KR20040055311A - 악성혈액종양 진단용 칩 및 이를 이용한 예후판단 시스템 - Google Patents

악성혈액종양 진단용 칩 및 이를 이용한 예후판단 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 악성혈액종양 진단용 칩 및 이를 이용한 예후판단 시스템에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 악성혈액종양의 치료반응과 상관관계가 높은 유전자를 포함하는 악성혈액종양 진단용 칩 및 이를 이용한 예후판단 시스템에 관한 것이다. 본 발명에 의한 진단용 칩 및 예후판단 시스템은 임상결과를 미리 예측할 수 있어 악성혈액종양에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

악성혈액종양 진단용 칩 및 이를 이용한 예후판단 시스템{Gene chip for hematological malignancy diagnosis and system of prognostic judgment using the selected gene expression pattern}
본 발명은 악성혈액종양 진단용 칩 및 이를 이용한 예후판단 시스템에 관한것으로서, 보다 상세하게는 악성혈액종양의 치료반응과 상관관계가 높은 유전자를 포함하는 악성혈액종양 진단용 칩 및 이를 이용한 예후 판단시스템에 관한 것이다.
세포의 생리학적 또는 병리학적 기능 변화는 유전자 발현 양상의 변이(alternation)와 연관성을 갖는다. 예를 들면, 악성 종양은 암 유전자(oncogene)의 과발현과 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)의 발현 감소로 인하여 발달할 수 있다. 따라서, 유전자 발현 변이의 확인은 질병 관련 유전자를 탐색하기 위한 하나의 도구로서 활용되어 왔다. 차별적으로 발현하는 유전자들을 탐색하는 방법으로는 노던 블럿(northern blot)(Alwineet al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,74:5350-5354, 1977), S1 뉴클레아제 프로텍션 분석(S1 nuclease protection analysis)(Berket al.,Cell,12:721-732, 1977), DD법(differential display method)(Lianget al.,Science,257:967-971, 1992), cDNA 라이브러리의 염기 서열 분석(Adamset al.,Science,252:1651-1656, 1991; Okuboet al.,Nature Genet.,2:173-179, 1992), SAGE(serial analysis of gene expression)(Velculescuet al.,Science,270:484-487, 1995), RDA(representational difference analysis)(Hubanket al.,Nucleic Acids Res.,22:5640-5648, 1994; Lisitsynet al.,Science,259:946-951, 1993) 등이 있다. 그러나, 상기 방법들은 한 번의 실험으로 얻을 수 있는 데이터의 양에 한계가 있고, 많은 시간을 요구한다.
최근 30억 개의 염기서열을 분석한 인간 게놈 프로젝트가 완료된 후, 생체 내 많은 유전자의 기능을 효율적으로 해석하기 위한 대표적인 기술로서 DNA 칩(DNA 마이크로어레이라고도 함)이 대두되고 있다. 또한, 지금까지 밝혀진 암이나 기타 질병과 관련된 수백 개의 유전자 돌연변이도 계속 증가되고 있는 추세이기 때문에, DNA 칩의 중요성은 더욱 커지고 있는 실정이다. 급속히 발달한 DNA 칩 기술은 수많은 세포 전사체들의 발현 변이를 일시에 관찰할 수 있도록 해 주었다(Schenaet al.,Science,270:467-470, 1995; DeRisiet al.,Science, 278:680-686, 1997; Iyeret al.,Science,283:83-87, 1999). 이러한 DNA 칩은 유리판, 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane) 혹은 실리콘과 같은 작은 면적의 고체 표면에 타겟(target) DNA 또는 cDNA나 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probe)를 정해진 위치에 미세 집적시킨 것이다.
상기한 바와 같이 DNA 칩의 기술이 개발되어 수천 개의 유전자 발현수준이 동시에 모니터 될 수 있게 되었다. 그러나, 종양시료(관측)의 개수와 비교하여 관련 유전자(변수)의 개수가 상당히 많은 수로 존재하여 유전자 발현 정보의 구조가 프로세스 정보의 구조와 상이하고, 실험적인 인위적 구조로 인하여 DNA 칩의 정보의 질을 떨어트리는 많은 변수와 노이즈가 존재하기 때문에 DNA 칩에서 얻은 유전자 발현 정보로부터 유용한 정보를 얻는데는 많은 어려움이 있다. 이와 같은 단점을 극복하기 위하여, 21세기 들어서는 생물정보학(Bioinformatics)에 관한 연구가 활발히 진행되어, 관련성이 없는 유전자를 제거하여 생물학적 정보 손실을 최소화함으로써 만족스런 결과를 보였다는 여러 연구결과가 발표되고 있다(Golub, T. R.,et al.,Science,286:531-537, 1999; Alizadeh, A.A., et al.,Nature,403: 503-511, 2000; Okabe, H., et al.,Cancer Research,61:2129-2137, 2001; Alon, U,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci,96:6745-6750, 1999; Ben-Dor, A.,et al.,Proc. of RECOMB.,54-64, 2000).
상기와 같은 마이크로어레이 기술에 의해 대부분의 백혈병과 골수이형성증후군(myelodysplastic syndrome), 골수증식성질환(myelproliferative disorder), 림프종과 같은 혈액종양에 존재하는 임상적, 형태학적으로 구분되는 아형(subtype)을 식별하고 이 아형에 특이적인 유전자를 발견하는데, 획기적 혁명을 이루었다. 각각의 아형은 서로 다른 치료 방법들을 요구하기 때문에, 종양의 아형을 정확하게 식별하는 것이 성공적인 치료에 있어서 무엇보다 중요하다(Golub, T. R.,et al.,Science,286:531-537, 1999; Alizadeh, A.A., et al.,Nature,403:503-511, 2000). 다양한 분류방법 및 클러스터링 방법들이 종양의 아형을 분류하는데 성공적으로 적용될 수 있으며, 심지어 진단 목적으로도 사용될 수 있다는 사실이 많은 연구를 통하여 밝혀졌다(Scherf, U.,et al.,Nature Genetics.,24:236-244, 2000; Horimito, K., et al.,Bioinformatics,17:1143-1151, 2001; Cho, J.,et al.,Biotechanl. Prog., 18:847-854, 2002; Choi, S.,et al.,AIChE Annual Meeting, 2001; Lee, D.,et al.,AIChE Annual Meeting, 2001; Keller, A.D., et al.,Technical Report Univ. of Washington, 2000).
