JP2018501493A - マラリアの検出 - Google Patents

Abstract

血液サンプル中のマラリアの指標であるヘモゾインの存在を、磁気分離し、溶解し、分光分析することにより検出する。【選択図】図２

Description

本発明は、サンプルにおける磁気的特性をもつターゲット材の検出、特に、全血または組織における、マラリア感染の徴候であるヘモゾインの検出に用いる装置および方法に関する。

マラリアの監視や疾病管理を効果的に行うには、マラリアを正確かつ早期に診断することが不可欠である。一方、簡単かつ低コストでマラリアを正確に診断する方法はなく、これまでは、「原因がはっきり特定されない発熱はマラリアを疑え」式の一般的な予防措置が講じられてきた。これでは、過剰にマラリアの想定診断が増え、マラリアとは無関係の発熱に対する誤った処置、限られた資源の損耗につながり、薬剤耐性の一因となる。

マラリア感染は、厚層および薄層血液塗抹標本の検鏡により正確に検出・定量化できるが、この手法は、技師の修練やスキルに大きく依存する。また、特に非都市部の環境では必ずしも入手可能ではない設備や作業条件を必要とする。抗原−抗体反応に基づく迅速診断検査（ＲＤＴ：Ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔ）では上記手法ほどのスキルや設備は必要ではないが、一般的に高額な検査であり、また、軽度のマラリアを検出するには感度が十分ではない。他にも検出システムは提案されているが、いずれも異なる現地条件での広範な実用化に好適とは言えない。例えば、特許文献１には、サンプル中の懸濁状態の磁性ナノ粒子の表面にβ−ヘマチンを吸着させ、同サンプルへの磁界強化を介してラマン分光法で得る信号の増大を図ることが記載されている。一方、特許文献２には、様々な強度の磁界を印加した血液中のβ−ヘマチンのｐ偏光とｓ偏光に、特異な吸収信号を用いることが記載されている。

このように、マラリア感染の検出方法や装置は、依然として改善の必要がある。

米国特許出願公開第２０１２／０２５７１９９号明細書 国際公開第２００８／０５６１７１号明細書

本発明の１つの局面によれば、請求項１に定義するように、サンプル中の磁気的特性（磁性）をもつ一形態のターゲット材を検出する方法が提供される。その他の局面は、上記請求項以外の従属請求項に定義されている。従属請求項には、好ましい実施形態または択一的実施形態が定義されている。

上記磁気的特性（磁性）をもつ一形態のターゲット材は、有機磁性材料であってもよく、例えば、ヘモゾインまたはβ−ヘマチンである。

ヘモゾインは、吸血性寄生体による血液の消化により産生される副産物である。こうしたマラリア寄生虫等の吸血性の微生物は、ヘモグロビンを消化し、ヘモグロビンの非タンパク性成分であるフリーヘムを大量に放出する。ヘムは、ポルフィリン複素環式環の中心に含まれる鉄原子から成る補欠分子族である。フリーヘムは細胞に毒性があるため、寄生体はこれをヘモゾインと呼ぶ不溶性の結晶形態に変換する。寄生サイクルの所定の段階では、血液中のヘモゾイン濃度と寄生虫血症の程度の間に相関関係があるため、血液サンプル中のヘモゾインを正確かつ感度よく定量化することで、軽度のマラリアや感染の初期段階を検出することが可能になる。

β−ヘマチンは、ヘモゾインと類似する合成物質である。β−ヘマチンは、分光特性や磁気的特性等、ヘモゾインと同様の特性をもつため、ヘモゾインの作用をシミュレートするために用いられる場合がある。

本方法は、サンプル中のヘモゾインまたはβ−ヘマチンの濃度として、例えば、≦０．１２μｇ／ｍＬ、好ましくは≦０．１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは≦０．０８μｇ／ｍＬ、より一層好ましくは≦０．０６μｇ／ｍＬ、または、≦０．０５μｇ／ｍＬ、および／または、上述の濃度のいずれかと２μｇ／ｍＬまたは２．５μｇ／ｍＬの間の範囲にある濃度を検出または定量化するために用いられる、および／または、上記濃度を検出可能または定量化可能である。０．１２μｇ／ｍＬのヘモゾイン濃度を検出すると、１μＬ当たり２００寄生虫数の寄生虫血症が検出可能になり（世界保健機関（ＷＨＯ）推奨）、一方、０．０５μｇ／ｍＬのヘモゾイン濃度を検出すると、１μＬ当たり８０寄生虫数の寄生虫血症が検出可能になる。上述の感度、特に濃度が低い場合の感度により、マラリアの早期発見が可能になり、患者に対する治療の大きな一助となる。

上記分析に供するサンプルの量は、例えば、≦１ｍＬ、好ましくは≦７５０μＬ、より好ましくは≦５００μＬ、より一層好ましくは≦３００μＬである。このように、被験者から採取する必要のある血液サンプルがごく少量で済む。特にマイクロフローシステムでは、分析用サンプルの量は、例えば、１０μＬ〜５０μＬである。分析用サンプルは、例えば、静脈穿刺または指穿刺により採取される。分析には、穿刺で採取した血液の量で十分である。

