JP2017526629A - 血液系悪性腫瘍を治療、診断および予後判定するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、血液系悪性腫瘍の予防および／または治療で使用するための、１型５−ＨＴＲ阻害剤および２型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択されるセロトニン受容体（５−ＨＴＲ）阻害剤に関する。さらに、本発明は、血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞を同定もしくは単離するための、または、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現の検出に基づいて血液系悪性腫瘍を診断するための、インビトロ法に関する。さらに、本発明は、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲのレベルの決定に基づく、予後を判定するための、治療法の効果をモニターするための、または、血液系悪性腫瘍を患う対象におけるカスタマイズされた治療法を設計するための、インビトロ法に関する。【選択図】 なし

Description

本発明は、治療法、診断法および予後判定法の分野に関する。

血液系または造血系の悪性腫瘍は、白血病およびリンパ腫を含む、血液または骨髄のがんである。白血病は、血液細胞の制御されない蓄積を特徴とし、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の４つの種類に分類される。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、非リンパ系、骨髄芽球性、顆粒球性または骨髄球性の白血病とも称され、顆粒球および単球を含む様々な白血球に影響を与える。急性白血病は、髄および血液内での未成熟で機能のない細胞の蓄積をもたらす、急速に進行する疾患であり；しばしば、髄が正常な赤血球、白血球および血小板を十分に産生することを停止し、白血病細胞が肝臓、脾臓、リンパ節、中枢神経系、腎臓および生殖腺に広がる。結果的に、ＡＭＬ患者は、例えば、貧血症、疲労、インフルエンザ様症状、骨痛、食欲不振、体重減少、紫斑の易形成（bruising easily）、出血、および易感染性等の、ＡＭＬの一つまたは複数の症状を発症し得る。

世界中で２５万人を超える成人が、毎年、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診断されている。過去３０年間のＡＭＬ治療法におけるかなりの進歩にもかかわらず、未だ、若年成人の２／３および高齢者の９０％がこれらの疾患によって死亡している。

血液系悪性腫瘍を有する患者、特に、ＡＭＬを患う患者から得られた経験は、診断ツールとして、および、患者の予後判定に、全身の血漿／血清サイトカインプロファイルが有用であり得ることを示唆している。しかし、サイトカイン／ケモカインは、広範な細胞によって放出され、広範な生物学的プロセスに関与しており；そのため、レベルの変化が生物学的プロセスの強弱および性質を主に反映し得ることから、ケモカイン／サイトカイン解析の最適な臨床使用は、臓器特異的な生物マーカーとの併用を必要とし得る。また、ケモカインレベルは臨床的処置、治療介入および患者の全身状態によっても変化する（Reikvam H. et al., Toxins (Basel). Feb 2013; 5(2): 336-362）。従って、血液系悪性腫瘍の最適な評価および管理を確立するために、新規の診断法および予後判定法が必要となる。

現在のＡＭＬ治療には、化学療法、放射線療法、免疫療法、輸血、および骨髄移植が含まれ得る。初期の治療の主力であった、シトシンアラビノシド（ａｒａ−Ｃ）およびアントラサイクリンの併用は、４０年近く前に開発されたものであり、世界的な標準治療のままである。あるいは、例えば、シタラビン、ダウノルビシン、イダルビシン、チオグアニン、ミトキサントロン、エトポシド、およびメトトレキサート等の、３〜８つの薬物の組合せがある。現在の化学療法は完全寛解をもたらし得る一方、白血病、特にＡＭＬの長期無病生存率は低い。

代替治療へのアプローチは、毒性が低くより効果的な治療の開発に向けられている。種々の新規化学療法剤、例えば、トポテカンおよびカンポテシン等のトポイソメラーゼＩ阻害剤、白金含有薬剤（カルボプラチン）、並びに、ゲムシタビン、トロキサシタビン（troxcitabine）およびクロファラビンを含む新規代謝拮抗剤が、ＡＭＬにおいて評価された（Smith M, et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2004; 50(3): 197-222）。これらの薬剤は全て、白血病性芽球（leukaemic blast）に対する活性を有しているが、それらの使用は依然研究中である。シクロスポリンＡまたはＰＳＣ８３３を用いたＭＤＲ−１遮断は、有益とは証明されておらず、毒性を増加させ得るか、または、用量減少を必要として全体的な化学療法への暴露を減少させ得る（Larson RA. et al, Leukemia 2003; 17: 488-91）。

また、化学療法は通常、正常細胞も殺傷してしまうことから、化学療法を受けている患者はしばしば、例えば、悪心、疲労、およびより高い感染リスク等の副作用を被る。

これらのことから、毒性が低減された、血液系悪性腫瘍（例えば、白血病）を治療するための効果的な治療法への需要が、明確に、そして未だ対処されずに、存在している。

第一の態様において、本発明は、血液系悪性腫瘍の予防および／または治療で使用するための、１型５−ＨＴＲ阻害剤および２型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択されるセロトニン受容体（５−ＨＴＲ）阻害剤に関する。

第二の態様において、本発明は、骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される試料中の血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞を同定するためのインビトロ法に関し、前記方法は、前記細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現を検出することを含む。

第三の態様において、本発明は、本発明の方法によって悪性細胞を同定することを含む、対象における血液系悪性腫瘍を診断するためのインビトロ法に関する。

第四の態様において、本発明は、骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される試料中の血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞を単離するためのインビトロ法に関し、前記方法は、前記細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現を検出し、前記５−ＨＴＲを発現する前記細胞を単離することを含む。

第五の態様において、本発明は、血液系悪性腫瘍を患う対象の予後を判定するためのインビトロ法に関し、前記方法は、
（ａ） 骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定し、
（ｂ） 前記レベルを基準値と比較すること、を含み、
前記方法では、基準値に対する１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲの発現レベルの減少は、対象が良好な予後を示すことを示し、または、基準値に対する１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲの発現レベルの増加は、対象が予後不良を示すことを示す。

第六の態様において、本発明は、血液系悪性腫瘍を患い、治療法による処置を受けている対象における、前記治療法の効果をモニターするためのインビトロ法に関し、前記方法は、
ａ） 骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定し、
ｂ） 前記レベルを、より早い時点の前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルと比較すること、を含み、
前記方法では、より早い時点での前記対象由来の試料において決定されたレベルに対する、１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲの発現レベルの減少は、治療法が効果的であることを示し、または、より早い時点での前記対象由来の試料において決定されたレベルに対する、１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲの発現レベルの増加は、治療法が効果的でないことを示す。

第七の態様において、本発明は、血液系悪性腫瘍があると診断された対象のためのカスタマイズされた治療法を設計するためのインビトロ法に関し、前記方法は、
ａ） 骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定し、
ｂ） 前記レベルを基準値と比較すること、を含み、
前記方法では、基準値に対する１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現細胞のレベルの増加は、対象が１型５−ＨＴＲ阻害剤および／または２型５−ＨＴＲ阻害剤で治療されるべきであることを示す。

