JP2017532063A5 - - Google Patents
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Description
DNAKに結合することが公知の特定のタンパク質が、その特定のタンパク質が発現されDNAKタグ株から単離される際に単離され得る場合、タグ付きDNAKを使用してもよい。これは、診断および研究応用の両方に有用であり得る。
タグ付きDNAKアミノ酸配列はまた、プロテアーゼ感受性認識部位で修飾することができ、任意の微量のDNAKをさらに減少させるために、そのような認識部位をタグ付きDNAKと共に用いてよい。
本明細書は本発明の特定の実施形態を説明しているが、当業者は、本発明の概念を逸脱することなく本発明の変化形を考案することができる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕a)DNAKタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチドおよび認識可能なタグをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝的に改変された遺伝子配列
を含む細菌であって、
b)該遺伝子配列は天然に存在しない、細菌。
〔2〕認識可能なタグをコードする前記ヌクレオチド配列が、DNAKのN末端またはC末端をコードするヌクレオチドの近くまたは内部の前記遺伝子配列上に位置する、前記〔1〕に記載の細菌。
〔3〕認識可能なタグがタンパク質タグであってよい、前記〔1〕に記載の細菌。
〔4〕DNAKのヌクレオチド配列と認識可能なタグをコードするヌクレオチド配列との間にリンカー配列が挿入される、前記〔1〕に記載の細菌。
〔5〕DNAKの天然に生じる遺伝子配列が欠失した、前記〔1〕に記載の細菌。
〔6〕DNAKの天然に生じる遺伝子配列が修飾されており、該修飾が、DNAKの天然に生じる遺伝子配列の発現を実質的に停止させた、前記〔1〕に記載の細菌。
〔7〕前記遺伝子配列が、細菌の染色体DNAと、認識可能なタグおよびDNAKの遺伝子配列の少なくともいくつかの部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸との相同組換えによって作製された、前記〔1〕に記載の細菌。
〔8〕前記〔7〕に記載の相同組換えであって、組換えの特異的部位が、DNAKの天然に生じる遺伝子配列の少なくとも一部の置換を可能にし、認識可能なタグを導入するものである、相同組換え。
〔9〕前記〔7〕に記載の核酸であって、プラスミドDNAの一部である、核酸。
〔10〕a)DNAKまたはDNAKホモログおよび認識可能なタグを含む内因性タンパク質を発現するように染色体が遺伝的に修飾されている細胞に、タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトすること、
b)核酸によりコードされるタンパク質を発現させること、
c)細胞溶解物を抽出すること、および
d)認識可能なタグに結合する方法により内因性タンパク質を除去することによって細胞溶解物を精製すること
を含む、タンパク質の単離方法。
〔11〕前記細胞が細菌細胞である、前記〔10〕に記載の方法。
〔12〕前記認識可能なタグがタンパク質タグである、前記〔10〕に記載の方法。
〔13〕精製工程が固相支持体または液相支持体単離手順を利用する、前記〔10〕に記載の方法。
〔14〕精製工程が少なくとも1回繰り返され得る、前記〔10〕に記載の方法。
〔15〕細胞溶解物中の他の汚染物質を標的とする他の精製工程が用いられる、前記〔10〕に記載の方法。
〔16〕内因性タンパク質の精製工程が、内因性タンパク質と関連し得る別のタンパク質も単離する、前記〔10〕に記載の方法。
〔17〕a)DNAKまたはDNAKホモログおよびタンパク質タグを含む内因性タンパク質を発現するように染色体が遺伝的に修飾されている細菌細胞に、タンパク質をコードする核酸を形質転換すること、
b)核酸によりコードされるタンパク質を発現させること、
c)細胞溶解物を抽出すること、および
d)タンパク質タグに結合する方法により内因性タンパク質を除去することによって細胞溶解物を精製すること
を含む、タンパク質の単離方法。
〔18〕タンパク質タグが、N末端またはC末端の近くに位置する、前記〔17〕に記載の方法。
〔19〕精製工程が固相支持体または液相支持体単離手順を利用する、前記〔17〕に記載の方法。
〔20〕内因性タンパク質の精製工程が、当該内因性タンパク質と関連し得る別のタンパク質も単離する、前記〔17〕に記載の方法。
タグ付きDNAKアミノ酸配列はまた、プロテアーゼ感受性認識部位で修飾することができ、任意の微量のDNAKをさらに減少させるために、そのような認識部位をタグ付きDNAKと共に用いてよい。
本明細書は本発明の特定の実施形態を説明しているが、当業者は、本発明の概念を逸脱することなく本発明の変化形を考案することができる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕a)DNAKタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチドおよび認識可能なタグをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝的に改変された遺伝子配列
を含む細菌であって、
