JP2018502568A - 哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟 - Google Patents

Abstract

本発明は、哺乳動物における生殖補助医療に対する組成物及び方法に関する。特に、本発明は、未熟な卵丘細胞卵母細胞複合体（COC）の体外成熟に対する組成物及び方法を提供し、それによって発生学的成果を増強する。【選択図】図1

Description

本発明は、概して、哺乳動物における生殖補助医療に対する組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟に対する組成物、及び方法に関する。

ヒトの不妊治療（infertility practice）では、大きな卵胞（すなわち、少なくとも直径17mm）を得るための高価なホルモン療法による過排卵後に、従来の体外受精（IVF）又は卵細胞質内精子注入法（ICSI）技術が今も使用されている。ホルモンの費用、ホルモン療法と関連する急性及び長期的な合併症のリスク、並びに卵胞生育をモニターするための度々の受診の不便さのいずれもが、卵胞貯蔵が正常な／高い不妊の夫婦に対して、それほど高価でなくより良い許容される治療手段の開発を駆り立てる。

卵母細胞の体外成熟（IVM）は、堅く圧縮されたコロナ（corona：放射冠）卵丘細胞層（卵丘細胞卵母細胞複合体（COC））で囲まれた、卵核胞（GV）期の卵母細胞を成熟させることができる技術である。ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）の投与によって排卵が誘発される前に、又はhCG投与のすぐ後に超音波ガイド下穿刺によってこれらの卵母細胞を得ることができる。したがって、卵母細胞IVMには、不妊治療を単純化するか、又は卵巣の卵胞貯蔵が正常な若しくは高い患者におけるホルモン（hCG）刺激と関係するリスク及び費用を減らす可能性がある。この卵胞貯蔵は、抗ミュラー管ホルモンレベルの測定、及び月経周期の3日目の超音波ガイド下卵胞カウントによって日常的に特定される。

卵母細胞IVMについては、超音波ガイド下穿刺を使用することにより、最小限に刺激された卵巣又は刺激されなかった卵巣において、小さな（10 mm未満）卵胞から卵母細胞を収集し、in vitroで成熟させることができる。しかしながら、発生の初期段階（例えば、卵胞が10 mm以下の直径にしか至っていない場合）で卵母細胞の正常な発生を干渉することは、成熟した卵母細胞が少なくなるだけでなく、後の胚の発生及び移植を減少させる。特に、IVMに続く胚当たりの移植成功率は通常10 %未満であり、日常的なIVF又はICSIの処置について報告される成功率の半分にすぎない。初期の妊娠損失率は変動的に見えるが、一般にIVF/ICSIの後より高い。ヒト患者について、減少した減数分裂成熟率（50 %）は、成熟した卵母細胞の胚発生で観察される欠損と併せて、今のところ、現在のIVM技術の主なボトルネックとなっている（非特許文献1、非特許文献2）。したがって、その方法が広く受け入れられる前に、IVM胚の発生可能性及び移植率の減少に対処する必要がある。

IVM培養のもととなるのは、発生能力の達成のための適切な環境の提供である。これは、主として、卵母細胞内の核及び細胞質成熟のプロセスの同期を可能とする化合物の使用による、ホルモン介入、及び必要なシグナル伝達経路の活性化を必要とする。in vitroでの卵母細胞成熟期間の延長の理論的根拠は、未熟な卵母細胞と適切に馴化された卵丘細胞との（and）間のより長い相互作用を促進することである。

減数分裂停止の原因である卵胞細胞と卵母細胞との間のシグナル伝達経路が、広範囲に調べられた。減数分裂停止は高レベルの環状アデノシン一リン酸（cAMP）の産生によって維持される。卵母細胞内cAMP濃度は、cAMPを分解するホスホジエステラーゼ（PDE）酵素の活性によって調節される。最近の研究から、グアニリル（guanylyl）−シクラーゼ結合2型ナトリウム利尿ペプチド受容体（NPR2）の活性化により、卵丘細胞においてcGMPが産生されることが示された。NPR2活性は、主に壁在性の顆粒膜細胞によって合成され、C型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）へと開裂される、顆粒膜細胞のリガンドであるナトリウム利尿ペプチド前駆体C（NPPC）によって誘導される。cGMPは、その後、卵母細胞に運ばれ、そこでcGMPはホスホジエステラーゼPDE3AによるcAMPの加水分解を阻害する。この阻害は、高濃度のcAMPを維持して減数分裂の進行を遮断する（非特許文献3、非特許文献4、非特許文献5）。

マウス、ウシ、ヒト等の異なる種に由来する体外成熟した卵母細胞におけるcAMPレベルによる薬理学的干渉は、卵母細胞減数分裂停止を促進し、卵母細胞の能力獲得を可能とするために以前から試みられてきた（非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8、非特許文献9）。それにもかかわらず、胚発生の可能性のレベルでは大きな改善は報告されていない。

最近、CNP/NPR2シグナル伝達経路は、中型で完全に成長した卵胞における卵母細胞減数分裂停止の維持において決定的な調節機構であることを示した（非特許文献10、非特許文献11、非特許文献12、非特許文献13）。しかしながら、上述の研究の大きな問題は、COCを短時間しか減数分裂停止状態に維持することができないことであり、したがって中型から大型の卵胞の体外成熟に成功したにすぎず、小さな初期胞状卵胞の成熟には失敗した。したがって、それらのIVMプロセスを改善するために小さな初期胞状卵胞の減数分裂の再開も同様に遅延させることが、現在主な課題である。特に、かかるプロトコルは、更なる体外成熟に影響を及ぼしてはならない。可能性のある発生の次の段階に移る前に、又は卵母細胞と卵丘細胞との間の相互連結を維持する前であっても、小さな初期胞状卵胞が核成熟（すなわち、核小体を取り囲まない（non-surrounded nucleolus：NSN）段階から核小体を取り囲む（surrounded nucleolus：SN）段階への移行）を完了して、卵丘細胞からの栄養素の輸送を可能とする（例えば、RNAカーゴ）能力を得るか、又は保持するために必要であることから、この課題は、かかる小さな初期胞状卵胞に対して一層大きいものである。

De Vos et al., Fertil. Steril. 2011; 96（4） 860-864 Guzman et al., Fertil. Steril. 2012; 98（2）: 503-507 Tsafriri et al. Dev. Biol. 1996, 178（2）: 393-402 Conti et al., Mol. Cell. Endocrinol. 1998, 145（1-2）: 9-14 Conti et al., Mol. Cell. Endocrinol. 2002, 187（1-2）: 153-159 Nogueira et al. Biol. Reprod. 2003, 69（6）: 2045-2052 Thomas et al. Biol. Reprod. 2004, 71（4）: 1142-1149 Shu et al. Hum. Reprod. 2008, 23（3）: 504-513 Vanhoutte et al. Hum. Reprod. 2009, 24（3）: 658-669 Zhang et al. J. Cell. Physiol. 2015, 230（1）: 71-81 Sato et al. Mol. Endocrinol. 2012, 26: 1158-1166 Franciosi et al. Biol. Reprod. 2014, 91（3）: 61 Santiquet et al. Biol. Reprod. 2014, 91（1）: 16

本発明は、哺乳動物における生殖補助医療に対する組成物及び方法に関する。特に、本発明は、未熟な卵丘細胞卵母細胞複合体（COC）の体外成熟に対する組成物及び方法を提供し、それによって発生学的成果を増強する。

本発明では、未熟な哺乳動物COCは事前のhCG刺激なしで、又はhCG刺激の後に収集される。好ましい実施の形態では、in vivoでのCOCの収集に先立って、高用量のFSH、LHRH及びそのアゴニスト、組み換えLH又はLH類縁体を含む任意のトリガー（triggers：誘引物質）を回避する。

第1の態様では、本発明は、0.1 nM〜50 nMのC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）と、エストラジオールと、FSHとを含む、哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体（COC）の体外成熟に対する受精能獲得培地を提供する。特定の実施の形態では、受精能獲得培地は、10 nM〜25 nMのCNP、更には、特に25 nMのCNPを含む。

具体的な実施の形態では、受精能獲得培地は、1 nM〜1000 nMのエストラジオール、最も好ましくは10 nMのエストラジオールを含む。別の実施の形態では、受精能獲得培地は、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSH、特に1 mIU/ml〜5 mIU/mlのFSH、更には、特に2.5mIU/mlのFSH又は1 mIU/mlのFSHを含む。更なる実施の形態では、受精能獲得培地は、25 nMのCNPと、10 nMのエストラジオールと、2.5 mIU/ml又は1 mIU/mlのFSHとを含む。更に別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量（equipotentdoses）の組み換えFSH、FSH類縁体又はFSHの模倣分子を含む。

更に別の実施の形態では、受精能獲得培地は0.1 ng/ml〜10 ng/mlのインスリン、特に5 ng/mlのインスリンを含む。別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量のインスリン類縁体又はインスリン模倣分子を含む。

更なる実施の形態では、受精能獲得培地は、卵母細胞分泌因子を含む。本明細書で使用される卵母細胞分泌因子は、特に、それぞれ10 ng/ml〜100 ng/mlの範囲の受精能獲得培地中の濃度で、GDF-9、BMP-15、FGF-8又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特定の実施の形態では、卵母細胞分泌因子は、組み換えタンパク質である。更に別の態様では、卵母細胞分泌因子は、ヘテロ二量体タンパク質である。

更に別の更なる実施の形態では、受精能獲得培地は、0.1 nM〜50 nMのCNP、最も好ましくは25 nMのCNPと、1 nM〜1000 nMのエストラジオール、最も好ましくは10 nMのエストラジオールと、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSH、最も好ましくは2.5 mIU/mlのFSH又は1 mIU/mlのFSHと、0.1 ng/ml〜10 ng/mlのインスリン、最も好ましくは5 ng/mlのインスリンと、GDF-9、BMP-15、FGF-8、若しくは任意の等価物、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される卵母細胞分泌因子とを含む。

また、本発明は、未熟な哺乳動物COCの体外成熟方法を提供する。

第1の態様では、上記方法は、未熟なCOCを収集培地中に収集することと、哺乳動物COCを0.1 nM〜50 nMのCNPとエストラジオールとFSHとを含む受精能獲得培地と接触させることと、哺乳動物COCと成熟培地とを更に接触させることとを含む。上記方法では、典型的には、最短30分〜最長2時間に亘って未熟なCOCを収集培地と接触させる。また、上記方法では、収集培地と接触させた後に、哺乳動物COCを、減数分裂停止を維持する受精能獲得培地と接触させる。特に、例えば、GV期に観察される、凝縮期又はいわゆる核小体を取り囲む（SN）配置への卵母細胞のクロマチンの再編成によって証明される、発生の進行期に達するのに十分な時間、COCを受精能獲得培地と接触させる。この期間の後、卵母細胞は、減数分裂再開のための刺激に続いて、卵核胞崩壊（GVBD）を経ることができる。さらに、最短2時間〜最長96時間に亘って、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。更に特定の実施の形態では、卵胞のサイズによって決定される期間に亘り、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。特に、卵胞サイズは、例えば、超音波画像診断等によってCOC回収の時に決定される。直径1 mm〜5 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも48時間留まることが好ましい。直径5 mm超〜10 mmの卵胞については、COCが受精能獲得培地に少なくとも24時間留まることが好ましく、直径10 mm超の卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも2時間留まることが好ましい。別の実施の形態では、卵母細胞の更なる減数分裂成熟を可能とするため、哺乳動物COCを成熟培地と接触させる。

特定の実施の形態では、本発明によるin vitro方法において、受精能獲得培地は、1 nM〜1000 nMのエストラジオール、特に10 nMのエストラジオールを含む。別の実施の形態では、本発明によるin vitro方法では、受精能獲得培地は、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSH、特に2.5mIU/mlのFSH、又は1 mIU/mlのFSHを含む。更に別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量の組み換えFSH、FSH類縁体又はFSH模倣分子を含む。

更に別の実施の形態では、本発明によるin vitro方法において、受精能獲得培地は、0.1 ng/ml〜10 ng/mlのインスリン、特に5 ng/mlのインスリンを含む。別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量のインスリン類縁体又はインスリン模倣分子を含む。

更なる実施の形態では、本発明によるin vitro方法において、受精能獲得培地は卵母細胞分泌因子を含む。本明細書で使用される卵母細胞分泌因子は、特に、それぞれ10 ng/ml〜100 ng/mlの範囲の受精能獲得培地中の濃度で、GDF-9、BMP-15、FGF-8又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特定の実施の形態では、卵母細胞分泌因子は組み換えタンパク質である。更に別の実施の形態では、卵母細胞分泌因子はヘテロ二量体タンパク質である。

別の実施の形態では、本発明によるin vitro方法において、最短2時間〜最長96時間に亘って、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。この時間は、例えば、凝縮期又はいわゆる核小体を取り囲む（SN）配置への卵母細胞のクロマチンの再編成によって証明される、発生の進行期に到達するのに十分である。更に特定の実施の形態では、卵胞のサイズによって決定される期間に亘って、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。特に、卵胞サイズは、例えば超音波画像診断等によってCOC回収の時に決定される。直径1 mm〜5 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも48時間留まることが好ましい。直径5 mm超〜10 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも24時間留まることが好ましく、直径10 mm超の卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも2時間留まることが好ましい。受精能獲得期間は、卵母細胞に減数分裂を再開する能力を獲得させることができるものであり、それは減数分裂の刺激が引き起こされた後にのみ評価される。別の実施の形態では、卵核胞崩壊（GVBD）及び第一極体（PB）の突出によって倒立顕微鏡下で証明される、卵母細胞の更なる減数分裂成熟を可能とするため、哺乳動物COCを成熟培地と接触させる（減数分裂刺激）。

特定の実施の形態では、本発明によるin vitro方法において、非接着性又は接着性の培養プレート、特に非接着性培養プレートにおいて哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。

