JP2018162262A - 制御性t細胞機能を調節する方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】転移性前立腺がんをはじめとするがん患者のための、より効果的で手頃な価格のワクチン/薬剤を提供する。【解決手段】シプロフロキサシン等から選択される化合物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物。本発明の薬剤組成物は、抗原、および/またはアジュバントをさらに含んでなってもよい。MyD88−IRAK4シグナル伝達経路を活性化するヒトToll様受容体(TLR)8に対するリガンドを含んでなる医薬組成物を使用して、制御性T(Treg)細胞媒介性の免疫抑制を阻害する方法、またはより一般的には、免疫応答を増大させる方法もまた提供される。本発明は、CD25、GITR、およびFoxP3を発現して、IL−10を分泌し、CD4+T細胞の活性化を抑制できる、CD4+Treg細胞を使用して、Treg細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤をスクリーニングする方法をさらに提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、免疫学に関し、具体的には宿主の免疫応答を強化する方法、より具体的には、T−reg細胞が宿主の免疫応答を抑制する能力を逆転させる方法に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、2013年3月14日に出願された米国仮特許出願第61/781,024号明細書の優先権を主張する。その開示は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
本出願は、2013年3月14日に出願された米国仮特許出願第61/781,024号明細書の優先権を主張する。その開示は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
免疫系を利用して、感染性因子や悪性細胞などを根絶することは、有望な治療的アプローチである。しかし最近まで、がん治療におけるその応用からは、散発的な臨床的成功しか得られていない(Di Lorenzo et al.,2011;Lesterhuis et al.,2011;Rosenberg,2011)。最近、FDAによって、免疫療法に基づくワクチン/薬剤シプロイセルT(プロベンジ(登録商標))およびイピリムマブ(Yervoy(登録商標))が認可されたことは、免疫療法分野の画期的出来事に相当する(Hodi et al.,2010;Kantoff et al.,2010)。さらに、黒色腫のためのgp100ペプチドの第III相臨床試験からも、非常に有望な臨床結果が得られている(Schwartzentruber et al.,2011)。それでもなお、これらの薬剤について報告された臨床上の便益は、完全寛解および恒久的治癒にはほど遠い。シプロイセルTの場合、客観的な腫瘍退縮または実質的なPSAレベル変化のない、わずか4.1ヶ月の延命効果が報告されている一方で、これらの輸液のコストは93,000米ドルである。
したがって、転移性前立腺がんをはじめとするがん患者のための、より効果的で手頃な価格のワクチン/薬剤に対する大きな必要性が、なおもある。
ペプチドベースのワクチン、そしてFDA認可ワクチン療法(Buonerba et al.,2011)の比較的低い臨床的有効性の一因たり得る多数の要素の中でも、腫瘍微小環境内の制御性T(T−regまたはTreg)細胞媒介性免疫抑制をはじめとする強力な負の調節機構は、がんワクチンおよび薬剤の治療効果の改善にとって大きな障害である(Curiel et al.,2004;Wang et al.,2004;Wang and Wang,2007;Zou,2006)。例えば、腫瘍部位にある既存のCD4+制御性T(Treg)細胞は、抗腫瘍免疫応答を強力に阻害してもよく、したがって効果的ながん免疫療法の大きな障害となっている(Wang et al.,2004;Wang et al.,2005;Wrzesinski and Restifo,2005)。CD4+Treg細胞媒介性の免疫抑制は、動物腫瘍モデルおよびがん患者で十分に立証されており(Berendt and North,1980;Mukherji et al.,1989)、全CD4+T細胞集団中のCD4+CD25+Treg細胞比の増大が、肺、乳房、および卵巣腫瘍をはじめとする、異なる種類のがんがある個人で検出されている(Curiel et al.,2004;Woo et al.,2001)。本発明者らによる研究は、腫瘍部位の抗原特異的CD4+Treg細胞の存在をさらに実証し、これらは、腫瘍部位で抗原特異的および局所免疫寛容を誘発する(Wang et al.,2004;Wang et al.,2005)。したがって、免疫抑制を克服することが、より効果的ながんワクチンおよび薬剤開発を成功裏に開発する鍵であってもよい。幾人かの研究者らが、抗CD25+抗体によってCD4+CD25+Treg細胞を枯渇させることを試みている一方で(Mahnke et al.,2007;Morse et al.,2008;Powell et al.,2008;Rech and Vonderheide,2009)、他の研究者らは、シクロホスファミドを使用してTreg細胞を枯渇させている(Audia et al.,2007;Ghiringhelli et al.,2007)。しかしCD25は、CD4+CD25+Tregおよび新たに活性化されたエフェクターT細胞の双方の上で発現するので、抗CD25抗体(オンタックおよびダクリズマブ)およびシクロホスファミドは、Treg細胞枯渇に対して特異的ではない。
Treg細胞は、表現型、サイトカインプロファイルまたは抑制機構に基づいて、異なるサブセットに分類され得る。CD4+T細胞の小規模な母集団に相当する天然起源CD4+CD25+Treg細胞は、抗原刺激なしに胸線から誘導され、細胞接触依存性機序を通じて免疫応答を抑制し得る(Sakaguchi,2004;Shevach,2002)。対照的に、Tr1およびTh3などの抗原誘発性Treg細胞は、抗原による刺激後に末梢で誘発され、一般に、抑制性サイトカインIL−10および/またはTGF−βを通じて免疫応答を抑制する。(Levings et al.,2002;Shevach,2002;von Boehmer,2005)。本発明者らの以前の研究は、抗原(LAGE1またはARTC1)特異的CD4+Treg細胞が、天然起源CD4+CD25+Treg細胞により共有される細胞接触依存性機序を通じて、免疫応答を抑制することを実証する(Wang et al.,2004;Wang et al.,2005)。天然起源CD4+CD25+Treg細胞およびLAGE1特異的Treg細胞の双方の抑制機能は、DC不在下で、ポリグアノシンオリゴヌクレオチド(PolyG−OND)などのTLR8リガンドによって、直接、逆転され得る(Peng et al.,2005)。CD4+Treg細胞は腫瘍部位に豊富にあるので、本発明者らは、これらのTreg細胞の別のサブセットが、がん患者からの腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)中に存在するのではないかと仮定した。この予想を試験する研究は、その免疫抑制機能が、IL−10またはTGF−β(またはその双方)以外の可溶性要素によって媒介される、抗原特異的CD4+Treg細胞の新規サブセットを同定した。
PolyG−ONDによる治療は、Treg細胞の機能逆転をもたらしたが(Kiniwa et al.,2007;Peng et al.,2005;Peng et al.,2007)、PolyG−ONDが、ヒトおよびマウスTreg細胞の抑制機能を逆転させ得るかどうかは、明らかでない。
Treg細胞の免疫抑制性能力を操作するのに利用し得る、方法および治療薬に対する強い必要性がある。
本明細書に記載されるのは、IL−10またはTGF−β非依存性の可溶性因子媒介機構を介して免疫応答を抑制する、CD4+Treg細胞の新規サブセットの作成および特性解析である。枯渇ストラテジーに伴う、免疫抑制および可能な問題を克服する試みにおいて、本発明者らは、新たに同定されたTreg細胞を使用するスクリーニングシステムを開発し、Treg細胞の抑制機能を遮断できる化合物を同定した。これらの新たに同定された化合物による、異なる処理時間でのTreg細胞の処理からは、Treg細胞の非抑制状態を維持する異なる時間窓がもたらされた。マウスTLR8は機能性でないので、ヒトTLR8遺伝子組換えマウスが作成され、Treg細胞を阻害する本発明の化合物による処理が、抗腫瘍免疫を増強することが示された。
Treg細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤は、宿主の免疫応答を増強でき、がんまたは感染症など、患者の免疫系の増強が所望される疾患または病状を治療するのに使用されてもよい。
表1から表3に列挙される化合物1、2、3、4、5、6、7、13、22、23、24、および25によって表わされる化合物をはじめとするが、これに限定されるものではない、Treg細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性を阻害または増強する化合物、そして化合物を含んでなる医薬組成物が、開示される。
