JP2018162269A - P2x7受容体アンタゴニスト及びアゴニスト - Google Patents
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Abstract
【解決手段】50nM未満のKdでP2X7に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインを少なくとも1つ含む、P2X7関連疾患の処置における使用のためのポリペプチドであって、ここで、該P2X7への該免疫グロブリン単一可変ドメインの結合が、P2X7の活性を阻害するポリペプチドを提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、P2X7受容体に関連する生物学的材料に、及び、さらに特にポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸に;そのようなポリペプチドを調製するための方法に;そのようなポリペプチドを発現する又は発現することが可能である宿主細胞に;予防的、治療的、又は診断的な目的のために、そのようなポリペプチドを含む組成物に及び特に医薬的組成物に関する。
プリンヌクレオチドは、細胞外シグナル伝達分子として十分に確立されている。P2X受容体は、例えば、脳及び脊髄の多様な領域において、速い興奮性伝達を媒介するATP依存的カチオンチャネルである。P2X7サブタイプは、ATPへの長時間曝露の間にそのイオン選択性を変化させる珍しい特性を有し、それは、チャンネル孔の進行性拡張及び900Daという大きな分子の透過性の発生をもたらす。P2X7受容体は、本来は、造血起源の細胞(マクロファージ、ミクログリア、及び特定のリンパ球を含む)において記載されたが、Ca2+及びNa+イオンの流入、ならびに炎症性サイトカインの放出を媒介する。P2X7受容体は、インターロイキン1β(神経変性、慢性炎症、及び慢性疼痛の主要メディエーター)のプロセシング及び放出を調節するそれらの能力を通じて、神経細胞死に影響しうる。P2X7受容体の活性化は、炎症性刺激を提供し、P2X7受容体欠損マウスは、実質的に減弱した炎症応答を有し、神経障害性及び慢性炎症性疼痛のモデルを含む。さらに、P2X7受容体活性は、炎症性サイトカインの放出を調節することにより、鬱病の病態生理学において関与している。P2X7受容体は、このように、神経系と免疫系の間での決定的なコミュニケーションリンクを表しうる(Skaper et al. 2010 FASEB J. 24: 337-345)。免疫系の主要細胞へのP2X7受容体の局在化は、これらの細胞から重要な炎症メディエーターを放出するその能力と共役し、治療的な活用のための標的を提供しながら、広範囲の疾患(疼痛及び神経変性障害を含む)の処置におけるP2X7受容体アンタゴニストの潜在的な役割を示唆する。
本発明は、従来技術のアミノ酸配列及び抗体と比較し、他の有利な特性(例えば、調製の改善された容易さ、良い安定性、及び/又は低下した商品のコスト)に加えて、改善された予防的、治療的、及び/又は薬理学的特性を伴うポリペプチドを提供する。
− 免疫グロブリンフォールドを含む、又は適した条件(例えば生理学的条件など)下で、免疫グロブリンフォールド(即ち、フォールディングにより)を形成する、即ち、免疫グロブリン可変ドメイン(例えば、VH、VL、又はVHHドメインなど)を形成することが可能である;及び
− 機能的な抗原結合活性を含む免疫グロブリン可変ドメインを形成する(又は、そのような適した条件下で形成することが可能である)(機能的な抗原結合部位を形成するために、別の免疫グロブリン可変ドメインとの相互作用(例えばVH−VL相互作用など)を要求しないという意味において)。
(I)P2X7、好ましくはヒトP2X7(配列番号1〜3)に、50nM未満のKdで結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン。
(II)(I)に従った免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリン単一可変ドメインが、式1:FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4 (1)のアミノ酸配列を含む;ここで、FR1〜FR4が、フレームワーク領域1〜4を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域(FR)であり;及び
− ここで、CDR1は:
− 配列番号34〜47、
− 配列番号34〜47と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
− 配列番号34〜47と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれ、そして
− ここで、CDR2は:
− 配列番号62〜75、
− 配列番号62〜75と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
− 配列番号62〜75と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれ、そして
− ここで、CDR3は:
− 配列番号90〜103、
− 配列番号90〜103の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも1つと少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、そして
− 配列番号90〜103と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれる。
(III)(II)に従った免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、フレームワーク領域(FR)が、配列番号6〜19のFRと80%を上回る配列同一性を有する。
(IV)(I)に従った免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリン単一可変ドメインが、式1:
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4 (1)
のアミノ酸配列を含む;
ここで、FR1〜FR4が、フレームワーク領域1〜4を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域であり;ここで、CDR1は配列番号34であり、ここで、CDR2は配列番号62であり;及び、ここで、CDR3は配列番号90である。
(V)(I)に従った免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリン単一可変ドメインが、式1:
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4 (1)
のアミノ酸配列を含む;
ここで、FR1〜FR4が、フレームワーク領域1〜4を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域であり;ここで、CDR1は配列番号35であり、ここで、CDR2は配列番号63であり;及び、ここで、CDR3は配列番号91である。
(VI)(I)に従った免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリン単一可変ドメインが、式1:
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4 (1)
のアミノ酸配列を含む;
ここで、FR1〜FR4が、フレームワーク領域1〜4を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域であり;ここで、CDR1は配列番号40であり、ここで、CDR2は配列番号68であり;そして、ここで、CDR3は配列番号96である。
(VII)(I)−(VI)のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド。
(VIII)(VII)に従ったポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドが、配列番号6〜19と80%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される。
(IX)(VII)又は(VIII)に従ったポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドが、配列番号6〜19と80%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される。
(X)さらにヒト血清アルブミン、例えばAlb8(配列番号126)又はAlb11(配列番号125)などを結合している免疫グログリン単一可変ドメインを含む、(VII)−(IX)のいずれかに従ったポリペプチド。
(XI)(I)−(VI)のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン又は(VII)−(X)のいずれかに従ったポリペプチドであって、ここで、アルファスクリーン(Alphascreen)アッセイにおけるIC50が30nM以下である。
(XII)(I)−(VI)のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン又は(VII)−(X)のいずれかに従ったポリペプチドであって、ここで、アルファスクリーンアッセイにおけるIC50が3nM以下である。
(XIII)i)(I)−(VI)、(XI)、もしくは(XII)のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はii)(VII)−(X)のいずれかに従ったポリペプチドをコードする核酸配列。
(XIV)i)(I)−(VI)、(XI)、もしくは(XII)のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はii)(VII)−(X)のいずれかに従ったポリペプチド;及び、場合により、医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬的組成物。
(XV)P2X7関連疾患(しかし、限定しないが、MS、IBD、神経因性疼痛、てんかん、脳卒中、糖尿病、高血圧、及び癌を含む)の処置における使用のための、(I)−(VI)、(XI)、もしくは(XII)のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は(VII)−(X)のいずれかに従ったポリペプチド。
(XVI)(I)−(VI)、(XI)、もしくは(XII)のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は(VII)−(X)のいずれかに従ったポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、以下の工程を少なくとも含む:
a)適した宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適した発現系において、(XIII)に従った核酸又はヌクレオチド配列を発現させること;場合により、以下が続く:
b)前記免疫グロブリン単一可変ドメイン又は前記ポリペプチドを単離及び/又は精製すること。
(XVII):P2X7及び特にヒトP2X7(配列番号1〜3)に対して向けられた免疫グロブリン単一可変ドメインをスクリーニングするための方法であって、少なくとも以下の工程を含む:
a)免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーを提供すること;及び
b)P2X7及び特にヒトP2X7(配列番号1〜3)に結合することができる及び/又はそれについての親和性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインについての免疫グロブリン単一可変ドメインの前記セット、コレクション、又はライブラリーをスクリーニングすること;及び
c)P2X7及び特にヒトP2X7(配列番号1〜3)に結合することができる及び/又はそれについての親和性を有するアミノ酸配列を単離すること。
