JP2018196397A - Dnaライブラリーの調製のためのdnaアダプター分子およびその生成法および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
次世代シーケンシング(NGS)は、DNA配列もしくはRNA配列の核酸塩基の配列を決定するための最新技術である。NGSの利点(速度、経済的有効性、正確性)は、遺伝情報の分析およびその実施を取り扱う全ての学術機関においてますます広がるようになっている。Roche、Life TechnologiesおよびIlluminaをはじめとする数社の世界的企業がNGS用の溶液を提供している。
本発明の目的は、ライブラリー調製の開始時に、フラグメント化されたDNAにアダプター配列が既に添加され得るように、アダプター配列を改変することである。本発明の別の目的は、アダプターのダイマーおよびオリゴマーの形成を回避することである。
本発明は、二本鎖ポリヌクレオチド分子を含むDNAアダプター分子を開示し、ここで
a.その第1鎖の5’末端は、一番目のヌクレオチドが遊離ヒドロキシル基を含まず、かつ5’位において遊離ホスフェートを含まず、その結果、キナーゼ結合部位が利用可能でないように改変(modify)されており、
b.該第1鎖の3’末端は、最後のヌクレオチドが3’位において遊離ヒドロキシル基を含まず、その結果、ライゲーションが起こり得ないように改変されており、
c.そのリバース鎖の5’末端は、一番目のヌクレオチドが遊離ヒドロキシル基を含まず、かつ5’位において遊離ホスフェートを含まず、その結果、キナーゼ結合部位が利用可能でないように改変されており、
d.該リバース鎖の3’末端は、(最後のヌクレオチドの3’位の)遊離ヒドロキシル基を特徴とする。
本願の特定の態様では例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
二本鎖分子を含むDNAアダプター分子であって、ここで
a.その第1鎖の5’末端は、一番目のヌクレオチドが遊離ヒドロキシル基を含まず、5’位において遊離ホスフェートを含まないように改変されており、
b.該第1鎖の3’末端は、最後のヌクレオチドが3’位において遊離ヒドロキシル基を含まないように改変されており、
c.そのリバース鎖の5’末端は、一番目のヌクレオチドが遊離ヒドロキシル基を含まず、5’位において遊離ホスフェートを含まないように改変されており、
d.該リバース鎖の3’末端は、遊離ヒドロキシル基を特徴とする、
DNAアダプター分子。
(項目2)
バーコード配列、ならびに増幅および配列決定プライマーのための結合部位を含む、項目1に記載のDNAアダプター分子。
(項目3)
20〜90、好ましくは40〜70、最も好ましくは40〜60塩基対の長さを有する点で特徴付けられる、項目1または2に記載のDNAアダプター分子。
(項目4)
前記両方の鎖の5’末端および前記第1鎖の3’末端にあるヒドロキシル基が、エステル化もしくはエーテル化されているという点で特徴付けられる、項目1〜3のうちの1項に記載のDNAアダプター分子。
(項目5)
前記リバース鎖の5’末端は、5‘−C3−スペーサーもしくは5‘−D−スペーサーの付着によって改変されているという点で特徴付けられる、項目1〜4のうちの1項に記載のDNAアダプター分子。
(項目6)
前記第1鎖の5’末端は、5’ C3−スペーサーもしくは5’−O−メチルデオキシヌクレオチドの付着によって改変されているという点で特徴付けられる、項目1〜5のうちの1項に記載のDNAアダプター分子。
(項目7)
前記第1鎖の3’末端は、3‘−C3−スペーサーもしくは3‘−アミノ−改変因子によって改変されるという点で特徴付けられる、項目1〜6のうちの1項に記載のDNAアダプター分子。
(項目8)
二本鎖分子を含むDNAアダプター分子の生成のための方法であって、該方法は、以下の工程:
a.遊離ヒドロキシル基も遊離ホスフェートも利用可能でないようにその第1鎖の5’末端を改変する工程、
b.遊離ヒドロキシル基が利用可能でないように該第1鎖の3’末端を改変する工程、
c.遊離ヒドロキシル基および遊離ホスフェートが利用可能でないようにそのリバース鎖の5’末端を改変する工程、
を包含する、方法。
(項目9)
前記第1鎖の5’末端の改変は、5‘−O−メチルデオキシチミジンモノホスフェートもしくは5‘−C3−スペーサーの付着によって達成される、項目8に記載のDNAアダプター分子の生成のための方法。
(項目10)
前記第1鎖の3’末端の改変は、3‘−C3−スペーサーもしくは3‘−アミノ−改変因子の付着によって達成される、項目8または9に記載のDNAアダプター分子の生成のための方法。
(項目11)
前記リバース鎖の5’末端の改変は、5‘−C3−スペーサーもしくは5‘−D−スペーサーの付着によって達成される、項目8〜10のうちの1項に記載のDNAアダプター分子の生成のための方法。
(項目12)
DNAライブラリーを生成するための方法であって、該方法は、
