JP2018113898A - Mutant gene detection kit and mutant gene detection method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子の変異検出キット及び遺伝子の変異検出方法に関する。 The present invention relates to a gene mutation detection kit and a gene mutation detection method.
がんに特徴的な遺伝子変異の検出は、病理標本を用いた形態学的ながんの診断に加えて、がんの診断の有効な方法となりつつある。がんの診断に有用な変異が報告されている遺伝子としては、例えば、成人では、膵がん又は大腸がんのＫＲＡＳ遺伝子、肺がんのＥＧＦＲ遺伝子が挙げられる。一方、小児では、神経芽腫のＡＬＫ遺伝子及び肝芽腫のβカテニン遺伝子が知られている。βカテニン遺伝子の変異は、成人の肝細胞がんの診断に有用なバイオマーカーとしても期待されている。 Detection of genetic mutations characteristic of cancer is becoming an effective method for cancer diagnosis in addition to morphological cancer diagnosis using pathological specimens. Examples of genes that have been reported to be useful for cancer diagnosis include KRAS gene for pancreatic cancer or colorectal cancer and EGFR gene for lung cancer in adults. On the other hand, in children, the ALK gene of neuroblastoma and the β-catenin gene of hepatoblastoma are known. The mutation of β-catenin gene is also expected as a useful biomarker for diagnosis of adult hepatocellular carcinoma.
腫瘍から流出してくる遊離ＤＮＡを血液中等から回収して、遺伝子の変異を検出することでがんを診断するリキッドバイオプシーと言われる方法が開発されつつある。リキッドバイオプシーによれば、遺伝子の変異の検出によって手術による腫瘍の切除又は生検の必要がなくなり、患者の負担が軽減される。リキッドバイオプシーでは、血液中又は体液中にある極めて微量の腫瘍由来のＤＮＡと正常のＤＮＡとが混ざった試料が用いられるため、高感度かつ迅速に遺伝子の変異を検出することが肝要である。 A method called liquid biopsy for diagnosing cancer by collecting free DNA flowing out of a tumor from blood or the like and detecting a gene mutation is being developed. According to liquid biopsy, the detection of a gene mutation eliminates the need for surgical tumor resection or biopsy, reducing the burden on the patient. In liquid biopsy, a sample in which a very small amount of tumor-derived DNA in blood or body fluid is mixed with normal DNA is used. Therefore, it is important to detect gene mutations with high sensitivity and speed.
遺伝子の変異の検出には、核酸の塩基配列を一塩基ずつ決定していくダイレクトシークエンス法が用いられる。変異部位が明らかであれば、変異部位を切断する制限酵素による解析法及びインベーダー法等も遺伝子の変異の検出に用いられる。また、変異部位を特異的に増幅するように設計したプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）法でも変異が検出できる。 For detection of gene mutation, a direct sequencing method is used in which the base sequence of a nucleic acid is determined one by one. If the mutation site is clear, an analysis method using a restriction enzyme that cleaves the mutation site, an invader method, and the like can also be used for detection of a gene mutation. Mutations can also be detected by polymerase chain reaction (PCR) using primers designed to specifically amplify mutation sites.
特許文献１には、変異を高感度に検出するために、ＰＣＲ法において変異部位に特異的に結合するプローブを用いるＴａｑＭａｎ（商標） ＰＣＲ法によるＵＧＴ１Ａ１遺伝子の多型検出方法が開示されている。該多型検出方法では、プロモーター領域に存在する多型ＵＧＴ１Ａ１＊２８と、エクソン１に存在する多型ＵＧＴ１Ａ１＊６を含む４２４ｂｐのアンプリコンをＰＣＲ産物として増幅し、ＵＧＴ１Ａ１＊２８の野生型及び変異型をそれぞれ検出するためのプローブ２種と、ＵＧＴ１Ａ１＊６の野生型及び変異型をそれぞれ検出するためのプローブ２種と、を用いて遺伝子型が決定される。 Patent Document 1 discloses a UGT1A1 gene polymorphism detection method by TaqMan ™ PCR method using a probe that specifically binds to a mutation site in PCR method in order to detect mutation with high sensitivity. In the polymorphism detection method, a 424 bp amplicon containing a polymorphism UGT1A1 * 28 present in the promoter region and a polymorphism UGT1A1 * 6 present in exon 1 is amplified as a PCR product, and the wild type and mutation of UGT1A1 * 28 are detected. The genotype is determined using two types of probes for detecting the type and two types of probes for detecting the wild type and the mutant type of UGT1A1 * 6, respectively.
タンパク質の機能に重要な部位を構成するアミノ酸の変異が、がん等の疾患に関連していることがある。タンパク質の機能に重要な部位は、例えば、βカテニンであればユビキチン化による分解に必要な部位、ＡＬＫであれば活性化部位である。タンパク質の機能に重要な部位をコードする遺伝子の領域において、疾患に関連する変異が集中する領域はホットスポットと言われる。タンパク質を構成するアミノ酸は、４種類の塩基３個からなるコドンで規定される。このため、タンパク質の機能に重要な部位を構成するアミノ酸に変異がある場合、ホットスポットの塩基配列のパターンは、複数あることが通常である。 Amino acid mutations that constitute sites important for protein function may be related to diseases such as cancer. The site important for the function of the protein is, for example, a site necessary for degradation by ubiquitination if it is β-catenin, and an activation site if it is ALK. In a region of a gene encoding a site important for protein function, a region where mutations related to a disease are concentrated is called a hot spot. Amino acids constituting the protein are defined by codons consisting of three types of four bases. For this reason, when there is a mutation in an amino acid that constitutes a site important for the function of a protein, there are usually a plurality of hot spot base sequence patterns.
ホットスポットにおける変異の検出において、ダイレクトシークエンス法は煩雑で時間を要することに加え、検体内のＤＮＡ量が少ない場合は変異の検出が難しい。また、上述の変異部位に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ法では、変異部位の塩基の種類ごとにプライマーを設計し、ＰＣＲを繰り返し行う必要がある。 In the detection of mutations in hot spots, the direct sequencing method is complicated and time consuming, and it is difficult to detect mutations when the amount of DNA in the sample is small. Further, in the PCR method using a primer specific to the mutation site described above, it is necessary to design a primer for each type of base at the mutation site and repeat PCR.
上記特許文献１に開示された多型検出方法では、ホットスポットのように多数の変異が集中する領域で、しかも変異部位の塩基の種類が不明の場合、想定される塩基の種類ごとに異なる蛍光標識を有するプローブが必要なため、プローブの調製作業及び多種類の蛍光の解析作業が煩雑で迅速な解析が困難である。さらに、特許文献１に記載されているように、４２４ｂｐもの大きさのアンプリコンでは、増幅効率及び特異性等が低下するのが通常であり、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子以外の遺伝子を対象とした場合に、高い検出感度が得られるのかが不明である。 In the polymorphism detection method disclosed in Patent Document 1 above, in a region where a large number of mutations are concentrated, such as a hot spot, and when the type of base at the mutation site is unknown, fluorescence that varies depending on the type of base assumed. Since a probe having a label is necessary, the preparation of the probe and the analysis of various types of fluorescence are complicated and it is difficult to perform a rapid analysis. Furthermore, as described in Patent Document 1, in an amplicon as large as 424 bp, amplification efficiency, specificity and the like are usually lowered, and this is high when a gene other than the UGT1A1 gene is targeted. It is unknown whether detection sensitivity can be obtained.
