JP2017527308A - 細胞の細胞質への分子の送達のための構築物 - Google Patents
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- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
Description
(a)ターゲティング部分;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子
を含む構築物に関する。さらに、本発明は、本発明に従った構築物、および任意で、薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物に関する。さらに、本発明は、SEQ ID NO:1に示される配列またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列を含むキットに関する。さらに、本発明は、細胞の細胞質への治療用部分、検出可能な部分、核酸分子、好ましくはsiRNA、キャリア分子、好ましくはナノ粒子、リポソーム、およびウイルスベクターの送達における使用のための、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列の使用に関する。
(a)ターゲティング部分;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子
を含む構築物を提供する。
が、ウイルス配列を欠く構築物と比較して最高95倍の、ヒト化抗EGFR scFvおよびランピルナーゼを含む免疫RNaseの特異的細胞毒性の有意な向上につながり、一方でオフターゲット効果(非特異的細胞毒性)は回避されることを実証する。
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子、を含む構築物を提供する。
が用いられているものの、本発明の膜融合配列は、デングウイルス糖タンパク質E血清型2の糖タンパク質Eのアミノ酸98〜113のコア領域、すなわちアミノ酸配列
を少なくとも含む。なお、好ましくは、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する膜融合配列は、アミノ酸配列
を含む。
である領域にわたって、または少なくとも約16個のアミノ酸(すなわち、上述のデングウイルス糖タンパク質E血清型2の糖タンパク質Eのアミノ酸98〜113のコア領域、すなわちアミノ酸配列
である領域にわたって存在する。当業者であれば、当技術分野において公知であるように、例えば、CLUSTALWコンピュータープログラム(Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680)またはFASTDB(Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245)に基づくものなどのアルゴリズムを用いて、配列の間/中での同一性パーセントを判定する方法を知っているであろう。
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および/あるいは(c)「積み荷」、すなわち細胞の細胞質へ送達されるべき分子、のすべての組み合わせに関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv);
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としての、ラナ・ピピエンスに由来するRNase
を含む構築物に関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗EGFR scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としての、ラナ・ピピエンスに由来するRNase
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗EGFR scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としての、ラナ・ピピエンスに由来するRNaseであって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:4:
(式中、(*)はピログルタメートを表す;(SEQ ID NO:4))
を有するランピルナーゼ(オンコナーゼ(登録商標))である、RNase
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗EGFR scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)
またはそれぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:5〜20と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列からなる群より選択される1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;ならびに
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としての、ラナ・ピピエンスに由来するRNaseであって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:4:
(式中、(*)はピログルタメートを表す;(SEQ ID NO:4))
を有するランピルナーゼ(オンコナーゼ(登録商標))である、RNase
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv);
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としての、ラナ・ピピエンスに由来するRNase
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗CD22 scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としての、ラナ・ピピエンスに由来するRNase
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗CD22 scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としての、ラナ・ピピエンスに由来するRNaseであって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:4:
(式中、(*)はピログルタメートを表す;(SEQ ID NO:4))
を有するランピルナーゼ(オンコナーゼ(登録商標))である、RNase
