JP2017518975A - 化学的に固定された二重特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、2014年5月10日に出願された米国特許仮出願第61/991,508号の優先権を主張する。
(a)第1の抗体「A」を、ヒンジ領域内の重鎖間の実質的にすべてのジスルフィド結合が切断されるのに充分な条件下で、還元剤と接触させ、各々が1本の重鎖に結合している1本の軽鎖を含むものである1対の第1の抗体断片A’を得ること、該重鎖は、前記ジスルフィド結合の該還元により形成された1個以上の反応性チオール基を有するものである;
(b)第1のヘテロ二官能性リンカーを第1の抗体断片A’に結合させ(ここで、第1のヘテロ二官能性リンカーは(i)第1の抗体断片A’の重鎖の反応性チオール基との共有結合のための第1のチオール反応性官能基および(ii)アジドを含むものである。)、アジド官能基化された第1の抗体断片を形成すること;
(c)第2の抗体「B」を、ヒンジ領域内の重鎖間の実質的にすべてのジスルフィド結合が切断されるのに充分な条件下で、還元剤と接触させ、各々が1本の重鎖に結合している1本の軽鎖を含むものである1対の第2の抗体断片B’を得ること、該重鎖は、前記ジスルフィド結合の該還元により形成された1個以上の反応性チオール基を有するものである;
(d)第2のヘテロ二官能性リンカーを前記第2の抗体断片B’に結合させ(前記第2のヘテロ二官能性リンカーは:(i)前記第2の抗体断片の前記重鎖の反応性チオール基との共有結合のための第2のチオール反応性官能基;および(ii)アルキンを含むものである。);アルキン官能基化された第2の抗体断片を形成すること;
(e)前記アジド官能基化された第1の抗体断片を前記アルキン官能基化された第2の抗体断片と反応させて、前記アジドと前記アルキンとの1,3−双極子付加環化によって前記第1の抗体断片を前記第2の抗体断片に共有結合させ、化学的に固定された二重特異性抗体「AB」または「BA」を形成すること
を含むものである。
Ra、Rb、RcおよびRdは独立して、−O−、−NRN−、−CH2−、−(CH2)n−、−(CR* 2)n−、−(CH2CH2−O)n−、−(CR* 2CR* 2−O)n−、−(O−CH2CH2)n−、−(O−CR* 2CR* 2)n−、−CR*=CR*−(シスまたはトランス)、−N=C−、−C=N−、−N=N−、−C≡C−、−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−、−(C=O)−(CH2)n−、−(CH2)n−(C=O)−(CH2)n−、−O−(C=O)−、−(C=O)−O−、−O−(C=O)−O−、−(CH2)n−(C=O)−O−、−O−(C=O)−(CH2)n、−(C=O)−O−(CH2)n−、−(CH2)n−O−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−O−(CH2)n−、−(CH2)n−O−(C=O)−(CH2)n−、−NRN−(C=O)−、−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−O−、−O−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−NRN−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−(CH2)n、−(C=O)−NRN−(CH2)n−、−(CH2)n−NRN−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−−(CH2)n−、−(CH2)n−NRN−(C=O)−(CH2)n−、−(C=O)−NRN−(CH2CH2−O)n−、−(CH2CH2−O)n−(C=O)−NRN−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−(CH2CH2−O)n−、−(CH2CH2−O)n−(C=O)−NRN−(CH2)n−、および2から8員の環式炭化水素、複素環、アリール、またはヘテロアリール環;(ここで、「n」は独立してゼロまたは1から10の整数である。)からなる群より選択され;「l」、「p」、「q」および「r」は独立してゼロまたは1から10の整数であり;
Ωは結合(即ち、存在しない。)であるかまたは、C3−26の炭化水素環もしくは、場合により4個までの縮合環を含む縮合環系であるかのいずれかであり、各環は3から8個の構成員を有し、場合により各環内にO、SおよびNから選択される1から4個のヘテロ原子を含むものである。好ましくは、Ωは、シクロオクタン環に縮合しているか、または8員の複素環式の環もしくは環系に縮合している1,2,3−トリアゾール環であり;
R*およびRNは独立して、各存在においてHであるか、またはC1−12炭化水素のいずれかであり、ハロゲン、O、SおよびNから選択される1から6個のヘテロ原子で場合により置換されており;ここで、任意の2つの基R*および/またはRNは一体となって3から8員の環を形成していてもよい。