1.二本鎖DNAを、好ましくは、物理的もしくは化学的もしくは酵素的な方法またはこれらの組み合わせによってフラグメント化する工程;
2.該フラグメント化された二本鎖DNAを、好ましくは、T4−DNAポリメラーゼのような、3’→5`エキソヌクレアーゼおよび5’→3’ポリメラーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの助けを借りて、末端修復する工程;
3.該フラグメント化された二本鎖DNAの5’末端を、好ましくは、T4ポリヌクレオチドキナーゼのようなポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化する工程;
4.本発明に従うDNAアダプター分子を、該フラグメント化され、末端修復され、かつ5’リン酸化された二本鎖DNAにライゲーションする工程であって、ここで本発明に従うDNAアダプター分子は、工程2の前に添加される、工程、
を包含する方法。
(項目13)
DNAライブラリーを生成するための方法であって、該方法は、項目1〜7のうちの1項に記載のDNAアダプター分子を、フラグメント化し、末端修復し、かつ5’リン酸化した二本鎖DNAにライゲーションする工程を包含し、ここでライゲーションの前に、酵素の不活性化を行わない、方法。
(項目14)
キットであって、
−項目1〜7のうちの1項に記載のDNAアダプター分子、
−好ましくは、3’→5`エキソヌクレアーゼおよび5’→3’ポリメラーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ、ならびにデスオキシヌクレオシドトリホスフェート、
−好ましくは、ポリヌクレオチドキナーゼ、
−好ましくは、リガーゼ、
−5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ならびに
−好ましくは、緩衝液、
を含む、キット。
(項目15)
DNAライブラリーの生成のための、特に、次世代シーケンシングおよび/もしくはライブラリー多重化の分野における、項目1〜7のうちの1項に記載のDNAアダプター分子もしくは項目14に記載のキットの使用。
ここで
ここで
ここでRxは、必要に応じて置換されたおよび/もしくは分枝状のC1〜C3アルキル残基であり、より好ましくは、Rxは、CH3であり、
ここで
ここでRxは、必要に応じて置換されたおよび/もしくは分枝状のC1〜C3アルキル残基であり、より好ましくは、Rxは、CH3であり、
ここで
a.キナーゼ結合部位、特に遊離ヒドロキシル基も遊離ホスフェートも利用可能でないような、その第1鎖の5’末端の改変、
b.遊離ヒドロキシル基が利用可能でなく、かつ5’リン酸化dsDNAを有する結合が形成できないような、該第1鎖の3’末端の改変、
c.キナーゼ結合部位、特に遊離ヒドロキシル基も遊離ホスフェートも利用可能でないような、そのリバース鎖の5’末端の改変。
ここで、工程a〜cは任意の順序で行われ得る。
1.二本鎖DNAを、好ましくは、物理的もしくは化学的もしくは酵素的な方法またはこれらの組み合わせによってフラグメント化する工程;
2.該フラグメント化された二本鎖DNAを、好ましくは、T4−DNAポリメラーゼのような、3’→5`エキソヌクレアーゼおよび5’→3’ポリメラーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの助けを借りて、末端修復する工程;
3.該フラグメント化された二本鎖DNAの5’末端を、好ましくは、T4ポリヌクレオチドキナーゼのようなポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化する工程;
4.本発明に従うDNAアダプター分子を、該フラグメント化され、末端修復され、かつ5’リン酸化された二本鎖DNAにライゲーションする工程であって、ここで本発明に従うDNAアダプター分子は、工程2の前に添加され、好ましくは酵素(特に末端修復酵素)の不活性化はライゲーションの前に行われない、工程。
i.本発明に従うDNAアダプター分子、
ii.好ましくは、末端修復のために:3’→5`エキソヌクレアーゼおよび5’→3’ポリメラーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ、ならびにデオキシヌクレオシドトリホスフェート(好ましくは、dATP、dTTP、dGTPおよびdCTP)、
iii.好ましくは、5’リン酸化のために:ポリヌクレオチドキナーゼ、
iv.好ましくは、ライゲーションのために:リガーゼ、
v.好ましくは、上記のとおりの第2のDNAアダプター分子(好ましくは、ユニバーサルアダプター)、
vi.好ましくは、ニック修復のために:5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、および
vii.好ましくは、緩衝液(上記のとおり、好ましくは、マグネシウムおよびATPを含む)
を含む。
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