JP2017528699A - 生体試料品質を評価するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2014年7月31日に出願された米国仮特許出願第62/031,247号への優先権の利益を主張し、その全ての内容が、参照によって本明細書中に組み込まれる。
製薬会社は、特異的経路阻害剤の開発に大いに取り組んでおり、新たな薬物が、前臨床開発プログラムから多数出現し得る。患者集団における、層別化および予測的バイオマーカーとしての薬物標的の同定は、薬物開発における重要な分野になっている;実際、かかるバイオマーカーは、現在のおよび将来の患者ケアに必須であり、がんケアにおける償還コストの制御における重要な戦略であると考えられる。
例えば遺伝子および/またはタンパク質発現(例えば、mRNAまたはリンタンパク質の発現)であるがこれらに限定されないバイオマーカーの発現は、当該分野で周知の種々の技術によって測定され得る。バイオマーカーのメッセンジャーRNA(mRNA)のレベルを定量化することは、バイオマーカーの発現を測定するために使用され得る。あるいは、バイオマーカーのタンパク質産物のレベルを定量化することが、バイオマーカーの発現を測定するために使用され得る。以下で議論される方法に関するさらなる情報は、Ausubelら(2003年)またはSambrookら(1989年)において見出され得る。当業者は、どのパラメーターが目的のmRNAまたはタンパク質の検出を最適化するために操作され得るかを知る。
一部の態様では、前記遺伝子の発現を測定するステップは、タンパク質発現レベルを測定するステップを含む。タンパク質発現レベルを測定するステップは、例えば、ELISA、ウエスタンブロット、免疫組織化学検査、または抗体アレイへの結合を実施するステップを含み得る。ある特定の態様では、試料中のリンタンパク質のレベルを決定するステップは、この試料を、示されたリンタンパク質に対するリン酸化特異的抗体と接触させるステップを含む。
B.核酸検出の方法
本明細書で使用する場合、用語「生物学的試料」は、その最も広い意味で使用され、被験体(例えば、ヒト)から取得された身体試料を指し得る。例えば、この生物学的試料には、「臨床試料」、すなわち、被験体に由来する試料が含まれ得る。かかる試料には、以下が含まれ得るがこれらに限定されない:細胞を含有していてもいなくてもよい末梢体液、例えば、血液、尿、血漿、粘液、胆汁膵液、上澄み液および血清;組織または細針生検試料;ならびに既知の診断、処置および/またはアウトカム履歴を有する保存試料。生物学的試料には、組織の切片、例えば、組織学的目的のために採取された凍結切片もまた含まれ得る。用語「生物学的試料」は、試料を処理することによって得られた任意の材料もまた包含し得る。得られた材料には、生物学的試料から単離された細胞(またはそれらの子孫)およびこの試料から抽出されたタンパク質が含まれ得るがこれらに限定されない。生物学的試料の処理は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、固定、妨害性成分の不活性化、試薬の添加などのうち、1または複数を含み得る。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を示すこと、およびしたがって、本発明の実施のための好ましい様式を構成するとみなされ得ることが、当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、多くの変更が、開示された具体的な実施形態においてなされ得、同様または類似の結果がなおも得られることを、理解すべきである。
試料の収集および調製
原発性結腸直腸がん(CRC)を有する50人の患者およびCRCの肝内転移を有する43人の患者を、この研究に登録した。原発性腫瘍を有する50人の患者から、370のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料および780の液体窒素中凍結(FF)組織試料を収集し、転移したがんを有する43人の患者から、592のFFPE組織試料および642のFF組織試料を収集した。全ての試料を、形態学的品質管理に供した(図1A〜1B)。
タンパク質の定量化
40のFF標本を使用した。組織溶解物を、各FF標本から20μmスライスをカットしホモジナイズすることによって調製した。得られた組織溶解物を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ(BCAキット;Sigma、Steinheim、Germany)に供して、タンパク質濃度を決定した。タンパク質の定量化を、MSD(Gaithersburg、MD、USA)のアッセイプラットフォームに基づいて、捕捉抗体を用いて96ウェルプレートを使用して実施した。以下のアッセイキットを使用した:HIF1アルファシングルプレックス、HSP27/pHSP27(Ser15)デュプレックス、EGFR/pEGFR(Tyr1173)デュプレックス、AKT/pAKT(Ser473)デュプレックス、mTOR/pmTOR(Ser2448)デュプレックス、p70−S6K/pp70−S6K(Thr421、Ser424)デュプレックス、GSK3−ベータ/pGSK3−ベータ(Ser9)デュプレックス、MEK1/2/pMEK1/2(Ser217/221)デュプレックスおよびERK1/2/pERK1/2(Thr202/Tyr204、Thr185/Tyr187)デュプレックス。