アポモルヒネ処理はＡＭＬ細胞生存率を減少させた。完全ＲＰＭＩ培地中１０^６／ｍｌのＨＬ−６０細胞、ＫＧ−１細胞、ＭｏｎｏＭａｃ−１細胞およびＫａｓｕｍｉ−１細胞を、０．１、１および１０μＭのアポモルヒネで７２時間処理した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞を７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、ＣＡＳ登録番号７２４０−３７−１）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＣＡＳ登録番号２３４９１−５２−３）で染色し、フローサイトメトリーで解析した。死細胞を７−ＡＡＤ陽性染色で除外しながら、有核細胞（nuclear cell）をＨｏｅｃｈｓｔ陽性染色で特定した。細胞数を体積計数（volumetric count）により算出した。Ａ． 各々のＡＭＬ細胞株の平均値（シンボル）および６つの異なる生物学的反復から得られた標準偏差（エラーバー）が示される。Ｂ． ４つの異なるＡＭＬ細胞株に対応する平均値が示される。^＊ｐ＜０．０５。 １型および２型５ＨＴＲ拮抗薬はＡＭＬ細胞株に対し細胞死を誘導した。１０^６／ｍｌのＨＬ−６０、ＫＧ−１、ＭｏｎｏＭａｃ−１およびＫａｓｕｍｉ−１ ＡＭＬ細胞株を、０．１、１および１０μＭのアポモルヒネ、メチオテピン、アムペロジドまたはＧＲ１１３８０８と一緒に、３７℃、５％ＣＯ_２で、７２時間インキュベートした。死細胞を７−ＡＡＤ陽性染色で除外しながら、有核細胞をＨｏｅｃｈｓｔ陽性染色で特定した。細胞数を体積計数により算出した。Ａ． 各々のＡＭＬ細胞株の平均値（シンボル）および６つの異なる生物学的反復から得られた標準偏差（エラーバー）が示される。Ｂ． ＡＭＬ細胞株を、５−ＣＴまたは５−ＨＴの存在下または非存在下で、１０μＭのアポモルヒネまたはメチオテピンで処理した。^＊ｐ＜０．０５。Ａｐｏ：アポモルヒネ；Ｍｅｔｈｉｏ：メチオテピン。 同上。 ５ＨＴＲ拮抗薬は２４時間における初代患者ＡＭＬ試料の細胞生存率を減少させた。５×１０^６／ｍｌの初代ＡＭＬ細胞を、完全ＩＭＤＭ培地中で０．１、１および１０μＭのアポモルヒネまたはメチオテピンで３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間処理した。ＡＭＬ混合集団（bulk population）を、それらのＣＤ４５発現および細胞数測定によるＳＳＣプロファイルに基づいて特定した。ＡＭＬ混合集団内の未分化ＡＭＬ集団を、それらのＣＤ３４に対する陽性度（positivity）およびＣＤ３８に対する陰性度（negativity）に基づいて、特定した。死細胞を７−ＡＡＤ陽性染色で除外しながら、有核細胞をＨｏｅｃｈｓｔ陽性染色で特定した。細胞数を体積計数により算出した。１１個の初代ＡＭＬ試料を３連で分析した。各々のシンボルは特定のＡＭＬ患者を表す。バーは各々の反復実験の細胞生存率の平均値を表す。^＊ｐ＜０．０５ ５ＨＴＲ拮抗薬は７２時間における初代患者ＡＭＬ試料の細胞生存率を減少させた。５×１０^６／ｍｌの初代ＡＭＬ細胞を、完全ＩＭＤＭ培地中で０．１、１および１０μＭのアポモルヒネまたはメチオテピンで３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間処理した。ＡＭＬ混合集団を、それらのＣＤ４５発現および細胞数測定によるＳＳＣプロファイルに基づいて特定した。ＡＭＬ混合集団内の未分化ＡＭＬ集団を、それらのＣＤ３４に対する陽性度およびＣＤ３８に対する陰性度に基づいて、特定した。死細胞を７−ＡＡＤ陽性染色で除外しながら、有核細胞をＨｏｅｃｈｓｔ陽性染色で特定した。細胞数を体積計数により算出した。１１個の初代ＡＭＬ試料を３連で分析した。各々のシンボルは特定のＡＭＬ患者を表す。バーは各々の反復実験の細胞生存率の平均値を表す。^＊ｐ＜０．０５。 ５ＨＴＲ拮抗薬はＡＭＬ細胞株に対し骨髄分化を誘導した。１０^６／ｍｌのＨＬ−６０、ＫＧ−１、ＭｏｎｏＭａｃ−１およびＫａｓｕｍｉ−１ ＡＭＬ細胞を、完全ＲＰＭＩ培地中で０．１、１および１０μＭのアポモルヒネおよぼメチオテピンで３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間処理した。ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４の細胞表面発現をフローサイトメトリーで検出した。死細胞を７−ＡＡＤ−陽性染色で除外した。^＊ｐ＜０．０５。ＭＦＩ：平均蛍光強度。 ５ＨＴＲ拮抗薬であるアポモルヒネは初代患者ＡＭＬ試料に対し骨髄分化を誘導した。５×１０^６／ｍｌの初代ＡＭＬ細胞を、完全ＩＭＤＭ培地中で０．１、１および１０μＭのアポモルヒネで３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間処理した。ＡＭＬ混合集団を、それらのＣＤ４５発現および細胞数測定によるＳＳＣプロファイルに基づいて特定した。ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４およびＣＤ１５の細胞表面発現をフローサイトメトリーで検出した。死細胞を７−ＡＡＤ−陽性染色で除外した。９個の初代ＡＭＬ試料を３連で分析した。各々のシンボルは特定のＡＭＬ患者を表す。バーは各々の反復実験の細胞生存率の平均値を表す。^＊ｐ＜０．０５。 ５ＨＴＲ拮抗薬であるメチオテピンは初代患者ＡＭＬ試料に対し骨髄分化を誘導した。５×１０６／ｍｌの初代ＡＭＬ細胞を、完全ＩＭＤＭ培地中で０．１、１および１０μＭのメチオテピンで３７℃、５％ＣＯ２で７２時間処理した。ＡＭＬ混合集団を、それらのＣＤ４５発現および細胞数測定によるＳＳＣプロファイルに基づいて特定した。ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４およびＣＤ１５の細胞表面発現をフローサイトメトリーで検出した。死細胞を７−ＡＡＤ−陽性染色で除外した。９個の初代ＡＭＬ試料を３連で分析した。各々のシンボルは特定のＡＭＬ患者を表す。線は各々の反復実験の細胞生存率平均値を表す。^＊ｐ＜０．０５。 健常な血液細胞生存率は５ＨＴＲ拮抗薬による処理後も未影響のままである。健常ドナーから得られた末梢血試料由来の５×１０^６個のフィコール単離された単核細胞を、完全ＲＰＭＩ培地中で０．１、１および１０μＭ／６ｍＬのアポモルヒネまたはメチオテピンで３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間（Ａ）または７２時間（Ｂ）処理した。血液細胞を、それらのＣＤ４５発現および細胞数測定によるＳＳＣプロファイルに基づいて特定した。死細胞を７−ＡＡＤ陽性染色で除外しながら、有核細胞をＨｏｅｃｈｓｔ陽性染色で特定した。細胞数を体積計数により算出した。４つの初代ドナー試料を３連で分析した。バーは各々の反復実験の細胞生存率平均値を表し、エラーバーは標準偏差を示す。^＊ｐ＜０．０５。 ５ＨＴＲ拮抗薬処理は健常な造血幹／前駆細胞に影響を与えなかった。健常ドナーから得られた臍帯血試料由来の２×１０^５個の系統枯渇（lineage-depleted）フィコール単離単核細胞を、完全ＩＭＤＭ培地中で１０μＭのアポモルヒネで３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間処理した。血液細胞を、それらのＣＤ４５発現および細胞数測定によるＳＳＣプロファイルに基づいて特定した。ＣＤ３４およびＣＤ３８表面染色を行い、各々の亜集団を特定した。死細胞を７−ＡＡＤ陽性染色で除外しながら、有核細胞をＨｏｅｃｈｓｔ陽性染色で特定した。細胞数を体積計数により算出した。３つの初代臍帯血試料を３連で分析した。バーは各々の反復実験の細胞生存率平均値を表し、エラーバーは標準偏差を示す。 初代ＡＭＬ試料のクローン原性は５ＨＴＲ拮抗薬処理後に低減される。５×１０^５／ｍｌの初代患者ＡＭＬ血液細胞を、完全ＩＭＤＭ培地中で１０μＭのアポモルヒネまたはメチオテピンで３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間処理した。次に細胞を、造血サイトカインを添加したメチルセルロース中で１４日間培養した。得られたＣＦＵ−Ｂの数を形態学的基準に基づいて、顕微鏡法で測定した。７つの初代ＡＭＬ血液試料を分析した。各々のシンボルは特定の患者試料を表す。線は中央値を表す。^＊ｐ＜０．０５。ＣＦＵ−Ｂ：芽球コロニー形成単位。 ５ＨＴＲ拮抗薬処理は健常な造血幹細胞のクローン原性を低減させなかった。１×１０^３／ｍｌの初代系統枯渇 臍帯血細胞を、完全ＩＭＤＭ培地中で１０μＭのアポモルヒネまたはメチオテピンで３７℃、５％ＣＯ２で１８時間処理した。次に細胞を、造血サイトカインを添加したメチルセルロース中で１４日間培養した。得られたコロニーの数を形態学的基準に基づいて、顕微鏡法で測定した。Ａ． コロニーの総数を表す。ＣＦＵ：コロニー形成単位。Ｂ． 各々のコロニー亜型の頻度が示される（ＣＦＵ−Ｍｉｘ、混合系統（Mix lineaged）コロニー；ＣＦＵ−ＧＭ、顆粒単球（granulo-monocyte）コロニー；ＣＦＵ−Ｇ、顆粒球コロニー；ＣＦＵ−Ｍ、単球コロニー；ＢＦＵ−Ｅ 赤血球芽球（erythrocyte blast）コロニー）。４つの初代臍帯血試料を分析した。バーは各々の反復実験の細胞生存率平均値を表し、エラーバーは標準偏差を示す。^＊ｐ＜０．０５。 ＡＭＬ試料は５ＨＴＲを示差的に発現する。初代ＡＭＬ血液試料、健常な末梢血試料およびＡＭＬ細胞株（ＨＬ−６０、ＫＧ−１、ＭｏｎｏＭａｃ−１およびＫａｓｕｍｉ−１）を、５ＨＴＲ１ＡおよびＨＴＲ１Ｂについて表面染色した。試料をフローサイトメトリーで分析した。陽性細胞の頻度が示される。１８個の初代患者ＡＭＬ末梢血試料および１６個の健常ドナー末梢血試料が示される。丸：ＡＭＬ細胞株、四角：ＡＭＬ、菱形：健常な成熟血液細胞 ^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１。 ５ＨＴＲのｍＲＮＡレベルはＡＭＬ臨床成績と相関する。初代患者ＡＭＬ血液試料由来の全ＲＮＡを単離し、５ＨＴＲ１Ａ（Ａ）および５ＨＴＲ１Ｂ（Ｂ）のｍＲＮＡレベルを半定量的ＰＣＲで測定した。発現レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化し、２^−ΔＣｔ法に従って算出した。良好予後群に対応する６つのＡＭＬ試料および不良予後群に対応する８つのＡＭＬ試料が３連で示される。^＊ｐ＜０．０５。 ５ＨＴＲ拮抗薬による処理は二次ＣＦＵの減少をもたらす。１０μＭアポモルヒネ、１０μＭメチオテピンまたはビヒクル対照で事前処理された初代ＣＦＵ由来の１０^６／ｍｌの初代ＡＭＬ患者細胞を、造血サイトカインを添加したメチルセルロース中に１４日間再播種した。得られたＣＦＵ−Ｂの数を形態学的基準に基づいて、顕微鏡法で測定した。３つの初代ＡＭＬ試料を試験した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００５、^＊＊＊＊ｐ＜０．００１。 ５ＨＴＲ１拮抗薬による処置はインビボ異種移植マウスモデルにおけるＡＭＬ負荷を低減する。６〜８週齢ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを、０日目にブスルファン（３０ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）で骨髄破壊した（myeloablate）。１日目に、１０^６個のＭｏｎｏＭａｃ−１細胞を静脈内注射した。７日目から１４日目まで、マウスを一日おきにアポモルヒネ（５ｍｇ／ｋｇ）またはメチオテピン（０．１ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内処置し、一方、対照マウスは食塩水ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）で処置した。１５日目に、マウスを屠殺し、それらの骨（腸骨稜、大腿骨および脛骨）を回収し、ヒト細胞の存在について分析した。骨髄試料をフローサイトメトリーで測定した。ＢＭにおける、ヒトＣＤ４５陽性細胞の頻度（上段パネル）およびヒトＣＤ４５陽性細胞の総数（下段パネル）は、対照を参照している。バーは平均値を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。 ５ＨＴＲ拮抗薬処理は、健常な造血幹／前駆細胞細胞に影響を与えずに、初代ＡＭＬ細胞の白血病再生能（leukemia regeneration capacity）を低減させる。１〜１０×１０^６個の初代ＡＭＬ患者細胞または１０〜１４×１０^４個の系統枯渇ＣＢ細胞を、５％熱非働化ウシ胎児血清および造血サイトカインを添加したＩＭＤＭ中で１８時間、エキソビボ処理（１０μＭアポモルヒネ、１０μＭメチオテピンまたはビヒクル対照）した。細胞を、事前ブスルファン（３０ｍｇ／ｋｇ）−条件付けＮＳＧマウスに静脈内注射し、８週間非処置のままにした。マウスを屠殺し、それらの骨（腸骨稜、大腿骨および脛骨）を回収し、フローサイトメトリーでヒト白血病細胞（上段パネル）または健常な血液細胞（下段パネル）の存在について分析した。４つのＡＭＬ患者試料および３つの臍帯血（ＵＣＢ）試料を試験した。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１。 ５ＨＴＲ拮抗薬による処置は、正常な造血に影響を与えずに、二次レシピエントにおける初代ＡＭＬ試料の白血病再生能を低減させる。上段パネル：一次移植マウス由来の３〜１０×１０^５個の移植骨髄性細胞を、二次レシピエント（条件付けＮＳＧマウス）に静脈内注射し、８週間非処置のままにした。骨髄性細胞を図１６のように分析した。対照を参照したヒトＣＤ４５陽性細胞の頻度が示される。下段パネル：５０×１０^３個の移植ヒト細胞をＣＦＵについてスクリーニングした。正規化した、得られたＣＦＵ数が示される。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００５；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

本発明の発明者は、血液悪性細胞、特にＡＭＬ細胞、がセロトニン受容体（５ＨＴＲ）を発現すること、並びに、１型および／または２型５ＨＴＲの阻害が、実施例１および２に示されるように、ＡＭＬ細胞に対する細胞毒性効果を有し、健常な造血幹細胞には影響を与えずに、ＡＭＬ芽球のクローン原性を低減させること（実施例５）、並びに、１型および／または２型５−ＨＴＲ阻害剤が健常な血液細胞にも健常な造血幹／前駆細胞にも影響を与えないこと（実施例４）、を発見した。さらに、本発明者らによって、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現の検出が血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞の特定に使用できること（実施例６）、並びに、血液系悪性腫瘍を患う患者由来の試料における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現の減少が良好な予後と相関すること（実施例７）、が観察された。

定義
「セロトニン受容体」は、５−ヒドロキシトリプタミン受容体または５−ＨＴ受容体または５−ＨＴＲとしても知られており、本明細書で使用される場合、中枢および末梢神経系に存在する、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）およびリガンド開口型イオンチャネル（ＬＧＩＣ）の１群である。

用語「１型５−ＨＴ受容体」または「１型５−ＨＴＲ」または「５−ＨＴ１受容体」または「５−ＨＴＲ１」は、本明細書で使用される場合、内在性神経伝達物質セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）と結合する５−ＨＴ受容体のサブファミリーに関する。５−ＨＴ１受容体サブファミリーは、Ｇｉ／Ｇｏと共役している５つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）から成り、前記用語には、５−ＨＴＲ１Ａ、５−ＨＴＲ１Ｂ、５−ＨＴＲ１Ｄ、５−ＨＴＲ１Ｅ、および５−ＨＴＲ１Ｆが包含される。これらの受容体は、ｃＡＭＰの細胞レベルを減少させることにより抑制性神経伝達を仲介する。ヒト１Ａ型５−ＨＴ受容体の完全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０８９０８（２０１４年４月１６日）を有する。ヒト１Ｂ型５−ＨＴ受容体の完全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２８２２２（２０１４年４月１６日）を有する。ヒト１Ｄ型５−ＨＴ受容体の完全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２８２２１（２０１４年４月１６日）を有する。ヒト１Ｅ型５−ＨＴ受容体の完全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２８５６６（２０１４年５月１４日）を有する。ヒト１Ｆ型５−ＨＴ受容体の完全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ３０９３９（２０１４年４月１６日）を有する。

用語「２型５−ＨＴ受容体」または「２型５−ＨＴＲ」または「５−ＨＴ２受容体」または「５−ＨＴＲ２」は、本明細書で使用される場合、内在性神経伝達物質セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）と結合する５−ＨＴ受容体のサブファミリーを指す。５−ＨＴ２受容体サブファミリーは、Ｇｑ／Ｇ１１と共役している３つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）から成り、前記用語には、５−ＨＴＲ２Ａ、５−ＨＴＲ２Ｂ、および５−ＨＴＲ２Ｃが包含される。これらの受容体は、ＩＰ３およびＤＡＧの細胞レベルを増加させることにより興奮性神経伝達を仲介する。ヒト２Ａ型５−ＨＴ受容体の完全タンパク質配列はＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２８２２３（２０１４年５月１４日）を有し、ヒト２Ｂ型５−ＨＴ受容体の完全タンパク質配列はＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ４１５９５（２０１４年５月１４日）を有し、ヒト２Ｃ型５−ＨＴ受容体の完全タンパク質配列はＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２８３３５（２０１４年５月１４日）を有する。

