JP2017529066A - 哺乳動物多能性幹細胞、それらの調製のための方法、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年8月4日に提出された米国仮出願第62/032,911号の優先権利益を主張し、その内容は本明細書中への参照によってその全体が本明細書に組み込まれている。
本発明は、国防省によって与えられたDARPA−11−65−Open−BAA−FP−169の下で政府支援で行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
本出願は、ASCIIフォーマットにおいて電子的に提出され、その全体が参照によってここに組み込まれている配列表を含む。2015年7月31日に作成された前記ASCIIコピーは、KNS−001_SL.txtという名前を付けられ、サイズが2,057バイトである。
本開示は、神経由来成体多能性幹細胞(NEDAPS細胞)およびその集団を提供する。「NEDAPS」の文脈で使用する場合、「成体」という用語は、非胚性供給源を表す。したがって、NEDAPS細胞は、若年または成体対象からとすることができ、対象は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、もしくはウマなどの家畜化された哺乳動物、またはサルもしくはヒトなどの霊長類とすることができる。
(a)それは、単離されている;かつ/または
(b)それは、少なくとも50%均質である;かつ/または
(c)それは、少なくとも10の細胞を含有する。
7.2.1.NEDAPS細胞増殖条件
本開示は、インビボとエキソビボの両方でNEDAPS細胞およびその集団を調製する方法を提供する。NEDAPS細胞およびNEDAPS細胞の集団は、エキソビボでNEDAPS細胞増殖条件に晒された末梢神経を培養することによって、またはインビボで対象においてNEDAPS細胞増殖条件に晒された末梢神経からの細胞を培養することによって調製され得る。NEDAPS細胞のエキソビボ調製の文脈では、「末梢神経」という用語は、本明細書で記載されたように崩した末梢神経を含む。NEDAPS細胞を産出するのに適した神経は、機能的に重要な神経への傷害を被った神経移植対象のために常法に従って外科的に収集された末梢神経を含む。機能の喪失がたとえあるにせよ最小限で収集され得る、容易に入手可能な神経が数種存在する。末梢神経は、例えば、腓腹神経、腓腹神経の枝、手指もしくは足指の固有指神経(proper digital nerve)、閉鎖神経の薄筋枝(gracilis branch)、内側前腕皮神経のセグメント(segment of a medial antebrachial cutaneous nerve)、外側前腕皮神経、近位第3趾間束神経(proximal third webspace fascicle nerve)、後骨内神経(posterior intraosseous nerve)または他の末梢神経とすることができる。
インビボでNEDAPS細胞増殖条件に晒された対象の末梢神経は、NEDAPS細胞増殖条件に晒した直後に対象から、例えば、外科的切除によって収集され得るかまたはある期間後に収集され得る。一部の実施形態では、末梢神経は、NEDAPS細胞増殖条件に晒した後、最大4日、より好ましくは最大3日で収集される。例えば、末梢神経は、NEDAPS細胞増殖条件に晒した後、例えば約8時間(すなわち1/3日)、約12時間(すなわち半日)、約24時間(すなわち1日)、約48時間(すなわち2日)、もしくは約72時間(すなわち3日)で、または前述の値の任意の組を境界とする範囲(例えば、NEDAPS細胞増殖条件に晒した後8時間〜72時間(すなわち1/3日〜3日)、8〜12時間(すなわち1/3日〜半日)、12〜24時間(すなわち半日〜1日)、24から48時間(すなわち1〜2日)、もしくは48〜72時間(すなわち2〜3日)など)から選択される期間後に収集され得る。収集後、神経は、神経からのNEDAPS細胞の出現を促進するように任意選択で崩され得る。
