JP2018050556A - 嗅覚受容体共受容体 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 以下の第一のアミノ酸配列と、第一のアミノ酸配列の最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基に続いて以下の第二のアミノ酸配列とを有する嗅覚受容体共受容体:
(1)第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列であって、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ末端から、第4膜貫通ドメインの最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基の前後20アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基までの連続したアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列、及び
(2)第一の昆虫とは異種の第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列であって、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列と第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列とをアライメント解析した場合、第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントにおいて第一のアミノ酸配列の最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基に相当する位置の一つカルボキシル末端側のアミノ酸残基から、第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのカルボキシル末端までの連続したアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列。
[2]第一の昆虫及び第二の昆虫が、内翅上目昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、[1]に記載の嗅覚受容体共受容体。
[3]第一の昆虫及び第二の昆虫が、双翅目昆虫、鱗翅目昆虫及び膜翅目昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、[1]又は[2]に記載の嗅覚受容体共受容体。
[4]第一の昆虫及び第二の昆虫が、カ科昆虫、ショウジョウバエ科昆虫、カイコガ科昆虫及びミツバチ科昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、[1]〜[3]のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
[5]第一の昆虫が、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)、ガンビエハマダラカ(Anopheles gambiae)、又はキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のいずれかの昆虫である、[1]〜[4]のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
[6]第一のアミノ酸配列が、配列番号1、135又は136のいずれかに記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列である、[1]〜[5]のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
[7]第二の昆虫が、ネッタイシマカ又はセイヨウミツバチ(Apis mellifera)のいずれかの昆虫である、[1]〜[6]のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
[8]第二のアミノ酸配列が、配列番号2又は137に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列である、[1]〜[7]のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
[9]第一の昆虫がキイロショウジョウバエであり、第二の昆虫がセイヨウミツバチである、[1]〜[4]のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
[10]配列番号100に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、[9]に記載の嗅覚受容体共受容体。
[11]第一の昆虫がキイロショウジョウバエであり、第二の昆虫がネッタイシマカである、[1]〜[4]のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
[12]配列番号71に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項[11]に記載の嗅覚受容体共受容体。
[13]第一の昆虫がネッタイシマカであり、第二の昆虫がセイヨウミツバチである、[1]〜[4]のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
[14]配列番号108に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、[13]に記載の嗅覚受容体共受容体。
[15][1]〜[14]のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体をコードするポリヌクレオチド。
[16][15]に記載のポリヌクレオチドが導入された発現プラスミド。
[17][15]に記載のポリヌクレオチド又は[16]に記載の発現プラスミドが導入された細胞。
第一のアミノ酸配列がキイロショウジョウバエ共受容体の部分アミノ酸配列であり、第二のアミノ酸配列がセイヨウミツバチ共受容体の部分アミノ酸配列である嗅覚受容体共受容体、
配列番号100に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体共受容体、
第一のアミノ酸配列がキイロショウジョウバエ共受容体の部分アミノ酸配列であり、第二のアミノ酸配列がネッタイシマカ共受容体の部分アミノ酸配列である上記嗅覚受容体共受容体、
配列番号71に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体共受容体、
第一のアミノ酸配列がネッタイシマカ共受容体の部分アミノ酸配列であり、第二のアミノ酸配列がセイヨウミツバチ共受容体の部分アミノ酸配列である上記嗅覚受容体共受容体、及び
配列番号108に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体共受容体、
を挙げることができる。ここで、「90%以上の同一性」としては、90%、95%、98%、若しくは99%以上の同一性、又は100%の同一性が挙げられる。
ガンビエハマダラカ(Anopheles gambiae:以下、「ハマダラカ」又は「Ag」という場合もある。)
ネッタイシマカ(Aedes aegypti:以下、「シマカ」又は「Aa」という場合もある。)
キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster:以下、「ショウジョウバエ」又は「Dm」という場合もある。)
セイヨウミツバチ(Apis mellifera:以下、「ミツバチ」又は「Am」という場合もある。)
カイコガ(Bombyx mori:以下、「カイコ」又は「Bm」という場合もある。)
ショウジョウバエ共受容体(以下、「DmORCO」という場合もある。)の発現プラスミド
ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)成虫RNA(TAKARA社製)を鋳型に用いて、Super Script III逆転写酵素(インビトロジェン社製)を添加し、55℃で50分間、次いで75℃で15分間保温することにより逆転写反応を行い、cDNAを得た。得られたcDNA1μLを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーDmOrco−5’(5’-caccatgacaacctcgatgcagccgagcaagt;配列番号3)1μL、10μMのリバースプライマーDmOrco−3’(5’-ttacttgagctgcaccagcaccataaagt;配列番号4)1μL及びKOD Plus neo DNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(3)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約1.5kbのDNAを回収した。回収されたDNAをpENTR/D-TOPOベクター(インビトロジェン社製)へ導入し、pENTR−DmOrcoと名付けたプラスミドを得た。4μLのpENTR−DmOrco、1μLのpcDNA6.2V5−DEST及び2μLのLRクロナーゼII(インビトロジェン社製)を混合し室温で1時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、pcDNA6.2−DmOrcoと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドpcDNA6.2−DmOrcoの塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、当該プラスミドは、配列番号5で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号5で示される塩基配列は配列番号6で示されるアミノ酸配列をコードする。
ネッタイシマカ(Aedes aegypti)の頭部を液体窒素で凍結させた後、TRIzol(インビトロジェン社製)を加えて液体窒素存在下で乳鉢と乳棒を用いて破砕した。得られた破砕物から、TRIzol試薬に添付の説明書に従いRNAを抽出した。抽出されたRNAを、RNA精製キット(RNeasy Mini Kit; QIAGEN社製)を用い、当該キットに添付された説明書に従って精製した。得られたTotal RNAを鋳型にし、Super Script III逆転写酵素(インビトロジェン社製)を添加し、55℃で50分間、次いで75℃で15分間保温することにより逆転写反応を行い、cDNAを得た。得られたcDNA1μLを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーAaOrco−5’(5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgtccaaccgacaaagtacc;配列番号7)1μL、10μMのリバースプライマーAaOrco−3’(5’-gccactgtgctggatttatttcaactgcaccaacacc;配列番号8)1μL及びKOD Plus neo DNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)63℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物を、EcoRVで消化されたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)に、In−Fusion HD Cloning Kit(TAKARA社製)を使用して連結した後、大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA3.1−AaOrcoと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドpcDNA3.1−AaOrcoの塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、当該プラスミドは、配列番号9で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号9で示される塩基配列は配列番号10で示されるアミノ酸配列をコードする。
いずれか一方のDNA鎖に配列番号11で示される塩基配列を有する二本鎖DNAを合成した。得られたDNA100ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーAmOrco−5’(5’-tggaattctgcagatcaccatgaagttcaagcaacaagggctaa;配列番号12)1μL、10μMのリバースプライマーAmOrco−3’(5’-gccactgtgctggattcacttcagttgcaccaacaccatgaa;配列番号13)1μL及びKOD Plus neo DNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)63℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物を、EcoRVで消化されたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)に、In−Fusion HD Cloning Kit(TAKARA社製)を使用して連結した後、大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA3.1−AmOrcoと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドpcDNA3.1−AmOrcoの塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、当該プラスミドは、配列番号11で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号11で示される塩基配列は配列番号14で示されるアミノ酸配列をコードする。
ガンビエハマダラカ(Anopheles gambiae)Kisum系統又はG3系統の頭部を液体窒素で凍結させた後、TRIzol(インビトロジェン社製)を加えて液体窒素存在下で乳鉢と乳棒を用いて破砕した。得られた破砕物から、TRIzol試薬に添付の説明書に従いRNAを抽出した。抽出されたRNAを、RNA精製キット(RNeasy Mini Kit;QIAGEN社製)を用い、当該キットに添付された説明書に従って精製した。得られたTotal RNAを鋳型にし、Super Script III逆転写酵素(インビトロジェン社製)を添加し、55℃で50分間、次いで75℃で15分間保温することにより逆転写反応を行い、cDNAを得た。得られたcDNA1μLを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーAgOrco−5’(5’-caccatgcaagtccagccgaccaagtacgtcggcct;配列番号15)1μL、10μMのリバースプライマーAgOrco−3’(5’-ttacttcagctgcaccagcaccatgaagt;配列番号16)1μL及びKOD Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、5分間、(2)98℃、10秒間、(3)60℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約1.4kbのDNAを回収した。回収されたDNAをpENTR/D−TOPOベクター(インビトロジェン社製)へ導入し、pENTR−AgOrcoと名付けたプラスミドを得た。4μLのpENTR−AgOrco、1μLのpcDNA6.2V5−DEST及び2μLのLRクロナーゼII(インビトロジェン社製)を混合して室温で1時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、pcDNA6.2−AgOrcoと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドpcDNA6.2−AgOrcoの塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、当該プラスミドは、配列番号17で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号17で示される塩基配列は配列番号18で示されるアミノ酸配列をコードする。
