JP2017512496A - 動的多臓器プレート - Google Patents

Abstract

細胞または組織を培養増殖するように構成された２つ以上のウェルと、該２つ以上のウェルと流体連通する少なくとも１つのトランスウェルチューブと、該少なくとも１つのトランスウェルチューブと流体連通するポンプとを備える動的多臓器プレートが本明細書に開示される。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月２１日に出願された米国特許出願第１４／２２２，５８１号の利益を主張し、すべての表、図面、および特許請求の範囲を含むその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、導電性生物学的分析検査の分野の発明であり、より詳細には多臓器検査の分野の発明である。

化学工業、化粧品工業、および製薬工業では、動物実験を使用することなく人体における化学物質の悪影響の可能性を理解し予測する必要性が高まっている。特に細胞培養を使用して反復投与の全身毒性または有効性を予想することは、動物モデルまたは人体モデルにおけるこれらの効果を研究するのとは対照的に必要性が非常に大きい。これまで特定の臓器を擬態した単一の細胞モデルの使用が試みられてきた。医用生体工学は臓器をマイクロチップ上に組み込む発想の検討および開発を開始し、主に各組織の微環境および三次元成分に焦点を合わせてきた。これらの技術は組織と血液の質量対体積比に対処せず、またこれらの技術は化学的効果の生物学的分析評価ができるプラットフォームも提供しない。加えてこれらの初期の試みは、区画培地を完全に交換することなく、組織区画間の流体連通を可能にするメソスケールに流体動的システムを組み込んでこなかった。したがって科学者が、自身の実験室における既存の技術と、多くのヒトの臓器において化学的安全性の評価を同時にできる、新規の細胞培養プレートを組み合わせることができるツールが真に求められている。

細胞または組織を培養増殖するように構成された２つ以上のウェルと、該２つ以上のウェルと流体連通する少なくとも１つのトランスウェルチューブと、該少なくとも１つのトランスウェルチューブと流体連通するポンプとを備える動的多臓器プレートが本明細書に開示される。

開示された動的多臓器プレート（ＤＭＯＰ）の一実施形態の６つのウェルの配置を示す平面図である。 プレートのフットプリントを実証する、開示されたＤＭＯＰの一実施形態の側面図である。 臓器の位置付けおよび模擬血流を示す、開示されたＤＭＯＰの一実施形態の平面図である。 多壁ウェルの一実施形態を示す平面図である。 多壁ウェルの一実施形態を示す側面図である。 吸入チャンバを備えた肺ウェルを示す図である。

多組織（臓器）型とメソスケール流体システムを組み合わせた動的多臓器プレート（ＤＭＯＰ）が本明細書に開示されている。大規模な構成の開示されたＤＭＯＰは、研究者が人工の半透性血管系の表面積を調節することにより、組織の質量を血液量に合わせることを可能にする。これらのプレートは、ウェル間で容量を交換することなく検体搬送ができる流体システムによって連結された、単一のプレート内で細胞または組織培養によって表れた多臓器への薬物効果または化学的効果の研究のために提供される。ある特定の実施形態では、臓器の模擬は、肺組織の上に蒸気発生器を提供し、ヒトまたは動物の心筋細胞の拍動を観察するためにマイクロ電極アレイを提供することによって改善された。

一部の態様では、本開示されたＤＭＯＰは多数のウェルを備える。各ウェルは単一の臓器に由来する細胞または組織を備える。ＤＭＯＰのウェルは互いに並列もしくは直列に、またはこの２つを組み合わせて流体連通される。流体、例えば血液もしくは血液シミュレータ、または栄養もしくは生体物質を運ぶことができるあらゆる他の流体はＤＭＯＰの中に流入し、次いで１つのウェルから別のウェルに流れる。各ウェル内の培地は他のウェルの培地から分離されている。ある特定の実施形態では、生体物質および試験物質ならびにそれらの代謝産物のみがウェル間を移動することができる。