したがって、一実施形態では、本発明は、表1から表3に記載される化合物1、2、3、4、5、6、7、13、22、23、24、および25からなる群から選択される化合物の薬理有効量と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物を提供する。本発明の薬剤組成物は抗原をさらに含んでなってもよく、それは、ペプチド抗原、タンパク質抗原、ポリヌクレオチド抗原、または多糖類抗原であってもよい。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、アジュバントをさらに含んでなってもよい。
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする哺乳類において、制御性T(Treg)細胞媒介性の免疫抑制を阻害する方法、またはより一般的には、免疫応答を増強する方法を提供し、方法は、MyD88−IRAK4シグナル伝達経路を活性化するヒトToll様受容体(TLR)8に対するリガンドを含んでなる医薬組成物の薬理有効量を、哺乳類に投与するステップを含んでなる。リガンドは、ssRNA40、ssRNA33、CpG、Poly−G10、レシキモド、ロキソリビン、フラジェリン、LPS、およびPam3CSK4からなる群から選択され;または化合物1、2、3、4、5、6、7、13、22、23、24、および25からなる群から選択される。
一実施形態では、哺乳類はヒトである。哺乳類は、がんに罹患していてもよく、またはがんを発症するリスクがあってもよい。哺乳類に、がん特異的抗原を含んでなるがんワクチンの免疫原性量をさらに投与してもよい。別の実施形態では、哺乳類にアジュバントがさらに投与される。アジュバントは、抗原と共に投与されてもよく、または抗原と共役していてもよい。
別の実施形態では、哺乳類に、化学療法剤の有効量もまた投与してもよい。
哺乳類はまた、感染症を患っていてもよく、または発症するリスクがあってもよい。
本発明は、1)候補化合物を提供するステップと、2)CD4+Treg細胞を提供するステップと、3)候補化合物の存在または不在下で、未感作CD4+T細胞をCD4+Treg細胞と共に培養するステップと、4)候補化合物の存在または不在下で、未感作CD4+T細胞の増殖速度を測定するステップと、5)候補化合物存在下の増殖速度と、候補化合物不在下の増殖速度とを比較するステップとを含んでなり、未感作CD4+T細胞の増殖速度が、その存在下でその不在下よりも高い候補化合物が、CD4+Treg細胞の阻害を逆転させると判定されて阻害剤として選択される、Treg細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤をスクリーニングする方法をさらに提供する。CD4+Treg細胞は、CD25、GITR、およびFoxP3を発現して;IL−10を分泌し、宿主の免疫応答を阻害できる。CD4+Treg細胞は、抗原に特異的であってもよい。一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、特異的抗原を提示するDCなどの抗原提示細胞(APC)の存在下で、CD4+T細胞を培養するステップを含む。CD4+T細胞の増殖速度は、CD4+T細胞の[3H]−チミジン取り込み速度によって、判定されてもよい。
本発明の化合物または医薬組成物を単独で、または抗原製剤またはワクチンなどのその他の治療薬と組み合わせて使用して、それを必要とする患者(例えばがん患者、または感染症に罹患している患者)を治療する方法もまた提供される。
自己組織および腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を抑制することで、CD4+制御性T(Treg)細胞が自己免疫寛容を誘発する強力な能力は十分に認識されているが、Treg細胞の異なるサブセットが利用する抑制機構については、ほとんど理解されていない。本発明者は、本明細書において、特有の免疫抑制機序がある、抗原特異的CD4+Treg細胞の新規サブセットを開示する。この抗原特異的CD4+Treg細胞の新規サブセットは、それらのCD25、GITR、およびFoxP3マーカーの発現と、それらのIL−10分泌について、その他のTreg細胞と類似するが、IL−10およびTGF−β以外の可溶性因子を通じて、免疫応答を阻害する。抑制活性は、MyD88−IRAK4経路を活性化するヒトToll様受容体(TLR)8に対するリガンドにより、Treg細胞を処理することで逆転させ得ることが分かり、TLR8−MyD88シグナル伝達が、免疫抑制に関与する可溶性分子を調節する、新規機序が示唆された。
したがって本発明は、CD4+制御性T(Treg)細胞が、宿主の免疫応答を免疫抑制する効果を逆転させる方法を提供する。本発明はまた、免疫賦活性組み合わせと、本発明の免疫賦活性組み合わせを対象に投与するステップを含む、治療的および/または予防的方法とを提供する。本発明はまた、CD4+制御性T(Treg)細胞が、宿主の免疫応答を免疫抑制する効果を阻害する分子をスクリーニングする方法も提供する。本発明の方法および組成物は、免疫応答増大を提供して、特にがん特異的抗原ベースのワクチンによるがんの予防または治療における、特定の免疫学的治療の効力を改善し得る。
薬剤としての応用本発明のTreg細胞阻害剤は、様々な炎症性疾患、喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性疾患(アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性好酸球性胃腸炎など)、腎炎、腎障害、肝炎、関節炎、慢性関節リウマチ、乾癬、鼻炎、結膜炎、虚血再灌流傷害、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、急性呼吸窮迫症候群、細菌感染症に伴うショック、糖尿病、自己免疫疾患、移植拒絶反応、免疫抑制、がん転移、後天性免疫不全症候群などを予防および/または治療する薬剤として有用である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、抗原をさらに含んでもよい。存在する場合、抗原は、組み合わせの別の成分との併用で、抗原に対する免疫応答を生じるのに有効な量で投与してもよい。免疫応答を生じるのに有効な量を構成する抗原の特定の量は、当業者によって容易に判定され得る。
抗原は、医薬組成物のいずれかの成分と共に、同時にまたは順次投与してもよい。したがって、抗原は、単独で、または(例えば本発明のTreg抑制因子をはじめとする)全身免疫応答の刺激物質である、1つまたは複数のアジュバントとの混合物中で、投与してもよい。いくつかの実施形態では、抗原は、1つのアジュバントに関して同時に(例えば混合物中で)投与してもよいが、1つまたは複数の追加的なアジュバントに関して順次投与してもよい。
抗原と医薬組成物のその他の成分との逐次同時投与は、抗原とその他の成分が同時投与されないにもかかわらず、それぞれが治療部位に同時に存在するように、その中で抗原とその他の医薬組成物の少なくとも1つの成分とが、投与される場合を含み得る。抗原と免疫賦活性組み合わせのその他の成分との逐次同時投与は、その中で抗原または医薬組成物の少なくとも1つのその他の成分が治療部位から除去されるが、除去される抗原またはその他の成分の少なくとも1つの細胞効果(例えばサイトカイン産生、特定細胞集団の活性化など)が、医薬組成物の少なくとも1つまたは複数の追加的成分が治療部位に投与されるまで、治療部位で持続する場合もまた含み得る。
抗原は、例えば、CD8+T細胞応答、NK T細胞応答、γ/σ T細胞応答、またはTH1抗体応答の1つまたは複数をはじめとする、TH1免疫応答を生じる能力がある、いずれかの物質であり得る。適切な抗原としては、ペプチド;ポリペプチド;脂質;糖脂質;多糖類;炭水化物;ポリヌクレオチド;プリオン;生きたまたは不活性化細菌、ウイルスまたは真菌;および細菌、ウイルス、真菌、原生動物、腫瘍由来または生物由来の抗原、毒素または類毒素が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、特定の現在の実験的抗原、特に、強力な免疫応答を生じさせない、組換えタンパク質、糖タンパク質、およびペプチドなどの物質を、本発明のTreg細胞抑制因子化合物に関連して使用し得ることも検討される。例示的な実験的サブユニット抗原としては、アデノウイルス、AIDS、水痘、サイトメガロウイルス、デング、ネコ白血病、家禽ペスト、A型肝炎、B型肝炎、HSV−1、HSV−2、豚コレラ、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、日本脳炎、はしか、パラインフルエンザ、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス、疣贅、および黄熱病などのウイルス性疾患に関連するものが挙げられる。特定の実施形態では、抗原は、がん抗原または腫瘍抗原であってもよい。がん抗原および腫瘍抗原という用語は同義的に使用されて、がん細胞によって差次的に発現される抗原を指す。