サンプル分析の期間（例えば、サンプル注入から最終データの受信まで）は、例えば、１０分未満、好ましくは８分未満、より好ましくは６分未満または５分未満である。これにより、検鏡と比較して、かなり迅速に結果を得ることができる。

サンプルは、水溶液、または、有機溶媒溶液、および／または、懸濁液を含んでもよい。また、サンプルは、生物学的マトリックス、または、生物学的マトリックス由来の水溶液、または、有機溶媒溶液、および／または、懸濁液を含んでもよい。上記生物学的マトリックスは、流体、細胞、組織、抽出物、溶解物、原核生物または真核生物の培養細胞、上清および／または溶解物、透析サンプル、微小透析サンプルを含んでもよい。上記サンプルは、ヒトおよび動物の体液または組織、例えば、全血、溶解全血、血清、血漿、尿、精子、赤血球および／または白血球の懸濁液または溶解物、解離および／または溶解組織、生検サンプル、毛、爪等を含んでもよい。

マラリアの生長期に赤血球のシゾントが高濃度であると、細胞の自然溶解が起こり、ヘモゾインがシゾントと同時に血液中に遊離し、新たな赤血球に感染する。分離または精製赤血球ではなく全血（または溶解全血）を含むサンプルを用いる場合の有利な点は、（ｉ）赤血球中に残存するヘモゾインと、（ｉｉ）既に赤血球から放出されたヘモゾインと、（ｉｉｉ）大食細胞と単核細胞と白血球に概して高濃度に取り込まれるヘモゾインを含む全ヘモゾインの分析が可能になることである。

サンプルは溶解全血を含むことが好ましい。中性ｐＨまたは若干酸性の溶解液を優先して用いる。これにより、全血サンプル中のヘモゾインまたはβ−ヘマチンの溶解が回避される。例えば、全血サンプルを、トリス緩衝溶液（ｐＨ７）とトリトンＸ−１００とサポニンで溶解させてもよい。溶解液は、「シンプルかつ安価な、抗マラリア薬剤の蛍光利用高スループットスクリーニング技術（Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」（Ｍ．Ｓｍｉｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２００４，ｖｏｌ．４８，ｐ１８０３）に記載されている方法に従って調製可能である。他の使用可能な溶解液は、例えば、様々なｐＨ、好ましくは、酸性または中性の低張のバッファである。核酸物質の放出による粘度を低下させるために、サンプルに、ＲＮａｓｅの添加（１０〜１００μｇ／ｍＬ）とともに、ＤＮａｓｅを添加（通常、１０〜１００μｇ／ｍＬ）することができる。溶解させる全サンプルに、ヌクレアーゼ阻害剤、および／または、プロテアーゼ阻害剤を加えることができる。溶解方法としては、機械的分裂、例えば、ガラスビーズ、冷凍・解凍、乳鉢と乳棒の使用、液体均質化等がある。いずれの手法を採用する場合も、音波処理を用いてもよく、または、用いなくてもよい。サンプルは、好ましくは、溶解液を用いて溶解させた全血、すなわち、機械的な溶解ではなく化学的に溶解させた全血を含む。これにより、サンプル調製の簡素化が図れる。

サンプルからターゲット材を磁気分離する前に、サンプルを精製してもよい。この場合の精製には、例えば、濾過、遠心分離、析出、直接位相法、逆相法、イオン、親水性、親和性による方法、ゲル浸透クロマトグラフィーやサイズ排除クロマトグラフィーがあり、すべて、液−液抽出と固相抽出のいずれかと組合せることが可能である。但し、上記のような精製は不要、または、実施しないことが好ましい。

分析対象のサンプルは、水、有機溶液、水溶液、例えば約０．３％、０．６％、または０．９％以上の濃度をもつ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液を含む担体流体に導入してもよい。担体流体は、水、特に精製水であることが好ましい。これにより、簡素化が図れる。

磁気分離に続いて、分析に供するために、ターゲット材を採取用流体によって採取する。採取用流体は、分析可能な溶液を得るために、分離したターゲット材が溶解した成分を含むことが好ましい。溶解したターゲット材は非磁化状態、すなわち、磁気的特性を喪失した溶解物であることが好ましい。採取用流体は、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、有機四級水酸化アンモニウム、アンモニア、有機アミン等のアルカリ化剤を含有する水溶液を含んでもよい。好ましい採取用流体は、水酸化ナトリウム溶液である。採取用流体の濃度は、例えば、０．１Ｍ以上、および／または、１Ｍ以下であり、一例として、０．４Ｍ濃度のＮａＯＨ溶液を用いてもよい。上述のような溶液は簡単に入手可能であり、ラボ使用時には標準的な注意事項が求められるだけである。また、塩類析出は、装置、例えば切換えバルブ等の装置の小断面部位等の閉塞を引き起こす可能性があるが、上述の溶液濃度であれば、その発生リスクが回避される。

