JP2018504116A - 分枝状および線状のキメラ化合物、ポリヌクレオチド、使用およびそれらの調製方法 - Google Patents

分枝状および線状のキメラ化合物、ポリヌクレオチド、使用およびそれらの調製方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、核酸および非核酸部分の両方を含む、分枝状キメラ化合物および線状キメラ化合物、ならびにポリヌクレオチドに関する。本開示はまた、免疫応答を刺激するためのその使用、および分枝状キメラ化合物を調製するための方法に関する。（ｉ）薬学的に許容される賦形剤、ならびに（ｉｉ）本発明の分枝状キメラ化合物、本発明のポリヌクレオチド、および本発明の線状キメラ化合物からなる群のうちの１つを含む医薬組成物もまた提供される。

Description

関連出願の引用
本願は、２０１５年１月２３日に出願した米国仮出願第６２／１０７，２９１号の利益を主張する。この出願は、すべての目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
ＡＳＣＩＩテキストファイルとしての配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている：配列表のコンピューターで読み込み可能な形式（ＣＲＦ）（ファイル名：３７７８８２００５６４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録した日付：２０１６年１月２２日、サイズ：７ＫＢ）。
分野
本発明は、核酸および非核酸部分の両方を含有する分枝状および線状のキメラ化合物、ならびにポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、免疫応答を刺激するためのその使用、および分枝状キメラ化合物を調製するための方法に関する。
トール様受容体（ＴＬＲ）は、宿主分子から区別可能である、病原体関連分子パターンと呼ばれる保存された微生物分子を認識する膜貫通タンパク質のファミリーである。したがって、ＴＬＲは、自然免疫応答において重要な役割を果たす。ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、およびＴＬＲ１３は、核酸を検知するＴＬＲである。
ＴＬＲのアゴニストおよびアンタゴニストは、免疫応答のモジュレーションにおいて使用を見出す。ＴＬＲアゴニストは、典型的には免疫応答を刺激するのに使用され、一方、ＴＬＲアンタゴニストは、典型的には免疫応答を阻害するのに使用される（Gosuら、Molecules、１７巻：１３５０３〜１３５２９頁、２０１２年）。ＴＬＲ９は、様々な抗原提示細胞によって発現され、核酸内の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを認識する。よって、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドは、ＴＬＲ９を活性化するこれらの能力によってアジュバントを有効にすることができる。その上、非核酸部分、および核酸部分を含有する非メチル化ＣｐＧの両方を含有するキメラ化合物は、免疫応答を刺激することができる。
ＴＬＲ９アゴニストの効力は、核酸部分の長さ、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドに隣接する残基、および抗原提示細胞取込みの有効性に依存する（Marshallら、Nucleic Acids Research、３１巻：５１２２〜５１３３頁、２００３年）。複数のポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物が多価担体部分（例えば、多糖）に付着しているある特定の分枝状キメラ化合物は、非コンジュゲートポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物と比べて増強された免疫応答を誘発した（Marshallら、上記）。ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅがＦＩＣＯＬＬ（登録商標）として販売している高度に分枝状の親水性多糖は、分枝状キメラ化合物の多価担体部分として使用することができる。しかし、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）のコンジュゲーションにおいて使用される伝統的なリンカー部分は疎水性であり、それは、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を含有する合成中間体の沈殿を引き起こし得る。これは、分枝状キメラ化合物を製造するのに使用されるプロセス、および後続の、最終生成物を貯蔵する能力に負のインパクトを与える。さらに、合成ＴＬＲアゴニストの治療的有用性は、その毒性によって影響される。
強力な免疫刺激性活性を有するポリヌクレオチドおよびキメラ化合物が依然として必要とされている。その上、再現性よく製造することができる強力なキメラ化合物が依然として必要とされている。許容される毒性プロファイルを有するポリヌクレオチドおよびキメラ化合物が特に望ましい。
Gosuら、Molecules、１７巻：１３５０３〜１３５２９頁、２０１２年 Marshallら、Nucleic Acids Research、３１巻：５１２２〜５１３３頁、２００３年
本開示は、核酸および非核酸部分の両方を含有する分枝状および線状キメラ化合物、ならびにポリヌクレオチドに関する。本開示はまた、免疫応答を刺激するためのその使用、および分枝状キメラ化合物を調製するための方法に関する。
一態様では、本開示は、式（Ｉ）：［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ（Ｉ）の分枝状キメラ化合物を提供し、式中、Ｄは、ポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物であり；Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；ＰＥＧは、式−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−のものであり、式中、ｎは、２〜８０の整数であり；ｘは、３〜３００の整数であり；Ｆは、約１００，０００〜約７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、Ｄのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列：５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含み、ポリヌクレオチドは、長さが５０ヌクレオチド未満であり、ヌクレオチド同士間および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結（linkage）は、ホスホロチオエートエステル連結であり；Ｄの線状キメラ化合物は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含み、線状キメラ化合物は、５０未満のヌクレオチドを含有し、ヌクレオチド同士間、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である。一部の実施形態では、ｘは、２０〜３００、９０〜１５０、または１００〜１４０である。一部の実施形態では、Ｌ２は、
である。一部の実施形態では、Ｌ３は、
である。一部の実施形態では、Ｌ３は、
である。一部の実施形態では、式−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−のｎは、６、２４、４５、または７０である。一部の実施形態では、Ｆは、約３００，０００〜約５００，０００ダルトンの分子量を有する。一部の実施形態では、Ｆは、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＰＭ４００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが販売するポリマー）である。一部の実施形態では、Ｄは、ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）からなるポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｄは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）からなる線状キメラ化合物である。一部の実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−であり、ｍは、２〜９の整数である。一部の実施形態では、ｘは、２０〜２００である。一部の実施形態では、ｘは、９０〜１５０であり、ｎは、６であり、ｍは、３または６である。一部の実施形態では、ヌクレオチド同士間の連結、存在する場合、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の連結、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の連結のすべては、ホスホロチオエートエステル連結である。ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドまたは線状キメラ化合物の核酸部分は、非メチル化されている。
別の態様では、本開示は、ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号３）を含む単離ポリヌクレオチドであって、長さが５０ヌクレオチド未満であり、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、単離ポリヌクレオチドを提供する。関連した態様では、本開示は、ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含む単離ポリヌクレオチドであって、長さが５０ヌクレオチド未満であり、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、単離ポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）のヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２’−デオキシリボポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、連結のすべては、ホスホロチオエートエステル連結である。ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドは、非メチル化されている。
さらなる態様では、本開示は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号４）として２つの核酸部分および１つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含む線状キメラ化合物であって、５０未満のヌクレオチドを含有し、ヌクレオチド同士間およびヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、線状キメラ化合物を提供する。関連した態様では、本開示は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含む線状キメラ化合物であって、５０未満のヌクレオチドを含有し、ヌクレオチド同士間およびヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、線状キメラ化合物を提供する。一部の実施形態では、線状キメラ化合物は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）からなる。一部の実施形態では、核酸部分は、２’−デオキシリボポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、連結のすべては、ホスホロチオエートエステル連結である。
さらに、本開示は、（ｉ）薬学的に許容される賦形剤、および（ｉｉ）課題を解決するための手段の前記段落のうちのいずれかの分枝状キメラ化合物、ポリヌクレオチド、および線状キメラ化合物からなる群のうちの１つを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、分枝状キメラ化合物、ポリヌクレオチド、および線状キメラ化合物はそれぞれ、ヒト末梢血単核細胞によるＩＦＮ−アルファの産生を刺激すること；ヒトＢリンパ球によるＩＬ−６の産生を刺激すること；ならびにマウス脾細胞によるＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−６の一方または両方の産生を刺激することからなる群のうちの１つまたは複数を含む、哺乳動物白血球によるサイトカイン産生を刺激することができる。一部の実施形態では、分枝状キメラ化合物、ポリヌクレオチド、および線状キメラ化合物はそれぞれ、哺乳動物Ｂリンパ球の増殖を刺激することができる。一部の実施形態では、組成物は、滅菌溶液である。他の実施形態では、組成物は、滅菌凍結乾燥固体である。一部の実施形態では、組成物は、組成物中に存在する分枝状キメラ化合物、ポリヌクレオチド、および線状キメラ化合物に共有結合的に連結されていない抗原をさらに含む（例えば、抗原は、組成物中に存在する分枝状キメラ化合物、ポリヌクレオチド、または線状キメラ化合物にコンジュゲートされているのではなく、混合されている）。組成物中に存在する分枝状キメラ化合物、ポリヌクレオチド、および線状キメラ化合物。一部の実施形態では、抗原は、微生物抗原、アレルゲン、または腫瘍抗原である。一部の実施形態では、抗原は、単離または組換えタンパク質である。一部の実施形態では、組成物は、本質的にエンドトキシンフリーである。
その上、本開示は、哺乳動物被験体における免疫応答を刺激する方法であって、哺乳動物被験体における免疫応答を刺激するのに十分な量で上述した医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、免疫応答を刺激することは、ＩＦＮ−アルファ産生を刺激すること；ＩＬ−６産生を刺激すること；Ｂリンパ球増殖を刺激すること；インターフェロン経路関連遺伝子発現を刺激すること；化学誘引物質関連遺伝子発現を刺激すること；および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）成熟を刺激することからなる群のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、医薬組成物が抗原をさらに含む場合、免疫応答を刺激することは、抗原特異的抗体応答を誘導することを含み、抗原特異的抗体応答の力価は、抗原が分枝状キメラ化合物、ポリヌクレオチド、または線状キメラ化合物と組み合わせて投与されるとき、抗原が分枝状キメラ化合物、ポリヌクレオチド、または線状キメラ化合物無しで投与されるときより高い。一部の実施形態では、抗原特異的抗体応答の力価は、抗原が分枝状キメラ化合物と組み合わせて投与されるとき、抗原が対応する線状キメラ化合物とともに投与されるときより高い。
本開示は、ヒト患者などの哺乳動物被験体において上述した医薬組成物を使用するための複数の方法を提供する。一態様では、哺乳動物被験体における抗原特異的抗体応答を誘導するための方法であって、哺乳動物被験体における抗原特異的抗体応答を誘導するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法が提供されている。一態様では、哺乳動物被験体における感染疾患を防止するための方法であって、哺乳動物被験体における感染疾患を防止するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法が提供されている。一態様では、哺乳動物被験体における感染疾患を処置または防止するための方法であって、哺乳動物被験体における感染疾患を処置または防止するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法が提供されている。一態様では、哺乳動物被験体における感染疾患の症状を改善するための方法であって、哺乳動物被験体における感染疾患の症状を改善するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法が提供されている。一態様では、哺乳動物被験体におけるＩｇＥ関連障害の症状を改善するための方法であって、哺乳動物被験体におけるＩｇＥ関連障害の症状を改善するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法が提供されている。一態様では、哺乳動物被験体におけるＩｇＥ関連障害を処置または防止するための方法であって、哺乳動物被験体におけるＩｇＥ関連障害を処置または防止するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法が提供されている。一態様では、哺乳動物被験体におけるがんを処置するための方法であって、哺乳動物被験体におけるがんを処置するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法が提供されている。一部の実施形態では、がんを処置することは、固形腫瘍のサイズを縮小することを含む。一部の実施形態では、がんを処置することは、生存可能ながん細胞数を低減することを含む。一部の実施形態では、がんを処置することは、がん患者の生存期間を延長することを含む。一部の実施形態では、がんは、癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）である。一部の実施形態では、がんは、肉腫である。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、リンパ腫である。
さらに、本開示は、式（Ｉ）：［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ （Ｉ）の分枝状キメラ化合物を調製するための方法であって、式中、Ｄは、ポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物であり；Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり；ｘは、３〜３００の整数であり；Ｆは、約１００，０００〜約７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列：５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含み、ポリヌクレオチドは、長さが５０ヌクレオチド未満であり、ヌクレオチド同士間および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結であり；線状キメラ化合物は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含み、線状キメラ化合物は、５０未満のヌクレオチドを含有し、ヌクレオチド同士間、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結であり、この方法は、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物（式中、Ｄは、式（Ｉ）について定義した通りであり、Ｌ１ａは、（ＣＨ２）ｍであり、ｍは、２〜９の整数である）を式（ＩＩ）：［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ （ＩＩ）の化合物（式中、Ｌ３、ＰＥＧ、およびＦは、式（Ｉ）について定義した通りであり；Ｌ２ａは、
であり；ｙは、３〜３５０の整数である）と反応させることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ｘは、２０〜３００、９０〜１５０、または１００〜１４０であり；ｙは、２０〜３５０、３０〜３００、１５５〜２１５、または１６５〜２０５である。一部の実施形態では、本方法は、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＳ−Ｌ１ａ−ＯＨの化合物を還元剤と反応させて式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物を生成することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、式（ＩＩＩ）：［ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２］ｚ−Ｆ （ＩＩＩ）の化合物（式中、Ｆは、式（Ｉ）について定義した通りであり、ｚは、３〜４００の整数である）を、式Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−Ｌｖの化合物（式中、Ｌ２ａおよびＰＥＧは、式（ＩＩ）について定義した通りであり；Ｌ３ａは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｌｖは、脱離基である）と反応させて式（ＩＩ）の化合物を形成することをさらに含む。一部の実施形態では、ｚは、２０〜４００、５０〜３００、１９０〜２５０、または２００〜２４０である。一部の実施形態では、Ｌｖは、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシである。一部の実施形態では、方法Ｄは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）である。本開示の方法で使用するのに適したＤのポリヌクレオチドおよび線状キメラ化合物におけるバリエーションは、前記段落においてより完全に記載されている。
図１は、例示的な分枝状キメラ化合物、Ｄ５６−０５、（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）を調製するのに使用される製造スキームの流れ図を提供する。
図２は、例示的な分枝状キメラ化合物、Ｄ５６−０５、（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）の調製を例示する。
図３は、カルボキシメチル化ＦＩＣＯＬＬの調製の反応スキームを示す。
図４は、Ｎ−（２−アミノエチル）カルバミルメチル化ＦＩＣＯＬＬの調製の反応スキームを示す。
図５Ａ〜５Ｅは、スクシンイミジル−（（Ｎ−マレイミドプロピオンアミドール（maleimidopropionamidol））−ポリエチレングリコール）エステルおよびスクシンイミジル−（（Ｎ−マレイミドアルキル）−ポリエチレングリコール）エステルヘテロ二官能性リンカー（ＳＭ−ＰＥＧｎ）の化学構造を示す。
図６は、［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬの調製の反応スキームを示す。
図７は、［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬパイロットロット４および５のサイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー分析からの結果を提供する。Ａ１は、精製したパイロットロット４からのものであり、Ａ２は、粗製のパイロットロット４からのものであり、Ｂ１は、精製したパイロットロット５からのものであり、Ｂ２は、粗製のパイロットロット５からのものである。それぞれの四半分における上側および下側のクロマトグラムは、それぞれ２１５ｎｍおよび２６０ｎｍにおける検出を表す。［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬは、約７．２分で溶出した。未反応の試薬および低分子は、約１１．２〜１７．３分に溶出した。
図８は、Ｄ５６−０２（配列番号２）からのＤ５６−０３（配列番号２）の調製の反応スキームを示し、これらは、その３’エンドにおいて非ヌクレオチド部分が異なる。
図９Ａ〜Ｄは、精製したＤ５６−０３のサイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー分析からの結果を提供する。図９Ａは、パイロットロット４からのものであり、図９Ｂは、パイロットロット５パート１からのものであり、図９Ｃは、パイロットロット５パート２からのものであり、図９Ｄは、組み合わせたパイロットロット５からのものである。Ｄ５６−０３の保持時間は、１２．２分であった。ＴＣＥＰ（（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を対照としてランさせ、１４．６分の保持時間で単一ピークとして溶出した。
図１０は、Ｄ５６−０５の調製の反応スキームを示す。
図１１Ａ〜Ｅは、Ｄ５６−０５ナノ粒子が、単量体Ｄ５６−０１と比較して、ＩＦＮ調節、ケモカイン、サイトカイン、および経内皮遊走関連遺伝子の発現を増強し、注射部位筋肉内の細胞動員の増強をもたらすことを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６／群）にＤ５６−０５またはＤ５６−０１ １０ｍｇ（ＣｐＧ−ＯＤＮに基づく用量）をｉ．ｍ．注射した。注射部位筋肉を注射の６時間後に収集してＩＦＮ調節（図１１Ａ）、ケモカイン（図１１Ｂ）、サイトカイン（図１１Ｃ）、および経内皮遊走関連（図１１Ｄ）遺伝子発現を査定した。ＰＢＳ注射対照と比べた遺伝子発現をΔΔＣｔ評価（２−ΔΔＣｔ）によって判定した。データは、単一実験からの９５％ＣＩを伴った個々の試料の平均として示されている（図１１Ｅ）。１２〜２４時間におけるＤ５６−０５注射対Ｄ５６−０１注射マウス（１０ｍｇ）の筋肉内の様々な細胞集団の相対的割合（全細胞に対して正規化した）をフローサイトメトリーによって評価した。リンパ球の光散乱ゲーティングおよび除外の後（ＣＤ３／ＣＤ１９／ＣＤ４９ｂダンプチャネル）、細胞集団を以下の通り同定した：マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−／Ｆ４／８０＋／Ｌｙ６Ｃ＋／Ｌｙ６Ｇ−）、単球（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−／Ｆ４／８０−／Ｌｙ６Ｃ＋／Ｌｙ６Ｇ−）、好中球（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−／Ｌｙ６Ｇ＋）、全ＣＤ１１ｂ＋細胞、およびｃＤＣ（ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ１１ｃ＋）。ＳＥＭを伴った平均として示したデータは、２つの独立した実験のアベレージである。 図１１Ａ〜Ｅは、Ｄ５６−０５ナノ粒子が、単量体Ｄ５６−０１と比較して、ＩＦＮ調節、ケモカイン、サイトカイン、および経内皮遊走関連遺伝子の発現を増強し、注射部位筋肉内の細胞動員の増強をもたらすことを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６／群）にＤ５６−０５またはＤ５６−０１ １０ｍｇ（ＣｐＧ−ＯＤＮに基づく用量）をｉ．ｍ．注射した。注射部位筋肉を注射の６時間後に収集してＩＦＮ調節（図１１Ａ）、ケモカイン（図１１Ｂ）、サイトカイン（図１１Ｃ）、および経内皮遊走関連（図１１Ｄ）遺伝子発現を査定した。ＰＢＳ注射対照と比べた遺伝子発現をΔΔＣｔ評価（２−ΔΔＣｔ）によって判定した。データは、単一実験からの９５％ＣＩを伴った個々の試料の平均として示されている（図１１Ｅ）。１２〜２４時間におけるＤ５６−０５注射対Ｄ５６−０１注射マウス（１０ｍｇ）の筋肉内の様々な細胞集団の相対的割合（全細胞に対して正規化した）をフローサイトメトリーによって評価した。リンパ球の光散乱ゲーティングおよび除外の後（ＣＤ３／ＣＤ１９／ＣＤ４９ｂダンプチャネル）、細胞集団を以下の通り同定した：マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−／Ｆ４／８０＋／Ｌｙ６Ｃ＋／Ｌｙ６Ｇ−）、単球（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−／Ｆ４／８０−／Ｌｙ６Ｃ＋／Ｌｙ６Ｇ−）、好中球（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−／Ｌｙ６Ｇ＋）、全ＣＤ１１ｂ＋細胞、およびｃＤＣ（ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ１１ｃ＋）。ＳＥＭを伴った平均として示したデータは、２つの独立した実験のアベレージである。
図１２Ａ〜Ｂは、Ｄ５６−０５のアジュバント効果がＴＬＲ９発現に依存することを示す。図１２Ａでは、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）またはＴＬＲ９２／２マウス（ｎ＝６）にＤ５６−０５ １０ｍｇをｉ．ｍ．注射し、注射部位筋肉を注射の６時間後に収集して遺伝子発現を判定した。個々の遺伝子誘導倍率をＰＢＳ注射対照と比べて計算した。データは、ＳＥＭを伴った平均として示されている。図１２Ｂでは、Ｃ５７ＢＬ／６またはＴＬＲ９２／２マウス（ｎ＝８〜１０）に、Ｄ５６−０５ １０ｍｇと組み合わせてｒＰＡ ５ｍｇをｉ．ｍ．免疫した。１４日目におけるＴＮＡ力価レベルが平均として示されている。＊＊＊マン−ホイットニーＵ検定によってｐ＜０．００１
図１３Ａ〜Ｃは、Ｄ５６−０５ナノ粒子がＩＦＮ調節、ケモカイン、およびサイトカイン遺伝子を増強することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）にＤ５６−０５またはＤ５６−０１ １０ｍｇをｓ．ｃ．免疫した。膝窩リンパ節を免疫化の１８時間後に収集してＩＦＮ調節（図１３Ａ）、ケモカイン（図１３Ｂ）、およびサイトカイン（図１３Ｃ）遺伝子発現を査定した。ＰＢＳ注射対照と比べた遺伝子発現をΔΔＣｔ評価（２−ΔΔＣｔ）によって判定した。データは、単一実験からの９５％ＣＩを伴った個々の試料の平均として示されている。
図１４は、Ｄ５６−０５ナノ粒子が流入領域リンパ節内で細胞動員を増強することを示す。ｒＰＡ １０または２ｍｇと組み合わせてＤ５６−０５またはＤ５６−０１ １０ｍｇを４８時間前に足蹠にｓ．ｃ．免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４〜６）の膝窩リンパ節内の異なる細胞集団の相対的割合をフローサイトメトリーによって分析した。光散乱ゲーティング後に、細胞集団を以下の通り同定した：Ｔ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ１９−）、Ｂ細胞（ＣＤ３−／ＣＤ１９＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ３−／ＣＤ１９−／ＣＤ４９ｂ＋）、ならびに以下のＣＤ３−／ＣＤ１９−／ＣＤ４９ｂ−細胞集団：ｃＤＣ（ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ＩＩ＋）、ｐＤＣｓ（ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ＩＩ＋／ＰＤＣＡ１＋、またはＢ２２０＋）、ｍＤＣｓ（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ＩＩ＋）、骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−／ＭＨＣ ＩＩ＋）、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−／ＭＨＣ ＩＩ＋／Ｆ４／８０＋／Ｌｙ６Ｃ＋／Ｌｙ６Ｇ−）、単球（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−／ＭＨＣ ＩＩ＋／Ｆ４／８０−／Ｌｙ６Ｃ＋／Ｌｙ６Ｇ−）、および好中球（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−／Ｌｙ６Ｇ＋）。データは、ＳＥＭを伴った平均として示されており、４つの独立した実験を代表する。
図１５Ａ〜Ｄは、ｒＰＡ／Ｄ５６−０５ワクチン接種は、サルにおいて抗ｒＰＡ Ａｂ応答の急速な誘導および持続性のメモリーをもたらすことを例示する。Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ（ｎ＝３〜６／群）に、０および２８日目に、単独で、あるいはＤ５６−０５ １０００、２５０、もしくは５０ｍｇ、またはＤ５６−０１ １０００もしくは２５０ｍｇと組み合わせてｒＰＡ １０ｍｇをｉ．ｍ．免疫した（↓）。すべてのサルは、最初の免疫化の２３週間後にｒＰＡ ２５ｍｇ単独を受けた（↓）。ＴＮＡおよび抗ｒＰＡ ＩｇＧ力価レベルを最初の免疫化後２５週間にわたって監視した。図１５Ａ〜Ｂでは、最初の免疫化の２週間後の力価が、９５％ ＣＩを伴った平均として示されており、３つの独立した実験を代表する。Ｄｕｎｎ事後検定を伴ったクラスカル−ウォリスによって＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図１５Ｃは、最初の免疫化の２週間後の抗ｒＰＡ ＩｇＧレベルとＴＮＡ力価レベルとの相関を例示する。スピアマン順位相関。図１５Ｄは、研究全体にわたって監視したＴＮＡ力価データ（平均）を示す。
図１６Ａ〜Ｃは、ｒＰＡ／Ｄ５６−０５ワクチン接種が、サル予防的炭疽チャレンジモデルにおいて強力なメモリー応答を誘導し、エアロゾル化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子でのチャレンジからの完全な保護を媒介することを例示する。Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ（ｎ＝６〜８／群）に、０および／または２９日目（１３または２３）にＤ５６−０５ １０００または２５０ｍｇと組み合わせたｒＰＡ １０ｍｇをｉ．ｍ．免疫した（↓）。ワクチン接種されていない動物の群（ｎ＝６）も含めた。すべてのサルを、６９、７０、または７１日目にエアロゾル化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子の２００ ＬＤ５０当量の標的用量に曝露した（↓）。図１６Ａでは、生存時間をチャレンジ後２８日にわたって１日２回監視した。図１６Ｂでは、ＴＮＡ力価レベルを研究全体にわたって、かつチャレンジ後４週間にわたって監視した。データは、９５％ ＣＩを伴った平均として示されている。Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ（ｎ＝４〜６）に、０および２８日目に、単独で、またはＤ５６−０５ １０００、５０、２０、もしくは５ｍｇと組み合わせてｒＰＡ １０ｍｇで免疫した（↓）。すべてのサルは、最初の免疫化の１０週間後にｒＰＡ ２５ｍｇ単独を受けた（↓）。図１６Ｃでは、ＴＮＡ力価レベルを１２週間にわたって監視し、力価を平均として示した。 図１６Ａ〜Ｃは、ｒＰＡ／Ｄ５６−０５ワクチン接種が、サル予防的炭疽チャレンジモデルにおいて強力なメモリー応答を誘導し、エアロゾル化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子でのチャレンジからの完全な保護を媒介することを例示する。Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ（ｎ＝６〜８／群）に、０および／または２９日目（１３または２３）にＤ５６−０５ １０００または２５０ｍｇと組み合わせたｒＰＡ １０ｍｇをｉ．ｍ．免疫した（↓）。ワクチン接種されていない動物の群（ｎ＝６）も含めた。すべてのサルを、６９、７０、または７１日目にエアロゾル化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子の２００ ＬＤ５０当量の標的用量に曝露した（↓）。図１６Ａでは、生存時間をチャレンジ後２８日にわたって１日２回監視した。図１６Ｂでは、ＴＮＡ力価レベルを研究全体にわたって、かつチャレンジ後４週間にわたって監視した。データは、９５％ ＣＩを伴った平均として示されている。Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ（ｎ＝４〜６）に、０および２８日目に、単独で、またはＤ５６−０５ １０００、５０、２０、もしくは５ｍｇと組み合わせてｒＰＡ １０ｍｇで免疫した（↓）。すべてのサルは、最初の免疫化の１０週間後にｒＰＡ ２５ｍｇ単独を受けた（↓）。図１６Ｃでは、ＴＮＡ力価レベルを１２週間にわたって監視し、力価を平均として示した。