本発明の薬剤組成物は、細胞媒介性の免疫応答によって治療可能な病状を治療的に処置するのに利用し得る。このような組み合わせは、少なくとも治療有効量のTreg細胞抑制因子を含有し得て、治療有効量の抗原をさらに含んでもよい。
医薬組成物は、治療計画において単剤として、または抗ウイルス剤や抗生物質などの別の治療薬との組み合わせで、投与し得る。
本発明の医薬組成物は、それらが免疫応答を増強する能力のために、(a)アデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、HSV−I、HSV−II、CMV、またはVZV)、ポックスウイルス(例えば、痘瘡またはワクシニア、または伝染性軟属腫などのオルソポックスウイルス)、ピコルナウイルス(例えば、ライノウイルスまたは腸内ウイルス)、オルソミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、および呼吸器合胞体ウイルス(RSV))、コロナウイルス(例えばSARS)、パポバウイルス(例えば、性器疣贅、尋常性肬贅、または足底疣贅を引き起こすものなどの乳頭腫ウイルス)、ヘパドナウイルス(例えばB型肝炎ウイルス)、フラビウイルス(例えば、C型肝炎ウイルスまたはデングウイルス)、またはレトロウイルス(例えばHIVなどのレンチウイルス)による感染に起因する疾患などのウイルス性疾患;(b)例えば、エシェリキア属(Escherichia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、サルモネラ属(Salmonella)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、シゲラ属(Shigella)、リステリア属(Listeria)、アエロバクター属(Aerobacter)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、クラミジア属(Chlamydia)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、ナイセリア属(Neisseria)、クロストリジウム属(Clostridium)、バチルス属(Bacillus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、カンピロバクター属(Campylobacter)、ビブリオ属(Vibrio)、セラチア属(Serratia)、プロビデンシア属(Providencia)、クロモバクテリウム属(Chromobacterium)、ブルセラ属(Brucella)、エルシニア属(Yersinia)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、またはボルデテラ属(Bordetella)などの細菌による感染に起因する疾患などの細菌疾患;(c)クラミジア;カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコッカス髄膜炎をはじめとするが、これに限定されるものではない真菌疾患;またはマラリア、ニューモシスチスカリニ肺炎、レーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、およびトリパノソーマ感染症をはじめとするが、これに限定されるものではない寄生性疾患などのその他の伝染性疾患;(d)上皮内新生物、子宮頸部異形成、日光角化症、基底細胞がん、扁平上皮がん、腎細胞がん、カポジ肉腫、黒色腫、腎細胞がん、骨髄性白血病や慢性リンパ球性白血病をはじめとするがこれに限定されるものではない白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、B細胞リンパ腫、および有毛細胞白血病、およびその他のがん(例えば上で同定されたがん)などの新生物疾患;および(e)アトピー性皮膚炎または湿疹、好酸球増加症、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、全身性エリテマトーデス、本態性血小板血症、多発性硬化症、オーメン症候群、円板状ループス、円形脱毛症などのTH2媒介性、アトピー性、および自己免疫疾患;ケロイド生成阻害およびその他の各種瘢痕阻害;および慢性創傷をはじめとする創傷の治癒促進などであるが、これに限定されるものではない、病状の治療に特に有用であり得る。
本発明の医薬組成物のいくつかの実施形態は、例えば、BCG、コレラ、腺ペスト、腸チフス、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、パラインフルエンザ、ポリオ、狂犬病、はしか、おたふく風邪、風疹、黄熱病、破傷風、ジフテリア、ヘモフィルスインフルエンザb、結核、髄膜炎菌性および肺炎球菌のワクチン、アデノウイルス、HIV、水痘、サイトメガロウイルス、デング、ネコ白血病、家禽ペスト、HSV−1およびHSV−2、豚コレラ、日本脳炎、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス、乳頭腫ウイルス、黄熱病、およびアルツハイマー病と関連して使用するための、生きたウイルス、細菌、または寄生虫抗原;不活性化ウイルス、腫瘍由来、原生動物、生物由来、真菌、または細菌抗原、類毒素、毒素;自己抗原;多糖類;タンパク質;糖タンパク質;ペプチド;細胞ワクチン;DNAワクチン;組換えタンパク質;糖タンパク質;ペプチドなどの体液性および/または細胞媒介性の免疫応答のどちらかを生じさせるいずれかの物質と併用して使用するための、ワクチンアジュバントとして有用であってもよい。本発明の免疫賦活性組み合わせはまた、免疫機能損傷を有する個人において、特に役立ってもよい。例えばそれは、例えば移植患者、がん患者、およびHIV患者などにおける、細胞媒介性免疫抑制後に発生する、日和見感染症および腫瘍を治療するために使用してもよい。
上の目的で、本発明の阻害剤は、任意選択的にその他の薬剤との併用で、通常は経口または非経口投与によって、通常は全身または局所投与されてもよい。投与される用量は、例えば、年齢、体重、症状、所望の治療効果、投与経路、および治療持続期間に応じて決定される。ヒト成人では、1人あたりの用量は、一般に、数日間に1回、3日に1回、2日に1回、毎日1回、または最大で毎日数回、経口投与で1ng〜1000mg;数日間に1回、3日に1回、2日に1回、毎日1回、または最大で毎日数回、非経口投与(好ましくは静脈内投与)で1ng〜100mg;または毎日1〜24時間の連続静脈内投与である。上述したように、様々な病状または臨床状態のために、用量が変更されてもよい。したがって、上で規定される範囲よりも低いまたはそれを上回る用量を使用してもよい場合がある。本発明の阻害剤は、任意選択的にその他の薬剤との併用で、経口投与のための固体形態、経口投与のための液体形態、または例えば注射剤、外用薬、坐薬、点眼剤、吸入剤などの非経口投与のための形態などの、様々な形態で投与されてもよい。
一実施形態では、本発明は、1)候補化合物または被検物質を提供するステップと、2)免疫応答を抑制するCD4+Treg細胞を提供するステップと;3)任意選択的にDCなどの抗原提示細胞の存在下で、免疫応答を抑制するCD4+Treg細胞と共に、候補化合物の存在または不在下で、未感作CD4+T細胞を培養するステップと、4)CD4+T細胞の増殖速度(例えば[3H]−チミジンの取り込み)を測定して、候補化合物存在下の増殖速度を候補化合物不在下の速度と比較するステップとを含んでなり、候補化合物存在下の増殖速度の増大が、化合物がTreg細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤であることを示唆する、Treg細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態では、CD4+Treg細胞は、IL−10またはTGF−β非依存性の可溶性因子媒介機序を通じて、宿主の免疫応答を抑制する。
薬剤に曝露されていない培養物(例えば、培地単独または別の対照)との比較で、[3H]チミジン取り込みの少なくとも約20%の増大などの顕著な抑制効果を示す薬剤または試験化合物は、Treg細胞活性の抑制因子として適する。上述の方法を使用して、コンビナトリアルケミストリーに基づくもの、または天然起源化合物およびそれらの誘導体の収集物などの化合物ライブラリーをスクリーニングし得る。一実施例は、数千から数百万個の系統的に分類された化合物収集物の活性に関する情報を与えるようにデザインされた、混合物ベースの位置スキャニングライブラリーである。位置スキャニング技術は、新規酵素阻害剤、受容体作動薬および拮抗薬、抗菌、抗真菌、および抗ウイルス化合物を同定するために、成功裏に使用されている(Houghten et al.,J.Med.Chem.42:3743−3778,1999;Pinilla et al.,Nat.Med.9:118−122,2003)。さらに、この技術は、いくつかの研究グループによって独立して検証されている。およそ50の研究所によって実施された、100を超える別個の研究からの文献は(Houghten et al.,J.Med.Chem.42:3743−3778,1999)、位置スキャニングライブラリーなどの系統的に分類された化合物の収集物をスクリーニングすることの、広範な効用を反映する。