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗CD22 scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)
またはそれぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:5〜20と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列からなる群より選択される1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;ならびに
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としての、ラナ・ピピエンスに由来するRNaseであって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:4:
(式中、(*)はピログルタメートを表す;(SEQ ID NO:4))
を有するランピルナーゼ(オンコナーゼ(登録商標))であるRNase
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv);
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)
を含む構築物に関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗EGFR scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗EGFR scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)であって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:22:
を有する、ヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗EGFR scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)
またはそれぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:5〜20と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列からなる群より選択される1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;ならびに
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)であって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:22:
を有する、ヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv);
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗CD22 scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗CD22 scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)であって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:22:
を有する、ヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗CD22 scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)
またはそれぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:5〜20と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列からなる群より選択される1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;ならびに
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)であって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:22:
を有する、ヒト膵臓RNase(RNase 1またはHP-RNase)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv);
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのアンギオゲニン(RNase 5)
を含む構築物に関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗EGFR scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのアンギオゲニン(RNase 5)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗EGFR scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのアンギオゲニン(RNase 5)であって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:23:
を有する、アンギオゲニン(RNase 5)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗EGFR scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)
またはそれぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:5〜20と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列からなる群より選択される1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;ならびに
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのアンギオゲニン(RNase 5)であって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:23:
を有する、アンギオゲニン(RNase 5)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv);