ここで、Zは独立して、各存在においてH、Br、IおよびSPhから選択される。一部の実施形態では、少なくとも1つのZの存在はHではないが、マレイミドの場合、Zは各存在において水素であり得る。Mは独立して、各存在において、CR*またはNのいずれかである。
Ra、Rb、RcおよびRdは独立して、各存在において、−O−、−NRN−、−CH2−、−(CH2)n−、−(CR* 2)n−、−(CH2CH2−O)n−、−(CR* 2CR* 2−O)n−、−(O−CH2CH2)n−、−(O−CR* 2CR* 2)n−、−CR*=CR*−(シスもしくはトランス)、−N=C−、−C=N−、−N=N−、−C≡C−、−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−、−(C=O)−(CH2)n−、−(CH2)n−(C=O)−(CH2)n−、−O−(C=O)−、−(C=O)−O−、−O−(C=O)−O−、−(CH2)n−(C=O)−O−、−O−(C=O)−(CH2)n、−(C=O)−O−(CH2)n−、−(CH2)n−O−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−O−(CH2)n−、−(CH2)n−O−(C=O)−(CH2)n−、−NRN−(C=O)−、−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−O−、−O−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−NRN−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−(CH2)n、−(C=O)−NRN−(CH2)n−、−(CH2)n−NRN−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−−(CH2)n−、−(CH2)n−NRN−(C=O)−(CH2)n−、−(C=O)−NRN−(CH2CH2−O)n−、−(CH2CH2−O)n−(C=O)−NRN−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−(CH2CH2−O)n−、−(CH2CH2−O)n−(C=O)−NRN−(CH2)n−、または2から8員の環式炭化水素、複素環、アリール、もしくはヘテロアリール環;(「n」は独立して、各存在において、ゼロまたは1から10の整数のいずれかである。)から選択され;「l」、「p」、「q」および「r」は独立して、ゼロまたは1から10の整数のいずれかであり;
Ωは結合(即ち、存在しない。)または、C3−26の炭化水素環もしくは、場合により4個までの縮合環を含む縮合環系であるかのいずれかであり、各環は3から8個の構成員を有し、場合により各環内にO、SおよびNから選択される1から4個のヘテロ原子を含むものである。一実施形態では、Ωは、シクロオクタン環に縮合しているか、または8員の複素環式の環もしくは環系に縮合している1,2,3−トリアゾール環を含むものである。
(a)各抗体Aと抗体Bを還元すること、ここで、還元条件は、ヒンジ残基配列(EU−インデックスの番号付け:残基226から229;カバットの番号付け:残基239から242)CPPCまたはCPSCまたはSPPCまたはSPSCを有する各抗体のヒンジ領域内の任意の鎖間ジスルフィド結合または鎖内ジスルフィド結合を破壊するものである;
(b)
からなる群より選択される化合物を;
半抗体Aのヒンジコア配列の一方または両方のCys残基(EU−インデックスの番号付け:残基226および229;カバットの番号付け:残基239および242)に連結させ、連結部含有半抗体Aを形成すること;
(c)
(d)ほぼ等モル量の連結部含有抗体Aと連結部含有抗体Bを中性条件下でインキュベートし、連結された二重特異性抗体ABを形成すること
を含む方法を提供する。
を含むものである、IgGクラスの抗体「A」またはその断片とIgGクラスの抗体「B」に由来する化学的に固定された二重特異性抗体「AB」または「BA」を提供する。
(a)抗体A由来の1本の重鎖と軽鎖を含む第1の抗体断片A’、該重鎖は1個以上の反応性チオール基を有するものである;
(b)1本の重鎖と軽鎖を含む第2の抗体断片B’、該重鎖は1個以上の反応性チオール基を有するものである、
を含むものであり;
前記第1の抗体断片と第2の抗体断片は、リンカーを介して前記第1の抗体断片の反応性チオールに結合しているアジドとリンカーを介して前記第2の抗体断片の反応性チオールに結合しているアルキンとの付加環化反応により形成された1,2,3−トリアゾールによって共有結合されている、二重特異性抗体を提供する。該リンカーは上記のものである。抗体断片A’およびB’は、IgG1、IgG2またはIgG4免疫グロブリンまたはそのFab2断片に由来するものである。
からなる群より選択される構造を有するA部分により;
半抗体Aのヒンジコア配列の一方または両方のCys残基(EU−インデックスの番号付け:残基226および229;カバットの番号付け:残基239および242)に連結させ、連結部含有半抗体Aを形成する;
(c):
