JP2017523983A

JP2017523983A - 生理活性で、ナノカプセル化された抗酸化物質の送達

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Publication number: JP2017523983A
Application number: JP2017505869A
Authority: JP
Inventors: エム．サブリオフ、クリスティーナ; イー．アステーテ、カルロス; ボドキ、エデ; ボスティナル、オリビュー; シプリアンサモリア、オビジュー; ディンテ、エレナ
Original assignee: Iuliu Hatieganu University Of Medicine And Pharmacy; Louisiana State University
Current assignee: Iuliu Hatieganu University Of Medicine And Pharmacy; Louisiana State University
Priority date: 2014-08-11
Filing date: 2015-08-10
Publication date: 2017-08-24
Anticipated expiration: 2035-08-10
Also published as: BR112017002580A2; MX2017001903A; CA2992879A1; KR102218883B1; EP3179988A2; AU2015301945A1; EA035620B1; WO2016025394A2; US10292943B2; MX388028B; EA201790361A1; AU2015301945B2; KR20170097601A; AP2017009684A0; CA2992879C; JP6668327B2; ZA201700987B; WO2016025394A3; EP3179988A4; US10952974B2

Abstract

抗酸化物質を分解から保護しながら、ルテイン又はその他の抗酸化物質を眼などの標的組織に生理活性形態で送達するための、方法及び組成物が開示される。抗酸化物質は、ゼインなどのタンパク質又は乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）などのポリマーを含むナノ粒子にカプセル化される。同様に、界面活性剤もナノ粒子とさせて、抗酸化物質の保護をさらに促進するのが好ましい。ナノ粒子を標的組織に投与した後、時間をかけて組織に生理活性抗酸化物質を放出する。任意選択で、抗酸化物質の徐放を促進するために、感熱性、生体付着性ゲルとナノ粒子を混合する。本方法及び組成物は、加齢黄斑変性又は白内障などの病状を治療又は予防する上で有用である。

Description

本発明は、組織に対する生理活性ルテイン又はその他の抗酸化物質の送達を増強するための方法及び組成物、並びに組織、特に、眼や角膜及び網膜などの眼の構成要素に対する生理活性ルテイン又はその他の抗酸化物質の送達増強に有用な組成物を製造する方法に関する。

ルテイン
ルテインは、植物色素、キサントフィル、ジヒドロキシカロテノイドである。ルテインのＩＵＰＡＣ名は、β，ε−カロテン−３，３’−ジオールであり；その構造は以下の通りである：

ヒトは、ｉｎｖｉｖｏでカロテノイドを合成することができないため、ヒト組織中のルテインは、通常、食事に由来するものである。ルテインは、緑色野菜（例えば、アルファルファ、ホイートグラス、バーレイグラス、ケール、ホウレンソウ、ブロッコリー、サヤマメ、グリンピース、ライマメ、キャベツ、コラード、カラシナ、及びカブの葉）、いくつかの花（例えば、マリーゴールド花弁）、特定の黄色果実及び野菜（例えば、ニンジン、モモ、マンゴー、パパイヤ、スカッシュ、及びオレンジ）、卵黄、鶏の皮、鶏の脂肪に見出される。例えば、トウモロコシの場合、ルテインは、主として硬質胚乳に見出される。また、マリーゴールド花弁（アフリカン・マリーゴールド（Ｔａｇｅｔｅｓｅｒｅｃｔａ））も、トウモロコシから得られるルテインより高価ではあるが、ルテインの優れた供給源である。

ルテインは、１０個の炭素−炭素二重結合が共役した配列を有する。この共役構造によって、ルテインは、ペルオキシルラジカルなどのラジカルを除去することにより、生物系において主要な抗酸化物質として機能することができるが、広範囲の共役は、光、酸素、及び熱による分解に対してルテインを感受性にもする。分解に対する感受性は、必要とされる組織にルテインを送達することを困難にする。

ヒドロキシル基は、ルテインをその非修飾βカロテン類似体より極性にする。ルテインは、非極性及び極性溶媒の両方に可溶性である。表１を参照されたい。

健康及び疾患におけるルテインの役割
ルテインは、特定の疾患のリスクを低下させ、そして特定の疾患、とりわけ、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などの眼病、並びに乳癌及び結腸癌などの血管新生に関連する疾患の症状を低減する。ＡＭＤは、中心視覚を担う網膜の領域の変性状態である。ＡＭＤは、高齢者における不可逆的視力障害の最も一般的な原因である。眼内のカロテノイドは、黄斑の内網膜に集中している。ヒト試験からのエビデンスは、カロテノイドの食事からの摂取によって、網膜内にカロテノイドの蓄積をもたらすことが可能になり、網膜変性からの保護を達成すると考えられることを示唆している。しかし、ルテインは、水溶性であるため、分解のない生理活性形態で、生理活性ルテインを網膜などの標的組織に有効に送達するのが困難である。生存生物における網膜などの標的組織に、生理活性ルテイン又はその他の抗酸化物質を、分解のない生理活性形態で有効に送達する方法及び組成物の要求はまだ満たされていない。本発明者らの知る限り、網膜を含む目の内部にルテインを送達するように眼への局所投与に適合させた組成物については、これまで一切報告されていない。

ルテインは、特に４４５ｎｍ前後の短波長ブルーライトを吸収するその能力により、光酸化損傷から網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）を保護する。ルテインは、炎症を調節することもでき、また、ＲＰＥにおける酸化ストレスと炎症応答の間の悪循環を少なくとも部分的に断ち切るのを助けることができる。さらに、ルテインは、一重項酸素をクエンチングすることができるため、ルテインは、酸化ストレスに起因する状態、例えば、心血管疾患、発作、肺癌、乳癌、及び結腸癌を阻害する上でも役立ち得る。ルテインは、低水溶性であり、ｉｎｖｉｖｏ吸収が乏しく、しかも生体利用性が低い。抗酸化物質としてのルテインの能力を利用し、加工及び保存中のその物理化学的安定性を向上させるための改善された到達系の要求は依然として満たされていない。

非特許文献１は、例えば、経皮抗酸化剤、抗ストレス剤、またはブルーライトフィルターとして使用される、ルテインの経皮送達のための脂質ナノキャリアの使用を開示している。試験された脂質ナノキャリアには、固体脂質ナノ粒子、ナノ構造脂質キャリア、及びナノエマルジョンが含まれた。新鮮なブタの耳の皮膚を用いた浸透試験によって、ルテインは、全く又はほとんど浸透しなかったことが判明したため、活性ルテインは皮膚に残るが、全身に吸収されないという推論が導かれた。

非特許文献２は、栄養補助食品及び機能性食品におけるナノカプセル化ルテインの考えられる使用のために、リポソーム膜安定性に対するルテインの作用に関する観察結果を報告している。

非特許文献３は、ルテインナノ懸濁液を調製するための高圧均質化の使用を開示している。ルテインナノ懸濁液は、ペレットに変換された後、栄養補助食品としての使用のためにゼラチンカプセルに充填された。凍結乾燥した懸濁液は、クリーム又はゲルに組み込まれた。考えられる経皮使用のためのモデルとしてのブタの耳の皮膚で試験した場合、ルテインは、皮膚を通して浸透しなかった。

非特許文献４は、ルテイン／ゼインナノ粒子の製造において、溶液分散を増強するための超臨界流体の使用を記載している。
非特許文献５は、薬物及び遺伝子送達のために考えられる候補としてのタンパク質ベースのナノキャリアの使用についての論文を記載している。

非特許文献６は、乳児用調剤粉乳、栄養補給品、及びメディカルフードにおける潜在的な使用ための、βカロテン及びルテインなどのカロテノイドの脱水エマルジョンの形成を開示している。レイヤー積層系は、単層エマルジョンより良好にカロテノイドを保持することが判明したが、レイヤー積層系は異性化も増大させた。

非特許文献７は、ルテインを含有する乳酸−グリコール酸共重合体ナノ粒子の合成、並びにオリーブ油、小麦粉及び水も含有するスラリーの経胃強制給餌（ｇａｓｔｒｉｃｇａｖａｇｅ）によるナノ粒子の投与後に起こる、選択組織へのルテインの血漿薬物動態及び沈着を開示している。

ゼインは、ナノ送達系の合成に使用されてきた天然のタンパク質である。ゼインは、米国食品医薬品局（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によりヒトの消費について「一般に安全と認められる（ｇｅｎｅｒａｌｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄａｓｓａｆｅ）」（ＧＲＡＳ）とされている。ゼインは、疎水性であるため、封入、制御放出、及び脂溶性化合物の安定化のためのキャリアとして使用することができる。ゼインナノ粒子は、封入薬物、抗菌剤、及び生理活性化合物、例えば、５−フルオロウラシル、チモール、クルクミン、精油、及びルテインなどと一緒に合成されている。