上述したDmORCOの発現プラスミド100ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマー1μLと、10μMのリバースプライマー1μLと、KOD Plus neoDNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)63℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせ及び得られたPCR産物を表1に示す。
また、上述したAaORCOの発現プラスミド1μL(100ng)を鋳型に用い、10μMのフォワードプライマー1μLと、10μMのリバースプライマー1μLと、KOD Plus neoDNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)63℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせ及び得られたPCR産物を表2に示す。
Dm(NT−EC1)AaORCOでは、N末端領域(NT)から第1細胞外ループ(EC1)までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第2膜貫通ドメインからC末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Dm(NT−TM3)AaORCOでは、N末端領域(NT)から第3膜貫通ドメイン(TM3)までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第2細胞外ループからC末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Dm(NT−TM4)AaORCOでは、N末端領域(NT)から第4膜貫通ドメイン(TM4)までのアミノ酸配列(そのN末端アミノ酸残基から234番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列)がショウジョウバエ共受容体由来(Dm(NT−TM4)、配列番号1)であり、第2細胞内ループからC末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来(Aa(IC2−CT)、配列番号137)である。
Dm(NT−TM5)AaORCOでは、N末端領域(NT)から第5膜貫通ドメイン(TM5)までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第3細胞外ループからC末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Dm(NT−TM6)AaORCOでは、N末端領域(NT)から第6膜貫通ドメイン(TM6)までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第3細胞内ループからC末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Dm(NT−792)AaORCOでは、そのN末端アミノ酸残基から264番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、265番目のアミノ酸残基からC末端アミノ酸残基までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Dm(NT−879)AaORCOでは、そのN末端アミノ酸残基から293番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、294番目のアミノ酸残基からC末端アミノ酸残基までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Dm(NT−969)AaORCOでは、そのN末端アミノ酸残基から323番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、324番目のアミノ酸残基からC末端アミノ酸残基までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Dm(NT−1080)AaORCOでは、そのN末端アミノ酸残基から360番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、361番目のアミノ酸残基からC末端アミノ酸残基までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Dm(NT−636)AaORCOでは、そのN末端アミノ酸残基から212番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、213番目のアミノ酸残基からC末端アミノ酸残基までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
いずれか一方のDNA鎖に配列番号79で示される塩基配列を有する二本鎖DNAを合成した。得られたDNA100ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーAaOrco−5’(5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgtccaaccgacaaagtacc;配列番号80)1μL、10μMのリバースプライマーDmAaOrco(IC2−CT)−3’(5’-gccactgtgctggatttatttcaactgcaccaaca;配列番号81)1μL及びKOD Plus neoDNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)63℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物を、EcoRVで消化されたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)にIn−Fusion HD Cloning Kit(TAKARA社製)を使用して連結した。連結されたDNAを大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA3.1−Aa(TM1−4Dm)AaOrcoと名付けた発現プラスミドを得た。得られた発現プラスミドpcDNA3.1−Aa(TM1−4Dm)AaOrcoの塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、配列番号79で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号79で示される塩基配列は配列番号82で示されるアミノ酸配列をコードする。発現プラスミドpcDNA3.1−Aa(TM1−4Dm)AaOrcoにコードされるキメラ共受容体では、第1膜貫通ドメイン、第2膜貫通ドメイン、第3膜貫通ドメイン、及び第4膜貫通ドメインのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、それ以外の領域のアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
