JP2017524137A - 非侵襲性体液ストレスセンシング - Google Patents
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Abstract
選択された体液生体分子レベルのための電気化学インピーダンスに基づく無標識でかつ迅速なバイオセンサ。コルチゾール等の生体分子に対するモノクローナル抗体を、ゼロ長架橋剤N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N−エチルカルボジイミドおよび10mMのN−ヒドロキシスルホスクシンイミドを用いて16−メルカプトヘキサデカン酸官能化金作用電極に共有結合させた。単純なフェロシアン化物試薬を用いてリン酸緩衝生理食塩水(疑似涙液)中で18.73pMの検出下限値と10%未満の相対標準偏差でコルチゾールを検出した。【選択図】 図2
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2014年8月13日に出願された、米国仮特許出願第62/037,006号、および2015年1月8日に出願された、米国仮特許出願第62/101,143号の利益を主張し、それらの全体が記載されているかのように参照により本明細書に援用される。
本出願は、2014年8月13日に出願された、米国仮特許出願第62/037,006号、および2015年1月8日に出願された、米国仮特許出願第62/101,143号の利益を主張し、それらの全体が記載されているかのように参照により本明細書に援用される。
本開示は電気化学的検知の分野に関する。
過去40年間で、慢性ストレスは幅広く多様化する人類の最も致命的で生活を変える疾患との関連性がますます深まってきている。これらには、糖尿病、アルツハイマー病、心臓発作、うつ病、骨粗しょう症、および免疫抑制のような重篤な状態だけでなく、一般的な風邪、腰痛、さらには勃起不全のような致命的ではないがそれでも好ましくない問題が含まれる。実際、科学文献には、ストレスが遺伝学や喫煙等の行動的要因よりも先進国の平均寿命に影響を与えることが示されている。
世界的に人間の生命と健康に対するストレスの多大な影響を考えると、人口規模で広範囲にストレスを測定しそして治療を行うことには大いなる可能性がある。ストレスはしばしば主観的な感情状態として述べられるが、医学的には、重要な生化学的および生理学的効果をもたらす。定量化できるこれらの効果としては、グルココルチコイドおよびカテコールアミンを含む特定ホルモンの群のレベル上昇等がある。しかしながら、これらのホルモンの生理的濃度は、上昇したとしても、多くの場合、涙、唾液および血清中で非常に低く(それぞれ38.9±15.5、46.3±16.0、および489.7±177.4nM)、正確な測定は継続的な技術的難題となっている。
マイクロ流体涙液捕捉システムを使用した改良電気化学センサが、ストレスおよび/またはトラウマに関連する生体分子、例えばコルチゾールを検出するために作製されている。また、他の体液、例えば唾液または血液を利用する可能性もある。
一実施形態において、モノクローナル抗体を、ゼロ長架橋剤N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N−エチルカルボジイミドおよび10mMのN−ヒドロキシスルホスクシンイミドを用いて、16−メルカプトヘキサデカン酸官能化金作用電極に共有結合させた。コルチゾールを単純なフェロシアン化物試薬を使用してリン酸緩衝生理食塩水(疑似涙液)中で18.73pMの検出下限値と10%未満の相対標準偏差で検出した。本明細書に提示するコルチゾール分析は、涙コルチゾール測定に関して十分以上の感度を備え無標識でかつ迅速な応答構成において高度な再現性でかつ超低レベルでの検出を維持する。
本明細書に開示された実施形態のこれらのおよび他の態様は、以下の詳細な説明および図面を参照することにより明らかになる。
図3Bは、1.184Hzでのインピーダンスを使用し、生理的な範囲にわたってかつセンサのダイナミックレンジ(n=3)を超えて示すPBS中のコルチゾールの濃度に対してプロットした。31.672オーム/pg/mLの傾きが0.9532のR2および最高濃度分散で10%のRSDで観察される。