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、変異が集中する領域における変異の存在の有無を簡便かつ高感度に検出できる遺伝子の変異検出キット及び遺伝子の変異検出方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a gene mutation detection kit and a gene mutation detection method capable of easily and highly sensitively detecting the presence or absence of a mutation in a region where mutations are concentrated. Objective.
本発明の第１の観点に係る遺伝子の変異検出キットは、
標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブと、
前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、
前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる１つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対と、
を備える。
The gene mutation detection kit according to the first aspect of the present invention comprises:
A probe that hybridizes to each of a plurality of independent non-overlapping regions included in an exon of a target gene when the base sequence of the region is a wild type,
A labeling substance indicating that each of the probes has hybridized to the region;
A primer pair designed to include all of the plurality of regions in one amplicon obtained by polymerase chain reaction;
Is provided.
この場合、前記標識物質は、
前記プローブが有する蛍光色素であって、
前記プローブは、
前記蛍光色素の発光を抑制する消光剤をさらに有し、
前記プローブが前記領域にハイブリダイズすると、前記消光剤による前記蛍光色素の発光の抑制が解除される、
こととしてもよい。
In this case, the labeling substance is
A fluorescent dye possessed by the probe,
The probe is
A quencher that suppresses light emission of the fluorescent dye,
When the probe is hybridized to the region, the suppression of the emission of the fluorescent dye by the quencher is released,
It is good as well.
また、前記蛍光色素の発光の抑制は、
エキソヌクレアーゼ活性によって前記領域にハイブリダイズした前記プローブが分解されると解除される、
こととしてもよい。
In addition, suppression of the emission of the fluorescent dye,
Released when the probe hybridized to the region is degraded by exonuclease activity,
It is good as well.
また、前記複数の領域各々には、
複数の部位に変異が含まれ得る、
こととしてもよい。
In each of the plurality of regions,
Multiple sites can contain mutations,
It is good as well.
また、前記標的遺伝子のエクソンの塩基配列は、
βカテニン遺伝子のエクソン３の塩基配列であって、
前記プローブは、
配列番号１に示される塩基配列を有する第１のプローブと、
配列番号２に示される塩基配列を有する第２のプローブと、
を含み、
前記プライマー対は、
配列番号３に示される塩基配列を有するフォワードプライマーと、
配列番号４に示される塩基配列を有するリバースプライマーと、
からなる、
こととしてもよい。
The base sequence of the exon of the target gene is
The base sequence of exon 3 of β-catenin gene,
The probe is
A first probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
A second probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2,
Including
The primer pair is
A forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3,
A reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Consist of,
It is good as well.
本発明の第２の観点に係る遺伝子の変異検出方法は、
次の（ａ）〜（ｄ）を含む反応液でポリメラーゼ連鎖反応を行う反応ステップと、
（ａ）標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブ、
（ｂ）前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質、
（ｃ）前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる１つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対、
（ｄ）前記複数の領域を含む核酸、
前記標識物質に基づいて、前記プローブがそれぞれ前記領域にハイブリダイズしたか否かを判定する判定ステップと、
を含む。
The gene mutation detection method according to the second aspect of the present invention comprises:
A reaction step of performing a polymerase chain reaction with a reaction solution containing the following (a) to (d);
(A) a probe that hybridizes to each of a plurality of independent non-overlapping regions included in an exon of a target gene when the base sequence of the region is a wild type,
(B) a labeling substance indicating that each of the probes has hybridized to the region;
(C) a primer pair designed to include all of the plurality of regions in one amplicon obtained by polymerase chain reaction;
(D) a nucleic acid comprising the plurality of regions,
A determination step of determining whether or not each of the probes is hybridized to the region based on the labeling substance;
including.
本発明によれば、変異が集中する領域における変異の存在の有無を簡便かつ高感度に検出できる。 According to the present invention, the presence or absence of a mutation in a region where mutations are concentrated can be detected easily and with high sensitivity.
本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。 Embodiments according to the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. In addition, this invention is not limited by the following embodiment and drawing.
（実施の形態）
本実施の形態に係る遺伝子の変異検出キットは、プローブと、標識物質と、プライマー対と、を備える。プローブは、標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに対応させるため、複数種である。「相互に重複しない独立した複数の領域」とは、同一部位の塩基を共有しない複数の領域を意味する。領域間の間隔は、特に限定されないが、１〜３０ｂｐ、１〜２０ｂｐ又は１〜１０ｂｐである。
(Embodiment)
The gene mutation detection kit according to the present embodiment includes a probe, a labeling substance, and a primer pair. There are a plurality of types of probes in order to correspond to each of a plurality of independent regions included in exons of the target gene that do not overlap each other. “Independent regions that do not overlap each other” means a plurality of regions that do not share the same base. Although the space | interval between area | regions is not specifically limited, It is 1-30 bp, 1-20 bp, or 1-10 bp.
各プローブは、当該複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズする。１つの領域の長さは、特に限定されず、１５〜３０塩基又は１５〜２５塩基、好ましくは１５〜２０塩基である。以下では、上記標的遺伝子をβカテニン遺伝子とした場合について説明する。 Each probe hybridizes to each of the plurality of regions when the base sequence of the region is a wild type. The length of one region is not particularly limited, and is 15 to 30 bases or 15 to 25 bases, preferably 15 to 20 bases. Hereinafter, a case where the target gene is a β-catenin gene will be described.
図１は、野生型のβカテニン遺伝子（「ＣＴＮＮＢ１遺伝子」ともいう）のエクソン３の一方の鎖の塩基配列を示す。エクソン３の５’末端側から８０〜９８番目の領域及び５’末端側から１０８〜１２４番目の領域は、上述のホットスポットに相当し、各領域には複数の部位に変異が含まれ得る。より詳細には、ユビキチン化によるβカテニンの分解に必要な部位に含まれるアミノ酸は、エクソン３の５’末端側から８２〜８４番目の塩基からなるコドン（ＧＡＣ）、８５〜８７番目の塩基からなるコドン（ＴＣＴ）、８８〜９０番目の塩基からなるコドン（ＧＧＡ）、９１〜９３番目の塩基からなるコドン（ＡＴＣ）及び９７〜９９番目の塩基からなるコドン（ＴＣＴ）、１０９〜１１１番目の塩基からなるコドン（ＡＣＣ）及び１２１〜１２３番目の塩基からなるコドン（ＴＣＴ）によってコードされる。 FIG. 1 shows the base sequence of one strand of exon 3 of a wild-type β-catenin gene (also referred to as “CTNNB1 gene”). The 80th to 98th region from the 5 'end side and the 108th to 124th region from the 5' end side of exon 3 correspond to the hot spots described above, and each region may contain mutations at a plurality of sites. More specifically, the amino acids contained in the site required for the degradation of β-catenin by ubiquitination are the codon (GAC) consisting of the 82-84th base from the 5 ′ end side of exon 3, and the 85-87th base. The codon consisting of the 88th to 90th bases (GGA), the codon consisting of the 91st to 93rd bases (ATC) and the codon consisting of the 97th to 99th bases (TCT), the 109th to 111th It is encoded by a codon consisting of a base (ACC) and a codon consisting of the 121st to 123rd bases (TCT).