以下の実施例は例示のみを目的として提供され、様々な修正や変更が、それに照らして当業者に提言され、これらは本出願の精神と範囲、および添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
材料と方法
T細胞系およびクローン。CD4+腫瘍浸潤性リンパ球(TIL108)は、黒色腫患者から外科的に除去された腫瘍サンプルから培養された。全てのTILおよびT細胞クローンは、10%ヒトAB血清および組換えIL−2(300IU/ml)を含有するRPMI 1640培地中で培養された。T細胞クローンは、以前記載されたような限界希釈法(0.3細胞/ウェル)によって、TIL108から作成された(Wang et al.,2002)。最適増幅を得るために、本発明者らは、以前記載されたようなOKT3増殖法を使用した(Wang et al.,2002)。TIL1363−ThおよびTIL1558−Thは、それぞれTIL1363およびTIL1558から確立されたCD4+細胞クローンであり、以前記載されたクローンと同一であり、またはそれに類似していた(Wang et al.,2004)。それらの名称は、それらをその他のCD4+Treg細胞から際立たせる特性、すなわち、抗CD3抗体に応答した、それらのTh1サイトカイン分泌と、未感作CD4+T細胞の増殖を亢進させるそれらの能力を反映することが意図される。T細胞からのサイトカイン放出は、以前記載されたようにして判定された(Wang et al.,2004)。
T細胞系およびクローン。CD4+腫瘍浸潤性リンパ球(TIL108)は、黒色腫患者から外科的に除去された腫瘍サンプルから培養された。全てのTILおよびT細胞クローンは、10%ヒトAB血清および組換えIL−2(300IU/ml)を含有するRPMI 1640培地中で培養された。T細胞クローンは、以前記載されたような限界希釈法(0.3細胞/ウェル)によって、TIL108から作成された(Wang et al.,2002)。最適増幅を得るために、本発明者らは、以前記載されたようなOKT3増殖法を使用した(Wang et al.,2002)。TIL1363−ThおよびTIL1558−Thは、それぞれTIL1363およびTIL1558から確立されたCD4+細胞クローンであり、以前記載されたクローンと同一であり、またはそれに類似していた(Wang et al.,2004)。それらの名称は、それらをその他のCD4+Treg細胞から際立たせる特性、すなわち、抗CD3抗体に応答した、それらのTh1サイトカイン分泌と、未感作CD4+T細胞の増殖を亢進させるそれらの能力を反映することが意図される。T細胞からのサイトカイン放出は、以前記載されたようにして判定された(Wang et al.,2004)。
FACS分析。GITRの発現は、抗GITR抗体(R & D Systems)と、それに続くFITCに共役結合する二次的ヤギ抗マウスmAbによる、T細胞の染色後に判定された。T細胞は、FACS分析前に、300IU/mlのIL−2を含有する培地中に、少なくとも2週間維持された。CD4、CD25、およびGITRの発現を判定するために、本発明者らは、PEまたはFITCのどちらかに共役結合するそれぞれの抗体(BD Biosciences)によって、T細胞を染色した。洗浄後、細胞はFACSスキャンによって分析された。
増殖アッセイ。抗CD3mAb被覆(2μg/ml)96ウェルプレート内で、未感作CD4T細胞(1×105)が、制御性T細胞と共に、異なる比率(1:0.2、1:0.1、および1:0.05)で培養された。代案としては、TIL108 Treg細胞またはその他のエフェクター細胞(TIL1363−ThおよびTIL1558−Th)のどちらかからの上清が、新鮮アッセイ培地に添加されて、増殖アッセイのための総容積が200μlにされた。56時間の培養後、最後の16時間の培養中に、増殖未感作またはエフェクターT細胞が、1μCi/ウェルの最終濃度の[3H]チミジンによって標識された。[3H]チミジン取り込みは、液体シンチレーションカウンターで測定された。場合によっては、TIL108 Treg細胞は、Poly−G10、OKT3抗体または異なるTLRリガンドで12時間処理され、次にPBSまたはT細胞アッセイ培地で洗浄された。新鮮培地中で24〜36時間の培養後、それらの抑制活性を測定するために、これらのT細胞からの上清が収集された。以下のリガンドは、Invivogene(San Diego,CA)から購入された:LPS(100ng/ml)、CpG−A(3μg/ml)、CpG−B(3μg/ml)、イミキモド(10μg/ml)、ロキソリビン(500μM)、ポリ(I:C)(25μg/ml)、ssRNA40/LyoVec(3μg/ml)、ssRNA33/LyoVec(3μg/ml)、pam3CSK4(200ng/ml)、フラジェリン(10μg/ml)、またはPoly−G3(3μg/ml)。以前記載されたようにして、トランスウェル実験が実施された(Wang et al.,2004)。
リアルタイム定量PCR分析。Trizol試薬(Invitrogen,Inc.San Diego,CA)によって、1×107個のT細胞から全RNAが抽出された。SuperScript II RTキット(Invitrogen,Inc.San Diego,CA)が、逆転写のために使用された。逆転写混合物(20μl)は2μgの全RNAを含有し、42°Cで1時間培養された。ABI/PRISM7000配列検出システム(PE Applied Biosystems,Inc.Foster City,CA)が使用され、リアルタイムPCRによって、Foxp3 mRNAレベルが定量化された。プライマー、およびPE Applied Biosystems Inc.(Foster City,CA)から購入されたFoxp3またはHPRTに特異的な内部蛍光性TaqManプローブを用いて、PCR反応が実施された。以前記載されたようにして、各サンプル中のTLR7、8、および9、MyD88、およびIRAK4の発現レベルがリアルタイムPCRによって判定され、HPRTの相対量について正規化された(Pengetal.,2005)。
レンチウイルスベースのsiRNAの構築およびウイルス形質導入。コンピュータ支援プログラムが使用されて、各遺伝子について数個のsiRNA配列(19ヌクレオチド)が選択された。siRNA配列、8ヌクレオチドスペーサー、およびpolyTターミネーター配列を含有するオリゴヌクレオチドがアニールされ、次にGFP発現pLentilox3.7ベクターのHapIおよびXhoI部位にクローンされた(Rubinson et al.,2003)。IRAK4、MyD88、およびTLR7、8、および9、およびウイルス形質導入のためのsiRNAについては、以前記載されている(Peng et al.,2005)。形質導入の3または4日後に形質導入効率が分析され、FACS ARIA選別装置によって、細胞がGFP+およびGFP−細胞に選別された。次に機能的増殖アッセイにおいて、Poly−G10によるそれらの可逆性を判定するために、選別されたTreg細胞が使用された。
結果と考察
抑制活性があるCD4+TIL系の同定
腫瘍特異的CD4+T細胞系を作成するために、本発明者らは、最初に、がん患者から外科的に除去された新鮮腫瘍サンプルから、腫瘍浸潤性リンパ球を確立した。CD8+T細胞の枯渇後、腫瘍細胞系のパネルとの対比で、精製CD4+T細胞系が試験された。TIL108は、腫瘍反応性CD4+T細胞系であり、さらなる分析のために選択された。FACS分析は、TIL108が、全CD4+T細胞母集団中に、17%のCD4+CD25+T細胞を含有した一方で、正常なPBMC誘導CD4+T細胞母集団は、約6%のCD25+T細胞を保有したことを明らかにした(図1(A))。これらの細胞の機能特性を判定するために、本発明者らは、TIL108細胞が、抗CD3抗体刺激に対する、精製未感作CD4+T細胞の増殖応答を抑制できた一方で(図1(A))、対照未感作CD4+T細胞は、増殖応答を阻害できなかったことを示し、CD4+TIL108細胞系が、抗原特異的CD4+Treg細胞クローンの豊富な供給源であることが示唆された。
抑制活性があるCD4+TIL系の同定
腫瘍特異的CD4+T細胞系を作成するために、本発明者らは、最初に、がん患者から外科的に除去された新鮮腫瘍サンプルから、腫瘍浸潤性リンパ球を確立した。CD8+T細胞の枯渇後、腫瘍細胞系のパネルとの対比で、精製CD4+T細胞系が試験された。TIL108は、腫瘍反応性CD4+T細胞系であり、さらなる分析のために選択された。FACS分析は、TIL108が、全CD4+T細胞母集団中に、17%のCD4+CD25+T細胞を含有した一方で、正常なPBMC誘導CD4+T細胞母集団は、約6%のCD25+T細胞を保有したことを明らかにした(図1(A))。これらの細胞の機能特性を判定するために、本発明者らは、TIL108細胞が、抗CD3抗体刺激に対する、精製未感作CD4+T細胞の増殖応答を抑制できた一方で(図1(A))、対照未感作CD4+T細胞は、増殖応答を阻害できなかったことを示し、CD4+TIL108細胞系が、抗原特異的CD4+Treg細胞クローンの豊富な供給源であることが示唆された。