ミトリ，Ｋ（Ｍｉｔｒｉ，Ｋ．）；シェゴカー，Ｒ．（Ｓｈｅｇｏｋａｒ，Ｒ．）；ゴーラ，Ｓ．（Ｇｏｈｌａ，Ｓ．）；アンセルミ，Ｃ．（Ａｎｓｅｌｍｉ，Ｃ．）；ミュラー，Ｒ．Ｈ．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．）ら著、「ルテインの経皮送達のための脂質ナノキャリア：調製、特性評価、安定性及び性能（Ｌｉｐｉｄｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓｆｏｒｄｅｒｍａｌｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｌｕｔｅｉｎ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）」、国際薬学ジャーナル（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）、２０１１年、第４１４巻（１−２）、ｐ．２６５〜７５タン，Ｃ．（Ｔａｎ，Ｃ．）；シャー，Ｓ．（Ｘｉａ，Ｓ．）；シュー，Ｊ．（Ｘｕｅ，Ｊ．）；シエ，Ｊ．（Ｘｉｅ，Ｊ．）；フェン，Ｂ．（Ｆｅｎｇ，Ｂ．）；チャン，Ｘ．（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．）ら著、「ルテインのビヒクルとしてのリポソーム：調製、安定性、リポソーム膜力学、及び構造（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓａｓｖｅｈｉｃｌｅｓｆｏｒｌｕｔｅｉｎ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｌｉｐｏｓｏｍａｌｍｅｍｂｒａｎｅｄｙｎａｍｉｃｓ，ａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、農業及び食品化学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄｆｏｏｄｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０１３年、第６１巻（３４）、ｐ．８１７５〜８１８４ミトリ，Ｋ（Ｍｉｔｒｉ，Ｋ．）；シェゴカー，Ｒ．（Ｓｈｅｇｏｋａｒ，Ｒ．）；ゴーラ，Ｓ．（Ｇｏｈｌａ，Ｓ．）；アンセルミ，Ｃ．（Ａｎｓｅｌｍｉ，Ｃ．）；ミュラー，Ｒ．Ｈ．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．）ら著、「経口及び経皮送達のための抗酸化製剤としてのルテインナノクリスタル（Ｌｕｔｅｉｎｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓａｓａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｆｏｒｏｒａｌａｎｄｄｅｒｍａｌｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、国際薬学会誌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）、２０１１年、第４２０巻（１）、ｐ．１４１〜６フー，Ｄ（Ｈｕ，Ｄ）；リン，Ｃ．（Ｌｉｎ，Ｃ．）；リュウ，Ｌ．（Ｌｉｕ，Ｌ．）；リー，Ｓ．（Ｌｉ，Ｓ．）；チャオ，Ｙ．（Ｚｈａｏ，Ｙ．）ら著、「超臨界流体による溶液増強分散を用いたルテイン／ゼインナノ粒子の調製、特性評価、及びｉｎｖｉｔｒｏ放出の研究（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｒｅｌｅａｓｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｌｕｔｅｉｎ／ｚｅｉｎｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｖｉａｓｏｌｕｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｄｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｂｙｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｓ）」、食品工学会誌（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、２０１２年、第１０９巻（３）、ｐ．５４５〜５５２エルゾグビー，Ａ．Ｏ．（Ｅｌｚｏｇｈｂｙ，Ａ．Ｏ．）；サミー，Ｗ．Ｍ．（Ｓａｍｙ，Ｗ．Ｍ．）；エルギンディ，Ｎ．Ａ．（Ｅｌｇｉｎｄｙ，Ｎ．Ａ．）ら著、「有望な薬物及び遺伝子送達系としてのタンパク質ベースのナノキャリア（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄｎａｎｏｃａｒｉｉｅｒｓａｓｐｒｏｍｉｓｉｎｇｄｒｕｇａｎｄｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍｓ）」、制御放出ジャーナル（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ）、２０１２年、第１６１巻（１）、ｐ．３８〜４９リム，Ａ．Ｓ．Ｌ．（Ｌｉｍ，Ａ．Ｓ．Ｌ．）；グリフィン，Ｃ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｃ．）；ルース，Ｙ．Ｈ．（Ｒｏｏｓ，Ｙ．Ｈ．）ら著、「層化界面及びガラス形成剤としてのトレハロースを有する凍結乾燥エマルジョンにカプセル化されたルテイン及びβカロテンの安定性及び損失動態（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｌｏｓｓｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｌｕｔｅｉｎａｎｄ β−ｃａｒｏｔｅｎｅｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄｉｎｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄｅｍｕｌｓｉｏｎｓｗｉｔｈｌａｙｅｒｅｄｉｎｔｅｒｆａｃｅａｎｄｔｒｅｈａｌｏｓｅａｓｇｌａｓｓｆｏｒｍｅｒ」、フード・リサーチ・インターナショナル（ＦｏｏｄＲｅｓｅａｃｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、２０１４年、第６２巻（０）、ｐ．４０３〜４０９カミル，Ａ（Ｋａｍｉｌ，Ａ）；スミス，Ｄ．Ｅ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｅ．）；ブランバーグ，Ｊ．Ｂ．（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂ．）；アステテ，Ｃ．（Ａｓｔｅｔｅ，Ｃ．）；サブリオブ，Ｃ．（Ｓａｂｌｉｏｖ，Ｃ．）；チェン（Ｃｈｅｎ，Ｃ．−Ｙ．Ｏ．）ら著、「ナノ送達されたルテインの生体利用性及び生体分布（Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙａｎｄｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｎａｎｏｄｅｌｉｖｅｒｅｄｌｕｔｅｉｎ）」、食品化学（ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０１６年、第１９２巻、ｐ．９１５〜９２３（２０１５年７月２３日オンラインで入手可能）

眼など、必要とされる組織に生理活性ルテイン又はその他の抗酸化物質を送達すると共に、こうした組織に送達されるまで、ルテイン又はその他の抗酸化物質を分解から保護する、改善された組成物及び方法の要求は依然として満たされていない。

本発明者らは、ルテイン又はその他の抗酸化物質を分解から保護しながら、ルテイン又はその他の抗酸化物質を眼などの標的組織に生理活性形態で局所送達（網膜へのルテインの送達を含む）する、新規の方法を見出した。ルテイン又はその他の抗酸化物質は、ゼインなどのタンパク質又は乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）などの合成ポリマーを含むナノ粒子にカプセル化される。同様に、界面活性剤もナノ粒子と会合させて、ルテイン又はその他の抗酸化物質の保護をさらに促進するのが好ましい。ナノ粒子を標的組織に投与した後、時間をかけて組織に生理活性ルテイン又はその他の抗酸化物質を放出する。ルテイン又はその他の抗酸化物質の徐放を促進するために、感熱性、生体付着性ゲルとナノ粒子を混合するのが好ましい。

１セットの実施形態において、本発明者らは、界面活性剤の非存在下及び存在下の両方で、ゼインベースのナノ粒子が、ルテインを酸化から保護すると共に、ルテインの放出を制御する能力を調べた。本発明者らの仮定は、ゼインナノ粒子と界面活性剤分子との間の静電親和性が、ルテインのより持続的な放出をもたらし、封入された生理活性ルテインの化学的安定性を向上させるというものであった。ルテインをロードしたゼインナノ粒子は、界面活性剤あり又はなしのいずれかで、液−液分散製法を用いて合成した。界面活性剤として、リン脂質ダイズレシチンとトリブロックコポリマープルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７の組み合わせを使用した。例えば、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）８０及びトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）ファミリーの別の界面活性剤などの他の界面活性剤を使用することも可能である。対照として、ルテインを含有する「従来の」エマルジョンを調製した。動的光散乱法（ＤＬＳ）及び透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）を用いて、粒子の物理的安定性を特性評価した。ＰＢＳに懸濁したナノ粒子からのルテイン放出及びルテイン分解を界面活性剤の存在及び非存在下の両方で測定した。ルテインの熱及び光酸化も化学的安定性の指標として測定した。ナノ粒子は、界面活性剤なしで１５６．１±１８ｎｍ、界面活性剤を含む場合、２１６．５±２９ｎｍであった。界面活性剤は、多分散指数を改善し、ゼータ電位を低下させると共に、封入効率を高めた。二相放出プロフィール：２４時間にわたる初期バースト放出（界面活性剤の存在下の方が小さかった）；続いて、界面活性剤あり及びなしのいずれの系でも、漸進的ゼロ次放出プロフィールが観察された。ルテイン分解の後、二次反応速度が続くが、その際、ＰＢＳに懸濁させたナノ粒子と乳化対照との間に有意な差はなかった。ナノ粒子へのルテインの組み込みにより、特に界面活性剤の存在下で、熱及びＵＶストレスの両方に対してルテインの安定性が向上した。これらのデータから、特に界面活性剤を添加した場合、ゼインベースのナノ粒子は、ルテインの生理活性を保持し、且つ分解からルテインを保護しながら、疎水性ルテインを効率的に封入することができるため、生理学的条件下でその徐放を可能にすることが判明した。

一実施形態では、眼に生理活性ルテインを送達するために、ポリマー（ＰＬＧＡ）ナノ粒子を使用した。眼に投与される生理活性ルテインは、白内障又は黄斑変性を阻害するなどの用途に有益となり得る。ラットモデルから得られた中間結果は、心強いものであった
。本発明者らの中間結果から、ポリマーナノ粒子は、ルテインを眼に首尾よく送達し、治療利益をもたらしたことが明らかにされた。

３７℃、１００ｒｐｍで、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中、界面活性剤あり及びなしで、ゼインナノ粒子からのルテインの７日間の放出速度を示す図。界面活性剤あり（ＬＴＺＮＳＦ）及びなし（ＬＴＺＮＮＳＦ）両方のゼインナノ粒子中のルテイン保持、並びに界面活性剤あり（ＬＴＥＭＳＦ）で乳化したルテインについての同様の観察結果を示す図。測定は全て、３７℃、１００ｒｐｍで、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中で７日間にわたり実施した。様々な温度で時間の関数としてのゼインナノ粒子中のルテイン保持を示す図。様々な温度で時間の関数としてのゼインナノ粒子中のルテイン保持を示す図。様々な温度で時間の関数としてのゼインナノ粒子中のルテイン保持を示す図。ＵＶ誘導の分解に応答する様々な組成物についての時間の関数としてのルテインの保持を示す図。

ゼイン封入ルテインナノ粒子
様々な処理及び保存条件下で、ゼインナノ粒子に封入されたルテインの安定性に関しても、また、ルテインの放出及び安定性に対する界面活性剤の作用に関しても、これまでほとんど報告されていない。本発明者らは、界面活性剤（レシチン及びプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７共界面活性剤）の存在及び非存在下の両方で、ルテインの熱安定性、その光安定性、及びゼインナノ粒子からのその放出を研究してきた。本発明者らの仮定は、ゼインナノ粒子に封入されたルテインは、様々な保存条件下で、より安定性であること、並びにゼインナノ粒子と界面活性剤分子との間の静電気親和性が、ルテインのより持続的な放出をもたらすため、封入生理活性ルテインの安定性を向上させることであった。

［実施例］
材料
実施例１．ゼイン、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７、クロロホルム、エタノール、ペプシン及びパンクレアチンは、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（シグマ・ケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．Ｌｔｄ．）、ミズーリ州、セントルイス）から購入した。ダイズレシチン、塩酸、及び水酸化ナトリウムは、フィッシャー・ケミカル（ＦｉｓｈｅｒＣｈｅｍｉｃａｌ）（フィッシャー・サイエンティフィック・インターナショナル（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ニュージャージー州、フェアローン）から購入した。ルテインは、ケミン・フーズ，Ｌ．Ｃ．（ＫｅｍｉｎＦｏｏｄｓ，Ｌ．Ｃ．）（米国、アイオワ州）から取得した。ナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）水は、ナノピュア・ダイアモンド１００ｋＤＡセルロース・エステル・バイオテク（ＮａｎｏｐｕｒｅＤｉａｍｏｎｄ１００ｋＤＡＣｅｌｌｕｌｏｓｅＥｓｔｅｒＢｉｏｔｅｃｈ）メンブレンチューブ（バーンステッド・インターナショナル（Ｂａｒｎｓｔｅａｄｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、米国、アイオワ州）を用いて取得し、また、クロージャは、スペクトラム・ラボラトリーズ社（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．）（米国、カリフォルニア州）から購入した。使用した全ての他の試薬および組成物は、分析グレードであった。