本実施の形態では、ホットスポットを考慮して、βカテニン遺伝子のエクソン３内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域を、図１に示す領域Ｒ１及び領域Ｒ２とする。この場合、上記プローブは、例えば、Ｒ１の塩基配列が野生型の場合にＲ１にハイブリダイズする第１のプローブと、Ｒ２の塩基配列が野生型の場合にＲ２にハイブリダイズする第２のプローブと、である。第１のプローブ及び第２のプローブは、それぞれＲ１及びＲ２の塩基配列に相補的な塩基配列を有するものであってもよいし、Ｒ１及びＲ２それぞれの相補鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するものであってもよい。具体的には、第１のプローブは、配列番号１に示される塩基配列を有し、第２のプローブは、配列番号２に示される塩基配列を有する。 In the present embodiment, in consideration of hot spots, a plurality of independent regions that are included in exon 3 of the β-catenin gene and do not overlap each other are defined as region R1 and region R2 shown in FIG. In this case, the probe includes, for example, a first probe that hybridizes to R1 when the base sequence of R1 is wild type, and a second probe that hybridizes to R2 when the base sequence of R2 is wild type. . The first probe and the second probe may have base sequences complementary to the base sequences of R1 and R2, respectively, or base sequences complementary to the base sequences of the complementary strands of R1 and R2, respectively. It may have. Specifically, the first probe has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the second probe has the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
第１のプローブ及び第２のプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、既知の方法で合成することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、塩基配列に従って、固相ホスホルアミダイト法及びトリエステル法等の任意の核酸合成法により合成される。オリゴヌクレオチドは、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置で合成することもできる第１のプローブ及び第２のプローブの長さは、特に限定されず、変異を検出したい領域の長さに応じて適宜設定される。第１のプローブ及び第２のプローブの長さは、例えば、それぞれ１０塩基以上、１５〜３０塩基又は１５〜２５塩基、好ましくは１５〜２０塩基である。 Oligonucleotides as the first probe and the second probe can be synthesized by a known method. Oligonucleotides are synthesized by any nucleic acid synthesis method such as solid phase phosphoramidite method and triester method according to the base sequence. The lengths of the first probe and the second probe that can be synthesized with a commercially available automatic oligonucleotide synthesizer are not particularly limited, and the oligonucleotide is appropriately set according to the length of the region where mutation is to be detected. The The lengths of the first probe and the second probe are, for example, 10 bases or more, 15 to 30 bases, or 15 to 25 bases, preferably 15 to 20 bases, respectively.
上記第１のプローブ及び第２のプローブは、ＰＣＲ法で増幅されたアンプリコンにハイブリダイズさせる。ＰＣＲ法におけるプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型となるＤＮＡに相補的なデオキシヌクレオチド三リン酸がその３’末端に付加されて、５’末端から３’末端の方向に伸長される。ＰＣＲ法では、反応温度の変化により、２本鎖の鋳型のＤＮＡが１本鎖にほどかれ、プライマーが鋳型のＤＮＡにアニーリングされ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が行われ、伸長されたプライマーと鋳型のＤＮＡとがほどかれる。これを繰り返すことにより、アンプリコンを増幅することができる。プライマー対とは、例えば、２本鎖の鋳型ＤＮＡのコーディング鎖側を５’末端から３’末端の方向に伸長するためのフォワードプライマーと、非コーディング鎖側を５’末端から３’末端の方向に伸長するためのリバースプライマーとの対をいう。 The first probe and the second probe are hybridized to an amplicon amplified by the PCR method. The primer in the PCR method is extended in the direction from the 5 'end to the 3' end by adding a deoxynucleotide triphosphate complementary to the template DNA to the 3 'end by DNA polymerase. In the PCR method, a double-stranded template DNA is unwound into a single strand due to a change in reaction temperature, a primer is annealed to the template DNA, an extension reaction is performed by DNA polymerase, and the extended primer and template Unraveled with DNA. By repeating this, the amplicon can be amplified. The primer pair is, for example, a forward primer for extending the coding strand side of a double-stranded template DNA from the 5 ′ end to the 3 ′ end, and the non-coding strand side from the 5 ′ end to the 3 ′ end. A pair with a reverse primer for extension.
上記遺伝子の変異検出キットが備えるプライマー対は、Ｒ１及びＲ２のすべてを、ＰＣＲで得られる１つのアンプリコンに含むように設計される。アンプリコンの長さは、Ｒ１及びＲ２のすべてを含むのであれば特に限定されない。ＰＣＲの効率及び特異性を考慮すると、アンプリコンの長さは最長で１００〜２００塩基対程度が好ましい。アンプリコンの長さとしては、３０〜２００、５０〜１５０又は６０〜１００塩基対が好ましい。フォワードプライマーはＲ１よりも５’末端側に設計され、リバースプライマーは、Ｒ２よりも３’末端側に設計される。例えば、Ｒ１及びＲ２を１つのアンプリコンに含むように設計されるフォワードプライマー及びリバースプライマーは、図１において下線で示された塩基配列に基づいて設計される。好適には、プライマー対は、配列番号３に示す塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列を有するリバースプライマーと、からなる。 The primer pair provided in the mutation detection kit of the gene is designed to include all of R1 and R2 in one amplicon obtained by PCR. The length of the amplicon is not particularly limited as long as it includes all of R1 and R2. Considering the efficiency and specificity of PCR, the length of the amplicon is preferably about 100 to 200 base pairs at the longest. The length of the amplicon is preferably 30 to 200, 50 to 150, or 60 to 100 base pairs. The forward primer is designed 5 'end side from R1, and the reverse primer is designed 3' end side from R2. For example, the forward primer and the reverse primer designed to include R1 and R2 in one amplicon are designed based on the base sequence indicated by the underline in FIG. Suitably, a primer pair consists of a forward primer which has a base sequence shown to sequence number 3, and a reverse primer which has a base sequence shown to sequence number 4.
ハイブリダイズの条件は、本技術分野で通常用いられる条件でよい。例えば、Ｒ１の塩基配列が野生型の場合に第１のプローブがＲ１にハイブリダイズする一方で、Ｒ１の塩基配列が野生型と異なる場合には第１のプローブがＲ１にハイブリダイズしないストリンジェントな条件である。ストリンジェントな条件としては、公知の条件を用いてよく、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ及び６５℃で保温等である。 Hybridization conditions may be those normally used in this technical field. For example, when the base sequence of R1 is wild type, the first probe hybridizes to R1, while when the base sequence of R1 is different from the wild type, the first probe does not hybridize to R1. It is a condition. As stringent conditions, known conditions may be used, for example, 0.2 × SSC, 0.1% SDS, and heat retention at 65 ° C.