血液は歴史的に標準的な診断試験流体であったが、近年、涙液が三つの主要な理由により、強力な検知媒体として注目を集めている。第一に、涙液膜は膨大な数のバイオマーカーを含んでいる。第二に、患者から血液を取得することに比べ涙液を取得することは比較的容易であるため、涙液は診断試験において血液に代わる理想的な代替物となっている。最後に、涙液は、唾液のように、血液よりもはるかに組成が単純であり、電気化学センシングに干渉する可能性があるタンパク質の含有が少ない。
涙を使用するいくつかの欠点はある(例えば、利用可能な量と標的濃度は血液のそれらよりもはるかに少なく低い)が、これらの問題よりも簡単かつ低侵襲性のサンプリングと非標的物質由来のバックグラウンド干渉が少ない優れたセンサ性能という利点が上回るため、涙液膜はストレス・センサのための理想的な診断流体であることが証明され、と同時に涙液膜は測定可能なレベルのコルチゾールを含有している。
したがって、本明細書の開示の一態様では、その実施形態が図1A〜Bに示されている、スクリーン印刷電極が、試料を試薬に導く新規なマイクロ流体捕捉システムを介して涙試料を捕捉し、前記センサのメソポーラスカーボン・インク自体にカプセル化されたコルチゾール(または涙中に見出される他のストレスマーカー)用の1つまたは複数の分子認識部が、ケア/傷害の時点で利用することができる、迅速、無標識かつ多重化可能な電気化学インピーダンス分光法(MEIS)を用いて開発された。前記分子認識部は1つまたは複数の抗体、アプタマー、ペプチド、合成抗体(synbodies)、核酸、触手プローブ、タンパク質等を含みうる。また、メソポーラスカーボン・インクは干渉物をブロックし、優れた試験結果をもたらすことが見出された。
ストレスはしばしば主観的な感情状態として述べられるが、人間の健康に劇的な影響を与える重要な生化学的および生理学的効果を有することが示されている。したがって、生化学的マーカーの検知によるストレスレベルの監視は、ストレス管理に劇的に影響する可能性がある。電気化学インピーダンス分光法(EIS)は、全細胞、タンパク質バイオマーカー、および小分子標的を含む、標的の種々の非常に低い濃度の無標識検出に成功している検知方法の1つである。他の電気化学的方法と比較して、EISには速度(1測定当たり90秒)、簡便性(「サンドイッチ」分析で用いられるような標識を要件としない)および感度(多くの他の方法の検出限界未満のピコモル濃度の標的の検出)を含む利点がある。この無標識の検知可能性と超低検出限界により、EISは涙中のコルチゾールのための理想的な検知機構となる。
実施例1
標準的な三電極系をインピーダンス分光測定のために使用した。前記系はAg/AgCl参照電極(CH Instruments、テキサス州オースティン)、金ディスク作用電極(GDE)(CH Instruments、テキサス州オースティン)、および白金対向電極(CH Instruments、テキサス州オースティン)から構成され、前記試料溶液中のコルチゾールを検出するために前記作用電極の表面に共有結合した抗コルチゾール抗体(シグマ アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)を伴う。1000μL容ピペットチップ(VWRインターナショナル、ペンシルバニア州ラドナー)はその先端が剃刀で切り取られ、前記GDEを覆ってしっかりと装着され、約0.2mLの試料液を保持することができるプラスチック製の「ウェル」が作製された。この系の図を図1に示す。
標準的な三電極系をインピーダンス分光測定のために使用した。前記系はAg/AgCl参照電極(CH Instruments、テキサス州オースティン)、金ディスク作用電極(GDE)(CH Instruments、テキサス州オースティン)、および白金対向電極(CH Instruments、テキサス州オースティン)から構成され、前記試料溶液中のコルチゾールを検出するために前記作用電極の表面に共有結合した抗コルチゾール抗体(シグマ アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)を伴う。1000μL容ピペットチップ(VWRインターナショナル、ペンシルバニア州ラドナー)はその先端が剃刀で切り取られ、前記GDEを覆ってしっかりと装着され、約0.2mLの試料液を保持することができるプラスチック製の「ウェル」が作製された。この系の図を図1に示す。