(d)ほぼ等モル量の連結部含有抗体Aと連結部含有抗体Bを中性条件下でインキュベートし、連結された二重特異性抗体ABを形成すること。
(a)ヒンジ残基配列(EU−インデックスの番号付け:残基226から229;カバットの番号付け:残基239から242)CPPCまたはCPSCまたはSPPCまたはSPSCを有する第1の抗体「A」とヒンジ残基配列(EU−インデックスの番号付け:残基226から229;カバットの番号付け:残基239から242)CPPCまたはCPSCまたはSPPCまたはSPSCを有する第2の抗体「B」を還元し、半抗体Aと半抗体Bを形成すること、ここで、抗体Aは第1の標的に結合するものであり、抗体Bは第2の標的に結合するものであり、還元条件は、ヒンジ残基配列(残基226から229)CPPCまたはCPSCまたはSPPCまたはSPSCを有するクラスの抗体のヒンジ領域内の任意の鎖間ジスルフィド結合または鎖内ジスルフィド結合を破壊するものである;
(b)式Iの化合物を、半抗体Aのヒンジコア配列の1個または2個のCys残基(EU−インデックスの番号付け:残基226および229;カバットの番号付け:残基239および242)に連結させ:
からなる群より選択される構造を有する連結部含有半抗体Aを形成すること;
(c)式IIの化合物を、抗体Bのヒンジコア配列の1個または2個のCys残基(EU−インデックスの番号付け:残基226および229;カバットの番号付け:残基239および242)に連結させ:
(d)ほぼ等モル量の連結部含有抗体Aと連結部含有抗体Bを中性条件下でインキュベートし、連結された二重特異性抗体ABを形成すること
を含む方法を提供する。
を含むものである、IgGクラスの抗体「A」とIgGクラスの抗体「B」に由来する化学的に固定された二重特異性抗体「AB」または「BA」を提供する。好ましくは、半抗体Aを形成するための抗体Aおよび半抗体Bを形成するための抗体Bの還元は還元剤中で、例えば、L−システイン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、システアミン、TCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン)、2−MEA(2−メルカプトエチルアミン)およびその組み合わせ中で行われる。
この実施例は、本開示の方法による二重特異性抗体の合成を示す。図4は、IgGクラスの抗体のヒンジ領域内の2個のCys残基への化学的コンジュゲーションによる二重特異性のモノクローナル抗体(mAb)を創出するためのスキームを示す。本開示の二重特異性mAbは、そのそれぞれのヒンジ領域で化学結合されている2種類の半抗体断片で構成されている。二重特異性mAbを合成するための方法は、図5に示す3つの主要な工程を伴う。第1工程は、2種類の異なるmAb、それぞれAとBのヒンジ内のジスルフィドの選択的還元である。第2工程は、各mAbの同じ重鎖上の2つのシステイン間へのリンカーXまたはYによる鎖内結合の導入である。この鎖内結合過程により、2種類の化学的に固定されたmAb断片A’およびB’がもたらされる。最後の工程では、この2種類のmAb断片を、XとY間の化学ライゲーションによって一体に連結させ、二重特異性抗体ABを形成する。
この実施例は、実施例1で作製した二重特異性抗体が元の半Mabの両方の結合特性を保持していたことを示す。
2.5gの3,4−ジブロモ−1H−ピロール−2,5−ジオン(10mmol)と1gのNMM(60mLのTHF中)にMeOCOCl(10mmol、10mlのDCM中940mg)を滴下し、20分間撹拌し、次いで、反応溶液を6omLのDCMで希釈し、水で3回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムによって撹拌し、濃縮し、2.65gの3,4−ジブロモ−2,5−ジオキソ−2H−ピロール−1(5H)−カルボン酸メチルを得た。311mg(1mmol)のこの化合物に、2−(2−アジドエトキシ)エタンアミン(130mg、1mmol)と5mLのDCMを添加し、TLCにより反応が20分で終了したことが示され、次いでDCMとブラインによって抽出し、NH4Cl溶液によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いでカラム精製のために濃縮し、2:1のヘキサンとエチルエチラートによりフラッシングし、230mgの1−(2−(2−アジドエトキシ)エチル)−3,4−ジブロモ−1H−ピロール−2,5−ジオンを得た。1HNMR:3.32ppm(t,J=5.0Hz,1H)、3.40ppm(t,J=5.0Hz,1H)、3.50ppm(q,J=5.0Hz,1H)、3.62ppm(t,J=5.0Hz,1H)、3.63−3.69ppm(m,3H)、3.84ppm(t,J=5Hz,1H).Fw:365.9、C8H8Br2N4O3;質量ピーク(1:2:1):366.9、368.9、370.9。