次に、標識物質について説明する。該標識物質は、相互に異なる複数種の標識物質である。標識物質は、上述の第１のプローブ及び第２のプローブが、それぞれＲ１及びＲ２にハイブリダイズしたことを示すものであれば特に限定されない。 Next, the labeling substance will be described. The labeling substance is a plurality of different labeling substances. The labeling substance is not particularly limited as long as it indicates that the first probe and the second probe described above have hybridized to R1 and R2, respectively.
好ましくは、標識物質は第１のプローブ及び第２のプローブがそれぞれ有する第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素である。蛍光色素としては、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＴＹＥ５６３、ＴＥＸ６１５、ＴＹＥ６６５、Ｃｙ５及びＣｙ３等、本技術分野で用いられるものが適宜用いられる。なお、以下では、第１のプローブに関して主に説明するが、特に言及しない限り第１のプローブと第２のプローブとは同様である。 Preferably, the labeling substance is a first fluorescent dye and a second fluorescent dye that the first probe and the second probe have, respectively. As the fluorescent dye, those used in this technical field such as FAM, HEX, TET, Yakima Yellow, TYE563, TEX615, TYE665, Cy5 and Cy3 are appropriately used. Hereinafter, the first probe will be mainly described, but the first probe and the second probe are the same unless otherwise specified.
第１の蛍光色素は、好ましくは、第１のプローブとＲ１とのハイブリダイズを経て蛍光を発する、あるいは蛍光強度を増大させるものである。例えば、第１のプローブは、第１の蛍光色素の発光を抑制する第１の消光剤（クエンチャー）をさらに有し、第１のプローブがＲ１にハイブリダイズすると、第１の消光剤による第１の蛍光色素の発光の抑制が解除されるようにしてもよい。第１の蛍光色素の発光の抑制の態様は特に限定されない。例えば、第１の消光剤は、蛍光共鳴エネルギー移動の消光原理で、第１の蛍光色素の発光を抑制してもよい。消光剤としては、例えばＺＥＮ、ＩＢＦＱ、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＩＢＱＲ等が挙げられる。 The first fluorescent dye preferably emits fluorescence or increases fluorescence intensity through hybridization of the first probe and R1. For example, the first probe further includes a first quencher (quencher) that suppresses the emission of the first fluorescent dye, and when the first probe hybridizes to R1, the first quencher by the first quencher The suppression of light emission of one fluorescent dye may be released. The aspect of suppression of light emission of the first fluorescent dye is not particularly limited. For example, the first quencher may suppress the light emission of the first fluorescent dye based on the quenching principle of fluorescence resonance energy transfer. Examples of the quencher include ZEN, IBFQ, TAMRA, BHQ1, BHQ2, and IBQR.
第１の蛍光色素の発光の抑制は、第１の蛍光色素が第１の消光剤から離れると解除されるようにしてもよい。この場合、第１の蛍光色素の発光の抑制は、ＰＣＲ法で用いるＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によってＲ１にハイブリダイズした第１のプローブが分解されると解除されるのが好ましい。このような第１のプローブとしては、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブが挙げられる。 The suppression of the emission of the first fluorescent dye may be released when the first fluorescent dye is separated from the first quencher. In this case, the suppression of the emission of the first fluorescent dye is preferably canceled when the first probe hybridized to R1 is decomposed by the exonuclease activity of the DNA polymerase used in the PCR method. An example of such a first probe is a TaqMan ™ probe.
第１の蛍光色素及び第１の消光剤は、第１のプローブの末端に公知の方法で付加される。例えば、第１の蛍光色素が第１のプローブの５’末端に付加され、第１の消光剤が第１のプローブの３’末端に付加される。 The first fluorescent dye and the first quencher are added to the end of the first probe by a known method. For example, a first fluorescent dye is added to the 5 'end of the first probe, and a first quencher is added to the 3' end of the first probe.
第１の蛍光色素及び第１の消光剤を有する第１のプローブは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法のプローブであってもよい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法では、第１のプローブは、Ｒ１の塩基配列に相補的な塩基配列を持つ１本鎖ＤＮＡのループと、ループの塩基配列を挟むように設計された互いに相補的な塩基配列（アーム）がアニールした２本鎖のステムと、からなるヘアピン型構造のプローブである。当該プローブの５’末端及び３’末端は、それぞれ蛍光色素及び消光剤で修飾されている。当該プローブは、遊離状態ではヘアピン型構造によって蛍光色素と消光剤とが近接しているため、蛍光色素から発光される蛍光がエネルギー転移により抑制される。Ｒ１にループがハイブリダイズすると、ヘアピン型構造がとれず、蛍光色素及び消光剤の間隔が広がるために抑制が解除されて蛍光色素の蛍光強度が増加する。 The first probe having the first fluorescent dye and the first quencher may be a probe of the Molecular Beacon method. In the Molecular Beacon method, the first probe is composed of a single-stranded DNA loop having a base sequence complementary to the base sequence of R1 and complementary base sequences (arms) designed to sandwich the base sequence of the loop. ) Is a probe having a hairpin structure comprising an annealed double-stranded stem. The 5 'end and 3' end of the probe are modified with a fluorescent dye and a quencher, respectively. Since the fluorescent dye and the quencher are close to each other in the free state due to the hairpin structure, the fluorescence emitted from the fluorescent dye is suppressed by energy transfer. When the loop is hybridized to R1, the hairpin structure cannot be taken, and the interval between the fluorescent dye and the quencher is widened, so the suppression is released and the fluorescent intensity of the fluorescent dye increases.
また、第１の蛍光色素及び第１の消光剤を有する第１のプローブとして、サイクリングプローブ法のプローブが採用できる。サイクリングプローブ法では、第１のプローブとして、Ｒ１の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＲＮＡとＤＮＡとからなるキメラプローブを用いる。キメラプローブの、ＲＮＡの部分を挟んで一方には第１の蛍光色素が、他方には第１の消光剤が付加される。キメラプローブの第１の蛍光色素の発光は、第１の消光剤によって抑制されているが、キメラプローブがＲ１にハイブリダイズすると、ＲＮａｓｅ ＨによりＲＮＡの部分が切断される。この結果、第１の蛍光色素の発光抑制が解除されて蛍光強度が増加する。 In addition, as the first probe having the first fluorescent dye and the first quencher, a probe of the cycling probe method can be employed. In the cycling probe method, a chimeric probe composed of RNA and DNA having a base sequence complementary to the base sequence of R1 is used as the first probe. The first fluorescent dye is added to one side of the chimeric probe across the RNA portion, and the first quencher is added to the other side. The light emission of the first fluorescent dye of the chimeric probe is suppressed by the first quencher, but when the chimeric probe hybridizes to R1, the RNA portion is cleaved by RNase H. As a result, the emission suppression of the first fluorescent dye is released and the fluorescence intensity increases.
続いて、上記遺伝子の変異検出キットに好適な遺伝子の変異検出方法について説明する。当該遺伝子の変異検出方法は、反応ステップと、判定ステップと、を含む。反応ステップでは、上述のプローブ、標識物質、プライマー対及びＲ１及びＲ２を含む核酸を含む反応液でＰＣＲを行う。以下では、第１の蛍光色素及び第１の消光剤を有する第１のプローブと、第２の蛍光色素及び第２の消光剤を有する第２のプローブとを用いた場合を例に説明する。 Subsequently, a gene mutation detection method suitable for the gene mutation detection kit will be described. The gene mutation detection method includes a reaction step and a determination step. In the reaction step, PCR is performed using a reaction solution containing the above-described probe, labeling substance, primer pair, and nucleic acid containing R1 and R2. Hereinafter, a case where a first probe having a first fluorescent dye and a first quencher and a second probe having a second fluorescent dye and a second quencher are used will be described as an example.