担体流体および／または採取用流体は、以下に例示する１つまたは複数の添加物を含んでもよい。

酸化防止剤：例えば、トコフェロール、トコトリエノール、アスコルビン酸またはエリソルビン酸または塩類、ブチル化ヒドロキシトルエンおよびブチル化ヒドロキシアニソールを含む合成酸化防止剤、または、精油のフラバノン、フラボノール、モノフェノール（チモール、カルバクロール、オイゲノール等）を含む天然のフェノール系成分、コーヒー酸、フェルラ酸、ブドウや赤ワインのフラボノイドおよびプロシアニジン、ロズマリン酸、ジテルペン酸、オリーブ油のヒドロキシチロソール、リグニン分解生成物およびリグナン、装置内部の腐食、特に使用時の金属ミクロスフィアの低減に適したリダクトン等を含む、酸化防止剤。また、酸化防止効果を引き出すために、クエン酸、リン酸、フマル酸、または金属キレート剤を加えることも可能である。

界面活性剤：例えば、結合または非結合の非イオン性界面活性剤（セトマクロゴール１０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドＤＥＡ、コカミドＭＥＡ、ＩｇｅｐａｌＣＡ６３０、Ｉｓｏｃｅｔｅｔｈ−２０、ラウリルグルコシド、モノラウリン、狭範エトキシレート、Ｎｏｎｉｄｅｔｐ−４０、Ｎｏｎｏｘｙｎｏｌ−９、ノンオキシノール、ｎｐ−４０、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ｎ−オクチルベータ−ｄ−チオグルコピラノシド、オクチルグルコシド、オレイルアルコール、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポロキサマー、ポロキサマー４０７、ポリグリセロールポリリシノール酸、ポリソルベート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、サポニン、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ステアリルアルコール、トリトンＸ−１００）、陽イオン界面活性剤（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ブロニドックス、臭化セトリモニウム、塩化セトリモニウム、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、塩化ラウリルメチルグルセス−１０ヒドロキシプロピルジモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム）、および／または、陰イオン界面活性剤（ラウリル硫酸アンモニウム、ジオクチルナトリウムスルホサクシネート、ＭＢＡＳアッセイ、ペルフルオロブタンスルホン酸、ペルフルオロノナン酸、ペルフルオロオクタンスルホン酸、ペルフルオロオクタン酸、ラウリル硫酸カリウム、サポニン、石鹸、石鹸代替物、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、ミレス硫酸ナトリウム、パレス硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム）、特に、装置内部の洗浄の容易化と、時間の経過とともに寄生分析信号につながり得る汚染の低減に適した界面活性剤等を含む、界面活性剤。

共色素：例えば、フラボノイド、アントシアニン、アントシアノサイド、および／または、桂皮誘導体、特に、分子会合によりヘモゾインの検出能強化につながる化学物質等を含む、共色素。

抗菌剤：例えば、アジ化合物、ヒドロキシル、エーテル、エステルを含む安息香酸誘導体、および／または、塩類、ソルビン酸、酢酸、硫化物、亜硫酸塩を含む硫黄誘導体、亜硝酸塩、硝酸塩を含む窒素誘導体、スルファミド、抗生物質、チアベンダゾール、特に、溶液中の微生物の生長を好適に阻止可能な抗菌剤等を含む、抗菌剤。

増粘剤、濃化剤、またはゲル化剤：例えば、アカシアゴムおよび誘導体、アセチル化モノグリセリド、モノグリセリドおよびジグリセリドのアセチル化酒石酸エステル、寒天、アルギン、アルギン酸、アルギン酸アンモニウム、カラギーナンアンモニウム、ファーセレランアンモニウム、リン酸化グリセリドのアンモニウム塩、アラビノガラクタン、パン酵母グリカン、アルギン酸カルシウム、カラギーナンカルシウム、カルボキシメチルセルロース、カロブビーンガム、カラギーナン、セルロースガム、ゼラチン、ゲランガム、グアーガム、アラビアゴム、ヒドロキシル化レシチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アイルランド苔ゲロース、カラヤガム、乳酸化モノグリセリドおよびジグリセリド、脂肪酸のラクチリックエステル、レシチン、ローカストビーンガム、メチルセルロース、メチルエチルセルロース、オート麦ガム、ペクチン、脂肪酸のポリグリセロールエステル、エステル交換ひまし油脂肪酸のポリグリセロールエステル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレイン酸（ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリステアレート（ポリソルベート６５）、ポリオキシエチレン（８）ステアレート、アルギン酸カリウム、カラギーナンカリウム、アルギン酸プロピレングリコール、メチルセルロースのプロピレングリコールエーテル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、アルギン酸ナトリウム、リン酸アルミニウムナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カラギーナンナトリウム、グリコール酸セルロースナトリウム、ステアロイル−２−乳酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、酒石酸塩ナトリウム、トリポリ燐酸ナトリウム、ソルビタンモノステアレート、トリオレイン酸ソルビタン、ソルビタントリステアレート、クエン酸ステアリルモノグリセリド、脂肪酸のスクロースエステル、トラガカントガム、キサンタンガム、特に、溶液の粘度増強につながる化学物質等を含む、増粘剤、濃化剤、またはゲル化剤。