特に記述がない限り、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(EMD Biosciences、カリフォルニア州ラホヤ)を、すべての溶液を作製するために使用した。前記金ディスク電極(GDE)の表面に抗コルチゾール抗体を固定するために、先ず前記GDEを3μmの酸化アルミニウム粒(CH Instruments、テキサス州オースティン)上で120回八字旋回させてウェット研磨し、蒸留水ですすいだ。次いで、前記した120回の八字旋回研磨を1μm粒で、その後に0.05μm粒(CH Instruments、テキサス州オースティン)で繰り返し、その後前記GDEを蒸留水中で20分間超音波洗浄した。次いで、試薬等級エタノール中1mMの16−メルカプトヘキサデカン酸(16−MHDA)(シグマ アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)の溶液100μLを前記センシング・ウェルに入れ、室温で1時間パラフィルムを用いて密封した。次に、前記GDEおよびセンシング・ウェルの表面と側面を注意深く蒸留水ですすいだ。対照EIS測定をPBS緩衝液中の100mMのフェロシアン化カリウム(シグマ アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)の「酸化還元プローブ」を用いて16−MHDA官能化GDE上で行い、各GDEに適切かつ同量のMHDAが固定されていることを確認した。これは、相互に比較するために、個々のGDEのそれぞれのインピーダンス応答を分析することによって決定した。
次いで、40mMのN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N−エチルカルボジイミド(EDC)(ピアース・バイオテクノロジー)と10mMのN−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)(VWR International)を含有するPBS溶液の100μLを前記センシング・ウェルに入れた。室温での1時間のインキュベーションの後、前記電極をPBS緩衝液ですすいだ。次に、PBS緩衝液中の抗コルチゾールIgG(アルドリッチ)の10μg/ml溶液の100μL液滴を前記電極に配置し、1時間室温で放置し、その後PBS緩衝液で洗い流した。最後に、蒸留水中の1mMのエタノールアミン(シグマ アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)の100μLを前記センシング・ウェルに加え、室温で30分間インキュベートして、16−MHDAおよびEDC/NHSのすべての未反応のカルボキシル基をブロックした。次に、前記電極をPBS緩衝液で注意深くすすぎ、使用するまで4℃でPBS中に保存した。
電気化学的インピーダンス測定はCHI660C Electrochemical Workstation(CH Instruments、テキサス州ヒューストン)を用いて行った。0〜10,000pg/mL(0〜27.59nM)のコルチゾール(シグマ アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)試料濃度を酸化還元プローブ溶液で作製し、使用するまで4℃で保存した。その後、コルチゾールの各濃度をそれぞれの前記抗体固定化電極で測定した。
各測定のために、100μLのコルチゾールと酸化還元プローブの溶液を前記抗体固定化GDEの前記センシング・ウェルに入れた。前記試料に印加された交流電位の振幅は、酸化還元プローブを用いる裸(固定化前の)電極上のCV実行によって決定した、150mVの式量電位(DCオフセット)で5mVであった。交流電圧を90秒のスキャン中に1〜100,000Hzの周波数の範囲で印加し、インピーダンスの大きさと位相をその試料の各周波数で記録した。実数および虚数のインピーダンスを各試料に関して算出し、ナイキスト線図を描いた。各測定後、次の試料を添加する前に、前記のGDEとセンシング・ウェルをPBSで十分にすすいだ。
試験した各交流周波数での各電極について、各コルチゾール濃度でのインピーダンスの大きさは、対数(濃度)に対して、算出された傾きおよびR2と相関関係があった。高い傾きとR2の最高のバランスをもたらす周波数を見つけるためにインピーダンスの傾きとR2値を周波数に対してそれぞれプロットした。次いで、この「最適な」周波数で測定されたインピーダンス値を使って、コルチゾール濃度をインピーダンスから推定できる最終的な濃度勾配をえた。