この実施例は、IgGクラスの抗体のヒンジ領域内に存在する1個のCys残基を用いた二重特異性抗体の化学的創出を示す。本明細書に記載の出発mAbは改変ヒンジ領域を含むものであり、この改変ヒンジ領域では、各鎖上の同じ位置の1個のCysがSerに変異され、従ってヒンジはジスルフィドが1つだけになっている。二重特異性mAbの創出方法は3つの主要な工程を伴う(図1)。第1工程は、2種類の異なるmAb、それぞれAとBのヒンジ内のジスルフィドの選択的還元である。第2工程は、システインベースでのコンジュゲーションによる官能性部分XまたはYの導入である。このCys連結工程により2種類の化学的に固定されたmAb断片A’およびB’がもたらされる。最後の工程では、この2種類のmAb断片を、XとY間の化学ライゲーションによって一体に連結させ、二重特異性抗体ABを形成する。この試験では、ヒンジ領域内変異(SPPC)を有するIgG1モノクローナル抗体を使用した。
この実施例は、本明細書に開示の方法による、本開示の化学連結構造体が各半抗体断片のヒンジ領域を互いに連結している二重特異性抗体の作製方法を示す。この抗体の骨格は:ヒンジ内変異(SPSC)を有するIgG4であった。
アジド−マレイミド(5.0当量)(DMSO中)を抗体試料に添加した。抗体試料中のDMSOの最終容量は約5%(v/v)であった。コンジュゲーション反応を室温で1時間、カルーセルによる混合下で行った。試料を先に記載のとおりに洗浄した。
この実施例は、クリック反応による二重特異性抗体の創出を示す。図10は、2種類の半抗体断片間のクリックコンジュゲーションによる二重特異性抗体の創出を示す。2種類の半抗体断片間のクリック反応を図10に示す。半抗体−アジド断片(500μg)(PBS中(5.0mg/mL))に半抗体−DBCO断片(500μg)(PBS中(5.0mg/mL))を添加した。反応を室温で2時間、カルーセルによる混合下で行った。混合物をSDS PAGE分析(図11)およびイオン交換クロマトグラフィーによる精製に供した。
この実施例は、本明細書において作製した二重特異性抗体についての種々のアッセイ結果を示す。二重特異性抗体の細胞ベースの結合と機能がみられる。二重特異性抗体CBA−0710はMDA−MB−231(ヒト乳がん)細胞に結合した(図15)(フローサイトメトリーによってアッセイ)。抗体のEC50値を調べた。抗原−1と抗原−2の両方を発現しているMDA−MB−231トリプルネガティブ乳がん(TNBC)細胞を、無酵素細胞解離バッファー(GIBCO)を用いて収集し、V字底96ウェルプレート(50,000細胞/ウェル)に移した。細胞を氷上で45分間、二重特異性抗体CBA−0710、または親の単一特異性抗−抗原−1抗体もしくは抗−抗原−2抗体のいずれかの連続希釈物とともに、FACSバッファー(PBS+2%FBS)+NaN3中でインキュベートした。FACSバッファー中で2回の洗浄後、フィコエリトリンコンジュゲート抗−ヒトIgG(γ−鎖特異的)の1:1000希釈物を添加し、30分間インキュベートした。最後の洗浄後、蛍光強度をIntellicyt High Throughput Flow Cytometer(HTFC)で測定した。データを、Graphpad Prismソフトウェアおよび非線形回帰フィットを用いて解析した。データ点を、陽性標識細胞の蛍光強度中央値(MFI)+/−標準誤差として示す。EC50値は、細胞に対する最大結合の50%が達成される抗体濃度として報告する。
この実施例は、F(ab)’2抗体A’とB’を用いて本開示の二重特異性抗体を合成するためのスキームを示す。本明細書に記載の二重特異性F(ab)’2は、ヒンジ領域で化学結合された2種類のF(ab)’断片で構成されている(図20)。出発抗体はIgG1またはIgG4アイソタイプのいずれかである。出発抗体は修飾ヒンジ領域を含むものであり、この修飾ヒンジ領域ではCys残基がSer残基に変異され、ヒンジ領域のジスルフィドが1つだけになっている。二重特異性F(ab)’2の化学的に固定された二重特異性抗体の創出は4つの主要な工程を伴う。第1工程はFc断片の除去である。第2工程は、それぞれ抗体AとBの選択的還元である。第3工程は、システインベースでのコンジュゲーションによるヒンジ領域内への官能性部分XまたはYの導入により、それぞれ化学修飾された抗体断片A’とB’をもたらすことである。最後の工程では、2種類の抗体断片を、XとY間の化学ライゲーションによって一体に連結させ、二重特異性F(ab)’2を形成する。この合成のスキームを図21に示す。
この実施例は、IgG2抗体A’とB’を用いて本開示の二重特異性抗体を合成するためのスキームを示す。本明細書に記載の二重特異性IgG2は、ヒンジ領域で化学結合された2種類のIgG2断片で構成されている(図29)。出発抗体はIgG2アイソタイプである。二重特異性IgG2の創出は3つの主要な工程を伴う。第1工程は、まだホモ二量体構造を維持しているIgG2抗体のヒンジ領域内の(4つのうちの)1つまたは2つのジスルフィド結合の還元である。第2工程は、システインベースでのコンジュゲーションによるヒンジ内への官能性部分XまたはYの導入により、それぞれ化学修飾された抗体断片A’とB’をもたらすことである。最後の工程では、この2種類の抗体をXとY間の化学ライゲーションによって一体に連結させ、二重特異性_IgG2を形成する。