用語「阻害剤」は、本明細書で使用される場合、５−ＨＴ受容体の活性を阻害する化合物を指す。阻害剤という用語には、限定はされないが、５−ＨＴ受容体の拮抗薬、５−ＨＴ受容体に対する抗体、５−ＨＴ受容体の発現を妨げる化合物、および５−ＨＴ受容体のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベル減少をもたらす化合物が包含される。好ましい実施形態では、阻害剤は拮抗薬である。本発明との関連において、用語「拮抗薬」は、５−ＨＴ受容体に結合し、受容体それ自体を活性化するいかなる実質的能力も示さない、化合物を指す。それにより、拮抗薬は、作動薬が存在する場合の作動薬または天然リガンドによる受容体の機能的活性化または占有を防止または低減させ得る。用語「５−ＨＴ受容体の拮抗薬」は、本明細書で使用される場合、ニュートラルアンタゴニストおよびインバースアゴニストの両方を包含することが意図される。「ニュートラルアンタゴニスト」は、作動薬の作用を遮断するが、内因性または自発性の受容体活性には影響を与えない、化合物である。「インバースアゴニスト」は、受容体における作動薬の作用の遮断および受容体の恒常的活性の減弱の両方が可能である。用語「拮抗薬」には、天然リガンドと同じ部位に結合する薬剤である競合的拮抗薬；天然リガンドとは異なる受容体上の部位に結合する非競合的拮抗薬；受容体−リガンド速度論によって決定される速度で受容体と結合および解離する可逆的拮抗薬；並びに、活性部位への共有結合を形成することにより、または解離速度が事実上ゼロになるほどただ堅固に結合することにより、受容体に永続的に結合する非可逆的拮抗薬、も包含される。

用語「１型５−ＨＴＲ阻害剤」は、本明細書で使用される場合、５−ＨＴＲ１の活性を阻害することが可能なあらゆる化合物を指す（例えば、５−ＨＴＲ１に結合し、受容体それ自体を活性化するいかなる実質的な能力も有さないことにより；または、５−ＨＴＲ１ ｍＲＮＡもしくは５−ＨＴＲ１タンパク質の発現を防止もしくは減少させることにより）。この用語には、５−ＨＴＲ１に対する、または５−ＨＴＲ１サブタイプ（５−ＨＴＲ１Ａ、５−ＨＴＲ１Ｂ、５−ＨＴＲ１Ｄ、５−ＨＴＲ１Ｅ、および５−ＨＴＲ１Ｆ）のいずれかに対する選択的阻害剤、および、他のサブファミリー由来の５−ＨＴ受容体に対する阻害剤として作用することも可能な非選択的阻害剤、が包含される。

用語「２型５−ＨＴＲ阻害剤」は、本明細書で使用される場合、５−ＨＴＲ２の活性を阻害することが可能なあらゆる化合物を指す（例えば、５−ＨＴＲ２に結合し、受容体それ自体を活性化するいかなる実質的な能力も有さないことにより；または、５−ＨＴＲ２ ｍＲＮＡもしくは５−ＨＴＲ２タンパク質の発現を防止もしくは減少させることにより）。この用語には、５−ＨＴＲ２に対する、または５−ＨＴＲ２サブタイプ（５−ＨＴＲ２Ａ、５−ＨＴＲ２Ｂおよび５−ＨＴＲ２Ｃ）のいずれかに対する選択的阻害剤、および、他のサブファミリー由来の５−ＨＴ受容体に対する阻害剤として作用することも可能な非選択的阻害剤、が包含される。

「アポモルヒネ」は、本明細書で使用される場合、（６ａＲ）−６−メチル−５，６，６ａ，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ジベンゾ［ｄｅ，ｇ］キノリン−１０，１１−ジオール（ＣＡＳ番号３１４−１９−２）を指す。アポモルヒネは１型および２型５−ＨＴＲ拮抗薬である（Millan M.J. et al. 2002. J Pharmacol Exp Ther, 303(2):791-804）。一実施形態では、阻害剤はアポモルヒネである。

「メチオテピン」またはメチテピンは、１−メチル−４−（８−メチルスルファニル−５，６−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１］ベンゾチエピン−６−イル）ピペラジン（ＣＡＳ番号７４６１１−２８−２）を指す。メチオテピンは１型および２型５−ＨＴＲ拮抗薬（Kawano H. et al. 2001. Blood, 97(6):1697-1702）、特にインバースアゴニスト、である。一実施形態では、阻害剤はメチオテピンである。

「アムペロジド」は、本明細書で使用される場合、４−［４，４−ビス（４−フルオロフェニル）ブチル］−Ｎ−エチルピペラジン−１−カルボキサミド（ＣＡＳ番号７５５５８−９０−６）を指す。アムペロジドは２型５−ＨＴＲ拮抗薬である（Svartengren J. and Simonsson P. Pharmacol Toxicol, 1990;66 suppl 1:8-11）。一実施形態では、阻害剤はアムペロジドである。

用語「血液系悪性腫瘍」とは、血液、骨髄、およびリンパ節に影響を与えるがん種を指す。血液系悪性腫瘍は、２つの主要な血液細胞系統（骨髄細胞系およびリンパ細胞系）のいずれかに由来し得る。骨髄細胞系は通常、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよびマスト細胞を産生し；リンパ細胞系はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および形質細胞を産生する。リンパ腫、リンパ性白血病、および骨髄腫はリンパ球系に由来し、一方、急性および慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および骨髄増殖性疾患は骨髄由来である。血液系悪性腫瘍の非限定的な例示としての例は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫および骨髄腫である。

「白血病」は、本明細書で使用される場合、「芽球」と呼ばれる未熟な白血球の異常な増殖を特徴とする、血液または骨髄のがんの一種を指す。白血病は一連の疾患を網羅する広義語である。また、白血病は、血液系、骨髄系、およびリンパ系に影響を与えるさらに広い疾患群の一部であり、これらは全て血液腫瘍として知られている。４種の主要な白血病が存在する：急性リンパ芽球性白血病、すなわちＡＬＬ；急性骨髄性白血病、すなわちＡＭＬ；慢性リンパ性白血病、すなわちＣＬＬ；慢性骨髄性白血病、すなわちＣＭＬ。

「急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または急性リンパ性白血病」は、リンパ芽球として知られるがん性の未熟な白血球の過剰産生を特徴とする、白血病、すなわち白血球のがん、の急性形態である。

「急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または急性骨髄性白血病または急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）」は、骨髄に蓄積し、正常な血液細胞の産生を妨げる異常な白血球（骨髄芽球（mieloblast））の急速な増殖を特徴とする、骨髄系血液細胞のがんである。ＡＭＬの症状は、赤血球、血小板および正常な白血球の減少を引き起こす、正常な骨髄の白血病細胞との置換によって引き起こされる。血液および血液髄（blood marrow）の塗抹標本に対するミエロペルオキシダーゼまたはスダンブラック染色および非特異的エステラーゼ染色の併用は、ＡＭＬをＡＬＬと区別するのに有用である。

「慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）またはＢ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）」は、身体に多数の白血球（Ｂ細胞リンパ球）を産生させるがんの一種である。

「慢性顆粒球性白血病（ＣＧＬ）」としても知られている「慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）」は、身体に多数の白血球（骨髄球）を産生させるがんの一種である。ＣＭＬでは、成熟顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）およびそれらの前駆体の増殖が見られる。ＣＭＬは、フィラデルフィア染色体と呼ばれる特徴的な染色体転座と関連している。

「試料」とは、本明細書で使用される場合、骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される試料を指す。

「末梢血」とは、本明細書で使用される場合、血液の循環プール内に存在し、リンパ系、脾臓、肝臓、または骨髄内に隔離されていない、赤血球、白血球、および血小板から成る血液の細胞成分を含む試料を指す。

「悪性細胞」は、本明細書で使用される場合、「腫瘍細胞」または「がん細胞」であり、制御されない急速なペースで成長および分裂する細胞を指す。

用語「対象」または「個体」または「動物」または「患者」には、治療法が所望される、あらゆる対象、特に哺乳類対象、が包含される。哺乳類対象としては、ヒト、家畜（domestic animal）、家畜（farm animal）、および動物園動物またはペット動物、例えば、犬、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ等、が挙げられる。

「免疫細胞化学」とは、細胞内の特定のタンパク質または抗原に結合する特異的な一次抗体の使用により、細胞内の特定のタンパク質または抗原の存在を局在化させるのに使用される手法を指し、この手法では、細胞外マトリックスおよび他の間質成分は取り除かれ、細胞全体のみが染色される。

用語「発現レベルの減少」とは、基準値よりも低い、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを指す。発現レベルは、発現レベルが、その基準値よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれ以上により低い場合に、基準値よりも低いと見なされる。

用語「発現レベルの増加」とは、基準値よりも高い、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを指す。発現レベルは、発現レベルが、その基準値よりも、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれ以上に高い場合に、その基準値よりも高いと見なされる。

用語「基準値」は、本明細書で使用される場合、対象から採取された試料から得られた値またはデータを評価するための参照として使用される所定の基準を指す。基準値または基準レベルは、絶対値；相対値；上限もしくは下限を有する値；ある範囲の値；平均値（average value）；中央値；平均値（mean value）；または特定の対照もしくはベースライン値と比較した値であり得る。基準値は、例えば、試験中の対象由来の試料から得られた、ただし初期時点における値等の、個々の試料値に基づいていてもよい。基準値は、暦年齢一致群の対象集団等から得られた多数の試料に基づいていてもよく、あるいは、試験されるべき試料を含む、またはそれを除外した試料プールに基づいていてもよい。

「良好な予後」とは、本明細書で使用される場合、患者にとって正と見なされるであろう結果を意味し、予後タイプに依存し；例えば、１年生存（１ＹＳ）という良好な予後は、患者が少なくとも１年間生存することを意味するであろう。好ましい実施形態では、良好な予後は、４０％超の確率の、疾患診断後の５年生存に関する。

「予後不良」とは、本明細書で使用される場合、患者にとって負と見なされるであろう結果を意味し、予後タイプに依存し；例えば、１年生存という予後不良は、患者が少なくとも１年間生存しないことを意味するであろう。好ましい実施形態では、予後不良は、４０％を下回る確率の、疾患診断後の５年生存に関する。

「初期時点」とは、本明細書で使用される場合、血液系悪性腫瘍を患う対象に治療法が施行される前のあらゆる瞬間を指す。

「有効な治療法」とは、本明細書で使用される場合、血液系悪性腫瘍を患っており前記治療法で治療されている患者の試料における、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＴＲのレベルの減少をもたらす治療法を指す。

「有効でない治療法」とは、本明細書で使用される場合、血液系悪性腫瘍を患っており前記治療法で治療されている患者の試料における、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲのレベルの減少に役立たない治療法を指す。

１−医学的用途
本発明の著者は、１型５−ＨＴＲ阻害剤および２型５−ＨＴＲ阻害剤が血液系悪性腫瘍、好ましくはＡＭＬ、の治療において治療効果があること、並びに、前記阻害剤が健常な血液細胞にも健常な造血幹細胞にも影響を与えず、それにより、従来の化学療法的処置によってもたらされる正常細胞に対する毒性が回避されること、を発見した。

第一の態様において、本発明は、血液系悪性腫瘍の予防および／または治療で使用するための、１型５−ＨＴＲ阻害剤および２型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択されるセロトニン受容体（５−ＨＴＲ）阻害剤に関する。

あるいは、本発明は、血液系悪性腫瘍の予防および／または治療のための薬剤の調製のための、１型５−ＨＴＲ阻害剤および２型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択されるセロトニン受容体（５−ＨＴＲ）阻害剤の用途に関する。

あるいは、本発明は、血液系悪性腫瘍を予防および／または治療するための方法に関し、前記方法は、１型５−ＨＴＲ阻害剤および２型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択されるセロトニン受容体（５−ＨＴＲ）阻害剤を、前記予防および／または治療を必要とする対象に投与することを含む。

用語「予防（prevention）」、「予防すること（preventing）」または「予防する（prevent）」とは、本明細書で使用される場合、投与時期には血液系悪性腫瘍を有し得ると診断されていないが、前記疾患を発症する、または前記疾患のリスクが増加していると通常予想されるであろう対象への、本発明による阻害剤の投与または前記阻害剤を含む薬剤の投与に関する。予防は、前記疾患の発症の回避を目的とする。予防は完全なものであってもよい（例えば、完全な無病（total absence of a disease））。予防は、例えば、対象における疾患の発症が、本発明の阻害剤の投与無しで発症したであろうものよりも少ないような、部分的なものであってもよい。予防は臨床状態に対する感受性の減少も指す。

