JP2017513516A - 操作されたキメラｐｅｇ化ａｄｉ及び使用方法 - Google Patents

操作されたキメラｐｅｇ化ａｄｉ及び使用方法 Download PDF

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Abstract

ＰＥＧ化キメラアルギニンデイミナーゼを含む、キメラアルギニンデイミナーゼ、ならびに関連組成物、及び癌を処置する方法を含む、その使用方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０１４年３月１８日に出願された米国特許出願第６１／９５４，９２９号明細書に基づく優先権を主張し、その内容全体が参照によって組み込まれる。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照によって本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＴＤＷＧ＿００２＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約２００ＫＢで、２０１５年３月１１日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子的に提出されている。
技術分野
本発明は一般に、操作されたＡＤＩ、特に抗原性を減少させるように操作された組換えキメラＡＤＩタンパク質に関する。このような操作されたキメラＡＤＩタンパク質は、癌などのアルギニン依存性疾患の処置に有用である。
関連技術の記載
アミノ酸欠乏療法は、一部の癌型の効果的な処置であり得る。今日までに、このアプローチに関する既知の臨床例が１つ存在し、これはアスパラギナーゼを利用してアスパラギンの循環レベルを低下させ、タンパク質合成を阻害するものである。この処置は、急性リンパ芽球性白血病に特に効果的である（Ａｖｒａｍｉｓ ２００５，Ｖｉｅｒａ Ｐｉｎｈｅｉｒｏ ２００４）。急性リンパ芽球性白血病細胞は、成長及び増殖のためにアミノ酸のアスパラギンを必要とする。対照的に、正常なヒト細胞の多くはアスパラギンを合成することができ、アスパラギン枯渇による影響を受けない。したがって、アスパラギナーゼで血清アスパラギンを減少させることにより、正常な細胞、組織、及び宿主を害することなく癌細胞を選択的に殺傷することができる。アスパラギナーゼのＥ．ｃｏｌｉ由来形態は、ヒトへの使用が承認されている。しかしながら、アスパラギナーゼは微生物においてのみ見出され；ヒトでは免疫原性が高く、注射後の血清半減期も短い（Ａｖｒａｍｉｓ ２００５）。アスパラギナーゼをより効果的な薬物にするために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のアスパラギナーゼを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて製剤化し、この酵素の免疫原性及び関連するアレルギー反応を減少させることにより、これらの欠点を最小限に抑えた。加えて、ＰＥＧはアスパラギナーゼの循環半減期を大幅に延長するので、処置頻度及び総治療費の両方を減少させる。ＰＥＧ製剤化アスパラギナーゼの使用は承認されており、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）の商標名で販売されている（Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）２０１１，Ａｖｒａｍｉｓ ２００５，Ｖｉｅｒａ Ｐｉｎｈｅｉｒｏ ２００４，Ｆｕ ２００７，Ｚｅｉｄａｎ ２００８）。
アルギニンは、ヒト及びマウスの別の非必須アミノ酸である（概説については、Ｒｏｇｅｒｓ １９９４を参照のこと）。ヒトでは、アルギニンは、シトルリンからクレブス（尿素）回路の酵素であるアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ、Ｌ−シトルリン：Ｌ−アスパラギン酸リガーゼ［ＡＭＰ形成］、ＥＣ６．３．４．５）及びアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ、Ｌ−アルギニノコハク酸アルギニンリアーゼ、ＥＣ４．３．２．）を介して２段階で合成され得る（Ｈａｉｎｅｓ ２０１１，Ｗｕ ２００９，Ｍｏｒｒｉｓ ２００６，Ｈｕｓｓｏｎ ２００３，Ｔａｐｉｅｒｏ ２００２，Ｒｏｇｅｒｓ １９９４）。ＡＳＳは、シトルリン及びアスパラギン酸のアルギニノコハク酸塩への変換を触媒し、次いで、これがＡＳＬによりアルギニン及びフマル酸へと変換される。
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０での処置は、ある期間にわたって複数回の用量を必要とする。多数回の処置後に、その継続的な効力を制限する場合もある抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体が発生し得る。したがって、アルギニン枯渇療法の有効性を改善及び延長するように操作されたＡＤＩが、当該技術分野において必要である。
参考文献：Ｏｎｃａｓｐａｒ ＦＤＡ Ｌａｂｅｌ，Ｒｅｖｉｓｅｄ ７，２００６；２０１１年４月５日にＦＤＡウェブサイトからダウンロードした；Ａｖｒａｍｉｓ ＶＩ，Ｐａｎｏｓｙａｎ ＥＨ．２００５．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４４：３６７−３９３；Ｆｕ ＣＨ，Ｓａｋａｍｏｔｏ ＫＭ．２００７．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ８：１９７７−１９８４；Ｈａｉｎｅｓ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２：８−２３；Ｈｕｓｓｏｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．２００３．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０：１８８７−１８９９；Ｍｏｒｒｉｓ ＳＭ Ｊｒ．２００６．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ８３（Ｓｕｐｐｌ）：５９８Ｓ−５１２Ｓ；Ｖｉｅｒａ Ｐｉｎｈｅｉｒｏ ＪＰ，Ｂｏｏｓ Ｊ．２００４．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １２５：１１７−１２７；Ｗｕ Ｇ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ３７：１５３−１６８；Ｚｅｉｄａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ９：１１１−１１９；Ｒｏｇｅｒｓ ＱＲ．Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ８６，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，Ａｐｒｉｌ ４−５，１９９４：９−２１；Ｔａｐｉｅｒｏ Ｈ，Ｍａｔｈｅ Ｇ，Ｃｏｕｖｒｅｕｒ Ｐ，Ｔｅｗ ＫＤ（２００２）Ｉ．Ａｒｇｉｎｉｎｅ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ５６：４３９−４４５；Ｗｈｅａｔｌｅｙ ＤＮ（２００４）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ １５（９）：８２５−８３３；Ｆｅｕｎ ＬＧ，ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１０６，１４８１−１４８５；Ｄｉｌｌｏｎ ＢＪ，ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ，２００４，１００（４），８２６−３３。
Ｏｎｃａｓｐａｒ ＦＤＡ Ｌａｂｅｌ，Ｒｅｖｉｓｅｄ ７，２００６；２０１１年４月５日にＦＤＡウェブサイトからダウンロードした Ａｖｒａｍｉｓ ＶＩ，Ｐａｎｏｓｙａｎ ＥＨ．２００５．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４４：３６７−３９３ Ｆｕ ＣＨ，Ｓａｋａｍｏｔｏ ＫＭ．２００７．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ８：１９７７−１９８４ Ｈａｉｎｅｓ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２：８−２３ Ｈｕｓｓｏｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．２００３．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０：１８８７−１８９９ Ｍｏｒｒｉｓ ＳＭ Ｊｒ．２００６．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ８３（Ｓｕｐｐｌ）：５９８Ｓ−５１２Ｓ Ｖｉｅｒａ Ｐｉｎｈｅｉｒｏ ＪＰ，Ｂｏｏｓ Ｊ．２００４．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １２５：１１７−１２７ Ｗｕ Ｇ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ３７：１５３−１６８ Ｚｅｉｄａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ９：１１１−１１９ Ｒｏｇｅｒｓ ＱＲ．Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ８６，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，Ａｐｒｉｌ ４−５，１９９４：９−２１ Ｔａｐｉｅｒｏ Ｈ，Ｍａｔｈｅ Ｇ，Ｃｏｕｖｒｅｕｒ Ｐ，Ｔｅｗ ＫＤ（２００２）Ｉ．Ａｒｇｉｎｉｎｅ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ５６：４３９−４４５ Ｗｈｅａｔｌｅｙ ＤＮ（２００４）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ １５（９）：８２５−８３３ Ｆｅｕｎ ＬＧ，ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１０６，１４８１−１４８５ Ｄｉｌｌｏｎ ＢＪ，ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ，２００４，１００（４），８２６−３３
本発明の一態様は、第１微生物に由来するＡＤＩタンパク質の触媒ドメイン及び第２微生物に由来するＡＤＩタンパク質のαヘリックスドメインを含む、組換えキメラアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）を提供する。一実施形態では、第１微生物は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＧｉａｒｄｉａ属から選択される。さらなる実施形態では、第１微生物は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓから成る群から選択される。さらに別の実施形態では、第１微生物は、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｔｅａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｈｏｃｉｄａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｏｗａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｎｅｒｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍから成る群から選択される。一実施形態では、第２微生物は場合により第１微生物とは異なり、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＧｉａｒｄｉａ属から選択される。別の実施形態では、第２微生物は場合により第１微生物とは異なり、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓから成る群から選択される。さらに別の実施形態では、第２微生物は場合により第１微生物とは異なり、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｔｅａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｈｏｃｉｄａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｏｗａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｎｅｒｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍから成る群から選択される。
一実施形態では、第１微生物は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｎｅｒｓ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍから成る群から選択され、第２微生物は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｎｅｒｓ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍから成る群から選択されて、第１及び第２微生物は場合により異なる微生物である。
さらなる実施形態では、第１微生物はＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉであり、第２微生物はＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓであり、その他の特定の実施形態では、第１微生物はＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉであり、第２微生物はＭ．ｈｏｍｉｎｉｓである、または第１微生物はＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓであり、第２微生物はＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉである。ある種の実施形態では、第１微生物はＭ．ｇａｔｅａｅであり、第２微生物はＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓである。ある種の実施形態では、第１微生物はＭ．ｇａｔｅａｅであり、第２微生物はＭ．ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍである。いくつかの実施形態では、第１微生物はＭ．ｇａｔｅａｅであり、第２微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅである。いくつかの実施形態では、第１微生物はＭ．ｇａｔｅａｅであり、第２微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅである。特定の実施形態では、第１微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅであり、第２微生物はＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉである。ある種の実施形態では、第１微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅであり、第２微生物はＭ．ｇａｔｅａｅである。特定の実施形態では、第１微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅであり、第２微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅである。ある種の実施形態では、第１微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅであり、第２微生物はＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉである。いくつかの実施形態では、第１微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅであり、第２微生物はＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓである。ある種の実施形態では、第１微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅであり、第２微生物はＭ．ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍである。特定の実施形態では、第１微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅであり、第２微生物はＭ．ｇａｔｅａｅである。ある種の実施形態では、第１微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅであり、第２微生物はＭ．ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅである。いくつかの実施形態では、第１微生物はＭ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍであり、第２微生物はＭ．ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍである。ある種の実施形態では、第１微生物はＭ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍであり、第２微生物はＭ．ｉｎｅｒｓである。いくつかの実施形態では、第１微生物はＭ．ｉｎｅｒｓであり、第２微生物はＭ．ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍである。ある種の実施形態では、第１微生物はＭ．ｉｎｅｒｓであり、第２微生物はＭ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍである。
例示的な組換えキメラＡＤＩ分子は、配列番号：４〜１３もしくは２２〜５９のいずれか１つに示すアミノ酸配列、または配列番号：４〜１３もしくは２２〜５９のいずれかと少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、それから成る、またはそれから本質的に成る。
本明細書に記載される組換えキメラＡＤＩのある種の実施形態では、組換えキメラＡＤＩは、少なくとも１つのＰＥＧ化部位を除去するように修飾されている。本明細書に記載される組換えキメラＡＤＩの別の実施形態では、少なくとも１つのリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている。本明細書に記載される組換えキメラＡＤＩのある種の実施形態では、少なくとも５つのリジン残基がアミノ酸置換により修飾され、少なくとも１０のリジン残基がアミノ酸置換により修飾され、少なくとも１５のリジン残基がアミノ酸置換により修飾され、または少なくとも２０のリジン残基がアミノ酸置換により修飾されている。本明細書に記載されるような例示的な組換えキメラＡＤＩ分子は、配列番号：１０〜１３のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載される組換えキメラＡＤＩの別の実施形態では、ＡＤＩは、生体適合性リンカーによりポリエチレングリコールに共有結合する。この点に関して、アルギニンデイミナーゼは、２つ以上のポリエチレングリコール分子に共有結合してよく、ある種の実施形態では、約１〜約１０のポリエチレングリコール分子に、特定の一実施形態では、５±３のＰＥＧ分子に共有結合してよい。本明細書に記載されるようなＡＤＩに共有結合するＰＥＧ分子は、直鎖または分岐鎖ＰＥＧ分子であってよく、約１，０００〜約４０，０００の総重量平均分子量、一実施形態では、約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有してよい。
本明細書に記載される組換えキメラＡＤＩのある種の実施形態では、生体適合性リンカーは、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。一実施形態では、スクシニル基の供給源は、スクシンイミジルスクシネートである。
本発明のその他の態様は、本明細書に記載される組換えキメラＡＤＩをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター及びこのようなベクターを含む単離宿主細胞を提供する。
プロモーター配列、終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適宜その他の配列を含む、適切な調節配列を含有する好適なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、適宜プラスミド、ウイルスの、例えばファージ、またはファージミドであってよい。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。例えば、核酸構築物の調製における核酸の操作、ＤＮＡの突然変異誘発、配列決定、細胞への導入及び遺伝子発現、ならびにタンパク質分析のための多くの既知の技術及びプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２、または以後のその最新版に詳述されている。
当業者によって理解されるように、天然に存在しないコドンを有する、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製することが、いくつかの場合において有利な場合がある。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンを選択して、タンパク質の発現率を増加させる、または天然に存在する配列から生じた転写産物の半減期よりも長い半減期などの、望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写産物を作製することができる。このようなポリヌクレオチドは、一般に「コドン最適化されている」と称される。本明細書に記載されるポリヌクレオチドのいずれかは、コドン最適化された形態で利用してよい。ある種の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの特定の細菌またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母で使用するためにコドン最適化され得る（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．５９：９４−１０２，２００８を参照のこと）。
種々の異なる宿主細胞におけるタンパク質のクローニング及び発現のための系は、周知である。好適な宿主細胞としては、哺乳動物細胞、細菌、酵母、及びバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチド発現のために当該技術分野で使用可能な哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ヒト線維肉腫細胞系ＨＴ−１０８０（例えば、Ｍｏｒａｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１１３９−４０，２０１０を参照のこと）、ＮＳＯマウス黒色腫細胞及び多くのその他の細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞系の追加の例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓系（２９３細胞または懸濁培養での成長用にサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。その他の有用な哺乳動物宿主細胞系としては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；ならびに骨髄腫細胞系、例えばＮＳＯ及びＳｐ２／０などが挙げられる。ポリペプチド産生に好適なある種の哺乳動物宿主細胞系の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２５５−２６８を参照のこと。ある種の好ましい哺乳動物細胞発現系としては、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞に基づく発現系が挙げられる。哺乳動物発現系は、当該技術分野において既知のものの中でも、例えばＴ−フラスコ、ローラーボトル、もしくはセルファクトリー中での付着細胞系、または例えば１Ｌ及び５Ｌのスピナー、５Ｌ、１４Ｌ、４０Ｌ、１００Ｌ及び２００Ｌの攪拌タンクバイオリアクター、もしくは２０／５０Ｌ及び１００／２００ＬのＷＡＶＥバイオリアクター中での懸濁培養を利用することができる。