(XVIII)50nM未満のKdでP2X7に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、前記P2X7への前記免疫グロブリン単一可変ドメインの結合によって、P2X7の活性が阻害される。
免疫グロブリン配列、例えば抗体及びそれらに由来する抗原結合フラグメント(例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン)は、研究及び治療的適用においてそれらのそれぞれの抗原を特異的に標的にするために用いられる。免疫グロブリン単一可変ドメイン(例えば、例えば、VHHなど)の生成は、実験動物(例えばラマなど)の免疫、免疫組織からのファージライブラリーの構築、抗原結合免疫グロブリン単一可変ドメインをディスプレイするファージの選択、ならびに所望の特異性についての前記ドメイン及びそれらの操作コンストラクトのスクリーニングを含みうる(WO94/04678)。あるいは、同様の免疫グロブリン単一可変ドメイン(例えば、例えば、dAbなど)を、天然又は合成ライブラリーから直接的に抗原結合免疫グロブリン単一可変ドメインをディスプレイするファージを選択すること、ならびに、その後の、所望の特異性について前記ドメイン及びそれらの操作コンストラクトのスクリーニングにより生成することができる(Ward et al., Nature, 1989, 341: 544-6; Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490;ならびに、例えば、WO06/030220、WO06/003388及びDomantis Ltd.の他の公開特許出願)。残念なことに、モノクローナル及び/又は重く操作された抗体の使用は、また、高い製造コストを要し、他の戦略と比較し、最適以下の腫瘍浸潤をもたらしうる。
他に示さない又は定義しない限り、使用する全ての用語は、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有し、それらは、当業者に明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( 2nd Ed.)Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、F. Ausubel et al.(Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987)、Lewin(Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985)、Old et al.(Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981);Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001)、Roitt et al.(Roitt's Essential Immunology (10th Ed.)Blackwell Publishing, UK, 2001)、及びJaneway et al.(Immunobiology (6th Ed.)Garland Science Publishing/ChurChill Livingstone, New York, 2005)、ならびに本明細書において引用する一般的な背景技術が参照される。
本発明のISV及びポリペプチドは、一般的に、P2X7へのATPの結合又は、P2X7及び特にヒトP2X7の細胞外ATP媒介性活性化を調節ならびに、特に阻害及び/又は防止し(表B−2を参照のこと)、このように、P2X7及び特にヒトP2X7(配列番号1〜3)によるゲーティングを調節及び特に阻害もしくは防止する、及び/又は、そのようなゲーティング(P2X7構築ブロック)に関連する生物学的機構、応答、及び効果を調節するために使用することができる。好ましくは、本発明のISVは、1c81様配列、3c23様配列、1c113様配列、13a7様配列、14d5様配列からなる群より選ばれる。
A)1C81様配列:本明細書において定義する通り、「1C81様配列」、「1C81様ISV」、又は「1C81様構築ブロック」は、以下を含むISV(本明細書において記載する通り)として定義される:
a)(i)アミノ酸配列RTFSFSTSTMG(配列番号34)又は(ii)アミノ酸配列RTFSFSTSTMG(配列番号34)とわずか3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列、のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR1;及び/又は
b)(i)アミノ酸配列AIDWSDFN(配列番号62)又は(ii)アミノ酸配列AIDWSDFN(配列番号62)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列AIDWSDFN(配列番号62)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列、のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR2;及び/又は
c)(i)アミノ酸配列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(配列番号90)又は(ii)アミノ酸配列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(配列番号90)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(配列番号90)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列、のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR3;
ここで、そのようなISV中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3は、好ましくは、1C81様ISVが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ(当技術分野において公知の通り)を用いて、又は細胞ベースのアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)により決定することができる。
d)(i)アミノ酸配列RTFSFSTSTMG(配列番号34)又は(ii)アミノ酸配列RTFSFSTSTMG(配列番号34)とわずか3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR1;及び/又は
e)(i)アミノ酸配列AIDWSDFN(配列番号62)又は(ii)アミノ酸配列AIDWSDFN(配列番号62)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列AIDWSDFN(配列番号62)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR2;及び/又は
f)(i)アミノ酸配列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(配列番号90)又は(ii)アミノ酸配列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(配列番号90)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(配列番号90)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR3;
ここで、そのようなISV中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3は、好ましくは、1C81様ISVが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)を用いて、又は細胞ベースのアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)により決定することができる。
a)(i)アミノ酸配列RTFRHYAMG(配列番号40)又は(ii)アミノ酸配列RTFRHYAMG(配列番号40)とわずか3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR1;及び/又は
b)(i)アミノ酸配列AISSYGST(配列番号68)又は(ii)アミノ酸配列AISSYGST(配列番号68)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列AISSYGST(配列番号68)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR2;及び/又は
c)(i)アミノ酸配列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(配列番号96)又は(ii)アミノ酸配列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(配列番号96)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(配列番号96)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR3;
ここで、そのようなISV中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3は、好ましくは、3C23様ISVが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ(当技術分野において公知の通り)を用いて、又は細胞ベースのアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)により決定することができる。
d)(i)アミノ酸配列RTFRHYAMG(配列番号40)又は(ii)アミノ酸配列RTFRHYAMG(配列番号40)とわずか3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR1;及び/又は
e)(i)アミノ酸配列AISSYGST(配列番号68)又は(ii)アミノ酸配列AISSYGST(配列番号68)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列AISSYGST(配列番号68)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR2;及び/又は
f)(i)アミノ酸配列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(配列番号96)又は(ii)アミノ酸配列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(配列番号96)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(配列番号96)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR3;
ここで、そのようなISV中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3は、好ましくは、3C23様ISVが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)を用いて、又は細胞ベースのアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)により決定することができる。
a)(i)アミノ酸配列IAFNYYSMS(配列番号35)又は(ii)アミノ酸配列IAFNYYSMS(配列番号35)とわずか3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR1;及び/又は
b)(i)アミノ酸配列DISPGGHT(配列番号63)又は(ii)アミノ酸配列DISPGGHT(配列番号63)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列DISPGGHT(配列番号63)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR2;及び/又は