免疫組織化学検査
FFPE組織由来の5μm切片を、ガラススライド上にマウントし、56℃で一晩風乾し、自動プラットフォーム(Ventana Discovery XT、Tucson、AZ、USA)を使用した免疫染色に供した。以下の一次抗体および希釈物を使用した:pERK1/2 1:300、pAkt(Ser473)1:30、pEGFR 1:110、pmTOR 1:130、pHer3 1:70(全てCell Signaling Technology Inc.、Danvers、MA、USAから)。染色後、切片を、上昇するエタノール濃度およびキシレンで処理し、最後にPertex(Medite GmbH、Burgdorf、Germany)でカバーした。切片は、病理学者が光学顕微鏡下で試験した。腫瘍細胞染色を、非存在、弱い、中程度または強いと分類し、染色スコアを、以下の式に従って染色の程度に基づいて計算した:スコア=3×強く染色された腫瘍細胞の百分率+2×中程度に染色された腫瘍細胞の百分率+1×弱く染色された腫瘍細胞の百分率。
遺伝子発現に対する、組織処理時点の影響
遺伝子発現分析のために、総RNAを、全ての凍結組織ブロックから2連で抽出した。簡潔に述べると、組織をホモジナイズし、RNAを、製造業者の指示に従って、フェノールクロロホルム抽出およびRNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen、Hilden、Germany)を使用して2ステップで単離した。RNA品質を、Agilent 2100バイオアナライザー(Agilent Technologies、Berlin、Germany)を使用して、18Sおよび28SのリボソームRNAピークに基づいて評価した。≧7のRNA完全性数を有するRNA試料のみを、遺伝子発現分析に使用した。RNA試料を、Affymetrix GeneChip(商標)テクノロジー(Affymetrix Inc.、Santa Clara、CA、USA)に基づいて、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ(GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0)を使用して反復で分析した。
潜在的なRNAベースの組織品質バイオマーカーの同定
階層的クラスタリングを使用して、遺伝子発現データをさらに評価し、異なる患者群を分類した。結腸手術を有した患者由来のデータのクラスタリング(別々に、正常および腫瘍組織クラスタリング)は、7つの異なるパーティションを生じた(図3)。ほとんどの患者(正常組織で89%)は、手術前の時点が手術後10分、20分および45分の時点から分離したことを意味するパーティション[手術前/10分20分45分]に入った。
手術および組織処理/虚血によって影響を受けないハウスキーピング遺伝子の同定
遺伝子発現データを、変動係数(CV)に従ってソートした。正常組織における4つ全ての時点にわたって最も低いCVを有する10個のプローブセットが、以下の表7に列挙される。一部のプローブセットは、調査が不十分なタンパク質をコードしたが、それらのうち、非常に構成的に発現された遺伝子は、遺伝子発現分析のための潜在的なハウスキーピング遺伝子として公知の、高コピー数で広く発現される遺伝子、真核生物翻訳伸長因子1アルファ1(EEF1A1)であった(Rienzoら、2013年)。低いCVを有するさらなる周知のハウスキーピング遺伝子は、リボソームタンパク質L13およびS18、ベータ−グルクロニダーゼ、ならびにベータ−アクチンであり、他の頻繁に使用されるハウスキーピング遺伝子、例えば、ベータ−2−ミクログロブリンおよびベータ2B−チューブリンは、構成的には発現されなかった。
EGFR経路タンパク質のリン酸化
EGFRならびにAKTおよびMAPK経路のその下流の重要なシグナル伝達タンパク質を、総タンパク質濃度およびリン酸化ステータスに関して調査した。手術前生検の発現レベルを参照として使用して、タンパク質発現における≧2倍の変化(上方または下方)が実証された。正常肝臓組織では、クランプ前組織生検を参照として使用した。
AKTおよびMAPK経路内の重要なシグナル伝達分子ならびにHSP27のリン酸化に対する、組織処理時点の影響
重要なシグナル伝達タンパク質のリン酸化ステータスは、ほとんどの患者において、正常組織と比較して腫瘍組織においてより高い程度まで、有意に影響を受けた。本発明者らは、リン酸化カスケードの一部においては活性化を示し他の部分においては不活性化を示す、一続きのリン酸化事象を見出した。手術前の試料と手術後10分の試料との間での最も重要な調節タンパク質における統計的に有意な変化、および手術後冷虚血時間の間の一部のタンパク質についてのさらなる変化が、見出された。これには、AKT、mTOR、ERK1/2およびMEKが含まれた(図5C〜5D)。
統計的分析