コンジュゲーションのため、DBCO−マレイミド(Click Chemistry Tools,A108−100)のDMSO(Sigma−Aldrich,472301)中のストック溶液を調製し、5当量のDBCO−マレイミドのDMSO溶液をIgG2_A試料(TCEPの精製なし)に添加した。抗体試料中のDMSOの最終容量は約5%(v/v)であった。コンジュゲーション反応を室温で1時間、カルーセルによる混合下で行った。アジド−マレイミド(5当量)のDMSO溶液をIgG2(B)試料に添加した。抗体試料中のDMSOの最終容量は約5%(v/v)であった。コンジュゲーション反応を室温で1時間、カルーセルによる混合下で行った。
(a)各抗体Aと抗体Bを還元すること、ここで、還元条件は、ヒンジ残基配列(EU−インデックスの番号付け:残基226から229;カバットの番号付け:残基239から242)CPPC(配列番号2)またはCPSC(配列番号1)またはSPPC(配列番号3)またはSPSC(配列番号4)を有する各抗体のヒンジ領域内の任意の鎖間ジスルフィド結合または鎖内ジスルフィド結合を破壊するものである;
(b)
(a)ヒンジ残基配列(EU−インデックスの番号付け:残基226から229;カバットの番号付け:残基239から242)CPPC(配列番号2)またはCPSC(配列番号1)またはSPPC(配列番号3)またはSPSC(配列番号4)を有する第1の抗体「A」とヒンジ残基配列(EU−インデックスの番号付け:残基226から229;カバットの番号付け:残基239から242)CPPC(配列番号2)またはCPSC(配列番号1)またはSPPC(配列番号3)またはSPSC(配列番号4)を有する第2の抗体「B」を還元し、半抗体Aと半抗体Bを形成すること、ここで、抗体Aは第1の標的に結合するものであり、抗体Bは第2の標的に結合するものであり、還元条件は、ヒンジ残基配列(残基226から229)CPPC(配列番号2)またはCPSC(配列番号1)またはSPPC(配列番号3)またはSPSC(配列番号4)を有するクラスの抗体のヒンジ領域内の任意の鎖間ジスルフィド結合または鎖内ジスルフィド結合を破壊するものである;
(b)式Iの化合物を、半抗体Aのヒンジコア配列の1個または2個のCys残基(EU−インデックスの番号付け:残基226および229;カバットの番号付け:残基239および242)に連結させ:
この実施例は、IgGクラスの抗体のヒンジ領域内に存在する1個のCys残基を用いた二重特異性抗体の化学的創出を示す。本明細書に記載の出発mAbは改変ヒンジ領域を含むものであり、この改変ヒンジ領域では、各鎖上の同じ位置の1個のCysがSerに変異され、従ってヒンジはジスルフィドが1つだけになっている。二重特異性mAbの創出方法は3つの主要な工程を伴う(図1)。第1工程は、2種類の異なるmAb、それぞれAとBのヒンジ内のジスルフィドの選択的還元である。第2工程は、システインベースでのコンジュゲーションによる官能性部分XまたはYの導入である。このCys連結工程により2種類の化学的に固定されたmAb断片A’およびB’がもたらされる。最後の工程では、この2種類のmAb断片を、XとY間の化学ライゲーションによって一体に連結させ、二重特異性抗体ABを形成する。この試験では、ヒンジ領域内変異(SPPC(配列番号3))を有するIgG1モノクローナル抗体を使用した。
この実施例は、本明細書に開示の方法による、本開示の化学連結構造体が各半抗体断片のヒンジ領域を互いに連結している二重特異性抗体の作製方法を示す。この抗体の骨格は:ヒンジ内変異(SPSC(配列番号4))を有するIgG4であった。
Claims (26)
- 第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための方法であって:
(a)前記第1の抗体Aを、ヒンジ領域内の重鎖間の実質的にすべてのジスルフィド結合が切断されるのに充分な条件下で、還元剤と接触させ、各々が1本の重鎖に結合している1本の軽鎖を含むものである1対の第1の抗体断片A’を得ること、ここで、該重鎖は、前記ジスルフィド結合の還元により形成された1個以上の反応性チオール基を有するものである;
(b)第1のヘテロ二官能性リンカーを前記第1の抗体断片A’に結合させ(前記第1のヘテロ二官能性リンカーは(i)前記第1の抗体断片の前記重鎖の反応性チオール基との共有結合のための第1のチオール反応性官能基および(ii)アジドを含むものである。)、これにより、アジド官能基化された第1の抗体断片を形成すること;
(c)前記第2の抗体Bを、ヒンジ領域内の重鎖間の実質的にすべてのジスルフィド結合が切断されるのに充分な条件下で、還元剤と接触させ、各々が1本の重鎖に結合している1本の軽鎖を含むものである1対の第2の抗体断片B’を得ること、ここで、該重鎖は、前記ジスルフィド結合の該還元により形成された1個以上の反応性チオール基を有するものである;
(d)第2のヘテロ二官能性リンカーを前記第2の抗体断片B’に結合させ(前記第2のヘテロ二官能性リンカーは:(i)前記第2の抗体断片の前記重鎖の反応性チオール基との共有結合のための第2のチオール反応性官能基および(ii)アルキンを含むものである。);これにより、アルキン官能基化された第2の抗体断片を形成すること;ならびに