一般的な細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞におけるタンパク質の発現は、当該技術分野で十分に確立されている。概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９：５４５−５５１（１９９１）を参照のこと。培養下の真核細胞における発現も、ポリペプチドの組換え産生の選択肢として当業者によって使用可能である（Ｒｅｆ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６，１９９３；及びＴｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：５５３−５６０，１９９５を参照のこと）。特定の実施形態では、タンパク質発現は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより制御され得る（例えば、ｐＥＴベクターシリーズ）。これらの及び関連する実施形態では、発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）、すなわちＢＬ２１のλＤＥ３溶原菌を利用する場合があり、これはＴ７媒介発現を支持し、標的タンパク質の安定性を改善するためにｌｏｎプロテアーゼ及びｏｍｐＴプロテアーゼを欠損している。また、Ｅ．ｃｏｌｉではほとんど使用されないｔＲＮＡをコードするプラスミドを含有する発現宿主株、例えばＲｏｓｅｔｔａ（商標）（ＤＥ３）及びＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株なども含まれる。細胞溶解及びサンプルの取り扱いも、試薬、例えばＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ及びＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔなどを使用して改善され得る。細胞培養については、自動誘導培地により、ハイスループットな発現系を含む多くの発現系の効率を改善することができる。この種類の培地（例えば、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）は、ＩＰＴＧなどの人工の誘導剤を添加することなく、代謝シフトによりタンパク質発現を徐々に誘発する。特定の実施形態では、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ・Ｔａｇ（登録商標）融合など）、続く固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製、または関連する技術を用いる。しかしながら、ある種の態様では、臨床グレードのタンパク質を、アフィニティータグを使用して、または使用することなくＥ．ｃｏｌｉ封入体から単離することができる（例えば、Ｓｈｉｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．５０：５８−６７，２００６を参照のこと）。さらなる例として、ある種の実施形態では、低温ショック誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ高収率産生系を用いてよく、その理由とは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける低温でのタンパク質の過剰発現が、それらの溶解度及び安定性を改善するからである（例えば、Ｑｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２２：８７７−８８２，２００４を参照のこと）。
加えて、宿主細胞株は、挿入配列の発現を調節するその能力、または所望の様式で発現タンパク質をプロセシングするその能力によって選択されてよい。このようなポリペプチドの修飾としては、翻訳後修飾、例えばアセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化などが挙げられるが、これらに限定されない。「プレプロ」形態のタンパク質を切断する翻訳後プロセシングを使用して、正確な挿入、フォールディング及び／または機能を促進してもよい。細菌細胞に加えて、このような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機序を有する、あるいはそれらを欠く様々な宿主細胞、例えば酵母、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、及びＷ１３８などを選択して、関心対象のタンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実に行ってよい。
長期間にわたる組換えタンパク質の高収率産生のためには、安定発現が一般に好ましい。例えば、関心対象のポリヌクレオチドを安定発現する細胞系は、ウイルスの複製起点及び／または内因性発現エレメントならびに選択マーカー遺伝子を、同じまたは別のベクター上に含有する場合がある発現ベクターを使用して形質転換してよい。ベクターの導入後、細胞を強化培地中で約１〜２日間成長させてから、それらを選択培地に切り替えてよい。選択可能マーカーの目的は、選択に対して耐性を付与することであり、その存在により、導入配列の発現に成功している細胞の成長及び回収が可能となる。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に適した組織培養技術を使用して増殖させてよい。一過性トランスフェクションまたは感染などによる一過性の産生を用いることもできる。一過性の産生に好適な例示的哺乳動物発現系としては、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯに基づく系が挙げられる。
関心対象のポリヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、タンパク質の発現及び細胞培養からの回収に好適な条件下で培養してよい。ある種の特定の実施形態では、無血清細胞発現系を利用する。例としては、無血清培地で成長可能なＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞が挙げられる（例えば、Ｒｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４０：２３７−４３，２００５；及び米国特許第Ｕ．Ｓ．６，２１０，９２２号明細書を参照のこと）。
組換え細胞により産生された１種以上のタンパク質を、当該技術分野において既知の様々な技術に従って精製し、特徴付けることができる。タンパク質精製の実施及びタンパク質純度の分析のための例示的なシステムとしては、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（例えば、ＡＫＴＡ及びＢｉｏ−Ｒａｄ ＦＰＬＣシステム）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ及びＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ）が挙げられる。精製のための例示的な化学現象としては、当該技術分野において既知のものの中でも、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑ、Ｓ）、サイズ排除クロマトグラフィー、塩勾配、アフィニティー精製（例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、ＦＬＡＧ、マルトース、グルタチオン、プロテインＡ／Ｇ）、ゲル濾過、逆相、セラミックＨｙｐｅｒＤ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）が挙げられる。分析方法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ（例えば、クーマシー染色、銀染色）、免疫ブロット、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、及びＥＬＩＳＡなども含まれ、これらは典型的に、タンパク質組成物の純度を測定するために、産生または精製工程の任意の段階において利用してよい。
組換え産生タンパク質、例えばキメラＡＤＩタンパク質を濃縮する方法も含まれる。例としては凍結乾燥が挙げられ、これは典型的に、溶液が関心対象のタンパク質以外の可溶性成分をほとんど含有しない場合に用いられる。凍結乾燥は、多くの場合ＨＰＬＣ実行後に実施され、混合物から揮発性成分の大部分またはすべてを除去することができる。限外濾過技術も含まれ、この技術では典型的に、タンパク質溶液を濃縮するために１種以上の選択的透過膜を用いる。この膜は、水及び小分子を通過させてタンパク質を保持する；すなわち溶液を、その他の技術の中でも機械式ポンプ、ガス圧力、または遠心分離によって膜に押し付けることができる。
ある種の実施形態では、キメラＡＤＩタンパク質は、当該技術分野の日常的な技術に従って測定した場合、少なくとも約９０％の純度を有する。ある種の実施形態、例えば診断用組成物またはある種の治療用組成物などでは、キメラＡＤＩタンパク質は、少なくとも約９５％の純度を有する。特定の実施形態、例えば治療用組成物または医薬組成物などでは、キメラＡＤＩタンパク質は、少なくとも約９７％または９８％または９９％の純度を有する。その他の実施形態、例えば参照試薬または研究試薬として使用される場合などでは、タンパク質は、より低純度であり得、少なくとも約５０％、６０％、７０％、または８０％の純度を有してよい。全体の純度、またはその他のタンパク質などの選択成分に対する純度、例えばタンパク質ベースの純度を測定することができる。
ある種の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、ほぼ実質的にエンドトキシンフリーであり、例えば約９５％エンドトキシンフリー、好ましくは約９９％エンドトキシンフリー、より好ましくは約９９．９９％エンドトキシンフリーを含む。エンドトキシンの存在は、本明細書に記載されるような、当該技術分野の日常的な技術に従って検出され得る。特定の実施形態では、キメラＡＤＩタンパク質は、実質的に無血清の培地中で真核細胞、例えば哺乳動物細胞またはヒト細胞などから作製される。
本発明の別の態様は、本明細書に記載される組換えキメラＡＤＩのうち１種以上及び生理学的に許容される担体を含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、オートファジー調節剤をさらに含んでよい。オートファジー調節剤としては、クロロキン、３−メチルアデニン、ヒドロキシクロロキン、バフィロマイシンＡ１、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、オカダ酸、Ｎ６−メルカプトプリンリボシド、ビンブラスチン、ワートマニン、ラパマイシン、エベロリムス、メトホルミン、ペリホシン、レスベラトロール、及びタモキシフェンが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本明細書に記載される組換えキメラＡＤＩを含む組成物は、化学療法剤、例えばこれらに限定されないが、ドセタキセル、カルボプラチン、シクロホスファミド、ゲムシタビン、シスプラチン、ソラフェニブ、スニチニブもしくはエベロリムス、またはこれらの組み合わせなどをさらに含んでよい。
本発明のさらに別の態様は、癌を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に記載される組換えキメラＡＤＩのうち１種以上及び生理学的に許容される担体を含む治療有効量の組成物を投与し、それによって癌を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害することを含む方法を提供する。この点に関して、癌としては、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞癌、肉腫、白血病、急性骨髄性白血病、再発性急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃の癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、及び胃癌を挙げることができるが、これらに限定されない。
配列の簡単な説明
配列番号：１は、野生型Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓのＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：２は、野生型Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉのＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：３は、野生型Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓのＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：４は、ＤＳ１組換えキメラＡＤＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：５は、ＤＳ２組換えキメラＡＤＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：６は、ＤＳ３組換えキメラＡＤＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：７は、ＤＳ４組換えキメラＡＤＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：８は、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ Ｐｈｏｅｎｉｘ（配列番号：１４を参照のこと；加えてリジン置換）（触媒ドメイン）及びＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉ（αヘリックスドメイン）に由来する組換えキメラＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：９は、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ Ｐｈｏｅｎｉｘ（配列番号：１４を参照のこと）（触媒ドメイン）及びＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ（αヘリックスドメイン）に由来する組換えキメラＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：１０は、組換えキメラＡＤＩタンパク質のＤＳ１−１リジン減少変異体のアミノ酸配列である（表Ｅ３を参照のこと）。
配列番号：１１は、組換えキメラＡＤＩタンパク質のＤＳ１−２リジン減少変異体のアミノ酸配列である（表Ｅ３を参照のこと）。
配列番号：１２は、組換えキメラＡＤＩタンパク質のＤＳ１−３リジン減少変異体のアミノ酸配列である（表Ｅ３を参照のこと）。
配列番号：１３は、組換えキメラＡＤＩタンパク質のＤＳ１−４リジン減少変異体のアミノ酸配列である（表Ｅ３を参照のこと）。
配列番号：１４は、ＡＤＩ Ｐｈｏｅｎｉｘ配列のアミノ酸配列である。このＡＤＩ配列は、Ｋ１１２Ｅ及びＰ２１０Ｓ置換を除いて、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓのＡＤＩと同一である。
配列番号：１５は、Ｍ．ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓのＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：１６は、Ｍ．ｃｏｌｏｍｂｉｎｕｍのＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：１７は、Ｍ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：１８は、Ｍ．ｇａｔｅａのＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：１９は、Ｍ．ｉｎｅｒｓのＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：２０は、Ｍ．ｐｈｏｃｉｃｅｒａｂｒａｌｅのＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：２１は、Ｍ．ｐｈｏｃｉｄａｅのＡＤＩのアミノ酸配列である。
配列番号：２２〜５９は、キメラＡＤＩタンパク質のアミノ酸配列である。
本発明は一般に、キメラＡＤＩタンパク質、例えば対応する野生型ＡＤＩ分子と比較して、減少した抗原性を有するように操作されたキメラＡＤＩタンパク質に関する。本発明はまた、癌及びその他の障害を、キメラＡＤＩ、特にキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０で処置する方法にも関する。
正常な細胞は、ＡＳＳ及びＡＳＬにより触媒される２段階工程でシトルリンからアルギニンを合成することができるので、成長のためにアルギニンを必要としない。対照的に、ある種の癌はＡＳＳを発現しない。ある種の癌はＡＳＬを発現せず、その他の癌は、ＡＳＳ及び／またはＡＳＬの発現が減少している場合がある、またはそれらを発現しない場合がある。したがって、これらの癌はアルギニンに対して栄養要求性である。この代謝の違いを、これらの癌型を処置する安全かつ効果的な療法を開発するために活用してよい。ＡＤＩは、アルギニンジヒドロラーゼ経路を介してアルギニンからシトルリンへの変換を触媒し、それゆえアルギニンを排除するために使用してよい。
本発明の実施には、特にそれとは反対の具体的な指示がない限り、当業者の技能範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学及び組換えＤＮＡ技術の従来方法を用い、その多くが例証の目的で以下に記載される。このような技術は、文献内で十分に説明される。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）及びその他の同様の参考文献を参照のこと。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書の全体を通して、文脈から別の意味に解釈すべき場合を除き、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変化形は、記述される要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を包含することを示唆するが、その他のあらゆる要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を除外することは示唆しないと理解されるだろう。
「約」とは、参照する分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％も変動する分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。
「統計的に有意」とは、結果が偶然に生じたという可能性が低かったことを意味する。統計的有意性は、当該技術分野において既知の任意の方法により決定され得る。一般に使用される有意性の尺度としてはｐ値が挙げられ、これは帰無仮説が真実であった場合に、観察された事象が生じるであろう頻度または確率である。得られたｐ値が有意水準よりも小さい場合は、帰無仮説が棄却される。単純な場合では、有意水準は、０．０５以下のｐ値で定義される。
本明細書における各実施形態は、別段の明確な記述がない限り、その他のあらゆる実施形態に準用されるものとする。
標準的な技術を、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法）のために使用してよい。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野で一般に行われるように、または本明細書に記載されるように実施してよい。これらの及び関連する技術及び手順は一般に、当該技術分野において周知の従来方法に従って、ならびに本明細書の全体を通して引用及び議論される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されるように実施してよい。特定の定義が提供されていない限り、本明細書に記載される分子生物学、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学及び薬化学に関連して利用される専門用語、ならびにそれらの実験室手順及び技術は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。標準的な技術を、組換え技術、分子生物学的、微生物学的、化学的な合成、化学分析、医薬調製、製剤化、及び送達、ならびに患者の処置に使用してよい。
「患者」は動物を指し、ある種の実施形態では哺乳動物を指し、特定の実施形態ではヒトを指す。
「生体適合性」は、生物学的機能に対して一般に有害ではなく、アレルギー状態及び疾患状態を含む許容できない毒性度合いを一切もたらさないだろう、材料または化合物を指す。
「参照配列」という用語は一般に、別の配列と比較している、核酸をコードする配列、またはアミノ酸配列を指す。本明細書に記載されるすべてのポリペプチド及びポリヌクレオチド配列が参照配列として含まれ、名称が記載されているもの、ならびに表及び配列表に記載されているものを含む。
本開示の全体を通して、以下の略語を使用してよい：ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＡＤＩ、アルギニンデイミナーゼ；ＳＳ、スクシンイミジルスクシネート；ＳＳＡ、スクシンイミジルスクシンイミド；ＳＰＡ、スクシンイミジルプロピオネート；ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド；ＡＳＳ１またはＡＳＳ、アルギニノコハク酸シンテターゼ；ＡＳＬ、アルギニノコハク酸リアーゼ。
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩ酵素は、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓに由来するベンチマークＡＤＩ−ＰＥＧ２０分子と比較される。本明細書で使用する場合、「ＡＤＩ−ＰＥＧ２０」は、当該技術分野において既知のＡＤＩ分子を指し、例えば、ＵＳ６１８３７３８；ＵＳ６６３５４６２；Ａｓｃｉｅｒｔｏ ＰＡ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｓｅ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３（３０）：７６６０−７６６８；Ｉｚｚｏ Ｆ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２（１０）：１８１５−１８２２；Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇ ＦＷ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）（ＰＥＧ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＰＥＧ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｉｔｓ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ８０（１−３）：２５９−２７１；Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ １０６，３２４−３３２に記載されている。当業者によって認識されるように、この分子は、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓに由来するＰＥＧ化（ＰＥＧ２０，０００）ＡＤＩ酵素であり、野生型Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓのＡＤＩ酵素と比較して２つの置換（Ｋ１１２Ｅ；Ｐ２１０Ｓ）を有する。
「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」ならびに「酵素」という用語は、同じ意味で使用され、特定の長さに一切限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、修飾、例えばシグナル配列のミリストイル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化及び付加または欠失などを除外しない。「ポリペプチド」もしくは「タンパク質」または「酵素」という用語は、アミノ酸の１つ以上の鎖を意味し、各鎖は、ペプチド結合により共有結合しているアミノ酸を含み、ポリペプチドまたはタンパク質は、ペプチド結合により互いに非共有結合及び／または共有結合している複数の鎖であって、天然タンパク質、すなわち天然に存在する、特に非組換え細胞により産生されたタンパク質の配列、または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞により産生されたタンパク質の配列を有する鎖を含み、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つ以上のアミノ酸からの欠失、アミノ酸への付加、及び／もしくはアミノ酸の置換を有する分子を含むことができる。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本開示のキメラＡＤＩ酵素、またはキメラＡＤＩ酵素の１つ以上のアミノ酸からの欠失、アミノ酸への付加、及び／もしくはアミノ酸の置換を有する配列を特に包含する。ある種の実施形態では、ポリペプチドは、１つ以上の組換えＤＮＡ分子を含む組換え細胞により産生される「組換え」ポリペプチドであり、このＤＮＡ分子は典型的に、異種ポリヌクレオチド配列またはさもなければ細胞で見られることのないポリヌクレオチド配列の組み合わせから作製される。