임상적 관점에서, 임상적 이종성에 대한 이유를 규명하고, 치료반응을 분석하는 것은 중요하다. 알리자데 등(Alizadeh, A.A., et al.,Nature,403: 503-511, 2000)은 임상적 이종성 행동양식의 원인을 관찰하고, 임상적 예후지표와 미만성 대형 B세포 림파종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)의 생존시간과의 연관성을 규명하였다. 비어 등(Van't Veer L.J., et al.,Nature,415:530-536, 2002)은 비감독 이차원 클러스터 분석법(unsupervised two-dimentional cluster analysis)을 사용하여 유방암의 임상결과를 예측하였다. 또한, 쉽 등(Shipp, M.A., et al.,Nature Medicine,8:68-74, 2002)은 정보를 가진 유전자를 보다 체계적으로 추출하였으며, 미만성 대형 B세포 림파종(DLBCL) 환자 정보에서 임상결과를 예견하는 단계를 취하였다. 그러나, 이 모든 연구들은 특정 약물에 대한 치료반응과 관련 유전자와의 연관성을 규명하지 못하였다.
본 발명자들은 특정약물로 동일한 치료를 했음에도 치료반응이 다른 악성혈액종양 환자들에게서 채취한 유전자를 마이크로어레이에 반응시켜, 주성분분석법 또는 판별 부분 최소자승법을 적용하여 유전자 발현패턴을 분석한 결과, 특정약물 치료에 성공한 경우와 실패한 경우에 각각 특이적으로 발현되는 유전자 패턴이 있음을 밝혀내어 특이적 유전자를 탐침 유전자로 하는 악성혈액종양 진단용 칩을 개발하고, 이를 이용한 악성혈액종양 예후판단 시스템을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 악성혈액종양의 치료반응에 특이적 유전자를 포함하는 탐침 유전자가 기판 상에 고정화되어져 있는 것을 특징으로 하는 악성혈액종양 진단용 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 진단용 칩을 이용하여 악성혈액종양 예후판단시스템을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 데이터 분석 과정을 도시한 개략도이다.
도 2는 급성골수백혈병(AML) 환자의 치료반응에 대한 행렬도 분석결과를 도시한 것이다.
도 3은 미만성 대형 B세포 림프종(DLBCL)의 치료반응에 특이적 유전자로 선별된 유전자에 대한 OSC-DPLS(Orthogonal Signal correction-Discriminant Partial Least Square) 모델에 의한 예측결과를 도시하였다.
도 4a 내지 도 4b는 미만성 대형 B세포 림프종(DLBCL) 환자의 행렬도의 스코어 플롯(score plot)과 로딩 플롯(loading plot)을 도시한 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 악성혈액종양의 치료반응에 특이적 유전자를 포함하는 탐침 유전자가 기판 상에 고정화된 것을 특징으로 하는 악성혈액종양 진단용 칩을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 진단용 칩을 이용하여 악성혈액종양 예후판단 시스템을 제공하는 것이다.
보다 구체적으로 본 발명은,
a) 피검체로부터 유전자 물질을 수집하는 단계;
b) 상기 유전자 물질을 악성혈액종양 진단용 칩에 적용시켜 발현패턴을 측정하는 단계;
c) 상기 측정된 유전자 발현패턴을 리브 원 아웃 T-검정 방법(leave-one-out T-test method)을 수행한 후 주성분분석방법(Principal component analysis, PCA)을 수행하여 분석하거나, 리브 원 아웃 VIP(leave-one-out VIP)를 수행한 후 직교신호수정(Orthogonal Signal Correction, OSC)을 포함하는 판별 부분 최소자승법(discriminant partial least square, DPLS)을 수행하여 유전자 발현패턴을 분석하는 단계; 및
d) 분석된 유전자 발현패턴을 데이터베이스에 축적되어 있는 유전자 발현패턴과 비교하여 악성혈액종양 예후판단 시스템을 제공한다.
본 발명에서 "탐침 유전자"란, 유전자칩의 기판 상에 고정화되는 유전자를 말하는 것으로서, 올리고뉴클레오티드, cDNA를 포함한다. 또한, 본 발명에서 "목적 유전자"란 피검체의 세포에서 추출한 유전자를 말하는 것으로, RNA 또는 RNA로 조제한 형광 표식 cDNA를 포함한다. 상기 목적 유전자는 탐침 유전자의 염기서열과 상보적인 서열을 갖고 있어 이들의 결합 정도로서 유전자의 발현량을 비교 분석할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
악성혈액종양은 백혈구계 또는 림프계에서 발생하는 악성종양으로 급성 및 만성 백혈병을 비롯하여 골수이형성증후군, 악성림프종, 호지킨씨병, 다발성골수종 및 골수증식성질환 등이 이에 포함된다. 본 발명에서 악성혈액종양 진단용 칩이라 함은 상기와 같은 질병의 치료반응에 특이적 유전자를 포함하는 탐침 유전자가 기판에 고정화되어 있는 진단용 칩을 말하는 것으로 cDNA칩 또는 올리고뉴클레오티드칩을 포함한다.
본 발명에서 악성혈액종양 중 급성골수백혈병(AML) 환자를 대상으로 하여 치료반응(치료에 성공 또는 실패한 경우)에 특이적으로 발현되는 하기 표 1a 및 1b에 기재된 유전자 20개를 선별하였고, 미만성 대형 B세포 림프종(DLBCL) 환자를 대상으로 하여 치료반응(치료에 성공 또는 실패한 경우)에 특이적으로 발현되는 하기 표 2a 및 2b에 기재된 유전자 35개를 선별하였다. 본 발명에서 상기 급성골수백혈병(AML) 치료반응에 특이적 유전자 또는 미만성 대형 B세포 림프종(DLBCL) 치료반응에 특이적 유전자를 탐침 유전자로 하거나, 상기 질병의 특이유전자 모두를 탐침 유전자로 하여 악성혈액종양 진단용 칩을 제작하였다.