方法
実施例２：封入されたルテインを含むゼインナノ粒子の合成
液−液分散によりナノ粒子を合成した。１ｍｌのエタノール−水溶液（７０：３０、ｖ／ｖ）に１０ｍｇのゼインを溶解させた。１００％エタノール中に０．７５ｍｇ／ｍｌのルテイン溶液を調製してから、穏やかな攪拌条件下、１：１比（ｖ／ｖ）でルテイン溶液を滴下しながらゼイン溶液に添加した。次に、界面活性剤としてレシチン及びプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７０．０４５％：０．０９％（ｗ／ｖ）の組み合わせを含有する７．５ｍｌの水相に、上記混合物を注入した。続いて、マイクロフルイダイザー（Ｍ−１１０Ｐ、マイクロフルイディックス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、米国、マサチューセッツ州）を用いて、２０６．８４ＭＰａ（３０，０００ＰＳＩ）で３サイクルにわたりサンプルを処理した。その後、ロータリエバポレーター（ブチ（Ｂｕｃｈｉ）Ｒ−１２４、ブチ・アナリティカル社（ＢｕｃｈｉＡｎａｌｙｔｉｃａｌＩｎｃ．）、米国、デラウエア州）を用いて、部分真空（約５００〜６００ｍｍＨｇ）及び窒素注入（８０ｍｍＨｇ）下でエタノールを蒸発させた。１００ｋＤａスペクトラ（Ｓｐｅｃｔｒａ）／ＰＯＲＣＥ膜（スペクトラム・ランチョ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＲａｎｃｈｏ）、米国、カリフォルニア州）を用いて、エタノールの完全蒸発後に残ったルテインをロードしたゼインナノ粒子を透析により洗浄した。ナノ粒子懸濁液を膜内に配置してから、１．５Ｌナノピュア水中に計２４時間懸濁させた；透析媒質（水）は、４〜６時間毎に取り換えて、遊離界面活性剤を除去した。懸濁液を収集し、さらなる分析のために室温で維持した。界面活性剤を含まないこと以外は同じ手順に従い、界面活性剤なしのゼインナノ粒子を調製した。最後に、界面活性剤のみ（ゼインナノ粒子なし）で製造したルテインエマルジョンを対照として使用した。
ゼインナノ粒子の特性評価
実施例３：粒度、多分散指数（ＰＤＩ）、及びゼータ電位
新しく調製したナノ粒子サンプルは、マルバーン・ゼータサイザー・ナノＺＳ（ＭａｌｖｅｒｎＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳ）（マルバーン・インストルメンツ社（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ．）、英国、ウスターシャー州）を用いた動的光散乱（ＤＬＳ）による、平均粒度、ＰＤＩ、及びゼータ電位を測定することにより、特性評価した。測定を実施する前に、０．２〜０．３２ｍｇ／ｍｌの最終濃度範囲までサンプルを希釈した。サンプルを安定化すると共に、粒子凝集を阻害するために、ｐＨ７．４（０．１Ｍ）のクエン酸バッファーを添加した。測定は全て、３回反復して実施した。

実施例４：形態
透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）により、新しく製造したゼインナノ粒子の形態を観察した。カーボン膜で被覆した４００メッシュの銅グリッド上に１滴のサンプルを垂らし、余剰のサンプルをフィルター紙に吸収させた。サンプルの対比を向上させるために、ネガティブ染色として酢酸ウラニルを使用した。

実施例５：封入効率（ＥＥ）
新しく製造したルテインをロードしたゼインナノ粒子の１．０ｍＬサンプルを３０，０００ｒｐｍで７５分間遠心分離した。上清とナノ粒子含有ペレットを収集した。両サンプルをエタノールにより分離した後、クロロホルム（１：１比）でルテインを抽出した。クロロホルム中のルテインの溶解度（６０００ｍｇ／Ｌ）は、エタノール中のその溶解度（３００ｍｇ／Ｌ）より２０倍高い。ガラスセル中のＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計、１ｃｍ経路長、４４５ｎｍで測定した吸収を用いて、ルテインの濃度を測定した。１：１エタノール及びクロロホルム中のルテインの標準曲線に基づいて、吸光度値をルテイン濃度に変換した。封入のために利用可能なルテインの理論量に対するペレット中のルテインの量の比として、カプセル化効率（％）を推定した。測定は全て、３回反復して実施した。

実施例６：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のゼインナノ粒子からのルテイン放出
本発明者らは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液（３７℃でｐＨ７．４）中のゼインナノ粒子からの封入ルテインの放出を調べた；放出されるルテインの溶解度を高めるために、０．５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０をＰＢＳに添加した。手短には、１０ｍｌの新しく製造したナノ粒子を２０ｍｌのトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０増強ＰＢＳに添加してから、入念に混合した。この混合物を分割し、１ｍｌ遠心分離管に導入してから、３７℃、１００ｒｐｍのシェーカインキュベータ（Ｃ２５ＫＣインキュベータシェーカ、ニュー・ブランスウィック・サイエンティフィック（ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国、ニュージャージー州）内に上記遠心分離管を配置した。予定時間に、遠心分離管をサンプリングして、３０，０００ｒｐｍで７５分間遠心分離した。上清を取り出し、エタノール及びクロロホルム（２ｍｌ：２ｍｌ）で抽出した後、１０分間ボルテックスした。封入効率のセクションに記載したように、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を用いて、４４５ｎｍでの吸光度を測定することにより、抽出されたルテインを上清中で決定した。測定は全て、３回反復して実施した。

実施例７：ＰＢＳ中に懸濁したゼインナノ粒子からのルテイン分解
ペレット中に検出されたルテインの量、及び同じ条件下での上清中のルテインの量を測定することにより、ゼインナノ粒子（界面活性剤あり及びなし）に封入されたルテイン、並びに界面活性剤安定化エマルジョン中のルテインの分解を決定した。

実施例８：封入されたルテインを含むゼインナノ粒子の物理的安定性
３つの異なる温度：冷蔵庫内の４℃、２５℃の室温、及びインキュベータ内の４０℃で、暗所において、新しく製造したサンプルを１ヵ月にわたり保存した。７、１５、及び３０日の保存後に、平均粒径、表面特徴、及び封入された画分の変化について、サンプルをモニターした。実験は全て、３回反復して実施した。

実施例９：ゼインナノ粒子に封入されたルテインの光化学安定性
光を通さないキャビネット内の透明なガラス容器中にナノ粒子及びエマルジョンサンプルを保存し、キャビネット内で、３６５ｎｍＵＶランプ（１００Ｗ：ブラク−レイ（Ｂｌａｋ−Ｒａｙ）モデルＢ１００ＡＰ）に最大１０時間サンプルを暴露した。０．５、１、２、３、５、７、及び１０時間後、１ｍｌを各サンプルから抜き取り、抽出して、４４５ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて、ルテイン濃度について分析した。実験は、３回反復して実施した。

実施例１０：分解反応速度式
ルテイン分解及び放出に関する反応速度の一般記述は、

（式中、Ｃは、ルテイン濃度、ｋは、反応速度定数、ｎは、反応次数である）
として示すことができる。反応速度モデルのベストフィットを決定するために、相関係数（Ｒ^２）を用いた。ＵＶ曝露によるルテインの分解は、一次速度式：

に従った。ＰＢＳ中で保存した場合、ルテイン分解は、二次速度式：

（式中、Ｃは、時間ｔでのルテイン濃度であり、Ｃ_０は、ルテインの初期濃度であり、ｔは、時間であり、ｋは、線形回帰分析の傾きから得られる反応速度である）
に従った。

実施例１１：データの統計分析
実験は全て、３回反復して実施し、結果は、平均±標準偏差として記録した。統計分析は、ＳＡＳソフトウェア（バージョン９．４、ＳＡＳインスティテュート社（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓＩｎｃ．）、米国、ノースカロライナ州）を用いて実施した。システム間の有意な差を決定するために、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。有意なレベル（ｐ）は、０．０５に設定した。

結果及び論考
実施例１２：物理化学的特性評価
液−液分散を用いて、界面活性剤あり及びなしの両方で、ルテインをロードしたゼインナノ粒子を巧く合成した。これらのプロトタイプ実験においてナノ粒子を安定化するのに使用した界面活性剤は、レシチン及びプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（商標）Ｆ１２７の組み合わせであった。天然の食品乳化剤又は安定剤であるレシチンは、親水性頭部、ホスファチジルコリン（ＰＣ）；並びに２つの疎水性尾部、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を有する。プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（商標）Ｆ１２７は、ポリエチレングリコールの２つの親水性ブロックの間にポリプロピレンの疎水性ブロックを有する親水性ノニオン性界面活性剤コポリマーである。本発明者らは、１つ又は複数のレシチン層が、内部にルテインが封入された疎水性ゼインナノ粒子の表面を被覆すると仮定する。レシチンの親水性頭部は、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（商標）Ｆ１２７の親水性ポリエチレングリコール部分と会合し；疎水性ポリプロピレン部分は、恐らくゼインマトリックスと会合する。その結果、疎水性ルテインをロードした親水性ゼインナノ粒子が得られ、これを用いて、分解からルテインを保護しながら、水性環境中に生理活性ルテインを分散させることができる。

ルテインをロードしたゼインナノ粒子、またはその反対にルテインを含まない類似ナノ粒子は、界面活性剤あり又はなしいずれの場合も、精製後直ちに特性評価した。表２を参
照されたい。クエン酸バッファー（ｐＨ７．４）中での２４時間透析後に、新しく製造したサンプルの平均粒度、ＰＤＩ、及びゼータ電位を測定した。界面活性剤あり又はなしの、ゼインナノ粒子にロードされたルテインの平均粒度は、それぞれ、２１７±２９ｎｍ又は１５６±１８ｎｍであった。界面活性剤を含むゼインナノ粒子は、比較的小さい多分散性（０．３未満）を有した。界面活性剤なしの場合、より高いＰＤＩ範囲０．３３〜０．４８が観察された。

透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）により結果を確認した（データは示していない）。界面活性剤を含む粒子は、粗い表面の球形をしており、一部の粒子は、界面活性剤「メッシュ」により互いに結合している。界面活性剤のないナノ粒子は、粒度が小さく、より球形の形状をしているが、粒度が不均一であり、凝集しやすいため、動的光散乱により測定すると、より高いＰＤＩ値を示した。

ゼータ電位は、ナノ粒子安定性の尺度である。約＋３０ｍＶ超、又は約−３０ｍＶ未満で、ゼータ電位にて高度の安定性が予想される。界面活性剤を含む粒子は、界面活性剤のない粒子（−３１．９±４．３ｍＶ）よりも負荷電（−４７．６±１．６ｍＶ）であることが判明し、これは、界面活性剤安定化粒子の優れた安定性を示している。封入されたルテインは、界面活性剤ありで−３０．９±３．３ｍＶ、又は界面活性剤なしで−２１．０±８．６ｍＶまでゼータ電位の大きさを低減した。恐らく、ルテインとゼイン同士の疎水性相互作用が、ゼイン構造を再編成したことにより、観察されたゼータ電位の変化が起こったのであろう。