本明細書で言及される「単離タンパク質」という用語は、本タンパク質が、（１）典型的には天然に見られるだろう少なくともいくつかのその他のタンパク質を含まないこと、（２）同じ供給源から、例えば同種からのその他のタンパク質を本質的に含まないこと、（３）異なる種の細胞で発現すること、（４）天然で関連するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、またはその他の材料の少なくとも約５０パーセントから分離されていること、（５）「単離タンパク質」が天然で関連するタンパク質の一部と（共有または非共有結合性相互作用によって）関連しないこと、（６）天然で関連しないポリペプチドと（共有または非共有結合性相互作用によって）機能的に関連すること、または（７）天然に存在しないことを意味する。このような単離タンパク質は、合成起源であってよいゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくはその他のＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせによりコードされ得る。ある種の実施形態では、単離タンパク質は、その使用（治療用、診断用、予防用、研究用または別の用途）に干渉するだろう、その天然の環境に見られるタンパク質もしくはポリペプチドまたはその他の混入物を実質的に含まない。
本発明では、キメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩをコードするポリヌクレオチドは、例えば、微生物を含む任意の供給源、組換えバイオテクノロジーまたはこれらの任意の組み合わせから誘導、クローニングまたは産生されてよい。例えば、アルギニンデイミナーゼは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｉａｒｄｉａ属の微生物からクローニングされてよい。ある種の実施形態では、アルギニンデイミナーゼは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｔｅａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｈｏｃｉｄａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｏｗａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｎｅｒｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ、またはこれらの任意の組み合わせからクローニングされる。これらのアルギニンデイミナーゼのいくつかのアミノ酸配列を、以下の表Ａ１に提供する。
したがって、いくつかの実施形態では、キメラＡＤＩで使用されるＡＤＩは、表Ａ１からのアミノ酸配列（配列番号：１〜３または１５〜２１のいずれか１つ）、もしくはＡＤＩ活性（例えば、アルギニンをシトルリン及びアンモニアに代謝できる）を有するそのバリアントもしくはＡＤＩ活性を有するその断片、またはＡＤＩ活性を有するその操作されたキメラを含んでよい。
例示的なキメラＡＤＩの配列を、以下の表Ａ２に提供する。
したがって、いくつかの実施形態では、キメラＡＤＩは、表Ａ２からの例示的なキメラ配列（配列番号：４〜１３または２２〜５９）、またはＡＤＩ活性を有するそのバリアントもしくは断片を含む、それから成る、またはそれから本質的に成る。
ある種の実施形態は、本明細書に記載される、すなわち名称が記載されている、または配列識別子の参照（例えば、表Ａ１〜Ａ２）によって記載されている参照ＡＤＩポリペプチド配列のバリアントを含む。「バリアント」配列は、この用語を本明細書で使用する場合、１つ以上の置換、欠失（例えば、切断）、付加、及び／または挿入により、本明細書に開示される参照配列とは異なるポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を指す。したがって、ある種のバリアントは、本明細書に記載される参照配列の断片を含む。バリアントポリペプチドは生物学的に活性であり、すなわち、それらは参照ポリペプチドの酵素活性または結合活性を有し続けている。このようなバリアントは、例えば、遺伝的多型により及び／または人為的操作によりもたらされてよい。
多くの場合には、生物学的に活性なバリアントは、１つ以上の保存的置換を含有するだろう。「保存的置換」とは、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸に置換されるものであり、その結果、ペプチド化学の当業者は、ポリペプチドの二次構造及び疎水性親水性が実質的に不変であると予想するだろう。上記のように、修飾を、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造で行ってよく、所望の特徴を有するバリアントポリペプチドまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子がなお得られる。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更して、本発明のポリペプチドの同等な、あるいは改善されたバリアントまたは一部を作製することが望ましい場合、当業者は典型的に、コードするＤＮＡ配列のコドンのうち１つ以上を変化させるだろう。
例えば、ある種のアミノ酸は、構造、例えば抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位などで相互作用的結合能を顕著に失うことなく、タンパク質構造においてその他のアミノ酸に置換されてよい。タンパク質の生物学的機能活性を定義するのは、タンパク質の相互作用能及び性質であるので、ある種のアミノ酸配列置換を、タンパク質配列、及び当然のことながらその基礎となるＤＮＡコード配列で行うことができ、それにもかかわらず同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、様々な変化を、開示された組成物のペプチド配列、またはペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列で、それらの実用性を顕著に失うことなく行ってよいことが意図される。
このような変化を行うには、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮してよい。タンパク質に相互作用的生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般に当該技術分野において理解されている（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２、参照によって本明細書に組み込まれる）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性の特徴が、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、それによりタンパク質とその他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義すると認められている。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。ある種のアミノ酸を、類似した疎水性親水性指標またはスコアを有するその他のアミノ酸で置換しても、なお類似した生物学的活性を有するタンパク質をもたらす、すなわち、なお生物学的機能性が同等のタンパク質を得る場合もあることが、当該技術分野において既知である。このような変化を行うには、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
同様のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効果的に行われ得ることも、当該技術分野においてさらに理解される。米国特許第４，５５４，１０１号明細書（その内容全体が参照によって本明細書に特に組み込まれる）は、隣接するアミノ酸の親水性によって決まるようなタンパク質の親水性の最大局所平均が、タンパク質の生物学的特性と相関することを記述している。米国特許第４，５５４，１０１号明細書に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似した親水性値を有する別のアミノ酸に置換されても、生物学的に同等の、特に免疫学的に同等のタンパク質をなお得ることができると理解される。このような変化では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
上で概略を述べたように、したがって、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどの類似性に基づく。様々な前述の特徴を考慮する例示的な置換が当業者には周知であり、このような置換としては、アルギニン及びリジン；グルタミン酸塩及びアスパラギン酸塩；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン及びイソロイシンが挙げられる。
アミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／または両親媒性の類似性に基づいてさらに行われてよい。例えば、負荷電アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ；正荷電アミノ酸としては、リジン及びアルギニンが挙げられ；類似した親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン及びバリン；グリシン及びアラニン；アスパラギン及びグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンが挙げられる。保存的変化を表す場合があるアミノ酸のその他の群としては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；及び（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。
バリアントはさらに、またはあるいは非保存的変化を含有してよい。好ましい実施形態では、バリアントポリペプチドは、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満のアミノ酸、あるいは１つのアミノ酸の置換、欠失または付加により、天然配列または参照配列とは異なる。バリアントはさらに（またはあるいは）、ポリペプチドの免疫原性、二次構造、酵素活性、及び／または疎水性親水性に対して最小限の影響を有するアミノ酸の、例えば欠失または付加により修飾されてよい。
ある種の実施形態では、ポリペプチド配列は、約、少なくとも約、または最大約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００である。７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００またはそれを超える連続アミノ酸長であり、その間のすべての整数を含み、参照配列のすべてまたは一部を含んでよい（例えば、配列表を参照のこと）。
その他の特定の実施形態では、ポリペプチド配列は、約または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００以下から成る。８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００またはそれを超える連続アミノ酸であり、その間のすべての整数を含み、参照配列のすべてまたは一部を含んでよい（例えば、配列表を参照のこと）。
さらにその他の特定の実施形態では、ポリペプチド配列は、約１０〜１０００、１０〜９００、１０〜８００、１０〜７００、１０〜６００、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜１０００、２０〜９００、２０〜８００、２０〜７００、２０〜６００、２０〜５００、２０〜４００、２０〜３００、２０〜２００、２０〜１００、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、５０〜１０００、５０〜９００、５０〜８００、５０〜７００、５０〜６００、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、５０〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、または２００〜３００の連続アミノ酸であり、その間のすべての範囲を含み、参照配列のすべてまたは一部を含む。ある種の実施形態では、切断ポリペプチドが参照ポリペプチドの結合特性及び／または結合活性を保持する限り、任意の参照ポリペプチドのＣ末端領域またはＮ末端領域は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、もしくは８００もしくはそれを超えるアミノ酸で、または約１０〜５０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００もしくはそれを超えるアミノ酸（その間のすべての整数及び範囲（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５）を含む）で切断されてよい。典型的には、生物学的に活性な断片は、それが由来する生物学的に活性な参照ポリペプチドの約１％、約５％、約１０％、約２５％、または約５０％以上の活性を有する。
一般に、バリアントは、参照ポリペプチド配列に対して少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性または配列同一性または配列相同性を示すだろう。さらに、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸（その間のすべての整数及び範囲を含む）の付加（例えば、Ｃ末端付加、Ｎ末端付加、その両方）、欠失、切断、挿入、または置換（例えば、保存的置換）によって天然配列または親配列とは異なるが、親ポリペプチド配列または参照ポリペプチド配列の特性または活性を保持する配列が意図される。
いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも１つであるが、５０、４０、３０、２０、１５、１０、８、６、５、４、３または２未満のアミノ酸残基で参照配列とは異なる。その他の実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも１％であるが、２０％、１５％、１０％または５％未満の残基で参照配列とは異なる。（この比較がアラインメントを必要とする場合、配列は、最大の類似性で整列されるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチによる「ループ」アウト配列が、差と考えられる。）
配列間の配列類似性または配列同一性（これらの用語は、本明細書において同じ意味で使用される）の計算を、以下の通りに実施する。２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一率を決定するために、最適な比較を目的として配列を整列する（例えば、第１及び第２アミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に、最適なアラインメントのためにギャップを導入することができ、比較のために非相同配列を無視することができる）。ある種の実施形態では、比較のために整列させた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１配列における位置が、第２配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合には、分子はその位置で同一である。
２つの配列間での同一率は、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮した、これらの配列によって共有される同一位置の数の関数である。
配列の比較及び２つの配列間での同一率の決定を、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間での同一率を、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラム内に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３，１９７０）アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびにギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６、または４及び長さ加重１、２、３、４、５、または６を使用して決定する。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間での同一率を、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびにギャップ加重４０、５０、６０、７０、または８０及び長さ加重１、２、３、４、５、または６を使用して決定する。特に好ましいパラメータセット（及び別段の指定がない限り使用すべきセット）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及びフレームシフトギャップペナルティ５を用いたＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスである。
２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間での同一率を、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃａｂｉｏｓ．４：１１−１７，１９８９）を使用し、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用して決定することができる。
本明細書に記載される核酸配列及びタンパク質配列を、公開データベースを検索するための「クエリー配列」として使用し、例えば、その他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−１０）のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施し、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施し、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
一実施形態では、上述の通り、ポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを、ＢＬＡＳＴアラインメントツールを使用して評価することができる。ローカルアラインメントは単純に一対の配列セグメントから成り、対は比較されている各配列からのものである。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムまたはＳｅｌｌｅｒｓアルゴリズムの修正により、伸長またはトリミングによってそのスコアを改善できないすべてのセグメント対（高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）と呼ばれる）を見出すだろう。ＢＬＡＳＴアラインメントの結果は、偶然によってのみＢＬＡＳＴスコアを期待できるという可能性を示すための統計的尺度を含む。
生スコアＳを、整列させた各配列に関連するギャップ数及び置換数から計算し、類似性スコアが高いほど、より有意なアラインメントを示す。置換スコアは、参照表から得られる（ＰＡＭ、ＢＬＯＳＵＭを参照のこと）。
ギャップスコアを、典型的にはＧ（ギャップ開始ペナルティ）及びＬ（ギャップ伸長ペナルティ）の和として計算する。長さｎのギャップについては、ギャップコストがＧ＋Ｌｎとなるだろう。ギャップコスト、Ｇ及びＬの選択は経験的であるが、Ｇについては高値（１０〜１５）、例えば１１、及びＬについては低値（１〜２）、例えば１を選択するのが通例である。
ビットスコアＳ’は生アラインメントスコアＳから導き出し、これは使用したスコアリングシステムの統計的特性が考慮されている。ビットスコアをスコアリングシステムに対して正規化し、それゆえ、このスコアを使用して異なる検索からのアラインメントスコアを比較することができる。「ビットスコア」及び「類似性スコア」という用語は、同じ意味で使用される。ビットスコアはアラインメントの良好度を示し、このスコアが高いほどアラインメントが良好である。
Ｅ値、すなわち期待値は、類似したスコアを有する配列が、データベース中に偶然生じるだろう可能性について記載する。これは、データベース検索中に偶然生じると期待されるＳと同等の、またはＳよりも良好なスコアを有する異なるアラインメント数の予想である。Ｅ値が小さいほど、アラインメントはより有意である。例えば、ｅ−１１７のＥ値を有するアラインメントは、類似したスコアを有する配列が全く偶然に生じるという可能性が極めて低いことを意味する。さらに、アミノ酸のランダム対のアラインメントに対する期待スコアは負である必要があり、さもなければ長いアラインメントは、整列させたセグメントが関連していたかとは無関係に高スコアを有する傾向があるだろう。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、適切な置換マトリックス、ヌクレオチドまたはアミノ酸を使用し、ギャップアラインメントについてはギャップ生成ペナルティ及びギャップ伸長ペナルティを使用する。例えば、ポリペプチド配列のＢＬＡＳＴアラインメント及び比較を、典型的にはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ存在ペナルティ１１及びギャップ伸長ペナルティ１を使用して行う。
一実施形態では、配列類似性スコアを、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ存在ペナルティ１１及びギャップ伸長ペナルティ１を使用して行ったＢＬＡＳＴ分析から報告する。
特定の実施形態では、本明細書で提供される配列同一性／類似性スコアは、以下のパラメータを使用したＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して得られた値を指す：ギャップ加重５０及び長さ加重３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用した、ヌクレオチド配列についての同一性％及び類似性％；ギャップ加重８及び長さ加重２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用した、アミノ酸配列についての同一性％及び類似性％（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）。ギャップには、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０）を使用して、マッチ数を最大にし、かつギャップ数を最小にする２つの完全な配列のアラインメントを見出す。
特定の一実施形態では、バリアントポリペプチドは、場合により参照ポリペプチド配列（例えば、配列表を参照のこと）と整列させて、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、またはそれを超える（その間のすべての整数及び範囲を含む）ＢＬＡＳＴビットスコアまたは配列類似性スコアを生成することができるアミノ酸配列を含み、ＢＬＡＳＴアラインメントにはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ存在ペナルティ１１、及びギャップ伸長ペナルティ１を使用した。
上述の通り、参照ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断、付加、及び挿入を含む様々な方法で変更されてよい。このような操作方法は一般に、当該技術分野において既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡの突然変異によって調製され得る。突然変異誘発方法及びヌクレオチド配列の変更方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８２：４８８−４９２，１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２，１９８７），米国特許第Ｕ．Ｓ．４，８７３，１９２号明細書，Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，”Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）及び当該文献で引用された参考文献を参照のこと。関心対象のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼすことのない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出されてよい。
このような修飾により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする方法、及び選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法は、当該技術分野において既知である。このような方法は、参照ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応可能である。一例として、ライブラリーにおける機能的変異体の頻度を高める技術である、再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用し、ポリペプチドバリアントを同定することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５，１９９２；Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．６：３２７−３３１，１９９３）。