いずれか一方のDNA鎖に配列番号83で示される塩基配列を有する二本鎖DNAを合成した。得られたDNA100ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーDmOrco(NT−TM4)−5’(5’-tggaattctgcagatcaccatgacaacctcgatgcagccgagcaa;配列番号84)1μL、10μMのリバースプライマーDmAaOrco (IC2−CT)−3’(5’-gccactgtgctggatttatttcaactgcaccaaca;配列番号85)1μL及びKOD Plus neoDNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)63℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物を、EcoRVで消化されたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)にIn−Fusion HD Cloning Kit(TAKARA社製)を使用して連結した。連結されたDNAを大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA3.1−Dm(TM1−4Aa)AaOrcoと名付けた発現プラスミドを得た。得られた発現プラスミドpcDNA3.1−Aa(TM1−4Dm)AaOrcoの塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、配列番号83で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号83で示される塩基配列は配列番号86で示されるアミノ酸配列をコードする。発現プラスミドpcDNA3.1−Aa(TM1−4Dm)AaOrcoにコードされるキメラ共受容体では、アミノ末端領域、第1細胞外ループ、第1細胞内ループ、及び第2細胞外ループのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第1膜貫通ドメイン、第2膜貫通ドメイン、第3膜貫通ドメイン、及び第4膜貫通ドメインのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来であり、第2細胞内ループからC末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
表1に示すPCR産物のDm(NT−TM3)、Dm(NT−TM4)、Dm(NT−TM5)及びDm(NT−Tm6)を調製した。
Dm(NT−TM3)AmORCOでは、N末端領域(NT)から第3膜貫通ドメイン(TM3)までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第2細胞外ループからC末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来(Am(IC2−CT)、配列番号2)である。
Dm(NT−TM4)AmORCOでは、N末端領域(NT)から第4膜貫通ドメイン(TM4)までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来(Dm(NT−TM4)、配列番号1)であり、第2細胞内ループからC末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来である。
Dm(NT−TM5)AmORCOでは、N末端領域(NT)から第5膜貫通ドメイン(TM5)までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第3細胞外ループからC末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来である。
Dm(NT−TM6)AmORCOでは、N末端領域(NT)から第6膜貫通ドメイン(TM6)までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第3細胞内ループからC末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来である。
上述したAaORCOの発現プラスミド100ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーAaOrco(NT−TM4)−5’(5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgtccaaccgacaaagtacc;配列番号103)1μL、10μMのリバースプライマーAaOrco(NT−TM4)−3’(5’-caaatgttgcagctgttcgcaagtga;配列番号104)1μL及びKOD Plus neo DNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)63℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。上述したAmORCOの発現プラスミド100ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーAaAmOrco(IC2−CT)−5’(5’-cagctgcaacatttgaagaatatcatgaagcctttgatggaa;配列番号105)1μL、10μMのリバースプライマーAaAmOrco (IC2−CT)−3’(5’-gccactgtgctggattcacttcagttgcaccaacaccatgaa;配列番号106)1μL及びKOD Plus neoDNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)63℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られた2つのPCR産物を、EcoRVで消化されたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)に、In−Fusion HD Cloning Kit(TAKARA社製)を使用して連結した。連結されたDNAを大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA3.1−AaAmOrcoと名付けたシマカ共受容体とミツバチ共受容体とのキメラ共受容体の発現プラスミドを得た。得られた発現プラスミドpcDNA3.1−AaAmOrcoの塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、配列番号107で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号107で示される塩基配列は配列番号108で示されるアミノ酸配列をコードする。発現プラスミドpcDNA3.1−AaAmOrcoにコードされるキメラ本共受容体では、そのN末端領域(NT)から第4膜貫通ドメイン(TM4)までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来(Aa(NT−TM4)、配列番号135)であり、第2細胞内ループからC末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来(Am(IC2−CT)、配列番号2)である。