図１７Ａ〜Ｂは、ｒＰＡ／Ｄ５６−０５免疫化がマウスにおいてより大きい一次および二次ＴＮＡ力価応答を誘導することを例示する。スイスウェブスターマウス（ｎ＝２５／群）に、０および２９日目に、単独で、またはＤ５６−０５もしくはＤ５６−０１ ２もしくは０．５ｍｇと組み合わせてｒＰＡ ５ｍｇで免疫した。ＴＮＡ力価レベルを（図１７Ａ）第１の免疫化の４週間後および（図１７Ｂ）第２の免疫化の２週間後に査定した。データは、９５％ ＣＩを伴った平均として示されている。Ｄｕｎｎ事後検定を伴ったクラスカル−ウォリスによって＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
図１８は、Ｄ５６−０５ナノ粒子が注射部位および流入領域リンパ節において保持されることを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）にＤ５６−０５またはＤ５６−０１ １００ｍｇをｉ．ｍ．注射した。注射部位筋肉、流入領域リンパ節（膝窩、鼠径部、坐骨、腰椎、および仙椎）、脾臓、肝臓、ならびに腎臓内のオリゴヌクレオチド含有量（組織１グラム当たりのマイクログラム）を、注射して１日後に査定した。データは、平均で示されており、２つの独立した実験を代表する。
図１９は、１〜４用量（１００μｇ）のＤＶ５６−０５またはＤＶ５６−０１を投与されたマウスの経時的な体重を示すプロットを提供する。
図２０は、Ｄ５６−０５またはＤ５６−３０を受けたマウスの腫瘍サイズを示すプロットを提供する。簡単に説明すると、約１００万Ｅ．Ｇ−７ ＯＶＡ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２１１３）をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部中に皮下注射した。研究日０（細胞を移植して４日後）に開始して、マウスにＰＢＳ １５０μＬの体積中のＤ５６−０５または対照非ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｄ５６−３０）５０マイクログラム（ｍｃｇ）を腫瘍内に（すなわち、確立された腫瘍塊中に）注射した。注射は、０、３、および７日目に投与した。マウスを観察し、腫瘍サイズ（体積）を示した通りに測定した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡは、ニワトリオボアルブミンを構成的に分泌する、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスリンパ腫細胞株ＥＬ４に由来するトランスジェニック細胞株である。
詳細な説明
本発明は、ポリヌクレオチド、ならびに核酸および非核酸部分の両方を含有する線状および分枝状キメラ化合物に関する。本発明はまた、免疫応答を刺激するためのその使用、および分枝状キメラ化合物を調製するための方法に関する。
一般的な方法および定義
本開示の実践では、別段に示されていない限り、当技術分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来の技法を使用することになる。このような技法は、文献に完全に記載されている。例えば、Animal Cell Culture、６版（Freshney、Wiley-Blackwell、２０１０年）；Antibodies, A Laboratory Manual、第２版（Greenfield編、Cold Spring Harbor Publications、２０１３年）；Bioconjugate Techniques、第３版（Hermanson、Academic Press、１９９６年）；Current Protocols in Cell Biology（Bonifacinoら編、John Wiley & Sons, Inc.、１９９６年、２０１４年にかけての補遺を含む）；Current Protocols in Immunology（Coliganら編、John Wiley & Sons, Inc.、１９９１年、２０１４年にかけての補遺を含む）；Current Protocols in Molecular Biology（Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc.、１９８７年、２０１４年にかけての補遺を含む）；Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry（Egliら編、John Wiley & Sons, Inc.、２０００年、２０１４年にかけての補遺を含む）；Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版（SambrookおよびRussell、Cold Spring Harbor Laboratory Press、２００１年）；Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第４版（GreenおよびSambrook、Cold Spring Harbor Laboratory Press、２０１２年）；Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications（Herdewijn編、Humana Press、２００４年）；Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties（Agrawal編、Humana Press、１９９３年）；ならびにUsing Antibodies: A Laboratory Manual（HarlowおよびLane、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９９８年）を参照。
本明細書で互換的に使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド、またはこれらの組合せを含む。ポリヌクレオチドは、線状、分枝状、もしくは環状に構成され得、またはポリヌクレオチドは、１つもしくは複数の線状、分枝状、および／または環状セグメントを含有し得る。ポリヌクレオチドは、一般にホスホジエステル連結によって接合されたヌクレオシドのポリマーであるが、ホスホロチオエートエステルなどの代替の連結（linkage）も使用され得る。ヌクレオシドは、糖に結合した（bonded）プリン（アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）、またはその誘導体）あるいはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、もしくはウラシル（Ｕ）、またはその誘導体）塩基からなる。ＤＮＡ中の４つのヌクレオシド単位（または塩基）は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、およびデオキシシチジンと呼ばれる。ＲＮＡ中の４つのヌクレオシド単位（または塩基）は、アデノシン、グアノシン、ウリジン、およびシチジンと呼ばれる。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。
本開示のポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、および分枝状キメラ化合物は、１４〜５０個のヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、ヌクレオチドの数は、（下限）１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、または４５より大きい。一部の実施形態では、ヌクレオチドの数は、（上限）５１、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０未満である。すなわち、ヌクレオチドの数は、下限が上限未満である約１４〜５０の範囲内である。
用語「３’」は一般に、同じポリヌクレオチド中の別の領域または位置から３’側の（下流の）ポリヌクレオチド中の領域または位置を指す。
用語「５’」は一般に、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の別の領域または位置から５’側の（上流の）ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の領域または位置を指す。
用語「個体」および「被験体」は、哺乳動物を指す。「哺乳動物」としては、それだけに限らないが、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、家畜、競技動物、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ならびにペット（例えば、イヌおよびネコ）がある。
用語「抗原」は、抗体またはＴ細胞抗原受容体によって特異的に認識および結合される物質を指す。抗原として、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、複合炭水化物、糖、ガングリオシド、脂質、およびリン脂質；これらの部分、ならびにこれらの組合せを挙げることができる。本開示の組成物中に存在する場合の抗原は、合成であり得、または自然から単離することができる。本開示の方法における投与に適した抗原は、抗原特異的Ｂ細胞またはＴ細胞応答を誘発することができる任意の分子を含む。ハプテンは、「抗原」の射程内に含まれる。「ハプテン」は、それ自体で免疫原性でないが、より大きい免疫原性分子（担体）とコンジュゲートされるとき免疫原性にされる低分子量化合物である。
「ポリペプチド抗原」として、精製天然ペプチド、合成ペプチド、組換えペプチド、粗製ペプチド抽出物、または部分的に精製された、もしくは未精製の活性状態にあるペプチド（減弱されたもしくは不活化されたウイルス、微生物、もしくは細胞の一部であるペプチドなど）、あるいはこのようなペプチドの断片を挙げることができる。ポリペプチド抗原は、好ましくは長さが少なくとも６アミノ酸残基である。
本明細書では、用語「免疫原性の」は、哺乳動物被験体に適当な条件下で投与すると適応免疫応答を誘発する作用物質（例えば、ポリペプチド抗原）を指す。免疫応答は、Ｂ細胞（体液性）および／またはＴ細胞（細胞性）応答であり得る。
「アジュバント」は、抗原などの免疫原性剤と混合されたとき、混合物に曝露されるとレシピエントにおいて作用物質に対する免疫応答を非特異的に増強または強化する物質を指す。
用語「アゴニスト」は、最も広い意味で使用され、受容体を通じたシグナル伝達を活性化する任意の分子を含む。例えば、ＴＬＲ９アゴニストは、ＴＬＲ９受容体に結合し、ＴＬＲ９シグナル伝達経路を活性化する。
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味で使用され、アゴニストの生物活性を遮断する任意の分子を含む。例えば、ＴＬＲ９アンタゴニストは、ＴＬＲ９シグナル伝達経路を遮断する。
用語「免疫刺激性配列」および「ＩＳＳ」は、測定可能な免疫応答（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ ｖｉｖｏで測定される）を刺激する核酸配列を指す。本開示の目的に関して、用語ＩＳＳは、非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含む核酸配列を指す。反対に、用語「免疫阻害性配列」および「ＩＩＳ」は、測定可能な免疫応答（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ ｖｉｖｏで測定される）を阻害する核酸配列を指す。測定可能な免疫応答の例としては、それだけに限らないが、抗原特異的抗体産生、サイトカイン分泌、リンパ球活性化、およびリンパ球増殖がある。
用語「ＣｐＧ」および「ＣＧ」は、リン酸によって分離されたシトシンおよびグアニンを指すのに本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、シトシンおよびグアニンの塩基対合とは対照的に線状配列を指す。本開示のポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、および分枝状キメラ化合物は、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する。すなわち、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンは、メチル化されていない（すなわち、５−メチルシトシンでない）。
用語「アンチセンス」および「アンチセンス配列」は、本明細書では、ｍＲＮＡのコード鎖に相補的な配列を有するポリヌクレオチドの非コード鎖を指す。好適な実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、アンチセンス配列またはＲＮＡｉ分子（ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）でない。すなわち、好適な実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、これらが使用されることになる哺乳動物被験体の転写物（または遺伝子）と有意な相同性（または相補性）を有さない。例えば、ヒト被験体における免疫応答をモジュレートするための本開示のポリヌクレオチドは、その長さにわたってヒトゲノムの核酸配列と好ましくは８０％未満同一である（例えば、長さが５０ヌクレオチドであるポリヌクレオチドは、ヒト転写物と５０塩基のうちの４０塩基以下を共有する）。すなわち、好適な実施形態では、ポリヌクレオチドは、これらが使用されることになる哺乳動物被験体（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなど）の核酸配列と８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、または２０％未満同一である。
応答またはパラメータの「刺激」は、目的のパラメータを除いてその他は同じ条件と比較したとき、または代わりに、別の条件と比較してその応答またはパラメータを誘発および／または増強することを含む（例えば、ＴＬＲアゴニストの非存在下と比較してＴＬＲアゴニストの存在下でＴＬＲシグナル伝達を増大させる）。例えば、免疫応答の「刺激」は、応答の増大を意味する。
応答またはパラメータの「阻害」は、目的のパラメータを除いてその他は同じ条件と比較したとき、または代わりに、別の条件と比較してその応答またはパラメータを遮断および／または抑制することを含む（例えば、ＴＬＲアンタゴニストの非存在下でのＴＬＲアゴニストの存在と比較してＴＬＲアゴニストおよびＴＬＲアンタゴニストの存在下でＴＬＲシグナル伝達を低下させる）。例えば、免疫応答の「阻害」は、応答の低下を意味する。
本明細書に開示の作用物質の「有効量」は、具体的に述べた目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、述べた目的に関して経験的に、かつ慣例的な様式で判定され得る。作用物質の「有効量」または「十分な量」は、有益な臨床結果を含めた有益な結果などの所望の生物学的効果をもたらすのに十分な量である。用語「治療有効量」は、被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）における疾患または障害を「処置する」のに有効な作用物質（例えば、ＴＬＲ阻害剤）の量を指す。アレルギーの場合では、治療有効量の作用物質は、アレルギーの徴候または症状を低減する。
用語、疾患を「処置すること」または疾患の「処置」は、疾患の徴候または症状を軽減する目的で個体（ヒトまたはその他）に１種または複数種の薬物を投与することを含み得るプロトコールを実行することを指す。よって「処置すること」または「処置」は、徴候または症状の完全な軽減を要求せず、治癒を要求せず、個体に対する緩和効果のみを有するプロトコールを具体的に含む。本明細書では、かつ当技術分野でよく理解されている通り、「処置」は、臨床結果を含めた有益なまたは所望の結果を得るための手法である。有益なまたは所望の臨床結果としては、それだけに限らないが、検出可能であっても検出不可能であっても、１つまたは複数の症状の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化でない）状態、疾患の蔓延の防止、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および緩解（部分的であっても全体的であっても）がある。「処置」は、処置を受けていない個体の予期される生存時間と比較した生存時間の延長も意味し得る。
疾患または障害を「緩和すること」は、予期される未処置の転帰と比較して、疾患もしくは障害の程度および／もしくは望ましくない臨床的顕在化が小さくなり、かつ／または疾患もしくは障害の進行の経時変化が減速されることを意味する。特にアレルギーの場面では、緩和は、アレルゲン（複数可）に対してＴｈ１免疫応答を刺激すると起こり得る。さらに、緩和は、必ずしも一用量の投与によって起こる必要はなく、一連の用量を投与すると起こることが多い。よって、応答または障害を緩和するのに十分な量は、１回または複数回の用量で投与することができる。
本明細書では、かつ添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段に示されていない限りまたは脈絡から明らかでない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、「ポリヌクレオチド（a polynucleotide）」は、１個または複数個のポリヌクレオチドを含む。
「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータの変動を記述する。例えば、約４００，０００ダルトンの分子量に言及する記述は、３６０，０００〜４４０，０００ダルトンの分子量を包含する。
「含む（comprising）」として本明細書に記載された態様および実施形態は、実施形態「からなる」および「から本質的になる」を含む（include）ことが理解される。
Ｉ．ポリヌクレオチドおよびキメラ化合物
本開示は、とりわけ、ヒト患者などの哺乳動物被験体における免疫応答をモジュレートするのに有用なポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、および分枝状キメラ化合物を提供する。本開示は、核酸部分が、単離ポリヌクレオチドとして提示される場合、感知できる免疫調節性活性を呈さない（例えば、劣るまたは測定不可能な活性）配列を有する場合においてを含めて、非核酸スペーサー部分および／またはポリマー担体に共有結合的に結合した核酸部分を含有する一部のキメラ化合物は、免疫調節性活性を有する（特にヒト細胞内で）という発見に部分的に基づく。一部の実施形態では、免疫刺激性活性を含む免疫調節性活性。他の実施形態では、免疫抑制性活性を含む免疫調節性活性。
Ａ．ポリヌクレオチド
一態様では、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが提供されている。ポリヌクレオチドは、免疫応答を刺激することができ、または免疫応答を刺激するためのキメラ化合物を構成する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号３）を含むポリヌクレオチドが提供されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドが提供されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、長さが５０ヌクレオチド未満である（すなわち、ポリヌクレオチドは、５０未満のヌクレオチドを含有する）。一部の実施形態では、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である。一部の実施形態では、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホジエステル連結である。好適な実施形態では、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号３）または５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）は、ポリヌクレオチドの５’末端に位置している（すなわち、任意の追加のヌクレオチドは、３’末端に付加される）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）のヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２’−デオキシリボポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ヌクレオチド同士間の連結のすべては、ホスホロチオエートエステル連結である。
Ｂ．線状キメラ化合物
別の態様では、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸部分を含む線状キメラ化合物が提供されている。線状キメラ化合物は、免疫応答を刺激することができ、または免疫応答を刺激するための分枝状キメラ化合物を構成する。一部の実施形態では、核酸部分および非核酸スペーサー部分を含む線状キメラ化合物が提供されている。一部の実施形態では、線状キメラ化合物は、式Ｎ１−Ｓｐ１−Ｎ２またはＮ１−Ｓｐ１−Ｎ２−Ｓｐ２−Ｎ３（式中、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３は、核酸部分であり、Ｓｐ１およびＳｐ２は、非核酸スペーサー部分であり、Ｓｐ１およびＳｐ２は、正確に２つの核酸部分に共有結合的に結合している）を有するコア構造を含む。これらの実施形態の一部では、線状キメラ化合物は、式（５’−Ｎ１−３’）−Ｓｐ１−（５’−Ｎ２−３’）のコア構造を含む。これらの実施形態の一部では、線状キメラ化合物は、式（５’−Ｎ１−３’）−Ｓｐ１−（５’−Ｎ２−３’）−Ｓｐ２−（５’−Ｎ３−３’）のコア構造を含む。一部の実施形態では、スペーサー部分は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）である。一部の実施形態では、線状キメラ化合物は、５０未満のヌクレオチドを含有する（すなわち、Ｎ１、Ｎ２、および任意選択でＮ３の和は、５０未満である）。一部の実施形態では、各核酸部分Ｎは、長さが８ヌクレオチド未満、好ましくは長さが７ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号４）として２つの核酸部分および１つのヘキサエチレングリコールスペーサーを含む線状キメラ化合物であって、５０未満のヌクレオチドを含有し（すなわち、Ｎ１およびＮ２の和は、５０未満である）、ヌクレオチド同士間およびヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、線状キメラ化合物が提供されている。一部の実施形態では、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコールスペーサーを含む線状キメラ化合物であって、５０未満のヌクレオチドを含有し（すなわち、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３の和は、５０未満である）、ヌクレオチド同士間およびヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、線状キメラ化合物が提供されている。一部の実施形態では、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号４）または５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）は、線状キメラ化合物の５’末端に位置している（すなわち、任意の追加のヌクレオチドは、３’末端に付加される）。一部の実施形態では、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）からなる線状キメラ化合物が提供されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホジエステル連結である。一部の実施形態では、ヌクレオチド間連結、およびヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の連結のすべては、ホスホロチオエートエステル連結である。一部の実施形態では、線状キメラ化合物の核酸部分は、２’−デオキシリボポリヌクレオチドである。線状キメラ化合物の核酸部分のＣｐＧジヌクレオチドは、非メチル化されている。
本開示は、
５’−ＴＣＧＴＴＣＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＴＴＣＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号９）（Ｄ５６−１６）、
５’−ＴＣＧＴＴＣＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＴＴＣＧ−３’（配列番号１０）（Ｄ５６−１７）、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号１１）（Ｄ５６−１８）、
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号１２）（Ｄ５６−１９）、
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号１３）（Ｄ５６−２０）、
５’−ＴＣＧＡＴＣＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＡＴＣＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号１４）（Ｄ５６−２１）、
５’−ＴＣＧＴＣＧＴ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＴＣＧＴ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号１５）（Ｄ５６−２２）、および
５’−ＴＣＧＴＣＧＴ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＴＣＧＴ−３’（配列番号１６）（Ｄ５６−２３）からなる群のうちの１つを含む線状キメラ化合物をさらに提供する。これらの実施形態の一部では、線状キメラ化合物は、５０未満のヌクレオチドを含有し、ヌクレオチド配列の５’−ＴＣＧ−３’は、線状キメラ化合物の５’末端に位置している（すなわち、任意の追加のヌクレオチドは、３’末端に付加される）。一部の実施形態では、ヌクレオチド同士間およびヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である。一部の実施形態では、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホジエステル連結である。一部の実施形態では、ヌクレオチド間連結およびヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の連結のすべては、ホスホロチオエートエステル連結である。一部の実施形態では、線状キメラ化合物の核酸部分は、２’−デオキシリボポリヌクレオチドである。線状キメラ化合物の核酸部分のＣｐＧジヌクレオチドは、非メチル化されている。
Ｃ．分枝状キメラ化合物
本開示の分枝状キメラ化合物は、ポリエチレングリコールを介して、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーに共有結合的に連結しているポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物を含む。ポリエチレングリコールを含有する本開示の分枝状キメラ化合物のマレイミド活性化ＦＩＣＯＬＬ中間体は、以前に開示された分枝状キメラ化合物の中間体と比較して、溶解性および安定性が改善されている。よって、本開示の分枝状キメラ化合物は、Ｄｙｎａｖａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの米国特許第８，５９７，６６５号、同第８，１１４，４１８号、および同第７，７８５，６１０号に記載の分枝状キメラ化合物Ｃ−１３７およびＣ−１３８と比較して、製造可能性および貯蔵性が改善されている。本開示の分枝状キメラ化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで強力な免疫調節性活性（例えば、免疫刺激性または免疫抑制性活性）および低毒性も有する。
一部の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）：
［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ （Ｉ）
の分枝状キメラ化合物を提供し、式中、
Ｄは、ポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物であり；
Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり；
ｘは、３〜３００の整数であり；
Ｆは、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである。式（Ｉ）の分枝状キメラ化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ならびに様々なリンカーＬ１、Ｌ２、およびＬ３を介して多価部分Ｆに連結した３つまたはそれ超のポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物Ｄを含む。Ｄのポリヌクレオチド、または線状キメラ化合物の核酸部分は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、Ｄは、ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’を含むポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｄは、ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号３）を含むポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｄは、ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｄのポリヌクレオチドは、長さが５０ヌクレオチド未満である（すなわち、Ｄのポリヌクレオチドは、５０未満のヌクレオチドを含有する）。一部の実施形態では、ヌクレオチド同士間およびＤの３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である。一部の実施形態では、Ｄの５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号３）または５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）は、ポリヌクレオチドの５’末端に位置している（すなわち、任意の追加のヌクレオチドは、３’末端に付加される）。一部の実施形態では、Ｄは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｄのポリヌクレオチドは、一本鎖である。一部の実施形態では、Ｄのポリヌクレオチドは、２’−デオキシリボポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホジエステル連結である。一部の実施形態では、ヌクレオチド同士間の連結およびＤの３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の連結のすべては、ホスホロチオエートエステル連結である。ＤのポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドは、非メチル化されている。
一部の実施形態では、Ｄは、核酸部分および非核酸スペーサー部分を含む線状キメラ化合物である。一部の実施形態では、線状キメラ化合物は、式Ｎ１−Ｓｐ１−Ｎ２またはＮ１−Ｓｐ１−Ｎ２−Ｓｐ２−Ｎ３（式中、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３は、核酸部分であり、Ｓｐ１およびＳｐ２は、非核酸スペーサー部分であり、Ｓｐ１およびＳｐ２は、正確に２つの核酸部分に共有結合的に結合している）を有するコア構造を含む。これらの実施形態の一部では、線状キメラ化合物は、式（５’−Ｎ１−３’）−Ｓｐ１−（５’−Ｎ２−３’）のコア構造を含む。これらの実施形態の一部では、線状キメラ化合物は、式（５’−Ｎ１−３’）−Ｓｐ１−（５’−Ｎ２−３’）−Ｓｐ２−（５’−Ｎ３−３’）のコア構造を含む。一部の実施形態では、Ｎ１は、配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’を有する。一部の実施形態では、Ｎ２は、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’を有する。一部の実施形態では、Ｎ３は、配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’を有する。一部の実施形態では、Ｎ１は、配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’を有し、Ｎ２は、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’を有する。一部の実施形態では、Ｎ１は、配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’を有し、Ｎ２は、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’を有し、Ｎ３は、配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’を有する。これらの実施形態の一部では、スペーサー部分は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）である。一部の実施形態では、Ｓｐ１は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）である。一部の実施形態では、Ｓｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）である。一部の実施形態では、Ｄの線状キメラ化合物は、５０未満のヌクレオチドを含有する（すなわち、Ｎ１、Ｎ２、および任意選択でＮ３の和は、５０未満である）。一部の実施形態では、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’は、線状キメラ化合物の５’末端に位置している（すなわち、任意の追加のヌクレオチドは、３’末端に付加される）。一部の実施形態では、各核酸部分Ｎは、長さが８ヌクレオチド未満、好ましくは長さが７ヌクレオチドである。一部の実施形態では、各核酸部分Ｎは、長さが４〜７、好ましくは５〜７、または６もしくは７ヌクレオチドである。Ｄの線状キメラ化合物の核酸部分のＣｐＧジヌクレオチドは、非メチル化されている。