更なる実施の形態では、本発明によるin vitro方法において、最短30分間〜最長2時間に亘って、未熟なCOCを収集培地と接触させる。

別の実施の形態では、本発明によるin vitro方法は生殖補助医療の一部である。特定の実施の形態では、上記生殖補助医療は体外受精又はICSIを含む。

本発明の特定の実施の形態では、哺乳動物COCはヒトCOCである。

更なる態様では、本発明は、未熟な哺乳動物COCの体外成熟に対するキットを提供する。上記キットは、本明細書に記載される受精能獲得培地を備える。特定の実施の形態では、本発明によるキットにおいて、受精能獲得培地は、0.1 nM〜50 nMのCNPと、エストラジオールと、FSHとを含む。更に特定の実施の形態では、本発明によるキットにおいて、受精能獲得培地は、10nM〜25 nMのCNP、好ましくは25 nMのCNPを含む。特定の実施の形態では、上記キットにおける受精能獲得培地は、1 nM〜1000 nMのエストラジオール、好ましくは10 nMのエストラジオールを含む。別の実施の形態では、上記キットにおける受精能獲得培地は、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSH、特に2.5 mIU/mlのFSH、又は1 mIU/mlのFSHを含む。更に別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量の組み換えFSH、FSH類縁体又はFSH模倣分子を含む。更に別の実施の形態では、本発明によるキットにおいて、受精能獲得培地は、0.1 ng/ml〜10 ng/mlのインスリン、特に5 ng/mlのインスリンを含む。別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量のインスリン類縁体又はインスリン模倣分子を含む。別の実施の形態では、本発明によるキットにおいて、受精能獲得培地は、0.1 nM〜50 nMのCNP、好ましくは25 nMのCNPと、1 nM〜1000 nMのエストラジオール、好ましくは10 nMのエストラジオールと、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSH、好ましくは2.5 mIU/mlのFSH又は1 mIU/mlのFSHと、0.1ng/ml〜10 ng/mlのインスリン、好ましくは5ng/mlのインスリンとを含む。

更なる実施の形態では、本発明によるキットにおいて、受精能獲得培地は卵母細胞分泌因子を含む。本明細書で使用される、卵母細胞分泌因子は、特に、それぞれ10 ng/ml〜100 ng/mlの範囲の受精能獲得培地中の濃度で、GDF-9、BMP-15、FGF-8又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特定の実施の形態では、本明細書で使用される、卵母細胞分泌因子は、組み換えタンパク質又はヘテロ二量体タンパク質である。

別の実施の形態では、未熟な哺乳動物のCOCの体外成熟に対するキットは、
（a）天然起源のホスホジエステラーゼを阻害する天然若しくは人工の化合物、又は卵母細胞減数分裂の天然阻害剤を含む収集培地と、
（b）本明細書に記載の受精能獲得培地と、
（c）成熟培地と、
（d）接着性及び／又は非接着性の培養プレートと、
（e）上記キットの使用に関する指示書と、
を備える。

別の態様では、本発明は、未熟な哺乳動物COCの体外成熟に対する受精能獲得培地の使用を提供する。本明細書に記載されるように、上記受精能獲得培地は、0.1 nM〜50 nMのCNPと、エストラジオールと、FSHとを含む。特定の実施の形態では、上記受精能獲得培地は1 nM〜1000 nMのエストラジオールを含む。別の実施の形態では、受精能獲得培地は、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSH、好ましくは2.5mIU/mlのFSH、又は1 mIU/mlのFSHを含む。更に別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量の組み換えFSH、FSH類縁体又はFSH模倣分子を含む。更に別の実施の形態では、受精能獲得培地は、0.1 ng/ml〜10 ng/mlのインスリン、好ましくは5 ng/mlのインスリンを含む。別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量のインスリン類縁体又はインスリン模倣分子を含む。更なる実施の形態では、本発明による受精能獲得培地の使用において、受精能獲得培地は卵母細胞分泌因子を含む。本明細書で使用される、卵母細胞分泌因子は、GDF-9、BMP-15、FGF-8又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特定の実施の形態では、卵母細胞分泌因子は組み換えタンパク質である。更に別の態様では、卵母細胞分泌因子はヘテロ二量体タンパク質である。

特定の実施の形態では、本発明による受精能獲得培地の使用において、最短2時間〜最長96時間に亘って、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。さらに、受精能獲得培地の使用において、減数分裂停止状態に卵母細胞を維持し、細胞質成熟の獲得を可能とするため、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。特に、例えば、凝縮期又はいわゆる核小体を取り囲む（SN）配置への卵母細胞のクロマチンの再編成によって証明される、発生の進行期に達するのに十分な時間、COCを受精能獲得培地と接触させる。更に特定の実施の形態では、卵胞のサイズによって決定される期間に亘り、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。特に、卵胞サイズは、例えば、超音波画像診断等によってCOC回収の時に決定される。直径1 mm〜5 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも48時間留まることが好ましい。直径5 mm超〜10 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも24時間留まることが好ましく、直径10 mm超の卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも2時間留まることが好ましい。核レベルでの卵母細胞成熟の判断、すなわち卵母細胞内のクロマチン再編成は蛍光顕微鏡下で判断される。

特定の実施の形態では、本発明による受精能獲得培地の使用において、非接着性又は接着性の培養プレート、特に非接着性培養プレートにおいて哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。

別の実施の形態では、受精能獲得培地の使用は、減数分裂停止状態に哺乳動物COCの卵母細胞を維持する。卵母細胞の更なる成熟に影響を及ぼさずに、減数分裂停止状態に卵母細胞を維持する能力に基づき、現在使用されるIVM方法と比較した場合、本発明の受精能獲得培地の使用は柔軟なIVM法を生み出す。in-vitro培養の延長、すなわち受精能獲得の間隔において可能な柔軟性により、（卵母細胞のマイクロインジェクションのような）重要な技術的作業は全て、ここでは通常の作業時間内であることができる。明らかに、これは現在のIVMプロトコルよりも重要で実用的な改善である。

更なる実施の形態では、本発明による受精能獲得培地の使用は、生殖補助医療の一部である。特定の実施の形態では、上記生殖補助医療は体外受精又はICSIを含む。

本発明の受精能獲得培地の使用に基づく更なる適用は、通常使用されるよりも小さな卵胞から得られるCOCのIVM成績の向上に帰する。

より小さな卵胞を成熟させることができることで、
小胞状卵胞から発達上有能な成熟卵母細胞を凍結保存することが可能となり、
小胞状卵胞からCOC（該COCは、超音波ガイド下経腟回収によって穿刺された卵胞よりも小さな卵胞の切開により得られる）を培養することが可能性となる（癌治療の場合の妊孕性温存の分野に重要）。

本発明の別の態様は、哺乳動物COCの体外成熟に対する受精能獲得培地を備えるキットの使用に基づく。上記キットは、本明細書に記載される受精能獲得培地を備える。特定の実施の形態では、本発明によるキットにおいて、受精能獲得培地は、0.1 nM〜50 nMのCNPと、エストラジオールと、FSHとを含む。特定の実施の形態では、上記キットにおける受精能獲得培地は、1 nM〜1000 nMのエストラジオールを含む。別の実施の形態では、上記キットにおける受精能獲得培地は、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSHを含む。まだ別の実施の形態では、本発明によるキットにおいて、受精能獲得培地は、0.1ng/ml〜10 ng/mlのインスリンを含む。別の実施の形態では、本発明によるキットにおいて受精能獲得培地は、0.1 nM〜50 nMのCNP、好ましくは25 nMのCNPと、1 nM〜1000 nMのエストラジオール、好ましくは10 nMのエストラジオールと、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSH、好ましくは2.5 mIU/mlのFSH、又は1 mIU/mlのFSHとを含む。更に別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量の組み換えFSH、FSH類縁体又はFSH模倣分子を含む。

更に別の実施の形態では、本発明によるキットにおいて受精能獲得培地は、0.1 ng/ml〜10 ng/mlのインスリン、特に5 ng/mlのインスリンを含む。別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量のインスリン類縁体又はインスリン模倣分子を含む。

更なる実施の形態では、本発明によるキットにおいて、受精能獲得培地は卵母細胞分泌因子を含む。本明細書で使用される、卵母細胞分泌因子は、GDF-9、BMP-15、FGF-8、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特定の実施の形態では、本明細書で使用される、卵母細胞分泌因子は、組み換えタンパク質、又はヘテロ二量体タンパク質である。

別の実施の形態では、未熟な哺乳動物COCの体外成熟に対する受精能獲得培地を備えるキットの使用は、最短2時間〜最長96時間に亘って、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させることを含む。さらに、受精能獲得培地を備えるキットの使用において、減数分裂停止を誘導し、成熟を可能とするために、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。特に、例えば、凝縮期又はいわゆる核小体を取り囲む（SN）配置への卵母細胞のクロマチンの再編成によって証明される、発生の進行期に達するのに十分な時間、COCを受精能獲得培地と接触させる。更に特定の実施の形態では、卵胞のサイズによって決定される期間に亘り、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。特に、卵胞サイズは、超音波画像診断によってCOC回収の時に決定される。直径1 mm〜5 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも48時間留まることが好ましい。直径5 mm超〜10 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも24時間留まることが好ましく、直径10 mm超の卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも2時間留まることが好ましい。核レベルでの卵母細胞成熟の判断、すなわち卵母細胞内のクロマチン再編成を蛍光顕微鏡下で判断する。

本発明の別の態様は、キットの使用であって、
（a）天然起源のホスホジエステラーゼを阻害する天然若しくは人工の化合物、又は卵母細胞減数分裂の天然阻害剤を含む収集培地と、
（b）本明細書に記載の受精能獲得培地と、
（c）成熟培地と、
（d）接着性及び／又は非接着性の培養プレートと、
（e）上記キットの使用に関する指示書と、
を備える、キットの使用に基づく。

本発明の特定の態様では、未熟な哺乳動物COCの体外成熟に対するキットの使用は、最短30分間〜最長2時間に亘るCOCと収集培地との接触を含む。別の態様では、本発明によるキットの使用では、最短2時間〜最長96時間に亘って哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。特に、収集培地、受精能獲得培地、成熟培地、接着性及び／又は非接着性の培養プレート、及び使用に関する指示書を備えるキットの使用では、減数分裂停止を誘導し、成熟を可能とするため、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。特に、例えば、凝縮期又はいわゆる核小体を取り囲む（SN）配置への卵母細胞のクロマチンの再編成によって証明される、発生の進行期に達するのに十分な時間、COCを受精能獲得培地と接触させる。更に特定の実施の形態では、卵胞のサイズによって決定される期間に亘り、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。特に、卵胞サイズは、例えば、超音波画像診断等によってCOC回収の時に決定される。直径1 mm〜5 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも48時間留まることが好ましい。直径5 mm超〜10 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも24時間留まることが好ましく、直径10 mm超の卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも2時間留まることが好ましい。

受精能獲得期間は、卵母細胞に減数分裂を再開する能力を獲得させることができるものであり、それは減数分裂の刺激が引き起こされた後にのみ評価される。別の実施の形態では、卵核胞崩壊（GVBD）及び第一極体（PB）の突出によって倒立顕微鏡下で証明される、卵母細胞の更なる減数分裂成熟を可能とするため、哺乳動物COCを成熟培地と接触させる（減数分裂刺激）。

特定の実施の形態では、本発明によるキットの使用では、非接着性又は接着性の培養プレートにおいて哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。

別の実施の形態では、本発明によるキットの使用では、受精能獲得培地は、哺乳動物COCの卵母細胞を減数分裂停止状態に維持する。

更なる実施の形態では、本発明によるキットの使用は、哺乳動物COCの成熟を誘導する。

更に別の実施の形態では、本発明によるキットの使用は、生殖補助医療の一部である。
特定の実施の形態では、上記生殖補助医療は、体外受精又はICSIを含む。

番号が付与された本発明の実施の形態は、以下のとおりである：
1．未熟な哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟に対する受精能獲得培地であって、0.1 nM〜50 nMのC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）と、エストラジオールと、卵胞刺激ホルモン（FSH）とを含み、特に10 nM〜50 nMのC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）を含み、更に25 nMのCNPを含む、受精能獲得培地。

2．1nM〜1000 nMのエストラジオールを含む、項1に記載の受精能獲得培地。

3．0.1mIU/ml〜10 mIU/mlの卵胞刺激ホルモン（FSH）を含む、項1に記載の受精能獲得培地。

4．0.1ng/ml〜10 ng/mlのインスリンを更に含む、上記のいずれかの項に記載の受精能獲得培地。

5．卵母細胞分泌因子を含む、上記のいずれかの項に記載の受精能獲得培地。

6．上記卵母細胞分泌因子が、GDF-9、BMP-15、FGF-8、それらの類縁体、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、特に該因子のそれぞれが受精能獲得培地中10 ng/ml〜100 ng/mlの範囲の濃度である、項5に記載の受精能獲得培地。

7．未熟な哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟方法であって、未熟な卵丘細胞卵母細胞複合体を収集培地中に収集することと、該哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を、0.1 nM〜50 nMのCNP（特に10 nM〜50 nMのCNP）とエストラジオールとFSHとを含む受精能獲得培地と接触させることと、該哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を成熟培地と更に接触させることとを含む、方法。

8．上記受精能獲得培地が1 nM〜1000 nMのエストラジオールを含む、項7に記載の方法。

9．上記受精能獲得培地が、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSHを含む、項7に記載の方法。

10．上記受精能獲得培地が、0.1 ng/ml〜10 ng/mlのインスリンを更に含む、項7〜9のいずれか一項に記載の方法。

11．上記受精能獲得培地が卵母細胞分泌因子を含む、項7〜10のいずれか一項に記載の方法。

12．上記卵母細胞分泌因子が、GDF-9、BMP-15、FGF-8、それらの類縁体、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、特に該因子のそれぞれが受精能獲得培地中10 ng/ml〜100 ng/mlの範囲の濃度である、項11に記載の方法。

13．上記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体がヒト卵丘細胞卵母細胞複合体である、項7〜12のいずれか一項に記載の方法。

14．上記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を、最短2時間〜最長96時間に亘って上記受精能獲得培地と接触させる、項7〜13のいずれか一項に記載の方法。

15．上記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を、非接着性又は接着性の培養プレート、特に非接着性培養プレートにおいて、上記受精能獲得培地と接触させる、項7〜14のいずれか一項に記載の方法。

16．最短30分間〜最長2時間に亘って上記未熟な卵丘細胞卵母細胞複合体を収集培地と接触させる、項7に記載の方法。

17．生殖補助医療の一部である、項7〜16のいずれか一項に記載の方法。

18．上記生殖補助医療が体外受精又はICSI又は妊孕性温存を含む、項17に記載の方法。

19．項1〜6のいずれか一項に記載の受精能獲得培地を備える、未熟な哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟に対するキット。