界面活性剤がない場合、封入効率は、６９．１±１１．４％であった。界面活性剤が存在すると、封入効率は、８３±５．８％に増加した。
実施例１３：放出及び放出機構。ゼインナノ粒子からのＰＢＳ中へのルテイン放出
薬物放出を試験するために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を一般に使用する。図１は、３７℃、１００ｒｐｍのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中への、７日間にわたる界面活性剤あり及びなしゼインナノ粒子からのルテインの放出速度を示す。放出プロフィールの後、２４時間にわたる初期バースト放出を示す２相パターン、続いて、２４時間後のゼロ次放出が起こった。表３を参照されたい。界面活性剤のない粒子（ＬＴＺＮＮＳＦ）の場合、４３％のルテインが、初期バースト相で放出された。界面活性剤（ＬＴＺＮＳＦ）を含む粒子の場合、２０％のルテインしか初期バースト相で放出されなかった。界面活性剤は、ルテイン放出を遅延させた。２４時間後のルテイン放出後にゼロ次反応速度が続いた。
以下の表４を参照されたい。界面活性剤を含まない粒子の場合、５２％のルテインが１６８時間後に放出されたのに対し、界面活性剤を含む粒子では、４３％だけが放出された。界面活性剤によって促進される疎水性相互作用は、ゼインの加水分解を阻害し、ルテインの放出を遅延させた。界面活性剤の非存在下では、急速なタンパク質膨潤のために、水和した膨潤ゼインマトリックス中に形成した水性チャネルを通じた拡散による封入生理活性のさらに急速な放出が起こった。界面活性剤によって、ルテインのより持続的な放出が達成された。

実施例１４：ＰＢＳ中でのルテイン分解
ルテインは、その共役二重結合及びその２つのヒドロキシル基のために、他の多くのカロテンよりも、熱及びその他の原因による分解に感受性となる傾向がある。本発明者らは、界面活性剤あり（ＬＴＺＮＳＦ）及びなし（ＬＴＺＮＮＳＦ）の両方で、ゼインナノ粒子に封入されたルテインの分解を評価した；同じ界面活性剤と一緒に乳化したルテイン（ＬＴＥＭＳＦ）の同様の観察結果と、上記の観察結果を比較した。全ての測定は、３７℃、１００ｒｐｍのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中で７日間にわたり実施した。図２を参照されたい。ルテイン分解プロフィールの後、二次反応速度が続いたが、試験した系の間で、分解速度定数（ｋ）に有意な差はなかった。以下の表４も参照されたい。

実施例１５及び１６：時間の関数として、並びに温度の関数としてのナノ粒子化学及び物理的安定性
本発明者らは、粒度、ＰＤＩ、及びゼータ電位を測定することにより、３０日にわたり、４℃、２５℃、及び４０℃でのゼインナノ粒子の物理的安定性を観測した。４４５ｎｍでの吸光度を測定することにより、並行して封入ルテインの化学的安定性を評価した。表３を参照されたい。ゼインナノ粒子は、界面活性剤あり及びなしのいずれも、低温で安定しており、４℃で３０日間保存した場合、１５６．１±１８ｎｍ及び２１６．５±２９ｎｍであった。ナノ粒子は、特に界面活性剤なしの場合、高い温度で保存されると、経時的に粒度が増加する傾向があった。例えば、界面活性剤を含むナノ粒子の粒度は、２５℃で３０日の保存後、３８０．５±５１ｎｍまで増加した。対照的に、界面活性剤のない粒子の粒度は、２５℃で３０日の保存後、それよりはるかに大きく、３１０３±３３２ｎｍまで増加した。４０℃では、界面活性剤なしの場合、わずか７日の保存後に、１μｍ超の粒子を検出することができた。ＰＤＩは、概して、温度及び保存時間と共に増加した（０．２７から０．８０に）。ゼータ電位は、界面活性剤なしのナノ粒子では、−１８ｍＶ〜−２５ｍＶの範囲であり、界面活性剤を含む粒子では、−１５ｍＶ〜−３８ｍＶの範囲であった。

界面活性剤は、少なくとも３０日間の長期貯蔵安定性をもたらしただけではなく、ルテインの分解も遅延させた。図３Ａ〜３Ｃを参照されたい。２５℃で３０日後、ＬＴＺＮＮＳＦの５４％と比較して、封入ルテインＬＴＺＮＳＦの２６％しか分解しなかった。両タイプの粒子について４０℃では同様の傾向がみられた：界面活性剤あり及びなしのナノ粒子で、それぞれ１３．８％及び７．５％のルテインが残った。全ての温度で、乳化ルテインは、ゼインナノ粒子に封入されたルテインより速く分解した。全ての温度でルテイン分解は二次反応速度に従った。表４を参照されたい。各保存温度で、最も低い分解速度は、界面活性剤を含むルテインをロードしたゼインナノ粒子に認められた。すべての系について、温度が高くなるほど、分解速度が増加した。

実施例１７：ＵＶ曝露に対する光化学安定性
ゼインナノ粒子は、ＵＶ誘導性分解に対するルテインの光化学安定性を増強し；ナノ粒子への界面活性剤の添加は安定性をさらに増強した。乳化ルテインは、急速な光化学分解を被った。図４を参照されたい。１０時間後、ルテインエマルジョンには１．４％の封入ルテインしか残留しなかったのに対して、界面活性剤のないゼインナノ粒子には１５．９％のルテインが、また、界面活性剤を含むゼインナノ粒子には、４６．６％のルテインが残留した。表４も参照されたい。すべてのケースで、光化学分解は、一次崩壊に従った。

この仮定に束縛されることを意図するものではないが、本発明者らは、ゼインによるＵＶ光子の競合的吸収が、ゼインナノ粒子に封入されたルテインに認められる光化学安定性増強の原因であったと考える。ゼインは、特に、フェニルアラニンなどのその芳香族アミノ酸が、ＵＶを吸収する。ゼインナノ粒子に会合したレシチンなどの界面活性剤も、ＵＶに対するルテインの安定性を向上させた。この仮定に束縛されることを意図するものではないが、本発明者らは、励起ルテイン種からレシチンへの急速なエネルギー転移が、ＵＶに対する安定性を促進すると考える。全体として、封入ルテインは、複合型レシチン及びプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（商標）Ｆ１２７界面活性剤を含むゼインナノ粒子において、ＵＶ分解に対する耐性が有意に高かった。

論考
本発明者らは、無溶媒の液−液分散法を用いて、複合型レシチン／プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７界面活性剤で安定化した７．５％ルテインをロードしたゼインナノ粒子を合成した。界面活性剤の添加によって、粒度が若干増加し、多分散指数が改善された。ゼータ電位はやや変化し、封入効率が、界面活性剤によって有意に増加した。界面活性剤なしのサンプルと比較して、界面活性剤を含むサンプルでは、初期の急速なルテインの放出が減少し；早期の「バースト」放出の減少は、持続的放出にとって有益である。ゼインナノ粒子は、単純に乳化されたルテインと比較して、様々な保存条件下でルテインを分解から保護した。界面活性剤を含むルテインをロードしたゼインナノ粒子は、活性をほとんど喪失せずに、４℃で少なくとも３０日間保存することができた。ナノ粒子／界面活性剤製剤は、ＵＶ線による分解に対して少なくとも１０時間ルテインを保護した。

白内障を阻害するためのルテインを含有するポリマー（ＰＬＧＡ）ナノ粒子
一実施形態では、本発明のポリマーナノ粒子は、眼にルテインを送達するために使用される。眼に投与されるルテインは、白内障を阻害するか、又は黄斑変性を阻害するなどの用途に有益となり得る。ラットモデルから得られた本発明者らの中間結果は心強いものである。本発明者らの中間結果から、ポリマーナノ粒子が、眼にルテインを巧く送達すると共に、治療利益を提供することができることが判明した。

ラットにおいて亜セレン酸塩誘導による白内障は、核性白内障のための迅速かつ好都合
なモデルである。亜セレン酸塩を幼若子ラットに投与することにより、白内障を誘導する。いくつかの生化学的機構が、関与していると考えられ、そのようなものとして、カルシウム恒常性の損失、カルパイン誘導性タンパク質分解、クリスタリン沈殿、及び細胞骨格喪失などが挙げられる。ルテインの抗酸化物質特性は、これらの経路の少なくとも一部を阻害するのを促進することができた。ポリマーナノ粒子に封入されたルテインの新規の局所製剤は、特に、生体付着性製剤で補足されると、ルテインの眼内生体利用性を増強すると共に、その治療効果を増大した。

黄斑変性の動物モデルにおけるさらなる実験によって、黄斑変性の進行を阻害するためのルテインの新規製剤の効力が確認されるであろう。加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のモデルは、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、及び非ヒト霊長類において作製されている。例えば、ペネッシＭＥ（ＰｅｎｅｓｓｉＭＥ）、ニューリンガーＭ（ＮｅｕｒｉｎｇｅｒＭ）、カートゥネィＲＪ（ＣｏｕｒｔｎｅｙＲＪ）ら著、「加齢黄斑変性の動物モデル（Ａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｏｆａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」、モレキュラー・アスペクツ・オブ・メディシン誌（ＭｏｌＡｓｐｅｃｔｓＭｅｄ．）、２０１２年、第３３巻（４）：ｐ．４８７〜５０９を参照されたい。少なくとも４つの黄斑変性げっ歯類モデルがある。１つのモデルは、不活性化ＳＯＤ１遺伝子（ＳＯＤ１−／−マウス）を利用するものである。イマムラＹ（ＩｍａｍｕｒａＹ）、ノダＳ（ＮｏｄａＳ）、ハシズメＫ（ＨａｓｈｉｚｕｍｅＫ）、シノダＫ（ＳｈｉｎｏｄａＫ）、ヤマグチＭ（ＹａｍａｇｕｃｈｉＭ）、ウチヤマＳ（ＵｃｈｉｙａｍａＳ）、シミズＴ（ＳｈｉｍｉｚｕＴ）、ミズシマＹ（ＭｉｚｕｓｈｉｍａＹ）、シラサワＴ（ＳｈｉｒａｓａｗａＴ）、ツボタＫ（ＴｓｕｂｏｔａＫ）ら著、「ＳＯＤ１欠損マウスにおけるドルーゼン、脈絡膜新生血管、及び網膜色素上皮機能不全：加齢黄斑変性のモデル（Ｄｒｕｓｅｎ，ｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎＳＯＤ１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅ：ａｍｏｄｅｌｏｆａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」米国科学アカデミー紀要(Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．)２００６年；第１０３巻（３０）：ｐ．１１２８２〜１１２
８７を参照されたい。別のモデルは、不活性化ＡｐｏＥ遺伝子（ＡｐｏＥ−／−マウス）を利用するものである。ディスマーＳ（ＤｉｔｈｍａｒＳ）、シャララＮＡ（ＳｈａｒａｒａＮＡ）、クルシオＣＡ（ＣｕｒｃｉｏＣＡ）、レＮＡ（ＬｅＮＡ）、チャンＹ（ＺｈａｎｇＹ）、ブラウンＳ（ＢｒｏｗｎＳ）、グロスニクラウス
ＨＥ（ＧｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓＨＥ）ら著、「ブルッフ膜における基底膜沈着のマウス高脂肪餌及びレーザ光化学モデル（Ｍｕｒｉｎｅｈｉｇｈ−ｆａｔｄｉｅｔａｎｄｌａｓｅｒｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｄｅｌｏｆｂａｓａｌｄｅｐｏｓｉｔｓｉｎＢｒｕｃｈｍｅｍｂｒａｎｅ）」、アーカイブス・オブ・オフタルモロジー（Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．）、２００１年；第１１９巻（１１）：ｐ．１６４３〜１６４９を参照されたい。別のタイプのモデルは、高脂肪餌を給餌した老齢マウス（１６ヵ月）を利用する。カズンズＳＷ（ＣｏｕｓｉｎｓＳＷ）、エスピノーサ−ヘイドマンＤＧ（Ｅｓｐｉｎｏｓａ−ＨｅｉｄｍａｎｎＤＧ）、アレクサンドリドウＡ（ＡｌｅｘａｎｄｒｉｄｏｕＡ）、サールＪ（ＳａｌｌＪ）、デュボビー
Ｓ（ＤｕｂｏｖｙＳ）、シアケーＫ（ＣｓａｋｙＫ）ら著、「基底膜沈着物形成のための実験マウスモデルにおける加齢、高脂肪餌及びブルーライト曝露の役割（Ｔｈｅ
ｒｏｌｅｏｆａｇｉｎｇ，ｈｉｇｈｆａｔｄｉｅｔａｎｄｂｌｕｅｌｉｇｈｔｅｘｐｏｓｕｒｅｉｎａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｆｏｒｂａｓａｌｌａｍｉｎａｒｄｅｐｏｓｉｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、エクスペリメンタル・アイ・リサーチ（Ｅｘｐ．ＥｙｅＲｅｓ．）、２００２年；第７５巻（５）：ｐ．５４３〜５５３を参照されたい。さらに別のモデルは、黄斑変性の紫外線誘導を利用する。パベリックＳＣ（ＰａｖｅｌｉｃＳＣ）ら著、「加齢黄斑変
性のラットモデルにおけるＵＶ誘導による網膜プロテオーム変化（ＵＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ
ｒｅｔｉｎａｌｐｒｏｔｅｏｍｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｒａｔｍｏｄｅｌｏｆａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」、ビオシミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ−疾患の分子的機序（ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ−ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓｏｆＤｉｓｅａｓｅ）、２０１５年、第１８５２巻（９）：ｐ．１８３３〜１８４５を参照されたい。最初の２つのモデルは、疾患寛解の可能性に対するルテインをロードしたナノ粒子の効果を検査する場合に、より適していると思われる。最後の２つのモデルは、ＡＭＤの発症から防御する上でのルテインをロードしたナノ粒子の効果を試験する場合に、より適していると考えられる。いずれの場合も、ルテインは、角膜に局所適用される生理活性ヒドロゲル中のルテインをロードしたポリマーナノ粒子として投与される。