上記のハマダラカ共受容体の発現プラスミド100ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーAgOrco(NT−TM4)−5’(5’-tggaattctgcagatcaccatgcaagtccagccgaccaagtacgt;配列番号109)1μL、10μMのリバースプライマーAgOrco (NT−TM4)−3’(5’-caagtgttgcagctgctcgcaggcta;配列番号110)1μL及びKODPlus neoDNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)63℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。上記のミツバチ共受容体の発現プラスミド100ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーAgAmOrco (IC2−CT)−5’(5’-cagctgcaacacttgaagaatatcatgaagcctttgatgg;配列番号111)1μL、10μMのリバースプライマーAmOrco−3’(5’-gccactgtgctggattcacttcagttgcaccaacaccatgaa;配列番号112)1μL及びKOD Plus neoDNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)63℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られた2つのPCR産物を、EcoRVで消化されたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)に、In−Fusion HD Cloning Kit(TAKARA社製)を使用して連結した。連結されたDNAを大腸菌へ導入してクローニングすることにより、pcDNA3.1−AgAmOrcoと名付けたハマダラカ共受容体とミツバチ共受容体とのキメラ共受容体の発現プラスミドを得た。得られた発現プラスミドpcDNA3.1−AgAmOrcoの塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、配列番号113で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号113で示される塩基配列は配列番号114で示されるアミノ酸配列をコードする。発現プラスミドpcDNA3.1−AgAmOrcoにコードされるキメラ共受容体では、アミノ末端領域(NT)から第4膜貫通ドメイン(TM4)までのアミノ酸配列がハマダラカ共受容体由来(Ag(NT−TM4)、配列番号136)であり、第2細胞内ループからC末端領域までの塩基配列がミツバチ共受容体由来(Am(IC2−CT)、配列番号2)である。
シマカ嗅覚受容体OR8(以下、「AaOR8」という場合もある。)の発現プラスミド
上記方法により調製されたシマカ頭部由来のcDNA1μLを鋳型に用いて、10μMのフォワードプライマーAaOR8−5’(5’-tggaattctgcagatcaccatgggaggtaagttctc;配列番号115)1μL、10μMのリバースプライマーAaOR8−3’(5’-gccactgtgctggattcacttctgacttggttc;配列番号116)1μL及びKOD Plus neoDNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)68℃、1分間で行い、(2)〜(4)の工程は30サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物を、EcoRVで消化されたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)に、In−Fusion HD Cloning Kit(TAKARA社製)を使用して連結した。連結されたDNAを大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA3.1−AaOR8と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドpcDNA3.1−AaOR8の塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、配列番号117で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号117で示される塩基配列は配列番号118で示されるアミノ酸配列をコードする。
上記方法により調製されたショウジョウバエ成虫由来のcDNA1μLを鋳型に用い、10μLのフォワードプライマーDmOR47a−5’(5’-caccatggacagttttctgcaagtacagaa;配列番号119)1μL、10μMのリバースプライマーDmOR47a−3’(5’-ttaggagaatgatctcagcattgtgatgta;配列番号120)1μL及びKOD Plus neo DNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(3)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約1.2kbのDNAを回収した。回収されたDNAをpENTR/D-TOPOベクター(インビトロジェン社製)へ導入し、pENTR−DmOR47aと名付けたプラスミドを得た。4μLのpENTR−DmOR47a、1μLのpcDNA6.2V5−DEST及び2μLのLRクロナーゼII(インビトロジェン社製)を混合し室温で1時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA6.2−DmOR47aと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドpcDNA6.2−DmOR47aの塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、配列番号121で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号121で示される塩基配列は配列番号122で示されるアミノ酸配列をコードする。
いずれか一方のDNA鎖に配列番号123で示される塩基配列を有する二本鎖DNAを合成した。配列番号123で示される塩基配列を有する二本鎖DNA100ngを鋳型に用いて、10μMのフォワードプライマーBmOR56−5’(5’-tggaattctgcagatcaccatgaagctcctggagaagctag;配列番号124)1μL、10μMのリバースプライマーBmOR56−3’(5’-gccactgtgctggattcatgttttattcatttgcgactgac;配列番号125)1μL及びKOD Plus neoDNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)63℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物を、EcoRVで消化されたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)に、In−Fusion HD Cloning Kit(TAKARA社製)を使用して連結した。連結されたDNAを大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA3.1−BmOR56と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドpcDNA3.1−BmOR56の塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、配列番号123で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号123で示される塩基配列は配列番号126で示されるアミノ酸配列をコードする。