天然ＡＤＩは微生物で見出される場合があり、免疫原性であって患者の循環から迅速に除去される。これらの問題は、ＡＤＩを操作してその抗原性を減少させることにより、例えばキメラＡＤＩ分子を操作することなどにより克服され得る。一実施形態では、キメラＡＤＩは、標準的な分子生物学的技術、またはタンパク質合成技術を使用して、異なるＡＤＩタンパク質からの異なるドメイン（例えば、触媒ドメイン及びαヘリックスドメイン）を組み合わせることにより構築される。一実施形態では、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉまたはＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓからの触媒ドメインを、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓのαヘリックスドメインと組み合わせる。別の実施形態では、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉの触媒ドメインを、Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓのαヘリックスドメインと組み合わせる。さらなる実施形態では、Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓの触媒ドメインを、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉのαヘリックスドメインと組み合わせる。当業者によって認識されるように、触媒ドメイン及びαヘリックスドメインのその他の組み合わせは、その他の種に、例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅなどに由来するＡＤＩタンパク質から構築され得る。
抗原性の問題はまた、キメラＡＤＩを修飾することにより克服され得る。したがって、本開示は、巨大分子ポリマー、タンパク質、ペプチド、多糖、またはその他の化合物を含むが、これらに限定されない修飾剤により修飾されるキメラＡＤＩを提供する。本明細書に記載されるようなアルギニンデイミナーゼまたはそのキメラ及び修飾剤は、共有結合または非共有結合性相互作用のいずれかにより連結され、安定した複合体または安定した組成物を形成して所望の効果を達成する場合がある。ある種の実施形態では、修飾キメラＡＤＩは、非修飾キメラＡＤＩの生物学的活性を保持しながら、非修飾キメラＡＤＩよりも長いインビボ半減期及び低い抗原性を有する。ある種の実施形態では、修飾キメラＡＤＩは、非修飾キメラＡＤＩの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える生物学的活性を保持する。
一実施形態では、修飾剤は、生体適合性であるポリマーもしくはタンパク質またはそれらの断片であり得、血液中のキメラＡＤＩの半減期を増加させ得る。修飾剤は、キメラＡＤＩに化学的に結合されるか、または適用可能な場合、融合タンパク質発現によりキメラＡＤＩに連結され得る。
巨大分子ポリマーとしては、非ペプチド巨大分子ポリマーを挙げてよく、ある種の実施形態では、それ自体で生物活性を有する場合がある。好適なポリマーとしては、ポリエノール化合物、ポリエーテル化合物、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルと無水マレイン酸のコポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、多糖、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリンまたはその断片、ポリ−アルキル−エチレングリコール及びその誘導体、ポリ−アルキル−エチレングリコールとその誘導体のコポリマー、ポリ（ビニルエチルエーテル）、ａ，Ｐ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド］、ポリカルボン酸塩、ポリオキシエチレン−オキシメチレン、ポリアクリロイルモルホリン、アミノ化合物とオキシオレフィンのコポリマー、ポリヒアルロン酸、ポリオキシラン、エタン二酸とマロン酸のコポリマー、ポリ（１，３−ジオキソラン）、エチレンとマレイン酸ヒドラジドのコポリマー、ポリシアル酸、シクロデキストリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、ポリマーはポリエチレングリコールである。
本明細書で使用する場合、ポリエノール化合物としては、ポリエチレングリコール（モノメトキシポリエチレングリコール、モノヒドロキシルポリエチレングリコールを含む）、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコール、ポリブテノールなど、及び脂質などのこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリエーテル化合物としては、ポリアルキレングリコール（ＨＯ（（ＣＨ２）ｘＯ）ｎＨ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン（ＨＯ（（ＣＨ２）２Ｏ）ｎＨ）、ポリビニルアルコール（（ＣＨ２ＣＨＯＨ）ｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリアミノ酸としては、１種類のアミノ酸のポリマーまたは２種類以上のアミノ酸のコポリマー、例えば、ポリアラニンもしくはポリリジン、またはこれらのブロックコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
多糖としては、グルコサン及びその誘導体、例えば硫酸デキストラン、セルロース及びその誘導体（メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含む）、デンプン及びその誘導体、ポリスクロースなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の特定の一実施形態では、キメラＡＤＩは、タンパク質またはペプチドと結合することにより修飾され、１種以上のタンパク質またはペプチドが、キメラＡＤＩに直接的または間接的に連結される。タンパク質は、天然に存在するヒト血清タンパク質またはそれらの断片、例えば、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、ａ１−酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲン、免疫グロブリン、Ｉｇ Ｆｃ領域、アルブミン、及びそれらの断片などを含むが、これらに限定されない天然に存在するタンパク質またはそれらの断片のいずれかであり得る。「断片」とは、タンパク質全体よりも小さいが、タンパク質の所望の機能を保持するタンパク質の任意の部分を意味する。操作されたキメラＡＤＩは、共有結合によってタンパク質に直接的または間接的に連結されてよい。直接連結は、キメラＡＤＩの１つのアミノ酸が、ペプチド結合またはジスルフィド架橋によって修飾タンパク質の１つのアミノ酸に直接的に連結されることを意味する。間接連結は、その間に元々存在する化学基、もしくは生物学的手段もしくは化学的手段により付加された特定の化学基、または上述した連結の組み合わせによる、キメラＡＤＩと修飾タンパク質との間の連結を指す。
特定の一実施形態では、キメラＡＤＩは、ＰＥＧとの共有結合により修飾される。ＰＥＧにより（リンカーを用いて、または用いずに）共有結合的に修飾されるキメラＡＤＩは、以後キメラ「ＡＤＩ−ＰＥＧ」と称される場合がある。非修飾キメラＡＤＩと比較した場合、キメラＡＤＩ−ＰＥＧは、その酵素活性の大部分を保持し、抗原性がはるかに低く、循環半減期が大幅に延長されて、腫瘍の処置にいっそう有効である。
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、分岐鎖または直鎖の、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を指し、一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨで表され、式中、ｎは少なくとも４である。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、数字の接尾辞と組み合わせて使用し、そのおよその重量平均分子量を示す。例えば、ＰＥＧ５，０００は、約５，０００の総重量平均分子量を有するＰＥＧを指し；ＰＥＧ１２，０００は、約１２，０００の総重量平均分子量を有するＰＥＧを指し；ＰＥＧ２０，０００は、約２０，０００の総重量平均分子量を有するＰＥＧを指す。
本発明の一実施形態では、ＰＥＧは、約１，０００〜約５０，０００；一実施形態では、約３，０００〜約４０，０００、別の実施形態では、約５，０００〜約３０，０００；ある種の実施形態では、約８，０００〜約３０，０００；その他の実施形態では、約１１，０００〜約３０，０００；追加の実施形態では、約１２，０００〜約２８，０００；さらにその他の実施形態では、約１６，０００〜約２４，０００；その他の実施形態では、約１８，０００〜約２２，０００；別の実施形態では、１９，０００〜約２１，０００の総重量平均分子量を有し、一実施形態では、ＰＥＧは、約２０，０００の総重量平均分子量を有する。一般に、３０，０００以上の分子量を有するＰＥＧは溶解させるのが難しく、製剤化生成物の収率が低下する場合がある。ＰＥＧは、分岐鎖または直鎖であってよい。一般に、ＰＥＧの分子量が増加すると、ＡＤＩまたはキメラＡＤＩの抗原性が減少する。この実施形態に記載される分子量を有するＰＥＧを、キメラＡＤＩ、及び場合により生体適合性リンカーと組み合わせて使用し、例えば、再発性急性骨髄性白血病などの急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃の癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、胃癌及び食道癌を含む癌を処置してよい。
本発明の別の実施形態では、ＰＥＧは、約１，０００〜約５０，０００；ある種の実施形態では、約３，０００〜約３０，０００；その他の実施形態では、約３，０００〜約２０，０００；一実施形態では、約４，０００〜約１２，０００；さらにその他の実施形態では、約４，０００〜約１０，０００；追加の実施形態では、約４，０００〜約８，０００；なおさらなる実施形態では、約４，０００〜約６，０００；別の実施形態では、約５，０００の総重量平均分子量を有する。ＰＥＧは、分岐鎖または直鎖であってよく、ある種の実施形態では、直鎖である。この実施形態に記載される分子量を有するＰＥＧを、キメラＡＤＩ、及び場合により生体適合性リンカーと組み合わせて使用し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または癌を処置してよい。
キメラＡＤＩ−ＰＥＧは、本明細書に記載される例示的な修飾キメラＡＤＩであるが、当業者によって認識されるように、キメラＡＤＩは所望の効果のために、特に抗原性を減少させ、血清半減期を増加させるために、その他のポリマーまたは適切な分子により修飾されてよい。
キメラＡＤＩは、リンカーを用いて、または用いずにＰＥＧなどの修飾剤に共有結合されてよいが、好ましい実施形態では、リンカーを利用する。
キメラＡＤＩを修飾剤、例えばＰＥＧに共有結合させるために使用されるリンカーは、任意の生体適合性リンカーであってよい。上述のように、「生体適合性」は、化合物または基が非毒性であり、損傷、病気、疾患、または死亡を引き起こすことなくインビトロまたはインビボで利用されてよいことを示す。ＰＥＧなどの修飾剤は、例えば、エーテル結合、チオール結合、またはアミド結合によってリンカーに結合され得る。リンカー基としては、例えば、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、及びこれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、生体適合性リンカーの供給源は、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）である。リンカーのその他の好適な供給源としては、オキシカルボニルイミダゾール基（例えば、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を含む）、ニトロフェニル基（例えば、ニトロフェニルカーボネート（ＮＣＰ）またはトリクロロフェニルカーボネート（ＴＣＰ）を含む）、トリシレート基、アルデヒド基、イソシアネート基、ビニルスルホン基、または第１級アミンを挙げてよい。別の実施形態では、リンカーは、ＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、またはＮＨＳに由来し；ある種の実施形態では、ＳＳ、ＳＰＡ、またはＮＨＳを使用し、その他の実施形態では、ＳＳまたはＳＰＡを使用する。したがって、ある種の実施形態では、可能なリンカーは、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルグルタレート（ＳＧ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルカーボネート（ＳＣ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ＳＣＭ）、メトキシ−ＰＥＧ２Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルブタノエート（ＳＢＡ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルグルタルアミド、及びメトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルスクシンイミドから形成され得る。
あるいは、キメラＡＤＩは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基によって、ＰＥＧなどの修飾剤に直接的に（すなわち、リンカーを用いずに）結合されてよい。
キメラＡＤＩは、例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１：３７３−３７６（１９８１）；及びＺａｐｌｉｐｓｋｙ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２１（１９９２）（これらの開示は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているような、当該技術分野において既知の方法を使用して、生体適合性リンカーによりＰＥＧに共有結合されてよい。
キメラＡＤＩへのＰＥＧの結合は、キメラＡＤＩの循環半減期を増加させる。一般に、ＰＥＧは、キメラＡＤＩの第１級アミンに結合される。キメラＡＤＩ上のＰＥＧ、またはその他の修飾剤の結合部位の選択は、当業者には既知であるように、タンパク質の活性ドメイン内での各々の部位の役割により決定される。ＰＥＧは、酵素活性を実質的に失うことなくキメラＡＤＩの第１級アミンに結合される場合がある。例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓからクローニングしたＡＤＩは、この手順によって修飾されてよい多数のリジン残基を有する。換言すれば、リジンのうち１つ以上またはそのすべては、本明細書に記載されるようなＡＤＩ及びＡＤＩのキメラ形態が、生体適合性リンカー、例えばＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡ及び／またはＮＨＳなどによって、ＰＥＧに結合され得る可能な地点である。ＰＥＧは、本開示の観点から当業者には明らかであるように、本明細書に記載されるようなＡＤＩ及びＡＤＩのキメラ形態上のその他の部位に結合されてもよい。
１〜約３０のＰＥＧ分子が、キメラＡＤＩに共有結合されてよい。ある種の実施形態では、キメラＡＤＩは、１つのＰＥＧ分子により修飾される。その他の実施形態では、キメラＡＤＩは、２つ以上のＰＥＧ分子により修飾される。一実施形態では、キメラＡＤＩは、約１〜約１０のＰＥＧ分子、一実施形態では、約２〜約８のＰＥＧ分子、別の実施形態では、約９〜約１２のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態では、キメラＡＤＩは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のＰＥＧ分子により修飾される。特定の一実施形態では、キメラＡＤＩは、ＡＤＩ当たり４．５〜５．５のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態では、キメラＡＤＩは、５±１．５のＰＥＧ分子により修飾される。
別の実施形態では、キメラＡＤＩの約１５％〜約７０％の第１級アミノ基がＰＥＧにより修飾され、一実施形態では、約２０％〜約６５％、約２５％〜約６０％、またはある種の実施形態では、約３０％〜約５５％、もしくは４５％〜約５０％、及びその他の実施形態では、アルギニンデイミナーゼの約２０％または３０％または４０％または５０％の第１級アミノ基が、ＰＥＧにより修飾される。当業者によって理解されるように、第１級アミノ基の範囲は、除去に成功したリジンの多さに依存する。ある種の実施形態では、すべてのリジンが除去されてよく、分子のＮ末端がＰＥＧ化される。ＰＥＧがキメラＡＤＩの末端に共有結合される場合、利用するＰＥＧ分子を１つだけ有することが望ましい場合もある。キメラＡＤＩ上のＰＥＧ単位数の増加は、酵素の循環半減期を増加させる。しかしながら、キメラＡＤＩ上のＰＥＧ単位数の増加は、酵素の比活性を減少させる。したがって、本開示の観点から当業者には明らかであるように、この２つの間でバランスをとる必要がある。
本発明において、生体適合性リンカーの共通の特徴は、それらがスクシニル基によってアルギニンデイミナーゼの第１級アミンに結合することである。一旦キメラＡＤＩと結合すると、ＳＳ−ＰＥＧは、ＰＥＧに隣接してエステル結合を有し、このことがこの部位に血清エステラーゼに対する感受性を付与する場合があり、体内でキメラＡＤＩからＰＥＧを放出させる場合もある。ＳＰＡ−ＰＥＧ及びＰＥＧ２−ＮＨＳは、エステル結合を有しないので、それらは血清エステラーゼに対する感受性がない。
ある種の実施形態では、生体適合性リンカーを本発明で使用する。タンパク質に結合されるＰＥＧは、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧ及びＳＣ−ＰＥＧのように直鎖であってよく、またはＰＥＧ２−ＮＨＳのようにＰＥＧの分岐鎖のいずれかを使用してよい。
ある種の実施形態では、本開示のキメラＡＤＩは、米国特許第ＵＳ６，６３５，４６２号明細書に記載されているように修飾されてよい。特に、ＡＤＩ及びＡＤＩのキメラ分子、特にＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ及びＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉに由来する分子の天然に存在するアミノ酸残基のうち１つ以上の修飾は、より容易に再生及び製剤化される酵素を提供し、それによってキメラＡＤＩ及びそれを含む治療用組成物の製造に関する既存の技術を改善することができる。一実施形態では、本開示のキメラＡＤＩは、１つ以上のリジン残基を除去するように修飾される（例えば、リジンは、別のアミノ酸もしくはその類似体、または非天然アミノ酸により置換され得る）。特に、一実施形態では、キメラＡＤＩは、配列番号：１（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓのＡＤＩ）の位置１１２、３７４、４０５もしくは４０８に、またはこれらの位置のうち１つ以上の組み合わせにリジンを含まないように修飾される。さらなる実施形態では、キメラＡＤＩは、１つ以上のリジン、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれを超えるリジン残基を含まないように修飾され、もしリジンが存在するならば、別のアミノ酸もしくはその類似体、または非天然アミノ酸により置換され得る。一実施形態では、キメラＡＤＩは、例えば、配列番号：４の位置７、８８、１３７、２０９、及び３８０で置換される５つのリジンを有する。別の実施形態では、キメラＡＤＩは、例えば、配列番号：４の位置７、９、５９、８８、１１５、１１６、１３７、１７８、２０９、及び３８０で置換される１０のリジンを有する。さらに別の実施形態では、キメラＡＤＩは、例えば、配列番号：４の位置７、９、５９、６６、８８、９１、９３、１１５、１１６、１３７、１４１、１７８、２０９、２７９、及び位置３８０で置換される１５のリジンを有する。一実施形態では、キメラＡＤＩは、例えば、配列番号：４の位置７、９、５６、５９、６６、８８、９１、９３、９６、１１５、１１６、１３７、１４１、１７８、２０９、２５４、２７９、３２５、３２６、３８０、及び４０６で置換される２１のリジンを含む。リジン置換を有する例示的なキメラＡＤＩ分子は、配列番号：１０〜１３に示す。
ある種の実施形態では、酵素の触媒領域に位置する、または隣接するＡＤＩと関連するＰＥＧ化部位が修飾される。本発明の目的のために、「ＰＥＧ化部位」という語句は、ポリエチレングリコールにより共有結合的に修飾されてよいＡＤＩまたはキメラＡＤＩの任意の部位または位置と定義されてよい。「ＰＥＧ化部位」は、酵素の触媒領域に位置する、または隣接すると考えられ得、部位のＰＥＧ化は、酵素の触媒活性に有意な減少をもたらす。このような部位のＰＥＧ化は、従来より酵素の不活性化をもたらしてきた。例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓからのＡＤＩは、酵素の触媒領域にある、または隣接すると考えられ得る１１２位にリジンを有する。１１２位のこのリジンへのＰＥＧ結合は、酵素を不活性化し得る。加えて、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓからのＡＤＩは、酵素の触媒領域にある、または隣接すると考えられ得る３９７位にシステインを有する。３９７位のシステインのアミノ酸置換は、酵素を不活性化し得る。特に、３９７位のシステインをアラニン、ヒスチジン、アルギニン、セリン、リジンまたはチロシンで置換すると、検出可能なすべての酵素活性の損失をもたらし得る。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓからのＡＤＩはまた、この保存システインの近傍に位置する３つのリジン、特にＬｙｓ３７４、Ｌｙｓ４０５及びＬｙｓ４０８を有する。Ｌｙｓ３７４、Ｌｙｓ４０５、Ｌｙｓ４０８またはこれらの組み合わせに対するＰＥＧの結合は、酵素を不活性化し得る。
その他の生物に由来するＡＤＩも、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓからのＡＤＩの１１２位に対応するＰＥＧ化部位を有する場合があることを理解すべきである。例えば、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓからのＡＤＩは１０４位にリジンを有し、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＡＤＩは１０６位にリジンを有し、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓからのＡＤＩは１１４位にリジンを有する。加えて、いくつかの生物からのＡＤＩは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓからのＡＤＩの１１２位と同じ一般位置に対応するリジンを有する場合がある。このような生物からのＡＤＩにおけるリジンの位置は、当業者には既知であり、米国特許第ＵＳ６，６３５，４６２号明細書に記載されている。
したがって、一実施形態では、本発明は、ＡＤＩのポリペプチド鎖においてある種のアミノ酸置換を提供する。これらのアミノ酸置換は、修飾剤により修飾される場合、例えばＰＥＧ化される場合でも、あまり活性を失わない修飾ＡＤＩを提供する。酵素の触媒領域の、または領域に隣接するＰＥＧ化部位、またはその他の既知の修飾部位を排除することにより、最適な修飾、例えばＰＥＧ化が、活性を失うことなく達成され得る。
本発明のその他の実施形態は、アルギニンデイミナーゼのある種の構造的特徴が、組換え技術により産生される場合に、適切かつ迅速な再生を妨げる、またはそれに干渉する場合があるという理解に基づいていることを理解すべきである。特に、これらの構造的特徴は、組換え産生中に酵素が活性立体配座をとることを妨害する、または妨げる。本発明の目的のために、「活性立体配座」という語句は、非修飾または修飾アルギニンデイミナーゼまたはキメラアルギニンデイミナーゼによる酵素活性を可能にする三次元構造と定義されてよい。活性立体配座は、特にアルギニンからシトルリンへの変換を触媒するために必要な場合がある。「構造的特徴」という語句は、特定のアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせから得られるポリペプチド鎖の任意の形質、品質または特性と定義されてよい。例えば、アルギニンデイミナーゼは、正常なペプチド鎖に折り曲げまたはねじれをもたらして、それゆえ酵素再生中に、酵素が活性立体配座をとることを妨害するアミノ酸を含有する場合がある。特に、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓからのアルギニンデイミナーゼは、ペプチド鎖に折り曲げまたはねじれをもたらす場合があるプロリンを２１０位に有し、これにより組換え産生中に酵素を再生することをより困難にしている。その他の生物に由来するアルギニンデイミナーゼも、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓからのアルギニンデイミナーゼの２１０位に対応する部位を有する場合があることを理解すべきである。