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのアンギオゲニン(RNase 5)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗CD22 scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのアンギオゲニン(RNase 5)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗CD22 scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)配列
またはSEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;および
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのアンギオゲニン(RNase 5)であって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:23:
を有する、アンギオゲニン(RNase 5)
を含む構築物にも関する。
(a)ターゲティング部分としてのヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)であって、該ヒト化抗CD22 scFv抗体は、以下のアミノ酸配列:
を有する、ヒト化抗CD22抗体一本鎖Fvフラグメント;
(b)
またはそれぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:5〜20と比較して1〜8個の置換、欠失、もしくは挿入を示す配列からなる群より選択される1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分;ならびに
(c)細胞の細胞質へ送達されるべき分子としてのアンギオゲニン(RNase 5)であって、以下のアミノ酸配列SEQ ID NO:23:
を有する、アンギオゲニン(RNase 5)
を含む構築物にも関する。
1.ランピルナーゼ-GS-scFvおよびランピルナーゼ-DEN-scFv融合タンパク質のクローニング
C末の(G4S)3リンカーに対する付加遺伝子セグメントおよび隣接する制限部位を有するランピルナーゼの遺伝子(UniProtKB/Swiss-Prot:P22069.2)を、哺乳類細胞における最適化された発現のために合成し(Entelechon, Bad Abbach, Germany)、かつサブクローニングベクターpMJA-1B内にApaLI/PvuIIフラグメントとしてクローニングした(Krauss et al., 2005a)。免疫RNaseのランピルナーゼ-GS-scFv遺伝子の生成のために、抗体C225(Goldstein et al., 1995)から生成されたヒト化抗上皮成長因子受容体(EGFR)scFv IZI08(Seifert et al., 2012)のDNA配列を、VHドメインDNA配列の5'末端にPvuII制限部位を導入するESR-1s
順方向プライマー、およびVLドメインDNA配列の3'末端にBamHI制限部位を付け加えるESR-2as
逆方向プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。ランピルナーゼ遺伝子を含有するサブクローニングベクター内へのIZI08遺伝子の挿入前に、付加的な内部PvuIIおよびBamHI部位を分断するためのサイレント変異を導入した。その後、c-mycタグおよび6ヒスチジンタグをコードするDNA配列を含有するサブクローニングベクターpMJA-1B内に、抗EGFR scFv IZI08遺伝子をランピルナーゼ遺伝子の下流にPvuII/BamHIフラグメントとしてクローニングした。ランピルナーゼ-DEN-scFvカセットサブクローニングベクターpDEN14をもたらすオーバーラップ伸長PCRによって、RNaseと抗体部分との間の標準的(G4S)3リンカー配列に対するDNA配列を、デングウイルス血清型2の糖タンパク質Eのアミノ酸96〜114をコードするDNA配列によって交換した。ランピルナーゼ-GS-scFvおよびランピルナーゼ-DEN-scFv融合タンパク質コード遺伝子をEcoRIで消化し、かつ哺乳類細胞用発現ベクターpEE12.4(Lonza Biologics, Slough, UK)内にクローニングした。DNAインサートの正しい配向を、BamHIを用いた制限消化によって確認した。
細胞株A431(ヒト類表皮癌腫)、MCF7(ヒト乳腺癌)、およびRaji(ヒトバーキットリンパ腫)をATCC(Manassas, VA, USA)から購入した。ヒト頭頸部扁平上皮細胞癌腫(HNSCC)細胞株HNO97(口腔(oral cavitiy))、HNO211(中咽頭)、およびHNO410 (下咽頭リンパ節転移)を、インフォームドコンセントおよびハイデルベルク大学医学部の倫理委員会による承認の後、HNSCC患者の外科的標本から確立した。A431、MCF7、およびHNSCC細胞株を、10%ウシ胎仔血清(Sigma-Aldrich)、100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン(Sigma-Aldrich)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)中、37℃で、5% CO2を有する加湿インキュベーターにて培養した。Raji細胞を、10%ウシ胎仔血清、100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI1640培地(Sigma-Aldrich)中、同一の条件下で培養した。HEK293-6E細胞(米国学術研究会議(National Research Council, Biotechnological Research Institute, Montreal, Canada)から認可を受けた)を、0.1% Kolliphor P188(Sigma-Aldrich)、4mMグルタミン(Invitrogen)、および25μg/ml G418(Carl Roth, Karlsruhe, Germany)を補充したF17培地(Invitrogen, Life Technologies, Darmstadt, Germany)中、37℃、5% CO2、および120rpmでの振とうインキュベーターにて培養した。