Aequorinをコードする配列番号127で示される塩基配列がpMD19ベクターにクローニングされたプラスミド(pMD19−AEQ)50ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーAEQ−5’(5’-caccatgacaagcaaacaatactc;配列番号128)1μL、10μMのリバースプライマーAEQ−3’(5’-ttaggggacagctccaccgtag;配列番号129)1μL及びKOD Plus neoDNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)95℃、3分間、(2)95℃、30秒間、(3)60℃、30秒間、(4)68℃、1分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約600bpのDNAを回収した。回収されたDNAをpENTR/D−TOPOベクター(インビトロジェン社製)へ導入し、pENTR−AEQと名付けたプラスミドを得た。配列番号127で示される塩基配列は配列番号130で示されるアミノ酸配列をコードする。4μLのpENTR−AEQ、1μLのpcDNA6.2V5−DEST及び2μLのLRクロナーゼII(インビトロジェン社製)を混合し室温で1時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し増幅することにより、pcDNA6.2−AEQと名付けたプラスミドを得た。プラスミドpcDNA6.2−AEQ100ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーIn−Fusion AEQ−5’(5’-gtggcggccgctcgaggccaccatgacaagcaaacaatactc;配列番号131)1μL、10μMのリバースプライマーIn−Fusion AEQ−3’(5’-gccctctagactcgagttaggggacagctccaccgtag;配列番号132)1μL及びKOD neo Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)95℃、3分間、(2)95℃、30秒間、(3)60℃、30秒間、(4)68℃、1分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたDNAをアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約600bpのDNAを回収してこれをインサートDNA1とした。XhoIで消化したpcDNA3.1(インビトロジェン社製)をベクターとして用い、これに上記インサートDNA1をIn−Fusion HD Cloning Kit(TAKARA社製)を用いて連結した。連結されたDNAを大腸菌へ導入し培養することによりpcDNA3.1−AEQと名付けたプラスミドを得た。pcDNA3.1−AEQ100ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーIn−Fusion AEQ−5’(5’-gtggcggccgctcgaggccaccatgacaagcaaacaatactc;配列番号133)1μL、10μMのリバースプライマーIn−Fusion AEQ−3’(5’-gccctctagactcgagttaggggacagctccaccgtag;配列番号134)1μL及びKOD Plus neo DNAポリメラーゼ(東洋紡製)1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、(1)95℃、3分間、(2)95℃、30秒間、(3)60℃、30秒間、(4)68℃、1分間で行い、(2)〜(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたDNAをアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約600bpのDNAを回収してこれをインサートDNA2とした。XhoIで消化したpcDNA3.1(hygro)(インビトロジェン社製)をベクターとして用い、これに上記インサートDNA2をIn−Fusion HD Cloning Kit(TAKARA社製)を用いて連結した。連結されたDNAを大腸菌へ導入し培養することによりpcDNA3.1(hygro)−AEQと名付けた発現プラスミドを得た。
HEK293FT細胞(Invitrogen社から購入)を10cmシャーレに3×106cells/シャーレで播種し、10%FBSを含むDMEM培地(ナカライテスク社製)中で、37℃、5%CO2条件下にて約24時間培養した。作製したいずれかの共受容体発現プラスミド3μgと、作製したいずれかの嗅覚受容体発現プラスミド1.5μgと、Aequorin発現プラスミド8μgとを、12.5μLのPlus試薬及び31.25μLのリポフェクトアミンLTX(インビトロジェン社製)と混合し、30分間保持した。その後、この混合液を上記細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション開始4時間後に96wellプレートに9×104cells/wellで播種し、10%FBSを含むDMEM培地(ナカライテスク社製)中で、37℃、5%CO2条件下にて約24時間培養した。これにより、共受容体発現プラスミド、嗅覚受容体発現プラスミド及びAequorin発現プラスミドがトランジェントに導入された形質転換細胞を得た。
イクオリンはカルシウムイオンと結合すると活性化されてセレンテラジン等の基質を酸化して発光する。したがって、イクオリンを発現する細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇は直接、発光量の増大として現れることになるため、被検物質の添加により嗅覚受容体複合体がイオンチャネルとして機能しているかどうかを発光量の変化から測定することができる。
上記形質転換細胞の培養液を除去してAssay buffer(0.5μMセレンテラジンh(プロメガ社製)及び0.3%のBSAを含むHanks−HEPES(20 mM pH 7.4))に置換し、更に4時間、室温で静置した。次いで、Flexstation3(Molecular devices社製)を用いて、嗅覚受容体に対応する被検物質を細胞の培養液中に添加するとともに細胞の発光量を測定した。対照物質としてジメチルスルホキシドを添加した細胞での発光量を1とし、被検物質を添加した細胞の発光量を相対値として算出した。
嗅覚受容体AaOR8の発現プラスミド、
共受容体AaORCOもしくはDmORCO、又は、組み換え位置の異なる各種キメラ共受容体Dm−AaORCO[Dm(NT−EC1)AaORCO、Dm(NT−TM3)AaOROC、Dm(NT−TM4)AaORCO、Dm(NT−TM5)AaORCO、もしくはDm(NT−TM6)AaORCO]のいずれかの発現プラスミド、及び
Aequorin発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては1−オクテン−3−オールを用い、10−4M、10−5M、10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、又は10−10Mの濃度で培養液に添加した。その結果を図1に示す。DmORCOとAaORCOとのキメラ共受容体のうち、N末端領域から第4膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第2細胞内ループからC末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来であるキメラ共受容体[Dm(NT−TM4)AaORCO]と嗅覚受容体とを発現する細胞では、元のAaORCO又はDmORCOと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、1−オクテン−3−オールの添加による発光量の増加が大きかった。N末端領域から第4膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第2細胞内ループからC末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来であるキメラ共受容体[Dm(NT−TM4)AaORCO]と嗅覚受容体とを発現する細胞は、元のAaORCO又はDmORCOのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、1−オクテン−3−オールに対してより強く応答することが示された。