20．未熟な哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟に対するキットであって、
（a）天然起源のホスホジエステラーゼを阻害する天然若しくは人工の化合物、又は卵母細胞減数分裂の天然阻害剤を含む収集培地と、
（b）項1〜6のいずれか一項に記載の受精能獲得培地と、
（c）成熟培地と、
（d）非接着性及び／又は接着性の培養プレートと、
（e）上記キットの使用に関する指示書と、
を備える、キット。

21．哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟に対する、項1〜6のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用。

22．上記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を、最短2時間〜最長96時間に亘って上記受精能獲得培地と接触させる、項1〜6のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用。

23．上記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を、非接着性又は接着性の培養プレート、特に非接着性培養プレートにおいて、上記受精能獲得培地と接触させる、項1〜6のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用。

24．上記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の卵母細胞を減数分裂停止状態に維持するための、項1〜6のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用。

25．生殖補助医療の一部としての、項1〜6のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用。

26．上記生殖補助医療は、体外受精又はICSIを含む、項25に記載の受精能獲得培地の使用。

27．例えば、癌治療の場合又は卵母細胞バンキングの場合（後者は、特に年齢バンカー（35歳〜40歳）に対して）等の妊孕性温存法における、項1〜6のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用。

28．上記妊孕性温存法が小胞状卵胞の凍結保存を含む、項27に記載の使用。

29．上記受精能獲得培地が、上記凍結保存された小胞状卵胞の体外成熟に使用される、項28に記載の使用。

30．癌治療の場合の妊孕性温存における項1〜6のいずれかに記載の受精能獲得培地の使用。

31．卵母細胞バンキングの場合の妊孕性温存における項1〜6のいずれかに記載の受精能獲得培地の使用。

32．哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟に対する、項19又は20に記載のキットの使用。

33．上記未熟な卵丘細胞卵母細胞複合体を、最短30分間〜最長2時間に亘って収集培地と接触させる、項20に記載のキットの使用。

34．上記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を、最短2時間〜最長96時間に亘って受精能獲得培地と接触させる、項19又は20に記載のキットの使用。

35．上記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を、非接着性又は接着性の培養プレート、特に非接着性培養プレートにおいて、受精能獲得培地と接触させる、項19又は20に記載のキットの使用。

36．上記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の卵母細胞を減数分裂停止状態に維持するための、項19又は20に記載のキットの使用。

37．哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の成熟を誘導するための、項19又は20に記載のキットの使用。

38．生殖補助医療の一部としての項19又は20に記載のキットの使用。

39．上記生殖補助医療が体外受精又はICSIを含む、項38に記載のキットの使用。

40．妊孕性温存法の一部として、特に癌治療の場合の妊孕性温存における、項19又は20に記載のキットの使用。

これより図面を具体的に参照するが、示される項目は例示であり、本発明の種々の実施形態の説明的な論考のみを目的とすることが強調される。これらの図面は、本発明の原理及び概念的態様の最も有用かつ簡単な説明であると考えられるものを提供するために提示される。この点で、本発明の基礎的理解に必要とされるよりも詳細な本発明の構造細部を示そうとはしていない。この説明は、図面と共に本発明の幾つかの形態を実際に具体化し得る方法を当業者に明らかとするものである。

減数分裂成熟の進行に対するCNP-22の用量依存性効果 排卵前のCOCを、0 nM（対照）、1 nM、10 nM、100 nMのCNP-22（A）の存在下で、及び4 ng/mLのEGF（B）と組み合わせて、18時間に亘って体外成熟させた。成熟期間の後、卵母細胞核成熟を評価した。各バーは、3つの再現（1つの処理あたり少なくとも33個の卵母細胞）から得られた実験データの平均±SDを表す。種々の文字は有意差（P＜0.05）を示す。 CNP-22は、減数分裂のEGFR依存性の再開を遅延させる （A）排卵前のCOCを0 nM（対照）又は25 nM CNP-22＋4 ng/mL EGFの存在下で培養に置き、初期の減数分裂再開を収集の2時間後、4時間後、及び6時間後に評価した。（B）排卵前のCOCを25 nM CNP-22、又は25nM CNP-22＋4 ng/mL EGFの存在下で培養に置き、減数分裂成熟（PB突出までの減数分裂の完了）を24時間後に評価した。各バーは、3つの再現（1つの処理あたり少なくとも41個の卵母細胞）から得られたデータの平均±SDを表す。種々の文字又は＊は有意差（P＜0.05）を示す。 卵母細胞減数分裂停止に対するE2、FSHの用量、及びGDF9補充の効果 未熟なCOCを、25 nM CNP-22単独、又は10 nM E2との存在下で培養に置いた。培養48時間の間の減数分裂停止の維持に対する、2.5mIU/mL又は5 mIU/mL FSH単独、又は50ng/mL GDF9と組み合わせた添加の効果の可能性を評価した。各バーは、3つの再現（1つの処理あたり少なくとも38個の卵母細胞）から得られた実験データの平均±SDを表す。種々の文字は有意差（P＜0.05）を示す。 クロマチン配置及びGV卵母細胞の直径に対する48時間の培養期間（前IVM）の効果 未熟なCOCを、25 nM CNP-22+10 nM E2の存在下で培養に置いた。卵母細胞のクロマチン配置（A）、又は卵母細胞の直径（B）に対する、2.5 mIU/mL FSH又は2.5mIU/mL FSH＋50 ng/mL GDF9の組み合わせの補充効果の可能性を評価した。材料及び方法に記載されるようにクロマチン配置を評価し、NSN、NSN/SN（移行）及びNSNとして採点した。さらに、培養前（0時間）、単離直後に卵母細胞において直径を評価した。（A）では、各バーは、3つの再現（1つの処理あたり少なくとも46個の卵母細胞）から得られた実験データの平均±SDを表す。（B）では、1つの処理あたり少なくとも31個のGV卵母細胞を測定した。異なる文字は有意差（P＜0.05）を示す。 前IVM＋IVMの後の卵母細胞及び胚の質の評価 48時間の前IVM期間及び18時間のIVM期間の後、卵母細胞を体外受精させて、胚を最長5日間培養した。評価パラメーターは、2細胞率（受精）（A）、及び5日目の胚盤胞形成（5日目の胚盤胞／2細胞）（B）であった。（A）及び（B）における各バーは、4つの再現（1つの処理当たり少なくとも64個の卵母細胞）から得られた実験データを表し、結果を平均±SDとして示す。 （C）2つの参照対照に関する2細胞率及び5日目の胚盤胞率（5日目の胚盤胞／2細胞）を示す。未熟なCOCを20日齢のマウスの小胞状卵胞から得て、100 ng/mLのEREG［20do（IVM）］の存在下で18時間に亘って体外成熟させた。同様に、48時間のeCG初回刺激に続く14時間のhCGの後、ゴールドスタンダード、すなわちin vivoで成長させた卵母細胞（対照）を25日齢〜27日齢のマウスから得た。これらの対照に関するデータは、2つの再現（1つの処理当たり少なくとも56個の卵母細胞）（P＜0.05）に由来する。 in vitro培養した卵丘細胞−卵母細胞結合に対するCNPの効果 PDE3阻害剤又はCNPのいずれかの存在下での48時間の培養後のマウスCOCにおける透明帯を貫通する突起（Toranszonal projections：TZP）。左、PDE3阻害剤が存在する状態、右、CNPが存在する状態。卵母細胞を囲む透明帯が描かれ、矢印で示される。PDE3阻害剤の存在下では、透明帯は黒く、透明帯を貫通する突起がほとんどないこと示す。予想外なことに、CNPの存在下では、透明帯は、正常な卵丘細胞−卵母細胞結合の透明帯を貫通する突起の兆候が多くある。 in vitro培養した卵丘細胞−卵母細胞結合の透明帯におけるアクチンフィラメント染色 CNP又はPDE3阻害剤に暴露されたCOCにおける透明帯に対する平均ピクセル強度。（A）では、PDE3に対する阻害剤としてOrg9935を使用し、アクチンフィラメントをテキサスレッド結合ファロイジンで証明したのに対し、（B）ではPDE3に対する阻害剤としてシロスタミドを使用し、アクチンフィラメントをActin green（商標）で証明した。（n=分析したCOCの数）。CNP及びPDE3iの群を、パネルAに対するP値0.0082、及びパネルBに対するP値＜0.0001のマンホイットニー検定を使用して統計学的に比較した。 受精能獲得培養中に存在するCNP及びPDE3Iの初期胞状卵胞に由来するマウスの卵丘細胞に囲まれた卵母細胞の発生能に対する差次的効果 受精能獲得培養に続くIVMの後の受精率（A）及び胚盤胞形成率（B）。いずれの場合も2つの参照対照からのデータ、すなわち、1）事前の受精能獲得培養を行わないIVMに対する対照、及び2）標準的なin-vivo対照（完全に成長した成熟卵母細胞）が含まれた。 18時間後の減数分裂の再開。減数分裂成熟の進行に対するCNP-22の用量依存性効果。 排卵前のCOCを、0.1 nM〜1 μMのCNP用量範囲の存在下で培養した。対照条件（CNPを含まない基本培地）を含んだ。各バーは、3つの再現から得られた実験データの平均±SDを表す（1つの処理当たり平均54個の卵母細胞）。アスタリスクは、CNPのない対照条件に対する有意差（P＜0.01）を示す。パネルAは、無傷の卵核胞を有する卵母細胞のパーセンテージ（GV）率（％）を提供し、ここで、無傷のGVの存在は減数分裂停止の指標である。パネルBは、減数分裂停止の場合には低いと予想される、卵核胞崩壊（GVBD）期での卵母細胞のパーセンテージを提供し、また、パネルCは、これもまた減数分裂停止の場合には低いと予想される、第一極体（PB）を突出している卵母細胞のパーセンテージを提供する。 18時間後の減数分裂の再開。減数分裂成熟の進行に対するCNP-53の用量依存性効果。 排卵前のCOCを、0.1 nM〜1 μMのCNP用量範囲の存在下で培養した。対照条件（CNPを含まない基本培地、及び25 nMのCNP-22を含む陽性対照）を含んだ。各バーは、3つの再現から得られた実験データの平均±SDを表す（1つの処理当たり平均54個の卵母細胞）。アスタリスクは、CNPのない対照条件に対する有意差（P＜0.01）を示す。パネルAは、無傷の卵核胞を有する卵母細胞のパーセンテージ（GV）率（％）を提供する。パネルBは、卵核胞崩壊（GVBD）期での卵母細胞のパーセンテージを提供する。パネルCは、第一極体（PB）を突出している卵母細胞のパーセンテージを提供する。 受精卵（2PN）の数当たり、又は初期COC（COC）の数当たりで表される成熟率、受精率、及び良質な胚（GQE）の数。 黒色の棒グラフ（N＝374名の患者）：「従来のIVF（ICSI）分野」による結果：欧州における現在のICSIの実施を反映する。このデータは、最も多用されている刺激療法（GnRHアンタゴニスト＋HP-hMG）から得られる：公開された「MEGASET」データによる発生学データ：全ての胚を胚盤胞期まで培養した、FerringPharmaceuticalsによる欧州多施設国際共同試験。灰色の棒グラフ（N＝413名の患者）：非HCG誘発サイクルから卵母細胞を得る場合に、日常的なIVM（Origioキット）により得られた結果。白色の棒グラフ（N＝15）：受精能獲得培養のためにCOCも与えた15名の患者に由来する卵母細胞に対して使用した「新たな受精能獲得培養」工程による結果。斜線の白色棒グラフ（N＝15名の患者）：これらの結果は、受精能獲得培養に対してCOCを与えた15名の患者（すなわちGreen群と「同胞」）からの卵母細胞の一部に対する日常的なIVM（Origio^（商標）法）に由来する。 受精卵（2PN）の数当たりで表される、MII卵母細胞当たりで表される、又は初期COC（COC）の数当たりで表される5日目〜6日目の胚盤胞形成。 黒色の棒グラフ（N＝374名の患者）は、「従来のIVF（ICSI）分野」による結果：欧州における現在のICSIの実施を反映する。このデータは、最も多用されている刺激療法（GnRHアンタゴニスト＋HP-hMG）から得られる：公開された「MEGASET」データによる発生学データ：全ての胚を胚盤胞期まで培養した、FerringPharmaceuticalsによる欧州多施設国際共同試験。灰色の棒グラフ（N＝98名の患者）は、98名の患者のサブグループによる結果である。4つ以上の良好な3日目の胚があった場合のみ、胚を更に胚盤胞培地へと培養した。白色の棒グラフ（N＝15）：受精能獲得培養のため、COCも与えた15名の患者に由来する卵母細胞に対して使用される「新たな受精能獲得培養」工程による結果。斜線の白色棒グラフ（N＝5名の患者）は、4つ以上の「良質」な3日目の胚があった場合のみ、その胚をさらに胚盤胞培地へと培養した、5名の患者のサブグループによる結果である。注：これは、日常的なIVMに対する最も有利な「バイアス」である。斑点の白色棒グラフ（N=7）は、「新たな受精能獲得培養」工程による7名の同胞患者のサブグループからの結果である。すなわち、4つ以上の「良質」な3日目の胚があった場合のみ、胚盤胞培地における胚の発生について胚を考慮する。注：このサブグループ分析を、日常的なIVMにおける胚盤胞培養の指針に対する理想的な比較をするため行った（斜線の白色棒グラフ）。

本発明は、哺乳動物における生殖補助医療に対する組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体（COC）の体外成熟に対する組成物及び方法に関する。本発明は、低用量のCNP、エストラジオール及びFSHの組み合わせが、初期胞状卵胞、特に直径9 mm未満の小さな初期胞状卵胞の体外成熟を成功させ得るという知見に基づく。

本明細書で使用される「卵胞」の用語は、女性の生殖生物学の基本単位であり、卵巣で見られる細胞のほぼ球状の凝集体で構成される卵巣卵胞を指す。卵胞は、単一の卵母細胞を含む。卵胞は、周期的に成長及び発生を開始し、通常、単一の能力のある卵母細胞の排卵で最高潮に達する。卵巣卵胞の細胞は、卵母細胞、顆粒膜細胞及び内卵胞膜層及び外卵胞膜層の細胞である。