Ｒ１及びＲ２を含む核酸は、例えば、被検者又は患者の血液、組織及び腫瘍等からプロテイナーゼＫ／フェノール抽出法、プロテイナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法及びボイリング法等の公知の方法で抽出できる。必要に応じて、抽出した核酸を精製してもよい。ＰＣＲの反応条件は、アンプリコンの増幅効率等を指標に設定すればよい。 Nucleic acids containing R1 and R2 are, for example, known methods such as proteinase K / phenol extraction method, proteinase K / phenol / chloroform extraction method, alkali lysis method and boiling method from subject's or patient's blood, tissue and tumor. Can be extracted. If necessary, the extracted nucleic acid may be purified. The PCR reaction conditions may be set using the amplification efficiency of the amplicon as an index.
判定ステップでは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素に基づいて、第１のプローブ及び第２のプローブがそれぞれＲ１及びＲ２にハイブリダイズしたか否かを判定する。判定ステップでは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の蛍光強度を測定することでハイブリダイズしたか否かを判定できる。判定ステップでは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素それぞれの励起波長及び検出波長を用いることで、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の蛍光強度を個別に測定することができる。蛍光強度は、任意の測光装置、例えばリアルタイムＰＣＲ装置でも測定できる。 In the determination step, based on the first fluorescent dye and the second fluorescent dye, it is determined whether or not the first probe and the second probe are hybridized to R1 and R2, respectively. In the determination step, it can be determined whether or not hybridization has occurred by measuring the fluorescence intensities of the first fluorescent dye and the second fluorescent dye. In the determination step, the fluorescence intensity of the first fluorescent dye and the second fluorescent dye can be individually measured by using the excitation wavelength and the detection wavelength of the first fluorescent dye and the second fluorescent dye, respectively. The fluorescence intensity can be measured by any photometric device such as a real-time PCR device.
第１のプローブは、Ｒ１の塩基配列が野生型の場合にＲ１にハイブリダイズする。このため、判定ステップにおいて、第１のプローブがハイブリダイズしないと判定された場合、上記の核酸におけるＲ１に変異があることがわかる。第２のプローブは、Ｒ２の塩基配列が野生型の場合にＲ２にハイブリダイズする。このため、判定ステップにおいて、第２のプローブがハイブリダイズしないと判定された場合、上記の核酸におけるＲ２に変異があることがわかる。通常、変異が存在する場合はＲ１及びＲ２ともに変異が存在するのではなく、Ｒ１及びＲ２のいずれか１か所にのみ変異が存在する。このため、判定ステップにおいて、第１のプローブ及び第２のプローブの双方がハイブリダイズしないと判定された場合、上記の核酸におけるＲ１及びＲ２の双方が欠損しているか、あるいはβカテニン遺伝子が反応液内に存在しないことがわかる。なお、判定ステップにおいて、第１のプローブがハイブリダイズすると判定された場合に、上記の核酸におけるＲ１に変異がない、すなわちＲ１の塩基配列は野生型である、としてもよい。 The first probe hybridizes to R1 when the base sequence of R1 is wild type. For this reason, when it is determined in the determination step that the first probe does not hybridize, it is found that there is a mutation in R1 in the nucleic acid. The second probe hybridizes to R2 when the base sequence of R2 is wild type. For this reason, when it is determined in the determination step that the second probe does not hybridize, it is found that there is a mutation in R2 in the nucleic acid. Usually, when a mutation exists, both R1 and R2 do not exist, but a mutation exists only in one of R1 and R2. For this reason, in the determination step, when it is determined that both the first probe and the second probe do not hybridize, both R1 and R2 in the nucleic acid are missing, or the β-catenin gene is present in the reaction solution. It turns out that it does not exist in. In the determination step, when it is determined that the first probe is hybridized, there is no mutation in R1 in the nucleic acid, that is, the base sequence of R1 may be a wild type.
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る遺伝子の変異検出キットによれば、標的遺伝子のエクソン内に含まれる複数の領域における変異の存在の有無を、変異した塩基の種類又は領域内の部位に制約されることなく検出できる。また、該遺伝子の変異検出キットは、変異を有する微量のＤＮＡの存在を高感度で検出できる。このため、ホットスポットのような変異が集中する領域における変異の存在の有無を簡便かつ高感度に検出できる。 As described above in detail, according to the gene mutation detection kit of the present embodiment, the presence or absence of mutations in a plurality of regions included in the exons of the target gene is determined based on the type or region of the mutated base. It is possible to detect without being restricted by the region. Moreover, the mutation detection kit of the gene can detect the presence of a trace amount of DNA having a mutation with high sensitivity. For this reason, the presence or absence of a mutation in a region where mutations are concentrated, such as a hot spot, can be detected easily and with high sensitivity.
また、上記遺伝子の変異検出キットによって、血液又は体液中の遊離ＤＮＡにおける遺伝子の変異も検出できる。したがって、上記遺伝子の変異検出キットは、診断のみならず、手術又は化学療法の効果判定、さらには再発及び再燃の判定にも利用できる。当該変異検出キットによって、第１の蛍光色素の蛍光強度に基づいて野生型に対する変異の存在比又は変異の頻度を解析することができる。これにより、治療又は処置後の患者における変異ＤＮＡの量的推移を検出できるため、当該変異検出キットは変異の診断又は治療のフォローアップに有用である。 In addition, gene mutations in free DNA in blood or body fluid can be detected by the gene mutation detection kit. Therefore, the gene mutation detection kit can be used not only for diagnosis but also for determining the effect of surgery or chemotherapy, and for determining recurrence and relapse. The mutation detection kit can analyze the abundance ratio of mutations relative to the wild type or the mutation frequency based on the fluorescence intensity of the first fluorescent dye. Thereby, since the quantitative transition of the mutant DNA in the patient after treatment or treatment can be detected, the mutation detection kit is useful for diagnosis of mutation or follow-up of therapy.
なお、該遺伝子の変異検出キットは、Ｒ１及びＲ２における変異の存在の有無のみの検出を目的にしているため、上記遺伝子の変異検出キットは、変異があるＲ１にハイブリダイズするプローブ及び変異があるＲ２にハイブリダイズするプローブを含まない。 In addition, since the mutation detection kit of the gene is intended to detect only the presence or absence of the mutation in R1 and R2, the mutation detection kit of the gene has a probe and a mutation that hybridize to R1 having the mutation. Does not include probes that hybridize to R2.