用語「治療」は、本明細書で使用される場合、疾患の初期または早期段階における投与を含む、血液系悪性腫瘍を患う対象への本発明による阻害剤または前記阻害剤を含む薬剤の投与を指し、目的は、望まれない生理学的変化または障害を予防する、または遅延（減弱）させることである。有益または望ましい臨床結果には、限定はされないが、検出可能または検出不可にかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の減弱、病状の安定化（すなわち、悪化させないこと）、疾患増悪の遅延または緩徐化、病状の改善または一時的緩和、および寛解（部分的なものであっても完全なものであってもよい）が含まれる。治療はまた、治療を受けていない場合の予想生存と比較した場合の、生存の延長も意味する。

好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲ阻害剤は１Ａ型、１Ｂ型、１Ｄ型、１Ｅ型および１Ｆ型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択され；１Ａ型５−ＨＴＲ阻害剤が好ましい。

別の好ましい実施形態では、２型５−ＨＴＲ阻害剤は２Ａ型、２Ｂ型および２Ｃ型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択され；２Ｂ型および２Ｃ型５−ＨＴＲ阻害剤から選択されることが好ましく；２Ｃ型５−ＨＴＲ阻害剤であることがより好ましい。

１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲに対する特定の分子の親和性を決定する方法、並びにまた、この特定の分子が前記受容体の阻害剤であるかどうかを決定する方法は、当業者に公知である。例えば、ある分子の５−ＨＴＲ親和性は、Millan et al.によって記述された方法論を用いて決定することができる（Millan et al. J Pharmacol Exp Ther. 2002;303(2):791-804）（放射性リガンド結合アッセイ）。ある化合物が１型５−ＨＴＲ阻害剤であるかどうかを評価するためのアッセイは、Ｇｉ活性化状態の決定、並びにｃＡＭＰ産生およびアデニリルシクラーゼの活性化の測定である（Nichols D.E. and Nichols C.E. Chem Rev, 2008;108(5):1614-41）。ある化合物が２型５−ＨＴＲ阻害剤であるかどうかを評価するためのアッセイは、膜ホスホイノシチドの加水分解およびＰＫＣの活性化の測定である（Nichols D.E. and Nichols C.E. Chem Rev, 2008;108(5):1614-41）。１型５−ＨＴＲ阻害剤が１Ａ型、１Ｂ型、１Ｄ型、１Ｅ型または１Ｆ型５−ＨＴＲ阻害剤であるかを識別するために当業者が実行することができるアッセイは、サブタイプ特異的な作動薬を用いた競合活性化アッセイである。２型５−ＨＴＲ阻害剤が２Ａ型、２Ｂ型および２Ｃ型５−ＨＴＲ阻害剤であるかを識別するために当業者が実行することができるアッセイは、サブタイプ特異的な作動薬を用いた競合活性化アッセイである。

一実施形態では、５−ＨＴＲ阻害剤は、様々な種類の５−ＨＴＲに対する阻害剤として機能し得る非選択的阻害剤である。別の実施形態では、５−ＨＴＲ阻害剤は、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲに対して選択的である。

１型または２型５−ＨＴＲ阻害剤は、特に、タンパク質、ペプチド、干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは有機小分子であり得る。

好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲ阻害剤および／または２型５−ＨＴＲ阻害剤は、表１の化合物またはそれらの薬剤的に許容できる塩から選択される。

好ましい実施形態では、阻害剤は拮抗薬であり、より好ましくは、アポモルヒネ、メチオテピン、アムペロジドおよびその薬剤的に許容できる塩からなる群から選択される拮抗薬である。用語「拮抗薬」は、先に定義されている。１型５−ＨＴＲの活性は、ｃＡＭＰのレベル減少（Williams C. Nat Rev Drug Discovery, 2004;3(2):125-35）およびリン光体（phosphor）−Ａｋｔのレベル増加（Suni MA. and Maino VC. Methods Mol Biol 2011;717:155-69）を検出することによって決定することができ；２型５−ＨＴＲの活性は、ＩＰ３およびＤＡＧのレベル増加（Thomsen W., Frazer J. et al. Curr Opin Biotechnol, 2005;16(6):655-65）並びにまた、リン光体（phosphor）−ＥＲＫ１／２のレベル増加（Suni MA. and Maino VC. Methods Mol Biol 2011;717:155-69）を検出することによって決定することができる。

用語「その薬剤的に許容できる塩」は、本明細書で使用される場合、その酸または塩基塩の作製により親化合物が修飾されている、表１の化合物の誘導体を指す。薬剤的に許容できる塩の例としては、限定はされないが、アミン等の塩基性残基の無機塩または有機酸塩；カルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩または有機酸塩；等が挙げられる。薬剤的に許容できる塩としては、例えば、無毒の無機酸または有機酸から形成される、親化合物の従来の無毒の塩または四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、そのような従来の無毒の塩としては、限定はされないが、１，２−エタンジスルホン酸、２−アセトキシ安息香酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリルアルサニル酸（glycollyarsanilic）、ヘキシルレゾルシン酸（hexylresorcinic）、ヒドラバム酸（hydrabamic）、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル酸（napsylic）、硝酸、シュウ酸、パモン酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロ酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、塩基性酢酸（subacetic）、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、およびトルエンスルホン酸から選択される無機酸および有機酸に由来する塩が挙げられる。

表１の化合物の薬剤的に許容できる塩は、従来の化学的手法によって、塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般的に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸形態または遊離塩基形態を、化学量論量の適切な塩基または酸と、水中もしくは有機溶剤中、または以下の２つの混合物中で反応させることにより調製することができ；一般的には、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水培地が有用である。適切な塩の列挙は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18^th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990, p. 1445に見出される。

一実施形態では、阻害剤は阻害性抗体である。用語「阻害性抗体」は、本発明によれば、１型５−ＨＴＲまたは２型５−ＨＴＲに結合することにより、その天然リガンドによる前記受容体の活性化の阻害を誘発することが可能な抗体を意味していると理解される。抗体は、当業者に公知のあらゆる方法を用いて調製され得る。従って、ポリクローナル抗体は、阻害されることを目的とするタンパク質で動物を免疫化することによって調製される。モノクローナル抗体は、Kohler, Milstein et al (Nature, 1975, 256: 495)に記載される方法を用いて調製され得る。１型５−ＨＴＲまたは２型５−ＨＴＲに結合可能な抗体が特定された後、１型５−ＨＴＲ活性または２型５−ＨＴＲ活性を決定するための上記アッセイを用いて、１型５−ＨＴＲ活性または２型５−ＨＴＲ活性を阻害可能な抗体が選択される。本発明において適切な抗体としては、抗原結合性可変領域および定常領域を含むインタクトな抗体、フラグメントである「Ｆａｂ」、「Ｆ（ａｂ´）２」、「Ｆａｂ‘」、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ並びに二重特異性抗体が挙げられる。

別の実施形態では、阻害剤は干渉ＲＮＡである。本明細書で使用される場合、用語「干渉ＲＮＡ」または「ｉＲＮＡ」は、１型５−ＨＴＲ遺伝子もしくは２型５−ＨＴＲ遺伝子、または１型５−ＨＴＲ機能もしくは２型５−ＨＴＲ機能に必要なあらゆる遺伝子の発現をサイレンシングすることが可能なＲＮＡ分子を指す。これを受けて、ｉＲＮＡは、典型的には、少なくとも３０塩基対長を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８または１７個のリボ核酸塩基対を含むことがより好ましい。数種類の分子が、ｉＲＮＡ技術において効果的に使用されており、例えば、短干渉ＲＮＡ（short interference RNA）またはサイレンサーＲＮＡとして知られている場合もある低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ前駆物質から加工され、標的ｍＲＮＡに対し部分的にしか相補性を示さないという理由でｓｉＲＮＡとは通常異なるミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）剤は、ＲＮＡを干渉することにより標的遺伝子発現を阻害することが可能である。ｓｉＲＮＡは、化学的に合成してもよいし、あるいはインビトロ転写により得てもよいし、あるいは標的細胞内でインビボ合成してもよい。典型的には、ｓｉＲＮＡは１５〜４０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡから成り、１〜６ヌクレオチド長の３’および／または５’突起領域を含有し得る。突起領域の長さは、ｓｉＲＮＡ分子の全長とは無関係である。ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーの転写後分解またはサイレンシングによって作用する。

ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを形成する逆平行鎖がループ領域またはヘアピン領域によって連結されていることを特徴とする、命名済みのｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）であってもよい。ｓｉＲＮＡは、短アンチセンス配列（１９〜２５個のヌクレオチド）、それに続く５〜９個のヌクレオチドのループ、およびセンス鎖によって構成される。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ用のＵ６プロモーター等のプロモーターの制御下で、プラスミドまたはウイルスに、具体的にはレトロウイルスに、より具体的にはレトロウイルスに、コードされていてもよい。

本発明のｓｉＲＮＡは、１型もしくは２型５−ＨＴＲのｍＲＮＡまたはこのタンパク質をコードするゲノム配列に実質的に相同である。用語「実質的に相同（substantially honomogous）」は、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡ分解を誘発可能であり得るように、ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡに十分に相補的または類似した配列を有することを意味していると理解される。干渉を誘発するのに適したｓｉＲＮＡとしては、ＲＮＡによって形成されるｓｉＲＮＡ、並びに、例えば以下の化学的に異なる修飾を含有するｓｉＲＮＡが挙げられる：
ヌクレオチド間の結合が天然に現れる結合とは異なる（例えば、ホスホロチオエート結合）、ｓｉＲＮＡ。
蛍光物質（fluorophoro）等の機能性試薬との鎖状ＲＮＡ複合体。
２’位における様々なヒドロキシル官能基との組合せによる、ＲＮＡ鎖の末端、特に３’末端、の修飾体。
２’−Ｏ−メチルリボースまたは２’−Ｏ−フルオロリボース等の、２’位でＯ−アルキル化されたラジカル等の、糖修飾ヌクレオチド。
ハロゲン化塩基（例えば、５−ブロモウラシルおよび５−ヨードウラシル）またはアルキル化塩基（例えば、７−メチル−グアノシン）等の、塩基修飾ヌクレオチド。

本発明のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、当業者に公知の一連の手法を用いて得てもよい。例えば、ｓｉＲＮＡは、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機において、保護リボヌクレオシドホスホラミダイトから化学合成されてもよい。あるいは、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ鎖（複数可）のコード領域がＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの作動制御下にあるプラスミドおよびウイルスベクターから、組換えダイサー（recombinant dicer）によって作製されてもよい。ＲＮａｓｅダイサーは、細胞内で、ｓｈＲＮＡをｓｉＲＮＡに加工する。

ｓｉＲＮＡを設計するための基礎と見なされる領域は、限定はされないが、コード配列の領域（開始コドンと終止コドンの間）を含有していてもよく、あるいは、好ましくは２５〜５０ヌクレオチド長の、および開始コドンに対して３’位にあるあらゆる位置において、５’または３’非翻訳領域由来の配列を含有していてもよい。ｓｉＲＮＡ設計のための手順には、目的配列における、Ｎがいかなるヌクレオチドであってもよい配列モチーフＡＡ（Ｎ１９）ＴＴの特定、および、Ｇ／Ｃ高含量を示す配列モチーフの選択が含まれる。前記配列モチーフが見つからない場合、Ｎがいかなるヌクレオチドであってもよい配列モチーフＮＡ（Ｎ２１）が特定され得る。

別の実施形態では、本発明の阻害剤は、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲ１に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、配列が１型５−ＨＴＲまたは２型５−ＨＴＲをコードするｍＲＮＡに相補的である、すなわち、ｃＤＮＡ有意鎖に相補的である、分子である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全コード領域、またはコード領域並びに５’および３’非翻訳領域の両方を含む完全コード領域のある領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のヌクレオチド長から成り得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に広く知られている、化学合成によって、または酵素結合反応によって、得ることができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その生物学的安定性または、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの間で形成されるバイカテナリー状（bicatenary）ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体の安定性を増加させる修飾ヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート誘導体、ペプチド核酸およびアクリジン置換オリゴヌクレオチドをさらに含有していてもよい。アンチセンス核酸の調製に使用され得る修飾オリゴヌクレオチドとしては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチル−シトシン（citosine）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（beta-D-galactosylqueosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン（3-methylcitosine）、５−メチルシトシン（5-methylcitosine）、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン（beta-D-mannosylqueosine）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、偽ウラシル（pseudouracil）、クエオシン（queosine）、２−チオシトシン（2- thiocitosine）、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、アンチセンス指向の核酸がクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に作製されてもよい。

本発明で使用することができる別の阻害剤群は、リボザイム（ribozime）として知られている触媒活性を有する核酸である。リボザイム（ribozime）は、触媒領域、および配列が標的核酸に相補的であり、リボザイム（ribozime）に基質特異性を付与する第二領域、を含む。ハイブリダイゼーションによるリボザイム（ribozime）とその基質との間の相互作用、および、標的核酸の相補領域とリボザイム（ribozime）との間の共役の後、触媒領域の活性化がもたらされ、標的核酸の分子間破壊または分子内破壊が誘発される。リボザイム（ribozime）を設計するための基本的な考慮事項は、当業者に広く知られている（例えば、Doherty and Doudna (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2001; 30:457- 75)を参照 。