次に本発明者らは、限界希釈法によって、TIL108系からCD4+T細胞クローンを作成した。35個の腫瘍反応性CD4+T細胞クローンの内、12個が成功裏に増殖され、さらなる分析のために、多数のT細胞が得られた。図1(B)に示されるように、全ての12個のTIL108クローンはMHCクラスII適合性108mel細胞を明確に認識し、その内3個は同種異系1558mel細胞を認識した一方で、それらのいずれもMHCクラスII適合性EBVおよび293誘導細胞系には反応しなかった。
IL−10分泌CD4+Treg細胞クローンの表現型分析
各T細胞クローンのサイトカインプロファイルを判定するために、本発明者らは、全ての12個のT細胞クローンが、大量のGM−CSF、IFN−γ、およびIL−10を分泌したが、その他のサイトカインの分泌はわずかまたは皆無であったことを見出した(図2(A))。FACS分析によって、本発明者らは、全てのIL−10産生T細胞クローンが、CD4、CD25、およびGITRマーカーを発現したことを示した。4つのクローンの典型的なデータは、図2(B)に示される。リアルタイムPCR分析は、これらのIL−10産生CD4+T細胞クローン中のフォークヘッド転写因子(Foxp3)の発現が、CD4+TIL1363−Th細胞中の発現よりも高かったことを明らかにした(図2(C))。総合すると、これらのデータは、TIL108T細胞クローンが、典型的にCD4+制御性T細胞に伴う、マーカーおよびサイトカインを発現することを示唆する。
各T細胞クローンのサイトカインプロファイルを判定するために、本発明者らは、全ての12個のT細胞クローンが、大量のGM−CSF、IFN−γ、およびIL−10を分泌したが、その他のサイトカインの分泌はわずかまたは皆無であったことを見出した(図2(A))。FACS分析によって、本発明者らは、全てのIL−10産生T細胞クローンが、CD4、CD25、およびGITRマーカーを発現したことを示した。4つのクローンの典型的なデータは、図2(B)に示される。リアルタイムPCR分析は、これらのIL−10産生CD4+T細胞クローン中のフォークヘッド転写因子(Foxp3)の発現が、CD4+TIL1363−Th細胞中の発現よりも高かったことを明らかにした(図2(C))。総合すると、これらのデータは、TIL108T細胞クローンが、典型的にCD4+制御性T細胞に伴う、マーカーおよびサイトカインを発現することを示唆する。
Treg細胞によって分泌される可溶性因子はCD4+T細胞の免疫抑制を媒介する
TIL1363−Thエフェクター細胞が、未感作CD4+T細胞増殖を阻害せずむしろ増強したのとは対照的に、全てのTIL108 Treg細胞クローンは、上の表現型特性に一致して、応答するCD4+T細胞の抗CD3誘発性増殖を用量依存様式で強力に抑制した(図3(A))。これらのTIL108 Treg細胞が、未感作T細胞増殖をどのように阻害するかを判定するために、本発明者らはトランスウェル実験を実施した。図3(B)に示されるように、内側ウェル内のTIL108 Treg細胞クローンは、内側ウェル内のT細胞抑制による影響を受けない外側ウェル内の未感作CD4+T細胞の増殖を依然として抑制できた。したがって、細胞と細胞の接触は、Treg細胞クローンの抑制機能に必須でない。
TIL1363−Thエフェクター細胞が、未感作CD4+T細胞増殖を阻害せずむしろ増強したのとは対照的に、全てのTIL108 Treg細胞クローンは、上の表現型特性に一致して、応答するCD4+T細胞の抗CD3誘発性増殖を用量依存様式で強力に抑制した(図3(A))。これらのTIL108 Treg細胞が、未感作T細胞増殖をどのように阻害するかを判定するために、本発明者らはトランスウェル実験を実施した。図3(B)に示されるように、内側ウェル内のTIL108 Treg細胞クローンは、内側ウェル内のT細胞抑制による影響を受けない外側ウェル内の未感作CD4+T細胞の増殖を依然として抑制できた。したがって、細胞と細胞の接触は、Treg細胞クローンの抑制機能に必須でない。
次に本発明者らは、Treg細胞クローンによって豊富に産生されるIL−10が、免疫抑制に関与するかどうかを調べた。アッセイ培地中への抗10、抗10R、またはその双方(各10μg)の包含は、未感作CD4+T細胞の増殖活性を回復できなかった(図3(C))。より多量(30μg)の抗体の添加、または抗体被覆プレートの使用でも、同様の結果が得られた(データ示さず)。第3の抗体である抗TGF−βもまた、未感作CD4+T細胞の増殖活性に対するいかなる効果も欠いていた(データ示さず)。これらの結果は、TIL108 Treg細胞クローンによって媒介される未感作T細胞増殖の抑制における、IL−10およびTGF−βの関与を除外する。
細胞培養物上清が、未感作CD4+T細胞の増殖を抑制できるかどうかを直接試験するために、本発明者らは、TIL108 Treg細胞クローンからのわずか10μlの細胞培養物上清の機能アッセイ培地への添加が、未感作CD4+T細胞増殖に90%を超える阻害をもたらした一方で、TIL1363−Th細胞またはいずれかの未感作CD4+T細胞からの同一量の培養物上清の添加が、未感作CD4+T細胞増殖を阻害せずむしろ増強したことを見出した(図3(D))。用量設定実験は、上清の量の増大と共に、抑制活性が増大したことを示した(図3(E))。これらの結果は、TIL108 Treg細胞によって分泌される可溶性因子が、それらの抑制機能に、直接関与することを実証する。したがって、TIL108系/クローンは、天然起源CD4+CD25+Treg細胞によって、またはTr1/Th3細胞によって用いられるものとは異なる機序を通じて免疫抑制を媒介する、Treg細胞の新規サブセットに相当してもよい(Levings et al.,2002;Sakaguchi,2004;Shevach,2002)。Treg細胞の追加的なサブセットは、がん患者からの追加的な臨床サンプルが評価される際に、同定される可能性が高い。CD4+Tregに加えて、CD8+Treg細胞、NKT、およびγδ TCR T細胞をはじめとするTreg細胞のサブセットもまた、異なる疾患状況(自己免疫疾患およびがん)において宿主免疫応答を調節する上で、重要な役割を果たしてもよく(Cortesini et al.,2001;Hayday and Tigelaar,2003;Jiang and Chess,2004)、特有の抑制機構または表現型があるTreg細胞サブセットのスペクトルの存在が示唆される。
TIL108 Treg細胞によるエフェクターT細胞機能の阻害
次に、Treg細胞上清に、抗原特異的CD8+エフェクター細胞増殖を抑制する能力があるかどうかを試験した。図4(A)に示されるように、上清もまた、CD8+TIL1359T細胞の増殖を強力に阻害した。TIL108 Treg細胞クローンによって分泌される可溶性因子が、TIL1363−Thエフェクター細胞のIL−2分泌能力を阻害できるかどうかを判定するために、本発明者らは、抗CD3(OKT3)抗体による刺激ありまたはなしで、TIL108 T細胞クローンからの50μlの細胞上清を添加した150μlの新鮮培養液中で、1363mel(刺激因子)細胞と共にTIL1363−Th細胞を培養した。OKT3刺激TIL1558−Thエフェクター細胞培養物からの上清、またはOKT3刺激なしで培養されたTIL108 Treg細胞からの上清には、いかなる活性も欠如していたのは対照的に、OKT3刺激TIL108 Treg細胞培養物からの上清は、TIL1363−C1細胞によるIL−2分泌を阻害した(図4(B))。TIL1363−Thおよび1363mel細胞と、TIL108 Treg細胞との共培養が、IL−2のより良い阻害をもたらすかどうかをさらに試験するために、本発明者らは、OKT3刺激TIL108 Treg細胞が、OKT3刺激のないTIL108 Treg細胞とは対照的に、TIL1363−Th細胞によるIL−2分泌のより強力な阻害を示すことを見出した(図4(C))。OKT3抗体刺激TIL1558−Th細胞は、TIL1363−Th細胞によるIL−2産生を阻害しなかった。これらのデータは、CD4+Th細胞によるIL−2産生の阻害に、TIL108 Treg細胞の活性化が必須であることを示唆する。
次に、Treg細胞上清に、抗原特異的CD8+エフェクター細胞増殖を抑制する能力があるかどうかを試験した。図4(A)に示されるように、上清もまた、CD8+TIL1359T細胞の増殖を強力に阻害した。TIL108 Treg細胞クローンによって分泌される可溶性因子が、TIL1363−Thエフェクター細胞のIL−2分泌能力を阻害できるかどうかを判定するために、本発明者らは、抗CD3(OKT3)抗体による刺激ありまたはなしで、TIL108 T細胞クローンからの50μlの細胞上清を添加した150μlの新鮮培養液中で、1363mel(刺激因子)細胞と共にTIL1363−Th細胞を培養した。OKT3刺激TIL1558−Thエフェクター細胞培養物からの上清、またはOKT3刺激なしで培養されたTIL108 Treg細胞からの上清には、いかなる活性も欠如していたのは対照的に、OKT3刺激TIL108 Treg細胞培養物からの上清は、TIL1363−C1細胞によるIL−2分泌を阻害した(図4(B))。TIL1363−Thおよび1363mel細胞と、TIL108 Treg細胞との共培養が、IL−2のより良い阻害をもたらすかどうかをさらに試験するために、本発明者らは、OKT3刺激TIL108 Treg細胞が、OKT3刺激のないTIL108 Treg細胞とは対照的に、TIL1363−Th細胞によるIL−2分泌のより強力な阻害を示すことを見出した(図4(C))。OKT3抗体刺激TIL1558−Th細胞は、TIL1363−Th細胞によるIL−2産生を阻害しなかった。これらのデータは、CD4+Th細胞によるIL−2産生の阻害に、TIL108 Treg細胞の活性化が必須であることを示唆する。