なお、第１の蛍光色素は、第１のプローブがＲ１にハイブリダイズしたことを示すものであれば足りるため、第１のプローブとＲ１とのハイブリダイズを経て蛍光を消光する、あるいは蛍光強度を減少させるものであってもよい。この場合、判定ステップにおいて、蛍光強度が低下したプローブをハイブリダイズしたと判定すればよい。このような第１のプローブとして、例えば蛍光消光プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ）が挙げられる。蛍光消光プローブは、プローブの末端に蛍光標識されたシトシンを有し、相補的な塩基配列を有する核酸とハイブリダイズすると蛍光強度が低下する。蛍光消光プローブを用いれば、プローブに消光剤を付加しなくても、核酸にハイブリダイズしたことを示すことができる。 The first fluorescent dye is sufficient if it indicates that the first probe has hybridized to R1, so that the fluorescence is quenched or the fluorescence intensity is increased through hybridization of the first probe and R1. It may be reduced. In this case, in the determination step, it may be determined that the probe having reduced fluorescence intensity has been hybridized. An example of such a first probe is a fluorescence quenching probe (Quenching Probe). A fluorescence quenching probe has cytosine fluorescently labeled at the end of the probe, and when it is hybridized with a nucleic acid having a complementary base sequence, the fluorescence intensity decreases. If a fluorescence quenching probe is used, it can be shown that it has hybridized to a nucleic acid without adding a quencher to the probe.
なお、標的遺伝子はβカテニン遺伝子に限定されない。標的遺伝子としては、ＫＲＡＳ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子及びＡＬＫ遺伝子等が挙げられる。ＫＲＡＳ遺伝子に関しては、エクソン２のコドン１２、１３を構成する６個の塩基の変異と膵がん又は大腸がんとの関連が知られている。例えば、図２に示すように、コドン１２、１３を含む領域Ｒ３に対して第１のプローブを設計し、Ｒ３よりも３’末端側の領域Ｒ４に第２のプローブを設定すればよい。Ｒ３及びＲ４を１つのアンプリコンに含むように設計されるフォワードプライマー及びリバースプライマーは、好ましくは図２において下線で示された塩基配列に基づいてそれぞれ設計される。疾患と関連性の高い変異がＲ４になくても、第２のプローブの第２の蛍光色素の蛍光強度をコントロールとすることで、ＰＣＲ及びプローブのハイブリダイズを確認することができる。 The target gene is not limited to the β-catenin gene. Examples of target genes include KRAS gene, EGFR gene, ALK gene and the like. Regarding the KRAS gene, it is known that 6 base mutations constituting codons 12 and 13 of exon 2 are associated with pancreatic cancer or colon cancer. For example, as shown in FIG. 2, a first probe may be designed for a region R3 including codons 12 and 13, and a second probe may be set in a region R4 on the 3 'end side of R3. The forward primer and the reverse primer designed so as to include R3 and R4 in one amplicon are preferably designed based on the base sequences indicated by underlining in FIG. Even if there is no mutation highly relevant to the disease in R4, PCR and probe hybridization can be confirmed by using the fluorescence intensity of the second fluorescent dye of the second probe as a control.
また、上記の実施の形態では、標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域として、２個の領域の場合を説明したが、領域の個数は２個に限らない。例えば、標的遺伝子のエクソン内を３個、４個、５個、６個又は７個以上の相互に重複しない独立した領域それぞれに対してプローブを設計してもよい。 Further, in the above-described embodiment, the case of two regions has been described as the plurality of independent regions that are included in the exon of the target gene and do not overlap with each other. However, the number of regions is not limited to two. For example, probes may be designed for each of 3, 4, 5, 6, 7 or more independent regions that do not overlap each other within the exon of the target gene.
なお、上記の反応ステップでは、反応液をドロプレット（ウェル）に分けて、各ドロップレット内でＰＣＲを行うデジタルＰＣＲ法を用いてもよい。デジタルＰＣＲ法によれば、各ドロプレットの第１の蛍光及び第２の蛍光を高精度で定量できるため、変異の存在の有無及び割合をさらに高感度に検出できる。デジタルＰＣＲ法を用いることで、野生型の塩基配列を有する核酸に対して、わずかに存在する変異型の塩基配列を有する核酸を検出することができる。 In the above reaction step, a digital PCR method in which the reaction solution is divided into droplets (wells) and PCR is performed in each droplet may be used. According to the digital PCR method, since the first fluorescence and the second fluorescence of each droplet can be quantified with high accuracy, the presence / absence and ratio of the mutation can be detected with higher sensitivity. By using the digital PCR method, it is possible to detect a nucleic acid having a mutated base sequence that is slightly present with respect to a nucleic acid having a wild type base sequence.
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples.
（実施例）
βカテニン遺伝子のエクソン３を標的遺伝子として変異の有無を検出した。βカテニンのＡｓｐ３２をコードするコドンがＴｙｒをコードするコドンに変異したＤＮＡが野生型のＤＮＡに混在するサンプル、及びβカテニンのＴｈｒ４１をコードするコドンがＩｌｅをコードするコドンに変異したＤＮＡが野生型のＤＮＡに混在するサンプルを解析した。Ａｓｐ３２をコードするコドンは、上記Ｒ１に存在する。Ｔｈｒ４１をコードするコドンは、上記Ｒ２に存在する。
(Example)
The presence or absence of mutation was detected using exon 3 of β-catenin gene as a target gene. A sample in which a DNA in which the codon encoding Asp32 of β-catenin is mutated to a codon encoding Tyr is mixed in wild-type DNA, and a DNA in which the codon encoding βr-catenin Thr41 is mutated to a codon encoding Ile is wild-type Samples mixed in DNA were analyzed. The codon encoding Asp32 is present in R1 above. A codon encoding Thr41 is present in R2.
小児肝癌（肝芽腫）組織から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとした。詳細には、組織を粉砕し、洗浄後、バッファー（１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１０ｍＭ ＮａＣｌ）５００μｌに溶解し、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（１ｍｇ／ｍｌ ｗｉｔｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ）５００μｌと、１０％ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｐｈａｔｅ）１０μｌと、を加えて、５０℃１時間又は３７℃一晩反応させた。反応後、フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールを２５：２４：１で混合した混合液を１ｍｌ加えて除蛋白した後に遠心し、上清を分離した。クロロホルム及びイソアミルアルコールを２４：１で混合した混合液を上清に０．５ｍｌ加えて遠心分離した。得られた上清に、１／１０倍量の５Ｍ塩化ナトリウムと３倍量のエタノールとを加えて混合後、遠心して塩析したＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを、適量の蒸留水又はＴＥ緩衝液に溶解し、５０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度としたものを鋳型ＤＮＡとした。 DNA extracted from tissue of childhood liver cancer (hepatoblastoma) was used as template DNA. Specifically, the tissue was crushed and washed, and then dissolved in 500 μl of a buffer (10 mM EDTA (pH 8.0), 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 10 mM NaCl), and Proteinase K (1 mg / ml with Buffer A). 500 μl and 10 μl of 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) were added and reacted at 50 ° C. for 1 hour or 37 ° C. overnight. After the reaction, 1 ml of a mixed solution in which phenol, chloroform and isoamyl alcohol were mixed at 25: 24: 1 was added for deproteinization, followed by centrifugation to separate the supernatant. 0.5 ml of a mixed solution in which chloroform and isoamyl alcohol were mixed at 24: 1 was added to the supernatant and centrifuged. To the obtained supernatant, 1/10 times the amount of 5M sodium chloride and 3 times the amount of ethanol were added and mixed, and then centrifuged to collect the salted out DNA. The recovered DNA was dissolved in an appropriate amount of distilled water or TE buffer to obtain a template DNA having a concentration of 50 to 100 ng / ml.