NEDAPS細胞の集団は、例えば、幹細胞が特定の細胞型に分化するように誘導する分化培地において集団を培養することによって、集団を分化条件に晒することによってより低能力の細胞型に分化され得る。本開示のNEDAPS細胞は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉系列の細胞に分化され得る。NEDAPS細胞が分化され得る細胞型の特定の例は、図18に示されている。様々な細胞型に関する分化条件が当技術分野で既知であり、ESCまたはiPS細胞を分化させるための分化培地などの分化培地が市販されている。例示的方法および培地は、実施例4〜6に記載されている。例えば、StemXVivo(商標) Ectoderm Kit(R&D Systems,カタログ#SC031)、StemXVivo(商標) Mesoderm Kit(R&D Systems,カタログ#SC030)、およびStemXVivo(商標) Endoderm Kit(R&D Systems,カタログ#SC019)は、それぞれ、NEDAPS細胞を外胚葉、中胚葉、および内胚葉細胞に分化させるために使用され得、実施例4に記載された培地は、NEDAPS細胞の集団を骨芽細胞または内皮細胞(すなわち2つの間葉系細胞型)に分化させるために使用され得、実施例5に記載された培地は、NEDAPS細胞の集団を内胚葉細胞に分化させるために使用され得、実施例6に記載された培地は、NEDAPS細胞の集団を神経幹細胞(すなわち、外胚葉細胞型)に分化させるために使用され得る。
本明細書で記載された方法は、NEDAPS細胞およびそれから分化した細胞型の集団(例えば、(a)単離されていることおよび/または(b)少なくとも50%均質であることおよび/または(c)少なくとも10の細胞を含有すること、および7節に記載されたその実施形態のいずれかによって特徴付けられる集団)を生成するために使用され得る。これら集団は、自家適用、すなわち、NEDAPS細胞が由来した(ヒトまたは他の動物)対象における移植のための特定の利点を見出す。
材料および方法:10匹のマウスに麻酔をかけ(IACUC承認プロトコールの下で)、右坐骨神経を標準的方法を使用して露出させた。7匹の動物においては、50ナノグラムのBMP2を神経に直接配置した。3匹の対照動物においては、神経に薬剤を適用しなかった。
材料および方法:20匹のマウスに麻酔をかけ、50ngまたは100ngのBMP2を各マウスの右大腿屈筋中に経皮的に注入した(IM)。このマウスを24、48、または72時間で屠殺した。大腿屈筋を坐骨神経まで解剖せずに収集したが、収集した組織がこの神経の通常の解剖的部位を含有することに気をつけた。反対側の(未処置)大腿屈筋を4匹の動物から収集し、対照組織として利用した。
インビボでのNEDAPS細胞調製:動物についての活動は全てWichita State University Animal Care Facilityにおいて行い、これは、Wichita State University Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。8から12週齢メスBALB/cマウスをThe Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)から購入し、研究における使用前に少なくとも1から6週間、施設に順応させた。外科的処置の日に、マウスに、予防的鎮痛のために外科的処置1時間前に皮下注射によって0.05mg/kgのブプレノルフィンを与えた。マウスに、ノーズコーンによって、1〜2%イソフルランを補充した90mg/kgケタミンおよび8mg/kgキシラジンの腹腔内注入によって麻酔をかけた。各動物の右足を剪毛し、外科手術領域をポビドンヨードおよびエタノールで消毒した。切り込みを大腿の外側面に作り、鈍的切開によって坐骨神経を露出させた。露出された神経の全長に沿って4つまたは5つの部位で1mmの幅でピンセットを使用してその本来の直径の約25%まで手動で神経を加圧するか、または10μlの無菌生理食塩水(INFUSE(登録商標) Bone Graft,Medtronic Spinal and Biologies,Memphis,TN)中の60ngのBMP2に晒した。各動物の切り込みを縫合して閉じ、動物をCO2吸入による屠殺まで8、24、48、または72時間ケアした。組織学的分析、細胞培養またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を使用した遺伝子発現に関するスクリーニングのために、屠殺後直ちに神経を収集した。