c)(i)アミノ酸配列RLRFEVSSNY(配列番号91)又は(ii)アミノ酸配列RLRFEVSSNY(配列番号91)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列RLRFEVSSNY(配列番号91)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR3;
ここで、そのようなISV中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3は、好ましくは、1C113様ISVが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ(当技術分野において公知の通り)を用いて、又は細胞ベースのアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)により決定することができる。
d)(i)アミノ酸配列IAFNYYSMS(配列番号35)又は(ii)アミノ酸配列IAFNYYSMS(配列番号35)とわずか3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR1;及び/又は
e)(i)アミノ酸配列DISPGGHT(配列番号63)又は(ii)アミノ酸配列DISPGGHT(配列番号63)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列DISPGGHTとわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR2;及び/又は
f)(i)アミノ酸配列RLRFEVSSNY(配列番号91)又は(ii)アミノ酸配列RLRFEVSSNY(配列番号91)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列RLRFEVSSNY(配列番号91)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR3;
ここで、そのようなISV中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3は、好ましくは、1C113様ISVが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)を用いて、又は細胞ベースのアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)により決定することができる。
a)(i)アミノ酸配列YYDIG(配列番号47)又は(ii)アミノ酸配列YYDIG(配列番号47)とわずか3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR1;及び/又は
b)(i)アミノ酸配列CRFTNDGSTAYADSVKG(配列番号75)又は(ii)アミノ酸配列CRFTNDGSTAYADSVKG(配列番号75)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列CRFTNDGSTAYADSVKG(配列番号75)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR2;及び/又は
c)(i)アミノ酸配列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(配列番号103)又は(ii)アミノ酸配列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(配列番号103)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(配列番号103)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR3;
ここで、そのようなISV中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3は、好ましくは、13A7様ISVが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ(当技術分野において公知の通り)を用いて、細胞ベースのアッセイ(当技術分野において公知の通り)により、インビボアッセイにより決定することができる。
d)(i)アミノ酸配列YYDIG(配列番号47)又は(ii)アミノ酸配列YYDIG(配列番号47)とわずか3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR1;及び/又は
e)(i)アミノ酸配列CRFTNDGSTAYADSVKG(配列番号75)又は(ii)アミノ酸配列CRFTNDGSTAYADSVKG(配列番号75)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列CRFTNDGSTAYADSVKG(配列番号75)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR2;及び/又は
f)(i)アミノ酸配列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(配列番号103)又は(ii)アミノ酸配列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(配列番号103)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(配列番号103)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR3;
ここで、そのようなISV中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3は、好ましくは、13A7様ISVが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)を用いて、又は細胞ベースのアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)により決定することができる。
a)(i)アミノ酸配列SYAMG(配列番号46)又は(ii)アミノ酸配列SYAMG(配列番号46)とわずか3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR1;及び/又は
b)(i)アミノ酸配列RIYTGGTAWYEDSVKG(配列番号74)又は(ii)アミノ酸配列RIYTGGTAWYEDSVKG(配列番号74)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列RIYTGGTAWYEDSVKG(配列番号74)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR2;及び/又は
c)(i)アミノ酸配列RVRYDY(配列番号102)又は(ii)アミノ酸配列RVRYDY(配列番号102)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列RVRYDYとわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるCDR3;
ここで、そのようなISV中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3は、好ましくは、14D5様ISVが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ(当技術分野において公知の通り)を用いて、細胞ベースのアッセイ(当技術分野において公知の通り)により、インビボアッセイにより決定することができる。
d)(i)アミノ酸配列SYAMG(配列番号46)又は(ii)アミノ酸配列SYAMG(配列番号46)とわずか3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR1;及び/又は
e)(i)アミノ酸配列RIYTGGTAWYEDSVKG(配列番号74)又は(ii)アミノ酸配列RIYTGGTAWYEDSVKG(配列番号74)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列RIYTGGTAWYEDSVKG(配列番号74)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR2;及び/又は
f)(i)アミノ酸配列RVRYDY(配列番号102)又は(ii)アミノ酸配列RVRYDY(配列番号102)と少なくとも80%、例えば少なくとも85%など、例えば、少なくとも90%、又は95%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列;又は(iii)アミノ酸配列RVRYDY(配列番号102)とわずか7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸の違い(本明細書において定義する通り)を有するアミノ酸配列のいずれかであるCDR3;
ここで、そのようなISV中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3は、好ましくは、14D5様ISVが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)を用いて、又は細胞ベースのアッセイ(例えば、本明細書において記載する通り、など)により決定することができる。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
を伴うアミノ酸配列として定義することができ、
ここで、FR1〜FR4は、それぞれフレームワーク領域1〜4を指し、及び、ここでCDR1〜CDR3は、それぞれ相補性決定領域1〜3を指す。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
を伴うアミノ酸配列である少なくとも免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提供し、
ここで、FR1〜FR4は、それぞれフレームワーク領域1〜4を指し、及び、ここでCDR1〜CDR3は、それぞれ相補性決定領域1〜3を指し、及び、ここで:
i)Kabatナンバリングに従った位置11、37、44、45、47、83、84、103、104、及び108のアミノ酸残基の少なくとも1つが、下の表A−1において言及されるホールマーク残基より選ばれる;及び、ここで:
ii)前記アミノ酸配列が、WO2009/138519に示す通りの免疫グロブリン単一可変ドメイン(WO2009/138519における配列番号1〜125を参照のこと)の少なくとも1つと少なくとも80%、より好ましくは90%、さらにより好ましくは95%のアミノ酸同一性を有し、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、CDR配列を形成するアミノ酸残基(配列中でXを用いて示される)を無視し;及び、ここで:
iii)CDR配列は、一般的に、本明細書においてさらに定義する通りであり(例えば、表(B−2)中に提供する通り、組み合わせにおけるCDR1、CDR2、及びCDR3。CDRの定義は、Kabatナンバリングシステムに従って算出されることに注意すること)。
a)配列番号34〜47;
b)配列番号34〜47のアミノ酸配列の少なくとも1つと少なくとも80%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ;
c)配列番号34〜47のアミノ酸配列の少なくとも1つと3、2、又は1つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ;
及び/又はCDR2配列:
d)配列番号62〜75;
e)配列番号62〜75のアミノ酸配列の少なくとも1つと少なくとも80%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ;
f)配列番号62〜75のアミノ酸配列の少なくとも1つと3、2、又は1つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ;