サンプルのターゲット材を磁気分離する処理では、磁気分離カラム、特に、磁性粒子または磁化可能粒子、例えば、鋼または鉄含有ミクロスフィアを含む磁気分離カラムで分離を行う。ミクロスフィア（microsphere）は、その粒径が、例えば、≧０．３ｍｍ、または、≧０．１ｍｍ、および／または、≦１ｍｍ、または、≦２ｍｍである。粒子をカラム内に保持するために微細な保持用グリッドやフィルタを設けると、特にサンプルが懸濁液を含む場合、閉塞を起こすリスクが伴う。しかし、上述の粒径であれば、こうした部材を設ける必要がなくなる。

磁気カラムは、例えば、分解・再組み立てが容易であり、磁化可能粒子の交換が容易になる。例えば、腐食および／または堆積物の集積および／または汚染物質の発生に備えて、装置の効率および／または精度を維持するために磁化可能粒子は定期的に交換してもよい。磁化可能粒子の取り換え前に行う分析の回数は、例えば、≧１０回、≧１５回、または、≦１０００回である。

磁気カラムは、その内径が、例えば、≧０．５ｍｍ、または、≧１ｍｍ、および／または、≦１５ｍｍ、または、≦１０ｍｍである。カラムの長さ寸法は、例えば、≧５ｍｍ、または、≧１ｃｍ、および／または、≦１２ｃｍ、または、≦１０ｃｍである。カラムは非磁性材料で構成することが好ましく、例えば、ポリプロピレン等のプラスチック材料が挙げられる。

例えば、１つまたは複数の永久磁石によって、磁気分離カラムに外部磁界を印加してもよい。分離カラムの磁界の大きさは、例えば、≧０．２Ｔ、または、≧１Ｔ、または、≦８Ｔ、または、≦１０Ｔである。

上記システムは、マイクロフローシステムとして構成してもよい。この場合、磁気カラムの寸法、ミクロスフィア、磁界、検査対象のサンプルは、マイクロフローシステムに適応させる。上記の場合は特に、磁性粒子は、例えば、ナノ粒子またはナノ球体である。磁性粒子は、上述したように、ミクロスフィアであってもよいが、小粒径のミクロスフィアであることが好ましい。この場合、ミクロスフィアの粒径は、例えば、≧５０μｍ、または、≧１００μｍ、および／または、≦５００μｍ、≦４００μｍ、または、≦３００μｍである。磁気カラムは、例えば、一体化フローセルの一部としてのマイクロビーズ貯留器の形状である。一体化フローセルには、光学ウィンドウと流体接続（fluid connection）したマイクロビーズ貯留器を設けてもよい。

一体化フローセルは、例えば、標準的な顕微鏡スライドと同等の寸法のものである。考えられる寸法として、例えば、長さは≧３０ｍｍ、≧４５ｍｍ、≧６０ｍｍ、または、≧７０ｍｍ、および／または、≦１５０ｍｍ、≦１２０ｍｍ、または、≦９０ｍｍ、および／または、幅は≧１５ｍｍ、または、≧２０ｍｍ、および／または、≦６０ｍｍ、≦４５ｍｍ、または、≦３０ｍｍ、および／または、厚みは≧１ｍｍ、≧２ｍｍ、または、≧４ｍｍ、および／または、≦１５ｍｍ、≦１２ｍｍ、≦１０ｍｍ、または、≦８ｍｍ、である。一体化フローセルの各部材間の接続コンジットまたは経路の直径は、例えば、≧２０μｍ、または、≧５０μｍ、および／または、≦２００μｍ、または、≦１５０μｍである。一体化フローセルは、例えば、略平坦形状であり、少なくとも約１０個のサンプル、および／または、約５０個以下のサンプルの分析に適した、単回使用または多回使用構成の装置が提供される。フローセルは、例えば、ＰＭＭＡ（ポリ（メチルメタクリレート））またはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のポリマーから成る。一体化フローセルは、ベース等としての第１の部と、カバー等としての第２の部を備える。第１の部には、例えば、一面が開放されたフロー回路が、表面への切削、彫版、または、成形加工により設けられる。第２の部は、例えば、上記ベースを被覆するための相補部材であり、第１の部に設けた回路の開放面を封止する。第２の部を第１の部上に位置決め・封止してフローセルを組立てる前に、フロー回路のマイクロビーズ貯留器に、例えば、鋼粒子またはナノ粒子等の磁化可能粒子を充填する。フローセルは、磁化可能微粒子を交換するために、カバーの取外し等により分解し、その後再度組立て可能である。

溶解したターゲット材の検出のために行う分析可能な溶液の分光分析には光学分析が含まれてもよく、例えば、吸収分光法が含まれる。放射源からの放射光は、例えば、分析可能な溶液を通過し、減衰信号を発生させ、該信号はセンサーによって受信される。放射源とセンサーは、ターゲット材の存在と、好ましくはその量を検出可能とする各波長を網羅するように選択される。