裸電極、抗体固定化電極、およびバイオマーカー(コルチゾール)が結合した電極のACスイープにより、ナイキスト線図をえた。一つの代表的な電極に結合するコルチゾールの9つの異なる濃度のナイキスト線図を図2に示す。試料のコルチゾール濃度が増加するにつれて、より多くのコルチゾールが前記電極表面上の前記抗体に結合するため、すべての周波数でインピーダンスの大きさが増大し、前記ナイキスト線図は原点からより遠ざかる。
予想されたように、インビトロ、従って前記抗体に結合したバイオマーカーの濃度が増加する場合、前記系によって測定されるインピーダンス(従って信号)も同様に増加した。
インピーダンス対標的濃度の相関プロットの傾きとR2は交流電位周波数の関数として変化する。一つの代表的な電極を図3aに示す。低い比例的誤差で測定することがより容易である、より大きな信号サイズ(異なるコルチゾール濃度間のインピーダンス値におけるより大きな差)に対応するため、より大きな傾きが望ましい。測定によってもたらされるコルチゾール濃度の推定値で高精度を示すため、より大きなR2が望ましい。図3aにおいて、R2は100Hz未満の周波数範囲で非常に高いが、傾きは非常に低い周波数で最も優れており(最大であり)、周波数が増加するにつれて急速に低下することが理解できる。試験した全ての電極に関して、傾きを最大にする最適な周波数は1.18Hzであることが見出された。したがって、これは、コルチゾールと抗体の相互作用をEISによって最も効果的に検出する推定最適周波数である。
この周波数(1.18Hz)で、インピーダンスのデータを複数のセンサに関して蓄積し、対応する濃度に対してプロットして図3bに示すインピーダンス勾配を作成した。この勾配により、涙液中コルチゾールの極めて低い濃度を検出する際のこの方法の申し分のない正確さが示される。検出下限値(LLD)の標準的な分析定義、すなわち標準偏差で割った傾きの3.3倍から、6.79pg/mL(18.73pM)のLLDが試料あたり90秒未満の検出時間で定量された。これにより、任意の濃度でセンサ分散に対して<10%センサでかつ高精度に測定された涙コルチゾールのレベルが明確に確認される。
18.73pMのLLDは涙における約40nMの通常のコルチゾール濃度範囲を完全に3桁下回る大きさであり、一見すると涙検知適用のための感度には非常に過剰レベルであるように思われる。しかしながら、実際には、この超高感度検出はまさに、このコルチゾール分析を実験室から物理的な現実世界のセンサ装置に置き換えうるのには必要とされるものである。再現可能で信頼性のあるセンサは、電気化学的分析だけでなく、物理的装置の実装においても、低分散が必要とされる。収集される涙液はほんの少量であるため、涙試料の大きさは体積で10μLを超えることはほとんどなく、その体積の一部は必然的にサンプリング系の壁に付着することによって、又は、前記試料を眼の表面から検知電極へ移動させるために必要な他の流体によって失われる。
その結果、電気化学的検知領域(官能化電極)内の流体の一貫性のある再現可能な体積を確保することは、体積を増加させること、即ち、その後に元の試料の濃度を計算するために考慮することができる既知因子によって標的濃度を希釈することなくしては、非常に困難である。さらに、涙には電気化学が動作するために必要とされる酸化還元メディエーター、例えばフェロシアン化物が高濃度に含まれていない。したがって、前記官能化電極領域に到達できる一貫性のある体積を確実にする動作可能な量まで総液量を毎回増加させ、かつ前記センサの電気化学のために十分なメディエーター濃度をもたらすことの両方を目的として、実際のセンサ装置に関して、コルチゾールの40nM程度を追加の試薬を用いて希釈することを回避することは困難である。このため、商業的に実行可能な涙コルチゾール・センサは1〜100nMの範囲内ではなく、10nM未満の範囲内で再現可能な測定を提供する必要がある(例えば、異常に低いコルチゾール・レベルの試料が処理中前記装置によってさらにより希釈される場合)。