本明細書で使用される「卵母細胞」の用語は、卵母細胞を単独で、又は卵丘細胞卵母細胞複合体（COC）の一部としての卵母細胞等の1以上の他の細胞と共に卵母細胞を含む。卵母細胞の核は、卵核胞と呼ばれる。

本明細書で使用される「卵丘細胞」の用語は、卵母細胞に直接又は近接する、発生途中の卵巣卵胞中の細胞を指す。卵丘細胞は、受精により生存可能な胚を生じるのに必要な、その栄養上、エネルギーの、及び／又はその他の要求の一部の卵母細胞への提供に関与する。

本明細書で使用される「卵丘細胞卵母細胞複合体」の用語は、互いに物理的に結び付いている少なくとも1つの卵母細胞及び少なくとも1つの卵丘細胞を指す。一般に、卵母細胞は、堅く詰め込まれた卵丘細胞の層に囲まれ、それによって、卵丘細胞卵母細胞複合体を形成する。

本明細書で使用される生殖補助医療すなわちARTは、雌性配偶子（卵母細胞）及び雄性配偶子（精子）の両方が扱われる全ての不妊治療を含む。体外受精（IVF）は、不妊夫婦が子供を授かるのを支援するために使用される、いくつかの生殖補助医療の1つである。IVFは、卵母細胞が女性の卵巣から取り出され、検査処置において精子により受精される手順を指す。

従来のARTでは、in vivoにおいて成熟卵母細胞と共により多くの大きな卵胞を産生するように卵巣を刺激するため性腺刺激ホルモンを使用するのに対し、IVMは、刺激されていない又は最小限に刺激された卵巣からの小卵胞（直径12 mm未満）に由来する未熟な卵母細胞を回収することにより、卵巣の刺激の副作用を回避することを主な目標とする。しかしながら、従来のARTと比較して、卵母細胞の固有の発生能はIVMの後に減少される。

卵母細胞の核成熟は、前期Iで減数分裂停止を再活性化するプロセスを包含し、通常受精が行われる段階である中期II（MII期）に進むために減数分裂のプロセスを刺激する。前期Iで停止された卵母細胞は、顕微鏡を通して核膜及び核小体を見ることができる、いわゆる卵核胞（GV期）を呈する。卵母細胞がいわゆるGV崩壊（GVBD期）を経る場合、核成熟がはっきりと表れ、MII期に進んで第一極体（PB）を突出させる。細胞質の成熟は、活性化、前核の形成、及び移植が遂行されるまで経験する発生経路に対して卵母細胞を準備するプロセスを指す。GV期の卵母細胞の核及び細胞質の両方の成熟を経る能力は、通常、段階的に獲得される。

卵母細胞の体外成熟（IVM）は、堅く圧縮されたコロナ卵丘細胞層で囲まれるGV期卵母細胞（COC等）を成熟させる技法である。ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）の投与によって排卵が引き起こされる前又はその後に、これらの卵母細胞を超音波ガイド下穿刺によって得ることができる。卵母細胞IVMは、不妊治療を単純化する可能性、又は卵巣の卵胞貯蔵が正常な若しくは高い患者におけるホルモン（hCG）刺激と関係するリスク及び費用を減らす可能性を有する。この卵胞貯蔵は、抗ミュラー管ホルモン（AMH）レベルの測定、及び月経周期の3日目の超音波ガイド下卵胞カウントによって日常的に特定される。

ART及びIVMの成功は、受精に先立つ卵母細胞の成熟に大きく依存する。胞状卵胞から採取された卵母細胞は、典型的には減数分裂の自発的な再開を経る（すなわち、培養に置かれた場合に核成熟へと進む）。卵母細胞が完全な細胞質成熟を経る前に、この核成熟が生じる場合が多い。これは、最終的には、受精及びおそらく後の胚発生及び移植の成功に影響すると考えられる。したがって、IVMに対する主な課題は、卵母細胞内の核及び細胞質の成熟プロセスの同調である。延長された卵母細胞成熟期間は、未熟な卵母細胞と適切に馴化された卵丘細胞とのより長い相互作用を促進するであろう。さらに、小卵胞のIVMは、更なる課題である。ヒト小卵胞が十分な量のLH受容体、及び／又はEGF及びEGF様因子に対する受容体系を発現しないことは、文献より知られている。結果的に、成熟を誘導するEGF様因子の主要なカスケードを活性化することはできない。

本発明では、未熟な哺乳動物COCを、事前のhCG刺激をせずに、又はhCG刺激の後にのみ収集する。好ましい実施形態では、hCG刺激はCOC収集の前には生じていない。より一層好ましい実施形態では、高用量のFSH、LHRH、組み換えLH、又はLH類縁体を含むいずれかのトリガーは、in vivoでのCOCの収集前には回避されなければならない。

本発明は、エストラジオール及びFSHと組み合わせた特定範囲の「低」用量のC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）が、哺乳動物COC、特に直径9mm未満の小さな初期胞状卵胞に由来するもののIVMプロセスを著しく改善するという知見に基づく。以下の実施例から更に明らかなように、減数分裂停止状態にCOCを維持するためのPDE3阻害剤の適用と明らかに異なり、CNPはベル形の用量曲線を有する。予想外にも、0.1 nMの非常に低用量のみならず、1 μMの非常に高用量もまた、GV期での卵母細胞の停止の維持において最適下限であることを実証した。用量曲線のこの差は、以下に更に詳述されるように、小さな初期胞状卵胞における減数分裂再開を単に遅らせることしのぐCNP治療を与える、異なった潜在的な機構を暗示する。

したがって、哺乳動物COCの体外成熟に対して受精能獲得培地を供給することは、本発明の第1の態様である。受精能獲得培地は、0.1 nM〜50 nMのC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）と、エストラジオールと、FSHとを含む。特定の実施形態では、受精能獲得培地は、1 nM〜1000 nMのエストラジオールを含む。別の実施形態では、受精能獲得培地は、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSHを含む。更に別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量の組み換えFSH、FSH類縁体又はFSHの模倣分子を含む。更に別の実施形態では、受精能獲得培地は、0.1 ng/ml〜10 ng/mlのインスリンを含む。別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量のインスリン類縁体又はインスリン模倣分子を含む。更に別の実施形態では、受精能獲得培地は、0.1 nM〜50 nMのCNP、好ましくは10 nM〜50 nMのCNP、最も好ましくは10 nM〜25 nMのCNP、更に好ましくは25 nM CNPと、1 nM〜1000nMのエストラジオール、最も好ましくは10 nMのエストラジオールと、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSH、最も好ましくは2.5 mIU/ml又は1 mIU/mlのFSHと、0.1ng/ml〜10 ng/mlのインスリン、最も好ましくは5ng/mlのインスリンとを含む。さらに、本発明のいくつかの実施形態では、受精能獲得培地は、卵母細胞分泌因子又は卵母細胞分泌因子の組み合わせを含む。本明細書で使用される卵母細胞分泌因子は、GDF-9、BMP-15、FGF-8又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、卵母細胞分泌因子は、組み換えタンパク質である。更に別の態様では、卵母細胞分泌因子は、ヘテロ二量体タンパク質である。更に別の更なる実施形態では、受精能獲得培地は、好ましくは0.1 nM〜50 nMのCNP、好ましくは10 nM〜50 nMのCNP、最も好ましくは10 nM〜25 nMのCNP、更に好ましくは25 nMのCNPと、1 nM〜1000 nMのエストラジオール、より好ましくは10 nMのエストラジオールと、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSH、更に好ましくは2.5 mIU/ml又は1 mIU/mlのFSHと、0.1ng/ml〜10 ng/mlのインスリン、より好ましくは5ng/mlのインスリンと、GDF-9、BMP-15、FGF-8、若しくは任意の等価物、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される卵母細胞分泌因子とを含む。

心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）、及びC型ナトリウム利尿ペプチドは、ナトリウム利尿ペプチドファミリーの中で最も研究されているメンバーである。CNPは、前駆物体NPPCタンパク質が22個のアミノ酸ペプチドCNPへと開裂される多様な細胞種において発現される、ナトリウム利尿ペプチド前駆体C（NPPC）遺伝子によってコードされる。CNPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体-B（NPRB）としても知られる、その同系統の受容体グアニリルシクラーゼB（GC-B）を活性化するのに対し、ANP及びBNPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体−A（NPRA）としても知られる、グアニリルシクラーゼ（GC-A）を刺激する。GC-A及びGC-Bは、セカンドメッセンジャーcGMPの産生を介してシグナル伝達を行う膜結合型グアニリルシクラーゼ酵素である。CNPは、オートクリン／パラクリン様式で作用して血管弛緩及び血管リモデリングを誘導し、また骨成長を調節する。

CNPは、22アミノ酸残基長（CNP-22）であり、53個のアミノ酸残基を含むN-末端伸長形態（CNP-53）も記載されている。ANP、BNP及びCNPは、分子内ジスルフィド結合によって形成される17残基環状構造と高度に相同性である。NPPC遺伝子に対する遺伝子配列には、Genbank、座NM_024409でアクセスすることができる。ANP及びBNPは、主に心房及び心室によってそれぞれもたらされる、主として心臓ホルモンとして働く。CNPは、主として脳で発現されると考えられた。しかしながら、他の研究は、多様なサイトカイン及び増殖因子によるCNPの産生の増大を伴った、培養された内皮細胞による、及び血管によるCNPのin vivoでの産生を実証した。研究は、NPPC及びNPRBの卵巣での発現及び性腺刺激ホルモンによるそれらの調節を報告した。最近の研究は、顆粒膜細胞中のNPPC mRNAの発現、及びCNPが卵丘細胞のcGMP産生を刺激する能力を実証した。その後、cGMPは卵丘細胞から卵母細胞までのギャップ結合を介して拡散し、3型ホスホジエステラーゼ（PDE3）依存性cAMP分解を妨げ、したがって減数分裂停止状態に卵母細胞を維持する。

以下の実施例から明らかになるように、エストラジオール及びFSHとの低用量のCNPの組み合わせは、CNP誘導性減数分裂停止の延長に必須である。CNPは、少なくとも24時間COCでは効率的に減数分裂停止を維持するが、CNP単独では48時間の間減数分裂停止を維持するには不十分だった。したがって、CNP単独では、長期のin vitro培養期間が成熟の成功に必須である、小さな初期胞状卵胞のIVMを可能としない。しかしながら、低用量のCNPとエストラジオールとの組み合わせは、COCが長期間の減数分裂停止を維持することを可能としたものの、IVF後の卵母細胞の最終的な胚の質は十分ではなかった。さらに、CNP及びエストラジオールに加えて受精能獲得培地へのFSHの補充もまた、長期間に亘ってCOCを減数分裂停止状態に維持した。さらに、FSHの補充は、減数分裂再開を改善し、卵母細胞の直径を増加させて、IVF処置後の胚の質を改善した。

FSHは、脳下垂体前葉における性腺刺激ホルモン産生細胞によって合成され、分泌されるホルモンである。FSHは、人体の発生、成長、青春期の成熟、及び生殖のプロセスを調節する。FSH及び黄体形成ホルモン（LH）は、生殖において相乗的に作用する。卵巣では、FSHは、未熟な卵胞の生育を刺激して成熟させる。卵胞が成長するにつれ、卵巣はFSH産生を阻むインヒビンを放出する。FSHは、二量体糖タンパク質である。LH、FSH、TSH及びhCGのアルファサブユニットは、同一であり、92個のアミノ酸を含む。FSHは、その特定の生物学の作用を与える118個のアミノ酸のベータサブユニットを有し、FSH受容体との相互作用を担う。

臨床用途について、多様な製剤が利用可能である。多様な製剤は、卵胞の発生を刺激するための不妊症療法において一般的に使用される。FSHは、組み換えFSH（例えばGonalF、Puregon）としての純粋な形態と同じく、例えば、尿の精製された性腺刺激ホルモンであるPergonal、Menopur、また実施例について、Gonal-F、Gonal-f RFF、Gonal-fRFF Penの形態で、LH又はhCGと混合されて、利用可能である。また、FSHの類縁体は臨床上有用であり、例えば、1個、2個、3個以上のアミノ酸が未変性形態から変更される、全ての生物学的に活性な突然変異体の形態、PEG化FSH、単鎖二官能性突然変異体、FSH-CTP等を含む。また、Elonva等のFSH-CTP（FSHベータサブユニットがhCGに由来するC末端ペプチド（CTP）部分によって連結される、コリフォリトロピンアルファ）を含む長時間作用型FSH療法が開発されている。

インスリンは、身体の炭水化物及び脂肪の代謝を調節するのに重要なホルモンである。標的細胞において、インスリンは、チロシンキナーゼ活性による膜レセプターの活性化を通じてシグナル伝達を開始する。このシグナル伝達は、グルコース取り込み及び貯蔵の増加をもたらす。また、卵母細胞では、インスリンシグナル伝達カスケードは活性である。インスリンは、顆粒膜細胞の分化及び機能の促進においてFSHと相乗的に作用する。臨床用途に対して、組み換えインスリンもまた利用可能である。インスリンは、人工血清代替物（SSR）の一部として病院で使用される。SSRは、種々の培地において胚培養に広く使用される培地の構成成分である。

卵母細胞分泌因子は、卵母細胞によって分泌されるパラクリン因子であり、正常な顆粒膜細胞及び卵胞膜細胞の機能に必要である。本明細書で使用される「卵母細胞分泌因子」の用語は、増殖、分化、グルコース代謝及びコレステロール生合成等の顆粒膜細胞における重要な機能を調節するため顆粒膜細胞に作用する、卵母細胞によって分泌される因子を意味すると理解される。卵母細胞分泌因子は、GDF-9、BMP-15、FGF-8、又はそれらの任意の等価物からなる群から選択される。GDF-9は、トランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバーである。GDF-9の卵母細胞発現は、原始濾胞期に始まり、排卵を通して持続する。本明細書で使用される「GDF-9」は、GDF-9タンパク質、その個々のサブユニット、その個々のサブユニットの多量体、GDF-9の機能性のフラグメント又は部分、並びにGDF-9の機能性等価物及び／又は類縁体を指す。本明細書に定義されるように、「GDF-9」の機能性等価物又はフラグメントは、得られるGDF-9生成物がGDF-9に類似する活性を有するような改変GDF-9タンパク質を含んだ。