(e)前記アジド官能基化された第1の抗体断片を前記アルキン官能基化された第2の抗体断片と反応させて、前記アジドと前記アルキンとの付加環化によって前記第1の抗体断片を前記第2の抗体断片に共有結合させ、化学的に固定された二重特異性抗体「AB」または「BA」を形成すること
を含む方法。 - 前記第1のヘテロ二官能性リンカーが形態Q−L−N3を有するものであり、ここで、Qは、アルキルハライド、ベンジルハライド、マレイミド、ハロ−マレアミドまたはジハロ−マレイミドを含むチオール反応性官能基であり;Lは、3から60個の原子を有する炭化水素リンカーであり、N3はアジド基である、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項1に記載の方法。
- 前記第1のヘテロ二官能性リンカーが形態Q−L−N3を有するものであり、ここで、Qは、マレイミド、ハロ−マレアミドまたはジハロ−マレイミド基を含むチオール反応性官能基であり;Lは、単位−(CH2CH2−O)n−および/または−(O−CH2CH2)n−(「n」は独立して1から20の整数である。)を有するポリマー形状の3から60個の原子を有する炭化水素リンカーであり;N3はアジド基である、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項1に記載の方法。
- 前記第1のヘテロ二官能性リンカーが、形態:
ここで、
Qは、形態:
ここで、Zは独立してH、Br、IおよびSPhからなる群より選択されるが、少なくとも1つのZの存在はHではないものとし;Mは独立してCR*またはNのいずれかであり;
X1、X2、X3、X2、X4およびX5は独立して、結合、−O−、−NRN−、−N=C−、−C=N−、−N=N−、−CR*=CR*−(シスまたはトランス)、−C≡C−、−(C=O)−、−(C=O)−O−、−(C=O)−NRN−、−(C=O)−(CH2)n−、−(C=O)−O−(CH2)n−、−(C=O)−NRN−(CH2)n−および−(C=O)−NRN−(CH2CH2−O)n−(ここで、「n」はゼロまたは1から10の整数のいずれかである。)からなる群より選択され;
Ra、Rb、RcおよびRdは独立して、−O−、−NRN−、−CH2−、−(CH2)n−、−(CR* 2)n−、−(CH2CH2−O)n−、−(CR* 2CR* 2−O)n−、−(O−CH2CH2)n−、−(O−CR* 2CR* 2)n−、−CR*=CR*−(シスもしくはトランス)、−N=C−、−C=N−、−N=N−、−C≡C−、−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−、−(C=O)−(CH2)n−、−(CH2)n−(C=O)−(CH2)n−、−O−(C=O)−、−(C=O)−O−、−O−(C=O)−O−、−(CH2)n−(C=O)−O−、−O−(C=O)−(CH2)n、−(C=O)−O−(CH2)n−、−(CH2)n−O−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−O−(CH2)n−、−(CH2)n−O−(C=O)−(CH2)n−、−NRN−(C=O)−、−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−O−、−O−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−NRN−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−(CH2)n、−(C=O)−NRN−(CH2)n−、−(CH2)n−NRN−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−−(CH2)n−、−(CH2)n−NRN−(C=O)−(CH2)n−、−(C=O)−NRN−(CH2CH2−O)n−、−(CH2CH2−O)n−(C=O)−NRN−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−(CH2CH2−O)n−、−(CH2CH2−O)n−(C=O)−NRN−(CH2)n−、または2から8員の環式炭化水素、複素環、アリール、もしくはヘテロアリール環からなる群より選択され;ここで、「n」は独立してゼロまたは1から10の整数のいずれかであり;
「l」、「p」、「q」および「r」は独立してゼロまたは1から10の整数のいずれかであり;
Ωは結合であるか、またはC3−26の炭化水素環もしくは、場合により4個までの縮合環を含む縮合環系であるかのいずれかであり、該環の各々は3から8個の構成員を有し、場合により各環内にO、SおよびNから選択される1から4個のヘテロ原子を含むものであり;
ここで、R*およびRNは独立してHまたはC1−12炭化水素のいずれかであり、ハロゲン、O、SおよびNからなる群より選択される1から6個のヘテロ原子で場合により置換されており;
R*および/またはRNは一体となって3から8員の環を形成していてもよい、