現在利用可能な技術は、化学的効果の生物学的分析評価ができるプラットフォームを提供しない。これは、試験薬物または化学物質に曝されると細胞によって放たれるか、または生成される生体物質が、検出できるほどに充分な高濃度で生成されないからである。さらに異なる組織（例えば肝臓または心臓）由来の細胞は、最適な増殖のために異なる成分をもつ培地の増殖を必要とするので、ウェル間の培地の自由な交換は細胞の増殖を大きく妨害する可能性がある。この問題に対処するために、開示されたＤＭＯＰの一部の実施形態では、血流を模擬する流体が透析膜の隙間を有するチュービングを通ってポンプ供給される。透析膜により対象の検体のみが模擬血液に流入出でき、それによってヒトの血流に似た方法ですべての模擬臓器を曝露する。模擬血流が特定の臓器に達する順番はヒトの血液循環に擬態するので、開示されたＤＭＯＰの一部の実施形態は、ウェルの配置がこの化学交換を促進するプレート設計を有する。

一部の実施形態では、開示されたＤＭＯＰの使用者は薬物動態のモデル化法を組み合わせることができ、それによって代謝、肝クリアランス、代謝的安定性、タンパク結合、血漿に対する時間の濃度曲線、半減期、Ｃ_ｍａｘ、濃度曲線の下の面積などの動態パラメータ、および特定の輸送体に対するＩＣ_５０値さえも決定できる。その結果は、概算の体系的臓器効果に使用できる集積された生物学系である。

一部の実施形態では、ウェル内の組織培養は二次元に増殖する一方で、他の実施形態では、組織培養は三次元に増殖する。ウェル間の培地の分離により、培養される細胞または組織の型に依存し、また増殖が二次元培養であるか三次元培養であるかに依存して、異なる栄養補助食品および培地を各ウェルに供給することができる。

一部の実施形態では、開示されたＤＭＯＰのウェルはトランスウェルチューブ、すなわち１つのウェルを別のウェルに連結するチューブを使用して互いに連結される。一部の実施形態では、単一のトランスウェルチューブは２つのウェルに連結する。別の実施形態では、トランスウェルチューブはウェルの中に流体を運び入れる一方で、別のトランスウェルチューブは流体をそのウェルから運び出す。この組合せは有機体内の動脈／静脈系を擬態する。

一部の実施形態では、トランスウェルチューブはＤＭＯＰの中に予め組み立てられる。他の実施形態では、使用者は使用者の所望に応じてウェルを配置し、次いでウェルを連結するために所望の方法でトランスウェルチューブを挿入できる。

一部の実施形態では、細胞はウェル内のトランスウェル膜上に増殖され、それにより細胞が頂部（上部）および基底外側部（下部）チャンバを有効に形成できる。模擬血流は、血液が移動するのと同じように増殖培地内のトランスウェルの下で移動する。流入および流出輸送体（例えばＯＡＴＰ１Ｂ１およびＢＳＥＰ）を含む細胞は、細胞の基底外側部または頂側部に向く（両極化）。各ウェル内のチュービングおよび透析膜は、トランスウェルチューブの壁を横切る流体または栄養の一方向の流れを提供する。したがって血流を模擬するチューブはトランスウェルチューブの基底外側部の下にある。

一部の実施形態では、透析膜はウェル内のチュービングおよびトランスウェルチューブの入口側部と出口側部を分離させる。この透析膜はウェル間の有効な連通を提供する。薬物、薬物代謝などの活性成分、またはブドウ糖、サイトカイン、増殖因子などの生物学的成分などを浸透圧的に運ぶ流体は、チュービングからウェルの中へまたは細胞からチュービングの中への受動拡散により濃度勾配を下方に移動させることができる。容量の純変化はないので、細胞培養ウェルはそれらの個々の特性における一意性を留める。模擬血管系は、透析膜を通してウェル内には存在しない低分子量成分を交換するだけである。一部の実施形態では、成分は試験化学物質、それらの代謝産物、細胞／組織産物、および低分子タンパク質さえも含む。