嗅覚受容体AaOR8の発現プラスミド、
共受容体AmORCOもしくはDmORCO、又は、組み換え位置の異なる各種キメラ共受容体Dm−AmORCO[Dm(NT−TM3)AmOROC、Dm(NT−TM4)AmORCO、Dm(NT−TM5)AmORCO、もしくはDm(NT−TM6)AmORCO]のいずれかの発現プラスミド、及び
Aequorin発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては1−オクテン−3−オールを用い、10−4M、10−5M、10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、又は10−10Mの濃度で培養液に添加した。その結果を図2に示す。DmORCOとAmORCOとのキメラ共受容体においてもDmORCOとAaORCOとのキメラ共受容体と同様に、N末端領域から第4膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第2細胞内ループからC末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来であるキメラ共受容体[Dm(NT−TM4)AmORCO]と嗅覚受容体とを発現する細胞では、元のAmORCO又はDmORCOのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、1−オクテン−3−オールの添加による発光量の増加が大きかった。試験例1及び2の結果から、嗅覚受容体と結合して嗅覚受容体複合体を形成した際にリガンドへの応答強度が大きいキメラ共受容体を作製するには、第4膜貫通ドメインのC末端付近で、元の2種の共受容体のアミノ酸配列を組み換えることが重要であることが示された。
嗅覚受容体AaOR8の発現プラスミド、
共受容体AaORCOもしくはDmORCO、又は組み換え位置の異なる各種キメラ共受容体Dm−AaORCO[Dm(NT−TM4)AaORCO、Dm(NT−792)AaORCO、Dm(NT−879)AaORCO、Dm(NT−969)AaORCO、Dm(NT−1080)AaORCO、Dm(NT−TM5)AaORCO、もしくはDm(NT−636)AaORCO]のいずれかの発現プラスミド、及び
Aequorin発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては1−オクテン−3−オールを用い、10−4M、10−5M、10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、又は10−10Mの濃度で培養液に添加した。その結果を図3及び4に示す。Dm(NT−TM4)AaORCOと嗅覚受容体とを発現する細胞は、1−オクテン−3−オールに対して、元のAaORCO又はDmORCOのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも応答強度が高かった。それに対し、DmORCO由来のアミノ酸配列がDm(NT−TM4)AaORCOよりも30アミノ酸残基C末端側に長いDm(792)AaORCOと嗅覚受容体とを発現する細胞は、元のAaORCOと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも1−オクテン−3−オールに対する応答強度が減少した。DmORCO由来のアミノ酸配列がDm(NT−TM4)AaORCOよりも22アミノ酸残基N末端側に短いDm(NT−636)AaORCOと嗅覚受容体とを発現する細胞でも、元のAaORCO又はDmORCOのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、1−オクテン−3−オールに対する応答強度が減少した。これらの結果から、キメラ共受容体において、第一の昆虫のORCO由来のアミノ酸配列は、N末端から第4膜貫通ドメインの最もC末端側のアミノ酸残基の前後20アミノ酸残基程度以内の範囲のいずれかのアミノ酸残基までが好ましいことが示唆された。
嗅覚受容体AaOR8の発現プラスミド、
共受容体AaORCOもしくはDmORCO、又は、キメラ共受容体Dm(NT−TM4)AaORCO、AaORCOから第一から第四までの膜貫通ドメインのみをDmORCOに組み替えたAa(TM1−4Dm)AaORCO、もしくは、AaORCOからN末端領域、第一及び第二細胞外領域、第一細胞内領域をDmORCOに組み替えたDm(TM1−4Aa)AaORCOのいずれかの発現プラスミド、及び
Aequorin発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては1−オクテン−3−オールを用い、10−4M、10−5M、10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、又は10−10Mの濃度で培養液に添加した。その結果を図5に示す。その結果、膜貫通領域や細胞内領域及び細胞外領域のみを組み替えたキメラ共受容体[Aa(TM1−4Dm)AaORCO又はDm(TM1−4Aa)AaORCO]と嗅覚受容体とを発現する細胞では、元のAaORCO又はDmORCOのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、1−オクテン−3−オールに対する応答強度が減少した。嗅覚受容体と結合して嗅覚受容体複合体を形成した際にリガンドへの応答強度が大きいキメラ共受容体を作製するには、N末端から第4膜貫通ドメインまで連続して同種のORCO由来の領域であることが必要なことが示された。
嗅覚受容体DmOR47aの発現プラスミド、
共受容体DmORCOもしくはAmORCO、又はキメラ共受容体Dm(NT−TM4)AmORCOのいずれかの発現プラスミド、及び
Aequorin発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはペンチルアセテートを用い、10−4M、10−4.5M、10−5M、10−5.5、M10−6M、10−6.5M、又は10−7Mの濃度で培養液に添加した。その結果を図6に示す。Dm(NT−TM4)AmORCOと嗅覚受容体とを発現する細胞は、元のDmORCO又はAmORCOのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、ペンチルアセテートに対して、より強く応答することが示された。
嗅覚受容体AaOR8の発現プラスミド、
共受容体AaORCOもしくはAmORCO、又はキメラ共受容体Aa(NT−TM4)AmORCOのいずれかの発現プラスミド、及び
Aequorin発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては1−オクタン−3−オールを用い、10−4M、10−5M、10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、又は10−10Mの濃度で培養液に添加した。その結果を図7に示す。Aa(NT−TM4)AmORCOと嗅覚受容体とを発現する細胞は、元のAaORCO又はAmORCOのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、1−オクタン−3−オールに対して、より強くに応答することが示された。
嗅覚受容体AaOR8の発現プラスミド、
共受容体AgORCOもしくはAmORCO、又はキメラ共受容体Ag(NT−TM4)AmORCOのいずれかの発現プラスミド、及び