상기 선별된 유전자를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로파이펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이어(microarrayer)를 이용하였다. 상기 진단용 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 사용하였다.
피검체의 세포로부터 분리한 목적 유전자를 본 발명에 의한 악성혈액종양 진단용 칩과 반응시켜 나온 데이터를 정확히 분석하기 위하여 본 발명에서는 종래에 사용되던 T-검정법 및 VIP(Variable importance to projection)을 새롭게 변형한 리브-원-아웃 T-검정방법(leave-one-out T-test method) 및 리브-원-아웃 VIP(leave-one-out Variable importance to projection)을 사용하여 유전자 발현 자료를 이용한 치료효능 분석을 위한 행렬도(biplot)를 작성하였다. 상기에서 VIP(Variable Importance to Projection)이라 함은 직교신호수정(Orthogonal Signal Correction, OSC)을 포함하는 판별 부분 최소자승법(discriminant partial least square, DPLS)을 수행하여 유전자 발현패턴을 분석하고 그 중에서 가장 영향도가 큰 유전자를 뽑아내는 방법(Cho J. H., et. al.,Biotechnology Progress,2002, 18(4): 847-854, 2002)을 말하는 것이다. 또한 상기 T-검정법은 두 집단의 평균치 차이가 표본오차에 의한 것인지, 두 집단의 속성에 의한 것인지를 밝히는 통계적 가설검정 기법이다.
행렬도(biplot)는 m-차원 변수 플롯과 n-차원 시료 정보의 상대적 위치 플롯을 동시에 제공한다. 이와 같은 형태의 플롯이 중첩될 경우, 이는 변수와 시료간의 연관성이 있음을 예상할 수 있게된다. 행렬도를 분석하는 방법으로는 다변량통계적 기법이 바람직하며, 주성분분석방법(PCA) 또는 판별 부분 최소자승법(DPLS)이 더 바람직하다. 도 1에서는 본 발명에서 사용된 데이터 분석과정을 도시하고 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 악성혈액종양 진단용 칩 및 이를 이용한 악성혈액종양 예후판단 시스템을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서는 다우노루비신(daunorubicin) 및 시타라빈(cytarabine)으로 치료를 받은 급성골수백혈병(AML) 환자 14명을 대상으로 환자의 예후에 영향을 가장 크게 미치는 유전자군을 선택하였다.
먼저 치료반응에 영향을 미치지 않는 일부 유전자를 제거시키기 위하여 리브-원-아웃 T-검정 방법(leave-one-out T-test method)을 수행하여, 음성 및 양성 각각 50개 유전자를 선택하였다. 즉, 14명 환자 샘플 중 첫 번째 환자 샘플을 제외한 나머지 13개의 샘플로 T-검정 방법을 이용하여 발현량에 차이가 나는 유전자를 선택한다. 그 다음에 두 번째 환자 샘플을 제외하고 나머지 13개의 샘플로 T-검정 방법을 다시 수행하여 발현량에 차이가 나는 유전자를 선택하였다. 이를 14번 반복하여 선택된 유전자 중에 p값이 0.05 미만(p<0.05)인 20개 유전자를 하기 표 1a 및 1b에 기재하였다. 20개 유전자에 대한 유전자 발현패턴을 분석하기 위하여 데이터를 분석하기 위하여 주성분분석법을 실시한 결과, 치료에 성공한 환자 및 실패한 환자 각각에게서 특이적 유전자가 발현되고 있음을 알 수 있었다(도 2). 도 2의 X축과 Y축은 각각 주성분 분석법을 통해 변이성을 가장 잘 설명하는 축을 순서대로 구한 것이고, 54%와 15.3%는 X축과 Y축 각각이 전체 데이터를 설명하는 정도를 의미하는 것이다.
상기 주성분 분석법(PCA)은 고차원(multi dimensional) 데이터를 각 변수들간의 상관관계를 이용하여 데이터의 차원을 축소(reduced)하는 방법이다. 상기 분석방법은 또한 일련의 연관된 변수들을 서로 상관관계가 없는 새로운 정보 세트로 변형시킨다. 상기 분석방법은 최초 변수의 공분산 행렬의 특이값 분해를 통해 산출될 수 있다. 주성분분석법(PCA) 알고리즘의 수식 모델에서 실제 데이터(original data)는 행렬(matrix)X로 표현될 수 있다.
상기 X 행렬은 변수영향을 나타내는 스코어 행렬(P) 및 X 변수를 요약하는 로딩 행렬(T)로 분해될 수 있다.
X^ = TP T
X=TP T+E
여기서, X의 차원은 (m,n), m은 변수, n은 샘플 데이터이다. E는 초기값과 산출값과의 편차, 즉 잔차 행렬을 나타낸다. 또한, 위첨자 T는 행렬호환 연산을 나타내며, X^는 X의 산출값을 나타낸다.