方法
実施例１８
一実施形態では、改変したエマルジョン／蒸発法により、ルテイン含有乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子を合成した。手短には、１００ｍｇのＰＬＧＡを１０ｍｌの酢酸エチルに溶解させた後、穏やかに攪拌しながら、１０ｍｇのルテインを添加した。続いて、酢酸エチルで飽和させた８０ｍｌのトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）８０（４ｍｇ／ｍｌ）の水溶液に、混合物を室温で滴下しながら添加した。５分の攪拌後、マイクロフルイダイザー（Ｍ−１１０Ｐ、マイクロフルイディックス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、米国、マサチューセッツ州）を用いて、約２００ＭＰａ（３０，０００ｐｓｉ）で３サイクルにわたりサンプルを処理した。その後、ロータリエバポレーター（ブチ（Ｂｕｃｈｉ）Ｒ−１２４、ブチ社（ＢｕｃｈｉＩｎｃ．）、米国、デラウエア州）を用いて、真空及び窒素注入下、溶媒を蒸発させた。１００ｋＤａスペクトラ（Ｓｐｅｃｔｒａ）／ＰＯＲＣＥ膜（スペクトラム・ランチョ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＲａｎｃｈｏ）、米国、カリフォルニア州）を用いて、ルテインをロードしたＰＬＧＡナノ粒子を水に対して２４時間透析し、その間、水を３回取り換えて、遊離界面活性剤を除去した。最後に、トレハロース（３：１ｗ／ｗ）をＰＬＧＡナノ粒子懸濁液に添加してから、凍結乾燥機（ラブコンコ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）、ミズーリ州、カンザスシティ）を用いて、サンプルを−８０℃で４８時間凍結乾燥した。ナノ粒子粉末は、使用するまで−２０℃で保存した。

実施例１９
別の実施形態では、若干異なるエマルジョン／蒸発法により、ルテイン含有乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子を合成した。これらのナノ粒子は、本発明の最初のセットの動物試験（実施例２５〜３８）で使用した。手短には、４００ｍｇのＰＬＧＡ５０：５０コポリマー（分子量３０〜６０ｋＤａ）（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミズーリ州、セントルイス）を８ｍｌの酢酸エチルに溶解させ；ポリマーが溶解した後、４０ｍｇのルテインを添加して、有機相を生成した。６０ｍＬの水中２％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（水相）と有機相を混合した後、氷浴中、約１７０ＭＰａ（２５，０００ｐｓｉ）で４回マイクロフルイダイズした（マイクロフルイディックス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、マサチューセッツ州、ウエストウッド）。ロトベイパー・ブチ（ＲｏｔｏｖａｐｏｒＢｕｃｈｉ）Ｒ−１２４（ブチレイバーテクニクＡＧ（ＢｕｃｈｉＬａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋＡＧ）、スイス）を用いて、Ｎ_２ガス下で溶媒を蒸発させた。次に、１００ｋＤａ分子量カットオフを有するスペクトラ（Ｓｐｅｃｔｒａ）／ＰｏｒＣＥセルロースエステル膜（スペクトラム・ランチョ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＲａｎｃｈｏ）、カリフォルニア州、ドミンクエズ）を用いて、ナノ粒子懸濁液を４８時間透析（８時間毎に水を取り換えながら）した。最後に、トレハロース（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミズーリ州、セントルイス）を添加した（１：１ｗ／ｗ理論比）後、懸濁液を凍結した。フリーゾーン２．５プラス（Ｆｒ
ｅｅｚｏｎｅ２．５Ｐｌｕｓ）凍結乾燥機（ラブコンコ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）、ミズーリ州、カンザスシティ）を用いて、サンプルを４０時間凍結乾燥した。

実施例２０
また別の実施形態では、若干異なるエマルジョン／蒸発法により、ルテイン含有乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子を合成した。これらのナノ粒子は、本発明の第２セットの動物試験（実施例３９〜５３）で使用した。手短には、１００ｍｇのＰＬＧＡを１０ｍｌの酢酸エチルに溶解させた後、穏やかに攪拌しながら、１０ｍｇのルテインを添加した。続いて、酢酸エチルで飽和させた８０ｍｌのトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）８０（４ｍｇ／ｍｌ）の水溶液に、混合物を室温で滴下しながら添加した。５分の攪拌後、マイクロフルイダイザー（Ｍ−１１０Ｐ、マイクロフルイディックス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、米国、マサチューセッツ州）を用いて、約２００ＭＰａ（３０，０００ＰＳＩ）で３サイクルにわたりサンプルを処理した。その後、ロータリエバポレーター（ブチ（Ｂｕｃｈｉ）Ｒ−１２４、ブチ社（ＢｕｃｈｉＩｎｃ．）、米国、デラウエア州）を用いて、真空及び窒素注入下、溶媒を蒸発させた。１００ｋＤａスペクトラ（Ｓｐｅｃｔｒａ）／ＰＯＲＣＥ膜（スペクトラム・ランチョ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＲａｎｃｈｏ）、米国、カリフォルニア州）を用いて、ルテインをロードしたＰＬＧＡナノ粒子を水に対して２４時間透析し、その間、水を３回取り換えて、遊離界面活性剤を除去した。最後に、トレハロース（３：１ｗ／ｗ）をＰＬＧＡナノ粒子懸濁液に添加してから、凍結乾燥機（ラブコンコ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）、ミズーリ州、カンザスシティ）を用いて、サンプルを−８０℃で４８時間凍結乾燥した。ナノ粒子粉末は、使用するまで−２０℃で保存した。

実施例２１
別の実施形態では、液−液分散により、ゼイン−ルテインナノ粒子を合成した。手短には、５００ｍｇのゼインを１５ｍｌのアセトン−水溶液（７０：３０、ｖ／ｖ）に溶解させた。次に、穏やかな攪拌条件下で、３ｍｇ／ｍｌの最終濃度となるまで、アセトン−水溶液にルテインを添加した。続いて、１１０ｍｌのトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）８０（３ｍｇ／ｍｌ）の水溶液に、混合物を注入した。マイクロフルイダイザー（Ｍ−１１０Ｐ、マイクロフルイディックス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、米国、マサチューセッツ州）を用いて、約２００ＭＰａ（３０，０００ＰＳＩ）で３サイクルにわたりサンプルを処理した。その後、ロータリエバポレーター（ブチ（Ｂｕｃｈｉ）Ｒ−１２４、ブチ・アナリティカル社（ＢｕｃｈｉＡｎａｌｙｔｉｃａｌＩｎｃ．）、米国、デラウエア州）を用いて、部分真空（約５００〜６００ｍｍＨｇ）及び窒素注入（８０ｍｍＨｇ）下、溶媒を蒸発させた。最後に、トレハロースをルテインをロードしたゼインナノ粒子懸濁液に質量比１：３で添加してから、−８０℃で２日間サンプルを凍結乾燥した。得られた粉末は、使用するまで−２０℃で保存した。

実施例２２
本発明者らは、ジオル（ＪＥＯＬ）１００−ＣＸシステム（ＪＥＯＬＵＳＡ社、マサチューセッツ州、ピーボディ）を用いた透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）により、実施例１９及び２０から得られたルテイン含有乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子の形状を調べた。手短には、以下のようにしてサンプルを調製した：５００μＬのナノ粒子懸濁液を造影剤（ネガティブ染色、１滴の２％酢酸ウラニル溶液）と混合した。カーボンで被覆した４００メッシュの銅グリッド上に１滴の混合物を垂らした。余剰のサンプルをフィルター紙で除去してから、グリッド上の液体膜を室温で１５分乾燥させた後、グリッドを顕微鏡に配置した。ＰＬＧＡナノ粒子は、概ね球形をしており、有意な凝集もなく、均一に分布していることが観察された。

実施例２３
本発明者らは、マルバーン・ゼータサイザー・ナノＺＳ（ＭａｌｖｅｒｎＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳ）（マルバーン・インストルメンツ社（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．）、マサチューセッツ州、サウスボロー）を用いた動的光散乱（ＤＬＳ）により、実施例１９から得たルテイン含有乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子の粒度、多分散指数（ＰＩ）、及びゼータ電位を調べた。再懸濁させたＰＬＧＡ−ルテインナノ粒子サンプルを０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。ナノ粒子の平均粒度は、１２４±４ｎｍと測定された。ＰＩは、０．１１±０．０９と測定された。ゼータ電位は、ｐＨ６．５で−５．３±１．９ｍＶと測定された。サンプルは全て、３回反復して測定した。