一部の実施形態では、Ｄは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号４）として２つの核酸部分および１つのヘキサエチレングリコールスペーサーを含む線状キメラ化合物であって、５０未満のヌクレオチドを含有し（すなわち、Ｎ１およびＮ２の和は、５０未満である）、ヌクレオチド同士間、ヌクレオチドとＨＥＧとの間、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、線状キメラ化合物である。一部の実施形態では、Ｄは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコールスペーサーを含む線状キメラ化合物であって、５０未満のヌクレオチドを含有し（すなわち、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３の和は、５０未満である）、ヌクレオチド同士間およびヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、線状キメラ化合物である。一部の実施形態では、Ｄの５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号４）または５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）は、線状キメラ化合物の５’末端に位置している（すなわち、任意の追加のヌクレオチドは、３’末端に付加される）。一部の実施形態では、Ｄは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）からなる線状キメラ化合物である。一部の実施形態では、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホジエステル連結である。一部の実施形態では、Ｄの線状キメラ化合物におけるヌクレオチド間連結、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の連結、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の連結のすべては、ホスホロチオエートエステル連結である。一部の実施形態では、Ｄの線状キメラ化合物の核酸部分は、２’−デオキシリボポリヌクレオチドである。Ｄの線状キメラ化合物の核酸部分のＣｐＧジヌクレオチドは、非メチル化されている。
核酸部分への連結を可能にするように誘導体化された多糖を、本開示の分枝状キメラ化合物の枝分れ単位として機能を果たす多価担体部分として使用することができる。適当な多糖は、天然に存在する多糖または合成多糖であり得る。例示的な多糖としては、例えば、デキストラン、マンニン（mannin）、キトサン、アガロース、およびデンプンがある。単球および肺胞マクロファージなどの免疫学的に関連した細胞型にマンニン（マンノース）受容体が存在するので、マンニンを使用することができ、したがって、多糖スペーサー部分を、特定の細胞型を標的化するのに使用することができる。一部の実施形態では、多糖は、架橋されている。好適な多価担体部分は、エピクロロヒドリン架橋スクロース（例えば、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅによってＦＩＣＯＬＬ（登録商標）としてブランド化されているスクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマー）である。
一部の実施形態では、式（Ｉ）のＦは、約１００，０００〜約７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、これは、エーテル基を介してＬ３に接続されている。エーテル基は、コポリマーのスクロースヒドロキシルに由来する。一部の実施形態では、Ｆは、（下限）約１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、または６００，０００ダルトンより大きい分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである。一部の実施形態では、Ｆは、（上限）約７００，０００、６００，０００、５００，０００、４００，０００、３００，０００、または２００，０００ダルトン未満の分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである。すなわち、Ｆの分子量は、下限が上限未満である約１００，０００〜約７００，０００ダルトンのサイズの範囲のいずれかであり得る。一部の実施形態では、Ｆは、約３００，００〜５００，００ダルトンの分子量を有する（例えば、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＰＭ４００）。
式（Ｉ）の分枝状キメラ化合物について本明細書に詳述したＦのありとあらゆるバリエーションを、式（Ｉ）の分枝状キメラ化合物について本明細書に詳述したＤのありとあらゆるバリエーションと、ありとあらゆる組合せが個々に記載されているように組み合わせることができることが意図されており、理解される。例えば、一部の実施形態では、式（Ｉ）：
［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ （Ｉ）、
の分枝状キメラ化合物が提供されており、式中、
Ｄは、ポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物であり；
Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎは、２〜８０の整数である）；
ｘは、３〜３００の整数であり；
Ｆは、約１００，０００〜約７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列：５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含み、Ｄのポリヌクレオチドは、長さが５０ヌクレオチド未満であり、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結であり、
Ｄの線状キメラ化合物は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含み、ヌクレオチド同士間、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間、および３’−ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である。
本開示は、−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３−としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ならびに様々なリンカーＬ１、Ｌ２、およびＬ３を介して多価部分Ｆに連結したポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物Ｄを含む式（Ｉ）の分枝状キメラ化合物であって、Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり、Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり、Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり、ＰＥＧは、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−である、分枝状キメラ化合物を提供する。
ポリエチレングリコールは、生物活性分子をコンジュゲート／修飾することにおいて広い使用を見出しており、その理由はこれが、無毒性、非免疫原性、親水性、水溶性、および高度に可撓性であるためである。本開示のキメラ化合物のＰＥＧ含有部分単位は、バイオコンジュゲーションに一般に使用されるメチルシクロヘキシル（ＭＣ）部分などの疎水性部分を使用するコンジュゲートと比較して、これらの化合物により良好な溶解性および安定性をもたらす。ＰＥＧリンカー中のエチレングリコール単位の数は、分枝状キメラ化合物の長さ、親水性、および粒径を最適化するように適応させることができる。
一部の実施形態では、式（Ｉ）のＰＥＧは、式−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−のものであり、式中、ｎは、２〜８０の整数である。一部の実施形態では、ｎは、（下限）２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０より大きい整数である。一部の実施形態では、ｎは、（上限）８０、７０、６０、５０、または４０未満の整数である。すなわち、ｎは、下限が上限未満である約２〜８０の範囲内の整数であり得る。一部の実施形態では、ｎは、２、４、６、２４、４５、４８、または７０である。一部の実施形態では、ｎは、６、２４、４５、または７０である。一部の実施形態では、ｎは、２、４、６、２４、２８、４５、４８、または７０である。一部の実施形態では、ｎは、６、２４、２８、４５、または７０である。好適な実施形態では、ＰＥＧは、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−である。
本開示の分枝状キメラ化合物中のＰＥＧは、スクシンイミド基を含むリンカーを介してＤのポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物の３’−ヌクレオチドに一端で付着しており、アミド基を含むリンカーを介して多価部分Ｆに他端で付着している。アルキルチオ基が、Ｄのポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物の３’−ヌクレオチドとスクシンイミド基との化学的カップリングを助長するために使用される。よって、第１のリンカーＬ１は、アルキルチオ基を含むリンカーであり、これは、Ｌ２を含む前駆物質中のマレイミド基と反応してＬ１とＬ２との間にチオスクシンイミド（thiosuccinimdo）連結を形成するＬ１を含む前駆物質の末端スルフヒドリル基（−ＳＨ）によって、第２のリンカーＬ２のスクシンイミド基に核酸の３’末端リン酸部分を連結することができる。一部の実施形態では、Ｌ１は、式−Ｌ１ａ−Ｓ−のものであり、式中、Ｌ１ａは、アルキレン基、例えば、式（ＣＨ２）ｍの基であり、ｍは、２〜９の整数である。一部の実施形態では、Ｌ１は、式−（ＣＨ２）ｍＳ−のアルキルチオ基であり、式中、ｍは、２〜９の整数である。諸実施形態の一部では、ｍは、２、３、４、５、６、７、８、または９である。一部の実施形態では、ｍは、３〜６である。一部の実施形態では、ｍは、３または６である。好適な実施形態では、ｍは、６である。別の好適な実施形態では、ｍは、３である。一部の実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）６Ｓ−または−（ＣＨ２）３Ｓ−である。
第２のリンカーＬ２は、スクシンイミド基を含むリンカーである。一部の実施形態では、Ｌ２は、アルキルスペーサー基（例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−）および／またはアルキルアミドスペーサー基（例えば、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）をさらに含む。一部の実施形態では、Ｌ２は、
である。一部の実施形態では、Ｌ２は、
である。
一部の実施形態では、Ｌ２は、式
のものであり、式中、Ｌ２ｂは、アルキルスペーサー基（例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）および／またはアルキルアミドスペーサー基（例えば、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）である。一部の実施形態では、Ｌ２ｂは、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２−である。一部の実施形態では、Ｌ２ｂは、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である。
一部の実施形態では、−Ｌ１−Ｌ２−部分は、
である。
第３のリンカーＬ３は、アミド基を含むリンカーであり、これは、ＰＥＧを、エーテル基を介して多価部分Ｆに共有結合的に連結する。一部の実施形態では、Ｌ３は、１個もしくは複数のアルキルスペーサー基（例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−）、１個もしくは複数のアミドスペーサー基（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−もしくは−ＮＨＣ（Ｏ）−）、またはこれらの組合せをさらに含む。一部の実施形態では、Ｌ３は、式
のものであり、式中、Ｌ３ａは、アルキル基およびアミンを連結することができるスペーサー、例えば、式−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）−のスペーサーなどである。Ｌ３の（２−アミノエチル）アミノカルボニルメチル部分は、Ｆのヒドロキシル基をクロロアセテートと反応させ、次いでエチレンジアミンとカップリングさせることによってＦに付着させることができる。
一部の実施形態では、Ｌ３は、
である。
式（Ｉ）の分枝状キメラ化合物について本明細書に詳述したＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＰＥＧのありとあらゆるバリエーションを互いに組み合わせることができること、また式（Ｉ）の分枝状キメラ化合物について本明細書に詳述したＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＰＥＧのありとあらゆるバリエーションを、式（Ｉ）の分枝状キメラ化合物について本明細書に詳述したＤおよびＦのありとあらゆるバリエーションと、ありとあらゆる組合せが個々に記載されているようにさらに組み合わせることができることが意図されており、理解される。例えば、一部の実施形態では、−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３−部分は、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、または（Ｇ）：
のものである。
一部の実施形態では、−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３−部分は、
である。
一部の実施形態では、分枝状キメラ化合物は、式
のものであり、式中、Ｄは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）からなる線状キメラ化合物であり、ヌクレオチド同士間、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結であり、Ｆは、約４００，０００の分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、ｎは、６、２４、４５、または７０であり、ｘは、３〜３００の整数であり、Ｆは、エーテル連結を介してメチレン基に接続されている。一部の実施形態では、ｎは、６であり、ｘは、９０〜１５０である。
一部の実施形態では、分枝状キメラ化合物は、式
のものであり、式中、Ｄは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）からなる線状キメラ化合物であり、ヌクレオチド同士間、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結であり、Ｆは、約４００，０００の分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、ｎは、６、２４、４５、または７０であり、ｘは、３〜３００の整数であり、Ｆは、エーテル連結を介してメチレン基に接続されている。一部の実施形態では、ｎは、６であり、ｘは、９０〜１５０である。一部の実施形態では、ｎは、４５であり、ｘは、９０〜１５０である。
式（Ｉ）の分枝状キメラ化合物中のＤのポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物の数は、３〜約３００の範囲であり得る。すなわち、ｘは、３〜３００の整数である。一部の実施形態では、ｘは、（下限）３、６、９、１２、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５５、１６５、１９０、または２００より大きい整数である。一部の実施形態では、ｘは、（上限）３００、２７５、２５０、２２５、２１５、２１０、２０５、２００、１９０、１８０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、または５０未満の整数である。そのｘは、下限が上限未満である約３〜３００の範囲内の整数であり得る。例えば、一部の実施形態では、ｘは、２０〜３００、２０〜２００、６０〜１８０、９０〜１５０、１００〜１４０、または１１０〜１３０である。一部の実施形態では、ｘは、約１２０±３０である。好適な実施形態では、ｘは、約１２０である。
本開示のキメラ化合物の典型的な調製物は、指定されたアベレージ分子量または多価担体部分Ｆ １個当たりのＤ部分のおおよその数を伴って担持比の分布を有するキメラ化合物から構成される異種混合物であるが、試薬および反応条件は、再現性よく所望の担持比を実現するように制御することができる。一態様では、本明細書に記載の式（Ｉ）の１種または複数種の分枝状キメラ化合物またはこれらのバリエーションを含む組成物が提供されている。一部の実施形態では、組成物は、確定した担持比およびアベレージ分子量の複数の分枝状キメラ化合物を含む。一部の実施形態では、組成物は、式（Ｉ）の化合物の異種混合物を含み、Ｄ、ＰＥＧ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｆ、およびｘは独立に、式（Ｉ）について本明細書に記載した通りであり、混合物のキメラ化合物のＦ部分は、約２００，０００から約６００，０００ダルトンの間のアベレージ分子量を有し、混合物のキメラ化合物は、約６０から約１８０の間のアベレージ担持比（ｘ）を有する。
一部の実施形態では、組成物は、式（Ｉ）の化合物の異種混合物を含み、Ｄ、ＰＥＧ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｆ、およびｘは独立に、式（Ｉ）について本明細書に記載した通りであり、混合物のキメラ化合物のＦ部分は、ダルトンで約３００，０００から約５００，０００の間（例えば、約４００，０００）のアベレージ分子量を有する。一部の実施形態では、混合物のキメラ化合物のＦ部分は、約４００，０００±１００，０００ダルトンの間の分子量を有する。一部の実施形態では、組成物は、式（Ｉ）の化合物の異種混合物を含み、Ｄ、ＰＥＧ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｆ、およびｘは独立に、式（Ｉ）について本明細書に記載した通りであり、混合物のキメラ化合物は、約９０から約１５０の間または約１００から約１４０の間（例えば、約１２０）のアベレージ担持比（ｘ）を有する。一部の実施形態では、混合物のキメラ化合物は、約１２０±３０または約１２０±２０の担持比（ｘ）を有する。一部の実施形態では、組成物は、式（Ｉ）の分枝状キメラ化合物の異種混合物を含み、Ｄ、ＰＥＧ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｆ、およびｘは独立に、式（Ｉ）について本明細書に記載した通りであり、混合物の分枝状キメラ化合物のＦ部分は、約４００，０００±１００，０００ダルトンの分子量を有し、混合物の分枝状キメラ化合物は、約１２０±３０のアベレージ担持比を有する。
本開示のポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、および分枝状キメラ化合物は、感知できる免疫調節性活性（例えば、非免疫調節性対照より少なくとも３倍高い）を有する。一部の実施形態では、免疫調節性活性は、免疫刺激性活性を含む。他の実施形態では、免疫調節性活性は、免疫阻害性活性を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであり得る。ヌクレオチド間連結、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の連結、および３’末端ヌクレオチドとリンカーＬ１との間の連結は、ホスフェートまたはチオホスフェートエステルであり得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、および分枝状キメラ化合物は、免疫刺激性活性を有する。これらの実施形態では、Ｄは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４を含む。一部の実施形態では、Ｄは、配列番号９〜１６からなる群のうちの１つを含む。Ｄのポリヌクレオチドまたは核酸部分のＣｐＧジヌクレオチドは、非メチル化されている。一部の実施形態では、Ｄのポリヌクレオチドまたは核酸部分の５’−ＴＣＧ−３’は、５’末端に位置している（例えば、任意の追加のヌクレオチドは、３’末端に付加される）。好適な実施形態では、ポリヌクレオチドは、トール様受容体（ＴＬＲ）阻害性モチーフを含まない。好適な実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９阻害性モチーフを含まない。例示的なＴＬＲ７阻害性モチーフとしては、５’−Ｑｚ’ＴＧＣ−３’、５’−Ｑｚ’ＵＧＣ−３’、５’−Ｑｚ’ＴＩＣ−３’、および５’−Ｑｚ’ＴＴＣ−３’があり、式中、Ｑは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｚ’は、０、１、または２である。すなわち、Ｑｚ’は、ポリヌクレオチドの５’末端にある。例示的なＴＬＲ８阻害性モチーフは、５’−Ｘ１Ｘ２Ｘ３−Ｍｙ’−３’であり、式中、Ｘ１は、Ａ、Ｔ、またはＣであり、Ｘ２は、ＧまたはＩであり、Ｘ３は、ＩまたはＡであり、Ｍは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｙ’は、０または１である。すなわち、Ｍｙ’は、ポリヌクレオチドの３’末端にある。例示的なＴＬＲ９阻害性モチーフは、５’−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−３’であり、式中、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４のそれぞれは独立に、ＧまたはＩ（イノシンまたは２’−デオキシイノシン）である。ＴＬＲ９阻害性モチーフが５’−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−３’である一部の実施形態では、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４のそれぞれは独立に、Ｇ、またはＧ−テトラッド形成を防止し、かつ／もしくはフーグスティーン塩基対合を防止することができる分子、例えば、イノシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−２’−デオキシキサントシン、７−デアザ−８−アザ−２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシネブラリン、イソデオキシグアノシン、および８−オキソ−２’−デオキシグアノシンなどである。
免疫刺激性活性を査定するためのアッセイは、当技術分野で公知であり、実施例Ｂ１およびＢ２に記載されている。本開示の目的に関して、免疫刺激性活性は、試験化合物の存在および非存在下でインキュベートした後にヒト末梢血単核細胞によるインターフェロン−アルファ産生を測定することによって判定することができる。試験化合物は、試験化合物の存在下で少なくとも２倍多くインターフェロン−アルファが産生されるとき、免疫刺激性活性を有すると言われる。陽性および陰性対照が免疫刺激性活性のアッセイにおいて有用であることが理解される。免疫刺激性活性の適当な陰性対照は、培地単独である。別の適当な陰性対照は、ヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡ ＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴ ＧＡ−３’からなるポリヌクレオチド（配列番号５として示したＤ５６−３０）である。免疫刺激性活性の適当な陽性対照は、ヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡ ＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴ ＧＡ−３’からなるポリヌクレオチド（配列番号６に示したＤ５６−１０）である。
ＩＩ．キメラ化合物の合成
本開示は、本明細書に詳述したキメラ化合物（分枝状キメラ化合物など）を調製するための方法、ならびにその方法において有用な組成物および中間体をさらに提供する。
一態様では、本開示は、式（Ｉ）：
［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ （Ｉ）
の分枝状キメラ化合物を作製するための方法であって、
式中、
Ｄは、ポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物であり；
Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎは、２〜８０の整数である）であり；
ｘは、３〜３００の整数であり；
Ｆは、約１００，０００〜約７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列：５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含み、ポリヌクレオチドは、長さが５０ヌクレオチド未満であり、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の連結は、ホスホロチオエートエステル連結であり；
線状キメラ化合物は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つのポリヌクレオチドおよび２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含み、ヌクレオチド同士間の連結、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の連結、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の連結の１個または複数は、ホスホロチオエートエステル連結であり、この方法は、
式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物（式中、Ｄは、式（Ｉ）について定義した通りであり、Ｌ１ａは、（ＣＨ２）ｍであり、ｍは、２〜９の整数である）を、式（ＩＩ）：
［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ （ＩＩ）
の化合物（式中、Ｌ３、ＰＥＧ、およびＦは、式（Ｉ）について定義した通りであり；
Ｌ２ａは、
であり、
ｙは、３〜３５０の整数である）と反応させることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、Ｌ２ａは、
である。
一部の事例では、式（ＩＩ）の化合物中のあらゆるマレイミド基が核酸部分Ｄと反応する。よって一部の実施形態では、ｙは、ｘに等しい。他の事例では、式（ＩＩ）の化合物中のマレイミド基のうちの一部のみが核酸部分Ｄと反応し、一方、一部は、核酸部分Ｄと反応しない。よって一部の実施形態では、ｙは、ｘより大きい整数である。一部の実施形態では、ｙは、（下限）３、６、９、１２、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５５、１６５、１９０、または２００より大きい整数である。一部の実施形態では、ｙは、（上限）３５０、３００、２７５、２５０、２２５、２１５、２１０、２０５、２００、１９０、１８０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、または５０未満の整数である。そのｙは、下限が上限未満である約３〜３５０の範囲内の整数であり得る。例えば、一部の実施形態では、ｙは、２０〜３５０、３０〜３００、１５５〜２１５、１６５〜２０５、２０〜２５０、９０〜２５０、１２０〜２５０、１２０〜２２０、１６０〜２２０、２０〜２００、６０〜１８０、９０〜１５０、１００〜１４０、または１１０〜１３０である。好適な実施形態では、ｙは、約１９０、約１８５、約１５０、または約１２０である。一部の実施形態では、ｙは、約１９０±３０または約１８５±３０である。一部の実施形態では、ｙがｘより大きい整数であるとき、核酸部分Ｄと反応しないマレイミド基は、キャッピングおよび／または加水分解される。一部の実施形態では、ｙがｘより大きい整数であるとき、核酸部分Ｄと反応しないマレイミド基は、システインでキャッピングされ、かつ／または水で加水分解される。
反応性チオール化合物Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨは、使用前により安定なジスルフィド化合物から作製されることが多い。一部の実施形態では、方法は、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＳ−Ｌ１ａ−ＯＨのジスルフィド化合物を還元剤（例えば、ホスフィン化合物）と反応させることをさらに含む。一部の実施形態では、Ｄは、式（Ｉ）について本明細書で定義した通りであり、Ｌ１ａは、（ＣＨ２）ｍであり、ｍは、２〜９の整数である。諸実施形態の一部では、ｍは、２、３、４、５、６、７、８、または９である。一部の実施形態では、ｍは、３〜６である。これらの実施形態の一部では、ｍは、３または６である。一実施形態では、ｍは、６である。一実施形態では、ｍは、３である。還元剤の一例は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）である。
本発明は、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物または式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＳ−Ｌ１ａ−ＯＨの化合物も提供し、式中、Ｄは、ポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物、例えば、本明細書に詳述したポリヌクレオチドまたは本明細書に詳述した線状キメラ化合物などであり、Ｌ１ａは、（ＣＨ２）ｍであり、ｍは、２〜９の整数である。これらの実施形態の一部では、Ｄは、ヌクレオチド配列：５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドであり、Ｄのポリヌクレオチドは、長さが５０ヌクレオチド未満であり、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である。これらの実施形態の一部では、Ｄは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含む線状キメラ化合物であり、線状キメラ化合物は、５０未満のヌクレオチドを含有し、ヌクレオチド同士間、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間、および３’ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である。これらの実施形態の一部では、Ｄは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）からなる線状キメラ化合物である。一部の実施形態では、Ｄの線状キメラ化合物におけるヌクレオチド間連結、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の連結、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の連結のすべては、ホスホロチオエートエステル連結である。一部の実施形態では、Ｄの線状キメラ化合物の核酸部分は、２’−デオキシリボヌクレオチドである。諸実施形態の一部では、ｍは、２、３、４、５、６、７、８、または９である。一部の実施形態では、ｍは、３〜６である。これらの実施形態の一部では、ｍは、３または６である。一実施形態では、ｍは、６である。一実施形態では、ｍは、３である。
一部の実施形態では、Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−（ＣＨ２）ｍ−ＳＨ（配列番号２）であり、ｍは、２〜９の整数である。一部の実施形態では、Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＳ−Ｌ１ａ−ＯＨは、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−（ＣＨ２）ｍ−ＳＳ−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨ（配列番号２）であり、ｍは、２〜９の整数である。これらの実施形態の一部では、ｍは、３または６である。一実施形態では、ｍは、６である。一実施形態では、ｍは、３である。
本明細書に記載のポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、およびジスルフィド修飾核酸は、当技術分野で公知の方法、例えば、米国特許第８，１１４，４１８号に記載の方法などを使用して調製することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、製造者のプロトコールに従って酸化的硫化を用いてホスホラミジット化学反応を使用して固相合成によって製造し、精製および単離することができる（Molecules、２０１３年、１８巻、１４２６８〜１４２８４頁）。使用されたヌクレオシドモノマーの例は、５’−ジメトキシトリチル保護−２’−デオキシヌクレオシドであった。線状キメラ化合物は、ポリヌクレオチド中にＨＥＧスペーサー（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ製Ｓｐａｃｅ Ｐｈｏｒｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ １８）を組み込むことによって作製される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／または線状キメラ化合物は、所望の順序でヌクレオチドモノマー、ＨＥＧスペーサー、およびリンカーを付加するようにプログラムされた固相シンセサイザーで合成され、合成は、３’から５’方向に行われる。３’−ヌクレオシドまたはリンカー基（例えば、３’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ Ｓ−Ｓ ＣＰＧ）は、固体支持体に付着される。一部の実施形態では、合成サイクルは、酸（例えば、トルエン中のジクロロ酢酸）を使用する脱トリチル化ステップ、ホスホラミジットモノマー＋弱酸性アクチベーター（例えば、サッカリン１−メチルイミダゾール）を使用するカップリングステップ、酸化的硫化ステップ（例えば、ピリジン中の０．２Ｍキサンタンヒドリド）、および未反応基のキャッピングステップ（例えば、イソ酪酸無水物およびＮ−メチルイミダゾール）からなる。合成サイクルは、ＰＮおよびＣＣ配列が完全にアセンブルされるまで繰り返される。保護されたポリヌクレオチドおよびキメラ化合物を固体支持体から切断および脱保護することができる（例えば、アセトニトリル中の２０％ ｔ−ブチルアミンを使用してシアノエチルホスフェート保護基を除去し、その後、濃アンモニア水で処置して支持体からＰＮまたはＣＣを切断し、得られた溶液を周囲温度で７２時間保持してヌクレオチド上の保護基を除去する）。ポリヌクレオチドは、精製し（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して）、脱塩し（例えば、タンジェンシャルフロー濾過システムを使用する限外濾過／ダイアフィルトレーションによって）、凍結乾燥し、凍結乾燥固体として冷凍貯蔵することができる。
式（ＩＩ）の化合物中のＰＥＧは、ＰＥＧを含む活性化エステル化合物と反応する多価多糖Ｆのアミン誘導体を介して導入することができる。一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を作製する方法は、式（ＩＩＩ）：
［ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２］ｚ−Ｆ （ＩＩＩ）
の化合物（式中、Ｆは、式（Ｉ）について定義した通りであり、ｚは、３〜４００の整数である）を、
式Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−Ｌｖの化合物（式中、Ｌ２ａおよびＰＥＧは、式（ＩＩ）について定義した通りであり；Ｌ３ａは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｌｖは、脱離基である）と反応させて式（ＩＩ）の化合物を形成することをさらに含む。