細胞培養:NEDAPS細胞を胚性幹細胞培地中で5日間培養した維持した後、細胞を分化のために実験した。骨芽細胞誘導のために、NEDAPS細胞を、DMEM/F12培地中の10mMβ−グリセロリン酸ナトリウム、50μg/mlアスコルビン酸および10nMデキサメタゾンを含み、加えて10%ウシ胎仔血清、100mg/mlストレプトマイシンおよび100U/mlペニシリンを含む骨原性培地で培養した。アルカリホスファターゼ染色およびI型コラーゲン染色を7日後に行って、骨芽細胞の構造特性および機能特性を識別した。内皮細胞分化へと方向づけられたNEDAPS細胞をフィブロネクチンでコーティングされたフラスコ(Sigma−Aldrich,US)上に蒔き、5%FBS、10ng/mlヒト上皮増殖因子(hEGF)、50ng/mlヒト血管内皮増殖因子(VEGF)、50ng/mlヒトインスリン様増殖因子−1(IGF−1)、1μg/mlヒドロコルチゾンならびに100U/mlペニシリン(Invitrogen,US)および100g/mlストレプトマイシン(Invitrogen,US)を含有する、EGM(商標)−2−MV SingleQuots(商標)を補充した内皮細胞基本培地−2(Lonza Walkersville,Inc.Walkersville,MD)中で培養した。
細胞培養:NEDAPS細胞をGibco(Life Technologies)製の市販のキットを使用してDE系列に誘導した。簡潔に述べると、NEDAPS細胞をGibco(登録商標)Essential 8(商標)培地を有する12ウェルプレートにおいて37℃、5%CO2で培養した。第1日に、Essential 8(商標)培地を、24時間予熱したDE誘導培地Aと交換した。第2日に、DE誘導培地Aを完全に吸引し、予熱されたDE誘導培地Bと交換した。プレートを37℃で24時間インキュベートした。細胞の形態変化を倒立顕微鏡下でモニタリングした。
細胞培養:NEDAPS細胞を増殖させ、誘導して、神経幹細胞に分化させた。細胞の増殖のために、NEDAPS細胞を、NSC基本培地(Stemcell Technologies,カタログ番号05700)中の10%NeuroCult(商標)NSC Proliferation supplement(v/v)(Stemcell Technologies,カタログ番号05701)を含有するComplete NeuroCult(商標) NSC Proliferation Medium中で培養した。20ng/mlの最終濃度でrhEGFも培養物に含めた。30%細胞コンフルエンスに到達した時、培地を除去し、10%NeuroCult(商標)NSC differentiation supplement(Stemcell Technologies,カタログ番号05703)を含有するComplete NeuroCult(商標) NSC Differentiation Mediumと交換し、培養物を37℃で2日間インキュベートした。細胞の形態変化を倒立顕微鏡下でモニタリングした。
材料および方法:マウス坐骨神経を外科的に露出させ、無菌技法を使用して回収した。身体から解剖して取り出す前に、神経に沿って1〜2秒間、緩やかな加圧を適用した。神経組織を1mmの小片に刻み、実施例3に記載されたようにコラゲナーゼおよびトリプシンで消化した。細胞を遠心分離によって収集し、実施例3に記載された幹細胞培地を入れた12ウェル培養プレートまたは8ウェルチャンバースライド中に入れた。24時間後に750ng/mlの最終濃度でBMP2を培地に加え、24時間培養し、その後、この培地を取り出し、実施例3に記載された幹細胞培地:20%Knockout serum replacement(KSR,Gibco)、100μM MEM可欠アミノ酸溶液(Gibco)、1×GlutaMAX(商標)−I(Cat.no.35050−079,Gibco);55μM β−メルカプトエタノール(Gibco)、20ng/mlヒト白血病阻害因子(LIF,Gibco)、100U/mlペニシリン(Invitrogen,Grand Island,NY)、および100μg/mlストレプトマイシン(Invitrogen)を補充したDMEM(Gibco,Life Technologies)と交換した。全ての段階において、細胞を5%CO2雰囲気中で37℃で培養した。
本開示は、以下の特定の実施形態によって例証される。
1.末梢神経における幹細胞の調製を誘導するための方法であって、
対象を提供すること;
対象の選択された末梢神経を選択された期間、外因的刺激に晒すこと;
選択された期間後、刺激された末梢神経から幹細胞を収集すること;および
非分化培地においてインビトロで胚性幹細胞を培養すること
を含む方法。
2.幹細胞が全能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞、オリゴポーテント細胞(oligopotent cell)、単能性細胞、およびその組合せからなる群から選択される、実施形態1に記載の方法。