도 2에 나타나 있는 바와 같이, J04605, S67070, X74614, U10550, J04739 및 M93651은 서로 가깝게 위치하는데, 이는 그들이 대 양성 상관관계임을 나타내며, M37984, X96849 및 U56998과 음성적으로 상관되어 있음을 의미한다. 양성 수평선위에 위치한 F4 환자는 상기 여섯 유전자에 의해 한정된 방향에 가깝게 위치하고 있다. 이는 상기 F4 환자가 이와 같은 여섯개 변수의 평균 점수보다 높아야 하고, M37984, X96849 및 U56998의 평균 점수보다 낮아야 한다는 것을 의미한다. 또한, F4 환자는 S4 환자와 비교할 때, 유전자 발현시 정반대의 경향을 나타낸다. 상기 유전자 중 S67070 (HSP72)은 부저드 등(Buzzard, K. A., et al.,J. Biol. Chem.,273:17147-17153, 1998)이 스트레스-유도된 자살 경로를 조절하고 항-자살 유전자 부류로 분류될 수 있다는 사실을 제안한 바 있다. 또한 U56998 (PLK3/PRK)은 비스트 등(Wiest, J., et al.,Genes Chromosomes & Cancer,32:384-389, 2001)에 의해 폐암의 경우 유사분열의 개시 및 유사분열 진행에 있어서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀진 바 있다. 최근에는, U56998 (PLK3/PRK)가 세포주에서 과발현될 경우에 자살을 유도한다는 것이 알려졌으며, 또한 세포증식 및 종양성장에도 관련되어 있다고 알려졌다. 다케타니 등(Taketani, T., et al.,Genes Chromosomes & Cancer,34:437-443, 2002)은 AML 형태가 hoxa9 및 뉴클레오포린 nup98 유전자를 포함하는 염색체 전위 t(7;11)(p15;p15)에 특징이 있다는 것을 보고한 바 있다. U82759(HoxA9)는 Meis1와 함께 AML의 특정 아형(subset)에서 함께 활성화(Coactivation)되는 것으로 잘 알려져 있다(Afonja O., et. al.,leukemia research, 24: 849-855, 2000). 또한 도 2에 나타낸 바에 의하면, U82759(HoxA9)는 과발현되면 AML 치료가 실패할 가능성이 큰 것으로 나타났다(Afonja O., et. al.,leukemia research, 24: 849-855, 2000). 또한 AML 상태를 세포 특이적으로 조절할 수 있는 것으로 알려진 U95626(CCR2)가 과발현되면 AML의 치료가 실패할 가능성이 높은 것으로 분석되었다.
상기한 바와 같은 방법으로 급성골수백혈병(AML) 환자를 대상으로 하여 치료반응(치료에 성공 또는 실패한 경우)에 특이적으로 발현되는 것으로 선별된 하기 표 1a 및 1b에 기재된 유전자 20개를 탐침 유전자로 하여 악성혈액종양 진단용 칩을 제작하였다.
그리고 새로운 환자의 샘플을 채취하여 본 발명의 악성혈액종양진단용 칩에 적용시켜 유전자 발현패턴을 측정하여 리브 원 아웃 T-검정 방법(leave-one-out T-test method)을 수행한 후 주성분분석방법(Principal component analysis, PCA)을 수행하여 분석하였다. 분석된 유전자 발현패턴을 도 2에 도시된 행렬도(biplot)에 투영하여 환자 진단 및 사용 약제량의 과다 여부를 예측하였다. 즉, 새로운 환자 샘플에 상기 주성분의 로딩값(P)을 곱하면 새로운 환자가 X축의 왼쪽에 투영되느냐 오른쪽에 투영되느냐를 알 수 있다. 따라서, 이를 통해 환자 진단이 가능하며 사용 약제의 양이 과다 여부는 사용 약제와 관련된 유전자의 발현 패턴을 보고 결정할 수 있다.
따라서 본 발명은 세포발생학적 수준에서 임상결과-관련 유전자를 나타내고, 제안한 절차가 임상결과를 분석하고 치료 효능을 추정하는데 유용하게 사용될 수 있다.
치료반응군 유전자명 진뱅크 등록번호(GeneBankaccession number
치료가성공한 군 아폽토시스 단백질 1 mRNA의 억제자(Inhibitor of appotosis protein 1 mRNA(IAP1)) U45878
인간 아드레날 크렙-rp 호모로그 및 테나신-엑스 mRNA(Human adrenal Creb-rp homolog(Creb-rp), complete CDs, and tenascin-X(XB), partial cds) mRNA U52696
KIAA0169 단백질의 호모사피엔스 mRNA(Homo sapiens mRNA for KIAA0169 protein, partial cds) D79991
PIG-B의 호모사피엔스 mRNA(Homo sapiens mRNA for PIG-B, complete cds) D42138
KIAA0384 유전자의 인간 mRNA(Human mRNA for KIAA0384 gene, complete cds) AB002382
인간 프리-mRNA 스플라이싱 인자 SRp75 mRNA(Human pre-mRNA splicing factor SRp75 mRNA, complete cds) L14076
인간의 서근 골격근/심장근 트로포닌 C 유전자(Human slow twitch skeletal muscle/cardiac muscle troponin C gene, complete cds) M37984
PECAM-1 분자의 호모 사피엔스 5'mRNA(Homo sapiens 5' mRNA of PECAM-1 molecule) X96849
인간 퓨터티브 세린/트레오닌 단백질 키나제 PRK mRNA(Human putative serine/threonine protein kinase PRK mRNA, complete CDs) U56998
치료반응군 유전자명 진뱅크 등록번호(GeneBankaccession number
치료가실패한 군 ATP 신타제 B 사슬, 5'UTR의 인간 mRNA(Human mRNA for ATP synthase B chain, 5'UTR (sequence from the 5'cap to the start codon)) D28383
인간 프로리다제 mRNA(Human prolidase (imidodipeptidase) mRNA, complete cds) J04605
인간 BPI 단백질 mRNA(Human bactericidal permeability increasing protein mRNA, complete cds) J04739