及び/又はCDR3配列:
g)配列番号90〜103;
h)配列番号90〜103のアミノ酸配列の少なくとも1つと少なくとも80%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ;
i)配列番号90〜103のアミノ酸配列の少なくとも1つと3、2、又は1つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ。
− 1000nM〜1nM又はそれ以下、好ましくは100nM〜1nM又はそれ以下、より好ましくは15nM〜1nM又はさらに10nM〜1nM又はそれ以下の会合定数(KD)を伴い、P2X7に結合するようにし;
及び/又は、それらは:
− 104M-1s-1〜約107M-1s-1の間、好ましくは105M-1s-1と107M-1s-1の間、より好ましくは106M-1s-1又はそれ以上のkon率を伴い、P2X7に結合するようにし;
及び/又は、それらは:
− 10−2s-1(t1/2=0.69s)と10−4s-1の間(複数の日のt1/2を伴う不可逆的に近い結合体を提供する)、好ましくは10−3s-1と10−4s-1又はそれ以下のkoff率を伴い、P2X7に結合するようにする。
a)配列番号34〜47;
b)配列番号34〜47のアミノ酸配列の少なくとも1つと少なくとも80%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ;
c)配列番号34〜47のアミノ酸配列の少なくとも1つと3、2、又は1つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ;
及び/又は
CDR2は、以下からなる群より選ばれる:
d)配列番号62〜75;
e)配列番号62〜75のアミノ酸配列の少なくとも1つと少なくとも80%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ;
f)配列番号62〜75のアミノ酸配列の少なくとも1つと3、2、又は1つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ;
及び/又は
CDR3は、以下からなる群より選ばれる:
g)配列番号90〜103;
h)配列番号90〜103のアミノ酸配列の少なくとも1つと少なくとも80%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ;
i)配列番号90〜103のアミノ酸配列の少なくとも1つと3、2、又は1つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ。
a)配列番号34〜47;
b)配列番号34〜47のアミノ酸配列の少なくとも1つと少なくとも80%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ;
c)配列番号34〜47のアミノ酸配列の少なくとも1つと3、2、又は1つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ;
及び
CDR2は、以下からなる群より選ばれる:
d)配列番号62〜75;
e)配列番号62〜75のアミノ酸配列の少なくとも1つと少なくとも80%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ;
f)配列番号62〜75のアミノ酸配列の少なくとも1つと3、2、又は1つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ;
及びCDR3は、以下からなる群より選ばれる:
g)配列番号90〜103;
h)配列番号90〜103のアミノ酸配列の少なくとも1つと少なくとも80%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ;
i)配列番号90〜103のアミノ酸配列の少なくとも1つと3、2、又は1つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
を伴う免疫グロブリン単一可変ドメイン及び/又はポリペプチドでありうるが、
ここで、FR1〜FR4は、それぞれフレームワーク領域1〜4を指し、及び、ここで、CDR1〜CDR3は、それぞれ相補性決定領域1〜3を指し、及び、それらは:
i)配列番号6〜19(表B−3を参照のこと)のアミノ酸配列の少なくとも1つと、少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、CDR配列を形成するアミノ酸残基を無視する。この点において、参照が、また、表B−1に作られ、それは、配列番号6〜19(表B−3を参照のこと)の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク1配列(配列番号20〜33)、フレームワーク2配列(配列番号48〜61)、フレームワーク3配列(配列番号76〜89)、及びフレームワーク4配列(配列番号104〜117)を列挙する;又は
ii)表B−1中に描写する通りのフレームワーク配列の組み合わせ;
及び、ここで:
iii)好ましくは、Kabatナンバリングに従った位置11、37、44、45、47、83、84、103、104、及び108でのアミノ酸残基の1つ以上が、WO08/020079の表A−1から表A−8中で言及するホールマーク残基より選ばれる。
(その遺伝子治療の送達方法のために参考として組み入れられる)を参照。送達の遺伝子治療方法を使用し、本発明のアミノ酸配列、ポリペプチドをコードする遺伝子を用いてトランスフェクトした初代細胞を、追加で、組織特異的プロモーターを用いてトランスフェクトし、特定の器官、組織、移植片、腫瘍、又は細胞を標的とすることができ、加えて、細胞内での局在化した発現のためのシグナル及び安定化配列を用いてトランスフェクトすることができる。
A1.50nM未満のKdを伴いP2X7に結合することができる、P2X7関連疾患を処置する際での使用のための少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、前記P2X7への前記免疫グロブリン単一可変ドメインの結合が、P2X7の活性を阻害する。
− ここで、CDR1は、以下からなる群より選ばれる:
− 配列番号34〜47、
− 配列番号34〜47と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
− 配列番号34〜47と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド;及び
− ここで、CDR2は、以下からなる群より選ばれる:
− 配列番号62〜75;
− 配列番号62〜75と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド;及び
− 配列番号62〜75と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド;及び
− ここで、CDR3は、以下からなる群より選ばれる:
− 配列番号90〜103;
− 配列番号90〜103と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド;及び
− 配列番号90〜103と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド。
− CDR1は配列番号34であり、CDR2は配列番号62であり;及び、CDR3は配列番号90;
− CDR1は配列番号35であり、CDR2は配列番号63であり;及び、CDR3は配列番号91;
− CDR1は配列番号40であり、CDR2は配列番号68であり;及び、CDR3は配列番号96;
− CDR1は配列番号36であり、CDR2は配列番号64であり;及び、CDR3は配列番号92;
− CDR1は配列番号37であり、CDR2は配列番号65であり;及び、CDR3は配列番号93であり;
− CDR1は配列番号38であり、CDR2は配列番号66であり;及び、CDR3は配列番号94であり;
− CDR1は配列番号39であり、CDR2は配列番号67であり;及び、CDR3は配列番号95であり;
− CDR1は配列番号41であり、CDR2は配列番号69であり;及び、CDR3は配列番号97であり;
− CDR1は配列番号42であり、CDR2は配列番号70であり;及び、CDR3は配列番号98であり;
− CDR1は配列番号43であり、CDR2は配列番号71であり;及び、CDR3は配列番号99であり;
− CDR1は配列番号44であり、CDR2は配列番号72であり;及び、CDR3は配列番号100であり;
− CDR1は配列番号45であり、CDR2は配列番号73であり;及び、CDR3は配列番号101であり;
− CDR1は配列番号46であり、CDR2は配列番号74であり;及び、CDR3は配列番号102であり;及び
− CDR1は配列番号47であり、CDR2は配列番号75であり;及び、CDR3は配列番号103である;
− ここで、CDR1は、以下からなる群より選ばれる:
− 配列番号34〜47、
− 配列番号34〜47と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
− 配列番号34〜47と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド;及び
− ここで、CDR2は、以下からなる群より選ばれる:
− 配列番号62〜75;
− 配列番号62〜75と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド;及び
− 配列番号62〜75と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド;及び
− ここで、CDR3は、以下からなる群より選ばれる:
− 配列番号90〜103;
− 配列番号90〜103と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド;及び
− 配列番号90〜103と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド。
− CDR1は配列番号34であり、CDR2は配列番号62であり;及び、CDR3は配列番号90であり;
− CDR1は配列番号35であり、CDR2は配列番号63であり;及び、CDR3は配列番号91であり;
− CDR1は配列番号40であり、CDR2は配列番号68であり;及び、CDR3は配列番号96であり;
− CDR1は配列番号36であり、CDR2は配列番号64であり;及び、CDR3は配列番号92であり;
− CDR1は配列番号37であり、CDR2は配列番号65であり;及び、CDR3は配列番号93であり;
− CDR1は配列番号38であり、CDR2は配列番号66であり;及び、CDR3は配列番号94であり;
− CDR1は配列番号39であり、CDR2は配列番号67であり;及び、CDR3は配列番号95であり;
− CDR1は配列番号41であり、CDR2は配列番号69であり;及び、CDR3は配列番号97であり;
− CDR1は配列番号42であり、CDR2は配列番号70であり;及び、CDR3は配列番号98であり;
− CDR1は配列番号43であり、CDR2は配列番号71であり;及び、CDR3は配列番号99であり;
− CDR1は配列番号44であり、CDR2は配列番号72であり;及び、CDR3は配列番号100であり;
− CDR1は配列番号45であり、CDR2は配列番号73であり;及び、CDR3は配列番号101であり;
− CDR1は配列番号46であり、CDR2は配列番号74であり;及び、CDR3は配列番号102であり;及び
− CDR1は配列番号47であり、CDR2は配列番号75であり;及び、CDR3は配列番号103である。
a)少なくとも1つの第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、P2X7の第1抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられ;及び、ここで、