一部の実施形態では、ＰＥＧを含む活性化エステル化合物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳまたはＨＯＳｕ）エステルであり、Ｌｖは、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ（すなわち、ＯＳｕ）である。当技術分野で公知の他の活性化カルボン酸またはエステルを、式（ＩＩＩ）のアミンと反応させて式（ＩＩ）の化合物を形成するのに使用することができる。
一部の実施形態では、Ｆは、ダルトンで約１００，０００〜７００，０００の分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである。一部の実施形態では、Ｆは、約４００，０００±１００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＰＭ４００）、式（ＩＩＩ）の化合物は、ＡＥＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００の化合物である。使用される式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、ＡＥＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００の化合物）に対する活性化エステルＬ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−Ｌｖ（例えば、ＮＨＳエステルＬ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−ＯＳｕ）の相対量に応じて、式（ＩＩＩ）の化合物中のアミノ基の一部またはすべてがＰＥＧ化され得る。よって一部の実施形態では、ｚは、ｙに等しい。一部の実施形態では、ｚは、ｙより大きい整数である。一部の実施形態では、ｚは、（下限）３、６、９、１２、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５５、１６５、１９０、または２００より大きい整数である。一部の実施形態では、ｚは、（上限）４００、３５０、３００、２７５、２５０、２２５、２１５、２１０、２０５、２００、１９０、１８０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、または５０未満の整数である。そのｚは、下限が上限未満である約３〜４００の範囲内の整数であり得る。例えば、一部の実施形態では、ｚは、２０〜４００、５０〜３００、１９０〜２５０、２００〜２４０、２０〜３５０、３０〜３００、１５５〜２１５、１６５〜２０５、２０〜２５０、９０〜２５０、１２０〜２５０、１２０〜２２０、１６０〜２２０、２０〜２００、６０〜１８０、９０〜１５０、１００〜１４０、または１１０〜１３０である。好適な実施形態では、ｚは、約２２０、約１９０、約１５０、または約１２０である。一部の実施形態では、ｚは、約２２０±３０または約２２０±２０である。一部の実施形態では、ｚがｙより大きい整数であるとき、過剰のアミンは、キャッピングされる。一部の実施形態では、ｚがｙより大きい整数であるとき、過剰のアミンは、スルホ−ＮＨＳ−アセテートまたはＮＨＳ−アセテートでキャッピングされる。
ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）は、スクロースを、高度に分枝状の構造をもたらすエピクロロヒドリンで架橋することによって合成される。アミノエチルカルボキシメチル−ＦＩＣＯＬＬ（ＡＥＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標））は、Inman、１９７５年、J. Imm.、１１４巻：７０４〜７０９頁の方法によって調製することができる。次いでＡＥＣＭ−ＦＩＣＯＬＬを６−マレイミドカプロイックアシルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのヘテロ二官能性架橋試薬と反応させ、次いでチオール誘導体化核酸部分にコンジュゲートさせることができる（Leeら、１９８０年、Mol. Imm.、１７巻：７４９〜５６頁を参照）。他の多糖も同様に修飾することができる。
本方法で使用されるＮＨＳエステル（Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−ＯＳｕ）は、商業的供給元から得、または当技術分野で公知の方法によって作製することができる。
一部の実施形態では、式（ＩＩ）：
［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ （ＩＩ）
の化合物が提供されており、式中、
Ｌ２ａは、マレイミド基を含む部分であり；
Ｌ３は、アミド基を含むリンカーであり；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり；
ｙは、３〜３５０の整数であり；
Ｆは、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続されている。
式（ＩＩ）の化合物の一部の実施形態では、Ｌ３、ＰＥＧ、およびＦは、式（Ｉ）について定義した通り、または本明細書に詳述した任意のバリエーションであり；
Ｌ２ａは、
であり、式中、Ｌ２ｂは、式（Ｉ）について詳述した通り、またはその任意のバリエーション（例えば、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、もしくは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）であり；
ｙは、式（ＩＩ）について本明細書に詳述した通りである。
例えば、式（ＩＩ）の化合物の一部の実施形態では、Ｆは、約３００，０００〜５００，０００ダルトンの分子量を有する（例えば、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＰＭ４００）。一部の実施形態では、ｙは、（下限）３、６、９、１２、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０より大きい整数である。一部の実施形態では、ｙは、（下限）３、６、９、１２、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５５、１６５、１９０、または２００より大きい整数である。一部の実施形態では、ｙは、（上限）３５０、３００、２７５、２５０、２２５、２１５、２１０、２０５、２００、１９０、１８０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、または５０未満の整数である。そのｙは、下限が上限未満である約３〜３５０の範囲内の整数であり得る。例えば、一部の実施形態では、ｙは、２０〜３５０、３０〜３００、１５５〜２１５、１６５〜２０５、２０〜２５０、９０〜２５０、１２０〜２５０、１２０〜２２０、１６０〜２２０、２０〜２００、６０〜１８０、９０〜１５０、１００〜１４０、または１１０〜１３０である。好適な実施形態では、ｙは、約１９０、約１８５、約１５０、または約１２０である。一部の実施形態では、ｙは、約１９０±３０または約１８５±３０である。一部の実施形態では、ＰＥＧは、式−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−のものであり、式中、ｎは、２〜８０の整数である。好適な実施形態では、ＰＥＧは、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−である。一部の実施形態では、Ｌ２ａは、
である。一部の実施形態では、Ｌ３は、式
のものであり、式中、Ｌ３ａは、アルキル基およびアミンを連結することができるスペーサー、例えば、式−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−のスペーサーなどである。
一部の実施形態では、式（ＩＩ）：
［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ （ＩＩ）
の化合物を作製するための方法であって、
式中、
Ｌ２ａは、マレイミド基を含む部分であり；
Ｌ３は、アミド基を含むリンカーであり；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎは、２〜８０の整数である）であり；
ｙは、３〜３５０の整数であり；
Ｆは、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、この方法は、
式（ＩＩＩ）
［ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２］ｚ−Ｆ （ＩＩＩ）
の化合物（式中、Ｆは、式（ＩＩ）について定義した通りであり、ｚは、３〜４００の整数である）を式Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−Ｌｖの化合物（式中、Ｌ２ａおよびＰＥＧは、式（ＩＩ）について定義した通りであり；Ｌ３ａは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｌｖは、脱離基（例えば、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）である）と反応させることを含む方法が提供されている。
一部の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物の異種混合物を含む組成物であって、Ｌ２ａ、ＰＥＧ、Ｌ３、Ｆ、およびｙは独立に、式（ＩＩ）について本明細書に記載した通りであり、式（ＩＩ）の化合物の異種混合物のＦ部分は、ダルトンで約２００，０００から約６００，０００の間のアベレージ分子量を有し、異種混合物中の式（ＩＩ）の化合物は、約６０から約２５０の間のアベレージ担持比（ｙ）を有する、組成物が提供されている。一部の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物の異種混合物のＦ部分は、ダルトンで約３００，０００から約５００，０００の間のアベレージ分子量を有する。一部の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物の異種混合物のＦ部分は、約４００，０００±１００，０００ダルトンのアベレージ分子量を有する。一部の実施形態では、異種混合物中の式（ＩＩ）の化合物は、約６０から約２５０の間、約９０から約２５０の間、約１２０から約２５０の間、約１２０から約２２０の間、約１６０から約２２０の間、約６０から約２００の間、約６０から約１８０の間、または約９０から約１５０の間のアベレージ担持比（ｙ）を有する。一部の実施形態では、異種混合物中の式（ＩＩ）の化合物は、約１２０±３０、約１５０±３０、約１８５±３０、または約１９０±３０のアベレージ担持比（ｙ）を有する。一部の実施形態では、組成物は、式（ＩＩ）の化合物の異種混合物を含み、Ｌ２ａ、ＰＥＧ、Ｌ３、Ｆ、およびｙは独立に、式（ＩＩ）について本明細書に記載した通りであり、式（ＩＩ）の化合物の異種混合物のＦ部分は、約４００，０００±１００，０００ダルトンのアベレージ分子量を有し、異種混合物中の式（ＩＩ）の化合物は、約１２０±３０、約１５０±３０、約１８５±３０、または約１９０±３０のアベレージ担持比（ｙ）を有する。
本発明は、本明細書に詳述した、ある分布の式（ＩＩ）の化合物から、本明細書に詳述した、ある分布の式（Ｉ）の化合物を含む混合物を作製するための方法も提供する。一態様では、式（Ｉ）：
［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ （Ｉ）
の分枝状キメラ化合物の異種混合物を作製するための方法であって、
式中、
Ｄは独立に、ポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物であり；
Ｌ１は独立に、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
Ｌ２は独立に、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
Ｌ３は独立に、アミド基を含む第３のリンカーであり；
ＰＥＧは独立に、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎは、２〜８０の整数である）であり；
ｘは独立に、３〜３００の整数であり；
Ｆは独立に、約１００，０００〜約７００，０００の分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列：５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含み、ポリヌクレオチドは独立に、長さが５０ヌクレオチド未満であり、ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の連結は、ホスホロチオエートエステル連結であり、
線状キメラ化合物は独立に、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つのポリヌクレオチドおよび２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含み、ヌクレオチド同士間の連結、ヌクレオチドとＨＥＧスペーサーとの間の連結、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の連結のうちの１個または複数は、ホスホロチオエートエステル連結であり、この方法は、
式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物（式中、Ｄは独立に、式（Ｉ）について定義した通りであり、Ｌ１ａは、（ＣＨ２）ｍ（式中、ｍは独立に、２〜９の整数である）を含む組成物を、式（ＩＩ）：
［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ （ＩＩ）
の化合物（式中、Ｌ３、ＰＥＧ、およびＦは独立に、式（Ｉ）について定義した通りであり；
各Ｌ２ａは独立に、
であり；
ｙは独立に、３〜３５０の整数である）の異種混合物を含む組成物と反応させることを含み、式（ＩＩ）の化合物を含む組成物は、式（ＩＩ）の化合物の異種混合物を含み、式（ＩＩ）の化合物の異種混合物のＦ部分は、ダルトンで約２００，０００から約６００，０００の間のアベレージ分子量を有し、混合物中の式（ＩＩ）の化合物は、約６０から約２５０の間のアベレージ担持比（ｙ）を有する、方法が提供されている。一部の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物の異種混合物のＦ部分は、約４００，０００±１００，０００ダルトンのアベレージ分子量を有する。一部の実施形態では、異種混合物中の式（ＩＩ）の化合物は、約１２０±３０、約１５０±３０、約１８５±３０、または約１９０±３０のアベレージ担持比（ｙ）を有する。
一部の実施形態では、各Ｌ２ａは独立に、
である。
一部の実施形態では、式（ＩＩ）：
［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ （ＩＩ）
の化合物の異種混合物を含む組成物を作製するための方法であって、
式中、
Ｌ２ａは独立に、マレイミド基を含む部分であり；
Ｌ３は独立に、アミド基を含むリンカーであり；
ＰＥＧは独立に、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎは、２〜８０の整数である）であり；
ｙは独立に、３〜３５０の整数であり；
Ｆは独立に、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続されているおり、この方法は、
式（ＩＩＩ）：
［ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２］ｚ−Ｆ （ＩＩＩ）
の化合物（式中、Ｆは、式（ＩＩ）について定義した通りであり、ｚは独立に、３〜４００の整数である）の混合物を含む組成物を、式Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−Ｌｖの化合物（式中、Ｌ２ａおよびＰＥＧは、式（ＩＩ）について定義した通りであり；Ｌ３ａは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｌｖは、脱離基（例えば、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）である）と反応させることを含み、
式（ＩＩＩ）の化合物の混合物のＦ部分は、約２００，０００から約６００，０００ダルトンの間のアベレージ分子量を有し、式（ＩＩＩ）の化合物の混合物は、約６０から約２８０の間のアベレージ担持比（ｚ）を有する、方法が提供されている。
式（ＩＩ）の化合物の異種混合物を含む組成物を作製するための方法の一部の実施形態では、Ｌ２ａ、ＰＥＧ、Ｌ３ａ、およびＬｖは、本明細書に詳述した通りであり、式（ＩＩＩ）の化合物の混合物のＦ部分は、ダルトンで約３００，０００から約５００，０００の間のアベレージ分子量を有する。一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物の混合物のＦ部分は、約４００，０００±１００，０００ダルトンのアベレージ分子量を有する。一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物の混合物は、約５０から約３５０の間、約５０から約２８０の間、約６０から約２５０の間、約６０から約１８０の間、約６０から約１５０の間、約９０から約２８０の間、約９０から約２５０の間、約９０から約２００の間、約９０から約１５０の間、約１２０から約２８０の間、約１２０から約２５０の間、約１５０から約２８０の間、約１５０から約２５０の間、約１８０から約２８０の間、約１８０から約２５０の間、約２００から約２５０の間、または約２１０から約２３０の間のアベレージ担持比（ｚ）を有する。一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物の混合物は、約１２０±３０、約１５０±３０、約１８０±３０、約２２０±３０、または約２２０±２０のアベレージ担持比（ｚ）を有する。一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物の混合物は、ＡＥＣＭ ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００である。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の分枝状キメラ化合物の異種混合物を作製するための方法は、本明細書に詳述した式（ＩＩＩ）の化合物の混合物を含む組成物を、本明細書に詳述した式Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−Ｌｖの化合物を反応させることをさらに含む。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物または式（Ｉ）の化合物の異種混合物を含む組成物を作製する方法は、式（Ｉ）のキメラ化合物、ならびに／または式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物などの中間化合物のうちのいずれかを精製することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、ダイアフィルトレーションによって式（Ｉ）のキメラ化合物を精製することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、１００，０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜を使用してダイアフィルトレーションによって式（Ｉ）のキメラ化合物を精製することをさらに含む。
ＩＩＩ．医薬組成物
本開示のポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、または分枝状キメラ化合物（例えば、活性剤）を含む医薬組成物も提供されている。医薬組成物は日常的に、薬学的に許容される賦形剤を含有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、抗原をさらに含む。本開示の医薬組成物は、溶液またはフリーズドライ固体の形態にあり得る。本開示の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、好ましくは本質的にエンドトキシンフリーである。
Ａ．賦形剤
本開示の薬学的に許容される賦形剤としては、例えば、溶媒、増量剤、緩衝剤、張性調整剤、および防腐剤がある（例えば、Pramanickら、Pharma Times、４５巻：６５〜７７頁、２０１３年を参照）。一部の実施形態では、医薬組成物は、溶媒、増量剤、緩衝剤、および張性調整剤のうちの１種または複数として機能する賦形剤を含み得る（例えば、生理食塩水中の塩化ナトリウムは、水性ビヒクルおよび張性調整剤の両方として機能を果たし得る）。本開示の医薬組成物は、非経口投与に適している。すなわち、本開示の医薬組成物は、経腸投与のために意図されていない。
一部の実施形態では、医薬組成物は、溶媒として水性ビヒクルを含む。適当なビヒクルとしては、例えば、滅菌水、食塩液、リン酸緩衝溶液、およびリンガー液がある。一部の実施形態では、組成物は、等張性または高張性である。
医薬組成物は、増量剤を含み得る。増量剤は、医薬組成物が投与前に凍結乾燥される場合、特に有用である。一部の実施形態では、増量剤は、リオプロテクタントであり、これは、フリーズドライ中および／または貯蔵中の活性剤の安定化および分解の防止に役立つ。適当な増量剤は、糖（単、二、および多糖）、例えば、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール（sorbital）、グルコース、およびラフィノースなどである。
医薬組成物は、緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、ｐＨを制御して、加工、貯蔵、および任意選択で復元中における活性剤の分解を阻害する。適当な緩衝液は、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、または硫酸塩を含む塩を含む。他の適当な緩衝液は、例えば、アミノ酸、例えば、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、およびリシンなどを含む。緩衝剤は、塩酸または水酸化ナトリウムをさらに含み得る。一部の実施形態では、緩衝剤は、４〜９の範囲内で組成物のｐＨを維持する。一部の実施形態では、ｐＨは、（下限）４、５、６、７、または８より大きい。一部の実施形態では、ｐＨは、（上限）９、８、７、６、または５未満である。すなわち、ｐＨは、下限が上限未満である約４．０〜９．０の範囲内である。
医薬組成物は、張性調整剤を含み得る。適当な張性調整剤としては、例えば、デキストロース、グリセロール、塩化ナトリウム、グリセリン、およびマンニトールがある。
医薬組成物は、防腐剤を含み得る。適当な防腐剤としては、例えば、抗酸化剤および抗菌剤がある。しかし、好適な実施形態では、医薬組成物は、滅菌条件下で調製され、使い捨てコンテナ中にあり、よって防腐剤を含めることを必要としない。
Ｂ．抗原
本開示は、ポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、または分枝状キメラ化合物に加えて抗原および賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。抗原を含む本開示の組成物において、抗原は、ポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、または分枝状キメラ化合物に共有結合的に連結されていない。一部の好適な実施形態では、抗原は、タンパク質抗原である。一部の好適な実施形態では、抗原は、多糖抗原であり、これは、好ましくは担体タンパク質に共有結合的に付着している。一部の実施形態では、抗原は、微生物抗原、アレルゲン、または腫瘍抗原である。
医薬組成物は、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌抗原、および寄生虫抗原からなる群から選択される微生物抗原を含み得る。一部の実施形態では、微生物抗原は、非ヒト哺乳動物被験体において感染疾患を引き起こす微生物由来である。一部の実施形態では、微生物抗原は、ヒト被験体において感染疾患を引き起こす微生物由来である。一部の実施形態では、感染疾患は、ウイルス、細菌、真菌、または原虫寄生虫によって引き起こされる。適当な微生物抗原としては、例えば、アデノウイルス４型、アデノウイルス７型、炭疽、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（例えば、ジフテリアトキソイド）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ（例えば、破傷風トキソイド）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、ＨＢｓＡｇ）、ヒトパピローマウイルス（６、１１、１６、１８、３１、３３、４５、５２、および５８型）、インフルエンザウイルスＡおよびＢ型（例えば、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ（neuraminadase））、インフルエンザウイルスＢ型、パラインフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Neisseria menigitidis）（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、およびＷ−１３５群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、水痘帯状疱疹ウイルス、ならびに黄熱病ウイルスの抗原がある（例えば、「www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines」を参照）。一部の実施形態では、微生物抗原は、単純ヘルペスウイルス１または２型、ヒトヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型、および呼吸器合胞体ウイルスのウイルス抗原である。一部の実施形態では、微生物抗原は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、およびＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉの真菌抗原である。一部の実施形態では、微生物抗原は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ種、またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種の寄生虫抗原である。
医薬組成物は、アレルゲンを含み得る。一部の実施形態では、アレルゲンは、哺乳動物、昆虫、植物、およびカビアレルゲンなどの環境抗原である。一部の実施形態では、哺乳動物アレルゲンとしては、毛およびフケがある。適当な哺乳動物アレルゲンとしては、例えば、ネコＦｅｌ ｄ１、ウシＢｏｓ ｄ２、イヌＣａｎ ｆ ＩおよびＣａｎ ｆ ＩＩ、ウマＥｑｕ ｃ１、ならびにマウスＭＵＰがある。一部の実施形態では、昆虫アレルゲンとしては、昆虫の糞および毒液がある。例示的な昆虫アレルゲンとしては、アリＳｏｌ ｉ２、ミツバチＰＬＡおよびＨｙａ、ゴキブリＢｌａ ｇ Ｂｄ９ＯＫ、Ｂｌａ ｇ４、ＧＳＴ、およびＰｅｒ ａ３、イエダニＤｅｒ ｐ２、Ｄｅｒ ｆ２、Ｄｅｒ ｐ１０、およびＴｙｒ ｐ２、ホーネットＤｏｌ ｍ Ｖ、蚊Ａｅｄ ａ１、ならびにイエロージャケットのヒアルロニダーゼおよびホスホリパーゼがある。一部の実施形態では、植物アレルゲンとしては、草、雑草、および樹木アレルゲン（例えば、花粉）がある。適当な草アレルゲンとしては、例えば、ケンタッキーブルーグラス、メドウフェスク、カモガヤ、コヌカグサ、ペレニアルライグラス、ハルガヤ、およびチモシーのアレルゲンがある。例示的な植物アレルゲンとしては、オオムギＨｏｒ ｖ９、カバノキＢｅｔ ｖ１、およびｖ２、サクラＰｒｕ ａ１、トウモロコシＺｍｌ３、草Ｐｈｌ ｐ１、２、４、５、６、７、１１、および１２、Ｈｏｌ １５、Ｃｙｎ ｄ７およびｄ１２、セイヨウスギＪｕｎ ａ２、Ｃｒｙ ｊ１、およびｊ２、ジュニパーＪｕｎ ｏ２、ラテックスＨｅｖ ｂ７、イエローマスタードＳｉｎ ａ Ｉ、菜種Ｂｒａ ｒ１、ブタクサＡｍｂ ａ １、ならびにライムギＬｏｌ ｐ１がある。一部の実施形態では、カビアレルゲンは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓアレルゲン、例えば、Ａｓｐ ｆ１、２、３、４、および６などである。一部の実施形態では、アレルゲンは、食物アレルゲン、例えば、甲殻類アレルゲン、マメ科植物アレルゲン、木の実アレルゲン、または乳アレルゲンなどである。例示的な食物アレルゲンとしては、エビトロポミオシン、ピーナッツＡｒａ ｈ１、２、３、８、および９、クルミＪｕｇ ｒ１および３、ヘーゼルナッツＣｏｒ ａ１、１４、および８ ＬＴＰ、ウシの乳ラクトアルブミン、カゼイン、およびラクトフェリンがある。
医薬組成物は、腫瘍抗原を含み得る。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、哺乳動物抗原である。適当な腫瘍抗原は、当技術分野で記載されている（例えば、Cheeverら、Clinical Cancer Research、１５巻：５３２３〜５３３７頁、２００９年を参照）。例えば、適当な腫瘍抗原としては、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６ Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ１、Ｒａｓ、ｇｐ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌｅ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫トランスロケーションブレイクポイント、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＰ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＰｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシル、ＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素（cabonic anhydrase）ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、およびＦｏｓ関連抗原１がある。
ＩＶ．使用の方法
本開示の医薬組成物は、その必要のある哺乳動物被験体における免疫応答のモジュレーションを伴う複数の使用に適している。哺乳動物被験体としては、それだけに限らないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、ペット、および家畜がある。一部の実施形態では、免疫応答をモジュレートすることは、免疫応答を刺激することを含む。一部の実施形態では、免疫応答をモジュレートすることは、免疫応答を阻害することを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、特定の転帰を実現するのに有効な量で被験体に投与され得る。
Ａ．投与量および投与モード
すべての医薬組成物と同様に、有効量および投与モードは、当業者に明白ないくつかの要因に基づいて変動し得る。考慮されるべき要因には、医薬組成物がポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、または分枝状キメラ化合物（例えば、活性剤）を含有するか否か、および医薬組成物が抗原をさらに含有するか否かが含まれる。一般に、分枝状キメラ化合物などの多価活性剤の投与量は、ポリヌクレオチドおよび線状キメラ化合物などの一価活性剤の投与量より低い。考慮されるべき他の要因としては、実現されるべき転帰、および投与されるべき用量の数がある。
適当な投与量範囲は、所望の効果をもたらすものである。投与量は、被験体に投与されるポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、または分枝状キメラ化合物の量によって判定され得る。被験体の体重によって送達されるべき量で与えられるポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、または分枝状キメラ化合物の例示的な投与量範囲は、約１〜１０００ｍｃｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投与量は、約（下限）１、５、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ｍｃｇ／ｋｇより大きい。一部の実施形態では、投与量は、約（上限）１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、または１００ｍｃｇ／ｋｇ未満である。すなわち、投与量は、下限が上限未満である約１〜１０００ｍｃｇ／ｋｇの範囲内のいずれかである。被験体に送達されるべき量で与えられるポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、または分枝状キメラ化合物の例示的な投与量範囲は、約１００〜５０００ｍｃｇである。一部の実施形態では、投与量は、約（下限）１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、または４０００ｍｃｇより大きい。一部の実施形態では、投与量は、約（上限）５０００、４５００、４０００、３５００、３０００、２５００、２０００、１５００、または１０００ｍｃｇである。すなわち、投与量は、下限が上限未満である約１００〜５０００ｍｃｇの範囲内のいずれかである。
一部の実施形態では、医薬組成物が抗原をさらに含むとき、被験体に送達されるべき量で与えられる抗原投与量範囲は、約１ｍｃｇ〜５０ｍｃｇである。一部の実施形態では、抗原投与量は、約（下限）１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０ｍｃｇより大きい。一部の実施形態では、抗原投与量は、約（上限）５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、または１０ｍｃｇ未満である。すなわち、抗原投与量は、下限が上限未満である約１〜５０ｍｃｇの範囲内のいずれかである。
同様に、適当な投与経路は、所望の効果をもたらすものである。一般に、本開示の医薬組成物は、非経口投与（例えば、経口または直腸投与でない）が意図されている。適当な投与経路としては、注射、局部的、および吸入がある。特に、本開示の医薬組成物は、筋肉内、皮下、静脈内、表皮（遺伝子銃）、経皮、および吸入などの経路によって投与され得る。吸入による投与に適したデバイスとしては、例えば、アトマイザー、気化器、ネブライザー、および乾燥粉末吸入送達デバイスがある。一部の実施形態では、医薬組成物が固形腫瘍を処置するように意図されているとき、組成物は、腫瘍内に投与される。
適当な投薬レジメンは、予防的または治療的状況において所望の効果をもたらすものである。選択された経路によって投与される用量の数は、１回または１回を超える場合がある。投薬の頻度は、毎週、隔週、毎月、隔月、または用量同士間で３〜１２カ月の範囲であり得る。一部の実施形態では、２回の用量が投与され、第２の用量は、第１の用量の１〜２カ月後に投与される。一部の実施形態では、３回の用量が投与され、第２の用量は、第１の用量の１〜２カ月後に投与され、第３の用量は、第２の用量の１〜５カ月後に投与される。他の実施形態では、３または４回の用量が隔週または毎月ベースで投与され得る。他の実施形態では、より短いまたはより長い時間が用量同士間で経過し得る。ある特定の実施形態では、連続的な投与間の間隔は、週の数または月の数の観点から変動し得る。一実施形態では、一連の毎週２、３、４、５、または６回の用量を投与することができ、後の時点で第２の一連の毎週数回の用量が続く。当業者は、抗原特異的抗体応答または腫瘍退縮などの実施例において例示されているように生物学的転帰を測定することによって投与レジメンを調整することができるであろう。
Ｂ．免疫応答の刺激