BMP-15は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（TGF-β）スーパーファミリーのメンバーである。BMP-15は、プレプロペプチドとして合成され、開裂された後、二量体タンパク質へと加工される。BMP-15はホモ二量体を形成してもよく、またGDF-9とヘテロ二量体を形成してもよい。本明細書で使用される「BMP-15」は、BMP-15タンパク質、その個々のサブユニット、その個々のサブユニットの多量体、BMP-15の機能性フラグメント又は部分、並びにBMP-15の機能性等価物及び／又は類縁体を指す。本明細書に定義される「BMP-15」の機能的な等価物又はフラグメントは、得られるBMP-15生成物がBMP-15に類似する活性を有するような改変BMP-15タンパク質を含んだ。

FGF-8は繊維芽細胞増殖因子（FGF）ファミリーのメンバーである。成人の卵巣では、FGF-8は卵母細胞で発現され、FGF受容体の発現は顆粒膜細胞で報告された。卵母細胞成熟の間、FGF-8は、他の卵母細胞分泌因子と共に卵丘細胞の解糖を促進する。本明細書で使用される「FGF-8」は、FGF-8タンパク質、その個々のサブユニット、その個々のサブユニットの多量体、FGF-8の機能性フラグメント又は部分、並びにFGF-8の機能性等価物及び／又は類縁体を指す。本明細書に定義される「FGF-8」の機能性の等価物又はフラグメントは、得られるFGF-8生成物がFGF-8に類似する活性を有するような改変FGF-8タンパク質を含んだ。

別の実施形態では、受精能獲得培地は、GDF-9、BMP-15、FGF-8又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された1つの母細胞分泌因子又はそれらの組み合わせと組み合わせてCNPと、エストラジオールと、FSHとを含む。増殖因子及びホルモンのこの組み合わせは、以下に記載される実施例において証明されるように、発生能、及び小胞状卵胞に由来する卵母細胞の最終的な胚の質を著しく改善する。特に、受精能獲得培地へのGDF-9の添加は、凝縮期へと再形成している卵母細胞クロマチン配置、卵母細胞の直径、及び胚の質を促進した。

本明細書において上に記載されるように、本発明の別の態様は、未熟な哺乳動物COCの体外成熟のための受精能獲得培地の使用である。上記使用は、最短2時間及び最長96時間の間、哺乳動物COCと受精能獲得培地とを接触させることを含む。特に、例えば、凝縮期又はいわゆる核小体を取り囲む（SN）配置への卵母細胞のクロマチンの再編成によって証明される、発生の進行期に達するのに十分な時間、COCを受精能獲得培地と接触させる。更に特定の実施形態では、哺乳動物COCを、卵胞のサイズによって決定される期間に亘り受精能獲得培地と接触させる。

CNPと、エストラジオールと、FSHとを含む受精能獲得培地の使用は、未熟な哺乳動物COCにおける減数分裂停止を誘導する。本発明に対して典型的であり、以下の実施例により証明されるように、CNPと、エストラジオールと、FSHとを含む受精能獲得培地の使用は、最長96時間の卵母細胞の延長された「受精能獲得」培養を可能とする。その結果、この減数分裂停止の期間の延長は、小卵胞に由来する卵母細胞が生存し、成長し、更により高い生殖能力を得る目的で発生の進行期に達することを可能とする。これまでのところ、卵母細胞が減数分裂停止状態で生存し得る培養の条件及び時間が短すぎて、全核及び発生能を獲得することができなかったため、これらの小卵胞の体外成熟が課題となっていた。実施例で更に示されるように、CNPなしで、最も小さなサイズの卵胞に由来する卵母細胞が、自発的に減数分裂を再開した。対照的に、1 nM、10 nM、25 nM又は50 nMのCNPで処理された場合、ほぼ100%の卵母細胞が減数分裂停止を維持することができた。

本発明の受精能獲得培地は、卵母細胞の長期培養を可能とするのみならず、CNPの存在は、特に減数分裂停止状態でのCOCの維持における現在のPDE3阻害剤の使用と比較した場合に、卵母細胞の発生能力に対する顕著な改善を伴って卵丘細胞−卵母細胞接続を均等に維持する。

本明細書に記載される受精能獲得培地の使用の後、卵母細胞は進行した（advance）発生段階に到達することができる。卵母細胞のクロマチン配置は、ヘキストによる染色、及び蛍光顕微鏡下での分析によりGV卵母細胞において評価される。クロマチン配置は、核小体のまわりのクロマチン凝集のパターンに従って、核小体を取り囲まない（NSN）段階、核小体を取り囲む（SN）段階、又は移行（NSN/SN）段階として分類される。また、卵母細胞の直径を、ヘキストで染色する前に記録する。さらに、受精能獲得期間の後、減数分裂能を誘導し、倒立顕微鏡下で核成熟期を判断することにより分析することができる。卵母細胞の核成熟を、GV（卵核胞）期、GVBD（卵核胞崩壊）期及びMII（中期）、又はPB（極体）として採点する。卵母細胞が成長するにつれ、卵母細胞は減数分裂を再開する（減数分裂再開とも呼ばれるプロセス）能力を獲得する。その段階では、卵母細胞は卵核胞膜の崩壊を経て、染色体が互いに分離する。

本発明では、例えば、凝縮期又はSN配置への卵母細胞のクロマチンの再編成によって証明される、発生の進行期に達するのに十分な時間、COCを受精能獲得培地と接触させる。さらに、哺乳動物COCを、卵胞のサイズによって決定される期間、受精能獲得培地と接触させる。卵胞サイズは、例えば、超音波画像診断等によってCOC回収の時に決定される。直径1 mm〜5 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも48時間留まることが好ましい。直径5 mm超〜10 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも24時間留まることが好ましく、直径10 mm超の卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも2時間留まることが好ましい。

別の実施形態では、受精能獲得培地の使用は、生殖補助医療、特に体外受精及びICSIの一部である。

また、本発明は、未熟な哺乳動物COCの体外成熟方法を提供する。上記方法では、未熟なCOCを収集培地に収集し、最短30分間〜最長2時間に亘って収集培地と接触させる。また、上記方法では、収集培地と接触させた後、哺乳動物COCを、減数分裂停止を維持し、卵丘細胞−卵母細胞相互作用を促進するため、上に記載される受精能獲得培地と接触させる。最後に、卵母細胞の減数分裂成熟を可能とするため、哺乳動物COCを成熟培地と更に接触させる。

特定の実施形態では、本発明による方法では、最短30分間〜最長2時間に亘り、未熟なCOCを収集培地と接触させる。

上記収集培地は、一般に減数分裂停止剤（meiotic arresters）と呼ばれる、天然起源のホスホジエステラーゼを阻害する天然若しくは人工の薬理学的化合物、又は卵母細胞の減数分裂再開の天然阻害剤を含む。上記天然阻害剤は、CNP、ヒポキサンチン又はそれらの類縁体からなる群から選択されてもよい。この収集培地の使用は、発情又は月経の周期のいずれかの時の卵巣刺激を強制的に必要とせずに、非常に小さい胞状卵胞からのCOCの回収を可能とする。収集培地中のかかる減数分裂停止剤の存在は、収集したCOCからのcAMPの減少を遮断する、特に、そうする能力があるもの、すなわち核成熟しているものにおける減数分裂再開を予防する、また卵母細胞と卵丘細胞との間の相互連結に「正しい」条件を保持する目的を有する。上記収集培地は、穿刺されたCOCが穿刺針から移される培地として、COC収集中に使用される。新たに剥離したCOCは、最短30分間〜最長2時間に亘ってこの収集培地中に留まることが好ましい。この収集培地の主な目的は、卵胞液及び他の汚染細胞から分けられている間に、最適な機能的状態にCOCを保持することである。COCは、「受精能獲得培地」に移される、別個の存在として単離される。

本発明によるin vitro方法の別の実施形態では、哺乳動物COCを、上に記載される受精能獲得培地と接触させる。上記方法では、哺乳動物COCを、最短2時間〜最長96時間に亘って、CNPと、エストラジオールと、FSHとを含む受精能獲得培地と接触させる。特に、体外成熟方法では、例えば、凝縮期又はいわゆる核小体を取り囲む（SN）配置への卵母細胞のクロマチンの再編成によって証明される、発生の進行期に到達するのに十分な時間、COCを受精能獲得培地と接触させる。さらには、体外成熟方法では、減数分裂の再開を、倒立顕微鏡下での核成熟期を判断することにより分析する。卵母細胞の核成熟は、GV（卵核胞）期、GVBD（卵核胞崩壊）期、及びMII（中期）期又はPB（極体）期として採点される。更に特定の実施形態では、哺乳動物COCを、卵胞のサイズによって決定される期間に亘って受精能獲得培地と接触させる。既に本明細書に記載されるように、卵胞サイズは、例えば超音波画像診断等によってCOC回収の時に決定される。直径1 mm〜5 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも48時間留まることが好ましい。直径5 mm超〜10 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも24時間留まることが好ましく、直径10 mm超の卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも2時間留まることが好ましい。

特定の実施形態では、非接着性又は接着性の培養プレートにおいて、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。以下の実施例から明らかになるように、低用量のCNPとエストラジオール及びFSHとの組み合わせは、CNP媒介減数分裂停止を延長するのに必須である。CNPは、少なくとも24時間に亘ってCOCにおいて効率的に減数分裂停止を維持するが、CNP単独では48時間に亘る減数分裂停止を維持するのに不十分であった。しかしながら、IVF後のこれらの卵母細胞の最終的な胚の質は十分に高くなかったものの、低用量のCNPとエストラジオールとの組み合わせは、COCが長期に亘って減数分裂停止を維持することを可能とした。CNP及びエストラジオールに加えて、受精能獲得培地へのFSHの補充もまた、長期に亘って減数分裂停止状態にCOCを維持し、卵母細胞の直径を増加させ、IVF処置の後の胚の質も改善した。

本発明によるin vitro方法の別の実施形態では、GDF-9、BMP-15、FGF-8又はそれらの任意の組み合わせ等の卵母細胞分泌因子を、CNPと、エストラジオールと、FSHとを含む受精能獲得培地に添加する。FSHと同様、これらの卵母細胞分泌因子は、小胞状卵胞の卵母細胞の発生能及びそれらの最終的な胚の質を改善する。

既に本明細書に言及されるように、本発明のin vitro方法では、COCを成熟培地と更に接触させる。その段階において、また本発明による受精能獲得培地を使用する場合、受精能獲得卵丘細胞に囲まれたGV期の卵母細胞は、増殖因子の選択により補充される任意の基本組成を有する成熟培地中で成熟され得る。これらの増殖因子は、限定されないが、アンフィレギュリン又はエピレギュリン等のEGF様因子、FSH、LH、cAMP調節因子、又はそれら組み合わせからなる群から選択される。したがって、更なる実施形態では、本発明の体外成熟方法は、COCを本明細書に記載される受精能獲得培地と接触させることと、COCを成熟培地と接触させることとを含み、成熟培地が、本明細書に記載される増殖因子の選択により補充された任意の基本組成からなることを特徴とする。

また、未熟な哺乳動物COCの体外成熟に対するキットを提供することも本発明の目的である。上記キットは、本明細書に記載される受精膿獲得培地を備え、0.1 nM〜50 nMのCNPと、エストラジオールと、FSHとを含む。特定の実施形態では、本発明によるキットは、1 nM〜1000 nMのエストラジオールを含む受精能獲得培地を備える。別の実施形態では、キットは0.1mIU/ml〜10 mIU/mlのFSHを備える。更に別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量の組み換えFSH、FSH類縁体、又はFSHの模倣分子を含む。更に別の実施形態では、本発明によるキットにおいて、受精能獲得培地は0.1 ng/ml〜10 ng/mlのインスリンを含む。別の態様では、受精能獲得培地は、等効用量のインスリン類縁体、又はインスリン模倣分子を含む。別の実施形態では、本発明によるキットにおいて、受精能獲得培地は、0.1 nM〜50 nMのCNP、好ましくは10 nM〜25 nMのCNP、更に好ましくは25 nMのCNPと、1 nM〜1000 nMのエストラジオール、好ましくは10 nMのエストラジオールと、0.1 mIU/ml〜10 mIU/mlのFSH、好ましくは2.5 mIU/ml又は1 mIU/mlのFSHと、0.1ng/ml〜10 ng/mlのインスリンとを含む。

更なる実施形態では、本発明によるキットにおいて、受精能獲得培地は、卵母細胞分泌因子を含む。本明細書で使用される卵母細胞分泌因子は、GDF-9、BMP-15、FGF-8又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、本明細書で使用される卵母細胞分泌因子は、組み換えタンパク質又はヘテロ二量体タンパク質である。別の実施形態では、未熟な哺乳動物COCの体外成熟に対するキットは、（a）天然起源ホスホジエステラーゼを阻害する天然若しくは人工の化合物、又は卵母細胞減数分裂の天然阻害剤を含む収集培地と、（b）上に記載される受精能獲得培地と、（c）成熟培地と、（d）接着性、及び非接着性の培養プレートと、（e）キットの使用に対する指示書とを備える。上記キットは、該キットに含まれる、該方法を行うための指示書と共に、本明細書に記載される方法を実行するのに有用な場合がある。

本明細書において上に記載されるように、本発明の別の態様は、哺乳動物COCの体外成熟に対するキットの使用を開示する。特定の実施形態では、本明細書において上に記載される受精能獲得培地を備えるキットの使用を開示する。この使用は、最短2時間〜最長96時間に亘って哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させることを含む。さらに、受精能獲得培地を備えるキットの使用において、減数分裂停止を維持し、核及び細胞質の成熟を可能とするため、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。特に、例えば、取り囲まれる核小体（SN）へのクロマチンの再編成によって証明される、発生の進行期に到達するのに十分な時間、COCを受精能獲得培地と接触させる。更に特定の実施形態では、卵胞のサイズによって決定される期間に亘って、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。既に本明細書に記載されているように卵胞サイズは、例えば、超音波画像診断等によってCOC回収の時に決定される。直径1 mm〜5 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも48時間留まることが好ましい。直径5 mm超〜10 mmの卵胞は受精能獲得培地に少なくとも24時間留まることが好ましく、直径10 mm超の卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも2時間留まることが好ましい。