MSDプラットフォーム上で測定したタンパク質含量の統計的分析および免疫組織化学検査から得られた染色スコアの統計的分析を、ソフトウェアシステムGraphPad Prism Version 5.0(GraphPad Software、San Diego、CA、USA)を使用して、クラスカル−ウォリス検定およびダンの多重比較検定を用いて実施した。有意レベルは0.05であった。
以下の参考文献は、本明細書に示されるものに対して補助的な、例示的な手順上の詳細または他の詳細をそれらが提供する程度において、参照によって本明細書に具体的に取り込まれる。
Claims (86)
- 患者試料の品質を決定するin vitro方法であって、
(a)該患者試料中の、HSP27タンパク質の発現のレベルおよびHSP27タンパク質のSer15のリン酸化のレベルを測定するステップ;および
(b)該患者試料中の、HSP27タンパク質リン酸化の百分率に基づいて、該患者試料の該品質を決定するステップ、
を含む、方法。 - 患者試料の品質を決定するin vitro方法であって、
(a)該患者試料中の、HSP27、EGFR、AKT、mTOR、p70−S6K、GSK3−ベータ、MEK1/2およびERK1/2からなる群から選択される少なくとも2種のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを測定するステップ;および
(b)該患者試料中の、該少なくとも2種のタンパク質のリン酸化の百分率に基づいて、該患者試料の該品質を決定するステップ、
を含む、方法。 - 前記試料が組織試料である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記試料が凍結試料である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記試料が、化学的に固定された試料である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料である、請求項5に記載の方法。
- 前記患者から試料を取得するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記試料が、第三者から取得される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記組織試料が、腫瘍切除試料である、請求項2に記載の方法。
- 前記腫瘍が、結腸直腸癌または肝癌である、請求項9に記載の方法。
- 参照レベルと比較した、前記患者試料中のリン酸化された前記タンパク質の百分率における変化が、前記組織品質を示す、請求項1または2に記載の方法。
- 前記参照レベルが、生検試料におけるレベルである、請求項11に記載の方法。
- 前記生検試料が、前記患者由来である、請求項12に記載の方法。
- 前記生検試料および前記患者試料が、同じ組織から取得される、請求項12に記載の方法。
- 前記患者試料の前記品質を決定するステップが、該試料が冷虚血状態に曝露された期間を推定するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記患者試料中の、リン酸化された少なくとも第2、第3または第4のタンパク質の百分率を決定するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第2、第3または第4のタンパク質が、EGFR、AKT、mTOR、p70−S6K、GSK3−ベータ、MEK1/2およびERK1/2からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- EGFRのTyr1173、AKTのSer473、mTORのSer2448、p70−S6KのThr421もしくはSer424、GSK3−ベータのSer9、MEK1/2のSer271/221、またはERK1/2のThr202/Tyr204もしくはThr185/Tyr187のリン酸化の百分率が決定される、請求項16に記載の方法。
- 前記患者試料中の、リン酸化された5、6、7、8、9または10種のタンパク質の百分率を決定するステップをさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 前記試料中の、CYR61、RGS1、DUSP1、DUOX2およびSLC6A14からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子のmRNA発現のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記mRNA発現のレベルが、定量的リアルタイムPCR、ノーザンブロッティング、in situハイブリダイゼーションまたはアレイハイブリダイゼーションによって測定される、請求項20に記載の方法。
- 前記タンパク質の前記発現のレベルが、ELISA、ウエスタンブロッティング、質量分析、キャピラリー免疫検出方法または免疫組織化学検査によって測定される、請求項1または2に記載の方法。
- 患者試料の品質を決定するin vitro方法であって、
(a)該患者試料中の、CYR61、RGS1、DUSP1、DUOX2およびSLC6A14からなる群から選択される少なくとも1種のmRNAの発現のレベルを測定するステップ;および
(b)該患者試料中の該少なくとも1種のmRNAの該発現のレベルに基づいて、該患者試料の該品質を決定するステップ、