本開示の医薬組成物は、その必要のある哺乳動物被験体における免疫応答のモジュレーションを伴う複数の使用に適している。一部の実施形態では、哺乳動物被験体は、ヒト患者である。一部の実施形態では、医薬組成物は、哺乳動物被験体における免疫応答を刺激するのに使用される。一部の実施形態では、医薬組成物は、哺乳動物被験体における免疫応答を阻害するのに使用される。一部の実施形態では、医薬組成物は、特定の転帰を実現するように被験体に投与される。
簡単に説明すると、本開示は、哺乳動物被験体における免疫応答を刺激する方法であって、哺乳動物被験体における免疫応答を刺激するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法を提供する。免疫応答を「刺激すること」は、免疫応答を増大させることを意味し、それは、新規の免疫応答を誘発すること（例えば、初期のワクチン接種レジメンの成り行きとして）または既存の免疫応答を増強すること（例えば、ブースターワクチン接種レジメンの成り行きとして）から生じ得る。一部の実施形態では、免疫応答を刺激することは、ＩＦＮ−アルファ産生を刺激すること；ＩＬ−６産生を刺激すること；Ｂリンパ球増殖を刺激すること；インターフェロン経路関連遺伝子発現を刺激すること；化学誘引物質関連遺伝子発現を刺激すること；および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）成熟を刺激することからなる群のうちの１つまたは複数を含む。免疫応答の刺激を測定するための方法は、当技術分野で公知であり、本開示の生物学的実施例において記載されている。医薬組成物が抗原をさらに含む実施形態では、免疫応答を刺激することは、抗原特異的抗体応答を誘導することを含む。
例えば、医薬組成物が抗原をさらに含む一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物被験体における抗原特異的抗体応答を誘導するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することによって、哺乳動物被験体における抗原特異的抗体応答を誘導する方法を提供する。抗原特異的抗体応答を「誘導すること」は、抗原特異的抗体の力価を投与前ベースライン力価またはセロプロテクティブ（seroprotective）レベルなどの閾値レベルより上に増大させることを意味する。
本開示は、哺乳動物被験体における感染症を防止する方法であって、哺乳動物被験体における感染症を防止するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法をさらに提供する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、予防ワクチンを提供する。一部の実施形態では、哺乳動物被験体は、感染エージェントへの曝露のリスクにある。感染疾患を「防止すること」は、感染疾患を発生させることから被験体を保護することを意味する。一部の実施形態では、感染疾患を防止することは、感染エージェントに感染することから被験体を保護すること（例えば、急性または慢性感染症を発生させることから被験体を保護すること）をさらに含む。その上、本開示は、哺乳動物被験体における感染疾患の症状を改善する方法であって、哺乳動物被験体における感染疾患の症状を改善するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法を提供する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、治療ワクチンを提供する。一部の実施形態では、被験体は、感染エージェントに急性的または慢性的に感染している。感染疾患は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫の疾患であり得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫抗原をさらに含み得る。感染疾患の症状を「改善すること」は、疾患の症状を向上させ、好ましくは疾患の程度を減らすことを意味する。
さらに、本開示は、哺乳動物被験体におけるＩｇＥ関連障害の症状を改善する方法であって、哺乳動物被験体におけるＩｇＥ関連障害の症状を改善するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法を提供する。一部の好適な実施形態では、ＩｇＥ関連障害は、アレルギーである。アレルギーとしては、それだけに限らないが、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、副鼻腔炎、湿疹、およびじん麻疹がある。一部の実施形態では、医薬組成物は、アレルゲンをさらに含み得る。ＩｇＥ関連障害の症状を「改善すること」は、障害の症状を向上させ、好ましくは障害の程度を減らすことを意味する。例えば、ＩｇＥ関連障害がアレルギー性鼻炎である場合、症状を改善することは、鼻粘膜の腫大を低減し、鼻漏（鼻水）を低減し、かつ／またはくしゃみを低減することを意味する。
さらに、本開示は、哺乳動物被験体におけるがんを処置する方法であって、哺乳動物被験体におけるがんを処置するのに十分な量で医薬組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む方法を提供する。がんを「処置すること」は、有益な臨床結果、例えば、緩解を引き起こすこと、またはさもなければ処置の非存在下で予期される生存時間と比較して生存期間を延長することなどをもたらすことを意味する。一部の実施形態では、がんが固形腫瘍であるとき、がんを「処置すること」は、固形腫瘍のサイズを縮小すること、またはさもなければ生存可能ながん細胞数を低減することを含む。他の実施形態では、がんが固形腫瘍であるとき、がんを「処置すること」は、固形腫瘍の増殖を遅延させることを含む。
免疫応答の分析（定性的および定量的の両方）は、それだけに限らないが、抗原特異的抗体産生の測定（特異的抗体サブクラスの測定を含む）、Ｂ細胞およびヘルパーＴ細胞などのリンパ球の特定集団の活性化、ＩＦＮ−アルファ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２などのサイトカインの産生、ならびに／またはヒスタミンの放出を含めた当技術分野で公知の任意の方法によるものであり得る。抗原特異的抗体応答を測定するための方法には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。リンパ球の特定集団の活性化は、増殖アッセイによって、および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いて測定することができる。サイトカインの産生も、ＥＬＩＳＡによって測定することができる。
好ましくは、Ｔｈ１型免疫応答が刺激される（すなわち、誘発または増強される）。本開示を参照すると、Ｔｈ１型免疫応答を刺激することは、活性剤で処置されていない対照細胞と比較して、本開示の活性剤（ポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、または分枝状キメラ化合物）で処置された細胞からのサイトカイン産生を測定することによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで判定することができる。「Ｔｈ１型サイトカイン」の例としては、それだけに限らないが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマ、およびＩＦＮ−アルファがある。対照的に、「Ｔｈ２型サイトカイン」としては、それだけに限らないが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３がある。免疫刺激性活性の判定に有用な細胞としては、免疫系の細胞、例えば、抗原提示細胞、リンパ球、好ましくはマクロファージおよびＴ細胞などがある。適当な免疫細胞としては、哺乳動物被験体から単離された、初代細胞、例えば、形質細胞様樹状細胞およびＢ細胞を含めた末梢血単核細胞、または脾細胞などがある。
Ｔｈ１型免疫応答を刺激することはまた、投与前後の、または活性剤で処置されていない対照被験体と比較した、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、およびインターフェロンのレベルを測定することによって、本開示の活性剤（ポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、または分枝状キメラ化合物）で処置された哺乳動物被験体において判定することができる。Ｔｈ１型免疫応答を刺激することは、Ｔｈ１型抗体価とＴｈ２型抗体価の比を測定することによっても判定することができる。「Ｔｈ１型」抗体としては、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３、ならびにネズミＩｇＧ２ａがある。対照的に、「Ｔｈ２型」抗体としては、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびＩｇＥ、ならびにネズミＩｇＧ１およびＩｇＥがある。
一部の実施形態では、本開示は、医薬組成物（賦形剤、およびポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、または分枝状キメラ化合物を含む）、ならびに本明細書に記載の方法のために組成物を使用することに関する一連の使用説明書を含むキットを提供する。キットの医薬組成物は、適切に梱包される。例えば、医薬組成物がフリーズドライ粉末である場合、弾性栓体を有するバイアルが通常使用され、その結果粉末は、弾性栓体を通じて流体を注射することによって容易に再懸濁され得る。一部の実施形態では、キットは、医薬組成物を投与するためのデバイス（例えば、シリンジおよび針）をさらに含む。医薬組成物の使用に関する使用説明書は一般に、意図された使用の方法についての投与量、スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。キットが抗原を含む一部の実施形態では、抗原は、ポリヌクレオチド、線状キメラ化合物、または分枝状キメラ化合物と同じコンテナに梱包されてもよく、されなくてもよい。
略語：ＢＣＣ（分枝状キメラ化合物）；ＣＣ（キメラ化合物）；ＨＥＧ（ヘキサエチレングリコール）；ＬＣＣ（線状キメラ化合物）；ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＰＮ（ポリヌクレオチド）；Ｓｐ（スペーサー）；ＴＦＦ（タンジェンシャルフロー濾過）。
本開示は、明確さおよび理解の目的で例示および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、ある特定の変更および改変を実践することができることが当業者に明らかとなるであろう。したがって、以下の合成および生物学的実施例は、添付の特許請求の範囲によって描写される本開示の射程を限定すると解釈されるべきでない。
合成実施例
（実施例Ｓ１）
ポリヌクレオチドおよびキメラ化合物の構造。
表Ｓ１−１は、実施例で参照されるポリヌクレオチド（ＰＮ）およびキメラ化合物（ＣＣ）の構造を示す。ポリヌクレオチドおよびキメラ化合物中のヌクレオチドは、２’−デオキシリボポリヌクレオチドである。ＨＥＧは、ヘキサエチレングリコールスペーサー部分である。他のスペーサーは、明細書および図に記載されている。表Ｓ１−１または特定の実施例に述べられている場合を除いて、すべてのヌクレオチド間連結および核酸部分とスペーサー部分との間の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である。表Ｓ１−１は、ＣＣ（例えば、Ｄ５６−０２、Ｄ５６−０３、Ｄ５６−０７、Ｄ５６−０８、Ｄ５６−１０、Ｄ５６−１１）であって、これらの分子を分枝状担体部分（例えば、［マレイミド−ＰＥＧｎ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ）と連結して分枝状ＣＣを創製するのに使用されるエンド連結基（例えば、−（ＣＨ２）６−ＳＳ−（ＣＨ２）６−ＯＨ、−（ＣＨ２）６−ＳＨ、−（ＣＨ２）３ＳＳ−（ＣＨ２）３−ＯＨ、−（ＣＨ２）３ＳＨ、ＨＯ（ＣＨ２）６−ＳＳ−（ＣＨ２）６−、およびＨＳ（ＣＨ２）６−）を有するＣＣも示す。これらの連結基は、ホスホロチオエート連結で末端ヌクレオチドまたはスペーサー部分を介してポリヌクレオチドまたはＣＣに接続されている。分枝状ＣＣ（例えば、［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧｎ］ｘ−ＦＩＣＯＬＬ）は、コンジュゲーションストラテジーによって調製され、実施例に記載した連結基を有する。
（実施例Ｓ２）
ポリヌクレオチド（ＰＮ）およびキメラ化合物（ＣＣ）の合成。
ポリヌクレオチドは、製造者のプロトコールに従って酸化的硫化を用いてホスホラミジット化学反応を使用して固相合成によって製造し、精製および単離した（Molecules、２０１３年、１８巻、１４２６８〜１４２８４頁）。使用したヌクレオシドモノマーは、５’−ジメトキシトリチル−保護−２’−デオキシヌクレオシド、３’−（（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル））−ホスホラミジットであった。ＣＣについては、ＨＥＧスペーサーを、１８−Ｏ−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール，１−（（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−イソプロピル））−ホスホラミジット（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ製Ｓｐａｃｅ Ｐｈｏｒｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ １８）を使用して組み込んだ。Ｄ５６−１１については、５’−Ｃ６−ジスルフィドリンカーを、１−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキシル−ジスルフィド−１’−（（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル））−ホスホラミジット（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ製Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ Ｓ−Ｓ）を使用して組み込んだ。Ｄ５６−０７については、３’−Ｃ３−ジスルフィドリンカーを、１−Ｏ−ジメトキシトリチル−プロピル−ジスルフィド，１’−スクシニル−固体支持体（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ製３’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ３ Ｓ−Ｓ ＣＰＧ）を使用して組み込んだ。Ｄ５６−０２については、３’−Ｃ６−ジスルフィドリンカーを、１−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキシル−ジスルフィド，１’−スクシニル−固体支持体（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ製３’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ Ｓ−Ｓ ＣＰＧ、またはＰｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓからの特注として）を使用して組み込んだ。
ＰＮおよびＣＣは、所望の順序でヌクレオチドモノマー、ＨＥＧスペーサー、およびリンカーを付加するようにプログラムされた固相シンセサイザーで合成し、合成は、３’から５’方向に行った。３’−ヌクレオシドまたはリンカー基（例えば、３’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ Ｓ−Ｓ ＣＰＧ）を固体支持体に付着させた。合成サイクルは、酸（例えば、トルエン中のジクロロ酢酸）を使用する脱トリチル化ステップ、ホスホラミジットモノマー＋弱酸性アクチベーター（例えば、サッカリン１−メチルイミダゾール）を使用するカップリングステップ、酸化的硫化ステップ（例えば、ピリジン中の０．２Ｍキサンタンヒドリド）、および未反応基のキャッピングステップ（例えば、イソ酪酸無水物およびＮ−メチルイミダゾール）からなっていた。合成サイクルを、ＰＮおよびＣＣ配列が完全にアセンブルされるまで繰り返した。保護されたＰＮおよびＣＣを固体支持体から切断および脱保護した（例えば、アセトニトリル中の２０％ ｔ−ブチルアミンを使用してシアノエチルホスフェート保護基を除去し、その後、濃アンモニア水で処置して支持体からＰＮまたはＣＣを切断し、得られた溶液を周囲温度で７２時間保持してヌクレオチド上の保護基を除去した）。ポリヌクレオチドを、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製し、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムを使用して限外濾過／ダイアフィルトレーションによって脱塩し、凍結乾燥した。ＰＮおよびＣＣを凍結乾燥固体として冷凍貯蔵する。
Ｄ５６−０２を１０ｍｍｏｌスケールで製造した。外観は、白色粉末であり、判明した分子量は、７７８０（理論７７８５Ｄａ）であり、逆相ＨＰＬＣによる純度は、８５％であり、イオン交換ＨＰＬＣによる純度は、８６％であった。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５−（Ｄ５６−０１）（蛍光標識Ｄ５６−０１とも呼ばれる）は、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって調製された。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ブランド蛍光色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）によって販売されている。
（実施例Ｓ３）
Ｄ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）の製造。
Ｄ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）製造スキームは、図１に示した通り、３段階で構成される。ＦＩＣＯＬＬへの他のＰＮまたはＣＣコンジュゲートは、ＰＮもしくはＣＣ配列、ＰＮもしくはＣＣへのチオールリンカー、および／またはアミン架橋剤へのチオールを変更することによって、同じ製造経路により調製することができる。
段階１では、ＦＩＣＯＬＬをいくつかのステップで修飾して反応性マレイミド基を含め、［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを得る。段階２では、Ｄ５６−０２（（Ｄ５６−０１）−３’−ＳＳとも呼ばれる）中のジスルフィドを還元してチオールにし、Ｄ５６−０３（（Ｄ５６−０１）−３’−ＳＨとも呼ばれる）を形成する。段階３では、［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬおよびＤ５６−０３を反応させてＤ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）を形成する。精製は、プロセス中の各ステップで行う。最終Ｄ５６−０５溶液を滅菌濾過し、特徴付ける。Ｄ５６−０５溶液を−６０℃未満で貯蔵する。
図２は、ＦＩＣＯＬＬ中間体のカルボキシメチル化（ＣＭ）−ＦＩＣＯＬＬ、アミノエチルカルバミルメチル化（aminoethylcarbamylmethylated）［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬ、および［マレイミド（Ｍａｌ）−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ、ならびに最終生成物の［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれるＤ５６−０５を製造するためのプロセスを概説する。
Ｉ．ＦＩＣＯＬＬ ＰＭ４００の組成物。ＦＩＣＯＬＬ ＰＭ４００（ＦＩＣＯＬＬ４００）は、ナノ粒子の懸濁液として存在する、４００，０００＋／−１００，０００の報告された分子量を有するスクロースの合成、中性、高度分枝状ポリマーである。これは、スクロースをエピクロロヒドリンと共重合することによって形成される。ＦＩＣＯＬＬ ＰＭ４００は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から噴霧乾燥粉末として購入した。
ＩＩ．段階１、ステップ１：カルボキシメチル化−ＦＩＣＯＬＬ（ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ）の調製
ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬは、標準的な脱塩手順（例えば、５ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜を使用する透析）を使用する代わりに、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を用いたタンジェンシャルフロー分画（ＴＦＦ）を使用する精製を実施したことを除いて、Inman、J. Immunology、１９７５年、１１４巻：７０４〜７０９頁の方法によってＦＩＣＯＬＬ ＰＭ４００から調製した。ＴＦＦ精製は、標準的な脱塩手順と同様に低分子および過剰の試薬を除去した。
ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬを、塩基性条件下でＦＩＣＯＬＬ ＰＭ４００をクロロ酢酸ナトリウムと反応させることによって生成する。反応スキームを図３に示す。ＦＩＣＯＬＬ ＰＭ４００（１３ｇ）の溶液をＭｉｌｌｉ−Ｑ脱イオン水中１３０ｍｇ／ｍＬで調製した。溶液を４０℃循環水浴に接続されたジャケット付き反応器に４０〜４５分間移した。このＦＩＣＯＬＬ溶液に、２．７Ｍクロロ酢酸ナトリウム溶液９２．５ｍＬ、１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液５０ｍＬ、およびＭｉｌｌｉ−Ｑ脱イオン水７．５ｍＬを添加した。反応は、撹拌しながら４０℃で２．５時間進行させた。次いで、反応溶液を冷却したガラス瓶に移し、氷上に置いた。その直後、２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４ １０ｍＬを反応溶液に添加し、ｐＨを、２０％クロロ酢酸溶液を添加することによって７．０に調整した。粗製ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬを、精製の準備ができるまで低温（氷上）に保った。粗製ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬを、１００ｋＤａ ＭＷＣＯを有するタンジェンシャルフロー分画（ＴＦＦ）膜を伴ったシステムセットアップを使用してダイアフィルトレーションによって精製した。粗製ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬを、合計およそ１５〜１８体積交換について、０．２Ｍ水性塩化ナトリウムに対してダイアフィルトレーションした。各透過液ダイアボリュームの吸光度を２１５ｎｍで測定し、透過液の吸光度が０．１ＡＵに到達したとき、ダイアフィルトレーションを停止した。精製したＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ溶液を約３０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で貯蔵した。それぞれＦＩＣＯＬＬ ＰＭ４００ １３ｇから開始して、３ロットのＣＭ−ＦＩＣＯＬＬをこのプロセスによって調製した。ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬの収量は、６．７ｇ、７．１ｇ、および７．７ｇであった。
ＩＩＩ．段階１、ステップ２：Ｎ−（２−アミノエチル）カルバミルメチル化−ＦＩＣＯＬＬ（［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）の調製。［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬは、標準的な脱塩手順（例えば、５ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜を使用する透析）を使用する代わりに、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を用いたタンジェンシャルフロー分画（ＴＦＦ）を使用する精製を実施したことを除いて（セクションＢでＣＭ−ＦＩＣＯＬＬについて記載したように）、Inman（J. Immunology、１９７５年、１１４巻：７０４〜７０９頁）の方法によってＣＭ−ＦＩＣＯＬＬから調製した。
［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬを、ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬを大過剰のエチレンジアミン、および水溶性カルボジイミドと反応させることによって生成する。反応スキームを図４に示す。ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ溶液（０．２Ｍ水性塩化ナトリウム中約３０ｍｇ／ｍＬ）を２２℃循環水浴に接続されたジャケット付き反応器に２０〜３０分間移した。このＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ溶液に、エチレンジアミン二塩酸塩（ＦＩＣＯＬＬ当たりおよそ１３８００モル当量）を添加し、完全に溶解させた。溶液のｐＨを１Ｎ水性水酸化ナトリウムで４．７に調整した。次いで、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ−ＨＣｌ、ＦＩＣＯＬＬ当たりおよそ８３５モル当量）を撹拌しながら１０分の期間にわたって混合物に添加した。溶液のｐＨを点検し、必要であれば、１Ｎ水性水酸化ナトリウムまたは１Ｎ水性塩化水素で４．７に調整した。反応は、２２℃で３．５時間進行させ、この時間中に、必要に応じてｐＨを４．７に調整した。粗製［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬを、１００ｋＤａ ＭＷＣＯを有するタンジェンシャルフロー分画（ＴＦＦ）膜を伴ったシステムセットアップを使用してダイアフィルトレーションによって精製した。粗製［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬを、合計およそ１５〜２０体積交換について、１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５ 緩衝液に対してダイアフィルトレーションした。各透過液ダイアボリュームの吸光度を２１５ｎｍで測定し、透過液の吸光度が０．１ＡＵに到達したとき、ダイアフィルトレーションを停止した。精製した［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬ溶液を約３３ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２２μｍ孔サイズフィルターを使用して濾過し、アリコートし、−８０℃で貯蔵した。ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ６．５ｇ、７．０ｇ、および７．５ｇから開始して、３ロットの［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬをこのプロセスによって調製した。［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬの収量は、それぞれ５．４ｇ、５．９ｇ、および６．９ｇであった。実施例Ｓ４および実施例Ｓ５に記載の手順を使用して判定したアミンとＦＩＣＯＬＬのモル比（ｚ）は、それぞれ２２１、２１８、および２２４であった。
ＩＶ．ＳＭ−ＰＥＧ６ヘテロ二官能性リンカーの組成物。ＳＭ−ＰＥＧ６（スクシンイミジル−（（Ｎ−マレイミドプロピオンアミドール）−ヘキサエチレングリコール（hexethyleneglycol））エステル）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ＃２２１０５ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から得た。ＳＭ−ＰＥＧ６は、６エチレングリコール単位の親水性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーアームを含有する、６０１．６の分子量を有するアミン−スルフヒドリル架橋剤である。スペーサーアーム長は、約３２オングストロームである。ＳＭ−ＰＥＧｎの一般的な化学構造を図５に示す。ＳＭ−ＰＥＧ６について、ｎ＝６であり、使用した化合物の構造は、図５Ａに示した通りであった。実施例Ｓ１３におけるＤ５６−２５、Ｄ５６−２６、およびＤ５６−２７の調製について、それぞれ、ｎ＝２４、４５、および７０のＳＭ−ＰＥＧｎを使用した。
Ｖ．段階１、ステップ３：ＳＭ−ＰＥＧ６を使用する［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬの調製。［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを、［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬのＳＭ−ＰＥＧ６との反応によって調製した。反応スキームを図６に示す。［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬ溶液（１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５ 緩衝液中２０ｍｇ／ｍＬ、アミンとＦＩＣＯＬＬのモル比（ｚ）＝２１８〜２２４）を、撹拌バーを含有するプラスチック瓶に移した。別個のガラスバイアルにおいて、ＳＭ−ＰＥＧ６をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させて１００ｍｇ／ｍＬの最終濃度の溶液にした。ＳＭ−ＰＥＧ６溶液（アミン当たり５当量）を、撹拌しながら［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬに徐々に添加した。反応瓶を２５℃の乾燥空気インキュベーターに移し、反応を穏やかに撹拌しながら４０分間進行させた。次いで反応瓶を室温（２２〜２４℃）に移した。
ＦＩＣＯＬＬ上の未反応アミンを、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−アセテート（Ｓｕ−ＮＨＳ−Ａｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してキャッピングした。Ｓｕ−ＮＨＳ−Ａｃをガラスバイアル中のＤＭＳＯに溶解させて１００ｍｇ／ｍＬの濃度にした。Ｓｕ−ＮＨＳ−Ａｃ溶液（アミン当たり５当量）を［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ溶液に添加し、室温で１５分間撹拌した。このキャッピング反応は、ＦＩＣＯＬＬ上の未反応アミンをアセトアミドに変換し、それは、得られるＦＩＣＯＬＬ生成物の物理化学的性質にとって重要であり得る。
未反応ＳＭ−ＰＥＧ６およびＳｕ−ＮＨＳ−Ａｃをグリシンでクエンチした。グリシンを１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５ 緩衝液に溶解させて１００ｍｇ／ｍＬの濃度にし、溶液を０．２２μｍ孔サイズフィルターを使用して濾過した。グリシン溶液（ＳＭ−ＰＥＧ６およびＳｕ−ＮＨＳ−Ａｃの合計当たり１０当量）を［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ溶液に添加し、室温で１５分間撹拌した。
［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ粗調製物を精製の準備ができるまで低温（湿った氷上）に保ち、精製をコンジュゲーション反応と同じ日に実施した。粗製［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを、１００ｋＤａ ＭＷＣＯを有するタンジェンシャルフロー分画（ＴＦＦ）膜を伴ったシステムセットアップを使用してダイアフィルトレーションによって精製した。粗製［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５ 緩衝液を使用して約５．８ｍｇ／ｍＬに希釈し、合計およそ２４〜２９体積交換について、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５ 緩衝液に対してダイアフィルトレーションした。各透過液ダイアボリュームの吸光度を２１５ｎｍで測定し、透過液の吸光度が０．１ＡＵに到達したとき、ダイアフィルトレーションを停止した。精製した［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを滅菌ポリプロピレンバイアル中にアリコートし、−８０℃で貯蔵した。濃度は、約５．３ｍｇ／ｍＬであった。２つの最大スケール反応（パイロットロット４および５）について、［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬ ６５５ｍｇおよび１９００ｍｇを使用し、精製した［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ ４４４ｍｇおよび１２８８ｍｇを単離した。
［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬのマレイミドとＦＩＣＯＬＬのモル比（ｙ）は、実施例Ｓ４および実施例Ｓ６に概説した手順によって判定した。表Ｓ３−１は、３つの異なるロットの［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬ、２つの異なるロットのＳＭ−ＰＥＧ６リンカー、および２つの異なるスケールの生成を使用して生成した［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬの一貫性を示す。指定範囲のマレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ約１６２〜２２１）を有する［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬの生成は、以下の試薬およびプロセスパラメータの制御を必要とする：１）約２１８〜２２４のアミン：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｚ）での［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬの調製、２）高度に純粋なＳＭ−ＰＥＧ６リンカーを有すること、ならびに３）試薬濃度、化学量論比、イオン強度、ｐＨ、時間、および温度について規定された反応条件。
［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬパイロットロット４および５の純度を、表Ｓ３−２に示したパラメータを使用してサイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって査定した。粗製および精製パイロットロット４および５のクロマトグラムを図７に示す。精製パイロットロット４および５は、それぞれ１００％および９９．６％純粋であった。