したがって、本発明は、野生型アルギニンデイミナーゼ及びそれらに由来するキメラアルギニンデイミナーゼのポリペプチド鎖に、ある種のアミノ酸置換をさらに提供する。このようなアミノ酸置換は、アルギニンデイミナーゼのペプチド鎖において問題となる構造的特徴を排除することができる。このようなアミノ酸置換は、修飾アルギニンデイミナーゼの改善した再生を提供する。これらのアミノ酸置換は、量を減らした緩衝液を使用して、修飾キメラアルギニンデイミナーゼの迅速な再生を可能にする。これらのアミノ酸置換は、再生される修飾キメラアルギニンデイミナーゼの収率増加も提供する場合がある。本発明の一実施形態では、修飾キメラアルギニンデイミナーゼは、Ｐ２１０または同等の残基にアミノ酸置換を有する。前述のように、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓに由来するアルギニンデイミナーゼは、２１０位に位置するアミノ酸のプロリンを有する。本発明に限定されることなく、位置２１０のアミノ酸プロリンの存在は、アルギニンデイミナーゼの再生（すなわち、リフォールディング）の困難さを増加させる折り曲げまたはねじれを、正常なポリペプチド鎖にもたらすと現在考えられている。位置２１０のプロリンの置換は、量を減らした緩衝液を使用して、修飾アルギニンデイミナーゼ及びそれに由来するキメラの迅速な再生を可能にする。位置２１０のプロリンの置換は、再生される修飾キメラアルギニンデイミナーゼの収率増加も提供する場合がある。一実施形態では、位置２１０のプロリンはセリンにより置換される。本発明のこの態様によると、位置２１０でその他の置換が行われてよいことを理解すべきである。その他の置換の例としては、Ｐｒｏ２１０をＴｈｒ２１０に、Ｐｒｏ２１０をＡｒｇ２１０に、Ｐｒｏ２１０をＡｓｎ２１０に、Ｐｒｏ２１０をＧｌｎ２１０に、またはＰｒｏ２１０をＭｅｔ２１０にする置換が挙げられる。野生型アルギニンデイミナーゼ及びそれに由来するキメラの位置２１０のアミノ酸に関連するこれらの構造的特徴を排除することにより、酵素の適切なリフォールディングが達成され得る。
本発明の方法は、インビトロ用途またはインビボ用途のいずれかを含み得る。細胞培養用途を含むインビトロ用途の場合、本明細書に記載される化合物を培養物中の細胞に添加し、次いでインキュベートすることができる。本発明の化合物を、当該技術分野において周知の抗体産生技術を使用して、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体の産生を促進するために使用してもよい。次いでモノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体を、当業者には明らかであるように、多種多様な診断用途に使用することができる。
本発明の化合物を投与するインビボ手段は、目的の用途に応じて変化するだろう。本明細書に記載されるキメラＡＤＩ組成物の投与は、純粋形態で、または適切な医薬組成物で、類似した実用性を与えるための、薬剤の認められている投与方法のいずれかにより実施され得る。医薬組成物は、キメラＡＤＩ、例えばキメラＡＤＩ−ＰＥＧ、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、適切な生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせることより調製され得、固体、半固体、液体または気体形態の、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、微粒子剤、及びエアゾール剤などの調製物へと製剤化されてよい。加えて、その他の薬学的活性成分（本明細書内の他の箇所に記載されているような、その他の抗癌剤を含む）ならびに／または好適な賦形剤、例えば塩、緩衝液及び安定剤などが、組成物内に存在する場合もあるが、必ずしもその必要はない。投与は、経口、非経口、経鼻、静脈内、皮内、皮下または局所を含む、種々の異なる経路により達成されてよい。投与方法は、処置または予防される状態の性質に依存する。したがって、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ、例えばキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０は、経口、鼻腔内、腹腔内、非経口、静脈内、リンパ管内、腫瘍内、筋肉内、間質内、動脈内、皮下、眼球内、滑液嚢内、経上皮、及び経皮的に投与されてよい。投与後に、癌の進行及び／または転移を減少、阻害、予防または遅延させる量が、効果的であると考えられる。ある種の実施形態では、本明細書のキメラＡＤＩ組成物は、統計的に有意な量で患者の生存期間の中央値を増加させる。一実施形態では、本明細書に記載されるキメラＡＤＩ処置は、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間、３０週間、４０週間、またはそれよりも長く、患者の生存期間の中央値を増加させる。ある種の実施形態では、キメラＡＤＩ処置は、１年間、２年間、３年間、またはそれよりも長く、患者の生存期間の中央値を増加させる。一実施形態では、本明細書に記載されるキメラＡＤＩ処置は、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間またはそれよりも長く、無増悪生存期間を増加させる。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるキメラＡＤＩ処置は、１年間、２年間、３年間、またはそれよりも長く、無増悪生存期間を増加させる。
ある種の実施形態では、投与される量は、生存腫瘍量の統計的に有意な減少、例えば腫瘍質量の少なくとも５０％の減少によって、または走査寸法の変更（例えば、統計的有意性のある減少）によって示されるように腫瘍退縮をもたらすのに十分である。ある種の実施形態では、投与される量は、安定した疾患をもたらすのに十分である。その他の実施形態では、投与される量は、熟練した臨床医に既知の特定の疾患適応症の症状に、臨床的に関連する減少をもたらすのに十分である。
ある種の実施形態では、投与される量は、ＮＯ合成を阻害する、血管新生を阻害するのに十分である、及びもしくは腫瘍細胞にアポトーシスを誘導するのに十分である、またはこれらの任意の組み合わせである。ＮＯ合成、血管新生及びアポトーシスは、当該技術分野において既知の方法を使用して測定されてよく、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９及びその最新版）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５；及びその他の同様の参考文献を参照のこと。特定の一実施形態では、投与される量は、ＮＯ合成を阻害し、黒色腫の成長を阻害し、シスプラチンなどの本明細書に記載されるようなその他の化学療法と相乗作用する。したがって、本開示の一実施形態は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０をシスプラチンと組み合わせて投与することにより、黒色腫を処置する方法を提供し、この処置は内因性一酸化窒素（ＮＯ）を枯渇させる。
正確な投与量及び処置期間は、処置される疾患の関数であり、既知の試験プロトコールを使用して経験的に、または当該技術分野において既知のモデル系で組成物を試験し、そこから推定することにより決定されてよい。対照臨床試験を実施してもよい。投与量は、緩和されるべき状態の重症度によっても変動する場合がある。医薬組成物は一般に、治療上有用な効果を発揮しながら、望ましくない副作用を最小限に抑えるように製剤化及び投与される。組成物は、一度に投与されてよい、または時間間隔を置いて投与される多数の小用量に分割されてよい。任意の特定の対象には、特定の投与レジメンを個人の必要性に従って経時的に調整してよい。
キメラＡＤＩ組成物は、単独でまたは既知のその他の癌処置法、例えば放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学療法などと組み合わせて投与されてよい。組成物はまた、抗生物質と組み合わせて投与されてもよい。
したがって、これらの及び関連する医薬組成物を投与する典型的な経路としては、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸内、膣内、及び鼻腔内が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、または注入技術を含む。本発明のある種の実施形態による医薬組成物は、その組成物に含有される活性成分が、患者への組成物の投与時に生物学的に利用可能であることを可能にするように製剤化される。対象または患者に投与されるだろう組成物は、１回以上の投与単位の形態をとってよく、例えば、錠剤は単回投与単位であってよく、エアゾール形態の本明細書に記載されるキメラＡＤＩ組成物の容器は、複数回の投与単位を保持してよい。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者には既知である、または当業者には明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００）を参照のこと。投与される組成物は、いずれにせよ、治療有効量の本開示のキメラＡＤＩ−ＰＥＧ、例えばキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０などを、本明細書の教示に従って関心対象の疾患または状態を処置するために含有するだろう。
医薬組成物は、固体または液体の形態であってよい。一実施形態では、１種以上の担体が粒状であり、それゆえ組成物は、例えば錠剤または散剤形態である。１種以上の担体は液体であってよく、組成物は、例えばアノーラル油、注射用液またはエアゾールであり、例えば吸入投与に有用である。経口投与を目的とする場合、医薬組成物は一般に、固体または液体形態のいずれかであり、半固体、半液体、懸濁液及びゲル形態が、本明細書において固体または液体のいずれかと考えられる形態内に含まれる。
経口投与用の固体組成物として、医薬組成物は、散剤、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル剤、チューインガム剤、ウェハ剤などへと製剤化されてよい。このような固体組成物は、典型的には１種以上の不活性希釈剤または食用担体を含有するだろう。加えて、以下のうち１種以上が存在してよい：結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなど；賦形剤、例えばデンプン、ラクトースまたはデキストリンなど、崩壊剤、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプンなど；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘなど；流動化剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素など；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリンなど；香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料など；及び着色剤。医薬組成物がカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態である場合、上記種類の材料に加えて、液体担体、例えばポリエチレングリコールまたは油などを含有してよい。
医薬組成物は、液体の形態、例えばエリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤または懸濁液であってよい。液体は、２つの例として、経口投与用または注射による送達用であってよい。経口投与を目的とする場合、好ましい組成物は、本発明の化合物に加えて、甘味剤、防腐剤、染料／着色剤及び香味増強剤のうち１種以上を含有する。注射による投与を目的とする組成物では、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝液、安定剤及び等張化剤のうち１種以上を含んでよい。
液体医薬組成物としては、それらが液剤、懸濁液またはその他の同様の形態であろうとなかろうと、以下のアジュバントのうち１種以上を挙げてよい：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、ある種の実施形態では生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウムなど、固定油、例えば溶媒もしくは懸濁媒体として機能する場合もある合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の溶媒など；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸など；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など、及び張度調整用の薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースなど。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアル内に密閉され得る。生理食塩水が、好ましいアジュバントである。注射用医薬組成物は、好ましくは滅菌である。
非経口または経口投与のいずれかを目的とする液体医薬組成物は、本明細書に開示されるようなキメラＡＤＩ、例えばキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０などの量を含有すべきであり、その結果、好適な投与量が得られるだろう。典型的には、この量は、組成物中において少なくとも０．０１％のキメラＡＤＩである。経口投与を目的とする場合、この量は、組成物の０．１〜約７０重量％の間で変動する場合がある。ある種の経口医薬組成物は、約４％〜約７５％のキメラＡＤＩ−ＰＥＧを含有する。ある種の実施形態では、本発明による医薬組成物及び調製物は、非経口投与単位が希釈前に０．０１〜１０重量％のキメラＡＤＩ−ＰＥＧを含有するように調製される。
医薬組成物は局所投与を目的としてよく、その場合に担体は、好適には液剤、乳剤、軟膏剤またはゲル剤の基剤を含んでよい。基剤は、例えば、以下のうち１種以上を含んでよい：ペトロラタム、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、希釈剤、例えば水及びアルコールなど、ならびに乳化剤ならびに安定剤。増粘剤が、局所投与用の医薬組成物中に存在してよい。経皮投与を目的とする場合、組成物は、経皮パッチまたはイオン導入装置を含んでよい。医薬組成物は、例えば坐剤の形態での直腸投与を目的としてよく、それは直腸内で融解し、薬物を放出するだろう。直腸投与用組成物は、好適な非刺激性賦形剤として油脂性基剤を含有してよい。このような基剤としては、ラノリン、ココアバター及びポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
医薬組成物は、固体または液体投与単位の物理的形態を修飾する様々な材料を含んでよい。例えば、組成物は、活性成分の周りにコーティングシェルを形成する材料を含んでよい。コーティングシェルを形成する材料は、典型的には不活性であり、例えば、糖、シェラック、及びその他の腸溶性コーティング剤から選択されてよい。あるいは、活性成分をゼラチンカプセル内に入れてよい。固体または液体形態の医薬組成物は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧに結合し、それによって化合物の送達を助ける薬剤を含んでよい。この能力で作用する場合もある好適な薬剤としては、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、１種以上のタンパク質またはリポソームが挙げられる。医薬組成物は、エアゾール剤として投与され得る投与単位から本質的に成ってよい。エアゾール剤という用語は、コロイド性の系から、加圧包装で構成される系までの範囲の様々な系を示すために使用される。送達は、液化ガスもしくは圧縮ガスによるもの、または活性成分を分配する好適なポンプ系によるものであってよい。エアゾール剤は、１種以上の活性成分を送達するために、単相、二相、または三相系で送達されてよい。エアゾール剤の送達には、必須の容器、活性化剤、バルブ、副容器などを含み、それら全体でキットを形成してよい。当業者は、過度な実験をすることなく好ましいエアゾール剤を決定してよい。
医薬組成物は、医薬技術分野において周知の手法により調製されてよい。例えば、注射により投与されることを目的とする医薬組成物は、本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩ−ＰＥＧ、ならびに場合により塩、緩衝液及び／または安定剤のうち１種以上を含む組成物を、滅菌蒸留水と組み合わせて液剤を形成することにより調製され得る。界面活性剤を添加して、均一な液剤または懸濁液の形成を促進してよい。界面活性剤は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ組成物と非共有結合的に相互作用して、水性送達系においてキメラＡＤＩ−ＰＥＧの溶解または均一な懸濁を促進する化合物である。
組成物は治療有効量で投与されてよく、この量は、用いられる特定の化合物（例えば、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ）の活性；化合物の代謝安定性及び作用の長さ；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、及び食事；投与方法及び投与時期；排出速度；薬物の組み合わせ；特定の障害または状態の重症度；ならびに療法を受けている対象を含む、様々な要因に応じて変動するだろう。
本発明の化合物のうち１種の治療有効量は、腫瘍成長を阻害するのに効果的な量である。一般に、処置は少量の投与量で開始して、その状況下で最適な効果が得られるまで少量ずつ増加させることができる。一般に、本発明の化合物の治療投与量は、約１〜約２００ｍｇ／ｋｇを１週間に２回〜２週間に約１回であってよい。例えば、投与量は、２ｍｌの静脈内注射として約１ｍｇ／ｋｇを１週間に１回〜約２０ｍｇ／ｋｇを３日に１回であってよい。さらなる実施形態では、用量は、約５０ＩＵ／ｍ２〜約８，０００ＩＵ／ｍ２であり、３日に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間に約１回投与されてよい。ある種の実施形態では、用量は、約５０ＩＵ／ｍ２、６０ＩＵ／ｍ２、７０ＩＵ／ｍ２、８０ＩＵ／ｍ２、９０ＩＵ／ｍ２、１００ＩＵ／ｍ２、１１０ＩＵ／ｍ２、１２０ＩＵ／ｍ２、１３０ＩＵ／ｍ２、１４０ＩＵ／ｍ２、１５０ＩＵ／ｍ２、１６０ＩＵ／ｍ２、１７０ＩＵ／ｍ２、１８０ＩＵ／ｍ２、１９０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２１０ＩＵ／ｍ２、２２０ＩＵ／ｍ２、２３０ＩＵ／ｍ２、２４０ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、２６０ＩＵ／ｍ２、２７０ＩＵ／ｍ２、２８０ＩＵ／ｍ２、２９０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３１０ＩＵ／ｍ２、約３２０ＩＵ／ｍ２、約３３０ＩＵ／ｍ２、３４０ＩＵ／ｍ２、約３５０ＩＵ／ｍ２、３６０ＩＵ／ｍ２、３７０ＩＵ／ｍ２、３８０ＩＵ／ｍ２、３９０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４１０ＩＵ／ｍ２、４２０ＩＵ／ｍ２、４３０ＩＵ／ｍ２、４４０ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６２０ＩＵ／ｍ２、６３０ＩＵ／ｍ２、６４０ＩＵ／ｍ２、６５０ＩＵ／ｍ２、６６０ＩＵ／ｍ２、６７０ＩＵ／ｍ２、６８０ＩＵ／ｍ２、６９０ＩＵ／ｍ２、７００ＩＵ／ｍ２、７５０ＩＵ／ｍ２、８００ＩＵ／ｍ２、８５０ＩＵ／ｍ２、９００ＩＵ／ｍ２、９５０ＩＵ／ｍ２、１，０００ＩＵ／ｍ２、１，１００ＩＵ／ｍ２、１，２００ＩＵ／ｍ２、１，３００ＩＵ／ｍ２、１，４００ＩＵ／ｍ２、１，５００ＩＵ／ｍ２、１，６００ＩＵ／ｍ２、１，７００ＩＵ／ｍ２、１，８００ＩＵ／ｍ２、１，９００ＩＵ／ｍ２、２，０００ＩＵ／ｍ２、２，１００ＩＵ／ｍ２、２，２００ＩＵ／ｍ２、２，３００ＩＵ／ｍ２、２，４００ＩＵ／ｍ２、２，５００ＩＵ／ｍ２、２，６００ＩＵ／ｍ２、２，７００ＩＵ／ｍ２、２，８００ＩＵ／ｍ２、２，９００ＩＵ／ｍ２、３，０００ＩＵ／ｍ２、３，１００ＩＵ／ｍ２、３２００ＩＵ／ｍ２、３，３００ＩＵ／ｍ２、３，４００ＩＵ／ｍ２、３，５００ＩＵ／ｍ２、３，６００ＩＵ／ｍ２、３，７００ＩＵ／ｍ２、３，８００ＩＵ／ｍ２、３，９００ＩＵ／ｍ２、４０００ＩＵ／ｍ２、４，１００ＩＵ／ｍ２、４，２００ＩＵ／ｍ２、４，３００ＩＵ／ｍ２、４，４００ＩＵ／ｍ２、４，５００ＩＵ／ｍ２、４，６００ＩＵ／ｍ２、４，７００ＩＵ／ｍ２、４，８００ＩＵ／ｍ２、４，９００ＩＵ／ｍ２、５，０００ＩＵ／ｍ２、５，１００ＩＵ／ｍ２、５，２００ＩＵ／ｍ２、５，３００ＩＵ／ｍ２、５，４００ＩＵ／ｍ２、５，５００ＩＵ／ｍ２、５，６００ＩＵ／ｍ２、５，７００ＩＵ／ｍ２、５，８００ＩＵ／ｍ２、５，９００ＩＵ／ｍ２、６，０００ＩＵ／ｍ２、６，１００ＩＵ／ｍ２、６，２００ＩＵ／ｍ２、６，３００ＩＵ／ｍ２、６，４００ＩＵ／ｍ２、６，５００ＩＵ／ｍ２、６，６００ＩＵ／ｍ２、６，７００ＩＵ／ｍ２、６，８００ＩＵ／ｍ２、６，９００ＩＵ／ｍ２、７，０００ＩＵ／ｍ２、７，１００ＩＵ／ｍ２、７，２００ＩＵ／ｍ２、７，３００ＩＵ／ｍ２、７，４００ＩＵ／ｍ２、７，５００ＩＵ／ｍ２、７，６００ＩＵ／ｍ２、７，７００ＩＵ／ｍ２、７，８００ＩＵ／ｍ２、７，９００ＩＵ／ｍ２、または約８，０００ＩＵ／ｍ２であり、３日に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間に約１回投与されてよい。いくつかの実施形態では、用量は、約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、または約８０ｍｇ／ｍ２であり、３日に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間に約１回投与されてよい。ある種の実施形態では、用量は、熟練した臨床医によって所望に応じて修正されてよい。いくつかの実施形態では、
キメラＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００による最適な投与は、１週間に約２回であってよいが、キメラＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００による最適な投与は、１週間に約１回〜２週間に約１回であってよい。ある種の実施形態では、キメラＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００による最適な投与は、１週間に約２回であってよい。
キメラＡＤＩ−ＰＥＧを、リン酸緩衝食塩水と、または当業者に既知の任意のその他の適切な溶液と、注射前に混合してよい。一実施形態では、キメラＡＤＩ−ＰＥＧを含む液体組成物は、約１０〜約１２ｍｇのキメラＡＤＩ、約２０〜約４０ｍｇのポリエチレングリコール、１．２７ｍｇの＋５％一塩基性リン酸ナトリウム、ＵＳＰ；約３ｍｇの＋５％二塩基性リン酸ナトリウム、ＵＳＰ；７．６ｍｇの＋５％塩化ナトリウム、ＵＳＰを；約６．６〜約７のｐＨで；適切な量の注射用水（例えば、約１ｍｌまたは約２ｍｌ）中に含む。一実施形態では、キメラＡＤＩ−ＰＥＧを含む液体組成物は、ヒスチジン−ＨＣｌを含み、ある種の実施形態では、組成物緩衝液は、約０．００３５Ｍのヒスチジン−ＨＣｌ〜約０．３５Ｍのヒスチジン−ＨＣｌである。特定の一実施形態では、組成物は、ｐＨ６．８で０．０３５Ｍのヒスチジン−ＨＣｌを、０．１３Ｍの塩化ナトリウムと共に含む緩衝液中で製剤化される。別の実施形態では、組成物は、ｐＨ６．８で０．０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液を、０．１３Ｍの塩化ナトリウムと共に含む緩衝液中で製剤化される。
一実施形態では、キメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物は、約５〜約９のｐＨ、約６〜約８のｐＨ、または約６．５〜約７．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、キメラＡＤＩを含む組成物は、約６．８±１．０のｐＨを有する。
一実施形態では、キメラＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物中の遊離ＰＥＧは１〜１０％であり、さらなる実施形態では、総ＰＥＧの７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満である。ある種の実施形態では、キメラＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物中の非修飾キメラＡＤＩは、約１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満または０．１％未満である。一般に、キメラＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物は、約４％以下、３％以下、２％以下、１．５％以下、１％以下または０．５％以下の総不純物を有する。一実施形態では、エンドトキシン規格値は、ＵＳＰに記述されている要件を満たす、すなわち、≦５０ＥＵ／ｍＬである。
一実施形態では、キメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物中の遊離スルフヒドリルは、約９０％超である。いくつかの実施形態では、キメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物中の遊離スルフヒドリルは、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％もしくは約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超える。