を含む、方法。 - 前記患者から試料を取得するステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 前記試料が、第三者から取得される、請求項23に記載の方法。
- 安定なmRNAの前記発現のレベルを測定するステップ、および前記少なくとも1種のmRNAと該安定なmRNAとの比率を決定するステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 参照レベルと比較した、前記比率における変化が、組織品質を示す、請求項26に記載の方法。
- 前記安定なmRNAがEEF1A1である、請求項26に記載の方法。
- 前記患者試料中の、2、3、4、5、6、7、8、9または10種のmRNAの発現のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 前記患者試料中の、リン酸化された少なくとも1種のタンパク質の百分率を決定するステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のタンパク質が、HSP27、EGFR、AKT、mTOR、p70−S6K、GSK3−ベータ、MEK1/2およびERK1/2からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記患者試料中の、リン酸化された少なくとも1種のタンパク質の百分率を決定するステップが、HSP27のSer15、EGFRのTyr1173、AKTのSer473、mTORのSer2448、p70−S6KのThr421もしくはSer424、GSK3−ベータのSer9、MEK1/2のSer271/221、および/またはERK1/2のThr202/Tyr204もしくはThr185/Tyr187におけるリン酸化の百分率を決定するステップを含む、請求項31に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のタンパク質がHSP27である、請求項31に記載の方法。
- 前記試料が組織試料である、請求項23に記載の方法。
- 前記試料が凍結試料である、請求項23に記載の方法。
- 前記試料が、化学的に固定された試料である、請求項23に記載の方法。
- 前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料である、請求項36に記載の方法。
- 前記組織試料が、腫瘍切除試料である、請求項34に記載の方法。
- 前記腫瘍が、結腸直腸癌または肝癌である、請求項38に記載の方法。
- 前記参照レベルが、生検試料におけるレベルである、請求項27に記載の方法。
- 前記生検試料が、前記患者由来である、請求項40に記載の方法。
- 前記生検試料および前記患者試料が、同じ組織から取得される、請求項40に記載の方法。
- リン酸化の百分率が、ELISA、ウエスタンブロッティング、質量分析、キャピラリー免疫検出方法または免疫組織化学検査によって決定される、請求項30に記載の方法。
- 前記mRNA発現のレベルが、定量的リアルタイムPCR、ノーザンブロッティング、in situハイブリダイゼーションまたはアレイハイブリダイゼーションによって測定される、請求項23に記載の方法。
- 患者由来の試料の分析のためのアッセイであって、該患者試料中の、HSP27タンパク質の発現のレベルおよびHSP27タンパク質のSer15のリン酸化のレベルを選択的に測定するステップを含む、アッセイ。
- 患者由来の試料の分析のためのアッセイであって、該患者試料中の、HSP27、EGFR、AKT、mTOR、p70−S6K、GSK3−ベータ、MEK1/2およびERK1/2からなる群から選択される少なくとも2種のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを選択的に測定するステップを含む、アッセイ。
- 前記患者試料が組織試料である、請求項45または46に記載のアッセイ。
- 前記患者試料が凍結試料である、請求項45または46に記載のアッセイ。
- 前記試料が、化学的に固定された試料である、請求項45または46に記載のアッセイ。
- 前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料である、請求項49に記載のアッセイ。
- 前記組織試料が、腫瘍切除試料である、請求項47に記載のアッセイ。
- 前記腫瘍が、結腸直腸癌または肝癌である、請求項47に記載のアッセイ。
- 前記患者から試料を取得するステップをさらに含む、請求項45または46に記載のアッセイ。
- 前記試料が、第三者から取得される、請求項45または46に記載のアッセイ。
- 参照試料中の、HSP27、EGFR、AKT、mTOR、p70−S6K、GSK3−ベータ、MEK1/2およびERK1/2からなる群から選択される少なくとも2種のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項45または46に記載のアッセイ。
- 前記参照試料が、生検試料である、請求項55に記載のアッセイ。
- 前記生検試料が、前記患者由来である、請求項56に記載のアッセイ。
- 前記生検試料および前記患者試料が、同じ組織から取得される、請求項56に記載のアッセイ。