受精能獲得期間は、減数分裂の刺激が引き起こされた（例えば成熟培地との接触）後にのみ評価される、減数分裂を再開する能力を卵母細胞に獲得させることができるものである。卵母細胞核成熟の判断は倒立顕微鏡下で行われ、卵核胞崩壊（GVBD）、及び第一極体（PB）の更なる突出によって証明される。

別の実施形態では、（a）天然起源ホスホジエステラーゼを阻害する天然若しくは人工の化合物、又は卵母細胞減数分裂の天然阻害剤を含む収集培地と、（b）上に記載される受精能獲得培地と、（c）成熟培地と、（d）接着性、及び／又は非接着性の培養プレートと、（e）キットの使用に対する指示書とを備えるキットの使用が開示される。典型的には、未熟な哺乳動物COCの体外成熟に対するキットの使用は、最短30分間〜最長2時間に亘る、COCの収集培地との接触を含む。別の態様では、本発明によるキットの使用において、哺乳動物COCを、最短2時間〜最長96時間に亘って、受精能獲得培地と接触させる。さらに、収集培地と、受精能獲得培地と、成熟培地と、接着性及び／又は非接着性の培養プレートと、使用に対する指示書とを備えるキットの使用において、減数分裂停止を維持し、成熟を可能とするため、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。特に、例えば取り囲まれる核小体（SN）によって証明される、GVBD期に到達して減数分裂を再開し、それによって発生の進行期に到達するのに十分な時間、COCを受精能獲得培地と接触させる。さらに、卵胞のサイズによって決定される期間に亘って、哺乳動物COCを受精能獲得培地と接触させる。既に本明細書に記載されているように卵胞サイズは、例えば、超音波画像診断等によってCOC回収の時に決定される。直径1 mm〜5 mmの卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも48時間留まることが好ましい。直径5 mm超〜10 mmの卵胞は受精能獲得培地に少なくとも24時間留まることが好ましく、直径10 mm超の卵胞は、受精能獲得培地に少なくとも2時間留まることが好ましい。

受精能獲得期間は、減数分裂の刺激が引き起こされた（例えば成熟培地との接触）後にのみ評価される、減数分裂を再開する能力を卵母細胞に獲得させることができるものである。卵母細胞核成熟の評価は、倒立顕微鏡下で行われ、卵核胞崩壊（GVBD）、及び第一極体（PB）の更なる突出によって証明される。

本発明の異なる実施形態では、哺乳動物COCはヒトCOCである。

本発明の他の態様は当該技術分野においてよく知られている。例えば、対象から卵母細胞を得る方法、卵母細胞を操作するための手段及び設備、低温保存法、IVF法、in vitro胚培養、及び患者の生殖器系における胚の配置に対する方法は、当該技術分野（in theart）でよく知られており、当該技術分野で知られている任意のかかる好適な方法を、本発明の方法及び組成物と共に使用することができる。

本発明は、以下の非限定的な実施例により、更に解説され得る。

実施例1
材料及び方法
動物モデル
本研究に使用した動物は、CBAB6F1（C57Bl/6j×CBA/caのF1雑種）であった。これらの動物を、国内法令に従い、ブリュッセル自由大学（プロジェクト番号：09-216-1）の倫理委員会の同意により、収容して繁殖させた。

小胞状卵胞由来の未熟な卵丘細胞−卵母細胞複合体（COC）及び大胞状卵胞による排卵前のCOCの収集
未熟なCOCの収集のため、卵胞発生の第一波のコンパクトなCOCを、事前の性腺刺激ホルモン投与をせずに青春期前（pre-pubertal）のマウス（19日齢〜21日齢）の小胞状卵胞から集めた。排卵前のCOC（対照）の収集のため、2.5 IUのウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（ChorionicGonadotropin）（eCG、Folligon、オランダ国オスのIntervet）による48時間の初回刺激の後、青春期前の雌性マウス（25日齢〜27日齢）の大胞状卵胞を穿刺してコンパクトなCOCを集めた。収集培地は、10 %の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）と、100 IU/mlペニシリンと、100 μg/mlストレプトマイシン（いずれもベルギー国ヘントのLife Technologies製）とを含み、収集及び培養前の取り扱いの間に減数分裂再開を予防するため200 μMの3−イソブチル−1−メチルキサンチン（IBMX、ドイツ国シュネルドルフのSigma）を補充した、Leibovitz L-15からなった。

COCの培養
COC（前IVM相及びIVM相）の培養のための基本培養培地は、α-MEM、2.5 %FBS（いずれもベルギー国ヘントのLifeTechnologies製）及び5 ng/mLインスリン、5 ug/mLアポトランスフェリン、5 ng/mL亜セレン酸ナトリウム（いずれもドイツ国シュネルドルフのSigma製）で構成された。

前IVM実験のため、CNP-22をPhoenix Europe（ドイツ国カールスルーエ）から、17-β-エストラジオールをSigma（ドイツ国シュネルドルフ）から、増殖分化因子9（GDF9）をR&Dsystems Europe（英国オクソン）から得た。

IVMを含む実験のため、組み換え表皮増殖因子（r-EGF）（ドイツ国マンハイムのRoche）、及び組み換えマウスエピレギュリン（EREG）（英国オクソンのR&D systems Europe）を、排卵刺激として使用し、18時間培養を続けた。

言及される場合、組み換え卵胞刺激ホルモン（FSH）（スイス国ジュネーブのMerck-Serono）を前IVM及びIVMの培地に添加した。

減数分裂再開の評価
規定の時間点で、口で制御するファインボア（fine bore）ガラスピペットを使用してコンパクトな又は拡大した卵丘細胞から卵母細胞を機械的に取り除いた。減数分裂再開を、ホフマンモジュレーションコントラストシステム（日本国東京のNikon）を備えた倒立顕微鏡下で核成熟ステージを判断することにより分析した。核成熟を、GV（卵核胞期）、GVBD（GVが不可視のとき）、PB（囲卵腔で第1極体が観察される）又はDEG（卵母細胞が変性されたとき）として採点した。

卵母細胞のクロマチン配置の評価
卵母細胞のクロマチン配置を、前IVM培養の前後に卵核胞卵母細胞で評価した。簡潔には、減数分裂再開の判断の後、GV卵母細胞を5分間の10 μg/mL Hoechst33258（Sigma、ドイツ国シュネルドルフ）で染色した。核小体のクロマチン配置を蛍光顕微鏡（IX70、Olympus）の下で分析した。クロマチン配置を、核小体のまわりのクロマチン凝集のパターンにより核小体を取り囲まない（NSN）段階、核小体を取り囲む（SN）段階、又は移行（NSN/SN）段階として分類した［27-29］。これらの卵母細胞のうちのいくつかの直径を、ヘキストで染色する前に記録した。

体外受精の手順（IVF）
卵母細胞の発生能を評価する最終試験では、前IVM＋IVM培養期間の後、体外受精（IVF）に続いて胚盤胞期までの胚培養を行った。この実験について、100 ng/mLのEREGをトリガーとして減数分裂再開に使用した。

IVFのための培地は、M16培地、3 %ウシ血清アルブミン画分V（BSA）（いずれもドイツ国シュネルドルフのSigma製）、及び非必須アミノ酸（ベルギー国ヘントのLife Technologies）からなった。胚培養培地は、M16培地、並びに必須及び非必須アミノ酸（ベルギー国ヘントのLife Technologies）からなった。

卵丘細胞卵母細胞複合体を種々の条件から収集し、IVF培地中で1回洗浄した。CBAB6F1の雄から得られた受精能獲得精子（最終希釈2×10⁶精子/mL）を使用して、IVF培地中で体外受精を行った。37℃、5%CO2、5 %O2、及び湿度100 %で3.5時間の共インキュベーションの後、予定接合子（presumptive zygotes）を剥離して2回洗浄し、胚培養のため油で覆われた20 μLの胚培養培地（Irvine Scientific、ベルギー国シントデアイスウェストレムのAlere）において、5 %CO2、5%O2及び湿度100 %中37℃にて10〜15の接合子の群で培養した。卵割（2細胞）比率を、IVFの24時間後に採点した。5日目に胚盤胞発生及び孵化を記録した。

また、100 ng/mLのEREGと共に18時間のIVMを経る、20日齢のマウスの小胞状卵胞に由来する未熟なCOCの能力を評価した。

invivoで成長した卵母細胞（対照）を25日齢〜27日齢の雌から得て、2.5 IUのウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（eCG、Folligon^（商標））で48時間の後、2.5 IUのhCG（Chorulon^（商標））で14時間（いずれもオランダ国Intervet製）に亘り初回刺激を行った。これらの卵母細胞を同じ精子試料で受精させ、卵母細胞／胚をIVM卵母細胞と全く同じ条件下で培養した。

統計学的分析
別段の言及がなければ、結果を平均±SDとして示す。種々のin vitro条件間のIVF後の卵母細胞の減数分裂再開（1つの減数分裂期当たり）、クロマチン配置及び胚発生の比率の差を、分散分析に続くテューキー多重比較検定、p＜0.05によって判断した。2つの条件を比較する場合、減数分裂再開の比率を比較するため、独立t検定を使用した。統計学的分析を行う前にパーセンテージデータを変換した（逆正弦）。

結果
CNPは、効率的に減数分裂停止を維持し、EGFR依存性の減数分裂再開を遅延させる
性腺刺激ホルモン初回刺激マウス（26日齢〜27日齢）から回収された排卵前COCを、0 nM（対照）、1 nM、10 nM、100 nMのCNP-22の存在下で、4ng/mLのEGFと組み合わせて18時間に亘って培養に置いた。

CNP-22は、減数分裂停止の維持に対して用量依存効果を有した。100 nM及び10 nMの用量では、培養終了時のGV率は、1 nM及び対照の比率より有意に高かった（96 %、93 %、48 %及び0 %）（図1A）。

EGFの存在下で、PB比率に対するCNP-22の用量依存効果が観察された。10 nM及び100 nMのCNP-22の用量では、多くの卵母細胞がGVBD期のままであり、したがって、PB率は、対照及び1 nMのCNP-22（それぞれ98 %及び92 %）と比較して有意に低い（それぞれ35 %及び15 %）のままであった（図1B）。10nM及び100 nMのCNP処理で観察されたGVBD卵母細胞の比率がより高いため、減数分裂再開のより遅いプロセスの可能性を探るため追跡実験を行った。

性腺刺激ホルモン初回刺激マウスから回収された排卵前のCOCを、25 nMのCNP-22＋4 ng/mLのEGFの不在下（対照）、又は存在下で培養に置き、減数分裂成熟を2時間、4時間及び6時間に判断した。減数分裂再開は対照群では2時間〜6時間増加したのに対し、同じ期間内に、CNP-22＋EGFで処理した群では誘導されたGVBDはほとんどなかった（11 %以下）（図2A）。さらに、24時間に亘ってCNP-22+EGF培地に置かれたCOCは、CNP-22のみに対して同じ期間培養したCOCよりも有意に高い数値でPB卵母細胞（93 %）を高発生した（図2B）。

概して、これらのデータは、CNP-22が少なくとも24時間減数分裂停止を維持することができ、EGFRシグナル伝達が、より遅い速度ではあるが（対照に対して6時間の遅延）、CNPによって減数分裂停止状態に維持されるCOCにおいて減数分裂再開を誘導することができることを示唆する。

未熟なCOCの長期のCNP誘導性減数分裂停止は、培養環境中のエストラジオールの存在に依存する
上に記載される研究と同様に、未熟なCOC（高度に減数分裂上／発生上、無能力）を用いる追試を行った。かかるCOCを（材料及び方法に記載されるように）小胞状卵胞から回収し、48時間培養に置いた。結果は、CNP-22が48時間ではなく24時間に亘る減数分裂停止を維持することができることを示したことから（データは示されていない）、CNP-22への反応性がE2、FSH及びGDF9による培地補充によって支持される研究を計画した。

未熟なCOCを、19日齢〜20日齢の雌性マウスの小胞状卵胞から回収し、25 nMのCNP-22の存在下、及び10nMの17-β-エストラジオールの存在下又は不在下で48時間培養に置き、さらに、2.5 mIU/mL又は5 mIU/mLのFSH、及び／又は、50ng/mLのGDF9の更なる添加の効果を評価した。

25nM CNP（単独）の存在下で培養されたCOCの卵母細胞は、減数分裂停止を優勢に維持することができず、結果的に、48時間の培養の後、GV率はCOCの総数の26 %を占めるにすぎなかった。対照的に、25 nMのCNP-22及び10 nMの17-β-エストラジオール（E2）の存在下で培養されたCOCの卵母細胞の大半は、効率的にFSH又はGDF9の補充にかかわらず、GV期で維持された（89 %以上、図3）。

卵母細胞クロマチン凝縮、卵母細胞直径及びEGFR排卵シグナル伝達に対するCOC反応性の状態に対するFSH及びGDF9の補充の効果
未熟なCOCを雌性マウス（19日齢〜20日齢）の小胞状卵胞から回収し、25 nM CNP-22及び10 nM 17-β-エストラジオールの存在下、2.5 mIU/mL FSH、又は2.5 mIU/mL FSH+50 ng/mLGDF9を添加して、48時間の培養に置いた（前IVM条件）。これらの前処理に続いて、EGFを含む培地による18時間の排卵刺激を行った（IVM条件）。

前IVM処理の前後の卵母細胞のクロマチン凝縮の分析は、48時間の培養の間に卵母細胞のクロマチンが優勢な核小体を取り囲まない（NSN）分散配置から核小体を取り囲む（SN）凝縮配置へとシフトしたことを明らかにした。実際、前IVMの前に、卵母細胞の34 %は移行性のNSN/SN配置（66%のNSN）を有していたのに対し、前IVMの後、卵母細胞の68%以上は、各条件においてSNパターンを示した（図4A）。2.5 mIU/mL FSH+50 ng/mL GDF9の存在下で培養した卵母細胞において、有意ではないがより大きな絶対量のSNパターン（86 %）が観察された。