好ましくは、分光分析には疑似単色光を用いる。すなわち、帯域幅が狭小な光、例えば、そのエネルギーの少なくとも８０％が８０ｎｍ、５０ｎｍ、２０ｎｍ、または、１０ｎｍの帯域幅にある光を用いることが好ましい。疑似単色光源とセンサーは、その一方を用いてもよく、または、両方を用いてもよい。好ましい一実施形態では、約３８０ｎｍ、約４０５ｎｍ、または、約６２０ｎｍの波長で発光する疑似単色ダイオードを用いる。代わりに、単色光を用いてもよい。ヘモゾインの吸収スペクトルでは、いくつかのピークを認める（図１）。ヘモゾインは、３３０ｎｍ〜４１０ｎｍの範囲の波長で強力に放射光を吸収し、６００ｎｍ〜６４０ｎｍの範囲の波長では吸収の度合いが下がる。第１の帯域は感度に、第２の帯域は特異性に関係している。この結果、対応する疑似単色光源を用いることで、簡素な構成でありながら、良好な感度または選択性が得られる堅牢な設備や装置を用いることができる。例えば、発光ダイオードは低出力ダイオードであり、分析可能流体の流れに隣接配置してもよい。これにより、光ファイバーによる送信が不必要となる。溶解全血サンプルを用いて、ヘモゾインを約３８０ｎｍ、約４０５ｎｍ、または、約６２０ｎｍで検出すると、特に有利である。この組合せにより、例えば、ヘモゾインが感度良く検出される、および／または、ヘモゾインを示唆する信号に干渉する、または、これをマスキングするサンプルからの不要な寄生信号が回避される。光検出子は、例えば、選択波長での検出が可能な光センサーである。この結果、ターゲット材を検出するための分光分析の１つまたは複数の波長は、例えば、≧３００ｎｍ、≧３２０ｎｍ、≧３４０ｎｍ、≧３５０ｎｍ、または、≧３６０ｎｍ、および／または、≦４４０ｎｍ、≦４３０ｎｍ、≦４２０ｎｍ、または、≦４１０ｎｍの波長を含む。または、上記１つまたは複数の波長は、例えば、≧５８０ｎｍ、≧５９０ｎｍ、または、≧６００ｎｍ、および／または、≦６５０ｎｍ、≦６４０ｎｍ、または、≦６３０ｎｍの波長を含む。

上述した波長を中心とした単色光エミッターと疑似単色光エミッターのいずれを用いてもよい。

分析可能な溶液の分光分析で用いる放射経路は、≧３ｍｍ、≧２０ｍｍ、≧３０ｍｍ、または、≧４０ｍｍから選択することが好ましく、これにより、検出感度が向上する。放射光は、例えば、分析可能な溶液の流路に「Ｚ」部を形成し、該「Ｚ」の長寸部を通過させることで、該流路の一部に沿って通過する。

本方法は、例えば、以下の各フェーズを含む。
− 例えば、サンプルに磁気分離器を通過させることで、ターゲット材をサンプルから磁気分離し、上記磁気分離器内のターゲット材の磁性形態を保持する第１の分離フェーズ、および／または、
− 例えば、溶液中の溶解と溶離を経てターゲット材を磁気分離器から除去し、分析可能な溶液を調製する第２の分析フェーズ、および／または、
− 磁気分離器を、以降の利用への準備として、洗浄する第３の洗浄フェーズ。

好ましくは、ターゲット材を溶液中に含む分析可能な溶液に、分光分析を実施する。

分析対象のサンプルは、特に入口を介した注入、例えば、噴射弁または隔壁（septum）を介した注入により、担体流体の流路に導入可能である。これにより、操作の中断や分解作業を行うことなく、サンプルが装置へ容易に導入される。

本発明の一実施形態を、添付図面を参照して、以下に一例として説明する。

ヘモゾインのＵＶ可視吸収スペクトルを示す図である。 分析装置の一実施形態を示す概略図である。 プログラム「ＰｃＬａｂ２０００」を介してβ−ヘマチンを含有する溶解全血のサンプルから得たクロマトグラムである。 プログラム「ＰｃＬａｂ２０００」を介してマラリア感染した溶解全血のサンプルから得たクロマトグラムである。 一体化フローセルとしての微小流体システムの概略平面図である。

図２の分析装置は以下を備える。

［符号１および２］
ＫＲ Ａｎａｌｙｔｉｃａ社の二重シリンジポンプの第１のシリンジ１と第２のシリンジ２であって、第１のシリンジには担体流体として用いる水を充填し、第２のシリンジには、採取、溶解、溶離用流体として用いる０．４Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を充填する。上記シリンジポンプは、シリンジの各々から０．５ｍＬ／分の一定流速を実現するよう設定する。

