の増殖特性と比較した。実施例３で調製した細胞生成物を解凍し、生存ＷＢＣ濃度を血球計算器とトリパンブルー染色法を用いて決定した。次いで、２×１０^６／ｍＬの一定ＷＢＣ濃度で細胞懸濁液に１μＭのカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）を加えた。比較例１で調製した細胞生成物を参照として用いた。

細胞培養は、プールした１０％熱失活ヒト血漿を含むＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で１ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２の存在下で５日間、３つの異なる増殖誘導刺激を加えることによって開始した。３つの増殖誘導刺激は、以下の通りであった：
１．「フィーダー効果」をもたらし得る細胞を加えることによってベースライン増殖を決定するための、照射された自家ドナー細胞
２．ＧｖＨＤに関連する、レシピエントに対する（保持された）反応性を決定するための、照射されたレシピエント細胞
３．非血縁ＨＬＡ抗原に対する（保持された）反応性を決定するための、照射された第三者細胞。

細胞の増殖（すなわちＣＦＳＥの希釈）は、アッセイの経過中の細胞数の増加を反映する増殖指数（ＰＩ）を答えるＭｏｄｆｉｔ ＬＴ（商標）ソフトウェアを使用して分析した（１．０のＰＩは増殖がないことを表す）。最初の処理は、ベースライン条件（すなわち自家ドナー細胞での刺激）に近い製造処理においてドナー細胞が刺激されたレシピエント細胞に対する増殖指数（ＰＩ）を示す生成物をもたらすことが知られていた。それでも、第三者細胞に対するＰＩは、明確に検出できるはずである。結果を表２に示す。

表２に示すように、本発明による光線力学的処理は、実施例１で得られた参照生成物と比較して第三者細胞に対する改善されたポスト解凍増殖指数を有する生成物をもたらした。

実施例５ 凍結解凍後の生成物の特性
実験の別のセットにおいて、本発明による細胞生成物の特性を、ポスト解凍ＷＢＣ回収率、ＷＢＣ生存率、生存Ｔ細胞含有量、２日間のＴ細胞生存および増殖に関して、実施例１による処理を用いて得られた参照生成物と比較した。両処理からの試料を凍結し、解凍後にＷＢＣ回収率、ＷＢＣ生存率、生存Ｔ細胞含有量、２日間のＴ細胞生存および増殖を分析した。同じ物質源による３つの実験の平均を表３に示す。

驚くべきことに、本発明による処理は参照生成物と比較して改善された生成物をもたらした。解凍後により高い生存率とより高い生存Ｔ細胞含有量を有するより多くのＷＢＣを回収し、本発明による生成物の解凍後の量がより高濃度の活性生成物を含有することが示された。さらに、２日間のＴ細胞生存はより高く、本発明による生成物中の活性成分はｉｎ ｖｉｖｏでより長く残存することが示された。最終的に、本発明に従う生成物の増殖特性は、優れたパターン、すなわち自己細胞に対するより低い増殖、レシピエント細胞に対するより低い増殖、第三者細胞に対するより高い増殖、を示す。このように、本発明に従う処理は、不必要なレシピエント反応細胞がよりよく枯渇されるが、血縁関係のない第三者の抗原に対するさらなる反応性を保持している生成物をもたらす。

結論として、本発明に従う処理は、優れた増殖能力を有する、より長く持続する細胞を含むより存続可能な生成物をもたらす。

Claims (20)