βカテニン遺伝子のエクソン３を挟むようにプライマー対を設計した。フォワードプライマーの塩基配列を配列番号３に示す。リバースプライマーの塩基配列を配列番号４に示す。上述のＲ１に対して配列番号１に示す塩基配列のプローブ１と、Ｒ２に対して配列番号２に示す塩基配列のプローブ２と、を設計した。プローブ１の５’末端はＦＡＭで、３’末端はＩＢＦＱでそれぞれ標識した。プローブ２の５’末端はＨＥＸで、３’末端はＩＢＦＱでそれぞれ標識した。 Primer pairs were designed to sandwich exon 3 of the β-catenin gene. The base sequence of the forward primer is shown in SEQ ID NO: 3. The base sequence of the reverse primer is shown in SEQ ID NO: 4. The probe 1 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 with respect to R1 described above and the probe 2 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 with respect to R2 were designed. Probe 5 was labeled with FAM at the 5 'end and IBFQ at the 3' end. The 5 'end of probe 2 was labeled with HEX and the 3' end was labeled with IBFQ.
ＰＣＲの反応液２２μｌの組成は、以下の通りである。
鋳型ＤＮＡ １μｌ
プローブ１（ＦＡＭ）（２０μＭ） １μｌ
プローブ２（ＨＥＸ）（２０μＭ） ０．５μｌ
フォワードプライマー（１０μＭ） １μｌ
リバースプライマー（１０μＭ） １μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ（１ｕｎｉｔ／μｌ） ２μｌ
バッファー（２ｘｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ） １０μｌ
蒸留水 ５．５μｌ
The composition of 22 μl of the PCR reaction solution is as follows.
Template DNA 1 μl
Probe 1 (FAM) (20 μM) 1 μl
Probe 2 (HEX) (20 μM) 0.5 μl
Forward primer (10 μM) 1 μl
Reverse primer (10 μM) 1 μl
DNA polymerase (1 unit / μl) 2 μl
Buffer (2 × ddPCR Supermix) 10 μl
Distilled water 5.5μl
ＰＣＲの反応条件は、以下の通りである。
９５℃で１０分を１サイクル
９５℃で３０秒、５７℃で４０秒を４０サイクル
９５℃で１０分を１サイクル
４℃で保存
PCR reaction conditions are as follows.
1 cycle at 95 ° C for 10 seconds 95 ° C for 30 seconds, 40 cycles at 57 ° C for 40 seconds 10 cycles at 95 ° C for 1 cycle 4 ° C
ＰＣＲは、反応液をドロプレットに分けて、各ドロップレット内でＰＣＲを行い、それぞれのドロプレットの蛍光を測定するデジタルＰＣＲ法で行った。ドロップレット作成機としてはＱＸ１００（商標） Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（バイオラッド社製）を使用した。デジタルＰＣＲの装置として、ＰｒｏＦｌｅｘ（商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６−ｗｅｌｌ（ライフテクノロジー社製）を用いた。ドロップレットの蛍光の検出には、ＱＸ１００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（バイオラッド社製）を用いた。 PCR was performed by a digital PCR method in which the reaction solution was divided into droplets, PCR was performed in each droplet, and fluorescence of each droplet was measured. A QX100 (trademark) Droplet Generator (manufactured by Bio-Rad) was used as a droplet generator. As a digital PCR apparatus, ProFlex (trademark) PCR System 96-well (manufactured by Life Technology Co., Ltd.) was used. For the detection of droplet fluorescence, QX100 (trademark) Droplet Reader (manufactured by Bio-Rad) was used.
鋳型ＤＮＡに変異がなく野生型の場合、プローブ１及びプローブ２の両方がアンプリコンに結合するため、ＦＡＭの青色及びＨＥＸの緑色の両方の蛍光によって橙色の蛍光が検出される。Ａｓｐ３２をコードするコドンがＴｙｒをコードするコドンに変異したアンプリコンが混在している場合は、プローブ１が結合できず、プローブ２のみが結合するために緑色の蛍光を発するドロプレットが検出される。一方、Ｔｈｒ４１をコードするコドンがＩｌｅをコードするコドンに変異したアンプリコンが混在している場合は、プローブ２が結合できず、プローブ１のみが結合するために青色の蛍光を発するドロプレットが検出される。 When the template DNA has no mutation and is a wild type, both the probe 1 and the probe 2 bind to the amplicon, so that orange fluorescence is detected by both FAM blue and HEX green fluorescence. When the amplicon in which the codon encoding Asp32 is mutated to the codon encoding Tyr is mixed, probe 1 cannot be bound and only probe 2 is bound, and thus a droplet emitting green fluorescence is detected. On the other hand, when the amplicon in which the codon encoding Thr41 is mutated to the codon encoding Ile is mixed, probe 2 cannot be bound, and only probe 1 binds, and a blue fluorescent fluorescent droplet is detected. The
（結果）
図３はＡｓｐ３２Ｔｙｒに対応する変異を有するＤＮＡが混在したサンプルの結果を示す。縦軸にプローブ１を標識したＦＡＭの蛍光強度、横軸にプローブ２を標識したＨＥＸの蛍光強度をプロットすると、両方の蛍光強度が相対的に高いシグナルとＨＥＸの蛍光強度のみが相対的に高いシグナルとを検出できた。両方の蛍光強度が相対的に高いシグナルは、Ｒ１及びＲ２が野生型の塩基配列であることを示す。一方、ＨＥＸの蛍光強度のみが相対的に高いシグナルは、Ａｓｐ３２Ｔｙｒの変異があることを示す。図３に示される野生型のシグナルと変異型のシグナルとを比較することで、野生型に対する変異型の割合を明らかにできた。
(result)
FIG. 3 shows the results of a sample in which DNA having a mutation corresponding to Asp32Tyr is mixed. When the fluorescence intensity of FAM labeled with the probe 1 is plotted on the vertical axis and the fluorescence intensity of HEX labeled with the probe 2 is plotted on the horizontal axis, both the signal with relatively high fluorescence intensity and the fluorescence intensity of only HEX are relatively high. Signal was detected. Signals with relatively high fluorescence intensities indicate that R1 and R2 are wild-type base sequences. On the other hand, a signal having only a relatively high fluorescence intensity of HEX indicates that there is an Asp32Tyr mutation. By comparing the wild type signal and the mutant type signal shown in FIG. 3, the ratio of the mutant type to the wild type could be clarified.