［符号３］
シリンジ１と切換えバルブの間の接続チューブ。

［符号４］
シリンジ２と上記切換えバルブの間の接続チューブ。

［符号５］
サンプルを注入するための挿入用隔壁。

［符号６］
Ｒｈｅｏｄｙｎｅ ＴｉｔａｎＭＸの切換えバルブ。

［符号７］
切換えバルブから廃棄部までの接続チューブ。

［符号８］
上記切換えバルブとカラムの間の接続チューブ。

［符号９］
粒径約０．５ｍｍの鋼製ミクロスフィアを約４ｇ収容する、長さ寸法が約６０ｍｍ、内径が約４ｍｍのポリプロピレンカラムを含む磁気分離カラム。

［符号１０］
約０．６５Ｔの大きさの磁界を発生させる永久磁石（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のＭｉｄｉＭＡＣＳ磁石）。

［符号１１］
カラムとフローセルの間の接続チューブ。

［符号１２］
光源として用いる疑似単色光発光ダイオード（４０５ｎｍ）。

［符号１３］
フローセル（２１０ｎｍ超の波長用紫外−可視波長域シリカウィンドウを備えるＯｃｅａｎＯｐｔｉｃｓ社の「ＳＭＡ Ｚセル」）。

［符号１４］
フローセルから廃棄部までの接続チューブ。

［符号１５］
光検出子。

［符号１６］
信号増幅器および電圧計。

β−ヘマチンの合成は、「鉄−カルボキシレート結合によるマラリア色素のヘムユニット同士の結合（Ａｎ ｉｒｏｎ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｂｏｎｄ ｌｉｎｋｓ ｔｈｅ ｈｅｍｅ ｕｎｉｔｓ ｏｆ ｍａｌａｒｉａ ｐｉｇｍｅｎｔ）」（ＡＦＧ Ｓｌａｔｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．３２５−３２９）に記載の応用方法に従い行った。０．５９２ｇのブタヘミンを０．４Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液で溶解してヘマチンの４５．４ｍＭ保存溶液を調製し、該溶液の２０ｍＬを得た。保存溶液の１０ｍＬを９０ｍＬの水で希釈し、ヘマチンの４．５４ｍＭ溶液を１００ｍＬ得た。その後、２％プロピオン酸を添加し、ｐＨ４の反応媒質を得た。上記混合物は、濾過前に、密閉容器内で７０°Ｃの恒温浴で１８時間反応させてもよい。濾過後の残留物を回収し、３７°Ｃの炉内で２４時間乾燥させた。その後、β−ヘマチン結晶を４°Ｃの冷蔵室に保管した。

ヒトの全血サンプル中のマラリア（ヘモゾイン結晶）検出をシミュレーションするために、非感染全血サンプル中にβ−ヘマチンを懸濁させて、試験対象サンプルを生成した。分析実施前に、全血サンプルを、トリス緩衝（ｐＨ７）溶液とトリトンＸ−１００とサポニン溶液で溶解させた。溶解液は、「シンプルで安価な、抗マラリア薬剤の蛍光利用高スループットスクリーニング技術（Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」（Ｍ．Ｓｍｉｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２００４，ｖｏｌ．４８，ｐ１８０３）に記載の方法を応用したプロトコールに従って調製した。先ず、１００ｍＬのトリス緩衝溶液を調製した。６０ｍＬの水に１２．１１ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを溶解後、ＨＣｌ（塩酸）を加え、ｐＨ７の溶液を得た。その後、水を加えて、１００ｍＬのトリス緩衝溶液を得た。必要量のトリス緩衝溶液を１０ｍｇのサポニンと１ｍＬのトリトンＸ−１００に加えて、１００ｍＬの溶解液を得た。この溶解液を４°Ｃの冷蔵室で保管し、７日以内に使用した。全血サンプルの溶解物は、溶解液で１／２の希釈を行い、３０分間反応させて得た。

第１の分離フェーズの開始時に、シリンジ（１）の担体流体が磁気カラム（９）を介して流路に向けられ、シリンジ（２）の採取用流体が切換えバルブ（６）から廃棄部まで流れるように切換えバルブ（６）を設定して、装置を固定する。

β−ヘマチン結晶を含有する３００μＬの溶解全血サンプルを隔壁（５）内へ注入する。サンプルは懸濁液であるため、注入したサンプルが均質化されるように、注入直前に振り動かす。約２分半続く第１のフェーズの間、シリンジ（１）の水は接続チューブ（３）を通過し、注入したサンプルを切換えバルブ（６）と接続チューブ（８）を介して、磁気カラムの入口へ運ぶ。担体流体により搬送されたサンプルは、カラム内の鋼製磁化ミクロスフィア上を通過するため、サンプル中の磁性β−ヘマチン結晶は、磁化ミクロスフィアに付着して保持される。

分離フェーズの終了時に、装置を第２の分析フェーズに切換える。分析フェーズの継続時間は約２分半である。分析フェーズでは、シリンジ（１）の担体流体が切換え（６）から廃棄部へ送られ、シリンジ（２）の採取用溶液が切換え（６）により接続チューブ（８）を通って分離カラム（９）の入口へ向かうように、切換えバルブ（６）を切換える。採取用溶液は、分離フェーズ中にミクロスフィア上を通過中にミクロスフィアに保持されたβ−ヘマチン結晶を採取・溶離するように、選択する。これにより、本実施形態では、水酸化ナトリウム採取用溶液に溶解したβ−ヘマチン結晶を含む分析可能溶液が得られる。