本発明で使用することができる、１型５−ＨＴＲまたは２型５−ＨＴＲの発現を阻害可能な他の化合物としては、アプタマーおよびスピーゲルマー（spiegelmer）が挙げられる。アプタマーおよびスピーゲルマーは、タンパク質に特異的に結合して、前記タンパク質の生物活性の改変をもたらす、一本鎖または二本鎖のＤ型またはＬ型核酸である。アプタマーおよびスピーゲルマーは、１５〜８０ヌクレオチド長、好ましくは、２０〜５０ヌクレオチド長である。

ある阻害剤がｍＲＮＡレベルを減少させることが可能かどうかを決定するのに適した方法としては、限定はされないが、ｍＲＮＡ発現レベルを決定するための標準的アッセイ、例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ保護分析、ノーザンブロット、ＲＮＡドットブロット、インサイツハイブリダイゼーション、マイクロアレイ技術、タグに基づく方法、例えば、ＬｏｎｇＳＡＧＥおよびＳｕｐｅｒＳＡＧＥ等の変種を含む遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、マイクロアレイ、Ｆｌｏｗ−ＦＩＳＨ、ｑＦｉＳＨおよび二重融合（double fusion）ＦＩＳＨ（Ｄ−ＦＩＳＨ）等の変種を含む蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）等が挙げられる。

ある阻害剤が１型または２型５−ＨＴＲのタンパク質レベルを減少させることにより作用するかどうかを決定するのに適した方法には、従来法による定量化、例えば、前記遺伝子によってコードされる前記タンパク質に（または、抗原決定基を含有するその断片に）特異的に結合する能力を有する抗体の使用、およびその後の得られた抗体−抗原複合体の定量化、が含まれる。

本発明の阻害剤は、１型または２型５−ＨＴＲの活性を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％、および、５％〜１００％の全範囲で、阻害し得る。ある阻害剤が１型または２型５−ＨＴＲの活性を低減させることによって作用するかどうかを決定するのに適した方法は、前述の通りである。

別の好ましい実施形態では、阻害剤は１型５−ＨＴＲ阻害剤、好ましくは拮抗薬である。

本発明によれば、１型５−ＨＴＲ阻害剤および２型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択されるセロトニン受容体（５−ＨＴＲ）阻害剤は、血液系悪性腫瘍を患う対象を予防および／または治療するのに有用である。本発明の好ましい実施形態では、対象は哺乳動物である。本発明のより好ましい実施形態では、対象はあらゆる人種および性別のヒトである。別の好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍は白血病、より好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

当業者によって認められるように、血液系悪性腫瘍治療法における１型５−ＨＴＲ阻害剤および２型５−ＨＴＲ阻害剤の有効性は、血液学的反応の分析（白血球、赤血球および血小板の数並びにヘモグロビンおよびヘマトクリットのレベルの測定）、細胞遺伝学的反応の分析、および／または血清腫瘍マーカーの分析によって示され得る。

個々の要求が変化しても、本発明による用途のための阻害剤の治療有効量の最適範囲の決定は、当業者の通例の経験に属する。一般的に、当業者によって調整され得る、有効処置を与えるために必要な投与量は、薬物送達系を使用する場合、および阻害剤が薬剤併用の一部として投与される場合、年齢、健康、適応度、性別、食事、体重、受容体の変化の程度、処置の頻度、傷害の性質および状態、機能障害または疾病の性質および程度、対象の医学的状態、投与経路、薬理学的な考慮事項、例えば、使用される特定の化合物の活性、有効性、薬物動態学的および毒性学的プロファイルに応じて変動する。

本発明の阻害剤は、限定はされないが、非経口経路、経口経路、局所経路、経鼻経路、経直腸経路等の、あらゆる適切な投与経路で投与され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の阻害剤は、非経口経路によって、例えば、静脈内投与、くも膜下腔内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与または硬膜外投与によって投与される。

２−血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞を特定するための方法
本発明の発明者らは、血液系悪性腫瘍由来、特にＡＭＬ由来の悪性細胞が、健常ドナーと比較して有意により高値の量で１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲを発現することを発見した。このことから、血液細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現の検出は、血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞を特定するのに有用である可能性がある。

別の態様において、本発明は、骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される試料中の血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞を同定するためのインビトロ法に関し、前記方法は、前記細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現を検出することを含む。

当業者には公知であり得るが、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現は、前記受容体の機能的に等価な変異体の発現を検出することによっても検出することができる。

「機能的に等価な変異体」は、機能が実質的に維持される限り、修飾、挿入および／もしくは欠失または一つもしくは複数のアミノ酸による、１型５−ＨＴＲまたは２型５−ＨＴＲの配列から生じる全てのタンパク質を意味すると理解される。

１型５−ＨＴＲの活性は、ｃＡＭＰのレベルの減少およびリン酸化Ａｋｔのレベルの増加を検出することによって決定することができ；２型５−ＨＴＲの活性は、ＩＰ３およびＤＡＧのレベルの増加、並びにまたリン光体（phosphor）−ＥＲＫ１／２のレベルの増加を検出することによって決定することができる。

１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの変異体は、（ｉ）一つまたは複数のアミノ酸残基が保存もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）によって置換されており、このような置換されたアミノ酸が遺伝暗号によってコードされていてもされていなくてもよい、ポリペプチド、（ｉｉ）一つもしくは複数の修飾アミノ酸残基、例えば、結合している置換基によって修飾された残基、が存在するポリペプチド、（ｉｉｉ）類似のｍＲＮＡの選択的プロセシングから生じるポリペプチド、（ｉｖ）ポリペプチド断片、並びに／または、（ｖ）分泌性リーダー配列もしくは精製（例えば、Ｈｉｓタグ）もしくは検出（例えば、Ｓｖ５エピトープ標識）に使用される配列等の別のポリペプチドを有する、１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲ融合から生じるポリペプチドもしくは（ｉ）〜（ｉｉｉ）で定義されたポリペプチド、であることが好ましい。断片には、元の配列のタンパク分解性切断（多部位タンパク質分解を含む）を介して生成されるポリペプチドが包含される。変異体は翻訳後修飾または化学修飾されてもよい。このような変異体は、当業者には明らかであると思われる。

当該技術分野において公知であるように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、アミノ酸配列およびあるポリペプチドから保存された置換アミノ酸を、第二のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。変異体は、元の配列と異なる、好ましくは、当該セグメント当たり４０％未満の残基において元の配列と異なる、より好ましくは、当該セグメント当たり２５％未満の残基において元の配列と異なる、より好ましくは、当該セグメント当たり１０％未満の残基において元の配列と異なる、より好ましくは、当該セグメント当たりごく少数の残基において元の配列と異なり、同時に、元の配列の機能性を保存するのに十分に元の配列と相同である、ポリペプチド配列を含むものと定義される。本発明は、元のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、もしくは９５％類似した、または同一のアミノ酸配列を含む。２つのポリペプチド間の同一性の程度は、コンピューターアルゴリズムおよび当業者に広く知られている方法を用いて決定されてもよい。２つのアミノ酸配列の間の同一性は、優先的に、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム[BLASTManual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]を用いて決定される。

１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルは、骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される試料において決定される。

骨髄由来の試料は、当該技術分野において公知の、吸引生検およびトレフィン生検（trephine biopsy）によって得ることができる。血液試料は、動脈または静脈、通常は肘関節の内側部分または手の甲の静脈、の穿刺による採血等の、技術の現状において当業者に公知の方法を用いて、従来の方法により得ることができ、血液試料は気密バイアルまたは注射器内に収集される。リンパ節は、リンパ節の全てまたは一部の生検（切除リンパ節生検または切開リンパ節生検）によって得られる。

「発現を検出する」という表現は、その表面上に１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲを保有する、または、１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲのｍＲＮＡを発現する、試料中の血液細胞の存在を検出することを指す。前記検出は、定性的であっても定量的であってもよい。

一実施形態では、本発明の悪性細胞を特定するための方法は、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルの決定を必要としない。

別の実施形態では、本発明の悪性細胞を特定するための方法は、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定することを含む。

「発現レベルを決定する」という表現は、本明細書で使用される場合、生物マーカー（１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲ）の発現レベル、および／または、その表面上にこの生物マーカー（すなわち細胞表面マーカー）を保有する細胞の数を決定することを指す。ここで、発現レベルとは、ｍＲＮＡのレベルおよび／またはタンパク質のレベルおよび／またはその表面上に生物マーカーを保有する細胞の数を指す。

発現を検出するための方法は、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲのｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に基づき得る。あるいは、前記方法は、全体としての試料中の、試料の細胞内の、および／または試料の非細胞画分中の、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルおよびその変異体のレベルの決定にも基づき得る。

ｍＲＮＡを検出するための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）、ノーザンブロット法、ナノストリング法（nanostring）およびマイクロアレイ技術が挙げられる。

非限定的な例示として、発現レベルは、前記遺伝子にコードされるｍＲＮＡのレベルの定量化によって決定される。ｍＲＮＡのレベルは、従来法、例えば、ｍＲＮＡの増幅および前記ｍＲＮＡの増幅産物の定量化を含む方法（例えば、電気泳動および染色）の使用によって、あるいは、ノーザンブロットおよび目的遺伝子のｍＲＮＡまたはその対応するｃＤＮＡ／ｃＲＮＡの適切なプローブの使用、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ＲＴ−ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ等によって、定量化することができる。同様に、マーカー遺伝子にコードされる前記ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ／ｃＲＮＡのレベルも、従来技術の使用によって定量化することができ；この場合、本発明の方法は、対応するｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）と、それに続く前記ｃＤＮＡに相補的なｃＲＮＡの合成（ＲＮＡポリメラーゼ）および増幅による、対応するｃＤＮＡの合成段階を含む。

異なる試料間でｍＲＮＡ発現の値を正規化するために、試験試料中の目的ｍＲＮＡの発現レベルが、対照ＲＮＡの発現と比較され得る。「対照ＲＮＡ」とは、本明細書で使用される場合、その発現レベルが変化しない、または限定された量でのみ変化する、ＲＮＡを指す。対照ＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子に由来し、構成的に発現され、必須の細胞機能を実行するタンパク質をコードする、ｍＲＮＡであることが好ましい。本発明で使用するための好ましいハウスキーピング遺伝子としては、１８−Ｓリボソームタンパク質、β−２−ミクログロブリン、ユビキチン、シクロフィリン、ＧＡＰＤＨ、ＰＳＭＢ４、チューブリンおよびβ−アクチンが挙げられる。

あるいは、遺伝子の発現が増加している場合、対応するタンパク質の量の増加が起こるはずであり、遺伝子の発現が減少している場合、対応するタンパク質の量の減少が起こるはずであることから、１型５−ＨＴＲ遺伝子および／または２型５−ＨＴＲ遺伝子にコードされるタンパク質の発現レベルの決定によって、前記遺伝子の発現レベルを決定することも可能である。

実質的にいかなる従来法も、タンパク質のレベルを検出および定量化するために、本発明の枠組みの中で使用することができる。非限定的な例示として、発現レベルは、測定されるべきタンパク質（または抗原決定基を含有するその断片）に特異的に結合する能力を有する抗体、および、その後の得られた抗原抗体複合体の定量化によって、決定される。この種のアッセイで使用されるであろう抗体は、例えば、ポリクローナル血清、ハイブリドーマ上清またはモノクローナル抗体、抗体断片、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、並びにヒト型化抗体であり得る。同時に、抗体は標識されていてもされていないくてもよい。使用することができるマーカーの、例示的な、ただし非排他的な、例としては、放射性同位元素、酵素、フルオロフォア、化学発光（chemoluminescent）試薬、酵素補因子または基質、酵素阻害剤、粒子、色素等が挙げられる。１型または２型５−ＨＴＲの、非標識抗体（一次抗体）、標識抗体（二次抗体）または標識された拮抗薬もしくは作動薬を使用する、本発明で使用することができる、種々様々な周知のアッセイが存在し；これらの手法としては、ウエスタンブロットもしくは免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合的ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的手法および免疫組織化学的手法、免疫蛍光法、バイオチップの使用に基づく手法、または特異的抗体を含むタンパク質マイクロアレイ、または試験紙等の形式のコロイド沈殿に基づくアッセイが挙げられる。タンパク質を検出および定量化する他の形式としては、アフィニティークロマトグラフィー法、リガンド−結合アッセイ等が挙げられる。