実施例２４
本発明者らは、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度測定によって、実施例１９からのナノ粒子のルテイン封入効率を測定した。手短には、音波処理により６ｍｇのＰＬＧＡ−ルテインナノ粒子粉末を６００μＬの水に再懸濁させた後、５．４ｍＬのアセトニトリルを添加した。混合物を４時間ボルテックスしてから、４℃にて、３０，０００×ｇで１５分間遠心分離することにより、白色のペレットを取得した。上清を採取し、ＵＶ−ｖｉｓ分光光度計（ジェネシス（Ｇｅｎｅｓｙｓ）６、サーモフィッシャー・サイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、マサチューセッツ州、ウォルサム）を用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定することにより、ルテイン濃度を取得した。サンプル及び標準曲線は、３回反復して測定した。測定したルテイン封入効率は、５２±３％であった。

実施例２５
懸濁ルテイン含有ＰＬＧＡナノ粒子を含有するｉｎｓｉｔｕ生体付着ゲル製剤の調製：
ルテイン封入ナノ粒子のビヒクルとしてこれらの実験に用いたｉｎｓｉｔｕ生体付着ゲルは、２．７％（ｗ／ｗ）生体付着ポリマー（ポリエチレンオキシド、ポリオックス（Ｐｏｌｙｏｘ）（商標）１１０５、ダウ・ケミカル（ＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌ、ＭＷ約９００，０００）と、１６．５％（ｗ／ｗ）ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）Ｐ４０７（２つのポリエチレングリコール親水性ブロックによってフランキングされるポリプロピレングリコールの中央疎水性ブロックを含むトリブロックコポリマー；２つのＰＥＧブロックのおおよその長さは、１０１反復単位であり；プロピレングリコールブロックのおおよその長さは、５６反復単位であった）の混合物を含んだ。ポリエチレンオキシド−ポロキサマーＰ４０７混合物は、熱可逆性ゲルを容易に形成する。ポリエチレンオキシド１１０５及びポロキサマーＰ４０７は、使用するまで、各々個別に滅菌水に分散させた。分散液を混合することにより、ポリエチレンオキシド／ポロキサマー混合物を調製した後、使用するまで、混合物を冷蔵庫内（４℃）で保存した。後に、連続的に穏やかに攪拌しながら、ルテイン含有ナノ粒子を生体付着ｉｎｓｉｔｕゲルに添加して、マトリックスを形成した。

生体付着マトリックスは、任意選択で、生体付着性を有する別のポリマー、コポリマー、又はポリマー若しくはコポリマーの混合物を含んでいてもよく、そのようなものとして、例えば、ポリアクリル酸誘導体、セルロース誘導体、ポリカルボフィル、その他のポリエチレンオキシド、ヒアルロン酸誘導体、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸塩などが挙げられる。マトリックスは、生体付着性であり、熱感受性であり（体温、又はより具体的には、結膜嚢の温度で、ゲルを形成し、ナノ粒子を徐放するために）、眼粘膜により耐容性であり、ナノ粒子と適合性であり、分散した生理活性成分の制御的、且つ再現可能な放出を促進すると共に、局所投与後に長期にわたる保持を呈示することが好ましい。

ポロキサマー及びポリエチレンオキシドの好ましい生体付着マトリックス組み合わせは
、いくつかの有利な特性及び特徴を提供する：ポロキサマーは、眼粘膜と適合性である。ポロキサマーは、熱可塑性ポリマーであって、より高い濃度及び温度で、安定な硬質ゲルを形成し、これは、それ自体では局所適用し難い。より低い温度では、このポリマーは、水溶液状、すなわち液体のままである。温度が上昇すると、ポリマーはゲルを形成する。組成物は、室温で液体であるが、体温（又はより具体的には、体温よりも２〜３℃低いと思われる結膜嚢の温度）でゲルとなり、これによって、一旦組成物が、角膜表面にゲルを形成したら、活性成分の徐放を可能にするのが好ましい。ポリエチレンオキシドは、優れた接着性を有する。ポリエチレンオキシド１１０５（小〜中分子量の範囲）は、その流動的特性のために、好ましい化合物である。ポリエチレンオキシドもまた、眼粘膜と適合性である。ポロキサマーとポリエチレンオキシドの混合物は、角膜に、結膜嚢中に液体として容易に適用され、体温で結膜と接触した後、ゲルを形成する生成物を提供する。混合物は、局所投与後の長期保持、従って、眼（目の内部及び網膜を含む）に対するルテインの改善された生体利用性のために、増強された生体付着性を有する。これらのノニオン性ポリマーは、生理活性成分に対して不適合性を呈示するものであってはならない。

前述したように熱可塑性ゲルを形成することができる液滴としてナノ粒子を投与するのが好ましいが、他の投与経路を用いてもよい。ポリマー成分は、任意選択で省いてもよい。あるいは、任意選択で、当技術分野で公知の他の医薬製剤（例えば、液体眼製剤（点眼薬、洗眼液、ゲル形成液）；半固体眼製剤（軟膏、ゲル）；固体眼製剤（粉末、眼内挿入物）；又はエーロゾル（加圧ガスと混合された眼科薬剤））を用いてもよい。

製剤は、ラミナエアフローフードを用いて無菌で製造し、事前に滅菌した容器中に保存した。防腐剤はいずれの製剤にも添加しなかった。
様々な割合を検査するための常用の実験によって、製剤の角膜上の滞留時間及び角膜中への浸透を増強するように、各成分の比及び濃度が最適化されている。これまで実施形態で検査された典型的な範囲には、１．５〜３．５％（ｗ／ｗ）の範囲のポリエチレンオキシド１１０５、及び１２〜１９％（ｗ／ｗ）の範囲のポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）Ｐ４０７が含まれる。

生体付着性マトリックスは、ナノ粒子の良好な分散をもたらし、保存中に均質性（物理的安定性）を維持するのに十分な粘度を有し、結膜粘膜への容易な適用を可能にすると共に、ナノ粒子の製剤に使用される物質と適合性でなければならない。

眼科製剤中のナノ粒子の濃度に応じて、粘度及び生体付着能を最適化するように、生体付着性／熱感受性ポリマーの濃度を調節することができる。実施されるルテイン含有ナノ粒子の必要ｗ／ｖ％は、そのルテインのロード量に左右される。これまで、本発明者らは、主に１〜５％ｗ／ｖ％の範囲で、生体付着性ゲルへのルテインのロードを試験してきた。これより高い、若しくは低い濃度を試験又は使用することもできる。

適切な割合で好適なポリマーを混合することにより、他の生体付着性ゲル形成マトリックスを調製してもよい。生体付着性ポリマーの例として、１種又は複数種のポリアクリル酸、ポリカルボフィル、ポリエチレンオキシド、セルロース誘導体、ヒアルロン酸誘導体、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸塩などが挙げられる。分子量は、性能を最適化するように選択することができる。

実施例２６〜３２：動物処置
４匹の妊娠したウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）雌アルビノラットは、ユリュー・ハツェガヌー医科薬科大学（ＩｕｌｉｕＨａｔｉｅｇａｎｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｙ）（クルジュ−ナポカ（Ｃｌｕｊ−Ｎａｐｏｃａ）、ルーマニア）の実験動物施設（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＦａｃｉ
ｌｉｔｙ）から取得した。各雌ラット及びその子ラットは、１２時間照明サイクル、一定温度（２２℃）のプラスチックケージに収容し、ラット用餌及び水道水は無制限に与えた。１２日齢で、以下のように子ラットを７つの群にランダムに分けた：
群１（亜セレン酸塩群、陽性対照）：ルテインに対する曝露なし
群２（ＰＬＧＡ−ＮＰ−１）には、３０％オリーブ油＋７０％小麦粉スラリーの０．５ｍＬエマルジョン中に分散させた２．５ｍｇ／ｋｇのＰＬＧＡ−ＮＰ−ルテインを毎日経口投与（これは、２．６６ｍｇルテイン／ｋｇ体重の１日用量に相当する）した。（小麦粉スラリーについては、次に、１ｍｌの水に０．３ｇの小麦粉を混合することにより調製した）。

群３（ＰＬＧＡ−ＮＰ−２）には、３０％オリーブ油＋７０％小麦粉スラリーの０．５ｍＬエマルジョン中に分散させた５ｍｇ／ｋｇのＰＬＧＡ−ＮＰ−ルテインを毎日経口投与（５．３２ｍｇルテイン／ｋｇ体重の１日用量に相当）した。（小麦粉スラリー：群２に用いたものと同じ
群４（ルテイン）には、３０％オリーブ油＋７０％小麦粉スラリーの０．５ｍＬエマルジョン中に分散させた０．００５２５ｍｇの非修飾ルテインを毎日経口投与（０．１２５ｍｇルテイン／ｋｇ体重の１日用量に相当）した。（小麦粉スラリー：群２に用いたものと同じ）。

群５（ＨＧ−ＰＬＧＡ−ＮＰ−１）は、実施例１９の生体付着性ヒドロゲル中の１ｗｔ％ＰＬＧＡ−ＮＰ−ルテインの角膜適用（片眼１滴ずつ）で、１日１回局所処置した。（３０ｍｇの凍結乾燥ルテインをロードしたＰＬＧＡＮＰを３ｍｌの生体付着性ヒドロゲルに溶解させた。ヒドロゲルの１滴の量は、約０．０１２ｍＬであり、密度は０．９４４４ｇ／ｍＬであった）。

群６（ＨＧ−ＰＬＧＡ−ＮＰ−２）は、生体付着性ヒドロゲル中の３％ＰＬＧＡ−ＮＰ−ルテインの角膜適用（１滴／各眼）により、１日１回局所処置した。（９０ｍｇの凍結乾燥ルテインをロードしたＰＬＧＡＮＰを３ｍｌの生体付着性ヒドロゲルに溶解させた。ヒドロゲルの１滴の量は、約０．０１２ｍＬであり、密度は０．９４４４ｇ／ｍＬであった）。

群７（陰性対照）−亜セレン酸塩への曝露なし、且つルテイン処置なし。
産後１３日目に、群１〜６の全動物に、亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳｅＯ_３）、３０μモル／ｋｇの単一回腹腔内注射で白内障を誘導した。その後、前述したプロトコルに従って、群２〜６の動物を毎日処置した。外部標準較正を用いたＵＶ−ＶＩＳ分光光度測定（４５０ｎｍ）によりＰＬＧＡ−ＮＰ（４２．６１μｇルテイン／ｍｇＰＬＧＡ−ＮＰ）のルテイン含量を評価した。産後２１日目に、スリットランプ検査により白内障発症を評価した。眼を次の５ステージの１つにスコアリングした：ステージ０（白内障なし）、ステージ１（若干の核混濁）、ステージ２（軽度の核混濁、核の直径の半分未満を占める中央白濁）、ステージ３（濃い混濁、核の直径の半分超を占める中央白濁）、及びステージ４（核全体に及ぶ、濃い白濁）。ウィンドウズ（登録商標）（ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標））及びエクセル（Ｅｘｃｅｌ）のＳＰＳＳ１４．０で統計を実施した。シャピロ−ウイルク（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ）検定を用いて、正規分布について変数をチェックした。ウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）検定を用いて、各群を比較した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。