ベクターpAB1(Muller et al., 2007)を用いた、大腸菌TG1細胞(Stratagene, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)のペリプラズムへの抗EGFR scFvの可溶性発現を、以前に記載されているように実施した(Diebolder et al., 2014)。固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によるさらなる精製のために、scFv含有ペリプラズム抽出物をSP10バッファー(20mM NaH2P04、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0)に対して4℃で十分に透析した。RNase融合タンパク質を、振とうフラスコ(Falcon, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)にて、浮遊増殖するHEK293-6E細胞内で一過性に発現させた。1.7〜2×106細胞/mlの細胞密度において、1mlの最終培養容量あたり1μgのendofreeプラスミドDNAおよび2μgのポリエチレンイミン(Polysciences, Warrington, PA, USA)を、G418不含のF17培地中にて最終培養容量の1/20で別個に調製し、混合し、室温で3分間インキュベートし、かつHEK293-6E細胞に添加した。トランスフェクションの1日後、細胞に0.5%(w/v)トリプトンTN1(Organotechnie S.A.S, La Courneuve, France)を補充した。トランスフェクションの5日後、タンパク質含有上清を収集し、かつSARTOFLOW(登録商標)Slice 200卓上クロスフローシステム(Sartorius, Goettingen, Germany)を用いて、ランピルナーゼ-GS-scFvに関してはSP20(20mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mMイミダゾール、pH8.0)に対して、またはランピルナーゼ-DEN-scFvに関してはTris-HClバッファー(25mM Tris、500mM NaCl、pH8.2)に対してそれぞれ透析した。IMACによる組換えタンパク質の精製を、対応するバッファーで平衡化されたNi-NTAカラム(GE Healthcare, Muenchen, Germany)を用いて行った。バッファーによる大量の洗浄後、結合しているタンパク質を、多段階勾配のイミダゾール含有バッファーで溶出した。組換えタンパク質を含有する画分(SDS-PAGEおよびSimply Blue Safe Stain(Invitrogen)およびウェスタンブロットによって判定された)をプールし、かつPBSに対して4℃で一晩透析した。より高い分子量種からの単量体scFvフラグメントおよび免疫RNaseの最終的な精製および分離を、HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade column(GE Healthcare)を用い、PBSバッファー中でサイズ排除クロマトグラフィーによって行った。
ランピルナーゼおよび免疫RNaseのリボ核酸分解活性を、蛍光発生基質6-カルボキシフルオレセイン-dArUdGdA-ブラックホールクエンチャー-1(6-FAM-dArUdGdA-BHQ-1)(biomers.net, Ulm, Germany)の切断を経時的にモニターすることによって測定した。蛍光強度を、485/535nm(励起/発光)フィルターセットを有するInfinite F200Proマイクロプレートリーダー(Tecan, Maennedorf, Switzerland)を用いて、96ウェル黒色マイクロタイタープレートで測定した。1ウェルあたり200μlの総反応容量で、100mM NaClおよび6-FAM-dArUdGdA-BHQ-1(5nM)を含有する100mM MES-NaOHバッファー(pH6.0)中にて25℃で反応を行った。RNase不含のバッファーが陰性対照としての役割を果たし、かつ過剰な濃度のRNase Aを陽性対照として用いた。それぞれが三つ組を含有する少なくとも3回の独立したアッセイを実施した。
平衡結合曲線の判定のために、A431細胞を、連続希釈の精製抗EGFR scFv、ランピルナーゼ-GS-scFv、またはランピルナーゼ-DEN-scFvのいずれかと三つ組でインキュベートした。結合している抗体または免疫RNaseの検出を、マウス(murine)抗c-mycモノクローナル抗体クローン9E10(Roche, Penzberg, Germany)およびヤギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲート(Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK)を用いて実施した。染色された細胞の蛍光を、FACS Divaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いたFACS Canto IIフローサイトメーター(Becton Dickinson)で測定した。測定された蛍光中央値からバックグラウンド蛍光を差し引き、かつ相対的アフィニティーを、GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)を用いて非線形回帰によって算出した。
組換えタンパク質の抗腫瘍効力を査定するために、細胞を96ウェル平底プレート(Falcon)に播種し、かつ種々の濃度のタンパク質または対照としてのバッファーとともに、110μlの総容量で37℃、5% CO2にて72時間インキュベートした。接着細胞株(A431、HNO97、HNO211、HNO410、MCF7)に関しては、PBS中に希釈された5mg/ml溶液の3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)の20μlの添加によって細胞生存率を判定した。MTTとともに37℃、5% CO2で4時間のインキュベーション後、培地を除去し、かつ細胞を1ウェルあたり100μlの溶解液(ジメチルスルホキシド中、10% SDS(w/v)および0.6%酢酸(v/v))中に溶解した。プレートを室温で5分間インキュベートし、その後に、放出されたホルマザン結晶を溶かす5分間の穏やかな撹拌が続いた。ホルマザン濃度を、Infinite F200Proマイクロプレートリーダー(Tecan)を用いて570nm(参照:620nm)における吸光度を測定することによって判定した。浮遊細胞株Rajiの生存率の判定に関しては、細胞を、後続の細胞溶解なしで、1ウェルあたり10μlのalamarBlue(登録商標)(ThermoScientific, Rockford, IL, USA)とともに37℃、5% CO2で4時間インキュベートした。吸光度を、MTT処理された細胞に対しするものと同じ波長および器具を用いて直接測定した。
EGFR発現癌細胞の標的殺傷のために、ランピルナーゼを、臨床的に確立されたmAbのセツキシマブ(アービタックス(登録商標))と同一の特異性を有するヒト化scFvフラグメントのN末に、柔軟性のある(G4S)3リンカーによって融合させた(ランピルナーゼ-GS-scFv)。あるいは、ランピルナーゼを、ウイルスのエンドソーム脱出メカニズムに関与することが報告された、デングウイルス血清型2の推定ウイルス融合ペプチドを含むウイルス配列から構成されるリンカーによって該scFvフラグメントに融合させ(Melo et al., 2009;Zaitseva et al., 2010)、免疫RNaseのランピルナーゼ-DEN-scFvをもたらした。検討されたタンパク質の概要が、図1に示されている。