TIL108 Treg細胞の抑制機能の逆転
次に本発明者らは、Poly−Gオリゴヌクレオチドが、TIL108 Treg細胞の抑制機能を逆転させ得るかどうかを試験した。Poly−G10によるTIL108 Treg細胞の前処理が、TIL108 Treg細胞の抑制機能の逆転をもたらし、未感作CD4+T細胞の増殖を回復させた一方で、未処理TIL108 Treg細胞は、抑制性であり続けた(図5(A))。より重要なことには、未処理親TIL108 Treg細胞からの上清が、それらの抑制特性を維持したのとは対照的に、Poly−G10処理TIL108 Treg細胞から収集された上清は、未感作CD4+T細胞の増殖を増強し(図5(B))、TIL108 Treg細胞によって分泌される可溶性因子の抑制活性が、Poly−G媒介シグナル伝達経路によって、直接調節されることが示唆された。
次に本発明者らは、Poly−Gオリゴヌクレオチドが、TIL108 Treg細胞の抑制機能を逆転させ得るかどうかを試験した。Poly−G10によるTIL108 Treg細胞の前処理が、TIL108 Treg細胞の抑制機能の逆転をもたらし、未感作CD4+T細胞の増殖を回復させた一方で、未処理TIL108 Treg細胞は、抑制性であり続けた(図5(A))。より重要なことには、未処理親TIL108 Treg細胞からの上清が、それらの抑制特性を維持したのとは対照的に、Poly−G10処理TIL108 Treg細胞から収集された上清は、未感作CD4+T細胞の増殖を増強し(図5(B))、TIL108 Treg細胞によって分泌される可溶性因子の抑制活性が、Poly−G媒介シグナル伝達経路によって、直接調節されることが示唆された。
次に本発明者らは、TLR8シグナル伝達経路が、Poly−GオリゴヌクレオチドによるTIL108 Treg細胞の機能逆転に、必要かどうかの判定を試みた。このようにして、本発明者らは、GFP発現レンチウイルスベースのsiRNAコンストラクトを使用して、TIL108 Treg細胞中で、TLR8、MyD88、およびIRAK4などの、TLR8シグナル伝達経路のいくつかの重要な分子をノックダウンして、それらの対応する遺伝子の発現が阻害されることを実証した(Peng et al.,2005)。標的遺伝子に対して特異的なsiRNAウイルス粒子を感染させたTIL108 Tregが、GFP+(形質導入)およびGFP−(非形質導入)細胞に選別され、Poly−G10オリゴヌクレオチドに応答するそれらの能力について試験された。図5(C)に示されるように、siRNAによるTLR8、MyD88、およびIRAK4の特異的ノックダウンは、Poly−G10オリゴヌクレオチドが、TIL108 Treg細胞の抑制活性を逆転させる能力を消滅させた。対照的に、TLR7および9に対して特異的なsiRNAウイルスをTIL108 Treg細胞に形質導入した場合は、抑制活性またはその可逆性のいずれも影響を受けなかった。選別されたGFP−TIL108 Treg細胞は、非形質導入親細胞と同じ可逆的抑制機能を保有した(図5(C))。この結果に一致して、ヒトTLR8に対する2つの天然リガンド(ssRNA40およびssRNA33)もまた、TIL108 Treg細胞の抑制機能を逆転させた一方で、その他のTLRに対するリガンドは、Treg細胞の存在下で、未感作CD4+T細胞の増殖を回復できなかった(図5(D))。Poly−G2およびssRNA40処理TIL108 Treg細胞からの上清について同様の結果が得られたが、ssRNA33リガンドは有効性が劣った(図5(D))。
天然起源CD4+CD25+Treg細胞ならびにLAGE1特異的CD4+Treg細胞と同様に、TIL108 Treg細胞によって分泌される可溶性因子の抑制活性もまた、TLR8シグナル伝達によって直接制御されるので、本発明者らは、TLR8−MyD88シグナル伝達経路が、抑制の特定の機構にかかわりなく、Treg細胞の抑制機能に関与する分子の機能を特異的に制御すると推測する。どうしてその他のTLRシグナル伝達経路でなく、TLR8がTreg細胞の抑制活性を抑制するのかは明らかでないが、Treg細胞中のTLR発現パターンが、TLR8シグナル伝達経路のこのユニークな特性をある程度説明してもよい。代案としては、Treg細胞中のTLR8−MyD88−IRAK4複合体が、Treg細胞機能の抑制に必要なMyD88−IRAK4下流のユニークなシグナル伝達経路を動員するのかもしれない。
別個のTLRリガンドを通じたマウスTreg細胞機能の調節
TLR8は、マウス中で機能性ではないので(Jurk et al.,2002)、マウス中のTreg細胞抑制の逆転は、ヒトとは異なることが予想される。Poly−Gオリゴヌクレオチドが、マウスTLR8によるTreg細胞の機能逆転を起こさせ得るかどうかを試験するために、本発明者らは、マウスCD4+CD25+Treg細胞を単離して精製し、TLRリガンドに応答するそれらの能力を評価した。マウスTreg細胞が、未感作CD4+T細胞の増殖を抑制できた一方で、Treg細胞またはAPC単独では、抗CD3抗体に応答して増殖しなかった(図6(A))。しかしPoly−Gオリゴヌクレオチドは、マウスTreg細胞の抑制活性の逆転に影響を及ぼさなかった(図6(B))。
TLR8は、マウス中で機能性ではないので(Jurk et al.,2002)、マウス中のTreg細胞抑制の逆転は、ヒトとは異なることが予想される。Poly−Gオリゴヌクレオチドが、マウスTLR8によるTreg細胞の機能逆転を起こさせ得るかどうかを試験するために、本発明者らは、マウスCD4+CD25+Treg細胞を単離して精製し、TLRリガンドに応答するそれらの能力を評価した。マウスTreg細胞が、未感作CD4+T細胞の増殖を抑制できた一方で、Treg細胞またはAPC単独では、抗CD3抗体に応答して増殖しなかった(図6(A))。しかしPoly−Gオリゴヌクレオチドは、マウスTreg細胞の抑制活性の逆転に影響を及ぼさなかった(図6(B))。
興味深いことに、TLR2、TLR7、およびTLR9に対するTLRリガンドは、マウスTreg細胞による未感作T細胞増殖の抑制を逆転させ得なかった(図6(B))。TLR4リガンドであるLPSは、Treg細胞の抑制機能の逆転に対する軽微な効果を有した一方で、TLR3およびTLR5に対するリガンドは、それらの抑制機能に対するいかなる効果も欠いていた。これらのデータは、マウスTreg細胞の存在下で未感作T細胞の増殖を抑制する、特定のTLR経路を同定し、CD4+TregとTヘルパー細胞間の平衡を変化させることで、抗腫瘍免疫を増強することの理論的根拠を提供する。
ヒトTLR8遺伝子組換えモデルの開発
マウスTLR8は機能性でないので、本発明者らは、最近、遺伝子組換え(Tg)マウスを作成した。ヒトTLR8は、脾臓、胸線、リンパ節、およびCD4+T細胞内で発現されたが、B細胞、CD8+T細胞またはその他の分析された組織(図7(A))中では発現されなかった。したがって、CD4−hTLR8TgマウスにおけるマウスCD4+T細胞中のhTLR8の忠実な発現および機能は、生体内でTreg細胞機能を操作する、本発明者らの能力を大幅に促進するであろう。hTLR8発現Treg細胞のPoly−G3による処理は、それらの抑制機能を逆転させたが、Poly−T10(対照)による処理は逆転させなかった(図7(B))。これらの研究は、Poly−G3によって、TLR8−発現マウスTreg細胞の抑制機能を逆転させ得ることを示唆する。
マウスTLR8は機能性でないので、本発明者らは、最近、遺伝子組換え(Tg)マウスを作成した。ヒトTLR8は、脾臓、胸線、リンパ節、およびCD4+T細胞内で発現されたが、B細胞、CD8+T細胞またはその他の分析された組織(図7(A))中では発現されなかった。したがって、CD4−hTLR8TgマウスにおけるマウスCD4+T細胞中のhTLR8の忠実な発現および機能は、生体内でTreg細胞機能を操作する、本発明者らの能力を大幅に促進するであろう。hTLR8発現Treg細胞のPoly−G3による処理は、それらの抑制機能を逆転させたが、Poly−T10(対照)による処理は逆転させなかった(図7(B))。これらの研究は、Poly−G3によって、TLR8−発現マウスTreg細胞の抑制機能を逆転させ得ることを示唆する。
Treg細胞機能の遮断による抗腫瘍免疫の増強
Poly−G3処理が、Treg細胞機能を遮断することにより、生体内で抗腫瘍免疫を増強するかどうかを試験するために、本発明者らは、−2および−1日目における、C57BL/6野生型(対照)およびCD4−hTLR8Tgマウスへの、Poly−G3、Poly−T10、またはCpGオリゴヌクレオチドの静脈内注射によって作成された保護腫瘍モデルを開発した。処置したマウスを0日目のB16腫瘍細胞(1×105細胞/マウス)の皮下注射によって攻撃投与して、腫瘍成長を2日毎にモニターした。本発明者らは、Poly−G3処理が、CD4−hTLR8 Tgマウス中で、B16細胞に対する抗腫瘍免疫を増強するが、C57BL/6マウス中では、増強しなかったことを見出した(図8)。Poly−T10およびCpG処理は、C57BL/6およびCD4−hTLR8Tgマウスのどちらにおいても、腫瘍成長を阻害できず、CD4+T細胞中のTLR8発現が、Poly−G3−誘発抗腫瘍免疫に必須であることが示唆された。重要なことに、本発明者らは、Poly−G3処理が、CD4−hTLR8Tgマウスにおいて、前立腺RM1腫瘍細胞の増殖を阻害したことを実証した(図8)。同様の結果は、リンパ腫、MCA28肉腫、およびRM1前立腺がん腫瘍細胞をはじめとする、いくつかのその他の各種がんでも得られた。