生物学的実験は全て、ユリュー・ハツェガヌー医科薬科大学クルジュ−ナポカ（ＩｕｌｉｕＨａｔｉｅｇａｎｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｙＣｌｕｊ−Ｎａｐｏｃａ）の倫理委員会（ＥｔｈｉｃｓＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により承認され、実験動物の使用について規定するＥＣ指令８６／６０９／
ＥＥＣに従って実施した。

結果
実施例３３〜３９
表５は、各群について観察された白内障重症度の分布を示す。陰性対照群の動物は全て、白内障の症状を示さなかった（ステージ０）。亜セレン酸塩陽性対照群の動物は全て、両側性、ステージ４白内障を発症した。

６２．５ｍｇ／ｋｇのＰＬＧＡ−ＮＰ−ルテイン（２．６６ｍｇルテイン／ｋｇ体重の用量に相当）で経口処置した群２では、３匹の動物がステージ４白内障を発症し、１匹がステージ２白内障を発症し、１匹がステージ１白内障を発症した。１２５ｍｇ／ｋｇのＰＬＧＡ−ＮＰ−ルテイン（５．３２ｍｇルテイン／ｋｇ体重の用量に相当）で経口処置した群３では、３匹の動物がステージ４白内障を発症し、２匹がステージ３白内障を発症し、１匹がステージ２白内障を発症した。０．１２５ｍｇ／ｋｇのルテインで経口処置した群４では、２匹がステージ４白内障を発症し、２匹がステージ３白内障、及び１匹がステージ２白内障を発症した。生体付着性ヒドロゲル中１％ＰＬＧＡ−ＮＰ−ルテインで局所処置した群５では、１匹がステージ３白内障を発症し、他の４匹が、ステージ２白内障を発症した。生体付着性ヒドロゲル中３％ＰＬＧＡ−ＮＰ−ルテインで局所処置した群６では、１匹がステージ４白内障を発症し、１匹がステージ３白内障を発症し、１匹がステージ２白内障を発症し、２匹が単にステージ１白内障を発症した。

論考
亜セレン酸塩の単一回注射は、群１の陽性対照動物の１００％にステージ４核性白内障を誘導した。陰性対照群７のいずれの動物も白内障を発症しなかった。陽性及び陰性対照は両方共、予想通りに応答したため、本発明者らは、環境の影響からの悪化因子の可能性を排除することができた。ルテイン単独で経口処置した動物、又はポリマーナノ粒子に封入したルテインで経口処置した動物では、白内障の発症にわずかな（且つ、統計的に有意ではない）低減しか認められなかった。しかし、ポリマーナノ粒子に封入したルテインを含む新規の局所生体付着性製剤の角膜適用で局所処置した動物においては、白内障の発症に実質的且つ有意な低減が認められた。

これらの結果から、新規の製剤が、治療に有効な濃度でルテインを眼に送達する上で非常に有効であることが判明した。新規の製剤により送達されたルテインは、恐らく、眼の全ての構造要素における酸化ストレスを低減することにより、亜セレン酸塩誘導性白内障を防御した。ポリマーナノ粒子に封入したルテインを含む局所生体付着性製剤は、ルテイ
ンの眼内生体利用性を増大した。

実施例４０〜４６：さらなる動物処置
９匹の妊娠したウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）雌アルビノラットは、ユリュー・ハツェガヌー医科薬科大学（ＩｕｌｉｕＨａｔｉｅｇａｎｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｙ）（クルジュ−ナポカ（Ｃｌｕｊ−Ｎａｐｏｃａ）、ルーマニア）の実験動物施設（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＦａｃｉｌｉｔｙ）から取得した。各雌ラット及びその子ラットは、１２時間照明サイクル、一定温度（２２℃）のプラスチックケージ内に収容し、ラット用餌及び水道水は無制限に与えた。各雌ラットの子ラットは、以下のように９つの試験群の１つを構成した：
群１（亜セレン酸塩群、陽性対照）：ルテインに対する曝露なし
群２（ルテイン−４２６）は、生体付着性ヒドロゲル中の非修飾ルテイン（４２６μｇルテイン／ｍｌ）の角膜適用（片眼１滴ずつ）で、１日１回局所処置した。粉砕により、３．２１ｍｇの微粉砕した純粋ルテインを７．５３ｍｌの生体付着性ヒドロゲル中に分散させた。ヒドロゲル１滴の量は、約０．０１２ｍＬであり、密度は１．０２３ｇ／ｍＬであった）。ルテインの最終濃度（４２６μｇルテイン／ｍｌ）は、ヒドロゲル中１ｗｔ％ルテインをロードしたナノ粒子に相当する。（この目的は、群２、４、及び７の動物が各々、ほぼ同じ濃度のルテインを受けるようにすることである）。

群３（ルテイン−２１３０）は、生体付着性ヒドロゲル中の非修飾ルテイン（２１３０μｇルテイン／ｍｌ）の角膜適用（片眼１滴ずつ）で、１日１回局所処置した。粉砕により、１１．９９ｍｇの微粉砕した純粋ルテインを５．６３ｍｌの生体付着性ヒドロゲル中に分散させた。ヒドロゲル１滴の量は、約０．０１２ｍＬであり、密度は１．０２３ｇ／ｍＬであった）。ルテインの濃度（２１３０μｇルテイン／ｍｌ）は、ヒドロゲル中５ｗｔ％ルテインをロードしたナノ粒子に相当する。

群４（ＰＬＧＡ−ＮＰ−ルテイン４２６）は、生体付着性ヒドロゲル中の４２６μｇルテイン／ｍＬ（ルテインをロードしたＰＬＧＡナノ粒子、実施例２０）の角膜適用（片眼１滴ずつ）で、１日１回局所処置した。３７５．７ｍｇの凍結乾燥したルテインをロードしたＰＬＧＡナノ粒子を１５．２５ｍｌの生体付着性ヒドロゲルに溶解させた。ヒドロゲル１滴の量は、約０．０１２ｍＬであり、密度は１．０４０ｇ／ｍＬであった。

群５（ＰＬＧＡ−ＮＰ−１２７８）は、生体付着性ヒドロゲル中の１２７８μｇルテイン／ｍＬ（ルテインをロードしたＰＬＧＡナノ粒子、実施例２０）の角膜適用（片眼１滴ずつ）で、１日１回局所処置した。３７９．９ｍｇの凍結乾燥したルテインをロードしたＰＬＧＡナノ粒子を５．１４ｍｌの生体付着性ヒドロゲルに溶解させた。ヒドロゲル１滴の量は、約０．０１２ｍＬであり、密度は１．０４０ｇ／ｍＬであった）。

群６（ＰＬＧＡ−ＮＰ−２１３０）は、生体付着性ヒドロゲル中の２１３０μｇルテイン／ｍＬ（ルテインをロードしたＰＬＧＡナノ粒子、実施例２０）の角膜適用（片眼１滴ずつ）で、１日１回局所処置した。３７６．７ｍｇの凍結乾燥したルテインをロードしたＰＬＧＡナノ粒子を３．０６ｍｌの生体付着性ヒドロゲルに溶解させた。ヒドロゲル１滴の量は、約０．０１２ｍＬであり、密度は１．０４０ｇ／ｍＬであった）。

群７（ＺＥＩＮ−ＮＰ−４２６）は、生体付着性ヒドロゲル中の４２６μｇルテイン／ｍＬ（ルテインをロードしたゼインナノ粒子、実施例２１）の角膜適用（片眼１滴ずつ）で、１日１回局所処置した。２５２．１ｍｇの凍結乾燥したルテインをロードしたゼインナノ粒子を８．８１ｍｌの生体付着性ヒドロゲルに溶解させた。ヒドロゲル１滴の量は、約０．０１２ｍＬであり、密度は１．０４０ｇ／ｍＬであった。

群８（ＺＥＩＮ−ＮＰ−１２７８）は、生体付着性ヒドロゲル中の１２７８μｇルテイン／ｍＬ（ルテインをロードしたゼインナノ粒子、実施例２１）の角膜適用（片眼１滴ずつ）で、１日１回局所処置した。３４５．７ｍｇの凍結乾燥したルテインをロードしたゼインナノ粒子を４．０３ｍｌの生体付着性ヒドロゲルに溶解させた。ヒドロゲル１滴の量は、約０．０１２ｍＬであり、密度は１．０４０ｇ／ｍＬであった。

群９（ＺＥＩＮ−ＮＰ−２１３０）は、生体付着性ヒドロゲル中の２１３０μｇルテイン／ｍＬ（ルテインをロードしたゼインナノ粒子、実施例２１）の角膜適用（片眼１滴ずつ）で、１日１回局所処置した。３４６．１ｍｇの凍結乾燥したルテインをロードしたゼインナノ粒子を２．４２ｍｌの生体付着性ヒドロゲルに溶解させた。ヒドロゲル１滴の量は、約０．０１２ｍＬであり、密度は１．０４０ｇ／ｍＬであった。

産後１３日目に、群１〜９各々の全動物に、亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳｅＯ_３）、３０μモル／ｋｇの単一回腹腔内注射で白内障を誘導した。その後、前述したプロトコルに従って群２〜９の動物を毎日処置した。外部標準較正を用いたＵＶ−ＶＩＳ分光光度測定（４４５ｎｍ）によりＰＬＧＡ−ＮＰ（１７．２９μｇルテイン／ｍｇＰＬＧＡ−ＮＰ）及びＺＥＩＮ−ＮＰ（１４．８９μｇルテイン／ｍｇＺＥＩＮ−ＮＰ）のルテイン含量を評価した。産後２１日目に、スリットランプ検査により白内障発症を評価した。眼を次の５ステージの１つにスコアリングした：ステージ０（白内障なし）、ステージ１（若干の核混濁）、ステージ２（軽度の核混濁、核の直径の半分未満を占める中央白濁）、ステージ３（濃い混濁、核の直径の半分超を占める中央白濁）、及びステージ４（核全体に及ぶ、濃い白濁）。ウィンドウズ（登録商標）（ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標））及びエクセル（Ｅｘｃｅｌ）のＳＰＳＳ１４．０で統計を実施した。シャピロ−ウイルク（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ）検定を用いて、正規分布について変数をチェックした。ウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）検定を用いて、各群を比較した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。

生物学的実験は全て、ユリュー・ハツェガヌー医科薬科大学クルジュ−ナポカ（ＩｕｌｉｕＨａｔｉｅｇａｎｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｙＣｌｕｊ−Ｎａｐｏｃａ）の倫理委員会（ＥｔｈｉｃｓＣｏｍｍｉｓｉｏｎ）により承認され、実験動物の使用について規定するＥＣ指令８６／６０９／ＥＥＣに従って実施した。