ＳＭ−ＰＥＧ６リンカーを使用して製造した［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬは、米国特許第８，５９７，６６５号で以前に記載されたスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）リンカーを使用して製造した［マレイミド−ＭＣ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬより、水性緩衝液中で有意に可溶性であった。スルホ−ＳＭＣＣリンカーは、疎水性メチルシクロヘキシル（ＭＣ）連結基をもたらし、それは、［マレイミド−ＭＣ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを冷凍／解凍サイクル（複数可）後に水性緩衝液中でオイルアウトおよび／または沈殿させ、チオール活性化ポリヌクレオチド（ＰＮ）またはキメラ化合物（ＣＣ）との信頼できない反応をもたらす。［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬまたは［マレイミド−ＭＣ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬが、これらが調製された日に使用されない場合、これらは、マレイミド基が活性なままであるように冷凍して貯蔵されなければならない。［マレイミド−ＭＣ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬの異種混合物は、これらの芳しくない安定性に起因してＤ５６−０３（（Ｄ５６−０１）−３’−ＳＨとも呼ばれる）とのコンジュゲーション反応において使用しなかった。［マレイミド−ＭＣ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬの合成については実施例Ｓ１４を参照。
Ｆ．段階２、ステップ１：Ｄ５６−０３（（Ｄ５６−０１）−３’−ＳＨとも呼ばれる）の調製。Ｄ５６−０３（チオール）は、Ｄ５６−０２（ジスルフィド）の過剰のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）との反応によって調製した。反応スキームを図８に示す。生成の日に、Ｄ５６−０２（（Ｄ５６−０１）−３’−ＳＳとも呼ばれる）をフリーザーから取り出し、瓶を開ける前に少なくとも１〜２時間にわたって室温に平衡化させて、吸湿性凍結乾燥固体中への水分取込みを最小限にした。Ｄ５６−０２を活性化緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．５）に溶解させて約５６ｍｇ／ｍＬの名目上の濃度にした。溶液の実際の濃度は、２２．６５ｍｇ／ｍＬ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して２６０ｎｍの吸光度によって判定した。濃度を活性化緩衝液でおよそ２５ｍｇ／ｍｌに調整し、２６０ｎｍの吸光度によって検証した。
ＴＣＥＰ−ＨＣｌは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ＃２０４９０、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から得た。生成の日に、ＴＣＥＰ−ＨＣｌを活性化緩衝液に溶解させて４８±１ｍｇ／ｍＬの濃度にした。ＴＣＥＰ溶液を周囲研究室温度に保ち、３時間以内に使用した。
Ｄ５６−０２溶液に、ＴＣＥＰ溶液（５当量）を撹拌しながら室温で添加した。反応器を４０±２℃の水浴に移し、還元ステップを１２０±１０分間進行させた。得られた粗製Ｄ５６−０３溶液を約１０〜１５分間室温に冷却させた後、精製した。この反応は、パイロットロット４についてＤ５６−０２ ９８９ｍｇに対して実施し、パイロットロット５についてＤ５６−０２ １８１４ｍｇおよび１８３６ｍｇに対して２つのパートで実施した。
Ｄ５６−０３の精製は、製造者の推奨手順に従ってＸＫ５０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆｉｎｅ（カタログ＃１７−００３２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用してゲル濾過によって実現した。Ｇ２５脱塩クロマトグラフィーカラムは、ＡＫＴＡピュリファイヤークロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、以前にＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって制御した。粗製Ｄ５６−０３溶液を１５〜１６％の試料体積とカラム容積の比でＧ２５カラムにロードした。移動相は、３０ｃｍ／時間の流量でカラムに施した。カラムからの溶離液を２１５ｎｍおよび２６０ｎｍで監視し、試料収集は、溶離液吸光度がおよそ１００ｍＡＵより上に上昇したとき開始した。カラムにロードした試料体積の約１．６〜１．７倍の全体積を収集した。精製したＤ５６−０３溶液をアリコートし、−８０℃で貯蔵した。パイロットロット４および５の精製の詳細を表Ｓ３−３に詳述する。
Ｄ５６−０３の純度は、表Ｓ３−２に概説した手順を使用してＳＥＣ−ＨＰＬＣによって判定したところ、パイロットロット４および５について１００％であった（図９）。パイロットロット４および５について、Ｄ５６−０３ ８０２ｍｇおよび２９０４ｍｇをそれぞれ単離した。
Ｇ．段階３、ステップ１：Ｄ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）の調製。Ｄ５６−０５は、［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬのＤ５６−０３（（Ｄ５６−０１）−３’−ＳＨとも呼ばれる）との反応によって調製した。反応スキームを図１０に示す。
［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬおよびＤ５６−０３はともに反応性であり、注意して取り扱わなければならない。両材料は、−８０℃で冷凍貯蔵し、使用直前に４℃の水浴中で数時間解凍した。［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ溶液（約５．３ｍｇ／ｍＬ、マレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）＝２０６〜２２１）を、撹拌バーを含有するプラスチック瓶に移した。この溶液に、Ｄ５６−０３の溶液（約１１．５ｍｇ／ｍＬ、マレイミド当たり０．６４〜０．６９当量、ＦＩＣＯＬＬ当たり１４１当量）を撹拌しながら添加した。反応器中の体積を、５ｍｇ／ｍＬの最終Ｄ５６−０３濃度を得るために１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５で調整した。次いでコンジュゲーション反応物を２５℃の乾燥空気インキュベーターに移し、反応を穏やかに撹拌しながら１時間進行させた。パイロットロット４について、［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ ２１８ｍｇおよびＤ５６−０３ ６００ｍｇを使用した。パイロットロット５について、［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ ８７４ｍｇおよびＤ５６−０３ ２４００ｍｇを使用した。
ＦＩＣＯＬＬ上の未反応マレイミド基を、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５ 緩衝液中のシステインの１００ｍｇ／ｍＬ溶液（マレイミド当たり１０当量）を使用して室温で１５分間キャッピングした。次いで粗製［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬを低温室（２〜８℃）に移し、一晩貯蔵した。このキャッピング反応は、ＦＩＣＯＬＬにシステインを導入し（硫黄による共有結合（covalent bond）を介して）、Ｄ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）生成物の物理化学的性質にとって重要であり得る。
Ｄ５６−０５の精製は、表Ｓ３−４に記載した通り、ダイアフィルトレーションによって実施した。粗製Ｄ５６−０５の体積を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４２ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２ 緩衝液で調整した。各ダイアボリューム（フィードリザーバー中の出発試料体積に等しい透過液の体積）で、透過液の試料を採取して２１５ｎｍの吸光度を判定した。ダイアフィルトレーションは、透過液吸光度が０．０５ＡＵ未満に下がったとき終了した。ダイアフィルトレーションを完了した際、Ｄ５６−０５試料をＴＦＦシステムから回収し、０．２２μｍフィルターを使用して滅菌濾過した。Ｄ５６−０５をアリコートし、−６０℃未満で貯蔵した。Ｄ５６−０５パイロットロットを特徴付け、結果を実施例Ｓ９に提供する。
（実施例Ｓ４）
ＦＩＣＯＬＬ含有中間体および生成物中のＦＩＣＯＬＬ濃度を判定する手順。
ＦＩＣＯＬＬ含有中間体および生成物のＦＩＣＯＬＬ濃度は、ＦＩＣＯＬＬ ＰＭ４００を、アッセイの検量線を作成するのに使用したことを除いて、製造者のプロトコールに従ってＰｉｅｒｃｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（製品＃２３２６０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して判定した。
（実施例Ｓ５）
［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬ溶液中のアミン濃度およびアミン：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｚ）を判定する手順。
［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬのアミン濃度は、製造者のプロトコールに従ってＰｉｅｒｃｅ Ｆｌｕｏｒａｌｄｅｈｙｄｅ ＯＰＡ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（製品＃２６０２５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して判定した。グリシンを使用してアッセイの検量線を作成した。アミン：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｚ）は、アミン濃度をＦＩＣＯＬＬ濃度で除すことによって計算し、ここでＦＩＣＯＬＬ濃度は、実施例Ｓ４に記載した通りに判定し、濃度は、モル濃度の単位でのものであった。
（実施例Ｓ６）
［マレイミド］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ溶液中のマレイミド濃度およびマレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）を判定する手順。
［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬおよび［マレイミド−ＭＣ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬのマレイミド濃度は、エルマン試薬（５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）、製品番号２２５８２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して判定した。［マレイミド］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを製造者のプロトコールに従って過剰のシステインと反応させ、残っているシステインをシステイン検量線を使用して定量化した。マレイミド濃度は、初期システイン濃度から残っているシステイン濃度を減じることによって判定した。マレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）は、マレイミド濃度をＦＩＣＯＬＬ濃度で除すことによって計算し、ここでＦＩＣＯＬＬ濃度は、実施例Ｓ４に記載した通りに判定し、濃度は、モル濃度の単位でのものであった。
（実施例Ｓ７）
ＦＩＣＯＬＬコンジュゲート（例えば、Ｄ５６−０５、［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）中のポリヌクレオチド（ＰＮ）またはキメラ化合物（ＣＣ）濃度およびＰＮ：ＦＩＣＯＬＬまたはＣＣ：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）を判定する手順。
Ｄ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）のＤ５６−０１（ＣＣ）濃度は、紫外分光光度法およびベールの法則式を使用して判定した。（慣習により、ＦＩＣＯＬＬに付着したキメラ化合物は、この段階で、リンカーを有するキメラ化合物、Ｄ５６−０３がこの化合物を形成するのに使用されたが、配列名称Ｄ５６−０１によって参照されることに留意されたい）。２６０ｎｍの吸光度を判定し、Ｄ５６−０１について２２．６５ｍｇ／ｍｌ−１×ｃｍ−１の吸光係数を使用した。ＦＩＣＯＬＬおよびリンカーは、２６０ｎｍで吸収せず、したがって吸光度は、ＣＣ、Ｄ５６−０１の吸光度に単に起因する。ｍｇ／ｍＬでのＤ５６−０１濃度をＤ５６−０１の遊離酸の分子量を使用してモル濃度に変換した。ＣＣ：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）は、ＣＣ濃度をＦＩＣＯＬＬ濃度で除すことによって判定し、ここでＦＩＣＯＬＬ濃度は、実施例Ｓ４に記載した通りに判定し、濃度は、モル濃度の単位でのものであった。他のＰＮ−ＦＩＣＯＬＬまたはＣＣ−ＦＩＣＯＬＬ溶液の濃度は、必要に応じて、使用したＰＮまたはＣＣの吸光係数および遊離酸分子量を使用して判定する。
（実施例Ｓ８）
粒径を判定する手順。
ＦＩＣＯＬＬ試料（例えば、Ｄ５６−０５）の粒径（Ｚ−アベレージ）および標準偏差（ＳＤ）は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。試料を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４２ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２ 緩衝液で０．５ｍｇ／ｍＬのＦＩＣＯＬＬ濃度に希釈し、規定された機器設定下で測定した。較正された５０ｎｍポリスチレンナノスフェア試料（製品＃３０５０Ａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）をシステム適性対照として分析に含め、これは、４９±６ｎｍの粒径を有していた。
（実施例Ｓ９）
精製した、［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれるＤ５６−０５の物理化学的特徴付け。
Ｄ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）の５つのパイロットロットを実施例Ｓ３に概説した手順を使用して製造した。これらのロットを特徴付け、結果を表Ｓ９−１に要約する。純度は、２１５ｎｍで検出して表Ｓ３−２に概説した手順を使用してＳＥＣ−ＨＰＬＣによって判定したところ、９９％超〜１００％の範囲であった。ＦＩＣＯＬＬ濃度は、実施例Ｓ４に記載の手順によって判定した。ＦＩＣＯＬＬ濃度については、ダイアフィルトレーションにおける保持液の最終濃度を制御することによって目標を定めることができる。Ｄ５６−０１濃度およびＤ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬ比（ｘ）は、実施例Ｓ７に記載の手順によって判定した。Ｄ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）は、１１７〜１４０の範囲であり、実施例Ｓ３に記載の製造手順がＦＩＣＯＬＬに対するキメラ化合物の担持量について高レベルの制御をもたらすことを実証した。このプロセスの標的Ｄ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）は、１２０±３０である。Ｄ５６−０５の粒径は、実施例Ｓ８に記載した通りに判定した。
表Ｓ９−１に示した結果は、Ｄ５６−０５の５つの連続して生成したパイロットロットの生成の一貫性を例示する。Ｄ５６−０５の重要な特性Ｄ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）および粒径のこの高レベルの制御は、実施例Ｓ３に概説した試薬および手順を使用することによって実現した。［マレイミド］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを製造するのにスルホ−ＳＭＣＣリンカーの代わりにＳＭ−ＰＥＧ６リンカーを使用することは、極めて重要であった。その理由は、ＳＭ−ＰＥＧ６リンカーが生成物を有意により水溶性にし、マレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）およびＤ５６−０３との反応性の制御を改善するためである。その上、試薬の品質（純度）ならびに当量の数、濃度、ｐＨ、イオン強度、時間、および温度（実施例Ｓ３に記載した）を含めたプロセスパラメータの制御は、一貫した結果を実現するのに極めて重要であった。実施例Ｓ４〜Ｓ８に記載の分析手順の開発も、プロセスの制御に必要であった。
（実施例Ｓ１０）
Ｄ５６−０５凍結乾燥製剤。
５℃超で貯蔵されるＤ５６−０５溶液製剤の安定性に限界があったため、制御された室温で良好な安定性を実現することを目標としたＤ５６−０５凍結乾燥製剤の開発を行った（実施例Ｓ１１を参照）。凍結乾燥される製剤の組成の選択は、熱安定性に影響し得るｐＨおよびイオン強度を制御するのに一般的に安全と認められる（ＧＲＡＳ）賦形剤を使用したプレフォーミュレーション研究に基づいた。Ｄ５６−０５霊長類投与量に基づいた一連の試験製剤を冷凍／解凍安定性について試験し、溶液透明度およびＨＰＬＣサイジングクロマトグラフィーに基づいて評価した。１ｍｇ／ｍｌ Ｄ５６−０５（パイロットロット２）、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７．５）、および３００ｍＭトレハロースを含有する製剤は、１０サイクル実験を通じて同一のクロマトグラフィー挙動および動的光散乱プロファイルを示したので、さらなる開発のために選択した。上述した製剤を、およそ−３５℃での棚冷凍、その後の−３５℃（約６０μｂａｒ真空）での３６時間の一次乾燥、３０℃の棚温度への２時間の移行、および追加の２４時間にわたる二次乾燥からなる凍結乾燥サイクルに付した。凍結乾燥した生成物（４０バイアル）は、１〜１．４％の残留水分を有すると示された許容されるケーキであった。製剤を水１ｍＬ中に復元し、生成物は、製剤直後または凍結乾燥および復元プロセス後に分析したとき、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってまったく同様に挙動することが示された。
（実施例Ｓ１１）
Ｄ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）溶液および凍結乾燥製剤の安定性。
本実施例は、液体および凍結乾燥した物質の安定性を記述する。
Ａ．Ｄ５６−０５溶液製剤の安定性。１２カ月の貯蔵にわたるＤ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）溶液製剤の安定性を評価した。溶液製剤は、約３〜５ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４２ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２ 緩衝液に溶解したＤ５６−０５からなっていた。Ｄ５６−０５溶液製剤（パイロットロット４）の安定性を−８０℃、５℃、および３７℃の貯蔵温度で評価した。安定性試験は、ｐＨ、Ｄ５６−０１濃度（実施例Ｓ７）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＤ５６−０５の％純度（表Ｓ３−２、２１５ｎｍでの検出）、および粒径分析（実施例Ｓ８）を含んでいた。
表Ｓ１１−１および表Ｓ１１−２は、−８０℃、５℃、および３７℃にて最大で１２カ月間貯蔵したＤ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）溶液製剤、パイロットロット４の安定性結果を示す。時間０の結果は、表Ｓ９−１に示されている。
Ｄ５６−０５溶液製剤、パイロットロット４について、ｐＨ、Ｄ５６−０１濃度、Ｄ５６−０５純度、および粒径は、最大で１２カ月間、冷凍（−８０℃）または冷蔵（５℃）条件で貯蔵して有意に変化しなかった。しかし３７℃で、ｐＨおよびＤ５６−０５純度はともに、より長い貯蔵時間で有意に低下し、一方、Ｄ５６−０１濃度および粒径は、一貫したままであった。異なる貯蔵条件下でのＤ５６−０５粒径の一貫性は、Ｄ５６−０５が経時的に凝集しないことを示す。
Ｂ．Ｄ５６−０５凍結乾燥製剤安定性。１２カ月の貯蔵にわたるＤ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）凍結乾燥製剤の安定性を評価した。凍結乾燥製剤は、実施例Ｓ１０に記載されている。Ｄ５６−０５凍結乾燥製剤の安定性を４℃、２５℃、および３７℃の貯蔵温度で評価した。安定性試験は、ｐＨ、Ｄ５６−０１濃度（実施例Ｓ７）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＤ５６−０５の％純度（２１５ｎｍでの検出を含む表Ｓ３−２）、および粒径分析（実施例Ｓ８）を含んでいた。
表Ｓ１１−３は、４℃、２５℃、および３７℃で最大で１２カ月間貯蔵したＤ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）凍結乾燥製剤の安定性結果を示す。凍結乾燥前の（ｐｒｅ−ｌｙｏ）Ｄ５６−０５製剤についてのデータも表Ｓ１１−３に含まれている。
Ｄ５６−０５凍結乾燥製剤について、ｐＨ、Ｄ５６−０１濃度、およびＤ５６−０５純度は、４℃、２５℃、および３７℃にて最大で１２カ月間貯蔵して有意に変化しなかった。粒径も４℃にて最大で１２カ月間貯蔵して安定であった。しかし、粒径の軽微な増大が２５℃で１２カ月間貯蔵した生成物について観察され、一方、粒径の大きな増大（約６×）が３７℃で１２カ月間貯蔵した試料について明白であった。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性（ヒトＢ細胞ＩＬ−６産生）は、いずれの温度でも１２カ月貯蔵した後未変化であった。凍結乾燥製剤は、２５℃で少なくとも１２カ月にわたって十分に安定であると結論付けられた。
Ｄ５６−０５溶液製剤は、冷凍（−８０℃）および冷蔵（５℃）貯蔵条件で安定であるが、Ｄ５６−０５凍結乾燥製剤は、特に２５℃および３７℃というより高い貯蔵温度で、溶液中のＤ５６−０５と比較して安定性の増強を示した。
（実施例Ｓ１２）
異なるマレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）を用いた［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬの調製、および精製したＤ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）におけるＤ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）に対するインパクト。
異なるマレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）を有する［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬロットを、より小さいスケールであることおよび異なる量のＳＭ−ＰＥＧ６（アミン当たり０．２５、０．５、０．７５、１．０、＆ ２．０当量）を使用したことを除いて、実施例Ｓ３、セクションＥに記載の手順を使用して（ＡＥＣＭ）ｚ−ＦＩＣＯＬＬ（アミン：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｚ）＝２２４）から生成した。マレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）は、実施例Ｓ４およびＳ６に記載の手順によって判定した。表Ｓ１２−１の結果は、異なる量のＳＭ−ＰＥＧ６を添加すると、８〜１８５のマレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）を有する［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬが生じたことを示す。次いで［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬロットをＤ５６−０３（マレイミド当たり１．１当量）と反応させ、得られたＤ５６−０５ロットを実施例Ｓ３、セクションＧに記載した通りに精製した。Ｄ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）ロットのＤ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）を実施例Ｓ４およびＳ７に記載した通りに判定したところ、２４〜１５４の範囲であった（表Ｓ１２−１）。これらの結果は、Ｄ５６−０５中のＤ５６−０１担持量を、［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬの調製に使用されるＳＭ−ＰＥＧ６の量によって制御することができることを示す。これらの化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力について実施例Ｂ９を参照。
（実施例Ｓ１３）
それぞれｎ＝２４、４５、および７０であるＳＭ−ＰＥＧｎリンカーを使用するＤ５６−２５、Ｄ５６−２６、およびＤ５６−２７（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧｎ］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）の調製。
異なるＰＥＧリンカー長を有する［マレイミド−ＰＥＧｎ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬロットを、より小さいスケールであることおよびそれぞれｎ＝２４、４５、および７０のＳＭ−ＰＥＧｎリンカーを使用したことを除いて、実施例Ｓ３、セクションＥに記載の手順を使用して（ＡＥＣＭ）ｚ−ＦＩＣＯＬＬ（アミン：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｚ）＝２２４）から生成した（ＳＭ−ＰＥＧｎの化学構造については図５を参照）。使用したＳＭ−ＰＥＧ２４試薬は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から得た。これは、ｎが２４である図５Ａに示した構造を有する。使用したＳＭ−ＰＥＧ４５およびＳＭ−ＰＥＧ７０試薬は、Ｎａｎｏｃｓ Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）から得た。構造は、図５−Ｂに示した通りである（ｎは、それぞれ４５および７０である）。得られた［マレイミド−ＰＥＧｎ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬロットのマレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）は、実施例Ｓ４およびＳ６に記載した通りに判定し、結果を表Ｓ１３−１に示す。マレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）は、１９９〜２２７の範囲であり、ＰＥＧリンカー長は、得られるマレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比に有意に影響しなかったことを示した。
Ｄ５６−２５、Ｄ５６−２６、およびＤ５６−２７（それぞれｎ＝２４、４５、および７０である［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧｎ］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）を、より小さいスケールであることを除いて実施例Ｓ３、セクションＧに記載した通りに３つの［マレイミド−ＰＥＧｎ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬロットから調製した。［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧｎ］ｘ−ＦＩＣＯＬＬロット（Ｄ５６−０５（ｎ＝６）、Ｄ５６−２５（ｎ＝２４）、Ｄ５６−２６（ｎ＝４５）、およびＤ５６−２７（ｎ＝７０））のＤ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）を実施例Ｓ４およびＳ７に記載した通りに判定し、平均粒径を実施例Ｓ８に記載した通りに判定した。Ｄ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）は、１０８〜１１６の範囲であり（表Ｓ１３−１）、ＰＥＧリンカー長は、得られるＤ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比に有意に影響しないことを示した。しかし、平均粒径の増大があり（５５ｎｍ〜９１ｎｍ）、それは、ＰＥＧリンカーの長さの増大と相関した（表Ｓ１３−１）。これらの化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力については実施例Ｂ１０を参照。
（実施例Ｓ１４）
［マレイミド−ＭＣ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬの調製。
［マレイミド−ＭＣ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを、米国特許第８，５９７，６６５号に記載のスルホ−ＳＭＣＣリンカーを使用して［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬから製造した。［マレイミド−ＭＣ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬは、オイルアウトおよび／または沈殿として観察される水性緩衝液中の溶解性問題を示した。マレイミド−ＭＣ−ＦＩＣＯＬＬの取り扱いが困難だったため、チオール活性化ポリヌクレオチド（ＰＮ）またはキメラ化合物（ＣＣ）とのコンジュゲーション反応は一貫性がなかった。
（実施例Ｓ１５）
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５−（Ｄ５６−０５）（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５／［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）の調製。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５のアミン反応性誘導体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５−ＮＨＳエステル）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から購入した。実施例Ｓ３に記載した通りに調製したＡＥＣＭ−ＦＩＣＯＬＬをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５−ＮＨＳエステルおよびＳＭ−ＰＥＧ６の混合物と反応させることによって活性化してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５／［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを形成し、これを実施例Ｓ３に記載した通りにＤ５６−０３（（Ｄ５６−０１）−３’−ＳＨとも呼ばれる）と反応させてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５−（Ｄ５６−０５）（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５／［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）を得た。
（実施例Ｓ１６）
Ｄ５６−０８、Ｄ５６−０９、Ｄ５６−１２、およびＤ５６−１３の調製。
Ｄ５６−０８、Ｄ５６−０９、Ｄ５６−１２、およびＤ５６−１３を米国特許第８，５９７，６６５号に記載されている通りに調製する。
（実施例Ｓ１７）
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７−（Ｄ５６−０５）（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７／［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）の調製。
Ｆｌｕｏｒ６４７−ＮＨＳエステル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をｒＰＡと反応させてｒＰＡ当たり１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の得られた比でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７／ｒＰＡを得た。
生物学的実施例
（実施例Ｂ１）
ヒト白血球の単離および刺激。
ポリヌクレオチド（ＰＮ）およびキメラ化合物（ＣＣ）の活性を、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および単離Ｂ細胞によるサイトカイン分泌の測定、およびＢ細胞増殖の測定によってｉｎ ｖｉｔｒｏで査定した。細胞培養培地中に分泌されたサイトカインレベルは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。
ヒト血液は、健康なヒトドナーからインフォームドコンセントとともに得た。ＰＢＭＣは、ＦＩＣＯＬＬ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）密度勾配遠心分離によって単離した。ヒトＢ細胞は、抗ＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いた正の選択によって単離した。ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は、抗ＢＤＣＡ−２マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いた正の選択によって単離した。単離ｐＤＣを全ＰＢＭＣのプールに戻して添加し、ドナーによって０．５〜２．４％に変動する全ＰＢＭＣ中の最終ｐＤＣ濃度をもたらした。
細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）＋５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、および１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０ （ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に再懸濁させた。Ｂ細胞刺激について、細胞を、５．５〜０．００５４μＭの濃度範囲のＰＮまたはＣＣとともに２通りに９６ウェル丸底プレート中１ｍＬ当たり０．７５×１０６で９０〜９３時間培養した。ＰＢＭＣおよびｐＤＣ富化ＰＢＭＣ刺激について、細胞を、２．５〜０．００１２μＭの濃度範囲のＰＮまたはＣＣとともに３通りに９６ウェル平底プレート中１ｍＬ当たり２．５×１０６で２１〜２４時間培養した。