第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項2に記載の方法。 - Qがマレイミド、ブロモ−マレイミドまたはジブロモマレイミドである、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項4に記載の方法。
- 前記第2のヘテロ二官能性リンカーが形態Q−L−Gを有するものであり、ここで、Qは、アルキルハライド、ベンジルハライド、マレイミド、ハロ−マレアミドまたはジハロ−マレイミドを含むチオール反応性官能基であり;Lは、3から60個の原子を有する炭化水素リンカーであり、Gがアルキン含有基である、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項1に記載の方法。
- Gが−C≡CHである、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項1に記載の方法。
- Gが、−C≡C−結合を有するC8環を含むものである、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項1に記載の方法。
- 前記第2のヘテロ二官能性リンカーが形態Q−L−Gを有するものであり、ここで、Qは、マレイミド、ハロ−マレアミドまたはジハロ−マレイミド基を含むチオール反応性官能基であり;Lは、3から60個の原子を有し、単位−(CH2CH2−O)n−または−(O−CH2CH2)n−(「n」は独立して1から20の整数である。)を有するポリマーを含む炭化水素リンカーであり;Gが、アジドとの1,3双極子付加環化反応を行い得る−C≡C−結合を有するC8環を含むC8−20炭化水素である、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項1に記載の方法。
- 前記第2のヘテロ二官能性リンカーが、形態:
ここで、
Qは、形態:
ここで、Zは独立してH、Br、IおよびSPhからなる群より選択されるが、少なくとも1つのZの存在はHではないものとし;Mは独立してCR*またはNのいずれかであり;
Gは、前記アジドとの1,3双極子付加環化反応を行い得る−C≡C−結合を有するC8環を含むC8−20炭化水素基であり;
X1、X2、X3、X2、X4およびX5は独立して、各存在において、結合、−O−、−NRN−、−N=C−、−C=N−、−N=N−、−CR*=CR*−(シスまたはトランス)、−C≡C−、−(C=O)−、−(C=O)−O−、−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−、−NRN−(C=O)−O−、−(C=O)−(CH2)n−、−(C=O)−O−(CH2)n−、−(C=O)−NRN−(CH2)n−および−(C=O)−NRN−(CH2CH2−O)n−(ここで、「n」はゼロまたは1から10の整数のいずれかである。)からなる群より選択され;
Ra、Rb、RcおよびRdは独立して、−O−、−NRN−、−CH2−、−(CH2)n−、−(CR* 2)n−、−(CH2CH2−O)n−、−(CR* 2CR* 2−O)n−、−(O−CH2CH2)n−、−(O−CR* 2CR* 2)n−、−CR*=CR*−(シスもしくはトランス)、−N=C−、−C=N−、−N=N−、−C≡C−、−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−、−(C=O)−(CH2)n−、−(CH2)n−(C=O)−(CH2)n−、−O−(C=O)−、−(C=O)−O−、−O−(C=O)−O−、−(CH2)n−(C=O)−O−、−O−(C=O)−(CH2)n、−(C=O)−O−(CH2)n−、−(CH2)n−O−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−O−(CH2)n−、−(CH2)n−O−(C=O)−(CH2)n−、−NRN−(C=O)−、−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−O−、−O−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−NRN−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−、−NRN−(C=O)−(CH2)n、−(C=O)−NRN−(CH2)n−、−(CH2)n−NRN−(C=O)−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−−(CH2)n−、−(CH2)n−NRN−(C=O)−(CH2)n−、−(C=O)−NRN−(CH2CH2−O)n−、−(CH2CH2−O)n−(C=O)−NRN−、−(CH2)n−(C=O)−NRN−(CH2CH2−O)n−、−(CH2CH2−O)n−(C=O)−NRN−(CH2)n−、または2から8員の環式炭化水素、複素環、アリール、もしくはヘテロアリール環からなる群より選択され;ここで、「n」は独立してゼロまたは1から10の整数のいずれかであり;「l」、「p」、「q」および「r」は独立してゼロまたは1から10の整数のいずれかであり;