scFvフラグメントを大腸菌で発現させ、かつペリプラズム空間から単離し、一方で免疫RNaseのランピルナーゼ-GS-scFvおよびランピルナーゼ-DEN-scFvをHEK293-6E細胞で産生し、かつIgVHリーダーペプチドの採用によって細胞培養上清に分泌させた(Krauss et al., 2005a)。タンパク質をNi-NTAカラムによって精製し、その後サイズ排除クロマトグラフィーを行い、>95%の純度を有する均一なタンパク質調製物が産出された。完全な精製後の産物収量は、それぞれ、scFVに関して1.9mg/l、ランピルナーゼ-GS-scFvに関して0.9mg/l、およびランピルナーゼ-DEN-scFvに関して3.2mg/lであった。
scFV、ランピルナーゼ-GS-scFv、およびランピルナーゼ-DEN-scFvの細胞結合および見かけの平衡解離定数(KD)を、EGFR発現A431細胞に対するフローサイトメトリーによって判定した。表1に示されるように、両方の免疫RNaseは、scFv単独と同程度の高いアフィニティーで標的抗原に結合した。
*6-FAM-dArUdGdA-BHQ-1の切断に対するkcat/KM(±SE)の値は、材料および方法に記載されるように判定された。
EGFR発現癌細胞に対する特異的毒性を評価するために、scFvフラグメント、ランピルナーゼ-GS-scFv、ランピルナーゼ-DEN-scFv、およびランピルナーゼを、EGFRを過剰発現している類表皮癌腫癌細胞A431、ならびに頭頸部癌患者の切除した腫瘍に由来するいくつかのEGFR陽性初代細胞株(HNO97、HNO211、HNO410)とともにインキュベートした。EGFR陰性の乳癌細胞株MCF7およびバーキットリンパ腫細胞株Rajiが、陰性対照としての役割を果たした。図2および表3に示されるように、抗EGFR scFvフラグメント単独では、細胞生存率にほどんど影響を有しなかった。
Claims (21)
- ターゲティング部分が、抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、またはリガンドである、請求項1記載の構築物。
- ターゲティング部分が、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fv抗体フラグメント、scFv、Fab、VH、scFv-Fc、sdFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、タンデム-scFv、タンデム-scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、Fab-scFv、Fab3、IgG-scFv、scFv-IgG、IgG-VH、または単一ドメイン抗体、好ましくはsdAb、ラクダ科由来のVHHフラグメント、または軟骨魚類由来のVNARフラグメントである、請求項1または2記載の構築物。
- ターゲティング部分が、癌に特異的な抗原、感染性疾患に特異的な抗原、または自己免疫疾患に特異的な抗原を標的にする、請求項1〜3のいずれか一項記載の構築物。
- ターゲティング部分がヒト化抗EGFR抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)である、請求項1〜4のいずれか一項記載の構築物。
- 細胞質へ送達されるべき分子が、治療用部分、検出可能な部分、核酸分子、好ましくはsiRNA、キャリア分子、好ましくはナノ粒子、リポソーム、およびウイルスベクターからなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の構築物。
- 治療用部分が、細胞毒性部分、抗体、抗体フラグメント、薬物、化学療法剤、小分子、酵素、ホルモン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、RNAi、放射性核種、ホウ素化合物、光活性剤、抗血管新生剤、およびアポトーシス促進剤からなる群より選択される、請求項6記載の構築物。
- 細胞毒性部分が、RNase Aファミリーメンバー、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、DNase I、ブドウ球菌(Staphylococcal)エンテロトキシン-A、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群より選択される、請求項7記載の構築物。
- RNase Aファミリーメンバーが、ラナ・ピピエンス(Rana pipiens)に由来するRNaseである、請求項8記載の構築物。
- ターゲティング部分、1つまたは複数の膜融合配列からなる膜融合部分、および細胞の細胞質へ送達されるべき分子が、共有結合で化学的に結合されている、請求項1〜10のいずれか一項記載の構築物。
- 融合タンパク質である、請求項1〜10のいずれか一項記載の構築物。
- 請求項12記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
- 請求項13記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項14記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1〜12のいずれか一項記載の構築物、請求項13記載の核酸分子、請求項14記載のベクター、または請求項15記載の宿主細胞、および任意で、薬学的に許容されるキャリアを含む、薬学的組成物。
- 癌、心血管疾患、ウイルス感染症、免疫機能不全、自己免疫疾患、神経学的障害、遺伝性代謝障害、または遺伝子障害の治療における使用のための、請求項16記載の薬学的組成物。
- 請求項1もしくは請求項10において特徴付けされる膜融合部分、請求項1〜12のいずれか一項記載の融合タンパク質、請求項13記載の核酸分子、請求項14記載のベクター、または請求項15記載の宿主細胞を含む、キット。
- 治療用部分、検出可能な部分、核酸分子、好ましくはsiRNA、キャリア分子、好ましくはナノ粒子、リポソーム、およびウイルスベクターの、細胞の細胞質への送達における使用のための、請求項1または請求項10において特徴付けされる膜融合部分の使用。
- 膜融合部分が、
SEQ ID NO:1に示される配列を含む、デングウイルス糖タンパク質Eに由来する1つまたは複数の膜融合配列
からなる、請求項19記載の使用。 - 1つまたは複数の膜融合配列が、SEQ ID NO:1と比較して1〜8個の置換、欠失、または挿入を示す配列である、請求項20記載の使用。
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