열충격 단백질 HSP72 호모로그(Heat shock protein HSP72 homolog [human, thyroid associated ophthalmopathy patient, mRNA Partial, 450 nt]) S67070
인간 겜 GTPase mRNA(uman Gem GTPase (gem) mRNA, complete cds) U10550
인간 13kD 분화-관련 단백질 mRNA(Human 13kD differentiation-associated protein mRNA, partial cds) U34343
인간의 헌팅틴 관련 단백질(HIPI) mRNA(Human huntingtin interacting protein mRNA, complete cds) U79734
인간 호메오 도메인 단백질 HoxA9 mRNA(Human homeodomain protein HoxA9 mRNA, complete cds) U82759
호모 사피엔스 Homo sapiens ccr2b (ccr2), ccr2a (ccr2), ccr5 (ccr5) and ccr6 (ccr6) 유전자 및 락토페린 유전자(Homo sapiens ccr2b (ccr2), ccr2a (ccr2), ccr5 (ccr5) and ccr6 (ccr6) genes, complete cds, and lactoferrin (lactoferrin) gene, partial cds, complete sequence) U95626
외부 밀집된 섬유 단백질의 호모 사피엔스 ODF2 유전자(Homo sapiens ODF2(allele 2) gene for outer dense fiber protein) X74614
인간 셋트 유전자(Human set gene, complete cds) M93651
본 발명의 다른 실시예에서는 동일한 치료(CHOP : Cyclophosphamide, adriamycin, vincristine, predinisone)를 받은 미만성 대형 B세포 림프종(DLBCL) 환자 58명을 대상으로 이를 올리고뉴클레오티드 칩(Affymetrix 사)에 반응시켜 얻은 발현 데이터를 분석하였다. 먼저 치료반응에 영향을 미치지 않는 일부 유전자를 제거하기 위하여 리브-원-아웃 VIP(Cho. et al., Biotechnology Prog.,18:847-854, 2002)를 수행하였다. 즉, 58개의 환자 샘플 중 첫 번째 환자 샘플을 제외한 나머지 57개의 샘플로 VIP(variable Importance to projection) 방법을 이용하여 발현량에 차이가 나는 유전자를 선택한다. 그 다음에 두 번째 환자 샘플을 제외하고 나머지 57개의 샘플로 VIP(variable Importance to projection) 방법을 다시 수행하여 발현량에 차이가 나는 유전자를 선택하였다. 이를 58번 반복하여 VIP값이 1.2 이상(VIP≥1.2)인 유전자 35개를 선별하고, 이를 표 2a 및 2b에 나타냈다. 선택된 유전자에 대한 OSC-DPLS(Orthogonal Signal correction-Discriminant Partial Least Square) 모델에 의한 예측결과를 도 3에 도시하였다. 상기 리브-원-아웃 VIP(variable Importance to projection)은 유전자 사이들의 상관관계를 고려하여 약제 투여시 치료반응과 상관관계가 높은 유전자를 뽑아내는 방식이다.
상기 직교신호수정(Orthogonal Signal Correction, 직교신호수정)은 Y에 연관되지 않은 일부의 X를 Y에 대하여 직각이 되게 한 후 제거시켜 측정하는 것이다. 오직 변수의 개수가 관찰 개수보다 큰 경우에만 직교신호수정(OSC)이 유효하기 때문에, 상기 직교신호수정(OSC) 방법은 차원이 감소되는 정보에는 적용될 수 없다. 그러나, 상기 직교신호수정(OSC)은 정보의 부적절성 및 과적절성을 제거한다. 만일 분류의 로버스트성(robustness)이 매우 강조된다면, 직교신호수정(OSC)를 포함한 판별 부분 최소자승법(DPLS)은 중복되지 않으면서 만족한 분류결과를 제공할 것이다. 만일 너무 많은 직교신호수정(OSC) 구성요소가 채택되고 대부분의 X가 수정된다면, 부분 최소자승(PLS) 회귀는 차원감소효과를 제공하지 않는 다수의 선형회귀해법으로 종결될 것임을 주지하여야 한다. 월드 등(Wold, S., et al.,BChemom. Intell. Lab. Syst.,44:175-185, 1998)은 두 개 혹은 세 개의 직교신호수정(OSC) 구성요소가 직교신호수정(OSC)를 포함한 부분최소자승(PLS)의 사용에 적합하다고 제안하였다.
상기 판별 부분 최소자승법(Discriminant Partial Least Square, DPLS)은 유전자 발현 정보로부터 임상결과를 예견하기 위하여 정보를 가진 유전자를 추출하고, 조정공식(calibration equation)을 산출하는데 사용된다.
판별 부분 최소자승법(DPLS)은 일련의 국소 최소자승 적합 검정을 사용하여 예측변수(독립변수) 블록 X와 예측(종속변수) 블록 Y간의 관계를 모델링한다. 일반적인 부분 최소자승법(PLS) 방법과는 달리, 판별 부분 최소자승법(DPLS) 모델의 예측 블록 Y ∈ Rn×c는 객체의 계급 소속성에 관한 정보를 포함하도록 구성되어 있다.
Y 행렬에서 각각의 행(yT)은 하기의 구조를 가지고 있다. y ij 는 만일i번째 시료가j계급에 속하면 1이고, 기타의 경우에는 0이다. 여기서, y j 는 Y의j번째 열이고,j= 1,2,....., c 이다. 결론적으로, Y 행렬은 하기의 이진변수형태을 가진다.
Y = [y1y2.....yc] =
X와 Y 행렬은 크기가 자동조정 되어져야 한다(영점 평균 및 단위 분산). 예측변수 블록 X는 하기와 같이 점수행렬 T ∈ Rn×lv, 적재행렬 P ∈ Rm×lv, 및 잔차 행렬 E(X와 동일한 크기)로 분해되며, 여기서 PLS 모델의 순서를 결정하는lv는 잠재변수의 개수이다.
X = TPT+ E
Y = UQT+ F
비선형 반복 부분 최소자승(nonlinear iterative partial least square, NIPALS) 알고리즘(Chiang, L. H., et al.,Chemom. Intell. Lab. Syst.,2000, 50:234-252)을 사용하여, X 및 Y 분산값을 최대로 하는 회귀행렬 B가 수득될 수 있으며, 판별 부분 최소자승법(DPLS) 모델이 하기 공식으로 주어진다.
Y = TBQT+ F*
상기 식에서, F*은 자체의 노름(norm)값이 회귀행렬 B에 의해 최소화되는 예측 오류 행렬이다.