1. （ｉ）５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中で細胞調製物をインキュベートすること、（ｉｉ）前記感光性化合物を除去するために（ｉ）の前記培地を押出し培地と交換すること、および（ｉｉｉ）前記感光性化合物を保持した細胞を選択的に死滅させるために前記押出し培地中の前記細胞調製物を照射することを含む光線力学的処理。
2. 前記押出し培地中の前記細胞調製物が少なくとも１×１０^８細胞を含む、請求項１に記載の光線力学的処理。
3. 前記押出し培養中の前記細胞の濃度が少なくとも２×１０^６細胞／ｍＬである、請求項１または２に記載の光線力学的処理。
4. ５マイクロモル以下の感光性化合物を含む前記培地中の前記細胞調製物が最初に混合リンパ球反応にかけられた、請求項１〜３に記載の光線力学的処理。
5. ５マイクロモル以下の感光性化合物を含む前記培地中の前記細胞調製物が１個体由来のＴリンパ球と、別の個体由来の非増殖性Ｔリンパ球とを含む、請求項１〜４に記載の光線力学的処理。
6. 前記１個体がドナーであり、および前記別の個体がレシピエントである、請求項５に記載の光線力学的処理。
7. 前記感光性化合物を保持した前記細胞がレシピエント活性化ドナー細胞、好ましくはアロ反応性Ｔリンパ球である、請求項１〜６に記載の光線力学的処理。
8. 前記感光性化合物がローダミンまたはローダミン誘導体である、請求項１〜７に記載の光線力学的処理。
9. 前記感光性化合物が以下のローダミンまたはローダミン誘導体：式：
   （式中：
   −Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、およびＲ_１０の１つはハロゲン原子を表し、残りのＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４の各々、および残りのＲ_１０基の各々は独立して水素、ハロゲン原子、アミノ、アシルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アザシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアミノ、アロイルアミノ、ジアリールアミノ、アリールアルキルアミノ、アラルキルアミノ、アルキルアラルキルアミノ、アリールアラルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルチオ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、シアン、ヒドロキシスルホニル、アミドスルホニル、ジアルキルアミドスルホニル、アリールアルキルアミドスルホニル、ホルミル、アシル、アロイル、アルキル、アルキレン、アルケニル、アリール、アラルキル、ビニル、アルキニル基からなる群からおよび対応する置換基によって選択され、
   −ｍ＝０〜１であり、
   −ｎ＝１〜４であり、
   −Ａは無、Ｏ、またはＮＨであり、
   −Ｒ_９はアルキレン基を表し、
   −ＺはＨ、アミノ、ジアルキルアミノ、またはトリアルキルアミノ塩であり、
   −Ｘ−は陰イオンであり、ならびに
   −Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８は独立してＨもしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり、またはＲ_５もしくはＲ_６との組み合わせのＲ_１、またはＲ_５もしくはＲ_６との組み合わせのＲ_２、またはＲ_７もしくはＲ_８との組み合わせのＲ_３、またはＲ_７もしくはＲ_８との組み合わせのＲ_４はアルキレンを表す）によって包含されるローダミン誘導体；または２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸メチルエステル；２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸エチルエステル；２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸オクチルエステル；２−（４，５−ジブロモ−６−アミノ−３−イミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸ｎ−ブチルエステル；２−（６−エチルアミノ−３−エチルイミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸ｎ−ブチルエステル；２，７−ジブロモローダミンＢメチルエステル；２，７−ジブロモローダミンＢヘキシルエステル；４，５−ジブロモローダミン６Ｇ；２’−（６−ジメチルアミノ−３−ジメチルイミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）４’，５’ジクロロ−安息香酸メチルエステル；４，５−ジブロモローダミン１１０ ２−（２−メトキシエトキシ）エチルエステルまたはローダミンＢ３−ブロモプロピルエステルの塩であるローダミン誘導体の１つである、請求項１〜８に記載の光線力学的処理。
10. 請求項１〜９に記載の光線力学的処理によって得られる細胞生成物。
11. ５マイクロモルを超える感光性化合物が用いられる処理によって得られる参照生成物と比較して、凍結および解凍後の白血球の回収率、白血球の生存率、生存Ｔ細胞含有量、２日間のＴ細胞生存または増殖曲線に関して改善されている、請求項１０に記載の細胞生成物。
12. アロ反応性Ｔ細胞が選択的に枯渇されたＴ細胞富化ドナーリンパ球調製物または癌細胞が枯渇された細胞調製物である、請求項１０または１１に記載の細胞生成物。
13. 移植片対宿主病を予防または処置するための方法における使用のための、請求項１０〜１２に記載の細胞生成物。
14. 癌を予防または治療するための方法における使用のための、請求項１０〜１２に記載の細胞生成物。
15. 請求項１０〜１４に記載の細胞生成物と医薬担体とを含む医薬組成物。
16. 移植片対宿主病を予防または処置するための方法における使用のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 癌を予防または処置するための方法における使用のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
18. 移植片対宿主病または癌を予防または処置するための方法における請求項１〜９に記載の光線力学的処理の使用。
19. 前記方法が（ｉ）５マイクロモル以下の感光性化合物を含む培地中で細胞調製物をインキュベートする、（ｉｉ）前記感光性化合物を除去するために（ｉ）の前記培地を押出し培地と交換する、および（ｉｉｉ）前記感光性化合物を保持した細胞を選択的に死滅させるために前記押出し培地中の前記細胞調製物を照射するｅｘ ｖｉｖｏステップを含む、細胞のｅｘ ｖｉｖｏ処置のための方法。
20. （ｉ）照射による細胞のｅｘ ｖｉｖｏ処置のための５マイクロモル以下の濃度での使用のための感光性化合物と、（ｉｉ）細胞の選択的染色をもたらす感光性化合物の除去のための押出し培地とを含むツールのキット。