本発明の好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現細胞は、免疫細胞化学によって、好ましくは免疫蛍光法によって検出される。

本発明の好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現の検出またはレベルの決定は、免疫蛍光法によって行われる。免疫蛍光法（ＩＦ）は、蛍光顕微鏡を用いる光学顕微鏡法に使用される手法であり、主に生物試料に対して使用される。この手法では、蛍光色素を細胞内の特定の生体分子標的に標的化するために、抗体のそれらの抗原に対する特異性が利用され、これにより、試料中の標的分子の分布が可視化される。ＩＦは、免疫染色の広く使用されている例であり、抗体の位置を可視化するためにフルオロフォアを利用する免疫組織化学（ＩＨＣ）または免疫細胞化学（ＩＣＣ）の具体例である。ＩＦは、組織切片、培養細胞株、または個々の細胞に対して使用することができる。ＩＦは、他の、抗体を使用しない蛍光染色法、例えばＤＮＡを標識するためのＤＡＰＩの使用、と組み合わせて使用することができる。いくつかの顕微鏡設計がＩＦ試料の分析に使用可能であり；最も単純なものは落射蛍光顕微鏡であり、共焦点顕微鏡も広く使用されている。また、さらに高度な解像度が可能な、様々な超解像度顕微鏡設計が使用可能である。好ましい実施形態では、悪性細胞の特定はフローサイトメトリーによって行われ、フローサイトメトリーは、液体流中に細胞を浮遊させ、電子検出器に細胞を通過させることによる、細胞計数、細胞選別および生物マーカー検出に使用される、レーザーに基づく生物物理学的技術である。

本発明によれば、骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される試料中の１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現の検出は、血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞の特定に有用である。

好ましい実施形態では、血液試料は末梢血である。

別の好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ１Ａであり、２型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ２Ａ、５−ＨＴＲ２Ｂおよび５−ＨＴＲ２Ｃからなる群から選択される。
より好ましい実施形態では、２型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ２Ｃである。

別の好ましい実施形態では、悪性細胞を特定するための本発明の方法は、５−ＨＴＲ１Ａおよび５−ＨＴＲ２Ｃの発現の検出を含む。

好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍は白血病であり、より好ましくは急性骨髄性白血病である。

前述の全ての用語および実施形態は、本発明のこの態様に等しく適用可能である。

３−血液系悪性腫瘍を診断するための方法
別の態様において、本発明は、本発明による方法によって、具体的には、骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される試料中の血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞の特定によって、悪性細胞を特定することを含む、対象における血液系悪性腫瘍を診断するためのｖｉｔｒｏ法（vitro method）に関し、前記方法は、前記細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現を検出することを含む。

診断とは、本明細書で使用される場合、対象における可能性のある疾患を決定および／または特定しようとする試みの過程、すなわち、診断法、並びに、この過程によって到達される所見、すなわち診断所見（diagnostic opinion）の両方を指す。従って、診断は、治療および予後に関する医療上の決定がなされることを可能にする、個人の状態を別々の異なる分類に分類する試みと見なすこともできる。当業者には理解されることであるが、血液系悪性腫瘍の診断は、好ましいことではあるが、診断または評価される対象の１００％において正しい必要はない。しかしながら、前記用語は、対象の統計的にかなりの部分が血液系悪性腫瘍を患っていると特定され得ることを要求する。対象が統計的に有意であるかどうかは、種々の周知の統計的評価手段（例えば、信頼区間の決定、ｐ値決定、スチューデントｔ検定、マン・ホイットニー検定等）を用いることで、当業者により造作なく決定され得る。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。ｐ値は、０．０５、０．０１、０．００５またはそれ未満が好ましい。

好ましい実施形態では、対象における血液系悪性腫瘍を診断するための方法は、
（ａ）骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定し、
（ｂ）前記レベルを基準値と比較すること、を含み、
前記方法では、基準値に対する、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲを発現する細胞のレベル増加は、対象が血液系悪性腫瘍を患っていることを示す。

基準値は、血液系悪性腫瘍に冒されていない正常な個人由来の分析されるべき試料の混合物によって形成されることが好ましい試料集合から導かれる。前記基準値は、技術の現状において周知の手法によって、例えば、健常な対象から採取された試料において測定された、１型５−ＨＴＲタンパク質および／または２型５−ＨＴＲタンパク質のレベルの平均値を決定することによって、決定することができる。基準値は、分析されるべき同一対象から採取された構成的に発現されたタンパク質から得ることもできる。

好ましい実施形態では、血液試料は末梢血である。別の好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ１Ａであり、２型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ２Ａ、５−ＨＴＲ２Ｂおよび５−ＨＴＲ２Ｃからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、２型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ２Ｃである。

別の好ましい実施形態では、本発明の血液系悪性腫瘍を診断するための方法は、５−ＨＴＲ１Ａおよび５−ＨＴＲ２Ｃの発現の検出を含む。

好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍は白血病であり、より好ましくは急性骨髄性白血病である。

別の好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現細胞は、免疫細胞化学によって、好ましくは免疫蛍光法によって、より好ましくはフローサイトメトリーによって、検出される。

前述の全ての用語および実施形態は、本発明のこの態様に等しく適用可能である。

４−悪性細胞を単離するための方法
別の態様において、本発明は、骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される試料中の血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞を単離するためのインビトロ法に関し、前記方法は、前記細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現を検出し、前記５−ＨＴＲを発現する前記細胞を単離することを含む。

用語「単離する」は、本明細書で使用される場合、骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される試料中に存在する残りの構成要素からの悪性細胞の、同定および分離または除去を意味する。

好ましい実施形態では、血液試料は末梢血である。

別の好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ１Ａであり、２型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ２Ａ、５−ＨＴＲ２Ｂおよび５−ＨＴＲ２Ｃからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、２型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ２Ｃである。

別の好ましい実施形態では、悪性細胞を単離するための本発明の方法は、５−ＨＴＲ１Ａおよび５−ＨＴＲ２Ｃの発現の検出を含む。

好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍は白血病であり、より好ましくは急性骨髄性白血病である。

別の好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現細胞は、免疫細胞化学によって、好ましくは免疫蛍光法によって、より好ましくはフローサイトメトリーによって、検出される。

前述の全ての用語および実施形態は、本発明のこの態様に等しく適用可能である。

５−予後を判定するための方法
別の態様において、本発明は、血液系悪性腫瘍を患う対象の予後を判定するためのインビトロ法に関し、前記方法は、
（ａ） 骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定し、
（ｂ） 前記レベルを基準値と比較すること、を含み、
前記方法では、基準値に対する１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルの減少は、対象が良好な予後を示すことを示しており、あるいは、基準値に対する１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルの増加は、対象が予後不良を示すことを示している。

好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍は白血病であり、より好ましくは急性骨髄性白血病である。

用語「決定する」は、本明細書で使用される場合、患者の進展を決定するのに有用であり得るあらゆるパラメータの決定を指す。当業者には理解されることであるが、予後の予測は、好ましいことではあるが、診断または評価される対象の１００％において正しい必要はない。しかしながら、前記用語は、対象の統計的にかなりの部分が所与の予後を有する可能性が高いと特定され得ることを要求する。対象が統計的に有意であるかどうかは、種々の周知の統計的評価手段（例えば、信頼区間の決定、ｐ値決定、スチューデントｔ検定、マン・ホイットニー検定等）を用いることで、当業者により造作なく決定され得る。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、９０％、または少なくとも９５％である。ｐ値は、０．０５、０．０１、０．００５またはそれ未満が好ましい。

用語「予後」とは、本明細書で使用される場合、疾患からの回復の見込み、または、疾患の起こり得る発症もしくは結果の予測、例えば、限定はされないが、全生存（ＯＳ）の期間、１年生存（１ＹＳ）、治療反応性（ＲＴ）、無病生存期間、無増悪生存期間、および無再発生存期間の予測、を意味する。当業者には理解されることであるが、予測は、好ましいことではあるが、診断または評価される対象の１００％において正しい必要はない。しかしながら、前記用語は、対象の統計的にかなりの部分が所与の予後を有する可能性が高いと特定され得ることを要求する。対象が統計的に有意であるかどうかは、種々の周知の統計的評価手段（例えば、信頼区間の決定、ｐ値決定、スチューデントｔ検定、マン・ホイットニー検定等）を用いることで、当業者により造作なく決定され得る。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％ 少なくとも９５％である。ｐ値は、０．０５、０．０２、０．０１またはそれ未満が好ましい。

Standard criteria (Miller, et al. Cancer, 1981; 47(1): 207-14)が、治療法への応答における患者の臨床成績を評価するために本明細書と共に使用され得る。処置の有効性を決定するための広く認められているあらゆるパラメーターが、処置の応答における患者の臨床成績の決定に使用可能であり、限定はされないが、以下が挙げられる：
本明細書で使用される場合、試験期間中に疾患を再発させなかった完全寛解の対象の比率を述べる、無病進行（disease-free progression）。
本明細書で使用される場合、対象が疾患の徴候無しで生存する疾患への処置の後の期間として理解される、無病生存期間（ＤＦＳ）。
本発明で使用される場合、完全または部分的な応答が観察される処置対象の比率を述べる、客観的応答（objective response）。
本発明で使用される場合、完全奏功、部分奏功、小（minor）奏功または６ヶ月間以上の安定病態が観察される処置対象の比率に関する、腫瘍制御（tumor control）。
本明細書で使用される場合、処置開始からがん成長の最初の測定までの時間と定義される、無増悪生存期間。
本明細書で使用される場合、疾患が増悪し始めるまでの、疾患が治療された後の時間を指す、腫瘍増殖停止時間。用語「進行」は、先に定義されている。
本明細書で使用される場合、治療法の開始後の最初の６ヶ月において無増悪である対象の割合を指す、６ヶ月無増悪生存率。
本明細書で使用される場合、原発性がんの診断後に生存している患者の割合と定義される、全生存率（ＯＳ）。
本明細書で使用される場合、試験に参加した対象の半数が生存している期間を指す、生存期間中央値、並びに
本明細書で使用される場合、白血病細胞の染色体構造に基づく５年生存の確率を指す、細胞遺伝学的なリスク層別化。

好ましい実施形態では、患者の臨床成績は細胞遺伝学的なリスク層別化を決定することにより測定される。

予後を判定するためのインビトロ法の第一段階は、骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定することを含む。生物マーカーの発現レベルの決定とは、生物マーカーの発現レベルおよび／またはその表面上に生物マーカー（すなわち細胞表面マーカー）を保有する細胞の数の決定を指す。ここで、発現レベルとは、ｍＲＮＡのレベルおよび／またはタンパク質のレベルおよび／またはその表面上に生物マーカーを保有する細胞の数を指す。生物マーカーの発現レベルを決定するための方法の例は先に記載された。

別の好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍を患う対象の予後を決定するためのインビトロ法は、１型５−ＨＴＲ遺伝子および／もしくは２型５−ＨＴＲ遺伝子にコードされるｍＲＮＡのレベル、またはその変異体のレベルを測定することによる、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルの決定を含む。別の好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルは、１型５−ＨＴＲタンパク質および／もしくは２型５−ＨＴＲタンパク質のレベル、またはその変異体のレベルを測定することにより決定される。より好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルはＰＣＲによって決定される。別の好ましい実施形態では、タンパク質またはその変異体の発現レベルは、ウェスタンブロットまたは免疫細胞化学によって決定される。より好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルは、半定量的ＰＣＲによって決定される。

別の好ましい実施形態では、血液試料は末梢血である。

好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍を患う対象の予後を判定するためのインビトロ法は、１型５−ＨＴＲのレベルの決定を含む。より好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ１Ａおよび５−ＨＴＲ−１Ｂからなる群から選択される。

好ましい実施形態では、前記方法は、５−ＨＴＲ１Ａおよび５−ＨＴＲ−１Ｂの発現レベルの決定を含む。

第二段階において、予後を判定するためのインビトロ法は、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲのレベルを基準値と比較することを含む。前記比較によって、対象が良好な予後または予後不良を示すかどうかが結論付けられる。

好ましい実施形態では、本発明のインビトロ法によって判定される予後は、５年生存の確率である。

前述の全ての用語および実施形態は、本発明のこの態様に等しく適用可能である。

６−治療法の効果をモニターするための方法
別の態様において、本発明は、血液系悪性腫瘍を患い、治療法による処置を受けている対象における、前記治療法の効果をモニターするためのインビトロ法に関し、前記方法は、
ａ） 骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定し、
ｂ） 前記レベルを、より早い時点の前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルと比較すること、を含み、
前記方法では、より早い時点での前記対象由来の試料において決定されたレベルに対する、１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲの発現レベルの減少は、治療法が効果的であることを示し、または、より早い時点での前記対象由来の試料において決定されたレベルに対する、１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲの発現レベルの増加は、治療法が効果的でないことを示す。