최종 판별 부분 최소자승법(DPLS) 모델이 예측에 사용될 경우, 추정된 Y^ 행렬은 Y와 동일한 구조를 가지지 않는다. 즉, Y^에서의 예측값은 이진수(0 및 1)가 아니고 실수이다. 이와 같은 실수값을 계급 지수로 전환시키는 방법이 문헌에 보고되어 있다(Chiang, L. H., et al.,Chemom. Intell. Lab. Syst.,50:234-252, 2000). 예측변수 블록(유전자)의 직교성이 판별 부분 최소자승법(DPLS) 방법의 장점이다. 판별 부분 최소자승법(DPLS) 모델링을 사용한 예측변수 블록의 직교변환은 각 유전자가 독립적이 되도록 하므로써, 유전자와 유전자간의 상호관계를 고려할 필요가 없다. 판별 부분 최소자승법(DPLS)는 부분 최소자승법(PLS) 회귀상의 변동이며, 경향분류에 회귀방법을 적용시킨 것을 의미한다는 것을 주지하여야 한다.
미만성 대형 B세포 림프종(DLBCL) 환자의 행렬도 분석결과를 도 4(a) 및 도 4(b)에 도시하였다. 도 4(a)는 스코어 플롯(score plot)이며, 도 4(b)는 로딩플롯(loading plot)이다. 상기 도 4(a)를 살펴보면, 일차 주 구성요소(X축)가 임상결과의 식별을 주관한다는 것을 알 수 있다. 제안된 방법은 쉽 등(Shipp, M.A., et al.,Nature Medicine,8:68-74, 2002)의 방법보다 우수한 성능과 향상된 시각효과를 제공한다. 즉, 쉽 등은 환자의 생사를 예측하기 위해 사용하는 분석방법 중 가장 진보적이라고 알려진 비선형성 방식인 SVM(Support Vector Machine)을 사용하여 분석한 결과, 75.9%의 예측률을 얻었다. 그러나 쉽 등의 방법은 사용된 약제와 유전자 사이의 관계를 규명하지는 못하였다.
본 발명에 의한 선형성 DPLS을 이용하여 분석한 결과 예측률이 84.5%로 쉽 등의 방법에 의한 것보다 예측률이 더 높아졌으며, 도 4(a) 및 4(b)에 나타낸 바와 같이 치료가 성공한 경우와 실패한 경우가 좌우로 나뉘어져 나타나 시각적 효과도 쉽 등의 방법보다 제고되었다.
임상결과 및 이와 관련된 유전자는 스코어 플롯(도 4(a))과 로딩 플롯(도 4(b)) 모두를 관찰하면 설명될 수 있다. 도 4(b)에서 M18255 및 L20971이 치료 불가능한 군에서 과발현되며, 반면에 M24736 및 Z30644는 치료 가능한 군에서 과발현된다는 사실을 알 수 있다. 카르복실에스터라제가 암호화하는 L07765는 비-호지킨 림파종 또는 B-세포 림파종과 연관될 수 있으며, 치료가능 군에서 과발현되며 치료불가능한 군에서는 과발현되지 않았다고 종래에 보고되었다(Komada F.,Cancer Res.51: 4271-4278, 1991). 모든 림프 백혈병 세포는 세포질 분획에서 Z15114(PKC-감마)를 발현하였지만, 이런 형태는 급성골수성백혈병(AML) 환자 수의 절반정도만이 세포에서 관찰되었다. 세포질 PKC-감마를 갖는급성골수성백혈병(AML)세포는 일반적으로 CD2, CD7, 및 CD19와 같은 림프표면항원을 발현한다. U48730(STAT5B)은 적혈구, 과립구, 대식세포 및 초기 혈액세포의 생산을 자극하는 전사 요소이다. 최근에 STATs에 의한 자살경로의 조절이 Bcl-xL, 카스파시스(caspases), Fax 및 TRAIL 등과 같은 세포사멸 과정을 매개하거나 유발시킬 뿐만 아니라, p21wafl과 같은 세포순환 진행을 조절하는 단백질을 암호화하는 유전자의 전사 활성화에 크게 기인한다는 것이 증명되고 있다(Battle, T. E., et al.,Curr. Mol. Med.,2002, 2:381-392, 2002). 쉽 등(Shipp, M.A., et al.,Nature Medicine,8:68-74, 2002)은 L20971(PDE4B), M18255(PKC-β 단백질) 및 U12767(MINOR)이 임상결과와 밀접하게 연관되어 있다고 보고한 바 있으며, 동일한 결과가 본 발명의 행렬도 분석을 통하여도 도출되었다. 따라서 본 발명에 의한 시스템이 기존의 연구 보다 강력한 계급 예측능력 및 치료 지침을 부여함을 알 수 있다.
도 4(b)에 나타난 바와 같이, 치료에 실패한 군에서 U46744(dystrobrevin gene)가 상대적으로 과발현되는 경향을 보여주고 있다. U46744(dystrobrevin gene)는 인터메디에이트 필라멘트(intermediate filament)와 관련되어 있다고 알려져 있어서, DLBCL 환자에게 투여된 약제 중 빈크리스틴(Vincristine)의 마이크로튜블 억제(Microtubule inhibitor) 작용에 의해서 치료 실패를 유발하는 것이 아닌가 생각된다. 즉, 빈크리스틴(Vincristine)에 의한 마이크로튜블 억제(Microtubule inhibitor)작용이 U46744(dystrobrevin gene)의 인터메디에이트 필라멘트(intermediate filament)의 작용에 영향을 미쳐,디스트로브레빈(dystrobrevin)의 작용으로 알려진 세포 영양장애(Cellular dystrophy)에 영향을 많이 미쳐 치료반응을 실패로 유발하는 것으로 생각된다.