分離カラムの出口は、接続チューブ（１１）を介してフローセル（１３）に接続され、狭帯域幅ダイオード（中心が４０５ｎｍ）の放射光は分析可能溶液を通過し、減衰光信号が送信されて光検出子（１５）に入射する。減衰光信号で検出した光吸収は、サンプルの溶解β−ヘマチンまたはヘモゾイン結晶の存在およびその量の指標となる。光検出子（１５）の出力は、信号増幅器と電圧計（１６）に接続され、その後段で、信号を処理・表示するよう構成したコンピュータに接続されている。

フローセル（１３）から流出した流体は、接続チューブ（１４）を介して、廃棄部へ送られる。

分析フェーズの終了時に、装置を第３の洗浄フェーズに切換える。洗浄フェーズ中、切換えバルブ（６）により、シリンジ（２）の採取用流体は廃棄部へ向かい、シリンジの担体流体は、接続チューブ（８）を介して分離カラム（９）へ向かう。

図３は、プログラム「ＰｃＬａｂ２０００」を介して、β−ヘマチンを含有する溶解全血サンプルから得たクロマトグラムであり、信号増幅（ｙ軸上のボルト単位）を時間関数（ｘ軸上の秒単位）として示す。矢印（１８）は、切換えバルブを分離フェーズから分析フェーズへ切換え・移行する時点を示す。ピーク（１９）は、β−ヘマチンが分析溶液で検出されたことを示す。このピーク（１９）の表面積は、サンプル中のβ−ヘマチンの濃度と相関している。

図４は、上述の手順で分析したマラリア感染溶解全血サンプルから、プログラム「ＰｃＬａｂ２０００」を介して得たクロマトグラムである。

サンプル中のヘモゾイン（またはβ−ヘマチン）の量を判定するために、例えば、既知量のβ−ヘマチンを含む検量サンプルを用いて、予備の検量線を作成してもよい。例えば、検量線は、ヘモゾインに対応するピーク信号下の表面積の関数として、ヘモゾインの濃度を表す（例えば、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて判定する）。別の選択肢として、吸収信号のヘモゾインに対応するピーク信号の最大強度の関数を用いてもよいが、上述のものより簡単である一方、精度は落ちる。

上記装置は簡略かつ堅牢な構造であるため、現地の各状況に応じて容易に使用できる。また、いかに迅速に信頼性の高い結果を高感度で得られるかという課題が、技師のスキルに大きく左右されないことも、有利な点である。

図５は、長さが７６ｍｍ、幅が２６ｍｍの一体化フローセル２６として示す、マイクロフローシステムの概略図である。このフローセルは、担体流体用入口２０と、採取用流体用入口２１と、サンプル用入口２２と、マイクロビーズ貯留器２３と、光学ウィンドウ２４と、出口／廃棄部２５を備え、マイクロビーズ貯留器と光学ウィンドウは、平面状フローセルまたはチップの形状で設けられている。平面状フローセルは、少なくとも（ｉ）そのマイクロビーズ貯留器を永久磁石上に載置、または、一対の平面状永久磁石間に介在させ、（ｉｉ）光エミッターと光検出子を光学ウィンドウに配置する使用構成となっている。磁石の形状とその位置は、好適な磁界を確実に発生させるため、適宜変更してもよい。各接続通路またはコンジット２７はそれぞれ、ａ）担体流体と採取用流体とサンプルの各入口からマイクロビーズ貯留器の入口まで通じるもの、ｂ）マイクロビーズ貯留器の出口から光学ウィンドウの入口まで通じるもの、ｃ）光学ウィンドウの出口から出口／廃棄部まで通じるものがあり、各々直径が１００μｍである。マイクロビーズ貯留器は、粒径が２００μｍの磁化可能な鋼製微粒子を収容する。

担体流体と採取用流体は外部容器から供給され、例えば、流体毎に蠕動ポンプを用いて、フローセル内へ送入される。逆流阻止バルブを備える蠕動ポンプを用いることで、流体循環を継続して行う必要がなく、また、図２の分析装置で説明したような、中間廃棄部（７）を設けた切換えバルブ（６）を設ける必要がない。分析対象のサンプルは、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ等の微量ピペット、または、ガラス毛細管を介して導入される。

本装置は、例えば、磁性微粒子を充填した１つまたは複数のフローセル２６と、永久磁石等の１つまたは複数の外部磁石と、蠕動ポンプと、光エミッターとこれに関連する光検出子と、信号処理装置と、好ましくはタッチスクリーンインターフェース等の結果表示用インターフェーススクリーンを備えるキットとして設けてもよい。