b)該遺伝子配列は天然に存在しない、細菌。
〔2〕認識可能なタグをコードする前記ヌクレオチド配列が、DNAKのN末端またはC末端をコードするヌクレオチドの近くまたは内部の前記遺伝子配列上に位置する、前記〔1〕に記載の細菌。
〔3〕認識可能なタグがタンパク質タグであってよい、前記〔1〕に記載の細菌。
〔4〕DNAKのヌクレオチド配列と認識可能なタグをコードするヌクレオチド配列との間にリンカー配列が挿入される、前記〔1〕に記載の細菌。
〔5〕DNAKの天然に生じる遺伝子配列が欠失した、前記〔1〕に記載の細菌。
〔6〕DNAKの天然に生じる遺伝子配列が修飾されており、該修飾が、DNAKの天然に生じる遺伝子配列の発現を実質的に停止させた、前記〔1〕に記載の細菌。
〔7〕前記遺伝子配列が、細菌の染色体DNAと、認識可能なタグおよびDNAKの遺伝子配列の少なくともいくつかの部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸との相同組換えによって作製された、前記〔1〕に記載の細菌。
〔8〕前記〔7〕に記載の相同組換えであって、組換えの特異的部位が、DNAKの天然に生じる遺伝子配列の少なくとも一部の置換を可能にし、認識可能なタグを導入するものである、相同組換え。
〔9〕前記〔7〕に記載の核酸であって、プラスミドDNAの一部である、核酸。
〔10〕a)DNAKまたはDNAKホモログおよび認識可能なタグを含む内因性タンパク質を発現するように染色体が遺伝的に修飾されている細胞に、タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトすること、
b)核酸によりコードされるタンパク質を発現させること、
c)細胞溶解物を抽出すること、および
d)認識可能なタグに結合する方法により内因性タンパク質を除去することによって細胞溶解物を精製すること
を含む、タンパク質の単離方法。
〔11〕前記細胞が細菌細胞である、前記〔10〕に記載の方法。
〔12〕前記認識可能なタグがタンパク質タグである、前記〔10〕に記載の方法。
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〔17〕a)DNAKまたはDNAKホモログおよびタンパク質タグを含む内因性タンパク質を発現するように染色体が遺伝的に修飾されている細菌細胞に、タンパク質をコードする核酸を形質転換すること、
b)核酸によりコードされるタンパク質を発現させること、
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d)タンパク質タグに結合する方法により内因性タンパク質を除去することによって細胞溶解物を精製すること
を含む、タンパク質の単離方法。
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〔20〕内因性タンパク質の精製工程が、当該内因性タンパク質と関連し得る別のタンパク質も単離する、前記〔17〕に記載の方法。
Claims (8)
- a)第1の認識可能なタグを含む発現可能なタンパク質をコードする核酸配列を、内因性DNAKタンパク質またはDNAKタンパク質ホモログおよび第2の認識可能なタグを発現するように遺伝的に修飾されている染色体を有する細胞に、挿入すること(ただし、発現可能なタンパク質は内因性DNAKタンパク質又はDNAKタンパク質ホモログではなく、第1の認識可能なタグと第2の認識可能なタグとは同じではない)、
b)核酸によりコードされる発現可能なタンパク質を発現させること、
c)発現可能なタンパク質と内因性タンパク質を含む、細胞溶解物を抽出すること、
d)第2の認識可能なタグを標的にすることによって細胞溶解物から内因性DNAKタンパク質又はDNAKタンパク質ホモログを除去することを含み、かつ、実質的に細胞溶解物から発現可能なタンパク質を除去しない、タンパク質精製手順に、細胞溶解物を適用することによって内因性DNAKタンパク質又はDNAKタンパク質ホモログを精製すること、および
e)核酸によりコードされる発現可能なタンパク質を、第1の認識可能なタグを標的にすることによって精製すること
を含み、工程dおよびeは、いずれの順で行われてもよく、前記細胞は細菌細胞である、タンパク質の単離方法。 - 第2の認識可能なタグが、タンパク質タグである、請求項1に記載の方法。
- タンパク質タグが、Strepタグ、Flagタグ、HisタグまたはMycタグである、請求項2に記載の方法。
- タンパク質精製手順が、固相支持体または液相支持体単離を利用する、請求項1に記載の方法。
- 内因性DNAKタンパク質又はDNAKタンパク質ホモログの精製工程が少なくとも1回繰り返されてもよい、請求項1に記載の方法。
- 細胞溶解物内の他の混入物を標的にする追加の精製工程に用いられる、請求項1に記載の方法。
- 内因性DNAKタンパク質又はDNAKタンパク質ホモログのタンパク質精製手順は、内因性DNAKタンパク質又はDNAKタンパク質ホモログに結合する別のタンパク質も単離する、請求項1に記載の方法。
- 遺伝的に修飾された染色体は、染色体DNAK遺伝子の欠失を含み、かつ、内因性DNAKタンパク質又はDNAKタンパク質ホモログおよび第2の認識可能なタグの核酸配列を含む形質転換されたベクターによって置換される、請求項1に記載の方法。
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