図４はＴｈｒ４１Ｉｌｅに対応する変異を有するＤＮＡが混在したサンプルの結果を示す。ＦＡＭとＨＥＸの両方の蛍光強度が相対的に高い野生型のＤＮＡと、ＦＡＭの蛍光強度のみが相対的に高いＴｈｒ４１Ｉｌｅに対応する変異があるＤＮＡと、を検出できた。野生型のＤＮＡを示すシグナル及び変異型のＤＮＡを示すシグナルから野生型のＤＮＡに対する変異型のＤＮＡの割合を明らかにできた。 FIG. 4 shows the results of a sample in which DNA having a mutation corresponding to Thr41Ile is mixed. Wild type DNA having relatively high fluorescence intensity of both FAM and HEX and DNA having a mutation corresponding to Thr41Ile having relatively high fluorescence intensity of FAM could be detected. From the signal indicating the wild type DNA and the signal indicating the mutant type DNA, the ratio of the mutant type DNA to the wild type DNA could be clarified.
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。 Various embodiments and modifications can be made to the present invention without departing from the broad spirit and scope of the present invention. The above-described embodiments are for explaining the present invention and do not limit the scope of the present invention. In other words, the scope of the present invention is shown not by the embodiments but by the claims. Various modifications within the scope of the claims and within the scope of the equivalent invention are considered to be within the scope of the present invention.
本発明は、遺伝子変異の有無の検出、特に疾患に関連する変異が集中する領域における変異の検出に好適である。 The present invention is suitable for detecting the presence or absence of a gene mutation, particularly for detecting a mutation in a region where mutations related to diseases are concentrated.
Claims (6)
前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、
前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる１つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対と、
を備える、遺伝子の変異検出キット。 A probe that hybridizes to each of a plurality of independent non-overlapping regions included in an exon of a target gene when the base sequence of the region is a wild type,
A labeling substance indicating that each of the probes has hybridized to the region;
A primer pair designed to include all of the plurality of regions in one amplicon obtained by polymerase chain reaction;
A gene mutation detection kit comprising:
前記プローブが有する蛍光色素であって、
前記プローブは、
前記蛍光色素の発光を抑制する消光剤をさらに有し、
前記プローブが前記領域にハイブリダイズすると、前記消光剤による前記蛍光色素の発光の抑制が解除される、
請求項１に記載の遺伝子の変異検出キット。 The labeling substance is
A fluorescent dye possessed by the probe,
The probe is
A quencher that suppresses light emission of the fluorescent dye,
When the probe is hybridized to the region, the suppression of the emission of the fluorescent dye by the quencher is released,
The gene mutation detection kit according to claim 1.
エキソヌクレアーゼ活性によって前記領域にハイブリダイズした前記プローブが分解されると解除される、
請求項２に記載の遺伝子の変異検出キット。 Suppression of the emission of the fluorescent dye is
Released when the probe hybridized to the region is degraded by exonuclease activity,
The gene mutation detection kit according to claim 2.
複数の部位に変異が含まれ得る、
請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子の変異検出キット。 In each of the plurality of regions,
Multiple sites can contain mutations,
The gene mutation detection kit according to any one of claims 1 to 3.
βカテニン遺伝子のエクソン３の塩基配列であって、
前記プローブは、
配列番号１に示される塩基配列を有する第１のプローブと、
配列番号２に示される塩基配列を有する第２のプローブと、
を含み、
前記プライマー対は、
配列番号３に示される塩基配列を有するフォワードプライマーと、
配列番号４に示される塩基配列を有するリバースプライマーと、
からなる、
請求項１から４のいずれか一項に記載の遺伝子の変異検出キット。 The base sequence of exon of the target gene is
The base sequence of exon 3 of β-catenin gene,
The probe is
A first probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
A second probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2,
Including
The primer pair is
A forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3,
A reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Consist of,
The gene mutation detection kit according to any one of claims 1 to 4.
（ａ）標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブ、
（ｂ）前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質、
（ｃ）前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる１つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対、
（ｄ）前記複数の領域を含む核酸、
前記標識物質に基づいて、前記プローブがそれぞれ前記領域にハイブリダイズしたか否かを判定する判定ステップと、
を含む、遺伝子の変異検出方法。 A reaction step of performing a polymerase chain reaction with a reaction solution containing the following (a) to (d);
(A) a probe that hybridizes to each of a plurality of independent non-overlapping regions included in an exon of a target gene when the base sequence of the region is a wild type,
(B) a labeling substance indicating that each of the probes has hybridized to the region;
(C) a primer pair designed to include all of the plurality of regions in one amplicon obtained by polymerase chain reaction;
(D) a nucleic acid comprising the plurality of regions,
A determination step of determining whether or not each of the probes is hybridized to the region based on the labeling substance;
A method for detecting a mutation of a gene, comprising:
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115678974A (en) * | 2022-11-16 | 2023-02-03 | 福州迈新生物技术开发有限公司 | Double-probe method applied to fluorescent quantitative PCR |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005511055A (en) * | 2001-11-30 | 2005-04-28 | ユニバーシティー オブ ロチェスター | Multiplex real-time quantitative PCR |
| JP2007505609A (en) * | 2003-09-23 | 2007-03-15 | ウニベルジテート ポツダム | Method for noninvasive early detection of colon cancer cells and / or colon cancer precursor cells |
| JP2010233496A (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Sekisui Medical Co Ltd | Method for detecting polymorphism of ugt1a1 gene |
| JP2015082992A (en) * | 2013-10-26 | 2015-04-30 | 国立大学法人名古屋大学 | Filaggrin gene mutation detecting method and application thereof |
| CN105950720A (en) * | 2016-04-29 | 2016-09-21 | 湖北工业大学 | Beta-catenin gene mutation detection reagent in Wnt signal path and applications of beta-catenin gene mutation detection reagent |
| WO2016167317A1 (en) * | 2015-04-14 | 2016-10-20 | 凸版印刷株式会社 | Method for detecting genetic mutation |
| CN106244715A (en) * | 2016-09-28 | 2016-12-21 | 湖北工业大学 | The reagent of a kind of β catenin interaction protein 1 gene abrupt climatic change and application |
-
2017
- 2017-01-18 JP JP2017006625A patent/JP6871598B2/en active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005511055A (en) * | 2001-11-30 | 2005-04-28 | ユニバーシティー オブ ロチェスター | Multiplex real-time quantitative PCR |
| JP2007505609A (en) * | 2003-09-23 | 2007-03-15 | ウニベルジテート ポツダム | Method for noninvasive early detection of colon cancer cells and / or colon cancer precursor cells |
| JP2010233496A (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Sekisui Medical Co Ltd | Method for detecting polymorphism of ugt1a1 gene |
| JP2015082992A (en) * | 2013-10-26 | 2015-04-30 | 国立大学法人名古屋大学 | Filaggrin gene mutation detecting method and application thereof |
| WO2016167317A1 (en) * | 2015-04-14 | 2016-10-20 | 凸版印刷株式会社 | Method for detecting genetic mutation |
| CN105950720A (en) * | 2016-04-29 | 2016-09-21 | 湖北工业大学 | Beta-catenin gene mutation detection reagent in Wnt signal path and applications of beta-catenin gene mutation detection reagent |
| CN106244715A (en) * | 2016-09-28 | 2016-12-21 | 湖北工业大学 | The reagent of a kind of β catenin interaction protein 1 gene abrupt climatic change and application |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115678974A (en) * | 2022-11-16 | 2023-02-03 | 福州迈新生物技术开发有限公司 | Double-probe method applied to fluorescent quantitative PCR |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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