これはまさに、本明細書で提示するEISに基づく分析が可能にするものである。0.02nM未満のLLDで、40nMのコルチゾールを含む10μLの涙試料を100倍に希釈することができ、依然としてEISに基づくコルチゾール・センサの直線範囲内に十分含まれうる。したがって、本明細書に示すコルチゾール分析は、涙中の低コルチゾール濃度を識別する技術的難題を十二分に満たすことができる。
この研究では、非常に低い濃度のコルチゾールの測定が、単純かつ無標識のEISに基づくバイオセンサを用いて再現性と高感度で実証される。反復センサのセットにより、最も高いばらつきで10%未満の相対標準偏差の、再現性を伴って1.184Hzで最適な結合がえられた。適合度は、31.672オーム/pg/mLの応答度と18.73pMの検出下限で0.9532であると測定された。この研究により、再現可能な性能のために既に低い濃度の標的のさらなる希釈が必要とされる可能性がある物理センサ設計の実用性を考慮した後でも、ヒト涙液で通常見出される低いコルチゾール・レベルでさえ、コルチゾール・レベルの小さな変化の正確かつ迅速な測定が技術的に実現可能であることが示される。
本明細書の開示の別の態様では、その実施形態が図4に示されている、スクリーン印刷電極が、試料を試薬に導く新規なマイクロ流体捕捉システムを介して体液試料を捕捉し、前記センサのメソポーラスカーボン・インク自体にカプセル化されたコルチゾール(または体液中に見出される他のストレスマーカー)用の1つまたは複数の分子認識部が、ケア/傷害の時点で利用することができる、迅速、無標識かつ多重化可能な電気化学インピーダンス分光法(MEIS)を用いて開発された。本実施形態では涙液を使用しているが、図6に示すように血液を使用することもできる。
前記分子認識部は1つまたは複数の抗体、アプタマー、ペプチド、合成抗体、核酸、触手プローブ、タンパク質等を含みうる。また、メソポーラスカーボン・インクは干渉物をブロックし、より良い試験結果をもたらすことが見出された。
実施例2
以下の実施例はコルチゾールを検出するためのものであるが、同様のプロトコルは関心のある他の生体分子の検出のために使用される。涙液または血液がこの実施例で使用されているが、他の体液を同様に用いてもよい。
以下の実施例はコルチゾールを検出するためのものであるが、同様のプロトコルは関心のある他の生体分子の検出のために使用される。涙液または血液がこの実施例で使用されているが、他の体液を同様に用いてもよい。
標準的な三電極系をインピーダンス分光測定のために使用した。前記系はAg/AgCl参照電極(CH Instruments、テキサス州オースティン)、金ディスク作用電極(GDE)(CH Instruments、テキサス州オースティン)、および白金対向電極(CH Instruments、テキサス州オースティン)から構成され、前記試料溶液中のコルチゾールを検出するために前記作用電極の表面に共有結合された抗コルチゾール抗体(シグマ アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)を伴う。1000μL容ピペットチップ(VWRインターナショナル、ペンシルバニア州ラドナー)はその先端が剃刀で切り取られ、前記GDEを覆ってしっかりと装着され、約0.2mLの試料液を保持することができるプラスチック製の「ウェル」が作製された。この系の図を図4に示す。
特に記述がない限り、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(EMD Biosciences、カリフォルニア州ラホヤ)を、すべての溶液を作製するために使用した。前記金ディスク電極(GDE)の表面に抗コルチゾール抗体を固定するために、先ず前記GDEを3μmの酸化アルミニウム粒(CH Instruments、テキサス州オースティン)上で120回八字旋回させてウェット研磨し、蒸留水ですすいだ。次いで、前記した120回の八字旋回研磨を1μm粒で、その後に0.05μm粒(CH Instruments、テキサス州オースティン)で繰り返し、その後前記GDEを蒸留水中で20分間超音波洗浄した。次いで、試薬等級エタノール中1mMの16−メルカプトヘキサデカン酸(16−MHDA)(シグマ アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)のの溶液100μLを前記センシング・ウェルに入れ、室温で1時間パラフィルムを用いて密封した。次に、前記GDEおよびセンシング・ウェルの表面と側面を注意深く蒸留水ですすいだ。対照EIS測定をPBS緩衝液中の100mMのフェロシアン化カリウム(シグマ アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)の「酸化還元プローブ」を用いて16−MHDA官能化GDE上で行い、各GDEに適切かつ同量のMHDAが固定されていることを確認した。これは、相互に比較するために、個々のGDEのそれぞれのインピーダンス応答を分析することによって決定した。