好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍は白血病であり、より好ましくは急性骨髄性白血病である。

当業者によって理解されるように、前記治療法は、血液系悪性腫瘍の治療を目的としている。非限定例として、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）およびダウノルビシン（ダウノマイシン）またはイダルビシン、フルダラビンまたはトポテカンの組合せが使用され得る。別の実施形態では、前記治療法は、１型５−ＨＴＲ阻害剤または２型５−ＨＴＲ阻害剤である。

１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定するための方法は、先に詳術された。

好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍を患う対象における治療法の効果をモニターするためのインビトロ法は、１型５−ＨＴＲのレベルの決定を含む。より好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ１Ａおよび５−ＨＴＲ−１Ｂからなる群から選択される。

好ましい実施形態では、前記方法は、５−ＨＴＲ１Ａおよび５−ＨＴＲ−１Ｂの発現レベルの決定を含む。

別の好ましい実施形態では、血液試料は末梢血である。

別の好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍を患う対象における治療法の効果をモニターするためのインビトロ法は、１型５−ＨＴＲ遺伝子および／もしくは２型５−ＨＴＲ遺伝子にコードされるｍＲＮＡのレベル、またはその変異体のレベルを測定することによる、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルの決定を含む。別の好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルは、１型５−ＨＴＲタンパク質および／もしくは２型５−ＨＴＲタンパク質のレベル、またはその変異体のレベルを測定することにより決定される。

より好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルはＰＣＲによって決定される。別の好ましい実施形態では、タンパク質またはその変異体の発現レベルは、ウェスタンブロットまたは免疫細胞化学によって決定される。より好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルは、半定量的ＰＣＲによって決定される。

前述の全ての用語および実施形態は、本発明のこの態様に等しく適用可能である。

７−カスタマイズされた治療法を設計するための方法
別の態様において、本発明は、血液系悪性腫瘍があると診断された対象のためのカスタマイズされた治療法を設計するためのインビトロ法に関し、前記方法は、
ａ） 骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定し、
ｂ） 前記レベルを基準値と比較すること、を含み、
前記方法では、基準値に対する１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現細胞のレベルの増加は、対象が１型５−ＨＴＲ阻害剤および／または２型５−ＨＴＲ阻害剤で治療されるべきであることを示す。

血液系悪性腫瘍があると診断された対象に対するカスタマイズされた治療法の設計は、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現に基づいて決定し、必要に応じて、１型５−ＨＴＲ阻害剤および／または２型５−ＨＴＲ阻害剤を投与すること、と理解される。

好ましい実施形態では、５−ＨＴＲ阻害剤は、表１の化合物またはそれらの薬剤的に塩から選択される。

より好ましい実施形態では、５−ＨＴＲ阻害剤は、アポモルヒネメチオテピン、アムペロジドおよびその薬剤的に許容できる塩からなる群から選択される。

好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍を患う対象におけるカスタマイズされた治療法を設計するためのインビトロ法は、１型５−ＨＴＲの発現レベルの決定を含む。より好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲは５−ＨＴＲ１Ａおよび５−ＨＴＲ−１Ｂからなる群から選択される。

好ましい実施形態では、前記方法は、５−ＨＴＲ１Ａおよび５−ＨＴＲ１Ｂの発現レベルの決定を含む。

別の好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍は白血病であり、より好ましくは急性骨髄性白血病である。

別の好ましい実施形態では、血液試料は末梢血である。

別の好ましい実施形態では、血液系悪性腫瘍を患う対象における治療法の効果をモニターするためのインビトロ法は、１型５−ＨＴＲ遺伝子および／もしくは２型５−ＨＴＲ遺伝子にコードされるｍＲＮＡのレベル、またはその変異体のレベルを測定することによる、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルの決定を含む。別の好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルは、１型５−ＨＴＲタンパク質および／もしくは２型５−ＨＴＲタンパク質のレベル、またはその変異体のレベルを測定することにより決定される。より好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルはＰＣＲによって決定される。別の好ましい実施形態では、タンパク質またはその変異体の発現レベルは、ウェスタンブロットまたは免疫細胞化学によって決定される。より好ましい実施形態では、１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルは、半定量的ＰＣＲによって決定される。

前述の全ての用語および実施形態は、本発明のこの態様に等しく適用可能である。

本発明は、単なる例示と見なされるべきであり、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない、以下の実施例によって説明される。

材料および方法

実施例１：セロトニン受容体（５ＨＴＲ）拮抗薬１型および２型はＡＭＬ細胞株に対する細胞毒性効果を有する。 ５ＨＴＲ拮抗薬の抗白血病作用を試験するために、ＨＬ−６０（Collins, Gallo et al. Nature. 1977;270(5635):347-9）、ＭｏｎｏＭａｃ−１（Steube, Teepe et al. Leuk Res. 1997;21(4):327-35）、ＫＧ−１（Koeffler and Golde. Science. 1978;200(4346):1153-4）およびＫａｓｕｍｉ−１（Asou, Tashiro et al. Blood. 1991;77(9):2031-6）のＡＭＬ（急性骨髄性白血病）細胞株を、様々な用量の、適用範囲の広い（broad）５ＨＴＲ拮抗薬であるアポモルヒネ（ＣＡＳ登録番号３１４−１９−２）で７２時間処理した。１００万細胞／ｍＬを、９６ウェルプレート内の１０％ウシ胎児血清を添加した完全ＲＰＭＩ培地中に播種した。アポモルヒネ処理に使用された濃度は０．１、１および１０μＭであった。図１に示すように、試験された全てのＡＭＬ細胞株において、用量反応様式で、細胞生存率の減少が検出された。

ヒト５ＨＴＲファミリーは、７つのサブタイプ（１〜７）の受容体によって構成される（Nichols and Nichols. Chem Rev 2008, 108:16414-41）。ＨＬ−６０、ＫＧ−１、ＭｏｎｏＭａｃ−１およびＫａｓｕｍｉ−１ ＡＭＬ細胞株を、サブタイプ特異的５ＨＴＲ拮抗薬：アポモルヒネ（１型、２型および５型）、メチオテピン（１型および２型）（ＣＡＳ登録番号７４６１１−２８−２）、アムペロジド（２型）（ＣＡＳ登録番号７５５５８−９０−６）、ＧＲ１１３８０８（４型）（ＣＡＳ登録番号１４４６２５−５１−４）と一緒にインキュベートした。処理の７２時間後、細胞生存率をフローサイトメトリーで決定した。細胞を７−ＡＡＤ（ＣＡＳ登録番号７２４０−３７−１）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＣＡＳ登録番号２３４９１−５２−３）で染色した。生細胞（viability cell）を、７−ＡＡＤ染色排除（7-AAD staining exclusion）およびＨｏｅｃｈｓｔ陽性染色の存在によって特定した。体積当たりの細胞数を測定した。アポモルヒネ、メチオテピンおよびアムペロジドのみが、ＡＭＬ細胞株に対し細胞死を誘導した（図２）；このことから、５ＴＨＲ１型および２型の阻害はＡＭＬ細胞に対する細胞毒性効果を有する。実際、抗白血病作用は、天然リガンドである５−ＨＴ（ＣＡＳ登録番号１５３−９８−０）または５−ＣＴ（ＣＡＳ登録番号７４８８５−７２−６）等の競合的作動薬の存在下で逆転した。

実施例２：セロトニン受容体（５ＨＴＲ）拮抗薬１型および２型は初代患者ＡＭＬ試料に対する細胞毒性効果を有する。 初代ＡＭＬ患者試料を、０．１、１および１０μＭのサブタイプ１および２のＨＴＲ拮抗薬で２４時間および７２時間処理した。５０００００細胞／ｍＬを、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ＩＬ３および可欠アミノ酸を添加したＩＭＤＭ中に播種した。細胞生存率を上記のようにフローサイトメトリーで測定した。ＡＭＬ細胞株と同様に、アポモルヒネ処理およびメチオテピン処理の両方が、用量反応様式で初代ＡＭＬ芽球に対して細胞死を誘導した（図３および図４）。

正常な造血系と同様に、ＡＭＬは、自己複製能が増強され、分化能が損なわれ、薬剤耐性が増加した少数の白血病幹細胞（ＬＳＣ）によって究極的には維持される、異なる、機能的に不均一な細胞クラスの階層として組織化されると考えられている（Bonnet and Dick Nat Med. 1997;3(7):730-7）。ＬＳＣ集団がＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＡＭＬ芽球集団の内部で富化されることが分かっている。アポモルヒネおよびメチオテピンは、ＣＤ３４の存在およびＣＤ３８の非存在に基づくフローサイトメトリーによって特定される、大部分の未分化ＬＳＣ富化芽球集団の細胞生存率を減少させた（図３および図４）。実際、未分化画分における減少は、混合集団における減少よりも、有意に高度であった；このことから、５ＨＴＲ拮抗薬はＬＳＣに選択的に影響を与える。

実施例３：５ＨＴＲ拮抗薬はＡＭＬ細胞株に対して分化を誘導した
ＨＬ−６０、ＫＧ−１、ＭｏｎｏＭａｃ−１およびＫａｓｕｍｉ−１ ＡＭＬ細胞株を、上記のように、様々な濃度のアポモルヒネおよびメチオテピンで７２時間処理した。分化関連表面マーカーの発現をフローサイトメトリーで測定した。全てのＡＭＬ細胞株において、５ＨＴＲ拮抗薬の存在はＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４の発現を誘導した（図５）。

同様に、アポモルヒネおよびメチオテピンは、初代ＡＭＬ患者試料に対し、骨髄性マーカーの発現上昇を誘導した（図６および図７）。

実施例４：５ＨＴＲ拮抗薬は健常な血液細胞にも健常な造血幹／前駆細胞にも影響を与えない
健常ドナー由来の末梢血細胞を単離し、初代患者ＡＭＬ試料と同じ条件を用いて５ＨＴＲ拮抗薬で処理した。初代患者ＡＭＬ試料（the latter）とは異なり、健常な血液細胞はアポモルヒネまたはメチオテピンによる処理に対して無影響のままであった（図８）。

造血幹／前駆細胞に対する５ＨＴＲ拮抗薬処理の影響を研究するため、健常ドナーから得られた臍帯血試料由来の単核細胞を単離し、系統陰性（lineage-negative）画分をアポモルヒネの存在下で培養した。ＡＭＬ細胞とは異なり、初代造血幹／前駆細胞は処理に対して無影響のままであった。各々の集団内頻度または細胞の絶対数において、有意な細胞生存率変化は観察されなかった（図９）。

実施例５：５ＨＴＲ拮抗薬は、健常な造血幹細胞のクローン原性を低減させずに、ＡＭＬ芽球のクローン原性を低減させる
５ＨＴＲ拮抗薬が大部分の未分化ＡＭＬ集団の細胞生存率を減少させないことを考慮して、処理に対するクローン原性を調べた。初代患者ＡＭＬ試料をアポモルヒネおよびメチオテピンの存在下で１８時間培養し、５万細胞／ｍＬの濃度で、系統誘導（instructive）サイトカインの存在下で、１４日間、半固体メチルセルロース培地に播種した。コロニーを、形態および細胞充実性に基づく光学顕微鏡法で計数した。図１０に示すように、両方の５ＨＴＲ拮抗薬が、得られるＣＦＵ−Ｂの数で測定される、初代ＡＭＬ試料のクローン原性を低減させた。

次に、系統枯渇臍帯血細胞を、ＡＭＬ細胞に対する上記の実行と同様に、アポモルヒネまたはメチオテピンで処理した。播種の１４日後、コロニーを形態および細胞充実性に基づく光学顕微鏡法で計数した。いずれの５ＨＴＲ拮抗薬も、コロニーの総数またはＣＦＵの各サブタイプの頻度によって測定される、健常な造血幹／前駆細胞のクローン原性に影響を与えなかった（図１１）。

実施例６：５ＨＴＲはＡＭＬ患者試料上で示差的に発現される
５ＨＴＲが、健常な血液試料と比較して、ＡＭＬ患者試料上で示差的に発現されるかどうかを決定するため、初代患者ＡＭＬ末梢血試料、健常ドナー末梢血試料およびＡＭＬ細胞株上でのそれらの発現をフローサイトメトリーで調べた。図１２に示すように、初代患者ＡＭＬ末梢血細胞は、健常ドナーと比較して、有意により高い含量で、５ＨＴＲを発現した。