一実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、約０．５μＭ〜約１５μＭのＫｍを有し、さらなる実施形態では、約１μＭ〜約１２μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約１．５μＭ〜約９μＭ、約１．５μＭ〜約８μＭまたは約１．５μＭ〜約７μＭである。ある種の実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、約１．５μＭ〜約６．５μＭのＫｍを有する。いくつかの実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、または約７μＭのＫｍを有する。一実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、組成物中の野生型ＡＤＩまたは野生型ＡＤＩ−ＰＥＧと比較して、減少したＫｍを有する。
一実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、約０．５秒−１〜約１５秒−１のＫｃａｔを有し、さらなる実施形態では、約１秒−１〜約１２秒−１、約１秒−１〜約１０秒−１、約１．５秒−１〜約９秒−１、約２秒−１〜約８秒−１または約２．５秒−１〜約７秒−１である。ある種の実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、約２．５秒−１〜約７．５秒−１のＫｃａｔを有する。いくつかの実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、約２．５秒−１、約３秒−１、約３．５秒−１、約４秒−１、約４．５秒−１、約５秒−１、約５．５秒−１、約６秒−１、約６．５秒−１、約７秒−１、約７．５秒−１または約８秒−１のＫｃａｔを有する。一実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、組成物中の野生型ＡＤＩまたは野生型ＡＤＩ−ＰＥＧよりも高いＫｃａｔを有する。
一実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、約５ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍの伝導率（当該技術分野において比導電率とも称される）、さらなる実施形態では、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約７ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍまたは約１０ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。いくつかの実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、約９ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍ、約１２ｍＳ／ｃｍまたは約１３ｍＳ／ｃｍ、約１４ｍＳ／ｃｍまたは約１５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。ある種の実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、約１３ｍＳ／ｃｍ±１．０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。
一実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。ある種の実施形態では、組成物中のキメラＡＤＩまたはキメラＡＤＩ−ＰＥＧは、約３００±３０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
一実施形態では、タンパク質濃度は、約１１．０±１．０ｍｇ／ｍＬである。ある種の実施形態では、タンパク質濃度は、約８〜約１５ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、タンパク質濃度は、約８、９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、または１５ｍｇ／ｍＬである。
一実施形態では、比酵素活性は５．０〜１５０ＩＵ／ｍｇであり、１ＩＵは、３７℃で１分間に１μｍｏｌのアルギニンを１μｍｏｌのシトルリンと１μｍｏｌのアンモニアへと変換する酵素の量と定義され、活性は１００±２０ＩＵ／ｍｇである。別の実施形態では、比酵素活性は、約５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９．０、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または約１５０±２．０ＩＵ／ｍｇである。特定の一実施形態では、比酵素活性は、１００±１０．０ＩＵ／ｍｇである。
本開示のキメラＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物はまた、１種以上のその他の治療剤の投与と同時に、投与前に、または投与後に投与されてもよい。このような併用療法としては、本発明の化合物及び１種以上の追加の活性剤を含有する単一の医薬投与製剤の投与、ならびに本発明のキメラＡＤＩ−ＰＥＧ（例えば、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０）を含む組成物及び各活性剤の、それぞれ別個の医薬投与製剤による投与を挙げてよい。例えば、本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩ−ＰＥＧ及び他方の活性剤を、単一の経口投与組成物、例えば錠剤もしくはカプセル剤などで一緒に患者に投与することができる、または各薬剤を別個の経口投与製剤で投与することができる。同様に、本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩ−ＰＥＧ及び他方の活性剤を、単一の非経口投与組成物で、例えば食塩水もしくはその他の生理学的に許容される溶液などで一緒に患者に投与することができる、または各薬剤を別個の非経口投与製剤で投与することができる。別個の投与製剤を使用する場合、キメラＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物及び１種以上の追加の活性剤を、本質的に同時に、すなわち並行して、または別々に時間差で、すなわち連続して任意の順番で投与することができ；併用療法は、これらすべてのレジメンを含むと理解される。
したがって、ある種の実施形態では、１種以上のその他の治療剤と組み合わせた、本開示のキメラＡＤＩ組成物の投与も意図される。このような治療剤は、本明細書に記載されるような特定の疾患状態、例えば特定の癌またはＧＶＨＤなどの標準的な処置として当該技術分野において認められる場合がある。意図される例示的な治療剤としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、オートファジー調節剤、またはその他の活性剤及び補助剤が挙げられる。
ある種の実施形態では、本明細書に開示されるキメラＡＤＩ組成物を、任意の数の化学療法剤と組み合わせて投与してよい。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））など；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなど；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなど；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチルメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなど；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補充剤、例えばフォリン酸など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、プリンストン、ニュージャージー州）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、アントニー、フランス）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸誘導体、例えばＴａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）など；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラマイシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように機能する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含み；ならびに抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなども、この定義に含まれる。さらなる化学療法剤としては、ソラフェニブ、ならびにその他のタンパク質キナーゼ阻害剤、例えばアファチニブ、アキシチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ルキソリチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、及びスニチニブなど；シロリムス（ラパマイシン）、エベロリムス及びその他のｍＴＯＲ阻害剤が挙げられる。上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体もまた、本明細書での使用が意図される。
ある種の実施形態では、本明細書に開示されるキメラＡＤＩ組成物を、任意の数のオートファジー阻害剤と組み合わせて投与してよい。いくつかの好ましい実施形態では、オートファジー阻害剤は、クロロキン、３−メチルアデニン、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ（商標））、バフィロマイシンＡ１、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、オカダ酸、２Ａ型または１型のタンパク質ホスファターゼを阻害するオートファジー抑制藻類毒素、ｃＡＭＰの類似体、及びｃＡＭＰレベルを上昇させる薬物、アデノシン、Ｎ６−メルカプトプリンリボシド、ワートマニン、ならびにビンブラスチンから成る群から選択される。加えて、オートファジーに必須のタンパク質、例えばＡＴＧ５などの発現を調節するアンチセンスまたはｓｉＲＮＡを使用してもよい。
一実施形態では、キメラＡＤＩ−ＰＥＧと１種以上の治療剤との組み合わせは、相加的または相乗的に作用する。この点に関して、相乗作用剤が本明細書に記載され、この剤としては、本明細書で提供されるようなキメラＡＤＩ−ＰＥＧと相乗的に作用できる治療剤（例えば、本明細書に記載されるような化学療法剤、オートファジー阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、または癌、ＧＶＨＤ、もしくは炎症性腸疾患の処置に使用される任意のその他の治療剤）が挙げられ、このような相乗効果は、化学療法剤は存在するが、ＡＤＩ−ＰＥＧ組成物が存在しない場合に、及び／またはＡＤＩ−ＰＥＧは存在するが、化学療法剤が存在しない場合に検出され得る効果よりも大きな（すなわち、適切な対照条件と比較して統計的に有意である）検出可能な効果として現れる。相乗効果を測定する方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｊａｎｕａｒｙ１５，２０１０ ７０；４４０を参照のこと）。
本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩを含む組成物、及び場合によりその他の治療剤は、癌を処置する処置方法及び癌の転移を予防する方法に使用されてよい。したがって、本発明は、種々の異なる癌を処置する、それらの症状を改善させる、またはそれらの進行を阻害する、またはそれらを予防する方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＧＶＨＤを処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供する。特に、本開示は、患者の癌またはＧＶＨＤを処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法であって、患者に、治療有効量の本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩ組成物を投与し、それによって癌またはＧＶＨＤを処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害することを含む方法を提供する。したがって、本明細書に記載されるキメラＡＤＩ組成物は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病；潰瘍性大腸炎）、ＧＶＨＤまたは癌、例えば白血病（例えば、急性骨髄性白血病及び再発性急性骨髄性白血病）、黒色腫、肉腫（転移性肉腫、子宮平滑筋肉腫を含むが、これらに限定されない）、膵臓癌、前立腺癌（ホルモン不応性前立腺癌などであるが、これに限定されない）、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃の癌（胃腺癌を含むが、これに限定されない）、神経膠腫、多形性膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌（腎細胞癌を含むが、これに限定されない）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌（頭頸部の扁平上皮癌；舌の癌を含むが、これらに限定されない）、子宮頸癌、精巣癌、胆嚢、胆管癌、及び胃癌を含むが、これらに限定されない癌に罹患した個人に投与されてよい。
一実施形態では、本開示は、治療有効量のキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を投与することにより、骨髄性白血病、例えばこれに限定されないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などを処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態では、ＡＭＬなどの骨髄性白血病は、ＡＳＳ、ＡＳＬ、またはその両方を欠損している。さらなる実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、３日に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間に約１回投与することを含む、ＡＭＬを処置する方法を提供する。ある種の実施形態では、ＡＭＬの処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約５０ＩＵ／ｍ２〜約８，０００ＩＵ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約５０ＩＵ／ｍ２、約１００ＩＵ／ｍ２、１５０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３５０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６５０ＩＵ／ｍ２、７００ＩＵ／ｍ２、７５０ＩＵ／ｍ２、８００ＩＵ／ｍ２、約９００ＩＵ／ｍ２、約１，０００ＩＵ／ｍ２、１，５００ＩＵ／ｍ２、約２，０００ＩＵ／ｍ２、約２，５００ＩＵ／ｍ２、約３，０００ＩＵ／ｍ２、３，５００ＩＵ／ｍ２、４，０００ＩＵ／ｍ２、４，５００ＩＵ／ｍ２、５，０００ＩＵ／ｍ２、５，５００ＩＵ／ｍ２、６，０００ＩＵ／ｍ２、６，５００ＩＵ／ｍ２、７，０００ＩＵ／ｍ２、７，５００ＩＵ／ｍ２、または約８，０００ＩＵ／ｍ２である。特定の実施形態では、ＡＭＬの処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約８０ｍｇ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、または約８０ｍｇ／ｍ２である。ある種の実施形態では、本開示はＡＭＬを処置する方法を提供し、キメラＡＤＩの用量を２倍にして、１週間当たり６４０ＩＵ／ｍ２まで、またはそれを超えて増加させてよい。特定の一実施形態では、ＡＭＬの処置のためのキメラＡＤＩは、キメラＡＤＩ当たり３．５〜６．５のＰＥＧ分子で、または一実施形態では、キメラＡＤＩ当たり４．５〜５．５のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物を投与することによりＡＭＬを処置する方法を提供し、組成物は、５±１．５のＰＥＧ分子、一実施形態では、５±１．５の直鎖ＰＥＧ分子により修飾されるキメラＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、組成物は、約０．５％未満の天然キメラＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧにより修飾されていない）及び／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む。さらなる実施形態では、組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
一実施形態では、本開示は、治療有効量のキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を投与することにより、転移性肉腫を含むが、これに限定されない肉腫を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態では、肉腫は、ＡＳＳ、ＡＳＬ、またはその両方を欠損している。さらなる実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、３日に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間に約１回投与することを含む、肉腫を処置する方法を提供する。ある種の実施形態では、肉腫の処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約５０ＩＵ／ｍ２〜約８，０００ＩＵ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約５０ＩＵ／ｍ２、約１００ＩＵ／ｍ２、１５０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３５０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６５０ＩＵ／ｍ２、７００ＩＵ／ｍ２、７５０ＩＵ／ｍ２、８００ＩＵ／ｍ２、約９００ＩＵ／ｍ２、約１，０００ＩＵ／ｍ２、１，５００ＩＵ／ｍ２、約２，０００ＩＵ／ｍ２、約２，５００ＩＵ／ｍ２、約３，０００ＩＵ／ｍ２、３，５００ＩＵ／ｍ２、４，０００ＩＵ／ｍ２、４，５００ＩＵ／ｍ２、５，０００ＩＵ／ｍ２、５，５００ＩＵ／ｍ２、６，０００ＩＵ／ｍ２、６，５００ＩＵ／ｍ２、７，０００ＩＵ／ｍ２、７，５００ＩＵ／ｍ２、または約８，０００ＩＵ／ｍ２である。特定の実施形態では、肉腫の処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約８０ｍｇ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、または約８０ｍｇ／ｍ２である。ある種の実施形態では、本開示は肉腫を処置する方法を提供し、キメラＡＤＩの用量を２倍にして、１週間当たり６４０ＩＵ／ｍ２まで、またはそれを超えて増加させてよい。特定の一実施形態では、ＡＭＬの処置のためのキメラＡＤＩは、キメラＡＤＩ当たり３．５〜６．５のＰＥＧ分子で、または一実施形態では、キメラＡＤＩ当たり４．５〜５．５のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物を投与することにより、転移性肉腫を含む肉腫を処置する方法を提供し、組成物は、５±１．５のＰＥＧ分子、一実施形態では、５±１．５の直鎖ＰＥＧ分子により修飾されるキメラＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、組成物は、約０．５％未満の天然キメラＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧにより修飾されていない）及び／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む。さらなる実施形態では、組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
一実施形態では、本開示は、治療有効量のキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、場合によりオートファジー阻害剤、例えばこれらに限定されないが、クロロキン、３−メチルアデニン、ヒドロキシクロロキン、バフィロマイシンＡ１、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、オカダ酸、Ｎ６−メルカプトプリンリボシド、ワートマニン、及びビンブラスチンなどと組み合わせて投与することにより、膵臓癌を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態では、膵臓癌は、ＡＳＳ、ＡＳＬ、またはその両方を欠損している。さらなる実施形態では、本開示は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、３日に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間に約１回；場合により、治療有効量のオートファジー阻害剤、例えばクロロキンなどと組み合わせて投与することを含む、膵臓癌を処置する方法を提供する。この点に関して、治療有効用量のクロロキンは、約６００ｍｇ塩基、続いて３００ｍｇ塩基を追加する初期用量、及び２日連続で各日３００ｍｇ塩基の単回用量であってよい。このことは、３日間の総用量が２．５ｇのリン酸クロロキンまたは１．５ｇ塩基であることを表す。さらなる実施形態では、用量は約３００ｍｇ塩基であってよい。クロロキン、またはその他のオートファジー阻害剤の用量は、当該技術分野において既知の投与量を使用して、熟練した臨床医によって必要に応じて修正されてよい。当業者によって理解されるように、オートファジー阻害剤は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、それと同時に、またはその後に投与されてよい。ある種の実施形態では、膵臓癌の処置のために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約５０ＩＵ／ｍ２〜約８，０００ＩＵ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約５０ＩＵ／ｍ２、約１００ＩＵ／ｍ２、１５０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３５０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６５０ＩＵ／ｍ２、７００ＩＵ／ｍ２、７５０ＩＵ／ｍ２、８００ＩＵ／ｍ２、約９００ＩＵ／ｍ２、約１，０００ＩＵ／ｍ２、１，５００ＩＵ／ｍ２、約２，０００ＩＵ／ｍ２、約２，５００ＩＵ／ｍ２、約３，０００ＩＵ／ｍ２、３，５００ＩＵ／ｍ２、４，０００ＩＵ／ｍ２、４，５００ＩＵ／ｍ２、５，０００ＩＵ／ｍ２、５，５００ＩＵ／ｍ２、６，０００ＩＵ／ｍ２、６，５００ＩＵ／ｍ２、７，０００ＩＵ／ｍ２、７，５００ＩＵ／ｍ２、または約８，０００ＩＵ／ｍ２である。特定の実施形態では、膵臓癌の処置のために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約８０ｍｇ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、または約８０ｍｇ／ｍ２である。ある種の実施形態では、本開示は膵臓癌を処置する方法を提供し、キメラＡＤＩの用量を２倍にして、１週間当たり６４０ＩＵ／ｍ２まで、またはそれを超えて増加させてよい。特定の一実施形態では、膵臓癌の処置のためのキメラＡＤＩは、キメラＡＤＩ当たり３．５〜６．５のＰＥＧ分子で、または一実施形態では、キメラＡＤＩ当たり４．５〜５．５のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物を、場合によりクロロキン、またはその他の適切なオートファジー阻害剤と組み合わせて投与することにより膵臓癌を処置する方法を提供し、組成物は、５±１．５のＰＥＧ分子、一実施形態では、５±１．５の直鎖ＰＥＧ分子により修飾されるキメラＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、組成物は、約０．５％未満の天然キメラＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧにより修飾されていない）及び／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む。さらなる実施形態では、組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