Aequorin発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては1−オクタン−3−オールを用い、10−4M、10−5M、10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、又は10−10Mの濃度で培養液に添加した。その結果を図8に示す。嗅覚受容体と結合して嗅覚受容体複合体を形成した際に、Ag(NT−TM4)AmORCOと嗅覚受容体とを発現する細胞は、元のAaORCO又はAmORCOのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、より低濃度の1−オクタン−3−オールに、応答することが示された。
嗅覚受容体BmOR56の発現プラスミド、
共受容体BmORCO、又はキメラ共受容体Dm(NT−TM4)AmORCOのいずれかの発現プラスミド、及び
Aequorin発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはcis−ジャスモンを用い、10−5M、10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、10−10M、又は10−11Mの濃度で培養液に添加した。その結果を図9に示す。Dm(NT−TM4)AmORCOとBmOR56とを発現する細胞は、BmORCOとBmOR56とを発現する細胞よりも、cis−ジャスモンに対し、より強く応答することが示された。また、実施例7及び8の結果から、キメラ共受容体を構成する元のORCOの由来となるそれぞれの昆虫とは異なる種の昆虫由来の嗅覚受容体本実施形態のキメラ共受容体とを発現する細胞は、元の嗅覚受容体共受容体と上記嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、リガンドに対して強く又は感度良く応答することが示された。
Claims (17)
- 以下の第一のアミノ酸配列と、前記第一のアミノ酸配列の最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基に続いて以下の第二のアミノ酸配列とを有する嗅覚受容体共受容体:
(1)第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列であって、前記第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ末端から、第4膜貫通ドメインの最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基の前後20アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基までの連続したアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列、及び
(2)前記第一の昆虫とは異種の第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列であって、前記第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列と前記第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列とをアライメント解析した場合、前記第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントにおいて前記第一のアミノ酸配列の最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基に相当する位置の一つカルボキシル末端側のアミノ酸残基から、前記第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのカルボキシル末端までの連続したアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列。 - 前記第一の昆虫及び前記第二の昆虫が、内翅上目昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、請求項1に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 前記第一の昆虫及び前記第二の昆虫が、双翅目昆虫、鱗翅目昆虫及び膜翅目昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、請求項1又は2に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 前記第一の昆虫及び前記第二の昆虫が、カ科昆虫、ショウジョウバエ科昆虫、カイコガ科昆虫及びミツバチ科昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、請求項1から3のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 前記第一の昆虫が、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)、ガンビエハマダラカ(Anopheles gambiae)、又はキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のいずれかの昆虫である、請求項1から4のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 前記第一のアミノ酸配列が、配列番号1、135又は136のいずれかに記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項1から5のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 前記第二の昆虫が、ネッタイシマカ又はセイヨウミツバチ(Apis mellifera)のいずれかの昆虫である、請求項1から6のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 前記第二のアミノ酸配列が、配列番号2又は137に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項1から7のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 前記第一の昆虫がキイロショウジョウバエであり、前記第二の昆虫がセイヨウミツバチである、請求項1から4のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 配列番号100に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項9に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 前記第一の昆虫がキイロショウジョウバエであり、前記第二の昆虫がネッタイシマカである、請求項1から4のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 配列番号71に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 前記第一の昆虫がネッタイシマカであり、前記第二の昆虫がセイヨウミツバチである、請求項1から4のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 配列番号108に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項13に記載の嗅覚受容体共受容体。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項15に記載のポリヌクレオチドが導入された発現プラスミド。
- 請求項15に記載のポリヌクレオチド又は請求項16に記載の発現プラスミドが導入された細胞。
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