Ωは独立して、結合または、C3−26の炭化水素環もしくは、場合により4個までの縮合環を含む縮合環系であるかのいずれかであり、各環は3から8個の構成員を有し、場合により各環内にO、SおよびNから独立して選択される1から4個のヘテロ原子を含むものであり;
ここで、R*およびRNは独立して、各存在においてH、または、ハロゲン、O、SおよびNから選択される1から6個のヘテロ原子で場合により置換されているC1−12炭化水素のいずれかであり;2つの基R*および/またはRNは一体となって3から8員の環を形成していてもよい、
第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項10に記載の方法。 - 前記付加環化反応が銅イオンの存在下で行われる、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項1に記載の方法。
- 前記付加環化反応が中性pHで行われる、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項1に記載の方法。
- ヒンジ領域内のジスルフィド結合の切断後、重鎖と軽鎖間のジスルフィド結合の少なくとも90%が実質的にそのままで維持されている、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項1に記載の方法。
- 抗体Aまたは抗体BがIgG1免疫グロブリンである、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項1に記載の方法。
- 抗体Aまたは抗体BがIgG4免疫グロブリンである、第1の抗体「A」と第2の抗体「B」から二重特異性抗体「AB」または「BA」を作製するための請求項1に記載の方法。
- IgG1、IgG2もしくはIgG4クラスの抗体またはそのFab2断片「A」とIgG1、IgG2もしくはIgG4クラスの抗体またはその断片「B」から化学的に固定された二重特異性抗体「AB」または「BA」を創出するための方法であって:
(a)CPPC、CPSC、SPPCおよびSPSCからなる群より選択されるヒンジ残基配列(EU−インデックスの番号付け:残基226から229)を有する第1の抗体「A」とCPPC、CPSC、SPPCおよびSPSCからなる群より選択されるヒンジ残基配列(EU−インデックスの番号付け:残基226から229)を有する抗体「B」を還元し;半抗体Aと半抗体Bを形成すること、ここで、抗体Aは第1の標的に結合するものであり、抗体Bは第2の標的に結合するものであり、還元条件は、抗体Aおよび抗体Bのヒンジ領域内の任意の鎖間ジスルフィド結合または鎖内ジスルフィド結合を破壊するものである;
(b)第1の化合物を、半抗体Aの抗体ヒンジコア配列のCys残基226または/および229(EU−インデックスの番号付け:残基226または/および229)の一方または両方に連結させ、連結部含有半抗体Aを形成すること、ここで、該第1の化合物は:
からなる群より選択される構造を有するものである;
(c)第2の化合物を、ヒンジ残基配列(残基226から229)CPPCまたはCPSCまたはSPPCまたはSPSCを有する抗体Bのヒンジコア配列のCys残基226と229の一方または両方に連結させ、連結部含有抗体Bを形成すること、ここで、該第2の化合物は:
(d)ほぼ等モル量の連結部含有抗体Aと連結部含有抗体Bを中性条件下でインキュベートし、化学的に固定された二重特異性抗体ABを形成すること
を含む方法。 - 半抗体Aを形成するための抗体Aの還元および半抗体Bを形成するための抗体Bの還元が還元剤中で行われ、該還元剤が、L−システイン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、システアミン、TCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン)、2−MEA(2−メルカプトエチルアミン)およびその組み合わせからなる群より選択される、化学的に固定された二重特異性抗体を創出するための請求項18に記載の方法。
- (a)抗体A由来の1本の重鎖と軽鎖を含む第1の抗体断片A’、ここで、該1本の重鎖は1個以上の反応性チオール基を有するものである;
(b)抗体B由来の1本の重鎖と軽鎖を含む第2の抗体断片B’、ここで、該1本の重鎖は1個以上の反応性チオール基を有するものである、
を含むものであり;
前記第1の抗体断片と第2の抗体断片は、リンカーを介して前記第1の抗体断片の反応性チオールに結合しているアジドとリンカーを介して前記第2の抗体断片の反応性チオールに結合しているアルキンとの付加環化反応により形成された1,2,3−トリアゾールによって共有結合されている、二重特異性抗体。 - 前記断片A’およびB’がIgG1またはIgG4免疫グロブリンに由来するものである、請求項24に記載の二重特異性抗体。
- リンカーに共有結合され、該リンカーが、アジドとの付加環化反応を行い得る−C≡C−結合を有するC8環を含むものである抗体断片。
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