ＥＬＩＳＡアッセイ。ＩＬ−６およびＩＦＮ−αレベルを、市販の抗体対（ＭａｂＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を使用してアッセイした。最小限の検出の限界は、ＩＬ−６について３１ｐｇ／ｍＬおよびＩＦＮ−αについて２３ｐｇ／ｍＬであった。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレートをサイトカイン特異的Ａｂで被覆し、次いでＤＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロックした。細胞培養試料を添加し、結合したサイトカインを、ビオチン標識二次抗体を添加し、その後西洋わさびペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ特異的比色基質を添加することによって検出した。検量線は、ＩＬ−６についてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびＩＦＮ−αについてＭａｂＴｅｃｈから購入した組換えサイトカインを使用して作成した。吸光度値は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０またはＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して６５０ｎｍでバックグラウンド減算して４５０ｎｍで判定した。最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値は、表にしたすべてのドナーについての累積的アベレージで内挿することによって各個体ドナーから計算した。ＥＣ５０は、最大サイトカインレベルの半分に等しい値を与えるＰＮまたはＣＣ濃度として定義した。
（実施例Ｂ２）
マウス脾細胞の単離および刺激
ポリヌクレオチド（ＰＮ）およびキメラ化合物（ＣＣ）の活性を、マウス脾細胞によるサイトカイン分泌を測定することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで査定した。細胞培養培地中に分泌されたサイトカインレベルは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。
生後８〜２０週のＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓を回収し、脾細胞を、標準的な裂きおよびＡＣＫ溶解緩衝液（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いた処置を使用して単離した。４つの脾臓を実験においてプールした。細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋５０μＭ ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁させた。刺激のために、脾細胞を、２２〜０．０００３μＭの濃度範囲のＰＮまたはＣＣとともに３通りに９６ウェル平底プレート中１ｍＬ当たり３．５×１０６細胞で２０〜２４時間培養した。
ＥＬＩＳＡアッセイ。ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０レベルを、市販の抗体対（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用してアッセイした。最小限の検出の限界は、ＩＬ−６について３１ｐｇ／ｍＬおよびＩＬ−１２ｐ４０について６３ｐｇ／ｍｌであった。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレートをサイトカイン特異的Ａｂで被覆し、次いでＤＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロックした。培養上清を添加し、結合したサイトカインを、ビオチン標識二次抗体を添加し、その後ＨＲＰおよびペルオキシダーゼ特異的比色基質を添加することによって検出した。検量線は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した組換えサイトカインを使用して作成した。吸光度値は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０またはＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して６５０ｎｍでバックグラウンド減算して４５０ｎｍで判定した。ＥＣ５０は、最大サイトカインレベルの半分に等しい値を与えるＰＮまたはＣＣの濃度として定義した。ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０のＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、Ｘ＝Ｌｏｇ（Ｘ）変換データのＳ字形用量応答曲線フィットを使用して判定した。
（実施例Ｂ３）
線状キメラ化合物（ＣＣ）配列最適化。
２つの別個の実験を行った。以下の表において、平均は、幾何平均を指す。
Ａ．実験１。線状ＣＣ Ｄ５６−１４は、ヒトＰＢＭＣからＩＦＮ−α、ヒトＢ細胞からＩＬ−６を誘導し、マウス脾細胞を刺激することが以前に示されていた（米国特許第８５９７６６５号）。配列最適化を実施して、ＩＦＮ−α活性をＤ５６−１４と比べて改善することができるか否かを判定した。７種の新しい線状ＣＣを一次スクリーニングアッセイ、すなわち、ヒトＰＢＭＣ ＩＦＮ−α活性およびヒトＢ細胞ＩＬ−６活性において試験した（手順については実施例Ｂ１を参照）。本実施例で使用した線状ＣＣの一般構造、Ｎ１−Ｓ１−Ｎ２−Ｓ２−Ｎ３を使用して、ＣＣ内の核酸モチーフ（Ｎ）の配置を記述することができる。本研究における新しいＣＣのうちの６種はすべて、Ｎ３位置にマウスモチーフ、５−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’を含有した。Ｄ５６−２４は、Ｎ２位置にマウスモチーフを含有しており、スクリーニングに含めて、線状のＣＣ場面におけるマウス活性モチーフの異なる適所配置を探索した。Ｄ５６−１０は、公知のＣｐＧ−Ｂ免疫刺激性配列（ＩＳＳ）であり、陽性対照としてパネルに含めた。
線状ＣＣ Ｄ５６−１６、Ｄ５６−１８、Ｄ５６−１９、ならびにＤ５６−２２およびＤ５６−２４は、Ｄ５６−１４と比較して同様のまたは改善されたＰＢＭＣ ＩＦＮ−α活性（表Ｂ３−１）、および同様のまたはわずかに低減したヒトＢ細胞活性（表Ｂ３−２）を示した。線状ＣＣ Ｄ５６−２４は、試験した配列のうちで最良のＰＢＭＣ ＩＦＮ−αおよびヒトＢ細胞活性を示した。上述したように、Ｄ５６−２４と他の配列との間の主要な差異は、それぞれＮ２およびＮ３のヒトおよびマウスモチーフがＤ５６−２４において交換されており、その結果、マウスモチーフが他の新しいＣＣにおけるＮ３位置と比較してＮ２位置に位置していることである。
Ｂ．実験２。実験１からの結果に基づいて、ＣＣ配列の新しいパネルを、ヒトおよびマウス活性を増大させる目標で設計した。具体的には、Ｄ５６−１６、Ｄ５６−１８、Ｄ５６−１９、およびＤ５６−２２に関連した４つの新しい配列を、マウスモチーフをＮ２位置に移動させて設計した：Ｄ５６−１７、Ｄ５６−０１、Ｄ５６−２０、およびＤ５６−２３。新しいＣＣの最初のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングをマウス脾細胞で実施した（表Ｂ３−３および表Ｂ３−４）。Ｎ２位置にマウスモチーフを有するすべての配列は、Ｎ３位置にマウスモチーフを有する対応するＣＣと比較して強く改善されたＩＬ−６およびＩＬ１２ｐ４０効力を示した。Ｄ５６−０１およびＤ５６−２３は、試験したＣＣのうちで最良のＩＬ−６効力を示し、一方、Ｄ５６−０１は、最良のＩＬ−１２ｐ４０効力を有した。
ヒトＰＢＭＣ ＩＦＮ−α活性およびヒトＢ細胞ＩＬ−６活性の結果を、それぞれ表Ｂ３−５および表Ｂ３−６に示す。意外にも、Ｎ２位置にマウスモチーフを有すると、ヒトＰＢＭＣ ＩＦＮ−α効力も有意に改善された。一般に、ヒトＩＬ−６効力も、Ｎ２位置にマウスモチーフを有するＣＣについて改善された。
実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のうちで、ＩＦＮ−α効力が、がん、抗ウイルス、喘息、およびアレルギーモデルにおける良好なｉｎ ｖｉｖｏ活性について最も予言に役立つと考えられる。このことに基づいて、Ｄ５６−０１、Ｄ５６−１７、Ｄ５６−２０、Ｄ５６−２３、およびＤ５６−２４をリード候補と見なした。これらの配列は、良好なヒトＢ細胞ＩＬ−６およびマウスＩＬ−６活性も示した。意外にも、Ｄ５６−０１は、他のＮ２マウスモチーフ配列と比較して有意に改善されたＩＬ１２ｐ４０効力を有する。
（実施例Ｂ４）
Ｄ５６−０５は、Ｄ５６−０１より強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ応答を誘導する。
ヒトおよびマウスサイトカインの両方の誘導の効力に基づいて、Ｄ５６−０１をナノ粒子製剤を開発するためのリード候補として選択した。Ｄ５６−０１配列を実施例Ｓ３に記載した通りにＦＩＣＯＬＬにコンジュゲートさせて、Ｄ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）を生成した。次いでＤ５６−０１およびＤ５６−０５を、ヒトＰＢＭＣ ＩＦＮ−αおよびヒトＢ細胞ＩＬ−６の誘導についての相対的なｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を比較した。ヒトＰＢＭＣ ＩＦＮ−α活性およびヒトＢ細胞ＩＬ−６活性の結果を、それぞれ表Ｂ４−１および表Ｂ４−２に示す。配列Ｄ５６−１０およびＤ５６−１４を本実験における歴史的陽性対照として使用した。
ナノ粒子製剤Ｄ５６−０５は、ＩＦＮ−α（表Ｂ４−１）およびＩＬ−６活性（表Ｂ４−２）の両方の誘導において著しくより強力であった。
（実施例Ｂ５）
Ｄ５６−０５は、Ｄ５６−０１より強力なｉｎ ｖｉｖｏ応答を誘導する。
Ｄ５６−０５およびＤ５６−０１をマウスおよびカニクイザルに投与した後の自然免疫応答の誘導を評価した。サルにおいて、インターフェロン経路関連遺伝子発現を、Ｄ５６−０５およびＤ５６−０１を投与する前、および投与して２４時間後に収集した血液試料中で測定した。マウスにおいて、インターフェロン経路およびケモカイン関連遺伝子発現を、化合物投与の１８時間後に回収した注射部位流入領域リンパ節中で測定した。Ｄ５６−０５およびＤ５６−０１を獲得する抗原提示細胞集団の相対能力を、化合物注射の２４時間後にマウスから回収した注射部位流入領域リンパ節中で評価した。その上、成熟マーカー発現（ＣＤ６９、ＣＤ８６）を、化合物注射の２０時間後に回収したリンパ節由来の形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に対して測定した。
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をＶａｌｌｅｙ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）またはＢａｔｔｅｌｌｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）に収容し、そこでオールインライフ（all in life）手順を実行した。健康な成体動物のみを各研究において使用した。全血を、免疫化前後にＰＡＸｇｅｎｅチューブ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖｅｎｌｏ、ＮＬ）に収集し、製造者の使用説明書に従ってＲＮＡを後で抽出するために冷凍した。３〜６匹のサルの群に、ＰｈａｒｍＡｔｈｅｎｅ（Ａｎｎａｐｏｌｉｓ、ＭＤ）製炭疽組換え防御抗原（ｒＰＡ）１０μｇを、単独で、あるいはＰＢＳ １ｍＬ中のＤ５６−０５ １０００、２５０、もしくは５０μｇ、またはＤ５６−０１ １０００もしくは２５０μｇと組み合わせて、筋肉内経路（四頭筋）によって免疫した。
免疫原性研究のために、カニクイザルの群に、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）製ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）１ｍｌの全体積中Ｄ５６−０１またはＤ５６−０５の用量を含む／含まないｒＰＡをｉ．ｍ．（四頭筋）またはｓ．ｃ．経路によって免疫し、引き続いて採血してＡｂ応答に対するアジュバントの効果を査定した。
スイスウェブスター、ＢＡＬＢ／ｃ、およびＣ５７ＢＬ／６マウス（生後８〜１２週）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）から購入し、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）またはＭｕｒｉｇｅｎｉｃｓ（Ｖａｌｌｅｊｏ、ＣＡ）に収容し、そこでオールインライフ手順を実行した。ＴＬＲ９−／−マウスをＳｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｉｌｒｏｙ、ＣＡ）で維持し、生後８〜１６週で使用した。
免疫原性、組織分布、および全身毒性研究のために、マウスの四頭筋に、ｒＰＡを含む／含まないアジュバント、またはｒＰＡ単独を注射した。筋組織応答を査定する研究のために、マウスの四頭筋に両側性に、アジュバント単独を注射した。遺伝子発現およびフローサイトメトリー査定を含めた流入領域リンパ節応答に関して、マウスの後足蹠の両方に、ｒＰＡを含む／含まないアジュバントを注射した。Ｄ５６−０１−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５は、使用したとき、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５／Ｄ５６−０５特異的相対的蛍光をマッチさせる比で非標識Ｄ５６−０１と組み合わせて投与した。すべての免疫化は、ＤＰＢＳまたは１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液５０μＬの全体積中で実施した。
遺伝子発現分析のために、マウスにＤＰＢＳ、またはＤ５６−０５もしくはＤ５６−０１ １０μｇを筋肉内または皮下経路（足蹠）によって注射した。筋組織および流入領域リンパ節をそれぞれ６時間または１８時間に、ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）中に回収し、製造者の使用説明書に従ってＲＮＡを後に抽出するために冷凍した。フローサイトメトリーによって化合物の細胞取込みを定量化するために、流入領域リンパ節を、蛍光標識Ｄ５６−０１またはＤ５６−０５ ２５μｇを注射して２４時間後に回収した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５−（Ｄ５６−０１）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５−（Ｄ５６−０５）の製造については、それぞれ実施例Ｓ２およびＳ１５を参照。フローサイトメトリーを使用して細胞表面マーカーを分析するために、流入領域リンパ節を、非蛍光標識Ｄ５６−０１またはＤ５６−０５ ５、２、または０．２μｇを注射して２０時間後に回収した。フローサイトメトリー実験のために、単一細胞懸濁液を、リンパ節をプールした処置群から調製した。
臓器をＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）中で冷凍した。トータルＲＮＡを、ともにオンカラムＤＮａｓｅ Ｉ消化を用いて、ＲＮｅａｓｙ線維性組織ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して個々のホモジナイズされた筋肉当たり３０ｍｇおよびＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してホモジナイズされた膝窩リンパ節全体から単離した。
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）。ｃＤＮＡを、組換えＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトータルＲＮＡ試料から調製した。ｍＲＮＡの定量化は、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。サイクリング条件は、９５℃で１５分、その後の４０ラウンドの９５℃で１５秒および６０℃で１分であり、ＳｔｅｐＯｎｅ ｖ２．１ソフトウェアを使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムによって分析した。ユビキチンを参照遺伝子として使用した。ＰＣＲ後に、Ｃｔ値を判定し、正規化されたデータを免疫化前またはＤＰＢＳ対照に対する倍率増大として表現した。あるいは、製造者の指示に従ってサイトカインおよびケモカインについてＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲアレイシステム（Ｑｉａｇｅｎ）とともに使用するために、ＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）によってＲＮＡを逆転写した。
フローサイトメトリー。単一細胞懸濁液をマウス組織から調製し、２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ、２型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）で３７℃にて４５分間最初に消化した筋肉を除いて実験群によってプールした。クローン２．４Ｇ２ ｍＡｂでＦｃｇＲをブロックした後、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む／含まない０．１％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ中で４℃にて３０分間細胞を染色した。細胞を１％の最終濃度のホルムアルデヒドで最低限２０分間固定し、その後ＦＡＣＳフロー緩衝液で洗浄および再懸濁させた。ＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８ａ（５３−６．７）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、ＣＤ１９（６Ｄ５）、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）、ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、ＣＤ８６（ＧＬ−１）、ＣＤ９５（Ｊｏ２）、ＣＤ２７９（Ｊ４３）、ＣＤ３１７／ＰＤＣＡ−１（ｅＢｉｏ９２７）、ＣＸＣＲ５（２Ｇ８）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、Ｌｙ−６Ｃ（ＡＬ−２１）、Ｌｙ−６Ｇ（１Ａ８）、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ；Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ）（Ｍ５／１１４．１５．２）、ならびにＴおよびＢ細胞活性化Ａｇ（ＧＬ７）に対するＡｂは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ビオチン化ピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）は、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から購入した。フローサイトメトリーデータは、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）フローサイトメーターで収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。多色イメージングフローサイトメトリーデータは、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ ｍｋ ＩＩ（Ａｍｎｉｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）で収集し、ＩＤＥＡＳ ｖ６．１ソフトウェアを使用して分析した。画像は、開口数０．９および有効被写界深度２．５ｍｍを有する３６０レンズを使用して捕捉した。共局在した蛍光シグナルを有する可能性のある細胞は、ブライトディテールシミラリティ（bright detail similarity）（ＢＤＳ）の助けを借りて同定した。ＢＤＳスコア付けは、重なりの空間的な場所および程度を比較して画像の非平均正規化ピアソン相関係数を計算することによって細胞内の蛍光マーカー間の共局在を定量化する。２の閾値レベルを超えるＢＤＳスコアを有する事象は、蛍光共局在を有する可能性があり、それは、視覚的に確認した。リンパ節細胞を抗体で染色して、ｐＤＣ（ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＣＤ４９ｂ−、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ＋、およびＢ２２０＋またはＰＤＣＡ−１＋）、ｃＤＣ（ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ＋）、ならびにｍＤＣ（ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋）、ならびに細胞成熟のマーカー（ＣＤ６９およびＣＤ８６）を同定した。一次ゲーティングは、光散乱、二重線除外、およびリンパ球系列除外ゲーティングによるものであった。ｐＤＣ、ｃＤＣ、およびｍＤＣに対する蛍光標識Ｄ５６−０５およびＤ５６−０１取込み、ならびに別個の実験における、ｐＤＣに対する成熟マーカー発現の程度（幾何平均蛍光強度；ｇＭＦＩ）は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して判定した。
統計分析。図面の簡単な説明で特定したＤｕｎｎ事後検定を伴ったマン−ホイットニーまたはクラスカル−ウォリス検定を使用して統計的有意性を判定した。０．０５未満またはそれに等しいｐ値を有意と見なした。
結果。表Ｂ５−１は、サル血液中のＩＦＮ経路関連遺伝子発現（免疫化前に対する倍率増大）を示す。これらのデータは、Ｄ５６−０１は、ＩＦＮ関連遺伝子発現を誘導したが、Ｄ５６−０５は、霊長類においてｒＰＡで免疫した後、より強いＩＦＮ関連遺伝子発現を誘導したことを示す。
単量体Ｄ５６−０１と比較してアジュバント活性の改善と関連し得る局部組織における早期Ｄ５６−０５効果を査定するために、転写変化を注射して６時間後に注射部位筋肉において分析した。マウスに等量のＣｐＧに基づく用量で、ｒＰＡを用いずにアジュバントを注射し、ＰＢＳを注射した動物は、対照として機能を果たした。Ｄ５６−０５は、複数のＩＦＮ調節遺伝子（ＩＲＧ）（図１１Ａ）およびケモカイン（図１１Ｂ）の両方について、単量体Ｄ５６−０１の効果と比較して、誘導される遺伝子の数および遺伝子誘導のレベルの両方に対してより強力な効果を呈した。同様に、Ｄ５６−０５は、より高いレベルのＩＬ−１およびＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインを誘導した（図１１Ｃ）。接着分子、インテグリン、および基質メタロプロテイナーゼも、Ｄ５６−０５処置後に注射部位筋肉においてはるかに大きい程度に誘導された（図１１Ｄ）。よって、ナノ粒子様製剤中のＤ５６−０１は、単量体Ｄ５６−０１と比較して、注射部位における免疫活性化の早期マーカーを誘導することにおいてより効率的である。ナノ粒子および単量体Ｄ５６−０１が注射部位筋肉への細胞動員に差次的に影響したか否かを判定するために、免疫細胞集団の相対的割合をフローサイトメトリーによって分析した。２４時間で、全ＣＤ４５＋細胞は、Ｄ５６−０１注射組織と比較してＤ５６−０５注射筋肉において３倍豊富であった（約２１２，０００対約６７，０００細胞／筋肉１ｇ）。Ｄ５６−０５注射は、単量体Ｄ５６−０１を投与されたマウスと比較して注射筋肉内で相対的により高い割合の通常のＤＣ（ｃＤＣ）、骨髄ＤＣ（ｍＤＣ）、骨髄細胞、マクロファージ、単球、および好中球を誘導した（図１１Ｅ）。
Ｄ５６−０５誘導炎症性遺伝子発現、およびｒＰＡ誘導Ａｂ応答に対するアジュバンティシティがＴＬＲ９非依存性経路を伴ったか否かを試験するために、応答をＴＬＲ９−／−マウスにおいて試験した。Ｄ５６−０５をｉ．ｍ．注射した後、ＩＲＧならびにケモカインおよびサイトカイン遺伝子の誘導は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて観察されたが、ＴＬＲ９−／−マウスでは観察されなかった（図１２Ａ）。したがって、Ｄ５６−０５アジュバント活性は、ＴＬＲ９−／−マウスにおいて観察されなかった（図１２Ｂ）。注射部位で誘導される炎症応答およびＴＬＲ９−／−マウスにおけるアジュバント効果の両方の欠如は、Ｄ５６−０５の活性がＴＬＲ９シグナル伝達に依存することを実証した。
ｓ．ｃ．注射して１８時間後に、Ｄ５６−０５は、Ｄ５６−０５と比較して、リンパ節内でインターフェロン調節遺伝子（図１３Ａ）、ケモカイン（図１３Ｂ）、およびサイトカイン（図１３Ｃ）の転写をより大きく増大させた。複数のケモカインのより強い誘導の可能性のある成り行きとして、Ｄ５６−０５注射は、Ｄ５６−０１注射マウスと比較して流入領域リンパ節内でより大きい数の様々な抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団をもたらした。ＭＨＣ ＩＩ＋ ｐＤＣは、特に影響され、Ｄ５６−０５処置後に５倍大きい数が存在した（平均、９４０対１８７細胞／リンパ節）（図１４）。総合すると、これらのデータは、Ｄ５６−０５は、注射部位および流入領域リンパ節において免疫応答を開始するのに単量体Ｄ５６−０１より強力であることを実証する。
Ｄ５６−０５処置後の細胞輸送の相対的増大がアジュバントの細胞取込みに対する差次的な効果を伴ったか否かを判定した。ＭＨＣＩＩ＋ ｐＤＣおよびｍＤＣ、骨髄細胞、マクロファージ、ならびに単球、ならびに好中球を含む広範囲の細胞集団が適応免疫応答の開始に関与し、すべてＤ５６−０５を注射した後により大きい蛍光を実証した。Ｄ５６−０５注射マウス内で高レベルのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５蛍光を伴った相当な割合のｍＤＣ、骨髄細胞、マクロファージ、および単球が存在した一方、ｍＤＣのみが同様の程度にＤ５６−０１を内部移行した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５標識Ｄ５６−０１−ＦｉｃｏｌｌまたはＤ５６−０１のリンパ球取込みは、無視できた。表Ｂ５−２は、細胞内のＡ５５５標識Ｄ５６−０５またはＤ５６−０１の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）によって測定した蛍光標識Ｄ５６−０５またはＤ５６−０１の取込みを示す。これらのデータは、流入領域リンパ節ｐＤＣ、ｃＤＣ、およびｍＤＣが、マウスにｉｎ ｖｉｖｏ注射した後にＤ５６−０５またはＤ５６−０１を吸収することを示す。一般に、Ｄ５６−０５の取込みは、より高いｇＭＦＩ値によって示される通り、異なる細胞集団においてＤ５６−０１の取込みより大きかった。
Ｄ５６−０５はまた、流入領域リンパ節内で単量体Ｄ５６−０１が発揮したより、ＡＰＣおよびリンパ球の活性化状態に対して大きい効果を発揮した。Ｄ５６−０５注射後に、単量体Ｄ５６−０１を注射したマウスから回収されたリンパ節細胞と比較して、ｐＤＣ、ＣＤ８＋ＤＣ、ｃＤＣ、ｍＤＣ、および骨髄細胞はすべて、ＣＤ８６のより大きい発現を示した一方、ＢおよびＮＫ細胞は、ＣＤ６９のより大きい発現を示した。表Ｂ５−３は、マウスリンパ節由来のｐＤＣ上の諸レベルのＣＤ６９およびＣＤ８６発現を示す。これらのデータは、Ｄ５６−０５およびＤ５６−０１はともに、ｐＤＣ上でＣＤ６９およびＣＤ８６発現を誘導するが、Ｄ５６−０５は、Ｄ５６−０１と比較してｉｎ ｖｉｖｏでｐＤＣの成熟を誘導することにおいてより強力であることを示す。よって、Ｆｉｃｏｌｌ上のＤ５６−０１のナノ粒子製剤は、重要なＡＰＣ集団によるその取込みおよびこの集団の活性化を実質的に改善し、適応免疫の有効な誘導に寄与する。
Ｆｉｃｏｌｌコンジュゲーションが同じ細胞内へのＣｐＧ−ＯＤＮおよびＡｇ取込みの効率を増大させたか否かを判定するために、マウスに蛍光標識アジュバント（上述の通り）＋Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されたｒＰＡを足蹠注射した。膝窩リンパ節細胞をフローサイトメトリー分析のために、注射して２４または４８時間後に回収した。検査した各ＡＰＣ型で、多くの細胞は、Ａｇまたはアジュバントのみを組み込んだが、ｒＰＡおよびＤ５６−０５またはＤ５６−０１の両方を取得した細胞の集団も存在した。Ｄ５６−０５およびｒＰＡで免疫されたマウスでは、Ａｇおよびアジュバントを同時に取り込んだＡＰＣならびにアジュバントのみを取り込んだ細胞の頻度が最も高いことが実証された。２つの追加の実験において多色イメージングフローサイトメトリーおよび後続のＢＤＳスコア付けの計算を使用して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５標識Ｄ５６−０５およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ｒＰＡが同じ細胞内に特異的に共局在したか否かを判定した。Ｄ５６−０５およびｒＰＡを合同で取り込んだｐＤＣのおよそ１１％、ｍＤＣの７％、骨髄細胞の５％、およびｃＤＣの１％未満が２超のＢＤＳスコアを実証し、測定時における細胞内でのＡｇおよびアジュバントの可能性のある共局在を示した。
注射部位流入領域リンパ節内でのＧＣ ＢおよびＴ濾胞性ヘルパー（ＴＦＨ）細胞応答に対するＤ５６−０５のインパクトを評価した。これは、Ｂ２２０＋／ＧＬ７＋／ＰＮＡ＋／ＣＤ９５＋細胞としてＧＣ Ｂ細胞およびＣＤ４＋／ＣＸＣＲ５＋／ＰＤ１＋細胞としてＴＦＨ細胞を同定して、フローサイトメトリーによって直接的に評価した。マウスの足蹠に、Ｄ５６−０５もしくはＤ５６−０１を含む／含まないｒＰＡまたはビヒクル対照で１回免疫し、ＧＣ ＢまたはＴＦＨ細胞の数を２週間監視した。より高い割合のＧＣ ＢおよびＴＦＨ細胞が５日目までにｒＰＡ／Ｄ５６−０５免疫化マウスの流入領域リンパ節内で検出され、１４日目で上昇したままであった。ＧＣ ＢおよびＴＦＨ応答は、ビヒクル注射マウスと比較してｒＰＡのみで免疫されたマウスにおいて最小であった。総合すると、これらのデータは、先天性免疫の誘導に関するＤ５６−０１に対するＤ５６−０５の効力の増大が早期のＧＣ ＢおよびＴ細胞応答に反映されることを示唆する。
（実施例Ｂ６）
Ｄ５６−０５アジュバント急速高力価毒素中和抗体は、ｒＰＡに応答し、生きたＢａｃｉｌｌｕｓ Ａｎｔｈｒａｘ胞子での致死的チャレンジからサルを保護する。
Ｄ５６−０５の哺乳動物被験体における防御抗原特異的抗体応答を誘導する能力（すなわち、免疫原性）を、Ｄ５６−０５＋ｒＰＡで免疫したサルにおいて評価した。比較のために、追加の群のサルをＤ５６−０１＋ｒＰＡまたはｒＰＡ単独で免疫した。Ｄ５６−０５で１回または２回の免疫した後の保護を試験するために、サルに致死量の炭疽胞子でチャレンジし、生存時間を監視した。
サル免疫原性研究についての生存中の手順は、実施例Ｂ５の下で記載されている。炭疽エアロゾルチャレンジ研究のために、サル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をＢａｔｔｅｌｌｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）に収容し、そこでオールインライフ手順を実行した。以前に炭疽に曝露されなかった２５匹の雄および２５匹の雌の健康サルを、体重によってランダム化して８匹（４匹の雄、４匹の雌）または６匹（３匹の雄、３匹の雌）の群にした。ＤＰＢＳ １ｍＬの全体積中Ｄ５６−０５ １０００または２５０μｇと組み合わせたｒＰＡ １０μｇで０および／または２９日目に四頭筋内にｉ．ｍ．経路によって動物を免疫した。６匹の非免疫動物から構成される群も含めた。血清試料を研究中に収集して抗体応答の発生を確認した。サルを２００×５０％致死量（ＬＤ５０）当量の標的用量のエアロゾル化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ａｍｅｓ胞子に、６９、７０、または７１日目に曝露した。各群からの少なくとも２匹のサルをそれぞれの日に割り当てて、サルを３つのチャレンジ日のうちの１つにランダム化した。動物を、チャレンジ後の２８日にわたって生存時間および疾病の臨床徴候について１日２回監視した。瀕死と判断されたいずれの動物も、直ちに安楽死させた。血液寒天プレート上にＥＤＴＡ全血３０〜４０ｍｌをストリークし、３７℃で少なくとも４８時間インキュベートすることによって、定性的な菌血症を６２日目以降査定した。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ形態と一致する任意のコロニー（粗い外観および不規則な縁部を伴って、ｇ−溶血性、白色コロニー、直径４〜１０ｍｍ）をもたらす試料を陽性と記録した。
毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）。ｒＰＡに対する抗体価の発生をｉｎ ｖｉｔｒｏ毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）によって査定した。アッセイは、ｒＰＡに対する血清抗体のＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ致死性毒素細胞傷害性からＪ７７４．１細胞を特異的に保護する能力を測定する。Ｊ７７４．１ネズミマクロファージ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、連続希釈血清試料の存在または非存在下でＰＡおよび致死因子（ＬＦ；Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＣＡ）に曝露した。生存能をＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の添加によって査定した。力価を、中和曲線の４−パラメータロジスティック対数フィットの変曲点に対応する、毒素媒介細胞傷害性の５０％中和（ＥＤ５０）をもたらす血清試料の希釈の逆数として計算した。ＴＮＡ結果を、試験試料のＥＤ５０および参照標準のＥＤ５０の商（ＮＦ５０）として報告する。アッセイ終点は、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏバージョン４．７．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して計算した。ＴＮＡアッセイは、Ｂａｔｔｅｌｌｅで実施したチャレンジに対して−１、＋１、＋３、＋５、＋７、＋１４、＋２１、および＋２８日目から生じる血清を除いてＤｙｎａｖａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって実施され、ヒト参照標準ＡＶＲ８０１を使用してＮＦ５０値を計算した。アッセイ終点は、ＳＡＳ（ＪＭＰ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して計算した。データ取得および分析は、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏバージョン５．０．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）またはＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０またはＶｅｒｓａ−Ｍａｘによって実施した。定量化の下限（ＬＬＯＱ）は、１００であった。検出不可能な値をもたらす試料は、ＬＬＯＱの半分に等しい値に割り当てた。
抗ｒＰＡ ＩｇＧ定量化。プレート（９６ウェル）をｒＰＡで被覆し、一晩インキュベートした。適切な希釈系列の標準物質および試験血清を２通りにアッセイした。ＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を検出に使用し、色を、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて発色させた。力価は、４−パラメータロジスティック対数フィット曲線の変曲点に対応する希釈の逆数（ＥＤ５０）として計算した。結果を、試験試料のＥＤ５０および参照標準のＥＤ５０の商（ＮＦ５０）として報告する。データ取得および分析は、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ ｖ５．０．１ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０またはＶｅｒｓａＭａｘによって実施した。