結果
実施例４８〜５４
表６は、各群について観察された白内障重症度の分布を示す。

シャピロ−ウイルク（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ）検定によれば、データセットのいずれも、正規分布に従っていなかった。そのため、ウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）統計検定を適用した。群６（ＰＬＧＡ−ＮＰ−５）の子ラットの数が少ないために、群６のデータは、それ以上の統計的評価について有効とみなさなかった。群５（ＰＬＧＡ−ＮＰ−１２７８）、８（Ｚｅｉｎ−ＮＰ−１２７８）及び９（Ｚｅｉｎ−ＮＰ−２１３０）は、対照（群１）と統計的に有意な差を示した（ｐ＜０．０５）。

論考
ルテイン処置群（群２〜９）を陽性対照群（群１）と比較すると、群５、８及び９（群５、ｐ＝０．００１；群８、ｐ＝０．００５；及び群９、ｐ＝０．０５）だけが、白内障発症に統計的に有意な低減を示した。対照的に、濃度に関係なく（４６２μｇルテイン／ｍｌ又は２１３０μｇルテイン／ｍｌ）、生体付着性ヒドロゲル中の非修飾ルテインで処置した子ラットの眼においては、統計的に非有意な白内障発症のわずかな低減しか認められなかった。これに対し、ポリマーナノ粒子にロードしたルテイン、及びヒドロゲルに組み込んだルテインは、治療的に有効な量でルテインを眼に巧く送達した（群５、８及び９）。群５（ＰＬＧＡ−ＮＰ−１２７８）は、より好ましい転帰を提供するように思われたが、ＰＬＧＡナノ粒子ではなく、ゼイン中に同じロード量のルテインを有する群８（ＺＥＩＮ−ＮＰ−１２７８）と統計的に差がなかった（ｐ＝０．１１２）。

この時点での本発明者らの結果は、生体付着性ヒドロゲルに組み込んだナノ構造ポリマービヒクルによってルテインを眼に送達する明らかに有益な効果を証明するものである。しかし、使用した２つのポリマー（ゼイン及びＰＬＧＡ）を等級付けするのは尚早である。新規製剤によって送達されたルテインは、恐らく、角膜の酸化ストレスを低減することによって、亜セレン酸塩誘導性白内障の作用を巧く阻害した。本発明者らの知る限り、これは、局所製剤による治療に有効な濃度で眼に対するルテイン送達の成功を示す最初の報告である。

実施例５５−他の抗酸化物質
本発明のプロトタイプ実施形態は、眼に送達するためにルテインを使用した。本発明はまた、βカロテン、リコペン、レチノール、及びその他のカロテノイドなど、他の抗酸化物質を送達するために使用してもよい。本発明は、必要とされるその他の組織、例えば、皮膚に抗酸化物質を送達するために用いることができる。

その他
本明細書及び請求項で使用されるとき、組成物の「治療に有効な量」は、白内障、萎縮型黄斑変性若しくは滲出型黄斑変性（加齢黄斑変性）、シュタルガルト（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ）病、又は網膜色素変性などの眼の疾患の進行を予防、阻害する、遅らせるか、又はこれらの疾患の症状を治療する目的で、治療に有効となるのに十分である組成物の量を指す。文脈上適切であれば、組成物の「治療に有効な量」はまた、組織に局所投与する場合、組織又はその周辺組織に臨床的に重要な効果を有するような濃度の抗酸化物質を組織に送達する上で十分な組成物の量も指す。

本願に引用した全ての参照文献の完全な開示内容は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。また、２つの優先出願、すなわち、２０１４年８月１１日に提出された米国仮出願第６２／０３５，６８３号明細書、及び２０１５年６月８日に提出された米国仮出願第６２／１７２，４５５号明細書の完全な開示内容も、参照により本明細書に組み込まれる。しかし、相容れない矛盾が生じた場合には、本明細書が優先されるものとする。

Claims

哺乳動物の眼にルテインを送達する方法であって、ナノ粒子とヒドロゲルとの混合物を含む組成物を哺乳動物の眼に局所投与するステップを含み：
（ａ）前記ナノ粒子が、（ｉ）合成ポリマー又はタンパク質、（ｉｉ）ルテイン、及び（ｉｉｉ）界面活性剤を含み；前記ポリマー又はタンパク質が、前記ルテインを封入し；前記界面活性剤が、前記ポリマー若しくはタンパク質と会合し；前記ナノ粒子が、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの直径を有し；前記ナノ粒子が、天然ルテインより親水性であり；前記ナノ粒子中の前記ルテインが、酸素による分解、紫外線による分解、又はその両方に対して、遊離ルテインよりも高い耐性を有し；
（ｂ）前記ヒドロゲルが、水、熱可逆性ゲル形成ポリマー、及び生体付着性ポリマーの混合物を含み；前記組成物が、２５℃で液体であり；前記熱可逆性ゲル形成ポリマーによって、前記哺乳動物の結膜の嚢である結膜嚢の温度又は角膜の表面の温度で前記組成物がゲルになり；前記生体付着性ポリマーは、前記ゲルが前記生体付着性ポリマーなしで付着するよりも強力に、前記ゲルを前記結膜の粘膜及び前記角膜に付着させ；且つ
（ｃ）前記組成物が、前記角膜の表面に、又は前記結膜嚢中に液体として適用され；前記結膜嚢の温度又は前記角膜の表面の温度によって、前記組成物がゲルを形成し；前記ゲルが、前記結膜の粘膜、前記角膜の表面、又はその両方に付着し；付着している前記ゲルが、所定の時間にわたって前記眼にルテインを放出する、方法。
前記ポリマー又はタンパク質が、ゼインを含む、請求項１に記載の方法。
前記ポリマー又はタンパク質が、乳酸−グリコール酸共重合体を含む、請求項１に記載の方法。
前記熱可逆性ゲル形成ポリマーが、ポロキサマーである、請求項１に記載の方法。
前記生体付着性ポリマーが、ポリエチレンオキシドである、請求項１に記載の方法。
前記哺乳動物が、加齢黄斑変性を有し、前記方法が、加齢黄斑変性の症状を改善する、請求項１に記載の方法。
前記哺乳動物に加齢黄斑変性を発症するリスクがあり、前記方法が、加齢黄斑変性の発症を予防するか、又は遅延させる、請求項１に記載の方法。
前記哺乳動物が、１種又は複数種の白内障を有し、前記方法が、前記１種又は複数種の白内障の症状を改善する、請求項１に記載の方法。
前記哺乳動物に白内障を発症するリスクがあり、前記方法が、白内障の発症を予防するか、又は遅延させる、請求項１に記載の方法。
前記方法によって、前記角膜へのルテインの送達が達成される、請求項１に記載の方法。
前記方法によって、網膜へのルテインの送達が達成される、請求項１に記載の方法。
哺乳動物の組織に抗酸化物質を送達する方法であって、ナノ粒子とヒドロゲルとの混合物を含む組成物を哺乳動物の組織に局所投与するステップを含み：
（ａ）前記ナノ粒子が、（ｉ）合成ポリマー又はタンパク質、（ｉｉ）抗酸化物質、及び（ｉｉｉ）界面活性剤を含み；前記ポリマー又はタンパク質が、前記抗酸化物質を封入
し；前記界面活性剤が、前記ポリマー若しくはタンパク質と会合し；前記ナノ粒子が、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの直径を有し；前記ナノ粒子が、天然抗酸化物質より親水性であり；前記ナノ粒子中の前記抗酸化物質が、酸素による分解、紫外線による分解、又はその両方に対して、対応する遊離抗酸化物質よりも高い耐性を有し；
（ｂ）前記ヒドロゲルが、水、熱可逆性ゲル形成ポリマー、及び生体付着性ポリマーの混合物を含み；前記組成物が、２５℃で液体であり；前記熱可逆性ゲル形成ポリマーによって、前記組織の温度で前記組成物がゲルになり；前記生体付着性ポリマーは、前記ゲルが前記生体付着性ポリマーなしで付着するよりも強力に、前記ゲルを前記組織に付着させ；且つ
（ｃ）前記組成物が、前記組織に液体として適用され、前記組織の温度によって、前記組成物がゲルを形成し；前記ゲルが、前記組織に付着し；付着している前記ゲルが、所定の時間にわたって前記組織に前記抗酸化物質を放出する、方法。
ナノ粒子とヒドロゲルとの混合物を含む組成物であって：
（ａ）前記ナノ粒子が、（ｉ）合成ポリマー又はタンパク質、（ｉｉ）ルテイン、及び（ｉｉｉ）界面活性剤を含み；前記ポリマー又はタンパク質が、前記ルテインを封入し；前記界面活性剤が、前記ポリマー若しくはタンパク質と会合し；前記ナノ粒子が、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの直径を有し；前記ナノ粒子が、天然ルテインより親水性であり；前記ナノ粒子中の前記ルテインが、酸素による分解、紫外線による分解、又はその両方に対して、遊離ルテインよりも高い耐性を有し；
（ｂ）前記ヒドロゲルが、水、熱可逆性ゲル形成ポリマー、及び生体付着性ポリマーの混合物を含み；前記組成物が、２５℃で液体であり；前記熱可逆性ゲル形成ポリマーによって、３５℃以上の温度で前記組成物がゲルになり；前記生体付着性ポリマーは、前記ゲルが前記生体付着性ポリマーなしで付着するよりも強力に、前記ゲルを哺乳動物の組織に付着させるように構成されており；且つ、付着している前記ゲルが、所定の時間にわたって哺乳動物の組織にルテインを放出するように構成されている、組成物。
ナノ粒子とヒドロゲルとの混合物を含む組成物であって：
（ａ）前記ナノ粒子が、（ｉ）合成ポリマー又はタンパク質、（ｉｉ）抗酸化物質、及び（ｉｉｉ）界面活性剤を含み；前記ポリマー又はタンパク質が、前記抗酸化物質を封入し；前記界面活性剤が、前記ポリマー若しくはタンパク質と会合し；前記ナノ粒子が、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの直径を有し；前記ナノ粒子が、対応する天然抗酸化物質より親水性であり；前記ナノ粒子中の前記抗酸化物質が、酸素による分解、紫外線による分解、又はその両方に対して、対応する遊離抗酸化物質よりも高い耐性を有し；
（ｂ）前記ヒドロゲルが、水、熱可逆性ゲル形成ポリマー、及び生体付着性ポリマーの混合物を含み；前記組成物が、２５℃で液体であり；前記熱可逆性ゲル形成ポリマーによって、３５℃以上の温度で前記組成物がゲルになり；前記生体付着性ポリマーは、前記ゲルが前記生体付着性ポリマーなしで付着するよりも強力に、前記ゲルを哺乳動物の組織に付着させるように構成されており；且つ、付着している前記ゲルが、所定の時間にわたって哺乳動物の組織に前記抗酸化物質を放出するように構成されている、組成物。
前記抗酸化物質が、カロテノイドである、請求項１４に記載の組成物。
前記カロテノイドが、βカロテン、リコペン、及びレチノールからなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。