一実施形態では、本開示は、治療有効量のＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、場合によりオートファジー阻害剤と組み合わせて投与することにより、小細胞肺癌を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態では、小細胞肺癌は、ＡＳＳ、ＡＳＬ、またはその両方を欠損している。さらなる実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、３日に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間に約１回；場合により、治療有効量のオートファジー阻害剤、例えばクロロキンなどと組み合わせて投与することを含む、小細胞肺癌を処置する方法を提供する。この点に関して、治療有効用量のクロロキンは、約６００ｍｇ塩基、続いて３００ｍｇ塩基を追加する初期用量、及び２日連続で各日３００ｍｇ塩基の単回用量であってよい。このことは、３日間の総用量が２．５ｇのリン酸クロロキンまたは１．５ｇ塩基であることを表す。さらなる実施形態では、用量は約３００ｍｇ塩基であってよい。クロロキンの用量は、当該技術分野において既知の投与量を使用して、熟練した臨床医によって必要に応じて修正されてよい。当業者によって理解されるように、オートファジー阻害剤は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、それと同時に、またはその後に投与されてよい。ある種の実施形態では、小細胞肺癌の処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約５０ＩＵ／ｍ２〜約８，０００ＩＵ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約５０ＩＵ／ｍ２、約１００ＩＵ／ｍ２、１５０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３５０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６５０ＩＵ／ｍ２、７００ＩＵ／ｍ２、７５０ＩＵ／ｍ２、８００ＩＵ／ｍ２、約９００ＩＵ／ｍ２、約１，０００ＩＵ／ｍ２、１，５００ＩＵ／ｍ２、約２，０００ＩＵ／ｍ２、約２，５００ＩＵ／ｍ２、約３，０００ＩＵ／ｍ２、３，５００ＩＵ／ｍ２、４，０００ＩＵ／ｍ２、４，５００ＩＵ／ｍ２、５，０００ＩＵ／ｍ２、５，５００ＩＵ／ｍ２、６，０００ＩＵ／ｍ２、６，５００ＩＵ／ｍ２、７，０００ＩＵ／ｍ２、７，５００ＩＵ／ｍ２、または約８，０００ＩＵ／ｍ２である。特定の実施形態では、小細胞肺癌の処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約８０ｍｇ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約１ｍｇ／ｍ２及び約８０ｍｇ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、または約８０ｍｇ／ｍ２である。ある種の実施形態では、本開示は小細胞肺癌を処置する方法を提供し、キメラＡＤＩの用量を２倍にして、１週間当たり６４０ＩＵ／ｍ２まで、またはそれを超えて増加させてよい。特定の一実施形態では、小細胞肺癌の処置のためのキメラＡＤＩは、キメラＡＤＩ当たり３．５〜６．５のＰＥＧ分子で、または一実施形態では、キメラＡＤＩ当たり４．５〜５．５のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物を、場合によりクロロキンと組み合わせて投与することにより小細胞肺癌を処置する方法を提供し、組成物は、５±１．５のＰＥＧ分子、一実施形態では、５±１．５の直鎖ＰＥＧ分子により修飾されるキメラＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、組成物は、約０．５％未満の天然キメラＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧにより修飾されていない）及び／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む。さらなる実施形態では、組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
一実施形態では、本開示は、治療有効量のキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、場合によりオートファジー阻害剤と組み合わせて投与することにより、肉腫（転移性肉腫を含むが、これに限定されない）を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態では、肉腫は、ＡＳＳ、ＡＳＬ、またはその両方を欠損している。さらなる実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、３日に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間に約１回；場合により、治療有効量のオートファジー阻害剤、例えばクロロキンなどと組み合わせて投与することを含む、肉腫を処置する方法を提供する。この点に関して、治療有効用量のクロロキンは、約６００ｍｇ塩基、続いて３００ｍｇ塩基を追加する初期用量、及び２日連続で各日３００ｍｇ塩基の単回用量であってよい。このことは、３日間の総用量が２．５ｇのリン酸クロロキンまたは１．５ｇ塩基であることを表す。さらなる実施形態では、用量は約３００ｍｇ塩基であってよい。クロロキンの用量は、当該技術分野において既知の投与量を使用して、熟練した臨床医によって必要に応じて修正されてよい。当業者によって理解されるように、オートファジー阻害剤は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、それと同時に、またはその後に投与されてよい。ある種の実施形態では、肉腫の処置のために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約５０ＩＵ／ｍ２〜約８，０００ＩＵ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約５０ＩＵ／ｍ２、約１００ＩＵ／ｍ２、１５０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３５０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６５０ＩＵ／ｍ２、７００ＩＵ／ｍ２、７５０ＩＵ／ｍ２、８００ＩＵ／ｍ２、約９００ＩＵ／ｍ２、約１，０００ＩＵ／ｍ２、１，５００ＩＵ／ｍ２、約２，０００ＩＵ／ｍ２、約２，５００ＩＵ／ｍ２、約３，０００ＩＵ／ｍ２、３，５００ＩＵ／ｍ２、４，０００ＩＵ／ｍ２、４，５００ＩＵ／ｍ２、５，０００ＩＵ／ｍ２、５，５００ＩＵ／ｍ２、６，０００ＩＵ／ｍ２、６，５００ＩＵ／ｍ２、７，０００ＩＵ／ｍ２、７，５００ＩＵ／ｍ２、または約８，０００ＩＵ／ｍ２である。ある種の実施形態では、肉腫の処置のために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約８０ｍｇ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、または約８０ｍｇ／ｍ２である。ある種の実施形態では、本開示は肉腫を処置する方法を提供し、キメラＡＤＩの用量を２倍にして、１週間当たり６４０ＩＵ／ｍ２まで、またはそれを超えて増加させてよい。特定の一実施形態では、肉腫の処置のためのキメラＡＤＩは、キメラＡＤＩ当たり３．５〜６．５のＰＥＧ分子で、または一実施形態では、キメラＡＤＩ当たり４．５〜５．５のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物を、場合によりクロロキンと組み合わせて投与することにより肉腫を処置する方法を提供し、組成物は、５±１．５のＰＥＧ分子、一実施形態では、５±１．５の直鎖ＰＥＧ分子により修飾されるキメラＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、組成物は、約０．５％未満の天然キメラＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧにより修飾されていない）及び／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む。さらなる実施形態では、組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
一実施形態では、本開示は、治療有効量のキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、場合によりドセタキセルと組み合わせて投与することにより、黒色腫を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態では、黒色腫は、ＡＳＳ、ＡＳＬ、またはその両方を欠損している。さらなる実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、３日に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間に約１回；場合により、治療有効量のドセタキセルと組み合わせて投与することを含む、黒色腫を処置する方法を提供する。この点に関して、治療有効用量のドセタキセルは、約３週間ごとに３０分〜１時間にわたって静脈内に投与される７５ｍｇ／ｍ２または１００ｍｇ／ｍ２を含んでよい。熟練した臨床医によって理解されるように、ドセタキセルの用量は、疾患適応症及び／またはこれまでの処置に応じて修正されてよく、ドセタキセルは、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、それと同時に、またはその後に投与されてよい。ある種の実施形態では、黒色腫の処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約５０ＩＵ／ｍ２〜約８，０００ＩＵ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約５０ＩＵ／ｍ２、約１００ＩＵ／ｍ２、１５０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３５０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６５０ＩＵ／ｍ２、７００ＩＵ／ｍ２、７５０ＩＵ／ｍ２、８００ＩＵ／ｍ２、約９００ＩＵ／ｍ２、約１，０００ＩＵ／ｍ２、１，５００ＩＵ／ｍ２、約２，０００ＩＵ／ｍ２、約２，５００ＩＵ／ｍ２、約３，０００ＩＵ／ｍ２、３，５００ＩＵ／ｍ２、４，０００ＩＵ／ｍ２、４，５００ＩＵ／ｍ２、５，０００ＩＵ／ｍ２、５，５００ＩＵ／ｍ２、６，０００ＩＵ／ｍ２、６，５００ＩＵ／ｍ２、７，０００ＩＵ／ｍ２、７，５００ＩＵ／ｍ２、または約８，０００ＩＵ／ｍ２である。黒色腫の処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約８０ｍｇ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、または約８０ｍｇ／ｍ２である。ある種の実施形態では、本開示は黒色腫を処置する方法を提供し、キメラＡＤＩの用量を２倍にして、１週間当たり６４０ＩＵ／ｍ２まで、またはそれを超えて増加させてよい。特定の一実施形態では、黒色腫の処置のためのキメラＡＤＩは、キメラＡＤＩ当たり３．５〜６．５のＰＥＧ分子で、または一実施形態では、キメラＡＤＩ当たり４．５〜５．５のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態では、本開示は、場合によりドセタキセルと組み合わせて、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物により黒色腫を処置する方法を提供し、組成物は、５±１．５のＰＥＧ分子、一実施形態では、５±１．５の直鎖ＰＥＧ分子により修飾されるキメラＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、組成物は、約０．５％未満の天然キメラＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧにより修飾されていない）及び／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む。さらなる実施形態では、組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
一実施形態では、本開示は、治療有効量のキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、場合によりシスプラチンと組み合わせて投与することにより、黒色腫を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態では、黒色腫は、ＡＳＳ、ＡＳＬ、またはその両方を欠損している。さらなる実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、３日に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間に約１回；場合により、治療有効量のシスプラチンと組み合わせて投与することを含む、黒色腫を処置する方法を提供する。この点に関して、治療有効用量のシスプラチンは、１サイクル当たり（３〜４週間ごとに）１回５０〜１００ｍｇ／ｍ２の投与、または５日間毎日投与して１サイクル当たり合計１００ｍｇ／ｍ２となる投与のいずれかを含んでよい。熟練した臨床医によって理解されるように、シスプラチンの用量は、疾患適応症、個々の患者、及び／またはこれまでの処置に応じて修正されてよく、シスプラチンは、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、それと同時に、またはその後に投与されてよい。ある種の実施形態では、黒色腫の処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約５０ＩＵ／ｍ２〜約８，０００ＩＵ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約５０ＩＵ／ｍ２、約１００ＩＵ／ｍ２、１５０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３５０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６５０ＩＵ／ｍ２、７００ＩＵ／ｍ２、７５０ＩＵ／ｍ２、８００ＩＵ／ｍ２、約９００ＩＵ／ｍ２、約１，０００ＩＵ／ｍ２、１，５００ＩＵ／ｍ２、約２，０００ＩＵ／ｍ２、約２，５００ＩＵ／ｍ２、約３，０００ＩＵ／ｍ２、３，５００ＩＵ／ｍ２、４，０００ＩＵ／ｍ２、４，５００ＩＵ／ｍ２、５，０００ＩＵ／ｍ２、５，５００ＩＵ／ｍ２、６，０００ＩＵ／ｍ２、６，５００ＩＵ／ｍ２、７，０００ＩＵ／ｍ２、７，５００ＩＵ／ｍ２、または約８，０００ＩＵ／ｍ２である。ある種の実施形態では、黒色腫の処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約８０ｍｇ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、または約８０ｍｇ／ｍ２である。ある種の実施形態では、本開示は黒色腫を処置する方法を提供し、キメラＡＤＩの用量を２倍にして、１週間当たり６４０ＩＵ／ｍ２まで、またはそれを超えて増加させてよい。特定の一実施形態では、黒色腫の処置のためのキメラＡＤＩは、キメラＡＤＩ当たり３．５〜６．５のＰＥＧ分子で、または一実施形態では、キメラＡＤＩ当たり４．５〜５．５のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物を、場合によりシスプラチンと組み合わせて投与することにより黒色腫を処置する方法を提供し、組成物は、５±１．５のＰＥＧ分子、一実施形態では、５±１．５の直鎖ＰＥＧ分子により修飾されるキメラＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、組成物は、約０．５％未満の天然キメラＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧにより修飾されていない）及び／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む。さらなる実施形態では、組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
一実施形態では、本開示は、治療有効量のキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、場合によりｍＴＯＲ阻害剤、例えばこれらに限定されないが、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、及びリダフォロリムスなどと組み合わせて投与することにより、腎細胞癌を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態では、腎細胞癌は、ＡＳＳ、ＡＳＬ、またはその両方を欠損している。さらなる実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、３日に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間に約１回；場合により、治療有効量のｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンなどと組み合わせて投与することを含む、腎細胞癌を処置する方法を提供する。ラパマイシン、またはその他のｍＴＯＲ阻害剤の用量は、当該技術分野において既知の投与量を使用して、熟練した臨床医によって必要に応じて決定されてよい。当業者によって理解されるように、ｍＴＯＲ阻害剤は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、それと同時に、またはその後に投与されてよい。ある種の実施形態では、腎細胞癌の処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約５０ＩＵ／ｍ２〜約８，０００ＩＵ／ｍ２であり、その他の実施形態では、約５０ＩＵ／ｍ２、約１００ＩＵ／ｍ２、１５０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３５０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６５０ＩＵ／ｍ２、７００ＩＵ／ｍ２、７５０ＩＵ／ｍ２、８００ＩＵ／ｍ２、約９００ＩＵ／ｍ２、約１，０００ＩＵ／ｍ２、１，５００ＩＵ／ｍ２、約２，０００ＩＵ／ｍ２、約２，５００ＩＵ／ｍ２、約３，０００ＩＵ／ｍ２、３，５００ＩＵ／ｍ２、４，０００ＩＵ／ｍ２、４，５００ＩＵ／ｍ２、５，０００ＩＵ／ｍ２、５，５００ＩＵ／ｍ２、６，０００ＩＵ／ｍ２、６，５００ＩＵ／ｍ２、７，０００ＩＵ／ｍ２、７，５００ＩＵ／ｍ２、または約８，０００ＩＵ／ｍ２である。ある種の実施形態では、黒色腫の処置のために投与されるキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、または約８０ｍｇ／ｍ２である。ある種の実施形態では、本開示は腎細胞癌を処置する方法を提供し、キメラＡＤＩの用量を２倍にして、１週間当たり６４０ＩＵ／ｍ２まで、またはそれを超えて増加させてよい。特定の一実施形態では、腎細胞癌の処置のためのキメラＡＤＩは、キメラＡＤＩ当たり３．５〜６．５のＰＥＧ分子で、または一実施形態では、キメラＡＤＩ当たり４．５〜５．５のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態では、本開示は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物を、場合によりラパマイシン、またはその他の適切なｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与することにより腎細胞癌を処置する方法を提供し、組成物は、５±１．５のＰＥＧ分子、一実施形態では、５±１．５の直鎖ＰＥＧ分子により修飾されるキメラＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、組成物は、約０．５％未満の天然キメラＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧにより修飾されていない）及び／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む。さらなる実施形態では、組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
本開示はまた、患者に、本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩ（例えば、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ、特にキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０）を含む組成物を、単独でまたは１種以上のその他の治療剤と組み合わせて投与することを含む、患者の炎症性障害を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法も提供する。一実施形態では、本開示はまた、患者に、本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩ（例えば、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ、特にキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０）を含む組成物を、単独でまたは１種以上のその他の治療剤と組み合わせて投与することを含む、患者の炎症性腸疾患を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法も提供する。この点に関して、本開示は、患者に、本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩ（例えば、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ、特にキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０）を含む組成物を、単独でまたは１種以上のその他の治療剤と組み合わせて投与することを含む、患者のクローン病または潰瘍性大腸炎を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、患者に、本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩを含む組成物、及び場合により１種以上のその他の治療剤を投与することを含む、患者の癌を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供し、癌はＡＳＳ、ＡＳＬ、またはその両方を欠損している。この点に関して、ＡＳＳまたはＡＳＬの欠損は、ｍＲＮＡ発現もしくはタンパク質発現により測定されるような発現の減少である場合があり、またはタンパク質活性の減少である場合もあり、一般に、当業者によって決定されるような発現または活性の統計的に有意な減少を含む。減少したＡＳＳまたはＡＳＬの発現または活性は、癌を含まないと分かっている適切な対照サンプルにおける発現または活性と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、またはそれを超える発現または活性の減少であってよい。ある種の実施形態では、ＡＳＳまたはＡＳＬの発現または活性は、非癌対照サンプルにおける発現または活性と比較して少なくとも２倍減少する。
ある種の実施形態では、ＡＳＳまたはＡＳＬの減少した発現または活性は、ＡＳＳまたはＡＳＬプロモーターのメチル化に起因する。別の実施形態では、ＡＳＳまたはＡＳＬの発現または活性の減少は、ＤＮＡ突然変異（例えば、１つ以上の点突然変異、小さな欠失、挿入など）または遺伝子の欠失をもたらす染色体異常に起因する。一実施形態では、癌は、ＡＳＳまたはＡＳＬ陰性であり、これは観察される発現または活性がないことを意味する。
ＡＳＳまたはＡＳＬの発現または活性の減少は、当該技術分野において既知の任意の方法、例えばこれらに限定されないが、定量ＰＣＲ、免疫組織化学、酵素活性アッセイ（例えば、シトルリンからアルギニノコハク酸塩への変換またはアルギニノコハク酸塩からアルギニン及びフマル酸塩への変換を測定するアッセイ）などを使用して測定されてよい。
したがって、本発明は、患者に、本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩを含む組成物を投与することを含む、患者の癌を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法を提供し、癌は、ＡＳＳもしくはＡＳＬ、またはその両方の減少した発現または活性を示し、癌としては、白血病（例えば、急性骨髄性白血病及び再発性急性骨髄性白血病）、黒色腫、肉腫（転移性肉腫、子宮平滑筋肉腫を含むが、これらに限定されない）、膵臓癌、前立腺癌（ホルモン不応性前立腺癌などであるが、これに限定されない）、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃の癌（胃腺癌を含むが、これに限定されない）、神経膠腫、多形性膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌（腎細胞癌を含むが、これに限定されない）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌（頭頸部の扁平上皮癌；舌の癌を含むが、これらに限定されない）、子宮頸癌、精巣癌、胆嚢、胆管癌、及び胃癌が挙げられるが、これらに限定されない。
文献の様々な研究では、以下の腫瘍でＡＳＳが欠損していることを示している：
したがって、これらのＡＳＳ欠損癌の処置は、キメラＡＤＩ−ＰＥＧを単独でまたはその他の処置と組み合わせて用いることが、本明細書では特に意図される。