さらに、FSHを含む培地（GDF9を含まない）中での前IVM培養の後に得られた卵母細胞は、FSHを含まない培地で培養された卵母細胞よりも有意に大きな平均径に達した。結果的に、卵胞（前IVMの前の）から単離した直後、卵母細胞は、71.9±2.1 μmの直径を示し、48時間の培養後の卵母細胞の直径は次の通りであった：CNP+E2、CNP+E2+FSH、及びCNP+E2+FSH+GDF9に対して、それぞれ72.1±1.7 μm、73.5±1.7 μm、及び73.3±1.4 μm（図4B）。

前IVMの後、減数分裂再開のためEGFによりいくつかのCOCを刺激し、それらのPB率を18時間後に評価した。IVM培地中のCNPの存在による減数分裂再開の遅延により（先の実験を参照されたい：CNPは効率的に減数分裂停止を維持し、EGFR依存性減数分裂再開を遅延させる）、実践的な理由のため、現在の実験では、CNPをIVM培地から除いた。3つの培養条件に由来する卵母細胞は、減数分裂再開の高い比率を示し、PB率は、CNP+E2、CNP+E2+FSH、及びCNP+E2+FSH+GDF9に対して、それぞれ79 %、78 %、及び82 %のPB率であった。

CNP、FSH及びGDF9の存在下での前IVMは、卵母細胞及び胚の質を改善する
前IVMに続いてIVM培養期間を経る、卵母細胞の発生能を調べた。卵母細胞を体外受精させ、胚を5日目まで培養した。

この実験のため、IVM相の間、減数分裂のトリガーとしてEREGを使用し、CNP及びGDF9を前IVM培地に添加するのみで、IVM培地からは除いた。

前IVM及びIVM培養期間の後、全ての処理に由来する卵丘細胞は、EREGに応答して、豊富な膨張及び粘液分泌期を示した。

2細胞（受精）率は、種々の処理で差はなかった（CNP+E2、CNP+E2+FSH、及びCNP+E2+FSH+GDF9に対して、それぞれ60 %、54 %及び56 %）。CNP+E2条件との比較では、5日目の胚盤胞／2細胞の比率は、FSH又はFSH+GDF9を含む培地で培養された卵母細胞でより高く、後者については有意であった（図5）。

参照として、1）IVM（前IVM培養なし）を経る未熟なCOCの能力、及び2）eCGに続いてhCGによる卵巣過剰刺激後のin vivoで成長した卵母細胞の能力を図5Cに表す。

実施例2
上述の実験は、本発明による受精能獲得培地の使用が、減数分裂停止状態に卵母細胞を維持するだけでなく、IVMを経るかかるCOCの能力に影響せずにそのようにすることを示す。しかしながら、受精能獲得培養中の卵母細胞発生能が大きく改善されたことから、ホスホジエステラーゼ（PDE、減数分裂再開中の卵母細胞内のcAMPの分解を担う酵素）に対する効果によってCNPの作用を有することから、CNPの作用は排他的に考慮することができない。したがって、「低」用量のCNP（特に1 nM〜50 nMのCNPの濃度範囲において）では、卵母細胞及び卵丘細胞の間の良好な伝達の維持により、卵母細胞の発生能の改善において更なる効果（追加的効果）を有すると仮定した。

cAMP調節因子の存在下では（具体的には、PDE3阻害剤を使用する成熟前の培養において）、COCを培養する場合、長期培養中の卵丘細胞−コロナと卵母細胞との間の分離の問題は、PDE阻害剤法の制限として明確に報告されている（Nogueira et al.,2003、Nogueira et al., 2006、Vanhoutteet al., 2009a）。

CNPを含む受精能獲得培地が実際に卵丘細胞−卵母細胞連結を持続させることを実証するため、CBAB6F1マウス（上記）の初期胞状卵胞に由来する卵丘細胞−卵母細胞複合体（COC）をCOCの培養用の基本培養培地に置き、CNP、及び比較物として、2つのよく知られているホスホジエステラーゼ阻害剤であるPDE3-I（Org9935及びシロスタミド）に暴露した。

材料及び方法
動物モデル
本研究に使用した動物は、CBAB6F1（C57Bl/6j×CBA/caのF1雑種）であった。これらの動物を、国内法令に従い、ブリュッセル自由大学（プロジェクト番号：14-216-1）の倫理委員会の同意により、収容して繁殖させた。

COCの培養
COC（前IVM相及びIVM相）の培養のための基本培養培地は、α-MEM、2.5 %FBS（いずれもベルギー国ヘントのLifeTechnologies製）及び5 ng/mLインスリン、5 ug/mLアポトランスフェリン、5 ng/mL亜セレン酸ナトリウム（いずれもドイツ国シュネルドルフのSigma製）で構成された。受精能獲得培地は、10 nM E2 17-β-エストラジオールと組み合わせて25 nM CNP、又は1 μMOrg9935若しくは1 μMシロスタミドのいずれかを補充した基本培地からなった。CNPをPhoenix Europe（ドイツ国カールスルーエ）から得て、シロスタミドをEnzo Life Sciences（ベルギー国アントウェルペン）から得た。実験の目標がCNPとPDE3阻害剤との間に明確な潜在的な能力の差を作ることであったため、FSHの干渉の可能性を回避することは決定的であり、したがって、後者を受精能獲得培地から除いた。FSHの存在下で試験した場合、後者は、それ自体をPDE3阻害剤の存在下でより一層明白である上記接続に寄与させ、卵母細胞及び卵丘細胞の周囲層の間の接続に対するCNPの効果をマスキングした（データは示されていない）。

染色及び画像分析
透明帯を貫通する突起（TZP、卵母細胞と接続する顆粒膜細胞からの膜性の膨張）は、テキサスレッド−ファロイジン又はActin green（商標）でFアクチンを蛍光標識することにより証明され、透明帯（矢印）を通り抜けるフィラメントとして見えた。

結果
3つの化合物が卵母細胞の減数分裂停止を維持することができたのに対し、予想外にも、CNPが、卵母細胞と卵丘細胞の周囲層との間の双方向性の伝達に必須の透明帯を貫通する突起を保持することができる因子であることが明らかになった（図6及び図7）。図7では、平均ピクセル強度を、透明帯を通り抜ける陽性アクチン染色（TZP）を定量する手段として使用した。画像分析は、ImageJを用いて行われ、卵母細胞と卵丘細胞との間に輪郭が描かれた目的の領域（Region of Interest：ROI）、すなわち透明帯が位置する領域の平均ピクセル強度の計算で構成された。画像分析の後、透明帯を貫通する突起（TZP）によって、CNPに暴露されたCOCが卵母細胞及び卵丘細胞の間の連結性をより良好に保持したことが観察された。図7（A）では、Org9935をPDE3に対する阻害剤として使用し、アクチンフィラメントをテキサスレッド結合ファロイジンで証明し、一方、図7（B）では、シロスタミドをPDE3に対する阻害剤として使用し、アクチンフィラメントをActin green（商標）で証明した。CNP群及びPDE3i群を、パネルAに対するP値0.0082及びパネルBに対するP値＜0.0001により、マンホイットニー検定を使用して、統計学的に比較した。

実施例3
先の結果が、CNPがCOCにおける卵母細胞と卵丘細胞との間の連結性を増強することを実証することから、以下の結果は、初期胞状卵胞から培養されたかかるCOCの発生能にCNPが影響を及ぼすかどうかを判断することを目標とした。この研究では、初期胞状卵胞に由来するマウスの卵丘細胞に囲まれた卵母細胞の発生能に対する、受精能獲得培養中に存在するCNP及びPDE3Iの差動効果を評価した。実験の目標がCNPとPDE3阻害剤との間に明確な潜在的な能力の差をつくることであったため、FSHの干渉可能性を回避することは決定的であり、したがって、この実験においても後者は受精能獲得培地から除いた。

設定：
未熟な卵丘細胞−卵母細胞複合体を、初期胞状卵胞（刺激されていない19日齢〜20日齢のマウスに由来）から単離した。実施例2と同様、CNP又はシロスタミド（PDE3阻害剤）のいずれかの存在下で48時間の間、COCを基本培養培地に置いた。

2つの参照対照を含んだ：
1）受精能獲得培養を行わない対照条件をIVMの前に行うもの、
2）標準的なin-vivo対照、すなわち26日齢〜27日齢のマウスに由来する完全に成長した成熟卵母細胞。これらのCOCは、23日齢〜24日齢のマウスに対する48時間のPMSGに続くhCGの投与によって得られた（IVFプロトコル）。

受精能獲得培養に続いて、COCを表皮増殖因子（EGF）の存在下で成熟させ、体外受精させた。受精後の胚発生を評価した。

各条件の下での卵母細胞能力の獲得を、それらの成熟能、受精能（2細胞率）、及び良質な胚盤胞（胚培養の5日目までに）の産生能によって評価した。

統計学的分析
CNP群とシロスタミド群との間の受精及び胚盤胞形成の比率の差を、カイ2乗によって評価した。

結果
両方の処理の受精率に対して差が観察されなかったのに対し（図8（A）を参照されたい）、1つの受精卵当たりの形成された胚盤胞の量は、CNPの存在下での受精能獲得培養の後で有意に高かった（図8（B）を参照されたい）。

実施例2及び実施例3の結論
PDE阻害剤とCNPを比較するこれらの2つの補足的研究における卵母細胞及び胚の質に対して観察された予期しない差は、CNPに起因する可能性がある。これらの結果は、CNPが3型ホスホジエステラーゼの調節により媒介したものを越えて延長する作用を有することを示唆する。PDE3の作用の阻害の他に、CNPは、卵母細胞と卵丘細胞との間の物理的な連結性を増加させ、卵母細胞の最終的な発生（細胞質の成熟）を完了するのに必須の因子の獲得を増強する。

実施例4
実施例1では、CNP-22が減数分裂停止の維持に対して用量依存性の効果を有したことが実証された。以下の研究では、より広いCNP範囲を含む更なる実験を行った。

設定：
この更なる実施例で使用される材料及び方法は、適宜、実施例1で使用される材料及び方法と共通する。24日齢〜26日齢のマウスに由来する卵丘細胞−卵母細胞複合体を、ウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（eCG、Folligon、オランダ国オスのIntervet）刺激の48時間後に、in vivoで成長させた胞状卵胞から単離した。22日齢〜24日齢の時、マウスに2.5IUのeCGを注射した。少なくとも2つの卵丘細胞の層を有する無傷のCOCを、以下の用量のCNPの存在下で18時間に亘り培養に置いた：
−対照（CNPなし）^*
−0.1nM^**
−1nM
−10nM
−50nM^**
−100nM
−1μM^**
*CNPが培養培地中に存在しない、対照条件。
^**0.1 nM、50nM及び1 μMの試験した新たな用量（特許請求の範囲に含まれる）。

実施例1において提供されたマウスにおける先の用量実験に従って、COCを収集し、培養した。

統計学的分析
卵母細胞の減数分裂再開（1つの減数分裂期当たり）の比率の差を、分散分析に続いてテューキーの多重比較検定、p＜0.01によって評価した。統計学的分析を行う前にパーセンテージデータを変換した（逆正弦）。

結果：
概して、本補足実験は、CNP-22が減数分裂停止の維持に対して用量依存性効果を有していることを確認した。卵母細胞の減数分裂停止を、倒立顕微鏡下で無傷の卵核胞（GV）の存在によって確認した。

図9Aは、1 nM、10 nM、50 nM及び100 nMによる用量が80 %以上の比率（それぞれ、80 %、98 %、94 %及び87 %）で卵母細胞の減数分裂停止を維持することを示す。しかしながら、CNPのない対照条件と比較して、10 nM及び50 nMの用量だけが有意に高かった（それぞれ、98 %、94 %対50 %、p＜0.01）。

卵核胞崩壊（GVBD）期での卵母細胞の割合では、有意差は記録されなかった（図9B）。

1nM、10 nM、50 nM及び100 nMのCNP用量で第一極体（PB率、図9C）を突出する卵母細胞の低い割合又は欠如（CNPのない対照条件と比較して有意差のある最後の3つ、p＜0.001）は、これらの用量において、CNPが卵母細胞の減数分裂停止の維持により強力な効果を示すという知見と一致した。

予想外にも、0.1 nMの非常に低い用量のみならず、1 μMの非常に高用量もGV期で停止された卵母細胞の維持において最適下限であることが実証された。

結論：
概して、これらのデータは、1 nMから100 nMに及ぶ用量間隔で80%超の比率で排卵前の卵母細胞においてCNP-22が減数分裂停止を維持することができることを示唆し、全ての卵母細胞をGV期における停止状態に維持するために使用されるCNPの望ましい用量は、10 nM〜50 nM、より好ましくは10nM〜25 nMの用量となるという特許請求の範囲と一致する。そのため、この挙動は、用量を増加させることが卵母細胞を連続的に停止させたままにしたPDE3阻害剤の使用とは異なる。

実施例5
上述のCNPの効果は、CNP-22にそれ自身制限されないことを裏付けるため、、これらの効果がCNP類縁体によって再現され得るかどうかを試験する追加実験を行った。CNP類縁体であるCNP-53の効果を試験する追加実験を行った。CNP-22と同様、CNP-53は、53個のアミノ酸配列を含むC型ナトリウム利尿ペプチドの主な内因性形態のうちの1つである。

設定：
この更なる実施例で使用される材料及び方法は、代わりにCNP-53を使用することを除いて、適宜、実施例4で使用される材料及び方法と共通する。24日齢〜25日齢のマウスに由来する卵丘細胞−卵母細胞複合体を、eCG刺激の48時間後に、in vivoで成長させた胞状卵胞から単離した。22日齢〜23日齢の時、マウスに2.5IUのeCGを注射した。無傷のCOCを、以下の用量のCNP-53の存在下で18時間に亘り培養に置いた：
−対照（CNPなし）^*
−0.1nM
−1nM
−10nM
−50nM
−100nM
−1μM
−対照 25 nM CNP-22^*
*2つの対照条件を含んだ：1）25 nMのCNP-22（既知であり、減数分裂停止を維持するために先の実験で使用した標準用量）、2）CNPが培養培地中に存在しない対照条件。

統計学的分析
卵母細胞の減数分裂再開（1つの減数分裂期当たり）の比率の差を、分散分析に続いてテューキーの多重比較検定、p＜0.001によって評価した。統計学的分析を行う前にパーセンテージデータを変換した（逆正弦）。