次いで、40mMのN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N−エチルカルボジイミド(EDC)(ピアース・バイオテクノロジー)と10mMのN−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)(VWR International)を含有するPBS溶液の100μLを前記センシング・ウェルに入れた。室温での1時間のインキュベーションの後、前記電極をPBS緩衝液ですすいだ。次に、PBS緩衝液中の抗コルチゾールIgG(アルドリッチ)の10μg/ml溶液の100μL液滴を前記電極に配置し、1時間室温で放置し、その後PBS緩衝液で洗い流した。最後に、蒸留水中の1mMのエタノールアミン(シグマ アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)の100μLを前記センシング・ウェルに加え、室温で30分間インキュベートして、16−MHDAおよびEDC/NHSのすべての未反応のカルボキシル基をブロックした。次に、前記電極をPBS緩衝液で注意深くすすぎ、使用するまで4℃でPBS中に保存した。
電気化学的インピーダンス測定はCHI660C Electrochemical Workstation(CH Instruments、テキサス州ヒューストン)を用いて行った。0〜10,000pg/mL(0〜27.59nM)のコルチゾール(シグマ アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)試料濃度を酸化還元プローブ溶液で作製し、使用するまで4℃で保存した。その後、コルチゾールの各濃度をそれぞれの前記抗体固定化電極で測定した。
各測定のために、100μLのコルチゾールと酸化還元プローブの溶液を前記抗体固定化GDEの前記センシング・ウェルに入れた。前記試料に印加された交流電位の振幅は、酸化還元プローブを用いる裸(固定化前の)電極上のCV実行によって決定した、150mVの式量電位(DCオフセット)で5mVであった。交流電圧を90秒のスキャン中に1〜100,000Hzの周波数の範囲で印加し、インピーダンスの大きさと位相をその試料の各周波数で記録した。実数および虚数のインピーダンスを各試料に関して算出し、ナイキスト線図を描いた。各測定後、次の試料を添加する前に、前記のGDEとセンシング・ウェルをPBSで十分にすすいだ。
試験した各交流周波数での各電極について、各コルチゾール濃度でのインピーダンスの大きさは、対数(濃度)に対して、算出された傾きおよびR2と相関関係があった。高い傾きとR2の最高のバランスをもたらす周波数を見つけるためにインピーダンスの傾きとR2値を周波数に対してそれぞれプロットした。次いで、この「最適な」周波数で測定されたインピーダンス値を使って、コルチゾール濃度をインピーダンスから推定できる最終的な濃度勾配をえた。
予想されたように、インビトロ、従って前記抗体に結合したバイオマーカーの濃度が増加する場合、前記系によって測定されたインピーダンス(従って信号)も同様に増加した。図5A〜5Iから図8参照。
この研究では、非常に低い濃度のコルチゾールの測定が、単純かつ無標識のEISに基づくバイオセンサを用いて再現性と高感度で実証される。反復センサのセットにより、最も高いばらつきで10%未満の相対標準偏差の、再現性を伴って1.184Hzで最適な結合がえられた。適合度は、31.672オーム/pg/mLの応答度と18.73pMの検出下限で0.9532であると測定された。この研究により、再現可能な性能のために既に低い濃度の標的のさらなる希釈が必要とされる可能性がある物理センサ設計の実用性を考慮した後でも、ヒト涙液で通常見出される低いコルチゾール・レベルでさえ、コルチゾール・レベルの小さな変化の正確かつ迅速な測定が技術的に実現可能であることが示される。