本発明は、患者に、本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩ（例えば、キメラＡＤＩ−ＰＥＧ、特にキメラＡＤＩ−ＰＥＧ２０）を含む組成物を、オートファジー阻害剤と組み合わせて投与することを含む、患者の癌を処置する、その症状を改善させる、またはその進行を阻害する方法をさらに提供する。一実施形態では、本発明は、患者に、治療有効量の本明細書に記載されるようなキメラＡＤＩを含む組成物を、オートファジー阻害剤と組み合わせて投与することを含む、患者の癌を処置する方法を提供し、癌は膵臓癌または小細胞肺癌である。
ある種の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるキメラＡＤＩを含む組成物の投与が、血漿中のアルギニンを少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間またはそれを超えて枯渇させる処置方法を提供する。
実施例１
キメラＡＤＩ酵素は、活性でありながら、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との交差反応性が低い
本実施例は、（１）アルギニンデイミナーゼ酵素活性を有するタンパク質、（２）抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との減少した交差反応性、（３）減少したリジン残基数、及び／または（４）化学的に安定したリンカーによるＰＥＧ結合から構成される、人為的に操作されたキメラＡＤＩ酵素の生成について記載する。
ＡＤＩの調製。組換えキメラＡＤＩ酵素を、例えば、Ｇａｌｌｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，７（１０）：ｅ４７８８６，２０１２；Ｍｏｎｓｔａｄｔ ａｎｄ Ｈｏｌｌｄｏｒｆ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７３：７３９−７４５，１９９０；Ｊｏｏ Ｎｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ．１３：１３７−１４３，２００２；及びＳｕｇｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．５８：２５１０−２５１５，１９９０に記載されているような標準的なプロトコールにより、試験のためにクローニング、発現、及び精製した。キメラＡＤＩ酵素のアミノ酸配列については、表Ａ１を参照のこと。
ヒト抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の精製。抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体を、臨床研究中にＡＤＩ−ＰＥＧ２０を受けた患者の血漿サンプルから精製した。合計６０ｍｌの血漿を、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した場合、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０に対する力価がより高くなった（力価＞／＝４）８人の異なる患者からプールした。２段階精製、すなわちプロテイン「Ａ」クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＡＤＩアフィニティークロマトグラフィーを使用した。約２０ｍｇの精製抗体を得て、必要になるまでアリコートにして−８０℃で保存した。
ＡＤＩ酵素アッセイ。アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）は、Ｌ−アルギニンからＬ−シトルリン及びアンモニアへの変換を触媒する。タンパク質のＩＵ／ｍｇとして表されるＡＤＩの比活性を計算するために、Ｌ−シトルリンの量を比色終点アッセイ（例えば、Ｋｎｉｐｐ ａｎｄ Ｖａｓａｋ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８６：２５７−２６４，２０００を参照のこと）によって検出し、Ｌ−シトルリンの既知量の検量線と比較することができる。１ＩＵの酵素活性は、試験されるｐＨ及び温度で、１分当たり１μｍｏｌのシトルリンを産生する酵素の量と定義される。標準的アッセイ条件を、生理的ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＨＢ）、すなわちｐＨ７．４の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１６０ｍＭのＮａＣｌ（Ｌａｎｇ ａｎｄ Ｚａｎｄｅｒ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ．３７：５６３−５７１，１９９９）、加えて０．１％のＢＳＡ中において３７℃で実施した。すべてのサンプル及び基準を、条件が許す場合には２回または３回反復して実施した。
Ｋｍ値及びＫｃａｔ値を、上記活性アッセイの変化量を使用することにより決定した。活性アッセイと同様に、すべての反応をＰＨＢ、加えて０．１％ＢＳＡ中において３７℃で実施した。酵素濃度、反応時間、及び基質濃度範囲を、ＡＤＩまたはＡＤＩｒ構築物の各々について調整し、それらの活性の差を明らかにした。一般に、２ｎＭの酵素、５分間の反応時間、及び０〜１６０μＭのアルギニンを出発条件として使用した。条件を最適化する場合、反応に添加する総基質のパーセンテージとして、消費される基質の量に対し特に注意を払った。検出の下限値は１μＭのシトルリンであり、定量の下限値は２μＭである。シトルリン検量線を、すべてのプレート上で実施し、これを使用して酵素反応により産生されたシトルリンを定量化した。
計算。各反応ウェルで産生されたシトルリンの濃度（μＭ）を、シトルリン検量線を使用して計算及び平均化した。次いで、各反応速度を、μＭ／分／５０ｎＭのＡＤＩで計算した。比活性（ＩＵ／ｍｇまたはμｍｏｌ生成物／分／ｍｇのＡＤＩ）を、この値に「ＩＵ」因数を掛けて計算した（ＩＵ因数は、ＡＤＩの分子量及び反応体積から計算した）。
アルギニンデイミナーゼ酵素活性。ＡＤＩ酵素アッセイの結果を、表Ｅ１に示す。
表Ｅ１の結果は、本明細書に記載される操作されたキメラＡＤＩ酵素が、効率的な触媒活性を有することを示す。これらの酵素の触媒パラメータであるＫｍ及びｋｃａｔは、アルギニンを除去し、血中のアルギニン濃度を低く維持するのに十分である。これらのパラメータは、好ましくはそれぞれ２０μＭ未満及び１秒−１超である。最適ｐＨは、血中で効率的な触媒活性を維持するように、およそ７．４である。酵素安定性、加えて共有結合したＰＥＧの安定性は、長期間の保存及び患者の処置中に３７℃で維持されなければならない。
抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との減少した交差反応性。ＡＤＩは、２つのドメイン、すなわち触媒ドメイン及びαヘリックスドメインから構成される。本発明は、ＡＤＩ活性を有する、操作された酵素、人工酵素、キメラ酵素、組換え酵素を部分的に対象とする。各々、２つのドメインから構成され、各ドメインは多数の可能な種から選択される。ドメイン境界は、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ及びＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉからのＡＤＩのＸ線結晶構造検査により決定し、これをその他のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ＡＤＩ酵素に相同性により伸長させる。
ＡＤＩ酵素の異なる種からのドメインの使用は、多数の表面残基を変化させても、触媒活性を維持し得る。これらの表面残基のいくつかは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０による患者の処置中に発現する抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体に対するエピトープを形成する。それらの置換は、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体に対する抗原性を減少させ、それゆえ抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の中和及び修飾薬物のクリアランスを減少させることができる。これを表Ｅ２に示し、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の２つの調製物が、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓのＡＤＩと比較して、ＤＳ１、ＤＳ２、ＤＳ３、及びＤＳ４抗原との結合性がより低いことを示した。このことは、これらの抗原の表面上における残基変化に起因し得、これによりエピトープを変更して、抗体−抗原結合相互作用を妨害する。
表面リジン残基含有数の減少。Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ（触媒ドメイン）−Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ（αヘリックスドメイン）キメラを、表面リジン残基をリジン以外のアミノ酸残基で置換し、ＡＤＩ活性をモニターすることによりさらに修飾した。４つの変異体を作製し（表Ｅ３）、それらのＡＤＩ活性を決定した。
表Ｅ４は、ＤＳ１（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ−Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）酵素及び４つのリジン置換変異体のＡＤＩ活性を示す。リジンを減少させて、可能なＰＥＧ化部位数を減少させた。
およそ３０の可能なＰＥＧ化部位により、ＰＥＧ占有率は、各部位で一般に小さい。可能なＰＥＧ化部位数の減少は、より高いＰＥＧ占有率、及び残存する各部位でより完全な遮蔽をもたらすだろう。このことは、タンパク質分解保護を増加させ、これまでの処置により親和性成熟した抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体に対する免疫交差反応性を減少させると予想する。このことはまた、より均一な薬物を作製するだろう。
要約すると、本実施例は、操作されたＡＤＩ酵素について記載し、この酵素は優れたＡＤＩ活性を有し、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体のエピトープを除去して、抗体の中和及びクリアランスを減少させ、ＰＥＧ化によりタンパク質分解及び腎クリアランスから保護される。
上記の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で言及される、及び／または出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許公報はすべて、それらの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。様々な特許、出願及び公開公報の構想を用いる必要があれば、実施形態の態様を修正して、なおさらなる実施形態を提供することができる。
これらの及びその他の変化を、上記の詳細説明に鑑みて、実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、このような特許請求の範囲が権利を有する等価物のすべての範囲と共に、すべての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により制限されることはない。

Claims (54)

  1. 第１微生物に由来するＡＤＩタンパク質の触媒ドメイン及び第２微生物に由来するＡＤＩタンパク質のαヘリックスドメインを含む、組換えキメラアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）。
  2. 前記第１微生物が、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＧｉａｒｄｉａ属から選択される、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  3. 前記第１微生物が、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓから成る群から選択される、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  4. 前記第１微生物が、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｔｅａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｈｏｃｉｄａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｏｗａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍから成る群から選択される、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  5. 前記第２微生物が、場合により前記第１微生物とは異なり、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＧｉａｒｄｉａ属から選択される、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  6. 前記第２微生物が、場合により前記第１微生物とは異なり、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓから成る群から選択される、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  7. 前記第２微生物が、場合により前記第１微生物とは異なり、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｔｅａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｈｏｃｉｄａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｏｗａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍから成る群から選択される、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  8. 前記第１微生物が、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｎｅｒｓ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍから成る群から選択され、前記第２微生物が、場合により前記第１微生物とは異なり、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｎｅｒｓ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍから成る群から選択される、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  9. 前記第１微生物がＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉであり、前記第２微生物がＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  10. 前記第１微生物がＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉであり、前記第２微生物がＭ．ｈｏｍｉｎｉｓである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  11. 前記第１微生物がＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓであり、前記第２微生物がＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  12. 前記第１微生物がＭ．ｇａｔｅａｅであり、前記第２微生物がＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  13. 前記第１微生物がＭ．ｇａｔｅａｅであり、前記第２微生物がＭ．ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  14. 前記第１微生物がＭ．ｇａｔｅａｅであり、前記第２微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  15. 前記第１微生物がＭ．ｇａｔｅａｅであり、前記第２微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  16. 前記第１微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅであり、前記第２微生物がＭ．ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  17. 前記第１微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅであり、前記第２微生物がＭ．ｇａｔｅａｅである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  18. 前記第１微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅであり、前記第２微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  19. 前記第１微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅであり、前記第２微生物がＭ．ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  20. 前記第１微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅであり、前記第２微生物がＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  21. 前記第１微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅであり、前記第２微生物がＭ．ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  22. 前記第１微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅであり、前記第２微生物がＭ．ｇａｔｅａｅである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  23. 前記第１微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｄａｅであり、前記第２微生物がＭ．ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  24. 前記第１微生物がＭ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍであり、前記第２微生物がＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  25. 前記第１微生物がＭ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍであり、前記第２微生物がＭ．ｉｎｅｒｓである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  26. 前記第１微生物がＭ．ｉｎｅｒｓであり、前記第２微生物がＭ．ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  27. 前記第１微生物がＭ．ｉｎｅｒｓであり、前記第２微生物がＭ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍである、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  28. 前記組換えキメラＡＤＩが、配列番号：４〜１３もしくは２２〜５９のいずれか１つに示すアミノ酸配列、または配列番号：４〜１３もしくは２２〜５９のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含む、請求項１に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  29. 前記組換えキメラＡＤＩが、少なくとも１つのＰＥＧ化部位を除去するように修飾されている、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  30. 少なくとも１つのリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  31. 少なくとも５つのリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  32. 少なくとも１０のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  33. 少なくとも１５のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  34. 少なくとも２０のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  35. 前記組換えキメラＡＤＩが、配列番号：１０〜１３のいずれか１つに示す前記アミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  36. 生体適合性リンカーによりポリエチレングリコールに共有結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  37. 前記アルギニンデイミナーゼが、２つ以上のポリエチレングリコール分子に共有結合する、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  38. 前記アルギニンデイミナーゼが、約１〜約１０のポリエチレングリコール分子に共有結合する、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  39. 前記アルギニンデイミナーゼが、５±３のＰＥＧ分子に共有結合する、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  40. 前記ＰＥＧ分子が、直鎖または分岐鎖ＰＥＧ分子である、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  41. 前記ポリエチレングリコールが、約１，０００〜約４０，０００の総重量平均分子量を有する、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  42. 前記ポリエチレングリコールが、約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  43. 前記生体適合性リンカーが、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  44. 前記スクシニル基の供給源が、スクシンイミジルスクシネートである、請求項３０に記載の組換えキメラＡＤＩ。
  45. 先行請求項のいずれか１項に記載の前記組換えキメラＡＤＩをコードするポリヌクレオチド。
  46. 請求項４５に記載の前記ポリヌクレオチドを含むベクター。
  47. 請求項４６に記載の前記ベクターを含む単離宿主細胞。
  48. 先行請求項のいずれか１項に記載の前記組換えキメラＡＤＩ及び生理学的に許容される担体を含む組成物。
  49. オートファジー調節剤をさらに含む、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記オートファジー調節剤が、クロロキン、３−メチルアデニン、ヒドロキシクロロキン、バフィロマイシンＡ１、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、オカダ酸、Ｎ６−メルカプトプリンリボシド、ビンブラスチン、ワートマニン、ラパマイシン、エベロリムス、メトホルミン、ペリホシン、レスベラトロール、及びタモキシフェンから成る群から選択される、請求項４９に記載の組成物。
  51. 化学療法剤をさらに含む、請求項４８に記載の組成物。
  52. 前記化学療法剤が、ドセタキセル、カルボプラチン、シクロホスファミド、ゲムシタビン、シスプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ及びエベロリムスから成る群から選択される、請求項５１に記載の組成物。
  53. 癌の処置方法、その症状の改善方法、またはその進行の阻害方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の請求項４８に記載の前記組成物を投与し、それによって前記癌を処置する、その前記症状を改善させる、またはその前記進行を阻害することを含む、前記方法。
  54. 前記癌が、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞癌、肉腫、白血病、急性骨髄性白血病、再発性急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃の癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、及び胃癌から成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
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