結果。表Ｂ６−１および図１５Ａは、免疫原性研究データ、具体的には、ｒＰＡ単独、ｒＰＡ＋Ｄ５６−０５、またはｒＰＡ＋Ｄ５６−０１を単回注射して２週間後のサル血清において誘導されたＴＮＡ力価（個々の力価、幾何平均、および９５％信頼区間）を示す。２つの最高用量のＤ５６−０５は、Ｄ５６−０１添加による有意でない増大と比較して、ｒＰＡのみを与えられた動物においてより有意に高い平均ＴＮＡ力価を誘導した。Ｄ５６−０５の最高用量において、ｒＰＡ単独と比較したＴＮＡ力価の計算された３１倍の増大は、アジュバント効力の過小評価である可能性があり、その理由は、ｒＰＡのみの動物における力価はすべて、ＴＮＡアッセイの検出のレベル未満であったためである。その上、Ｄ５６−０５ ２５０〜１０００ｍｇを受けたすべての動物（１１匹のうちの１１匹）は、血清陽性であった一方、Ｄ５６−０１ ２５０〜１０００ｍｇで免疫された１１匹の動物のうちの５匹は、ＬＬＯＱ未満であった。これらのデータは、ｒＰＡ＋Ｄ５６−０５およびｒＰＡ＋Ｄ５６−０１はともに、ｒＰＡ単独での免疫化と比較して毒素中和抗体の急速で強力な力価を誘導したが、ＴＮＡ力価は、等価なＣＣ量のＤ５６−０５で免疫されたサルにおいて最高であったことを示す。
同様に、１４日における全抗ｒＰＡ ＩｇＧの力価は、ｒＰＡ／Ｄ５６−０５で免疫した後に有意に増大し（図１５Ｂ）、ＴＮＡ結果と有意に相関した（図１５Ｃ）。２８日目における第２の免疫化の後、ＴＮＡ応答の１５倍超のブーストがすべての群において明白であり、力価は、少なくとも１８週間上昇したままであった。第２の免疫を行って約５カ月後の抗原チャレンジに対するメモリー応答も、これらの動物において評価した。少なくとも１５倍のＴＮＡ力価のさらなる増大（図１５Ｄ）は、急速な、ロバストな応答を実証し、潜在的防御免疫を示した。
保護を直接的に評価するために、ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓをｒＰＡ＋Ｄ５６−０５で１回（２９日目）または２回（０および２９日目）ｉ．ｍ．免疫し、２００ ＬＤ５０当量の標的用量のエアロゾル化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子で７０±１日目にチャレンジした。生存時間、菌血症、および臨床的疾患の症状をチャレンジ後２８日間監視し、血清試料を、ＴＮＡ力価を判定するためにチャレンジ前後に収集した。図１６Ａは、ｒＰＡ＋Ｄ５６−０５で１回または２回免疫した後、エアロゾル化した生きた炭疽胞子でチャレンジしたサルについてのカプラン−マイヤー生存分析を示す。炭疽チャレンジからの完全な保護が、Ｄ５６−０５ １０００ｍｇとともにｒＰＡの単回のワクチン接種、またはＤ５６−０５ ２５０もしくは１０００ｍｇとともに２回のワクチン接種を受けたすべてのサルにおいて実現され、一方、すべてのワクチン接種されなかった動物は、チャレンジの９日以内に疾患で死んだ。これらのデータは、ｒＰＡ＋Ｄ５６−０５で単回免疫すると致死的チャレンジからサルの１００％が保護されることを明確に示す。２回免疫された動物も保護された。
さらに、ｒＰＡ／Ｄ５６−０５をワクチン接種された動物は、チャレンジ後の任意の時点で菌血症または臨床症状を示さなかった。チャレンジ後、すべての動物は、ＴＮＡ力価の急速な増大をもたらし、強いメモリー応答を示した。メモリー応答は、単回ｒＰＡ／Ｄ５６−０５免疫化を受けたサルにおいて顕著であり、感染チャレンジの７日以内に２回免疫動物と同等のレベルに急速に上昇した（図１６Ｂ）。総合すると、これらのデータは、ｒＰＡ＋Ｄ５６−０５ １０００ｍｇで単回免疫すると、顕著なリコール応答について動物がプライムされ、エアロゾル化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子での致死的チャレンジからの保護がもたらされることを実証する。
炭疽曝露に対する急速な単回注射保護は、未充足ニーズを相当するが、Ｄ５６−０５の強力なアジュバント活性は、実質的に低減された用量が、２回注射予防レジメンが実現可能である局面において有効であり得ることを示唆した。したがって、別個の実験において、ＴＮＡ応答を、ｒＰＡおよび１０００、５０、２０、または５ｍｇのＤ５６−０５で０および２８日目に免疫されたサルにおいて監視した。１０００超のＴＮＡ力価が、試験した最低用量である５ｍｇのＤ５６−０５用量でさえ、２回免疫化レジメンにおいて誘発され、Ａｇのみの注射（細菌胞子曝露のサロゲートとして使用した）と比べて１０，０００超にさらにブーストされた（図１６Ｃ）。よって、２回免疫化レジメンにおいて、データは、サルにおける単回免疫化レジメンで保護的であると実証されたＤ５６−０５用量の１／２００で保護的能力があることを示唆する。
Ｄ５６−０５ナノ粒子製剤によるアジュバント活性の改善も、マウスにおいて評価した。実際に、ｒＰＡ／Ｄ５６−０５は、マウスにおいて第１および第２の免疫化の両方の後に有意により高いＴＮＡ力価を誘導し、Ｄ５６−０５作用機序を調査する研究に関する種の関連性を実証した（図１７Ａ−Ｂ）。
（実施例Ｂ７）
等価な用量で、ナノ粒子製剤Ｄ５６−０５は、遊離線状キメラ化合物Ｄ５６−０１と比較して、マウスにおいて安全性利点を実証する。
ｉｎ ｖｉｖｏでＣＣ配列の安全性／耐容性に対するナノ粒子製剤の効果を試験するために、マウスに、筋肉内経路によってＤ５６−０５およびＤ５６−０１の繰り返しの高用量注射を投与した。毒性を査定する種として、マウスは、マウスにおけるＴＬＲ９発現のより広範な細胞分布に起因して、霊長類と比較して、ＣｐＧ ＯＤＮ含有ヌクレオチドに対して誇張された薬理学的応答を実証する。本発明者らは、遊離およびナノ粒子バージョンのＣＣの相対的安全性を査定するために、合計４回の注射で２週間毎にＤ５６−０５またはＤ５６−０１のいずれか１００μｇ（Ｄ５６−０１の重量に基づいて）を受けているマウスにおいて血清サイトカイン応答を測定し、体重の変化を監視した。
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（生後６〜１０週）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入し、Ｍｕｒｉｇｅｎｉｃｓ（Ｖａｌｌｅｊｏ、ＣＡ）に収容し、そこでオールインライフ手順を実行した。５匹のマウスの群に、注射間に２週間を伴ってＤ５６−０５またはＤ５６−０１ １００μｇを１回、２回、３回、または４回投与した。選ばれた群を各注射の２時間後に屠殺した。対照に関して、１つの群は、注射を受けず、別の群に注射ビヒクル（生理食塩水、５０μＬ）を投与した。これらの群はともに、４回目の注射の１８時間後に屠殺した。血清を屠殺時に心穿刺によって回収した。脾臓、肝臓、および腎臓を屠殺時に回収し、秤量した。マウスを研究全体にわたって毎週２回秤量した。
ＥＬＩＳＡ。血清試料中のサイトカインレベルを実施例Ｂ１の下で記載した通りに市販の抗体対を使用して測定した。マウスＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０を検出するための抗体対は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から調達した。マウスＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−αを検出するための試薬は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から調達した。これらのアッセイの検出の限界は、約２０ｐｇ／ｍＬ〜約１５０ｐｇ／ｍＬの範囲であった。データ取得および分析は、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ ｖ５．０．１ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０またはＶｅｒｓａＭａｘによって実施した。
酵素結合ハイブリダイゼーションアッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイによるＤ５６−０５またはＤ５６−０１組織定量化。個々の動物ごとに１組織当たり２５〜５０ｍｇの脾臓、肝臓、腎臓、または注射部位筋肉、および個々の動物ごとにプールした注入領域リンパ節を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．２％ ＳＤＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）中でＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してホモジナイズし、１．２Ｕ／組織１ｍｇで５０℃にて６〜２０時間、プロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｔｃｈ、ＭＡ）消化に付した。Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒアミノプレートを、０．１Ｍリン酸ナトリウム（Ｔｅｋｎｏｖａ）中の３０ｎｇ／ｍｌ捕捉プローブ（Ｄ５６−０１定量化について配列番号１８に示した５’−ＧＣＧＣＣＧＡＧＡＡ ＣＧＴＴＧＣＧＣＣＧ Ａ−３’；およびＤ５６−０５定量化について配列番号１９に示した５’−ＡＧＣＣＧＣＧＴＴＧ ＣＡＡＧＡＧＡＡＧＣ ＧＡＴＧＣＧＣＧＧＣ ＴＣＧ−３’）で４℃にて一晩被覆した。Ｄ５６−０５を定量化するために、０．６ｍｇ／ｍｌ検出プローブ（配列番号１８に示した５’−ＧＣＧＣＣＧＡＧＡＡ ＣＧＴＴＧＣＧＣＣＧ Ａ−３’）と等体積で混合したホモジナイズされた試料を、５２℃で７５分間インキュベートした。Ｄ５６−０１を定量化するために、ＳＳＣ＋２％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩緩衝液と等体積で混合したホモジナイズされた試料を、４５℃で２時間インキュベートし、室温で３０分間冷却させた。捕捉されたＤ５６−０１の相補的３９エンドの合成を、０．５ｍＭビオチン化ｄＵＴＰおよび５０ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）の存在下で、１．２５Ｕクレノウ断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）によって触媒した。ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）をアジュバント検出に使用し、色を３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（ＫＰＬ）で発色させた。アジュバントは、標準物質として機能を果たした。ＬＬＯＱは、Ｄ５６−０５およびＤ５６−０１についてそれぞれ６．２４および７．６２ｎｇ／組織１ｇであった。すべてのデータ取得および分析は、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ ｖ５．０．１ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０またはＶｅｒｓａＭａｘによって実施した。
結果。Ｄ５６−０５および単量体Ｄ５６−０１がｉ．ｍ．注射後に差次的な組織分布動態を示したか否かを試験するために、マウスにＤ５６−０５またはＤ５６−０１を注射し、注射部位および流入領域リンパ節、ならびに遠位部位（脾臓、肝臓、および腎臓）におけるアジュバントのレベルを測定した。マウスは、回収を促進するために高用量（１００μｇ）のいずれかのアジュバントを受け、組織を注射の１日後に回収した。Ｄ５６−０５およびＤ５６−０１を上述したハイブリダイゼーションアッセイによって定量化した。Ｄ５６−０５は、注射部位筋肉およびリンパ節（膝窩、鼠径部、坐骨、腰椎、および仙椎）内で濃縮され、一方、Ｄ５６−０１は、全身性に急速に分布した（図１８）。Ｄ５６−０１は、注射部位およびリンパ節において最小限のレベルで検出され、代わりに、脾臓、肝臓、および腎臓内で濃縮されていた。これらのデータは、ナノ粒子および単量体Ｄ５６−０１は、注射の２４時間以内に差次的に分布し、Ｄ５６−０５の優先的な局所的保持がアジュバントとしてのその効力の増大に寄与し得ることを示唆する。
ＣｐＧ−ＯＤＮ投与後にマウスにおいて一般に観察されたすべての全身性毒性は、Ｄ５６−０１と比較してＤ５６−０５を注射された動物において大いに低減された。表Ｂ７−１は、Ｄ５６−０５またはＤ５６−０１の第１の用量を投与して２時間後のマウスにおける血清サイトカインレベルを示す。炎症性サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−αはすべて、Ｄ５６−０１注射の２時間後に血中に高レベルで誘導されたが、Ｄ５６−０５に応答して誘導されなかった。
その上、Ｄ５６−０５注射マウスにおける全身性効果の遅延の証拠はほとんどなかった。Ｄ５６−０５を４回隔週に注射した後に屠殺したマウスは、シャム注射マウスと同様の脾臓および肝臓の重量を実証した。Ｄ５６−０１を投与されたが、Ｄ５６−０５を投与されなかったマウスは、２回の注射後に明白な脾腫大および肝腫大を発生させ、３および４回の注射後により顕著になった。このデータを表Ｂ７−２に要約する。腎臓重量に対する効果はなかった。Ｄ５６−０５注射マウスにおける病理組織学的変化は最小限であった一方、Ｄ５６−０１注射の繰り返しは、脾臓骨髄外造血活性の増大、ならびに類洞の細胞浸潤、肝細胞変性、および軽度／中等度の肝臓壊死を含めた肝臓変化をもたらした。
図１９は、Ｄ５６−０５およびＤ５６−０１を受けたマウスの研究にわたる群アベレージ体重を示す。げっ歯類に特異的な顕著な体重減少、ＴＮＦ−アルファ依存性ＣｐＧ誘導毒物学事象が、Ｄ５６−０１注射を隔週に投与された動物において起こった。対照的に、高用量Ｄ５６−０５の注射を隔週に投与されたマウスについて、体重は、対照のものよりわずかに低いだけであった。このデータは、Ｄ５６−０１を投与されたマウスにおける脾腫大および肝腫大に起因して重量が追加された効果を除去するように調整されると、全体重は、高用量Ｄ５６−０１の連続的投与とともに低下するが、Ｄ５６−０５では低下しないことを実証する。総合して、これらのデータは、遊離ＣＣ Ｄ５６−０１に対してナノ粒子製剤化Ｄ５６−０５の顕著な安全性利点を示す。遊離ＣＣと異なり、ナノ粒子製剤は、高用量注射を繰り返した後でも炎症性血清サイトカイン応答、感知できる臓器肥大、または体重の劇的な低減を誘導しない。よって、単量体Ｄ５６−０１に対するＤ５６−０５ナノ粒子のアジュバント活性の改善は、全身毒性シグナルの低減が伴う。
（実施例Ｂ８）
Ｄ５６−０５の腫瘍内投与は、リンパ腫細胞株ＥＧ７−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍増殖を抑制する。
がん免疫療法のモデル（Mooreら、Cell、５４巻：７７７頁、１９９８年）におけるＤ５６−０５の適用を試験するために、リンパ腫細胞株ＥＧ７ ｌ ＯＶＡを使用して、確立された腫瘍の増殖に対するＤ５６−０５または対照非ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（Ｄ５６−３０）の腫瘍内注射の効果を査定した。
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（生後６〜１０週）をＨａｒｌａｎから購入し、Ｍｕｒｉｇｅｎｉｃｓ（Ｖａｌｌｅｊｏ、ＣＡ）に収容し、そこでオールインライフ手順を実行した。１×１０＊６ ＥＧ−７細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部内に皮下注射した。研究日０（細胞移植の４日後）に開始して、マウス（Ｎ＝５／群）の確立された腫瘍塊中に、ＰＢＳ １５０μＬの体積中Ｄ５６−０５または対照非ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｄ５６−３０）５０μｇの注射を投与した。注射は、０、３、および７日目に毎日投与した。動物を観察し、腫瘍サイズ（体積）を測定した。
腫瘍体積データを図２０に示す。データは、腫瘍内経路によって投与されたＤ５６−０５がこのネズミ腫瘍モデルにおいて腫瘍体積増大を阻害したことを実証する。
（実施例Ｂ９）
異なるＤ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）を有するＤ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力評価。
生物学的応答の効力に対するＤ５６−０５（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）コンジュゲート中の様々なＤ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）の効果をｉｎ ｖｉｔｒｏ分析によって査定した。ヒトＢ細胞内のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を、異なるＤ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）を有するＤ５６−０５コンジュゲート：Ｄ５６−０５ ｘ＝２４、Ｄ５６−０５ ｘ＝５３、Ｄ５６−０５ ｘ＝８２、Ｄ５６−０５ ｘ＝１２４、およびＤ５６−０５ ｘ＝１５４について実施例Ｂ１に記載した通りに判定した。ヒトＢ細胞ＩＬ−６アッセイの結果を表Ｂ９−１に示す。異なるＤ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）を有するＤ５６−０５の合成については実施例Ｓ１２を参照。
これらのデータは、より高いＤ５６−０１：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）を有するＤ５６−０５コンジュゲートが、Ｄ５６−０５と比較してヒトＩＬ−６アッセイにおいて同様の効力を示したことを示す。
（実施例Ｂ１０）
ｎ＝６、２４、４５、および７０のＳＭ−ＰＥＧｎを使用して製造したＤ５６−０５、Ｄ５６−２５、Ｄ５６−２６、およびＤ５６−２７（［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧｎ］ｘ−ＦＩＣＯＬＬとも呼ばれる）のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力評価
［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧｎ］ｘ−ＦＩＣＯＬＬ中の様々な長さ（ｎ）のＳＭ−ＰＥＧｎリンカー分子の効果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的応答の効力を測定することによって試験した。ヒトｐＤＣ富化ＰＢＭＣおよびＢ細胞内のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を、実施例Ｓ３および実施例Ｓ１３に記載した通りにそれぞれｎ＝６、２４、４５、および７０のＳＭ−ＰＥＧｎを使用して製造した［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧｎ］ｘ−ＦＩＣＯＬＬコンジュゲート、Ｄ５６−０５、Ｄ５６−２５、Ｄ５６−２６、およびＤ５６−２７について、実施例Ｂ１に記載した通りに判定した。ヒトｐＤＣ富化ＰＢＭＣ ＩＦＮ−αアッセイおよびヒトＢ細胞ＩＬ−６アッセイの結果をそれぞれ表Ｂ１０−１および表Ｂ１０−２に示す。より長いＰＥＧリンカーを有する［（Ｄ５６−０１）−ＰＥＧｎ］ｘ−ＦＩＣＯＬＬコンジュゲートは、ＩＦＮ−αアッセイにおいてわずかに増大した効力、およびＩＬ−６アッセイにおいてわずかに低減された効力を示した。

Claims (43)

  1. 式（Ｉ）：
    ［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ （Ｉ）
    の分枝状キメラ化合物であって、式中、
    Ｄは、ポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物であり；
    Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
    Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
    Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；
    ＰＥＧは、式−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−のものであり、式中、ｎは、２〜８０の整数であり；
    ｘは、３〜３００の整数であり；
    Ｆは、約１００，０００〜約７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、
    Ｄの前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列：５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含み、前記ポリヌクレオチドは、長さが５０ヌクレオチド未満であり、前記ヌクレオチド同士間および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結であり；
    Ｄの前記線状キメラ化合物は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含み、前記線状キメラ化合物は、５０未満のヌクレオチドを含有し、前記ヌクレオチド同士間、前記ヌクレオチドと前記ＨＥＧスペーサーとの間、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、分枝状キメラ化合物。
  2. Ｌ２が、
    である、請求項１に記載の分枝状キメラ化合物。
  3. Ｌ３が、
    である、請求項１または２に記載の分枝状キメラ化合物。
  4. 式−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−のｎが、６、２４、４５、または７０である、請求項１から３のいずれか一項に記載の分枝状キメラ化合物。
  5. Ｆが、約３００，０００〜約５００，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の分枝状キメラ化合物。
  6. Ｄが、ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）からなるポリヌクレオチドである、請求項１から５のいずれか一項に記載の分枝状キメラ化合物。
  7. Ｄが、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）からなる線状キメラ化合物である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分枝状キメラ化合物。
  8. Ｌ１が、−（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−であり、ｍは、２〜９の整数である、請求項１から７のいずれか一項に記載の分枝状キメラ化合物。
  9. ｘが、２０〜２００である、請求項１から８のいずれか一項に記載の分枝状キメラ化合物。
  10. ｘが９０〜１５０であり、ｎが６であり、ｍが３または６である、請求項９に記載の分枝状キメラ化合物。
  11. 前記ヌクレオチド同士間の前記連結、存在する場合には前記ヌクレオチドと前記ＨＥＧスペーサーとの間の前記連結、および前記３’−末端ヌクレオチドとＬ１との間の前記連結のすべてが、ホスホロチオエートエステル連結である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の分枝状キメラ化合物。
  12. ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号３）を含む単離ポリヌクレオチドであって、長さが５０ヌクレオチド未満であり、前記ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、単離ポリヌクレオチド。
  13. ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含む単離ポリヌクレオチドであって、長さが５０ヌクレオチド未満であり、前記ヌクレオチド同士間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、単離ポリヌクレオチド。
  14. ５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）のヌクレオチド配列からなる、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
  15. 一本鎖である、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  16. ２’−デオキシリボポリヌクレオチドである、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記連結のすべてが、ホスホロチオエートエステル連結である、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  18. ５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号４）として２つの核酸部分および１つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含む線状キメラ化合物であって、５０未満のヌクレオチドを含有し、前記ヌクレオチド同士間および前記ヌクレオチドと前記ＨＥＧスペーサーとの間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、線状キメラ化合物。
  19. ５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含む線状キメラ化合物であって、５０未満のヌクレオチドを含有し、前記ヌクレオチド同士間および前記ヌクレオチドと前記ＨＥＧスペーサーとの間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結である、線状キメラ化合物。
  20. ５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）からなる、請求項１９に記載の線状キメラ化合物。
  21. 前記核酸部分が、２’−デオキシリボポリヌクレオチドである、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の線状キメラ化合物。
  22. 前記連結のすべてが、ホスホロチオエートエステル連結である、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の線状キメラ化合物。
  23. （ｉ）薬学的に許容される賦形剤、ならびに（ｉｉ）請求項１から１１のいずれか一項に記載の分枝状キメラ化合物、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、および請求項１８から２２のいずれか一項に記載の線状キメラ化合物からなる群のうちの１つを含む医薬組成物。
  24. 前記分枝状キメラ化合物、前記ポリヌクレオチド、および前記線状キメラ化合物がそれぞれ、
    ヒト末梢血単核細胞によるＩＦＮ−アルファの産生を刺激すること；
    ヒトＢリンパ球によるＩＬ−６の産生を刺激すること；ならびに
    マウス脾細胞によるＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−６の一方または両方の産生を刺激すること
    からなる群のうちの１つまたは複数を含む、哺乳動物白血球によるサイトカイン産生を刺激することができる、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記分枝状キメラ化合物、前記ポリヌクレオチド、および前記線状キメラ化合物がそれぞれ、哺乳動物Ｂリンパ球の増殖を刺激することができる、請求項２３または請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 滅菌溶液である、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  27. 前記分枝状キメラ化合物、前記ポリヌクレオチド、および前記線状キメラ化合物に共有結合的に連結されていない抗原をさらに含む、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  28. 前記抗原が、微生物抗原、アレルゲン、または腫瘍抗原である、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 本質的にエンドトキシンフリーである、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  30. 哺乳動物被験体における免疫応答を刺激する方法であって、哺乳動物被験体における免疫応答を刺激するのに十分な量で請求項２３から２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記哺乳動物被験体に投与することを含む方法。
  31. 免疫応答を刺激することが、
    ＩＦＮ−アルファ産生を刺激すること；
    ＩＬ−６産生を刺激すること；
    Ｂリンパ球増殖を刺激すること；
    インターフェロン経路関連遺伝子発現を刺激すること；
    化学誘引物質関連遺伝子発現を刺激すること；および
    形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）成熟を刺激すること
    からなる群のうちの１つまたは複数を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記医薬組成物が抗原をさらに含む場合、免疫応答を刺激することは、抗原特異的抗体応答を誘導することを含み、前記抗原特異的抗体応答の力価は、前記抗原が前記分枝状キメラ化合物、前記ポリヌクレオチド、または前記線状キメラ化合物と組み合わせて投与されるときには、前記抗原が前記分枝状キメラ化合物も前記ポリヌクレオチドも前記線状キメラ化合物も無しで投与されるときより高い、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 哺乳動物被験体における抗原特異的抗体応答を誘導する方法であって、哺乳動物被験体における抗原特異的抗体応答を誘導するのに十分な量で請求項２７から２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記哺乳動物被験体に投与することを含む方法。
  34. 哺乳動物被験体における感染疾患を防止する方法であって、哺乳動物被験体における感染疾患を防止するのに十分な量で請求項２３から２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記哺乳動物被験体に投与することを含む方法。
  35. 哺乳動物被験体における感染疾患の症状を改善する方法であって、哺乳動物被験体における感染疾患の症状を改善するのに十分な量で請求項２３から２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記哺乳動物被験体に投与することを含む方法。
  36. 哺乳動物被験体におけるＩｇＥ関連障害の症状を改善する方法であって、哺乳動物被験体におけるＩｇＥ関連障害の症状を改善するのに十分な量で請求項２３から２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記哺乳動物被験体に投与することを含む方法。
  37. 哺乳動物被験体におけるがんを処置する方法であって、哺乳動物被験体におけるがんを処置するのに十分な量で請求項２３から２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記哺乳動物被験体に投与することを含む方法。
  38. がんを処置することが、固形腫瘍のサイズを縮小することを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 式（Ｉ）：
    ［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ （Ｉ）
    の分枝状キメラ化合物を調製するための方法であって、
    式中、
    Ｄは、ポリヌクレオチドまたは線状キメラ化合物であり；
    Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
    Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
    Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；
    ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり；
    ｘは、３〜３００の整数であり；
    Ｆは、約１００，０００〜約７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、
    前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列：５’−ＴＣＧＧＣＧＣ ＡＡＣＧＴＴＣ ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号１）を含み、前記ポリヌクレオチドは、長さが５０ヌクレオチド未満であり、前記ヌクレオチド同士間および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結であり
    前記線状キメラ化合物は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）として３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含み、前記線状キメラ化合物は、５０未満のヌクレオチドを含有し、前記ヌクレオチド同士間、前記ヌクレオチドと前記ＨＥＧスペーサーとの間、および３’末端ヌクレオチドとＬ１との間の１個または複数個の連結は、ホスホロチオエートエステル連結であり、前記方法は、
    式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物（式中、Ｄは、式（Ｉ）について定義した通りであり、Ｌ１ａは、（ＣＨ２）ｍであり、ｍは、２〜９の整数である）を式（ＩＩ）：
    ［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ （ＩＩ）
    の化合物（式中、Ｌ３、ＰＥＧ、およびＦは、式（Ｉ）について定義した通りであり；
    Ｌ２ａは、
    であり；
    ｙは、３〜３５０の整数である）と反応させることを含む方法。
  40. 式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＳ−Ｌ１ａ−ＯＨの化合物を還元剤と反応させて、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物を生成することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 式（ＩＩＩ）：
    ［ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２］ｚ−Ｆ （ＩＩＩ）
    の化合物（式中、Ｆは、式（Ｉ）について定義した通りであり、ｚは、３〜４００の整数である）を、式Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−Ｌｖの化合物（式中、Ｌ２ａおよびＰＥＧは、式（ＩＩ）について定義した通りであり；Ｌ３ａは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｌｖは、脱離基である）と反応させて、式（ＩＩ）の化合物を形成することをさらに含む、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. Ｌｖが、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシである、請求項４１に記載の方法。
  43. Ｄが、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号２）である、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の方法。
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