- 少なくとも第2、第3または第4のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項45または46に記載のアッセイ。
- 前記第2、第3または第4のタンパク質が、HSP27、EGFR、AKT、mTOR、p70−S6K、GSK3−ベータ、MEK1/2およびERK1/2からなる群から選択される、請求項59に記載のアッセイ。
- リン酸化のレベルを選択的に測定するステップが、HSP27のSer15、EGFRのTyr1173、AKTのSer473、mTORのSer2448、p70−S6KのThr421もしくはSer424、GSK3−ベータのSer9、MEK1/2のSer271/221、および/またはERK1/2のThr202/Tyr204もしくはThr185/Tyr187におけるリン酸化のレベルを測定するステップを含む、請求項59に記載のアッセイ。
- 前記患者試料中の、3、4、5、6、7、8、9または10種のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項60に記載のアッセイ。
- CYR61、RGS1、DUSP1、DUOX2およびSLC6A14からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子のmRNA発現のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項45または46に記載のアッセイ。
- 前記mRNA発現のレベルが、定量的リアルタイムPCR、ノーザンブロッティング、in situハイブリダイゼーションまたはアレイハイブリダイゼーションによって測定される、請求項63に記載のアッセイ。
- 前記タンパク質発現のレベルが、ELISA、ウエスタンブロッティング、質量分析、キャピラリー免疫検出方法または免疫組織化学検査によって測定される、請求項45または46に記載のアッセイ。
- 患者由来の試料の分析のためのアッセイであって、該患者試料中の、CYR61、RGS1、DUSP1、DUOX2およびSLC6A14からなる群から選択される少なくとも1種のmRNAの発現のレベルを選択的に測定するステップを含む、アッセイ。
- 前記患者から試料を取得するステップをさらに含む、請求項66に記載のアッセイ。
- 前記試料が、第三者から取得される、請求項66に記載のアッセイ。
- 前記試料中の、安定なmRNAの発現のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項66に記載のアッセイ。
- 前記安定なmRNAがEEF1A1である、請求項69に記載のアッセイ。
- 前記患者試料中の、2、3、4、5、6、7、8、9または10種のmRNAの発現のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項66に記載のアッセイ。
- 前記患者試料中の、少なくとも第1のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項66に記載のアッセイ。
- 前記第1のタンパク質が、HSP27、EGFR、AKT、mTOR、p70−S6K、GSK3−ベータ、MEK1/2およびERK1/2からなる群から選択される、請求項66に記載のアッセイ。
- 前記第1のタンパク質がHSP27である、請求項73に記載のアッセイ。
- 少なくとも第1のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを測定するステップが、ELISA、ウエスタンブロッティング、質量分析、キャピラリー免疫検出方法または免疫組織化学検査による、請求項72に記載のアッセイ。
- 前記試料が組織試料である、請求項66に記載のアッセイ。
- 前記試料が凍結試料である、請求項66に記載のアッセイ。
- 前記試料が、化学的に固定された試料である、請求項66に記載のアッセイ。
- 前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料である、請求項78に記載のアッセイ。
- 前記組織試料が、腫瘍切除試料である、請求項76に記載のアッセイ。
- 前記腫瘍が、結腸直腸癌または肝癌である、請求項80に記載のアッセイ。
- 参照試料中の、CYR61、RGS1、DUSP1、DUOX2およびSLC6A14からなる群から選択される少なくとも1種のmRNAの発現のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項66に記載のアッセイ。
- 前記参照試料が、生検試料である、請求項82に記載のアッセイ。
- 前記生検試料が、前記患者由来である、請求項83に記載のアッセイ。
- 前記生検試料および前記患者試料が、同じ組織から取得される、請求項83に記載のアッセイ。
- 少なくとも1種のmRNAの発現のレベルを測定するステップが、定量的リアルタイムPCR、ノーザンブロッティング、in situハイブリダイゼーションまたはアレイハイブリダイゼーションによる、請求項66に記載のアッセイ。
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