上述のマイクロフローシステムにより、少量のサンプルで好適に現地使用が可能な、低コストかつ小型の高速分析システムが実現する。

１ （二重シリンジポンプの）第１のシリンジ
２ （二重シリンジポンプの）第２のシリンジ
３ （シリンジ１と切換えバルブの間の）接続チューブ
４ （シリンジ２と切換えバルブの間の）接続チューブ
５ サンプルを注入するための挿入用隔壁
６ 切換えバルブ
７ 切換えバルブから廃棄部までの接続チューブ
８ 切換えバルブとカラムの間の接続チューブ
９ 磁気分離カラム
１０ 永久磁石
１１ カラムとフローセルの間の接続チューブ
１２ 疑似単色光発光ダイオード
１３ フローセル
１４ フローセルから廃棄部までの接続チューブ
１５ 光検出子
１６ 信号増幅器および電圧計
２０ 担体流体用入口
２１ 採取用流体用入口
２２ サンプル用入口
２３ マイクロビーズ貯留器
２４ 光学ウィンドウ
２５ 出口／廃棄部
２６ 一体化フローセル
２７ コンジット

Claims (14)

1. 磁性をもつ形態のターゲット材を含むサンプル中の前記ターゲット材を検出する方法であって、
   前記サンプルから前記ターゲット材の磁性形態を磁気分離し、
   分離した前記ターゲット材の磁性形態を溶解し、前記ターゲット材を含む分析可能溶液を提供し、
   前記分析可能溶液に分光分析を行い、前記ターゲット材を検出する、方法。
2. 前記ターゲット材は、ヘモゾインまたはβ−ヘマチンを含む、請求項１に記載の方法。
3. 血液サンプル中のヘモゾインを検出かつ定量化すると共に、マラリア感染を検出、および／または、寄生虫血症を推定および／または定量化する方法を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
4. 前記サンプルは溶解全血サンプルを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
5. 前記サンプルから前記ターゲット材の磁性形態を磁気分離する処理は、０．２〜１０Ｔの範囲の強度をもつ磁界を印加することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
6. 前記サンプルから前記ターゲット材の磁性形態を磁気分離する処理は、磁気分離カラム内で、前記サンプルに磁性粒子、特に鉄を含有する磁性粒子上を通過させることを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
7. 分離した前記ターゲット材の磁性形態を溶解し、分析可能溶液を提供する処理は、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、有機四級水酸化アンモニウム、アンモニア、有機アミン、およびこれらの組合せから成る群から選択されるアルカリ化剤を含む水溶液中で溶解させることを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
8. 前記分光分析は光学吸収分光法を含み、光源からの放射光は前記分析可能溶液を通過し、光検出子で受信される減衰した透過光を生じる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
9. 前記サンプル中の前記ターゲット材の量は、前記透過光の吸光度を介して得られるものである、請求項８に記載の方法。
10. 前記分析可能溶液に前記分光分析を行い、溶解した前記磁性ターゲット材を検出する処理は、疑似単色光、特に３５０ｎｍ〜４２０ｎｍ、または、６００ｎｍ〜６４０ｎｍの範囲の波長をもつ疑似単色光を分析することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
11. 磁気的特性をもつ前記ターゲット材はヘモゾインを含み、前記方法は、０．１μｇ／ｍＬ未満、好ましくは、０．０８μｇ／ｍＬ未満の前記サンプル中のヘモゾイン濃度を検出可能である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
12. 磁性をもつ形態のターゲット材を含む液状サンプル中の前記ターゲット材の存在を検出する装置であって、
    サンプル用入口とサンプル用出口の間にサンプル用流路を有する磁気分離器であって、前記流路は当該磁気分離器内に保持した磁気部材、特に磁化可能なミクロスフィア、上を通過する、磁気分離器と、
    サンプル用入口とサンプル用出口の間にサンプル用流路を有する分光分析器であって、前記磁気分離器の前記サンプル用出口は当該分光分析器のサンプル用入口と流体接続され、当該分光分析器の流路は検出ゾーンを含む、分光分析器とを備え、
    前記分光分析器は、
    放射光を前記検出ゾーンに投光するよう構成した放射光エミッター（特に、疑似単色光エミッター）と、
    前記検出ゾーンで放射光を検出するよう構成したセンサーとを含む、装置。
13. サンプルを担体流体の流路に導入可能な隔壁入口と、
    担体流体を前記磁気分離器に導入するよう構成した導入源（特に、シリンジ）と、
    採取用流体および／または溶解流体を前記磁気分離器に導入するよう構成した導入源（特に、シリンジ）と、
    前記装置内に流体の流れを発生させる流路デバイス（特に、ポンプ）と、
    分析対象の前記サンプルの流路を介して放射光を投光するよう構成した放射源（特に、疑似単色光源）と、
    分析対象の前記サンプルの流路を通過した放射光を検出するよう構成されるセンサーと、
    前記分光分析器からの出力に基づいて前記サンプル中の前記ターゲット材の存在および／または量を示すよう構成した信号処理装置、
    のうちの１つ以上をさらに備える、請求項１２に記載の装置。
14. 前記装置は、前記分光分析器からの出力信号に基づいて前記サンプル中の前記ターゲット材の量を表示するよう構成した信号分析器に接続されている、請求項１２または１３に記載の装置。