3.外因的刺激が物理的傷害、機械的操作、撹乱、電気的刺激、またはサイトカインに晒すことの1つまたは複数である、実施形態1に記載の方法。
4.サイトカインがサイトカインの骨形態形成タンパク質(BMP)ファミリーのメンバーである、実施形態3に記載の方法。
5.サイトカインがBMP2である、実施形態4に記載の方法。
6.BMP2をin situで末梢神経に適用して、幹細胞の増殖を刺激すること;
末梢神経を外科的に切除すること、および
幹細胞の増殖を促進するために非分化培地においてインビトロで幹細胞を培養して、幹細胞の集団を作り出すこと
をさらに含む、実施形態5に記載の方法。
7.電気的刺激をin situで末梢神経に適用して、幹細胞の増殖を刺激すること;
末梢神経を外科的に切除すること、および
幹細胞の増殖を促進するために非分化培地においてインビトロで幹細胞を培養して、幹細胞の集団を作り出すこと
をさらに含む、実施形態3に記載の方法。
8.インビトロで幹細胞を1つまたは複数の分化因子に晒して、組織前駆細胞を形成するように幹細胞の分化を引き起こすこと
をさらに含む、実施形態1に記載の方法。
9.組織前駆細胞を対象の身体に再移植することをさらに含む、実施形態8に記載の方法。
10.対象が実施形態1に記載の末梢神経のドナーである、実施形態9に記載の方法。
11.対象から刺激された末梢神経を収集すること;および
培養を開始する前または後に神経を機械的に崩して、末梢神経からの胚性幹細胞の出現を促進すること
をさらに含む、実施形態1に記載の方法。
12.機械的に崩すことが、末梢神経の鞘を刻むことまたは分割することのうちの1つまたは複数を含む、実施形態11に記載の方法。
13.対象から刺激された末梢神経を収集すること;および
培養を開始する前または後に神経を酵素処理して、末梢神経からの幹細胞の出現を促進すること
をさらに含む、実施形態1に記載の方法。
14.酵素的に処置することがプロテアーゼでの処置を含む、実施形態13に記載の方法。
15.プロテアーゼがコラゲナーゼまたはマトリックスメタロプロテイナーゼのうちの少なくとも1つである、実施形態14に記載の方法。
16.対象から末梢神経の少なくとも一部を外科的に切除すること;
外科的に切除された末梢神経を選択された期間、外因的刺激に晒すること;
選択された期間後、刺激された末梢神経から胚性幹細胞を収集すること;および
非分化培地においてインビトロで胚性幹細胞を培養すること
をさらに含む、実施形態1に記載の方法。
本出願において引用された全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、各個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が全ての目的のために参照によって組み込まれていると個々に示されている場合と同じ程度まで、全ての目的のためにその全体が参照によってここに組み込まれている。本明細書に組み込まれた参考文献の1つまたは複数の教示と本開示間に矛盾がある場合、本明細書の教示が意図されている。
Claims (19)
- Oct4、Sox2、c−Myc、およびKlf4の発現によって特徴付けられる哺乳動物神経由来成体多能性幹細胞(NEDAPS細胞)。
- 単離されている、請求項1に記載のNEDAPS細胞。
- 以下のうちの1つ、2つ、3つ、4つまたは全てによって特徴付けられる、請求項1または請求項2に記載のNEDAPS細胞:
(a)中胚葉細胞型、任意選択で、間葉系細胞型に分化する能力;
(b)内胚葉細胞型に分化する能力;
(c)外胚葉細胞型、任意選択で、神経幹細胞に分化する能力;
(d)運動性;および
(e)培養におけるガラスまたはプラスチック基板への付着性。 - 前記間葉系細胞型が(a)骨芽細胞または(b)内皮細胞である、請求項3に記載のNEDAPS細胞。
- 請求項1から4のいずれか1項に記載のNEDAPS細胞の集団。
- 単離されており、任意選択で、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%均質である、請求項5に記載の集団。
- 請求項6に記載の集団を調製する方法であって、
(a)エキソビボでNEDAPS細胞増殖条件に晒された末梢神経を培養すること;または
(b)インビボで対象においてNEDAPS細胞増殖条件に晒された末梢神経からの細胞を培養すること、ならびに
(i)任意選択で、培養する前に前記末梢神経を収集すること;および