b)少なくとも1つの第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、第1抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造とはそれぞれ異なる、前記P2X7の第2抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられる。
a)適した宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適した発現系において、局面A1〜A25のいずれか1つに従ったポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列を発現させること;場合により、以下が続く:
b)前記免疫グロブリン単一可変ドメイン又は前記ポリペプチドを単離及び/又は精製すること。
a)免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーを提供すること;及び
b)P2X7及び特にヒトP2X7(配列番号1〜3)に結合することができる及び/又はそれについての親和性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインについて、免疫グロブリン単一可変ドメインの前記セット、コレクション、又はライブラリーをスクリーニングすること;及び
c)P2X7及び特にヒトP2X7(配列番号1〜3)に結合することができる及び/又はそれについての親和性を有するアミノ酸配列を単離すること。
実施例1.1:ラマ405及び418の免疫化ならびにファージディスプレイライブラリーの構築
ラマを、DNAプライム>タンパク質の追加免疫戦略により免疫化した(Koch-Nolte et al.2007 Faseb J 21: 3490-3499)。ラマを、遺伝子銃(Biorad)当たり、剃毛した左右の脇腹上に、金粒子上に吸着されたマウスP2X7(mP2X7)及びヒトP2X7(hP2X7)用のcDNAコンストラクトを用いて免疫化し(1μm、1μg DNA/mg金を用いた各々、12ショット)、同を用いて、3回、2週間間隔で追加免疫した(図1)。最終的なDNA免疫化の3及び9日後、100mlの末梢血液を、各々、収集した。全RNAを血液リンパ球から調製し、VHHレパートリーをRT−PCRにより増幅し、pAX50ファージミド中にクローン化し、ファージライブラリーPBL1及びPBL2を生成した。ラマを、さらに、1回、mP2X7又はhP2X7を安定的に発現するようにトランスフェクトされたHEK細胞を用いて追加免疫した(Adriouch et al., 2008 FASEB J. 22, 861-869)(2×107個のHEK_mP2X7細胞及び3×107個のHEK_hP2X7細胞、15分間にわたり、1mM ATPを用いて前処理し、次に、2%パラホルムアルデヒド中で10分間にわたり氷上で固定)。4及び8日後、末梢血を収集し、ファージライブラリーPBL3及びPBL4を生成した。最終的な追加免疫を、HEK_mP2X7細胞ライセートからのアガロース共役mAbs HANO43及びHANO44(Adriouch et al. 2005, Moller et al.2007)を用いて免疫沈降した、精製ビーズ結合組換えmP2X7(5μg/50μlビーズ)を用いて実施した。4及び10日後、ファージライブラリーPBL5及びPBL6を生成した。RNAをcDNAに逆転写し、VHHレパートリーをPCRにより増幅し、pAX50ファージミドベクター中にクローン化した。ファージをTG1大腸菌中で増幅した。
抗hP2X7ナノボディ(Nb)の選択を、組み合わせたファージライブラリーPBL5及びPBL6を用いて行った。2つの選択を行い、各々が、hP2X7発現細胞上での2ラウンドのパニングを含んだ。セクション1において、ファージライブラリーPBL5+6(200μl)を、ヒトP2X7を安定的に発現するためのトランスフェクトされたマウスYac−1リンパ腫細胞(2.5×107個の細胞)上にパニングした。細胞結合ファージを、トリプシン処理(15分間、室温)により溶出し、上清を使用し、TG1大腸菌中での再感染当たりで、ファージを増幅させた。第1ラウンドの選択(200μl)からのレスキューファージを、hP2X7を発現するように安定的にトランスフェクトされたHEK細胞上にさらにパニングした(2×107個の細胞)。各々のラマについて、クローンを、ラウンド2(R2)だけから選定した。ファージミドを各々のクローンから調製し、pAX50シークエンシングプライマーを用いて配列決定した。単一ドメイン抗体としてのNbの発現のために、pAX50ファージミドベクターを、HB2151大腸菌中に個々に形質転換した。一価Nbを、可溶性His6xタグ付きタンパク質として発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによりペリプラズム溶解物から精製した。
Nb1c81、1c113、3c23のホモマー及びヘテロマー二量体をPCRにより構築し、長い隣接プライマーを使用し、35−GSリンカー(SfiI−Nb1−20GS−BamHI−15GS−Nb2−NotI)を挿入するようにした。VHHドメインを、また、真核生物発現ベクターpME(Scheuplein et al., 2010)中への、適した制限酵素部位(5’BamH1及び3’XhoI)により隣接されたプライマーを用いたPCR増幅により、マウスIgG1のFcドメインへの融合タンパク質として再クローン化した。
選択したNbの特異性を検証し、Nbが、また、マウスP2X7又はラットP2X7に結合しうるか否かを決定するために、HEK細胞を、GFP及びhP2X7、mP2X7、又はrP2X7のいずれかについての発現コンストラクトを用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、細胞を、Nb−Fc融合タンパク質又はmAb L4を用いて、FACS分析前に染色した(図3)。結果は、Nb3c23(図中でWD3c23Fcとして命名される)及び1c113(図中でWD1c113Fcとして命名される)が、hP2X7を認識するが、しかし、rP2X7又はmP2X7はしないのに対し、Nb1c81(図中でWD1c81Fcとして命名される)は、hP2X7、rP2X7、及びmP2X7を用いてトランスフェクトされた細胞と特異的に反応する。比較により、以前に記載されたNb13A7及び14D5(WO2010/070145)が、mP2X7を認識するが、しかし、hP2X7又はrP2X7はせず、mAb L4は、hP2X7及びrP2X7を認識するが、しかし、mP2X7はしない。
初代リンパ球は、低レベルのP2X7を発現する。異なるエピトープを認識する抗体を組み合わせること、又は立体構造に非依存的な抗体を使用することは、プリン受容体の可視化のための利点でありうる。選択したNbが重複エピトープを認識するか否かを検討するために、交差遮断分析を、非結合Nb−Fc融合タンパク質ならびにAlexa647結合mAb L4及びNb1c113−Fc及び3c23−Fcを用いて実施した(図4)。高レベルのhP2X7を安定的に発現するようにトランスフェクトされたHEK細胞を、飽和レベルの非結合mAb L4、Nb 1c81−Fc、Nb 1c113−Fc、Nb 3c23−Fc、コントロールNb(1067−Fc、抗hCD38)、又は培地(賦形剤)のいずれかを用いてプレインキュベートした。洗浄を伴わず、細胞を、非結合抗体より10倍少ない量で、示した結合抗体を用いて染色した。
初代リンパ球上でのP2X7の表面発現の検出は、適したツールの可用性及びリンパ球サブセット上でのプリン受容体の固有の低発現により限定される(Buell et al.1998)。3c23−Fcが、1c81−Fc及び1c113−Fcに非依存的に結合することを示しているため、本発明者らは、蛍光色素標識Nb−Fc融合タンパク質の組み合わせによって、ヒト末梢血中のリンパ球及び単球集団上でのP2X7の検出が改善されるか否かをテストした(図5)。この目的のために、単一ドナーからのPBLの比較染色を、mAb L4対1c113−Fc、3c23−Fc、又は後者の2つのNb−Fc融合タンパク質の組み合わせを用いて実施した。結果は、mAb L4単独を用いた染色と比較し、Nb−Fc融合タンパク質の組み合せによって、改善された検出感度がもたらされることを実証する(CD4+細胞についてMFI21対11及びCD4−細胞についてMFI17対10)(図5A)。観察された染色の特異性を検証するために、遮断分析を、染色のために使用したのと同じ非標識Nb−Fc融合タンパク質又はコントロールの組み合わせの10倍過剰量を用いて実施した。
本発明者らは、以前に、P2X7及びCD62L(Lセレクチン)を同時トランスフェクトしたHEK細胞のATPを用いた処置が、CD62LのP2X7依存的切断放出(内因性メタロプロテイナーゼのP2X7依存的活性化を介して)をもたらすことを示している。選択したNbがP2X7機能を遮断しうるか否かを決定するために、CD62L切断放出分析を、トランスフェクトHEK細胞を用いて行った(図6)。細胞を、CD62LだけについてのcDNA発現コンストラクトを用いてトランスフェクトした、又はCD62L及びhP2X7についてのコンストラクト(Y155_T348)を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、細胞を回収し、CD62Lの切断放出を、ATPを用いたインキュベートにより誘導した。
マウスmAb L4が、ヒト単球上でのP2X7活性化を遮断することが報告されている(Buell et al.1998)。選択されたNb、Nb−Fc融合タンパク質、及びmAb L4の遮断効力を比較するために、比較用量応答アッセイを、トランスフェクトHEK細胞を用いて実施した(図7)。この目的のために、HEK細胞を、GFP、CD62L、及びhP2X7を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、細胞を、穏やかなトリプシン処理により回収し、15分間にわたり室温で、示した量のNb、Nb−Fc融合タンパク質、又はmAb L4を用いてインキュベートした。細胞を、60分間にわたり37℃で、4mMのATPの非存在又は存在において、細胞表面CD62Lについての染色及びFACS分析の前に、さらにインキュベートした。
RPMI 8226は、P2X7を内因性に発現するB細胞ミエローマ細胞株である(図8A)。この細胞株は、ホスファチジルセリン(PS)の外在化及び細胞死(ヨウ化プロピジウムの不可逆取り込み)を伴うATP処理に応答する(Farrell et al. 2010 BioChimica et Biophysica Acta 1800 pp 1173-1182)。FACS分析では、RPMI 8226細胞によるPSのATP用量依存的な外在化が確認された(EC50 1.8mM)(図8B)。選択したNbが、内因性に発現されたP2X7のATP誘導性活性化を遮断することができるか否かをテストするために、RPMI8226細胞によるATP媒介性PS外在化を遮断するNbの能力を検討した(図8C)。この目的のために、RPMI 8226細胞を、mAb L4、抗hP2X7 Nb−Fc融合タンパク質1c113−Fc、1c81−Fc、3c23−Fcを用いて、又はコントロールNb−Fc融合タンパク質1067−Fcを用いて、15分間にわたり室温でプレインキュベートし、次に、60分間にわたり37℃で、4mMのATPを用いてさらにインキュベートした。P2X7活性化の範囲を、蛍光色素標識アネキシンVを用いた外在化ホスファチジルセリンの可視化によりアッセイした(図8C)。結果が、1c81−Fc及び3c23−FcによるATP誘導性PS外在化の完全に近い遮断を示すのに対し、mAb L4及び1c113−Fcは、両方が、PS外在化、及びコントロールNb−Fc融合タンパク質1067−Fcによる遮断の完全欠如を部分的にだけ遮断した。
ATPによるRPMI 8226細胞上でのP2X7の長期活性化が、ヨウ化プロピジウムの不可逆的取り込みにより検出された通り、細胞死をもたらすことが以前に実証されている(Farrell et al.2010)。次に、P2X7特異的Nbが細胞死を遮断しうるか否かを検討した。この目的のために、RPMI 8226細胞を、それぞれの抗体を用いて、ATPを用いた処理に先立ち、60分間又は24時間にわたりプレインキュベートした。細胞を、次に、洗浄し、アネキシンV及びヨウ化プロピジウムを用いて染色し、ホスファチジルセリンの外在化及び細胞死を評価した(図9)。