Poly−G3処理が、Treg細胞機能を遮断することにより、生体内で抗腫瘍免疫を増強するかどうかを試験するために、本発明者らは、−2および−1日目における、C57BL/6野生型(対照)およびCD4−hTLR8Tgマウスへの、Poly−G3、Poly−T10、またはCpGオリゴヌクレオチドの静脈内注射によって作成された保護腫瘍モデルを開発した。処置したマウスを0日目のB16腫瘍細胞(1×105細胞/マウス)の皮下注射によって攻撃投与して、腫瘍成長を2日毎にモニターした。本発明者らは、Poly−G3処理が、CD4−hTLR8 Tgマウス中で、B16細胞に対する抗腫瘍免疫を増強するが、C57BL/6マウス中では、増強しなかったことを見出した(図8)。Poly−T10およびCpG処理は、C57BL/6およびCD4−hTLR8Tgマウスのどちらにおいても、腫瘍成長を阻害できず、CD4+T細胞中のTLR8発現が、Poly−G3−誘発抗腫瘍免疫に必須であることが示唆された。重要なことに、本発明者らは、Poly−G3処理が、CD4−hTLR8Tgマウスにおいて、前立腺RM1腫瘍細胞の増殖を阻害したことを実証した(図8)。同様の結果は、リンパ腫、MCA28肉腫、およびRM1前立腺がん腫瘍細胞をはじめとする、いくつかのその他の各種がんでも得られた。
ヒトTreg細胞の抑制機能を逆転させる能力がある新規化合物の同定
TLR8シグナル伝達経路に関する本発明者らの知識は、現在のところ限定的であるので、代案のアプローチは、小分子化合物をスクリーニングすることであろう。このアプローチの実現可能性を実証するために、本発明者らは、Timtec,Inc.から数百種類の小分子化合物を入手して、図9に記載されるものと類似した実験で、それらをスクリーニングした。
TLR8シグナル伝達経路に関する本発明者らの知識は、現在のところ限定的であるので、代案のアプローチは、小分子化合物をスクリーニングすることであろう。このアプローチの実現可能性を実証するために、本発明者らは、Timtec,Inc.から数百種類の小分子化合物を入手して、図9に記載されるものと類似した実験で、それらをスクリーニングした。
具体的には、抗原提示細胞(APC)が添加された可溶性抗CD3抗体を使用して、機能スクリーニングアッセイを実施した。ミクロビーズ(Miltenvi Biotec)を使用して、未感作CD4+T細胞をPBMCから精製した。7日間にわたり、IL−4(500ng/ml)およびGM−CSF(800ng/ml)の存在下で、PBMC誘導単球からDCが生成された。様々な小分子化合物(1μM)の不在または存在下で、2×104のDCおよび抗CD3抗体(100ng/ml)を含有する200μlの培地中において、1:0.2、1:0.1、および1:0.05の異なる比率で、1×105個の未感作CD4+T細胞を制御性T細胞と共に培養した。56時間の培養後、1μCi/ウェルの最終濃度で[3H]チミジンを添加し、さらに16時間の培養がそれに続いた。液体シンチレーションカウンターによって、[3H]チミジンの取り込みを測定した。全ての実験は、三重反復試験で実施された。さらに、APCなしで被覆された抗CD3抗体を使用して、スクリーニングアッセイを実施した。様々な小分子化合物(1μM)の不在または存在下で、抗CD3mAb被覆(2μg/ml)96ウェルプレート内において、1:0.2、1:0.1、および1:0.05の異なる比率で、1×105個の未感作CD4T細胞を制御性T細胞と共に培養した。56時間の培養後、1μCi/ウェルの最終濃度で[3H]チミジンを添加し、さらに16時間の培養がそれに続いた。液体シンチレーションカウンターによって、[3H]チミジンの取り込みを測定した。
本発明者らは、Treg細胞の抑制機能を強力に逆転させる、11個の化合物を同定した(図10および表1から表3)。これらの結果は、小分子化合物がヒトTreg細胞の抑制機能を逆転できることを示唆する。
Treg細胞抑制機能の薬剤誘発性遮断の永続性は処理時間に依存する
Treg細胞抑制機能の薬剤誘発性逆転の永続性を判定するために、本発明者らは、それぞれ1、3、および5日間にわたり、(低濃度の)薬剤の存在下で、Treg細胞(各5×106)を培養した。薬剤なしで培養されたTreg細胞が、対照の役割を果たした。1、3および8日目にTreg細胞を収集して、PBSで3回洗浄して、内在する薬剤を除去した。これらの細胞(0.5〜1×106)の一部が、機能アッセイで使用された一方で、残りのT細胞は、IL−2を含有するT細胞培地中で培養され、3週間にわたり4日毎の機能アッセイで使用された。図11に示されるように、薬剤化合物#1、#4、および#7によるTreg細胞の1日間の処理、次に洗浄後、試験のための使用時までの薬剤非含有培地中での培養。前処理Treg細胞は抑制機能を喪失し、5〜6日間にわたり非抑制状態のままであった。Treg細胞の3日間の薬剤処理では、これらは3〜4週間にわたり非抑制性のままであり、次に再度抑制性になった。同様に、8日間前処理されたTreg細胞は抑制機能を喪失し、次に異なる種類の化合物次第で抑制性になった(図11)。したがって、未感作T細胞増殖の少なくとも50%の回復(すなわちTreg細胞の抑制活性の50%の遮断)に必要な最小薬物濃度と、エフェクターT細胞免疫の誘発を可能にするのに十分な時間にわたり非抑制状態を維持する能力とによる判定で、最も有望な化合物は、さらなる実験のために有用である。Treg細胞抑制機能逆転の永続性は、処理時間に左右されるので、本発明者らは、時間窓を調節して、最小の自己免疫応答リスクで、最大の抗腫瘍免疫を誘発できた。本発明者らはまた、Treg細胞の抑制機能を増強し得る小分子化合物を同定することを期待する。全体的に、本発明者らの研究は、異なる化合物/薬剤によってTreg細胞の抑制機能を調節し得ることを示唆し、これは多くの種類の疾患の治療にとって重要であってもよい。
Treg細胞抑制機能の薬剤誘発性逆転の永続性を判定するために、本発明者らは、それぞれ1、3、および5日間にわたり、(低濃度の)薬剤の存在下で、Treg細胞(各5×106)を培養した。薬剤なしで培養されたTreg細胞が、対照の役割を果たした。1、3および8日目にTreg細胞を収集して、PBSで3回洗浄して、内在する薬剤を除去した。これらの細胞(0.5〜1×106)の一部が、機能アッセイで使用された一方で、残りのT細胞は、IL−2を含有するT細胞培地中で培養され、3週間にわたり4日毎の機能アッセイで使用された。図11に示されるように、薬剤化合物#1、#4、および#7によるTreg細胞の1日間の処理、次に洗浄後、試験のための使用時までの薬剤非含有培地中での培養。前処理Treg細胞は抑制機能を喪失し、5〜6日間にわたり非抑制状態のままであった。Treg細胞の3日間の薬剤処理では、これらは3〜4週間にわたり非抑制性のままであり、次に再度抑制性になった。同様に、8日間前処理されたTreg細胞は抑制機能を喪失し、次に異なる種類の化合物次第で抑制性になった(図11)。したがって、未感作T細胞増殖の少なくとも50%の回復(すなわちTreg細胞の抑制活性の50%の遮断)に必要な最小薬物濃度と、エフェクターT細胞免疫の誘発を可能にするのに十分な時間にわたり非抑制状態を維持する能力とによる判定で、最も有望な化合物は、さらなる実験のために有用である。Treg細胞抑制機能逆転の永続性は、処理時間に左右されるので、本発明者らは、時間窓を調節して、最小の自己免疫応答リスクで、最大の抗腫瘍免疫を誘発できた。本発明者らはまた、Treg細胞の抑制機能を増強し得る小分子化合物を同定することを期待する。全体的に、本発明者らの研究は、異なる化合物/薬剤によってTreg細胞の抑制機能を調節し得ることを示唆し、これは多くの種類の疾患の治療にとって重要であってもよい。
本特許で言及される全ての文献、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために参照によって本明細書に援用する。いずれかの実施形態からの1つまたは複数の特性は、本開示の範囲を逸脱することなく、いずれかのその他の実施形態の1つまたは複数の特性と組み合わされてもよい。上の説明は、例証的であって制限的でない。本開示を検討することにより、本発明の多数のバリエーションが、当業者に明らかになるであろう。したがって本発明の範囲は、上の説明を参照して判定されるべきでなく、特許請求の範囲、そしてそれらの完全な範囲または同等物を参照して判定されるべきである。本発明の実施形態の例を項目として以下に示す。
[項目1]
化合物1、2、3、4、5、6、7、13、22、23、24、および25からなる群から選択される化合物の薬理有効量と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物であり、上記化合物1、2、3、4、5、6、7、13、22、23、24、および25は下記化学式によりそれぞれ与えられる、
医薬組成物。
[項目2]