또한 L28175(prostaglandin E receptor 4)는 또 다른 DLBCL에 사용되는 약제인 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)에 의해 발현이 증가되는데, 이 유전자의 증가된 발현은 면역억제작용(immunosupression)을 일으키는 것으로 알려져 있다(Higaki S., et. al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 43(6):1862-9, 2002). L28175(prostaglandin E receptor 4)이 과발현되면, 면역억제작용(immunosupression)이 과다하게 되어 치료반응이 실패로 유발되는 것으로 추정된다. 한편, J03242(IGF2 Insulin-like growth factor 2)의 경우 치료가 성공한 군에서 과발현된다. 이는 DLBCL에 병용 투여되는 약제인 프레드니손(prednisone)에 의해서 증가되는 글루코코르티코이드 반응요소(Glucocorticoid responsive element(GRE)) 중 하나인 IGF 1(Insulin-like growth factor binding protein 1)과 함께 작용하여 IGF(Insuline-like growth factor) 활성을 증가하게 하여 치료반응을 성공하게 유도하는 것을 추정할 수 있다. 또한 이는 세포성 IGF(cellular IGF) 활성이 DLBCL에서의 치료 성공의 경향성을 표현해주는 인자가 될 수 있다고 추정해 볼 수 있게 해준다.
따라서, 본 발명에 의한 방법으로 환자의 사망률(mortality)과 약제 그리고 결정적인 영향성을 가진 유전자 그리고 이들 유전자의 기능성이 체계적으로 규명해 나간다면 더욱 축적된 다양한 환자에서의 이들 유전자 발현의 체계적 분석을 통해 보다 나은 DLBCL 치료법의 모색이 가능할 수 있을 것으로 보인다. 상기한 바와 같이, 종래와는 달리 본 발명에 의한 방법에서는 유전자와 사용된 약제와의 관계를 맺을 수 있게 되었다.
상기한 바와 같은 방법으로 미만성 대형 B세포 림프종(DLBCL) 환자를 대상으로 하여 치료반응(치료에 성공 또는 실패한 경우)에 특이적 발현되는 것으로 선별된 하기 표 2a 및 2b에 기재된 유전자 35개를 탐침 유전자로 하여 악성혈액종양 진단용 칩을 제작하였다.
그리고 새로운 환자의 샘플을 채취하여 본 발명의 악성혈액종양진단용 칩에 적용시켜 유전자 발현패턴을 측정하여 리브 원 아웃 VIP(variable Importance to projection)을 수행한 후 직교신호수정(Orthogonal Signal Correction, OSC)을 포함하는 판별 부분 최소자승법(discriminant partial least square, DPLS)을 수행하여 유전자 발현패턴을 분석하였다. 분석된 유전자 발현패턴을 도 4a 및 4b에 도시된 행렬도(biplot)에 투영하여 환자 진단 및 사용 약제량의 과다 여부를 예측하였다. 예컨대, 상기한 바와 같이 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)에 의해 발현이 증가되는 L28175(prostaglandin E receptor 4)를 투여한 후 도 4b의 행렬도에 투영하여 치료에 실패한 군으로 투영되었다면 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)가 과다 투여되었음을 확인할 수 있다.
치료반응군 유전자명 진뱅크 등록번호(GenebankAccession number)
치료가 성공한 군 인간 하이알우로난 신타제 3 유전자(Human hyaluronan synthase 3 (HAS3) gene, partial cds) U86409
3'UTR 미지 단백질의 호모 사피엔스 mRNA(H.sapiens mRNA for 3'UTR of unknown protein) Y09836
5-HT2B 세로토닌 리셉터의 호모 사피엔스 mRNA(H.sapiens mRNA for 5-HT2B serotonin receptor) X77307
키나제 C 감마 단백질의 호모 사피엔스 mRNA(H.sapiens mRNA for protein kinase C gamma (partial)) Z15114
호모 사피엔스 시토플라스믹 안티프로테나제 2 mRNA(Homo sapiens cytoplasmic antiproteinase 2 (CAP2) mRNA, complete cds) L40377
구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질-유사물 1과 유사한 호모사피엔스 mRNA; HSR1 GTP-결합단백질, mRNA(Homo sapiens similar to guanine nucleotide binding protein-like 1; HSR1 GTP-binding protein (LOC257541), mRNA) XM_175175
액소네말 다이네인 중사슬의 호모 사피엔스 mRNA(H.sapiens mRNA for axonemal dynein heavy chain(partial, ID hdhc3)) Z83802
KIAA0278 유전자의 호모 사피엔스 mRNA(Human mRNA for KIAA0278 gene, partial cds) D87468
인간 카르복실에스테라제 mRNA(Human carboxylesterase mRNA, complete cds) L07765
염소 채널(퓨터티브)의 호모 사피엔스 mRNA(H.sapiens mRNA for chloride channel (putative) 2163bp) Z30644
인간 인슐린-유사 성장인자 Ⅱ mRNA(Human insulin-lke growth factor II mRNA, complete cds) J03242
인간 내피 백혈구 접착 분자 1 mRNA(Human endothelial leukocyte adhesion molecule 1 (ELAM-1) mRNA, complete cds) M24736
고아 핵수용체를 유도하는 인간 마이토겐 mRNA(Human mitogen induced nuclear orphan receptor (MINOR) mRNA, complete cds) U12767
치료가 실패한 군 7q21-q22로부터 분리된 인간 BAC 클론 GS1-244B22 (Human BAC clone GS1-244B22 from 7q21-q22, complete sequence) AC002450
KIAA0204 유전자의 인간 mRNA(Human mRNA for KIAA0204 gene, complete cds) D86959
KIAA0215 유전자의 인간 mRNA(Human mRNA for KIAA0215 gene, complete cds) D86969
리보좀 단백질 L14의 호모 사피엔스 mRNA(Homo sapiens mRNA for ribosomal protein L14, complete cds) D87735
치료반응군 유전자명 진뱅크 등록번호(GenebankAccession number)
치료가 실패한 군 Src-유사 어뎁터 단백질의 호모 사피엔스 mRNA(Homo sapiens mRNA for Src-like adapter protein, complete cds) D89077
호모 사피엔스 트롬보스폰딘 2 mRNA(Homo sapiens thrombospondin 2(THBS2) mRNA, complete cds) NM_003247
인간 포스포디에스테라제 mRNA(Human phosphodiesterase mRNA, complete CDs) L20971