Nb1c81及び3c23が、P2X7を内因的に発現するRPMI8226リンパ腫細胞によるPSのATP誘導性外在化を効果的に遮断することを実証しているため、本発明者らは、次に、これらのNbが、また、CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞によるPSのATP誘導性外在化及びCD62Lの切断放出を遮断することができるか否かを検討した。この目的のために、一定分量の全血液を、30分間にわたり室温で、それぞれのNb−Fc融合タンパク質を用いて又はmAb L4を用いて、4mMのATPを用いた30分間にわたる37℃での処理に先立ち、プレインキュベートした。その後、細胞を、P2X7活性化についての読み出しの通り、CD62L発現及びPSの外在化(アネキシンV)について染色した。
RPMI8226細胞に、Ca2+指示薬Fluo−4を用いて負荷した。リアルタイムフローサイトメトリー分析を実施した(BD FACS Canto)。細胞を洗浄し、ヒトP2X7特異的Nb 3c23−3c23又はマウスP2X7特異的Nb 13A7−13A7(ネガティブコントロール)の非存在(溶媒)又は存在において、Ca2+及びMg2+を用いて添加したPBS(Invitrogen)中に再懸濁し、フローサイトメトリー(BD FACS Canto)により分析した。赤外線ランプを使用し、37℃の一定のサンプル温度を維持した。100秒間にわたる平衡化後、ATPを、最終濃度2mMまで加え、インキュベーションを、最終濃度5μmまでのイオノマイシンの添加前に、100秒間にわたり継続した。図14は、Nb 3c23が、ヒトRPMI8226リンパ腫細胞におけるATP誘導性カルシウム流入を遮断することを実証する。
4人のドナーからのヘパリン化全血液の一定分量を、最終濃度5mMまでのATPの添加及び1時間にわたる37℃でのさらなるインキュベーションの前に、Nb3c23−3c23の非存在又は存在において、2時間にわたり、LPS(1μg/ml)を用いてインキュベートした。血漿を、細胞の遠心分離により調製し、血漿中のIL−1βレベルを、ELISA(R&D Systems)により決定した。***P<0.001(一元配置ANOVA)。図15は、Nb 3c23が、ヒト血液細胞からのIL−1βのATP誘導性放出を遮断することを実証する。
ヘパリン化全血液の一定分量を、最終濃度2mMまでのATPの添加及び1時間にわたる37℃でのさらなるインキュベーションの前に、示した濃度のNb 3c23、3c23−3c23、及び3c23Fcの非存在又は存在において、2時間にわたり、LPS(1μg/ml)を用いてインキュベートした。血漿を、細胞の遠心分離により調製し、血漿中のIL−1βレベルを、ELISA(R&D Systems)により決定した。マウスP2X7特異的Nb13A7を、ネガティブコントロールとして使用した。図16は、ヒト血液細胞からのIL−1βのATP誘導性放出を遮断するNb 3c23の用量応答分析を描写する。
マウス特異的Nbの機能的な効果を、P2X7発現マウス細胞を使用して、さらに評価した。リンパ腫細胞株Yac−1は、マウスP2X7及び毒素関連エクト−ADP−リボシルトランスフェラーゼART2.2を内因性に発現する。これらの細胞上で、P2X7は、細胞外ATPにより、ならびにART2.2により触媒されるR125のNAD+依存的ADPリボシル化により活性化されうる(Adriouch et al., 2008)。Nb13A7は、これらの細胞によるCD62LのNAD+誘導性及びATP誘導性の両方の切断放出を遮断した;二価フォーマット中への変換によって、このNbの遮断効力が著しく増強された。対照的に、Nb14D5は、Yac−1細胞によるCD62LのATP及びNAD+誘導性切断放出を促進した。再び、二価フォーマット中への変換によって、このNbの効力が著しく増強された(図1000b)。Nb14D5の結合は、それ自体で、マウスP2X7のゲーティングを誘導しないが、それは、ATP及びNAD+の両方についてのゲーティングの閾値を下げた(WO2010/070145)。同様に、Nb13A7は、初代T細胞からのCD62LのNAD+及びATP誘導性切断放出を効果的に遮断し、Nb14D5は、それを促進した(図22)。Nb13A7は、また、腹腔マクロファージによるATP誘導性Ca2+流入ならびにIL−1βのATP誘導性プロセシング及び分泌を効果的に遮断した(下の実施例1.18及び1.19を参照のこと)。
マウスP2X7特異的Nb 14D5−14D5、Nb 13A7−13A7又はヒトP2X7特異的Nb 3c23−3c23(ネガティブコントロール)の存在におけるCa2+指示薬Fluo−4を用いて負荷したマウスP2X7トランスフェクトHEK細胞のリアルタイムフローサイトメトリー分析。細胞を、最終濃度250μm又は1mMまで細胞外ATPに曝露し、2分後、濃度5μmでCa2+イオノフォアイオノマイシンに曝露した。図17において実証する通り、Nb13A7は、マウスP2X7を用いて安定的にトランスフェクトされたHEK細胞におけるATP誘導性カルシウム流入を遮断し、Nb14D5は、それを強化する。
Ca2+指示薬Fluo−4を用いて負荷したマウスP2X7トランスフェクトHEK細胞のリアルタイムフローサイトメトリー分析。細胞を、示した濃度のATPを用いて、2分間にわたり、マウスP2X7特異的Nb14D5−14D5、Nb13A7−13A7又はヒトP2X7特異的Nb3c23−3c23を用いた処置の前にインキュベートした。図18において実証する通り、Nb13A7は、マウスP2X7を用いて安定的にトランスフェクトされたHEK細胞におけるATP媒介性カルシウム流入を逆転し、Nb14D5は、それを誘導及び強化する。
マウス腹腔マクロファージを、Ca2+指示薬Fluo−4を用いて負荷した。リアルタイムフローサイトメトリー分析を実施した(BD FACS Canto)。細胞を洗浄し、P2X7強化Nb 14D5又はP2X7拮抗的Nb 13A7(1μg/500μl)の非存在(溶媒)又は存在において、Ca2+及びMg2+を用いて添加したPBS(Invitrogen)中に再懸濁した。赤外線ランプを使用し、37℃の一定のサンプル温度を維持した。120秒間にわたる平衡化後、細胞を、示した濃度の細胞外ATPに曝露し、2分後、最終濃度1μmまでCa2+イオノフォアイオノマイシンへ曝露した。図19において示す通り、Nb13A7は、マウス腹腔マクロファージにおけるATP誘導性カルシウム流入を遮断し、Nb14D5は、それを強化する。
野生型又はP2X7−/−マウスからのヘパリン化血液を、一価Nb(1μg/200μl) 14D5、13A7、又は溶媒の存在において、2時間にわたり、LPS(1μg/ml)を用いて、示した最終濃度までのATPの添加及び30分間にわたる37℃でのさらなるインキュベーションの前に、インキュベートした。a)サンプルを遠心分離し、血漿中のIL−1βレベルをELISA(Biolegend)により分析した。b)赤血球を溶解し、血液白血球を、2つの工程において、最初に、CD11b、Ly−6C、及びLy−6Gについての特異的な蛍光標識結合mAbを用いて染色した。細胞を、次に、プロIL−1β(e-Bioscience)についての染色前に、固定(2% PFA)及び透過処理(0.3%サポニン及び0.1%BSAを含むPBS)した。フローサイトメトリー分析を実施し(BD FACS Canto)、ゲーティングをCD11b+ LY−6Chi単球上で実施した。図20において実証する通り、Nb13A7は、腹腔マクロファージによるIL−1βのプロセシング及び分泌を遮断し、Nb14D5は、それを強化する。
Nbの3つの異なるファミリーを、ヒトP2X7(hP2X7)を発現する細胞上でのパンニングにより、2頭のラマより選択し、hP2X7の特異性について確認した。ファミリーa(1c81、ラマ418)及びb(1c113、ラマ405)を、hP2X7トランスフェクトYac−1及びHEK細胞上で、順次、ファージライブラリーをパニングすることにより選択した。ファミリーc(3c23、ラマ405)を、精製Nbを用いて1c81及び1c113エピトープをマスクし、パニングを繰り返すことにより選択した。Nbを、二価コンストラクト及びNb−Fc融合タンパク質に再フォーマット化した。一価及び二価Hisタグ付きNbを、大腸菌において発現させ、ペリプラズマライセートから、固定化した金属アフィニィークロマトグラフィーにより精製した。FLAGタグ付きNb−Fc融合タンパク質を、HEK細胞において発現させ、HEK細胞上清から、アフィニティークロマトグラフィーにより、固定化した抗FLAG mAb M2上で精製した。Nbの特異性を、ヒトP2X7、マウスP2X7、又はラットP2X7を用いてトランスフェクトしたHEK細胞上で検証した。エピトープ特異性を、選択されたNb及び抗hP2X7 mAb L4を用いた交差遮断分析によりテストした。Nb1c81及び1c113は、L4と共有されるエピトープを認識した。Nb3c23は、別個の非重複エピトープを認識する。Nbを異なるエピトープと組み合わせることによって、ヒト末梢血リンパ球及び単球上での細胞表面P2X7の改善された染色が許された。特に、Nb1c113−Fc及び3c23−Fcは、初代ヒト血液細胞上でのP2X7の発現をモニターするために有用である。Lセレクチン(CD62L)のP2X7依存的なATP誘導性切断放出及びホスファチジルセリン(PS)の外在化を遮断するためのNbの効力を、トランスフェクトHEK細胞、ヒトRPMI−8226リンパ腫細胞、及び初代ヒト末梢血白血球上でテストした。Nb1c81及び3c23は、mAb L4よりも効率的に、P2X7のATP誘導性活性化を遮断した。1c81及び3c23の再フォーマット化した二価Nb−Fc融合タンパク質は、それらの一価対応物よりも5〜20倍増強された、P2X7の活性化を遮断するための効力を示した。実施例1.15〜1.19は、ATP誘導性カルシウム流入及びIL−1βのATP誘導性放出に対するマウス特異的Nbの機能的な効果を示し、それは、ヒトP2X7特異的Nbを用いた結果を写す(実施例1.12〜1.14)。実施例1.20は、Nb13A7及び14D5が、リンパ節、脾臓、及び肝臓からの初代細胞上でP2X7の発現をモニターするための有用なツールであることを示す。
インビボでの全身注射後にP2X7を調節するナノボディの能力を評価するために、P2X7のNAD+及びATP媒介性ゲーティングに高い感度を提示することが以前に示されている2つの調節T細胞サブセット:CD4+CD25+Treg及びiNKT細胞をさらに精緻化した(Hubert et al. 2010 J. Exp. Med. 207 pp 2561-2568;Scheuplein et al., 2010)。
ナノボディを、マウスの尾静脈により静脈内注射した。マウスを1.5時間及び24時間後に屠殺し、P2X7活性化の遮断又は増強についてインビボ及びエクスビボの両方で分析した。
14D5−14D5−Alb8 Nbの注射は、顕著に、注射後2時間目、脾臓から回収したTregの分解における2倍低下及び肝臓から回収したiNKT細胞のさらにより劇的な低下をもたらした(図11a)。Treg数(CD4+細胞のパーセンテージとして)は、14D5−14D5−Alb8を用いて注射したマウスにおける4%(n=3)対13A7−13A7−Alb8を用いて注射したマウスにおける9%(n=3)及びダミーNbを用いて注射したマウスにおける12%(n=1)まで下がった。iNKT細胞数(CD3ポジティブ細胞のパーセンテージとして)は、13A7−13A7−Alb8及び14D5−14D5−Alb8を用いて処置したマウスにおける、それぞれ10%対45%まで、ダミーNbを用いて処置したマウスにおける55%(n=1)まで下がった。注射後24時間目、Tregs及びiNKT細胞の数は、14D5−14D5−Alb8を用いて注射したマウスにおいて部分的な回復を示したが、しかし、依然として、13A7−13A7−Alb8又はDum−Alb8−Dum(ダミーNb)を用いて注射したマウスのそれを下回っていた。別の実験において、8G11−8G11−Alb8を用いて注射したマウスは、ダミーNb注射マウスのそれと同程度のTregs及びiNKT細胞の数を示した(図11c)。14D5−14D5−Alb8注射マウスの脾臓から回収されたT細胞は、ダミーNbを用いて注射したマウスと比較し、外因性NADを用いた37℃での15分間のインキュベーションに応答し、増強したCD27の切断放出を示した(図11b)。
HLE−Nbsの腹腔内注射後2時間目に調製された脾臓及び肝臓細胞上で実施した機能アッセイの結果によって、P2X7上での8G11−8G11−Alb8及び13A7−13A7−Alb8の両方の遮断効果が明らかになる(図11c)。