抗原をさらに含んでなる、項目1に記載の医薬組成物。
[項目3]
アジュバントをさらに含んでなる、項目1又は2に記載の医薬組成物。
[項目4]
上記抗原が、ペプチド抗原、タンパク質抗原、ポリヌクレオチド抗原、または多糖類抗原である、項目2に記載の医薬組成物。
[項目5]
MyD88−IRAK4シグナル伝達経路を活性化するヒトToll様受容体(TLR)8に対するリガンドを含んでなる医薬組成物の薬理有効量を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、哺乳類において制御性T(Treg)細胞媒介性の免疫抑制を阻害する、または免疫応答を増大させる方法。
[項目6]
上記リガンドが、ssRNA40、ssRNA33、CpG、Poly−G10、レシキモド、ロキソリビン、フラジェリン、LPS、Pam3CSK4からなる群から選択される、項目5に記載の方法。
[項目7]
上記リガンドが、下記化学式によりそれぞれ与えられる化合物1、2、3、4、5、6、7、13、22、23、24、および25からなる群から選択される、
項目5又は6に記載の方法。
[項目8]
上記哺乳類がヒトである、項目5から7のいずれか一項に記載の方法。
[項目9]
上記哺乳類にがんがあり、またはがんを発症するリスクがあり、がん特異的抗原を含んでなるがんワクチンの免疫原性量が、上記哺乳類にさらに投与される、項目5から8のいずれか一項に記載の方法。
[項目10]
アジュバントが、上記哺乳類にさらに投与される、項目9に記載の方法。
[項目11]
上記アジュバントが、上記抗原と共に投与され、または上記抗原と共役している、項目10に記載の方法。
[項目12]
化学療法剤の有効量を投与するステップをさらに含んでなる、項目11に記載の方法。
[項目13]
上記哺乳類が、感染症を患っている、または発症するリスクがある、項目5から12のいずれか一項に記載の方法。
[項目14]
1)候補化合物を提供するステップと、
2)CD4+Treg細胞を提供するステップと、
3)上記候補化合物の存在または不在下で、未感作CD4+T細胞を上記CD4+Treg細胞と共に培養するステップと、
4)上記候補化合物の存在または不在下で、上記未感作CD4+T細胞の増殖速度を測定するステップと、
5)上記候補化合物の存在下の増殖速度と、上記候補化合物の不在下の増殖速度とを比較するステップと
を含んでなり、上記増殖速度が、その存在下でその不在下よりも高い候補化合物が、CD4+Treg細胞の阻害を逆転させると判定されて、阻害剤として選択される、Treg細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤をスクリーニングする方法。
[項目15]
上記CD4+Treg細胞が、CD25、GITR、およびFoxP3を発現して、IL−10を分泌し、宿主の免疫応答を阻害できる、項目14に記載の方法。
[項目16]
上記CD4+Treg細胞が、抗原に特異的である、項目14または15に記載の方法。
[項目17]
上記CD4+T細胞が、抗原提示細胞(APC)の存在下でさらに培養される、項目16に記載の方法。
[項目18]
上記APCが、抗原を提示する、項目17に記載の方法。
[項目19]
上記APCが、樹状細胞である、項目18に記載の方法。
[項目20]
上記増殖速度が、上記CD4+T細胞への[3H]−チミジン取り込み速度によって判定される、項目14から19のいずれか一項に記載の方法。
[項目1]
化合物1、2、3、4、5、6、7、13、22、23、24、および25からなる群から選択される化合物の薬理有効量と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物であり、上記化合物1、2、3、4、5、6、7、13、22、23、24、および25は下記化学式によりそれぞれ与えられる、
医薬組成物。
[項目2]
抗原をさらに含んでなる、項目1に記載の医薬組成物。
[項目3]
アジュバントをさらに含んでなる、項目1又は2に記載の医薬組成物。
[項目4]
上記抗原が、ペプチド抗原、タンパク質抗原、ポリヌクレオチド抗原、または多糖類抗原である、項目2に記載の医薬組成物。
[項目5]
MyD88−IRAK4シグナル伝達経路を活性化するヒトToll様受容体(TLR)8に対するリガンドを含んでなる医薬組成物の薬理有効量を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、哺乳類において制御性T(Treg)細胞媒介性の免疫抑制を阻害する、または免疫応答を増大させる方法。
[項目6]
上記リガンドが、ssRNA40、ssRNA33、CpG、Poly−G10、レシキモド、ロキソリビン、フラジェリン、LPS、Pam3CSK4からなる群から選択される、項目5に記載の方法。
[項目7]
上記リガンドが、下記化学式によりそれぞれ与えられる化合物1、2、3、4、5、6、7、13、22、23、24、および25からなる群から選択される、
項目5又は6に記載の方法。
[項目8]
上記哺乳類がヒトである、項目5から7のいずれか一項に記載の方法。
[項目9]
上記哺乳類にがんがあり、またはがんを発症するリスクがあり、がん特異的抗原を含んでなるがんワクチンの免疫原性量が、上記哺乳類にさらに投与される、項目5から8のいずれか一項に記載の方法。
[項目10]
アジュバントが、上記哺乳類にさらに投与される、項目9に記載の方法。
[項目11]
上記アジュバントが、上記抗原と共に投与され、または上記抗原と共役している、項目10に記載の方法。
[項目12]
化学療法剤の有効量を投与するステップをさらに含んでなる、項目11に記載の方法。
[項目13]
上記哺乳類が、感染症を患っている、または発症するリスクがある、項目5から12のいずれか一項に記載の方法。
[項目14]
1)候補化合物を提供するステップと、
2)CD4+Treg細胞を提供するステップと、
3)上記候補化合物の存在または不在下で、未感作CD4+T細胞を上記CD4+Treg細胞と共に培養するステップと、
4)上記候補化合物の存在または不在下で、上記未感作CD4+T細胞の増殖速度を測定するステップと、
5)上記候補化合物の存在下の増殖速度と、上記候補化合物の不在下の増殖速度とを比較するステップと
を含んでなり、上記増殖速度が、その存在下でその不在下よりも高い候補化合物が、CD4+Treg細胞の阻害を逆転させると判定されて、阻害剤として選択される、Treg細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤をスクリーニングする方法。
[項目15]
上記CD4+Treg細胞が、CD25、GITR、およびFoxP3を発現して、IL−10を分泌し、宿主の免疫応答を阻害できる、項目14に記載の方法。
[項目16]
上記CD4+Treg細胞が、抗原に特異的である、項目14または15に記載の方法。
[項目17]
上記CD4+T細胞が、抗原提示細胞(APC)の存在下でさらに培養される、項目16に記載の方法。
[項目18]
上記APCが、抗原を提示する、項目17に記載の方法。
[項目19]
上記APCが、樹状細胞である、項目18に記載の方法。
[項目20]
上記増殖速度が、上記CD4+T細胞への[3H]−チミジン取り込み速度によって判定される、項目14から19のいずれか一項に記載の方法。
参考文献
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Claims (8)
- 下記化学式により与えられる化合物1の薬理有効量と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、
哺乳類の制御性T(Treg)細胞媒介性の免疫抑制を阻害するための医薬組成物。 - 抗原をさらに含んでなる、請求項1に記載の医薬組成物。
- アジュバントをさらに含んでなる、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 前記抗原が、ペプチド抗原、タンパク質抗原、ポリヌクレオチド抗原、または多糖類抗原である、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記哺乳類がヒトである、請求項1から4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記哺乳類にがんがあり、またはがんを発症するリスクがあり、
前記医薬組成物は、がん特異的抗原を含んでなる免疫原性量のがんワクチンを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 上皮内新生物、子宮頸部異形成、日光角化症、基底細胞がん、扁平上皮がん、腎細胞がん、カポジ肉腫、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、及び、B細胞リンパ腫からなる群から選択される新生物疾患の治療のために用いられる、
請求項1から6のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 1μMの量で化合物1が用いられる請求項1から7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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