호모 사피엔스 프로스타글란딘 E2 리셉터 EP2 서브유닛 mRNA(Homo sapiens prostaglandin E2 receptor EP2 subtype mRNA, complete cds) L28175
인간 DNA 리가제 Ⅰ mRNA(Human DNA ligase I mRNA, complete cds) M36067
인간 글루코즈 트랜스포트-유사물 5 mRNA(Human glucose transport-like 5 (GLUT5) mRNA, complete cds) M55531
인간 p190-B mRNA(Human p190-B (p190-B) mRNA, complete cds) U17032
인간 msg1-관련 유전자 1(Human msg1-related gene 1 (mrg1) mRNA, complete cds) U65093
3p21.3로부터 분리한 호모 사피엔스 코스미드 클론 LUCA14(Homo sapiens cosmid clone LUCA14 from 3p21.3, complete sequence) U73167
인간 클론 23799 mRNA 서열(Human clone 23799 mRNA sequence) U79246
호모 사피엔스 p120E4F 전사인자 mRNA(Homo sapiens p120E4F transcription factor mRNA, complete cds) U87269
인간 WD 반복 단백질 HAN 11 mRNA(Human WD repeat protein HAN11 mRNA, complete cds) U94747
TGIF 단백질의 호모 사피엔스 mRNA(H.sapiens mRNA for TGIF protein) X89750
인간의 키나제 C 베타 2 유전자(Human protein kinase C beta 2 gene, last exon) M18255
P/Q-형 칼슘 채널 알파 서브유닛의 호모 사피엔스 mRNA(H.sapiens mRNA for P/Q-type calcium channel alpha1 subunit) X99897
인간 트랜스듀신-유사 인핸서 단백질 mRNA(Human transducin-like enhancer protein (TLE1) mRNA, complet) M99435
인간 디스트로브레빈-알파 mRNA(Human dystrobrevin-alpha mRNA, complete cds) U46744
호모 사피엔스 전사 인자 Stat5b mRNA(Homo sapiens transcription factor Stat5b (stat5b) mRNA, complete cds) U48730
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 악성혈액종양 진단용 칩은 악성혈액종양의 치료반응에 특이적인 유전자의 발현분석을 통하여 상관관계가 높은 것으로 선별된 유전자가 포함하도록 제작되어 악성혈액종양 진단을 빠르고 정확하게 할 수 있다. 또한 본 발명에 의한 진단용 칩을 이용하여 발현패턴을 분석함으로써 악성혈액종양 환자들의 치료결과를 미리 예측할 수 있어 악성혈액종양 치료에 유용하게 이용될 수 있으며, 신약개발에도 이용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 진뱅크 등록번호(Gene bank Accession Number)가 U45878, U52696, D79991, D42138, AB002382, L14076, M37984, X96849, U56998, D28383, J04605, J04739, S67070, U10550, U34343, U79734, U82759, U95626, X74614, M93651인 유전자를 포함하는 탐침 유전자가 기판 상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 악성혈액종양 진단용 칩.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 악성혈액종양은 급성골수백혈병(Acute Myeloid Leukemia, AML)인 것을 특징으로 하는 악성혈액종양 진단용 칩.
  3. 진뱅크 등록번호(Gene bank Accession Number)가 U86409, Y09836, X77307, Z15114, L40377, XM_175175, Z83802, D87468, L07765, Z30644, J03242, M24736, U12767, AC002450, D86959, D86969, D87735, D89077, NM_003247, L20971, L28175, M36067, M55531, U17032, U65093, U73167, U79246, U87269, U94747, X89750, M18255, X99897, M99435, U46744, U48730인 유전자를 포함하는 탐침 유전자가 기판 상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 악성혈액종양 진단용 칩.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 악성혈액종양은 미만성 대형 B세포 림프종(Diffuse Large B-cell Lymphoma, DLBCL)인 것을 특징으로 하는 악성혈액종양 진단용 칩.
  5. 제 1항 또는 제3항에 있어서, 상기 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것을 특징으로 하는 악성혈액종양 진단용 칩.
  6. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 악성혈액종양 진단용 칩.
  7. a) 피검체로부터 유전자 물질을 수집하는 단계;
    b) 상기 유전자 물질을 악성혈액종양 진단용 칩에 적용시켜 발현패턴을 측정하는 단계;
    c) 상기 측정된 유전자 발현패턴을 리브 원 아웃 T-검정 방법(leave-one-out T-test method)을 수행한 후 주성분분석방법(Principal component analysis, PCA)을 수행하여 분석하거나, 리브 원 아웃 VIP(leave-one-out VIP)를 수행한 후 직교신호수정(Orthogonal Signal Correction, OSC)을 포함하는 판별 부분 최소자승법(discriminant partial least square, DPLS)을 수행하여 유전자 발현패턴을 분석하는 단계; 및
    d) 분석된 유전자 발현패턴을 데이터베이스에 축적되어 있는 유전자 발현패턴과 비교하여 악성혈액종양 예후판단 시스템.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 b)단계의 혈액 악성종양 진단용 칩은 제1항 또는 제3항의 진단용 칩인 것을 특징으로 하는 악성혈액종양 예후판단 시스템.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 d)단계의 데이터베이스에 축적되어 있는 유전자 발현패턴은 동일한 치료를 한 환자를 피검체로 하여 상기 a) 내지 c)단계를 수행함으로써 치료에 성공한 환자의 유전자 발현패턴과 치료에 실패한 환자의 유전자 발현패턴을 분석하여 축적한 것을 특징으로 하는 악성혈액 종양 예후판단 시스템.
KR1020020081955A 2002-12-20 2002-12-20 악성혈액종양 진단용 칩 및 이를 이용한 예후판단 시스템 KR20040055311A (ko)

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KR1020020081955A KR20040055311A (ko) 2002-12-20 2002-12-20 악성혈액종양 진단용 칩 및 이를 이용한 예후판단 시스템

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