結果：
CNP-22を使用する補足実験で見出された結果に類似して、CNP-53は、卵母細胞の減数分裂停止の維持に対して予想外の（最大の）用量依存性効果を有することを実証した。

図10Aは、1 nM、10 nM、50 nM及び100 nMのCNP-53用量が、CNPを含まない対照条件と比較して有意に高い比率で減数分裂が停止した状態に卵母細胞を維持し（それぞれ66 %、98 %、72 %及び69 %対18 %、p＜0.001）、CNP-22対照に匹敵する（75 %、p＜0.01）ことを示した。

卵核胞崩壊（GVBD）期での卵母細胞の割合では、有意差は記録されなかった（図10B）。

1nM、10 nM、50 nM及び100 nMの用量で第一極体（PB期）を突出する卵母細胞の割合は、CNPのない対照条件と比較して有意差があり（p＜0.001）、これらの特定の用量では、卵母細胞減数分裂停止の維持においてCNP-53がより強力な効果を示すという知見と一致した（図10C）。

予想外にも、0.1 nMの非常に低い用量のみならず、1 μMの非常に高用量もGV期で停止された卵母細胞の維持において最適下限であることが実証された。

結論：
全体として、これらのデータは、CNP-22に匹敵し、CNP-53は高い比率で排卵前の卵母細胞において減数分裂停止を維持することができることを示す。さらに、CNP-53が効率的な用量は、CNP-22のものに類似し、すなわち1 nM、10 nM、50 nM及び100 nMであり、全ての排卵前の卵母細胞において減数分裂停止を維持するのに最適な10nM〜50 nMの用量範囲を含む、1 nM〜100nMのCNPの範囲において異なる発現をしている。

実施例6
前臨床試験の結果によれば、本発明の受精能獲得培地は、小卵胞に由来する卵母細胞の成熟に確かに予期しない効果を有する。この研究では、本出願の受精能獲得培地を使用するIVM方法が、卵母細胞の発生可能性に対する効果を有するかどうか、それらが受精可能な卵母細胞をもたらすかどうかについて、また、それらの胚盤胞形成可能性が増加するかどうかについて判断した。

患者集団：
研究（N=15）に含まれるIVM治療を受ける患者は、研究胚の作製のため、卵母細胞の一部を寄贈することを承諾し、次の特徴を有した：年齢37歳未満、ロッテルダム基準（RotterdamESHRE/ASRM-Sponsored PCOS consensus workshop Group, 2004）による多嚢胞性卵巣症候群（PCO又はPCOS）の病歴。

卵母細胞回収に先立つ最後の超音波スキャンにおいて患者が30以上の卵胞を有した場合、これらの一部（通常5個〜10個）を新たなIVM法に割り付け、残りを患者の治療の一環として日常的な臨床のIVMプロトコルに割り付けた。

全ての患者は、600 IUのHP-hMG（FerringPharmaceuticals SA製の高度に精製されたヒト下垂体性性腺刺激ホルモン）の累積投与量からなる個別化された刺激プロトコルを受けた。

患者が超音波スキャンで10 mm〜12 mmの範囲の平均径を有する少なくとも1つの代表的な卵胞を示すとすぐに、最後のHP-hMG注射の42時間後に卵子吸引（OPU）を計画した。

この原理証明研究では、15の同胞の症例を募った：
実験的治療=COC受精能獲得（本発明による受精能獲得培地を使用する）+IVM
日常的な臨床群=従来のIVM（Origio^（商標）IVM方法論、VUB適応）

未熟な卵母細胞の回収、受精能獲得培養、IVM及びICSI
70mmHgの吸引圧で17ゲージ単一内腔針を用いて2 mm〜10 mmの卵胞から卵丘細胞−卵母細胞複合体（COC）を回収し、25 IU/mlのヘパリン（Heparin Leo、ベルギー国のLeo Pharma）を補充した50 μMのIBMX（Sigma）を含む「収集培地」へと収集した。

収集の際の卵胞吸引物を収集培地中に即座に希釈した（1本のチューブ当たり3 mlの収集培地で予め満たす）。収集チューブの内容物を汚染している血球から濾過し（Falconセルストレーナー、70 mmメッシュサイズ）、COCを培養皿から収集し、最大1時間に亘り収集培地中に保持した。その後、COCを洗浄し、各ウェルが25 nM CNPを含む「新たな受精能獲得培養培地」（すなわち、本発明による受精能獲得培地）500 μlを含有する、4ウェルIVFディッシュ（Nunc、デンマーク国のThermo Fisher Scientific）中、1ウェル当たり最大10個のCOCの群で、37℃、空気中6 %のCO2で培養した。

22時間〜26時間の受精能獲得培養の後、COCを十分に洗浄し、100 ng/mlのヒト組み換えアンフィレギュリン（rhAREG）及び100 mIU/mlの組み換えFSH（Gonal-F）を含むIVF培地に移し、同じインキュベーター条件で30時間インキュベートして、in vitro減数分裂成熟を生じさせた。

IVM培養の30時間後、実体顕微鏡下で卵母細胞をそれらの卵丘細胞層から機械的、また酵素的にヒアルロニダーゼ（Cook Medical）を使用して取り除き、卵母細胞の成熟を倒立顕微鏡下で判断した。

研究群に含まれる成熟した卵母細胞（PB突出）に共通のドナーに由来する精子をマイクロインジェクションし、胚発生をICSI後5日目（最終的には6日目）まで評価した。

受精及び胚の発生を、標準的な評価時点で記録した。良好な形態を有し、移行可能とされる3日目の胚［（割球（少なくとも5細胞）の数、断片化の比率（最大20 %）、割球の多重核形成の証拠なし、及び／又は初期の胚細胞緊密化（compaction）に基づく］を「良質な胚」（GQE）と分類した。

結果：
図11及び図12は、欧州ICSIデータ（正常に刺激されたサイクルに由来する）及び、UZBrussel（2014-2015）において日常的に適応されるIVMに対して、「新たな受精能獲得培養+IVM」の結果と、同胞の卵母細胞に対する「日常的なIVM」とを比較している。

第1のデータセット（通常のICSI（Megaset））は、HP-hMGで過剰排卵され、大きな卵胞からそれらの卵母細胞を収集した374名の患者における、公開された従来の日常的なICSIの結果である（Megaset^（商標）Study：（出所：Devroeyet al. Fertil Steril 2012 Mar;97（3）:561-71）。

第2のデータセット（正：dataset）（従来のIVM（Origio））は、Origio^（商標） IVM培地を使用して、従来のIVM治療を受けた413名の患者からのUZBrusselデータである。

最終及び第3のデータセット（COC受精能獲得＋IVM）は、Origio^（商標） IVM培地を用いて処理したそれらの同胞卵母細胞と比較した、「新たな受精能獲得培養+IVM」（本特許出願の方法）による結果である。

受精能獲得培養法（すなわち本発明による受精能獲得培地）の適用は、ヒトIVMに先立って、未熟なCOCの培養に関して重要な利益、すなわち、より高い核成熟率、並びにより高い良質な3日目の胚及び胚盤胞の収率を示した。

図11中の矢印（1）は、卵母細胞の成熟率が従来のIVMと比較して高度に改善されることを示す。図11中の矢印（2）は、受精率が通常のICSIサイクル又は従来のIVMと等しいことを示す。図11中の矢印（3）は、従来のIVMよりも、初期のCOCの数当たりの3日目の良質な胚（GQE D3）の収率がほぼ2倍高く、大きな卵胞ICSIサイクルに由来する成熟卵母細胞から得られた良質な胚の比率に匹敵することを示す。

図12中の矢印（4）は、受精卵（2PN）数当たり又はMII卵母細胞当たりのいずれかでの、培養5日目又は6日目の良質な胚盤胞の収率を指している。「受精能獲得培養」による結果は、従来のIVMによる結果よりわずかに高い。しかしながら、3日目の発生学が有望な場合のみ（3日目において4以上優れた胚）、従来のIVM胚盤胞が更に成長するという事実は、それらの結果に確かに影響する。したがって、同じアプローチがCNPに適用される場合（斑点の白色棒グラフ）、結果は、他の群のどれよりもはるかに優れている。

図12中、矢印（5）は、CNP群において、初期のCOC数当たりの、培養5日目又は6日目の良質な胚盤胞の収率を指し、従来のIVMより高く（その群における正の選択バイアスにもかかわらず）、通常のICSIサイクルに更に匹敵する。ここでも、3日目における4以上のGQEの指針がCNP群に当てはまり、全ての群で最も良好な結果を生じた。

結論
IVM治療の一部としての「新たな受精能獲得培養」培養工程の適用は、in-vivoで成長させた（刺激後の大きな卵胞から得られる）卵母細胞に類似する程度までの小卵胞に由来する卵母細胞の成熟を増強する。このより高い成熟の効果は、初期胚発生の間持続され、従来のIVMと比較して、2倍の量の良質な胚をもたらす。初期胚発生中のかかる持続効果の達成は期待を超えており、現在用いられているIVM法と比較すると、柔軟なIVM法を作り出すものである。

図1
Meiotic resumptionafter 18 hours 18時間後の減数分裂再開
Ctrl 対照

図2
Start of meioticresumption (GVBD) 減数分裂再開の開始（GVBD）
Ctrl 対照
2h 2時間
4h 4時間
6h 6時間
Meiotic completion(PB) 減数分裂の完了（PB）
24h 24時間
(No EGF) （EGFなし）

図3
Meiotic resumption 減数分裂再開

図4
Chromatin configuration クロマチン配置
Isolation 単離
0h 0時間
Oocyte diameter 卵母細胞の直径
Isolation (0h) 単離（0時間）
48h culture 48時間培養

図5
2-cell rate 2細胞率
D5 Blast/2-cell 5日目の胚盤胞／2細胞
IVF referencecontrols IVF参照対照
In vivo control invivo対照
2-cell 2細胞

図7
mean TZP (TR-Phalloidin) 平均TZP（TR-ファロイジン）
Average pixelintensity 平均ピクセル強度
Parameter パラメーター
Mann Whitney test マンホイットニー検定
P value P値
Value 値
n=Number of COCsanalyzed N＝分析したCOCの数

図8
Fertilized/COCs 受精／COC
Cilost シロスタミド
Blastocyst/Fertilized 胚盤胞／受精
Cilostam シロスタミド

図9
GV rate GV率
no CNP CNPなし
GVBD rate GVBD率
PB rate PB率

図10
GV rate GV率
no CNP CNPなし
GVBD rate GVBD率
PB rate PB率

図11
Maturation rate andNumber of Good Quality Embryos (GQE) on D3 3日目の成熟率及び良質な胚（QGE）の数
Sibling 同胞
Maturation rate 成熟率
Fertilization rate 受精率
Day 3 3日目
Regular ICSI 通常のICSI
374 Patients 374名の患者
Conventional IVM 従来のIVM
COC capacitation COC受精能獲得

図12
Blastocystformation on D5-6 5日目〜6日目の胚盤胞形成
Sibling 同胞
GQ Blast 良質胚盤胞
Regular ICSI 通常のICSI
374 Patients 374名の患者
Conventional IVM 従来のIVM
COC capacitation COC受精能獲得
GQE on D3 3日目のGQE

Claims (18)

1. 0.1nM〜50 nMのC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）と、エストラジオールと、卵胞刺激ホルモン（FSH）とを含む、未熟な哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟に対する受精能獲得培地。
2. 0.1ng/ml〜10 ng/mlのインスリンを更に含む、請求項1に記載の受精能獲得培地。
3. 卵母細胞分泌因子、又は、GDF-9、BMP-15、FGF-8、それらの類縁体、若しくはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される卵母細胞分泌因子を含む、請求項1又は2に記載の受精能獲得培地。
4. 未熟な哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟方法であって、未熟な卵丘細胞卵母細胞複合体を収集培地中に収集することと、哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体と、請求項1〜3のいずれか一項に記載の受精能獲得培地とを接触させることと、哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体と成熟培地とを更に接触させることとを含む、方法。
5. 前記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を、最短2時間〜最長96時間に亘って受精能獲得培地と接触させる、請求項4に記載の方法。
6. 非接着性若しくは接着性の培養プレート、又は非接着性培養プレートにおいて、前記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を、前記受精能獲得培地と接触させる、請求項4又は5に記載の方法。
7. 体外受精又はICSIを含む生殖補助医療の一部である、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
8. 請求項1〜3のいずれか一項に記載の受精能獲得培地を備える、未熟な哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟に対するキット。
9. 未熟な哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟に対するキットであって、
   （a）天然起源のホスホジエステラーゼを阻害する天然若しくは人工の化合物、又は卵母細胞減数分裂の天然阻害剤を含む収集培地と、
   （b）請求項1〜3のいずれか一項に記載の受精能獲得培地と、
   （c）成熟培地と、
   （d）非接着性又は接着性の培養プレートと、
   （e）前記キットの使用に関する指示書と、
   を備える、キット。
10. 哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟に対する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用、又は請求項8若しくは9に記載のキットの使用。
11. 前記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を、最短2時間〜最長96時間に亘って前記受精能獲得培地と接触させる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用、又は請求項8若しくは9に記載のキットの使用。
12. 前記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体を、非接着性若しくは接着性の培養プレート、又は非接着性培養プレートにおいて、前記受精能獲得培地と接触させる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用、又は請求項8若しくは9に記載のキットの使用。
13. 前記哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の卵母細胞を減数分裂停止状態に維持するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用、又は請求項8若しくは9に記載のキットの使用。
14. 哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の成熟を誘導するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用、又は請求項8若しくは9に記載のキットの使用。
15. 体外受精又はICSIを含む生殖補助医療の一部としての、請求項1〜3のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用、又は請求項8若しくは9に記載のキットの使用。
16. 癌治療の場合又は卵母細胞バンキングの場合又は卵母細胞バンキングの場合であって年齢バンカー（35歳〜40歳）に対しての妊孕性温存法における、請求項1〜3のいずれか一項に記載の受精能獲得培地の使用、又は請求項8若しくは9に記載のキットの使用。
17. 前記妊孕性温存法が小胞状卵胞の凍結保存を含む、請求項16に記載の使用。
18. 前記受精能獲得培地が、前記凍結保存された小胞状卵胞の体外成熟に使用される、請求項17に記載の使用。