(ii)任意選択で、収集する前に前記末梢神経を前記NEDAPS細胞増殖条件に晒すこと
を含む方法。 - 前記NEDAPS細胞増殖条件が、
(a)前記末梢神経をBMP2に晒すこと;
(b)前記末梢神経をBMP2以外の神経炎症剤に晒すこと;
(c)外傷を前記末梢神経に与えること;
(d)(a)〜(c)の2つの組合せ;または
(e)(a)〜(c)の3つの組合せ
を含む、請求項7に記載の方法。 - 前記NEDAPS細胞増殖条件が前記末梢神経をBMP2に晒すことを含み、
(a)前記末梢神経がインビボで対象においてBMP2に晒され、任意選択で、
(i)BMP2が、任意選択で10ng〜1ミリグラムにわたる量で、前記末梢神経に直接適用される;
(ii)BMP2が、任意選択で10ng〜1ミリグラムにわたる量で、筋肉内注射を通して前記対象に投与される;もしくは
(iii)前記対象がBMP2の局所的産生をもたらす条件に晒され、任意選択で、前記条件が骨折、鈍的傷害、熱傷害、または電気ショックを含む;または
(b)前記末梢神経が、任意選択で5ng/ml〜1mg/mlにわたる濃度で、BMP2を含む培地において前記神経を培養することによってエキソビボでBMP2に晒される、
請求項8に記載の方法。 - 前記NEDAPS細胞増殖条件が外傷を前記末梢神経に与えることを含み、任意選択で、前記外傷が機械的外傷、電気刺激、超音波衝撃波、または熱損傷である、請求項8に記載の方法。
- 前記NEDAPS細胞増殖条件が前記末梢神経をBMP2以外の神経炎症剤に晒すことを含み、任意選択で、前記神経炎症剤が腫瘍壊死因子α、インターロイキン−1β、神経成長因子、ヒスタミン、インターロイキン6、またはその組合せである、請求項8に記載の方法。
- 前記末梢神経が、前記末梢神経または前記末梢神経からの細胞を培養する前に、任意選択でプロテアーゼ(任意選択でコラゲナーゼまたはマトリックスメタロプロテアーゼ)による処置によって、崩されている、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記末梢神経が腓腹神経、腓腹神経の枝、手指もしくは足指の固有指神経、閉鎖神経の薄筋枝、内側前腕皮神経のセグメント、外側前腕皮神経、近位第3趾間束神経、または後骨内神経であり、任意選択で前記神経が切断された肢からのものである、請求項7〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 分化細胞の集団を調製するための方法であって、請求項5から6のいずれか1項に記載の集団または請求項7〜13のいずれか1項に記載の方法によって調製された集団を分化条件に晒すことを含む方法。
- (a)前記分化細胞が中胚葉細胞であり、前記分化条件が中胚葉分化培地において前記集団を培養することを含む;
(b)前記分化細胞が内胚葉細胞であり、前記分化条件が内胚葉分化培地において前記集団を培養することを含む;または
(c)前記分化細胞が外胚葉細胞であり、前記分化条件が外胚葉分化培地において前記集団を培養することを含む、
請求項14に記載の方法。 - (a)前記分化細胞が骨芽細胞であり、前記分化条件が骨原性分化培地において前記集団を培養することを含む;
(b)前記分化細胞が内皮細胞であり、前記分化条件が内皮分化培地において前記集団を培養することを含む;または
(c)前記分化細胞が神経幹細胞であり、前記分化条件が神経幹細胞分化培地において前記集団を培養することを含む、
請求項14に記載の方法。 - 請求項14〜16のいずれか1項に記載の方法によって調製された分化細胞の集団。
- 組織再生を必要としている対象を処置する方法であって、前記対象に、前記組織再生に適した細胞の集団を移植することを含み、前記細胞の集団が、
(a)請求項7〜16のいずれか1項に記載の方法によって調製され;または
(b)請求項5〜6および17のいずれか1項に記載の細胞の集団であり、
任意選択で、前記細胞の集団が前記対象にとって自家性である、方法。 - 遺伝子治療を必要としている対象を処置する方法であって、前記対象に、前記対象が必要としている遺伝子の導入によって組換え型にされた細胞の集団を移植することを含み、前記細胞の集団が、
(a)請求項7〜16のいずれか1項に記載の方法によって調製され;または
(b)請求項5〜6および17のいずれか1項に記載の細胞の集団であり、
任意選択で、前記細胞の集団が前記対象にとって自家性である、方法。
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