実施例3.1:方法論
再フォーマット化Nbを、治療的な潜在能について、実験的に誘導された炎症:抗有足細胞抗体誘導性の糸球体腎炎のマウスモデルにおいてテストした。以前の試験では、P2X7欠損マウスが、これらの疾患のより軽度の形態を発生することが示されており、野生型マウスにおけるP2X7の薬理学的阻害が、P2X7の遺伝子欠失の有益な効果を模倣しうるとの仮説に導く。逆に、P2X7の薬理学的活性化は、これらの炎症応答を強化しうる。
マウス有足細胞を用いて免疫化した動物からの血清の全身注射は、腎臓の遅く進行する炎症を起こす。尿中のアルブミン(アルブミン尿)の出現は、糸球体濾過装置への損傷の読み出しとして使用することができる。尿の容積は広く変動しうるため、主に水分摂取量に依存して、尿中のアルブミン濃度を、クレアチニンの濃度に対して、正常化することが一般的である。疾患進行は、ConA誘導性肝炎のそれよりもずっと遅い。野生型マウスにおいて、アルブミン尿は、通常、血清注射後7−9日目から検出可能である。動物は、通常、疾患に屈し、血清注射後14〜15日目に屠殺しなければならない。
尿中のアルブミンをELISAにより定量化し、クレアチニンレベルを、自動化測定により決定した(図12A)。屠殺の日、血液尿素窒素、血清トリグリセリド、及び血清コレステロールレベルを自動測定により決定した;血清中IL−6及び尿中MCP−1をELISAにより定量化した。有意性を、マンホイットニーU検定を用いて評価した(図12B)。尿分析の結果は、抗有足細胞血清及びダミーNBを用いて処置した動物における検出可能なタンパク尿を示し、9日目に開始し、15又は21日の実験終了まで、着実に増加する尿アルブミンレベルを伴う(図12A)。P2X7アンタゴニスト13A7−13A7−ALB8を用いて処置されたマウスは、ダミーNbを用いて処置されたマウスよりも、屠殺の時にずっと低い尿中アルブミンレベルを示した(図12)。これらの差は、統計的に有意であった(p<0.05)。対照的に、P2X7増強14D5−14D5−ALB8を用いて処置されたマウスは、血清注射後3日目に既に、検出可能なアルブミン尿を発生し、ダミーNb又は13A7−13A7−ALB8処置マウスよりも有意に高い尿中アルブミンを、実験の経過を通じて提示し続けた。増強14D5−14D5−ALB8を受けるマウスにおけるより重度の腎炎症候群と一致して、これらのマウスは、また、血清トリグリセリド、コレステロール、及びクレアチニンの著しくより高いレベルを、15及び21日目に示し、13A7−13A7−ALB8を用いて処置されたマウスは、これらの血清パラメーターの正常レベルを示した。
屠殺の日(抗有足細胞抗体の注射後21日目、ナノボディの最終注射後3日目)、脾細胞を、NAD+の非存在(PBS)又は存在において、30分間にわたりインキュベートし、次に、CD4、CD25、及びCD27についてFACS分析前に染色した。ゲーティングは、CD4+CD25+Treg上で実施した。P2X7アゴニストNb14D5を用いて処置されたマウスからのTregは、より低い割合のCD27+T細胞を含んだが、その全てが、CD27のNAD+誘導性喪失に感受性であった;P2X7アンタゴニストNb13A7を用いて処置されたマウスからのTregは、CD27のNAD+誘導性切断放出に耐性であった。これらの結果は、脾臓Tregが、屠殺の日になおも、P2X7特異的Nbで、コートされたことを示す。
屠殺の日(抗有足細胞抗体の注射後21日目)、腎臓切片を、過ヨウ素酸シッフ染色(PAS)を用いて染色した(図12D上部)。尿細管性タンパク質キャストを、アスタリスクによりマークする。腎臓切片を、DNA染色色素draq5、T細胞マーカーCD3に対する蛍光色素結合mAb、及びネフリン(腎臓濾過障壁での有足細胞膜タンパク質)に対する蛍光色素結合mAbを用いて染色した(図12E、下)。有足細胞核を、アスタリスクによりマークする。Nb14D5を用いて処置されたマウスからの腎臓切片は、Nb13A7又はコントロールNbを用いて処置されたマウスよりも、CD3+T細胞のより強力な糸球体浸潤及びネフリンについての破壊染色を示す。
Yac−1リンパ腫細胞株でのP2X7のヌクレオチド誘導性活性化のインビトロ分析での結果は、二価及びHLE−Nbの同様の機能的な効力を明らかにした。2つのP2X7アンタゴニストHLE−Nb13A7及び8G11は、両方が、ATP誘導性活性化よりも、P2X7のNAD(ADPリボシル化)誘導性活性化のより効率的な遮断を示し、13A7は、一貫して、8G11よりも良い遮断有効性を示した。P2X7増強14D5 Nbの場合において、価数を一価から二価へ増加させることは、著しく増強された効力を伴ったが、さらなる価数の増加は、効力において、わずかなさらなる増加だけを示した。
まとめると、このプロジェクト拡張の結果は、T細胞上のP2X7イオンチャネルの機能をインビボで操作するためにHLE Nbを使用することの実行可能性を強調する。腎炎のマウスモデルを用いた実験は、P2X7遮断Nbが、この及び他の疾患において過剰な炎症反応の勢いを弱める際に、治療的に有益な効果を有することを示す。
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)ペプチド残基35〜55を使用した、MS、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の動物モデルを、野生型C57BL6マウスにおいて誘導する。疾患マウスは、抗P2X7 Nb又はダミーNbを受ける。疾患進行を、臨床徴候の出現、脳炎症及び神経損傷を評価するための免疫細胞化学染色により、及びT細胞サイトカイン産生の測定によりモニターする。
EAEを、合成ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35〜55(MOG35−55)を使用し、C57BL/6マウスにおいて能動的に誘導する(記載されている通り)(Matute et al., 2007)。マウスを、500μgのマイコバクテリウム・ツベルクローシスを含む100μLのCFAと混合した、100μLのPBS中に溶解した300μgのMOG35-55の乳剤を用いて皮下注射(1つの後肢において隣接領域中に2つの100μL注射)する。MOG35-55注射直後、動物は、百日咳毒素(200μLのPBS中のPTの200ng)の腹腔内注射を受ける。2日後、マウスは第2PT注射を受け、1週間後、MOG35−55の追加免疫注射を受ける。臨床徴候を、5ポイントスケールでスコア化する:グレード0、無臨床徴候;1、尾の引きずり及び/又は損なわれた立ち直り;2;1つの後肢での不全麻痺;3;2つの後肢での不全麻痺;4;瀕死;5、死亡。スコアリングは、盲検化研究者により毎日同じ時間に行われる。
ナノボディを、MOG35−55免疫化プロトコールと同時に、尾静脈により静脈内注射する。5−6匹のマウスの群が、ダミーNb、13A7−13A7−ALB8、又は14D5−14D5−ALB8を用いた注射を受ける(実施例2において記載する通り)。
脾細胞を、追加免疫MOG注射/Nb注射後4日目又は21日目に、MOG35−55免疫化EAEマウスから単離する。赤血球細胞の溶解後、脾細胞を、24ウェルプレート中に、1ウェル当たり2×105個細胞の密度で、400μlのRPMI培地中にプレーティングし、免疫原(0又は25μg/mlのMOG35−55ペプチド)を用いてインキュベートする。1日後、培地の一定分量を、IL−17又はIFNγのレベルについて、ELISAにより、推奨手順に従ってアッセイする。各々のサンプルを、少なくとも3通りにおいてアッセイし、ng/mlサイトカインの算出を標準曲線から決定し、MOGペプチドの存在に起因する増加を決定する。活性化した脾細胞により産生された64の炎症性分子の半定量分析を、マウスサイトカイン抗体アレイIII(例えば、RayBiotech)を使用し、製造者のプロトコールに従って行う。
マウス脳を、生理食塩水を用いて灌流し、4%パラホルムアルデヒド中で一晩後固定した。脳半球の脱水、洗浄、乾燥、及び固化は、標準的なプロトコールに従う。組織を、8μm厚に切断する。矢状切片(8又は10μm)は、正中線から始めて切断し、マウントする。切片のさらなる調製は、標準的なプロトコールに従っている。各々の動物からの4つの連続切片を、嗅球から背側第三脳室までの領域中に存在する浸潤細胞の数について分析する。全ての染色切片の白黒画像は、10×対物レンズを用いた同じ露光時間を使用して得られる。小さな丸い好ヘマトキシリン(hematoxylinophyllic)核を含む特定の視野を定義し、コントラストを調整し、より大きな丸い細胞、恐らくは、オリゴデンドロサイトをカウントしないようにする。データを、mm2当たりの細胞数として提示する。
前述の文書による明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするために十分であると考えられる。本発明は、提供する実施例により、範囲において限定されない。なぜなら、実施例は、本発明の特定の局面及び実施態様の例証として意図されるからである。他の機能的に等価の実施態様が、本発明の範囲内にある。本発明の種々の改変が、本明細書において示し、記載するものに加えて、前述の記載から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に入るであろう。本発明の利点及び目的は、本発明の各々の実施態様により必ずしも包含されない。
Claims (28)
- 50nM未満のKdでP2X7に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインを少なくとも1つ含む、P2X7関連疾患の処置における使用のためのポリペプチドであって、ここで、該P2X7への該免疫グロブリン単一可変ドメインの結合が、P2X7の活性を阻害するポリペプチド。
- P2X7関連疾患が、MS、IBD、神経因性疼痛、てんかん、脳卒中、糖尿病、高血圧、及び癌からなる群より選択される、請求項1記載のポリペプチド。
- P2X7がヒトP2X7である、請求項1又は2記載のポリペプチド。
- 免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号1、配列番号2、及び/又は配列番号3に結合する、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチドであって、ここで、少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、式1:
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4 (1);
ここで、FR1〜FR4が、フレームワーク領域1〜4を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域(FR)であり;そして
− ここで、CDR1は:
− 配列番号34〜47、
− 配列番号34〜47と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
− 配列番号34〜47と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれ、そして
− ここで、CDR2は:
− 配列番号62〜75、
− 配列番号62〜75と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
− 配列番号62〜75と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群よりら選ばれ、そして
− ここで、CDR3は:
− 配列番号90〜103、
− 配列番号90〜103と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
− 配列番号90〜103と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれる;
のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。 - フレームワーク領域(FR)が、配列番号6〜19のFRと80%を上回る配列同一性を有する、請求項5記載のポリペプチド。
- 請求項5又は6記載のポリペプチドであって、少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、免疫グロブリン単一可変ドメインの群:
− CDR1は配列番号34であり、CDR2は配列番号62であり、及び、CDR3は配列番号90である;
− CDR1は配列番号35であり、CDR2は配列番号63であり、及び、CDR3は配列番号91である;
− CDR1は配列番号40であり、CDR2は配列番号68であり、及び、CDR3は配列番号96である;
− CDR1は配列番号36であり、CDR2は配列番号64であり、及び、CDR3は配列番号92である;
− CDR1は配列番号37であり、CDR2は配列番号65であり、及び、CDR3は配列番号93である;
− CDR1は配列番号38であり、CDR2は配列番号66であり、及び、CDR3は配列番号94である;
− CDR1は配列番号39であり、CDR2は配列番号67であり、及び、CDR3は配列番号95である;
− CDR1は配列番号41であり、CDR2は配列番号69であり、及び、CDR3は配列番号97である;
− CDR1は配列番号42であり、CDR2は配列番号70であり、及び、CDR3は配列番号98である;
− CDR1は配列番号43であり、CDR2は配列番号71であり、及び、CDR3は配列番号99である;
− CDR1は配列番号44であり、CDR2は配列番号72であり、及び、CDR3は配列番号100である;
− CDR1は配列番号45であり、CDR2は配列番号73であり、及び、CDR3は配列番号101である;
− CDR1は配列番号46であり、CDR2は配列番号74であり、及び、CDR3は配列番号102である;及び
− CDR1は配列番号47であり、CDR2は配列番号75であり、及び、CDR3は配列番号103である;
より選ばれる、ポリペプチド。 - ポリペプチドが、配列番号6〜19と80%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択される、請求項5〜7のいずれか一項記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが、配列番号6〜19と90%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択される、請求項5〜7のいずれか一項記載のポリペプチド。
- P2X7に結合することができる少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 請求項10に記載のポリペプチドであって、少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインが式1;
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4 (1);
ここで、FR1〜FR4が、フレームワーク領域1〜4を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域(FR)であり;そして
− ここで、CDR1は:
− 配列番号34〜47、
− 配列番号34〜47と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
− 配列番号34〜47と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれ、そして
− ここで、CDR2は:
− 配列番号62〜75、
− 配列番号62〜75と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
− 配列番号62〜75と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれ、そして
− ここで、CDR3は:
− 配列番号90〜103、
− 配列番号90〜103と少なくとも80%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
− 配列番号90〜103と3、2、又は1アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれる;
のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。 - フレームワーク領域(FR)が、配列番号6〜19のFRと80%を上回る配列同一性を有する、請求項11記載のポリペプチド。
- 請求項11又は12記載のポリペプチドであって、ここで、少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、免疫グロブリン単一可変ドメインの群:
− CDR1は配列番号34であり、CDR2は配列番号62であり、及び、CDR3は配列番号90である;
− CDR1は配列番号35であり、CDR2は配列番号63であり、及び、CDR3は配列番号91である;
− CDR1は配列番号40であり、CDR2は配列番号68であり、及び、CDR3は配列番号96である;
− CDR1は配列番号36であり、CDR2は配列番号64であり、及び、CDR3は配列番号92である;
− CDR1は配列番号37であり、CDR2は配列番号65であり、及び、CDR3は配列番号93である;
− CDR1は配列番号38であり、CDR2は配列番号66であり、及び、CDR3は配列番号94である;
− CDR1は配列番号39であり、CDR2は配列番号67であり、及び、CDR3は配列番号95である;
− CDR1は配列番号41であり、CDR2は配列番号69であり、及び、CDR3は配列番号97である;
− CDR1は配列番号42であり、CDR2は配列番号70であり、及び、CDR3は配列番号98である;
− CDR1は配列番号43であり、CDR2は配列番号71であり、及び、CDR3は配列番号99である;
− CDR1は配列番号44であり、CDR2は配列番号72であり、及び、CDR3は配列番号100である;
− CDR1は配列番号45であり、CDR2は配列番号73であり、及び、CDR3は配列番号101である;
− CDR1は配列番号46であり、CDR2は配列番号74であり、及び、CDR3は配列番号102である;及び
− CDR1は配列番号47であり、CDR2は配列番号75であり、及び、CDR3は配列番号103である;
より選ばれる、ポリペプチド。 - 請求項10〜13のいずれか一項記載のポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドが、配列番号6〜19と80%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を各々有する少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド。
- 請求項10〜13のいずれか一項記載のポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドが、配列番号6〜19と90%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を各々有する少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド。
- P2X7に結合することができる少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項10〜15のいずれか一項記載のポリペプチドであって、ここで、P2X7に結合することができる前記の少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、同じでありうる又は異なりうるポリペプチド。
- 結合Alb8(配列番号126)又はAlb11(配列番号125)などのヒト血清アルブミンに結合している免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが、配列番号118〜124と80%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項1〜17のいずれか一項記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが、配列番号118〜124と90%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項1〜18のいずれか一項記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが、配列番号118〜124からなる群より選択される、請求項1〜19のいずれか一項記載のポリペプチド。
- P2X7に対して向けられた少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、ここで
a)少なくとも1つの第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、P2X7の第1抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられ;及び、ここで、
b)少なくとも1つの第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、第1抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造とはそれぞれ異なる、前記P2X7の第2抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられるポリペプチド。 - 請求項1〜21のいずれか一項記載のポリペプチドであって、ここで、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために適しているアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために適しているアミノ酸配列、dAb、dAbとしての使用のために適しているアミノ酸配列、ナノボディ、VHH配列、ヒト化VHH配列、又はラクダ化VH配列からなるポリペプチド。
- アルファスクリーンアッセイにおけるIC50が30nM以下である、請求項1〜22のいずれかに記載のポリペプチド。
- アルファスクリーンアッセイにおけるIC50が3nM以下である、請求項1〜23のいずれかに従ったポリペプチド。
- 医薬的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項1〜24のいずれかに従ったポリペプチド。
- 請求項1〜25のいずれか一項記載のポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、以下の工程:
a)適した宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適した発現系において、請求項1〜25のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列を発現させること;場合により、以下が続く:
b)前記免疫グロブリン単一可変ドメイン又は前記ポリペプチドを単離及び/又は精製すること
を少なくとも含む、方法。 - 少なくとも以下の工程:
a)免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーを提供すること;及び
b)P2X7及び特にヒトP2X7(配列番号1〜3)に結合することができる及び/又はそれについての親和性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインについて、免疫グロブリン単一可変ドメインの前記セット、コレクション、又はライブラリーをスクリーニングすること;及び
c)P2X7及び特にヒトP2X7(配列番号1〜3)に結合することができる及び/又はそれについての親和性を有するアミノ酸配列を単離すること
を含む、P2X7及び特にヒトP2X7(配列番号1〜3)に対して向けられた免疫グロブリン単一可変ドメインをスクリーニングするための方法。 - 50nM未満のKdでP2X7に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインであって、P2X7への免疫グロブリン単一可変ドメインの結合によって、P2X7の活性が阻害される、免疫グロブリン単一可変ドメイン。
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