また、図7に要約するように、コルチゾール、グルコース、乳酸塩、ラクトフェリン、IgE、カテコールアミン、S−100β、ニューロン特異的エノラーゼ、グリア線維性タンパク質、および腫瘍壊死因子−α等の関心のある多くの生体分子を検出することができる。
図9〜11を参照すると、ストレスバイオマーカーのデータの要約が示される。サイクリックボルタンメトリー(CV)は、電圧がネルンストの式によって予測される電圧を超える条件下で、電気化学セルに生じる電流を測定する電気化学的手法である。CVは作用電極の電位を循環させ、結果として生じる電流を測定することによって行われる。図9はA EP、B NE、C DA、およびD CortのCVの重ね合わせを示す(図中の構造を参照)。DA、EP、Cort、およびNEの濃度はそれぞれ0.04M、0.04M、0.04M、および0.1Mである。信号の最小重複をEで示し、Fは信号ピークの大きな重複を示す。
図10は、電流測定技術に由来するストレスバイオマーカーのデータを示す。化学および生化学におけるアンペロメトリーは、電流または電流の変化に基づいて溶液中のイオンを検出することである。(はめ込み図)DAのAmp−itの間、A 2秒、B 12秒、C 20秒で前記CVの酸化ピークで印加した電圧、0.52Vを用いた前記AMP−it。外側のグラフは、前記AMP−itの間の時点(a)、(b)、および(c)で電流対DAの濃度をプロットした検量線である。異なる時間A、B、およびCでのこの検量線の対数適合のR2はそれぞれ0.9566、0.9547、および0.9540である。
図11は、EPの濃度対酸化ピーク0.23Vでの電流を決定するために使用した30HzでのSWV(矩形波ボルタンメトリー)技術を示す。DAの濃度対酸化ピーク0.22Vでの電流を決定するために20Hzでの前記SWV技術を使用する。NEの濃度対酸化ピーク0.23Vでの電流を決定するために前記SWV技術を使用する。Cortの濃度対酸化ピーク0.18Vでの電流を決定するために15Hzでの前記SWV技術を使用する。
上述の実施形態は限定することを意図するものではない。
Claims (10)
- 電気化学センサであって、
参照電極と対向電極、
該参照電極と該対向電極の間に配置されたセンシング・ウェル、および
該センシング・ウェル内に配置された官能化作用電極
を含み、
該官能化作用電極にストレスマーカーに対する1つまたは複数の分子認識部が連結される、センサ。 - 前記1つまたは複数の分子認識部は16−メルカプトヘキサデカン酸官能化作用電極に共有結合されたモノクローナル抗体を含む、請求項1に記載のセンサ。
- 1つまたは複数の前記モノクローナル抗体はゼロ長架橋剤N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N−エチルカルボジイミドおよび10mMのN−ヒドロキシスルホスクシンイミドを用いて前記官能化作用電極に付けられる、請求項2に記載のセンサ。
- 前記参照電極はAg/AgCl電極を含む、請求項3に記載のセンサ。
- 前記対向電極はPt電極を含む、請求項4に記載のセンサ。
- 前記センサはさらに、それと動作可能な配置で多重化可能な電気化学インピーダンス分光システムを含む、請求項1に記載のセンサ。
- 体液中の生体分子を検知するための方法であって、
作用電極に連結された前記生体分子に対する分子認識部を有するセンサが体液試料と接触した後に、多重化可能な電気化学インピーダンス分光法を用いて前記センサの前記分子認識部に結合した前記生体分子の量を検出することを含む、方法。 - 前記1つまたは複数の分子認識部は16−メルカプトヘキサデカン酸官能化作用電極に共有結合されたモノクローナル抗体を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記体液は涙液または血液を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記生体分子はコルチゾール、グルコース、乳酸塩、ラクトフェリン、IgE、カテコールアミン、S−100β、ニューロン特異的エノラーゼ、グリア線維性タンパク質、および腫瘍壊死因子−αの群から選択される1つまたは複数である、請求項7に記載の方法。
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