実施例７：５ＨＴＲ発現はＡＭＬ患者の臨床成績と相関する
５ＨＴＲ１Ａおよび５ＨＴＲ１ＢのｍＲＮＡ発現レベルを初代患者ＡＭＬ試料において測定したところ、臨床成績と相関していた。２つの患者群を細胞遺伝学的リスクに基づいて定義した：良好（好ましい分子群）および不良（好ましくない分子群）。いずれの場合でも、各々の５ＨＴＲ ｍＲＮＡの高発現と臨床成績の悪化との間には関連性があった（図１３）。

実施例８：セロトニン受容体（５ＨＴＲ）拮抗薬は二次ＣＦＵにおけるＡＭＬ細胞のクローン原性を低減させる
クローン原性をインビトロでアッセイするために、等価な、アポモルヒネ処理、メチオテピン処理およびビヒクル処理したＡＭＬ患者由来初代ＣＦＵ−Ｂ（実施例５の説明の通り）を、５万細胞／ｍＬの濃度で、系統誘導サイトカインの存在下で、ただしいかなる薬剤も存在させずに、１４日間、半固体メチルセルロース培地中に、連続的に播種した。コロニーを形態および細胞充実性に基づく光学顕微鏡法で計数した。.図１４に示すように、クローン原性の低減が処理後に観察された。

実施例９：セロトニン受容体拮抗薬による処置は、健常な血液細胞には影響を与えずに、インビボ異種移植マウスモデルにおけるＡＭＬ負荷を低減させた
白血病細胞は骨髄ニッチに主に存在し、骨髄ニッチでは、間質細胞区画によって、白血病細胞の生存および増殖を強力に媒介し、白血病細胞をアポトーシス（）から保護するパラクリンシグナル伝達が提供される。従って、条件付けされた免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（Sanchez et al Leukemia. 2009 Nov;23(11):2109-17）に、ヒトＡＭＬ細胞を移植し、白血病を確立させるために７日間放置した。その後、マウスを、２日毎に、７日間、合計４回のアポモルヒネ（５ｍｇ／ｋｇ体重）（Schmidt et al J Neurosci. 1982 Mar;2(3):376-80）またはメチオテピン（０．１ｍｇ／ｋｇ体重）（Ginawi et al J Physiol Pharmacol. 2004 Jun;55(2):357-69）の腹腔内投与で処置した。両方の５ＨＴＲ１拮抗薬が、ビヒクル処置マウスと比較して、骨髄（ＢＭ）のＡＭＬ負荷における有意な低減をもたらした（図１５）。

白血病惹起細胞（ＬＩＣ）またはＬＳＣは、異種移植片マウスモデルにおけるＡＭＬ細胞の移植と関与しており、ヒトにおける前記疾患を惹起し維持すると考えられている。初代ＡＭＬ患者試料を、５ＨＴＲ拮抗薬で１８時間エキソビボ処理し、条件付けされた免疫不全ＮＳＧマウスに移植した。移植の８週間後、マウス骨髄をヒトＡＭＬ細胞の存在について分析した。図１６に示すように、アポモルヒネ処理ＡＭＬ細胞およびメチオテピン処理ＡＭＬ細胞は、ビヒクル処理ＡＭＬ細胞と比較して、より低いホーミング能および生着能を示した。興味深いことに、アポモルヒネおよびメチオテピンによる処理後の系統枯渇ＵＣＢ細胞の正常造血系再生能には、無視できる影響しか観察されなかった（図１６）。

移植された試料に残るインビボ自己複製能をアッセイするために、二次移植を行った。３５％未満のＡＭＬ細胞が、アポモルヒネ処理細胞またはメチオテピン処理細胞を注射されたマウスにおいて検出された（図１７）。しかし、健常な造血幹細胞は、二次移植におけるそれらの再生能によって示されるように、処理後にそれらの自己複製能および分化能を保持した（図１７）。さらに、移植試料のクローン原性は、ＣＦＵアッセイで測定された通り、５ＨＴＲ１拮抗薬で処理されたＡＭＬ細胞において有意に低減された。興味深いことに、移植された健常ＨＳＣにはわずかな影響しか観察されない（図１７）。

Claims (34)

1. 骨髄系の血液系悪性腫瘍の予防および／または治療で使用するための、１型５−ＨＴＲ阻害剤および２型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択されるセロトニン受容体（５−ＨＴＲ）阻害剤であって、１型５−ＨＴＲ阻害剤が１Ａ型５−ＨＴＲ阻害剤および１Ｂ型５−ＨＴＲ阻害剤から成る群から選択され、２型５−ＨＴＲ阻害剤がアポモルヒネ、アゴメラチン、アミトリプチリン、アセナピン、クロミプラミン、クロザピン、ジメボリン（Dimebolin）、エルトプラジン（Eltoprazine）、エトペリドン、フルオキセチン、ハロペリドール、イロペリドン、ケタンセリン、リスリド、メチセルジド、ミアンセリン、ミルタザピン、ネファゾドン、オランザピン、パロキセチン、クエチアピン、リスペリドン、リタンセリン、トラマドール、トラゾドン、ジプラシドン、ＳＢ−２４２０８４、およびＲＳ−１０２２２１からなる群から選択される２Ｃ型５−ＨＴＲ阻害剤である、前記セロトニン受容体（５−ＨＴＲ）阻害剤。
2. 前記阻害剤がアポモルヒネ、メチオテピン、アムペロジド、ＳＢ−２２４２８９およびその薬剤的に許容できる塩からなる群から選択される、請求項１に記載の用途のための５−ＨＴＲ阻害剤。
3. 前記阻害剤が１Ａ型５−ＨＴＲ阻害剤および１Ｂ型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択される１型５−ＨＴＲ阻害剤である、請求項１または２のいずれか一項に記載の用途のための５−ＨＴＲ阻害剤。
4. 血液系悪性腫瘍が白血病である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の用途のための５−ＨＴＲ阻害剤。
5. 白血病が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項４に記載の用途のための５−ＨＴＲ阻害剤。
6. 骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される試料中の血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞を同定するためのインビトロ法であって、前記細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現を検出することを含む、前記インビトロ法。
7. 対象において血液系悪性腫瘍を診断するためのインビトロ法であって、請求項６に記載の方法によって悪性細胞を同定することを含む、前記インビトロ法。
8. 骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される試料中の血液系悪性腫瘍由来の悪性細胞を単離するためのインビトロ法であって、前記細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現を検出し、前記５−ＨＴＲを発現する前記細胞を単離することを含む、前記インビトロ法。
9. １型５−ＨＴＲが５−ＨＴＲ １Ａであり、２型５−ＨＴＲが５−ＨＴＲ ２Ｃである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 血液系悪性腫瘍が白血病である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 白血病が急性骨髄性白血病である、請求項１０に記載の方法。
12. 血液試料が末梢血である、請求項６〜１１に記載の方法。
13. １型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現細胞が免疫細胞化学によって検出される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 血液系悪性腫瘍を患う対象の予後を判定するためのインビトロ法であって、
    （ａ） 骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定し、
    （ｂ） 前記レベルを基準値と比較すること、を含み、
    基準値に対する１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲの発現レベルの減少が、対象が良好な予後を示すことを示す、または
    基準値に対する１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲの発現レベルの増加が、対象が予後不良を示すことを示す、
    前記インビトロ法。
15. 血液系悪性腫瘍を患い、治療法による処置を受けている対象における、前記治療法の効果をモニターするためのインビトロ法であって、
    ａ） 骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定し、
    ｂ） 前記レベルを、より早い時点の前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルと比較すること、を含み
    より早い時点での前記対象由来の試料において決定されたレベルに対する、１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲの発現レベルの減少が、治療法が効果的であることを示す、または
    より早い時点での前記対象由来の試料において決定されたレベルに対する、１型５−ＨＴＲおよび／もしくは２型５−ＨＴＲの発現レベルの増加が、治療法が効果的でないことを示す、
    前記インビトロ法。
16. 血液系悪性腫瘍があると診断された対象のためのカスタマイズされた治療法を設計するためのインビトロ法であって、
    ａ） 骨髄、血液およびリンパ節からなる群から選択される前記対象由来の試料の細胞における１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルを決定し、
    ｂ） 前記レベルを基準値と比較すること、を含み、
    基準値に対する１型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現細胞のレベルの増加が、対象が１型５−ＨＴＲ阻害剤および／または２型５−ＨＴＲ阻害剤で治療されるべきであることを示す、
    前記インビトロ法。
17. ５−ＨＴＲ阻害剤がアポモルヒネ、メチオテピン、アムペロジドおよびその薬剤的に許容できる塩からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. １型５−ＨＴＲの発現レベルが決定される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. １型５−ＨＴＲが５−ＨＴＲ １Ａおよび５−ＨＴＲ １Ｂからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 血液系悪性腫瘍が白血病である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 白血病が急性骨髄性白血病である、請求項２０に記載の方法。
22. 血液試料が末梢血である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. １型５−ＨＴＲおよび／または２型５−ＨＴＲの発現レベルが、１型５−ＨＴＲ遺伝子および／もしくは２型５−ＨＴＲ遺伝子にコードされるｍＲＮＡのレベルを測定することによって、または１型５−ＨＴＲタンパク質および／もしくは２型５−ＨＴＲタンパク質、もしくはその変異体のレベルを測定することによって決定される、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. ｍＲＮＡ発現レベルがＰＣＲによって決定される、または、タンパク質もしくはその変異体の発現レベルがウェスタンブロットもしくは免疫細胞化学によって決定される、請求項２３に記載の方法。
25. 骨髄系の血液系悪性腫瘍の予防および／または治療のための薬剤の調製のための、１型５−ＨＴＲ阻害剤および２型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択されるセロトニン受容体（５−ＨＴＲ）阻害剤の用途であって、１型５−ＨＴＲ阻害剤が１Ａ型５−ＨＴＲ阻害剤および１Ｂ型５−ＨＴＲ阻害剤から成る群から選択され、２型５−ＨＴＲ阻害剤がアポモルヒネ、アゴメラチン、アミトリプチリン、アセナピン、クロミプラミン、クロザピン、ジメボリン、エルトプラジン、エトペリドン、フルオキセチン、ハロペリドール、イロペリドン、ケタンセリン、リスリド、メチセルジド、ミアンセリン、ミルタザピン、ネファゾドン、オランザピン、パロキセチン、クエチアピン、リスペリドン、リタンセリン、トラマドール、トラゾドン、ジプラシドン、ＳＢ−２４２０８４、およびＲＳ−１０２２２１からなる群から選択される２Ｃ型５−ＨＴＲ阻害剤である、前記用途。
26. ５−ＨＴＲ阻害剤がアポモルヒネ、メチオテピン、アムペロジド、ＳＢ−２２４２８９およびその薬剤的に許容できる塩からなる群から選択される、請求項２５に記載の用途。
27. 前記５−ＨＴＲ阻害剤が１Ａ型５−ＨＴＲ阻害剤および１Ｂ型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択される１型５−ＨＴＲ阻害剤である、請求項２５または２６のいずれか一項に記載の用途。
28. 血液系悪性腫瘍が白血病である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の用途。
29. 白血病が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項２８に記載の用途。
30. 骨髄系の血液系悪性腫瘍を予防および／または治療するための方法であって、１型５−ＨＴＲ阻害剤および２型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択されるセロトニン受容体（５−ＨＴＲ）阻害剤を、前記予防および／または治療を必要とする対象に投与することを含み、１型５−ＨＴＲ阻害剤が１Ａ型５−ＨＴＲ阻害剤および１Ｂ型５−ＨＴＲ阻害剤から成る群から選択され、２型５−ＨＴＲ阻害剤がアポモルヒネ、アゴメラチン、アミトリプチリン、アセナピン、クロミプラミン、クロザピン、ジメボリン、エルトプラジン、エトペリドン、フルオキセチン、ハロペリドール、イロペリドン、ケタンセリン、リスリド、メチセルジド、ミアンセリン、ミルタザピン、ネファゾドン、オランザピン、パロキセチン、クエチアピン、リスペリドン、リタンセリン、トラマドール、トラゾドン、ジプラシドン、ＳＢ−２４２０８４、およびＲＳ−１０２２２１からなる群から選択される２Ｃ型５−ＨＴＲ阻害剤である、前記方法。
31. ５−ＨＴＲ阻害剤がアポモルヒネ、メチオテピン、アムペロジド、ＳＢ−２２４２８９およびその薬剤的に許容できる塩からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記５−ＨＴＲ阻害剤が１Ａ型５−ＨＴＲ阻害剤および１Ｂ型５−ＨＴＲ阻害剤からなる群から選択される１型５−ＨＴＲ阻害剤である、請求項３０または３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 血液系悪性腫瘍が白血病である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 白血病が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項３３に記載の方法。