ウェル内の組織は、流体が有機体の内側と同じ順で組織を通過するように位置付けられることが可能である。例えば流体は肝臓組織／細胞を有するウェルに達する前に、胃腸組織／細胞を有するウェルを通過でき、次いで肺組織／細胞を有するウェルに進む。この意味では、ＤＭＯＰは、互いに流体連通する多組織型を有する多臓器有機体を模擬する。細胞の健康のマーカーは、チューブシステムを通り抜け、または直接ウェルから潅流液内に収集されることが可能である。次いでＤＭＯＰにより、動物実験を実行する必要なしに、多臓器系における成分または生物学的活性物質の試験が可能になる。

本明細書では、用語「プレート」は「動的多臓器プレート」とまた「ＤＭＯＰ」と交換可能に使用される。

一部の実施形態では、ＤＭＯＰは細胞培養と適応性がある材料、例えばプラスチックから構築される。「細胞培養と適応性がある」ことによって、プレートの組成が組織の機能またはあらゆる試験化合物の機能悪影響を及ぼさないことを意味する。換言すれば、細胞培養と適応性のある物質は生物学的な不活性物質であると考えられる。

一部の実施形態では、プレートは、直径が少なくとも０．５インチである大きいウェルを備える。ある特定の実施形態では、ウェルは１インチの直径を有し、他の実施形態では、直径は１インチより大きく、例えば１．２５インチ、１．５インチ、１．７５インチ、２インチ、２．２５インチ、２．５インチ、２．７５インチ、３インチなどである。

一部の実施形態では、プレートは少なくとも２つのウェルを備える。ある特定の実施形態では、プレートは４個、６個、８個、または１０個のウェルを備える。一部の実施形態では、プレートは１１個以上のウェルを備える。他の実施形態では、プレートは奇数のウェル、例えば３個、５個、７個、９個などのウェルを備える。

一部の実施形態では、ウェルは挿入されたチュービングおよび透析膜によって連結される。他の実施形態では、ウェルはウェルの壁内のチャネルによって接合される。一部の実施形態では、チャネルは開口チャネル、すなわちその上部が外側に開き、概ね半管形状を形成するチャネルである。他の実施形態では、チャネルは閉鎖チャネル、すなわち２つの隣接したウェルを連結するウェルの壁内に形成されたチューブである。

図１ＡはＤＭＯＰ１００の一実施形態を示す。ＤＭＯＰ１００は様々な構成要素を含む本体１０２を備える。この実施形態では、ＤＭＯＰ１００は６つのウェル１０４を備える。ウェル１０４は、実験の必要性に最良に適応するあらゆる順で配置されることが可能である。例えば一部の実施形態では、ウェル１０４は、流体の直列連結を促進するために一列に配置される。他の実施形態、例えば図１に示された実施形態では、ウェル１０４は、すべてのプレート間で同時に流体連結を促進できる六角形の形式で配置されている。明確に定義された幾何学的図形を擬態する他の配置、または無作為の配置も企図される。一部の実施形態では、メソスケールの形態は標準の細胞培養のフットプリントを有し、これによりプレートを現在市販されているプレートリーダーによって分析できる、または標準のロボットプラットフォームにおいて操作できる。図１Ｂは、ＤＭＯＰ１００の一実施形態の側面図およびそのフットプリントを示す。示された実施形態では、ＤＭＯＰ本体１０２は２つの部分を有する。下部１０６はウェル１０４を含む。したがってこの実施形態では、下部１０６の高さはウェル１０４の高さと等しい。上部１０８は、装置の中に漏出する、または装置から漏出するのを防ぐために追加の閉じ込めを提供する。図１Ｂは、以下に充分に説明されているように入口管２０４およびポンプ２０２の場所を示す。

一部の実施形態では、プレートはそのウェル内の有機体から組織を収納するように構成される。ある特定の実施形態では、ウェルに使用される様々な組織はすべて同じ種に由来する。他の実施形態では、異なる種に由来する組織は異なるウェルにおいて使用される。ある特定の実施形態では、有機体は動物である。これらの実施形態の一部では、動物は脊椎動物である。ある特定の実施形態では、有機体は哺乳類である。一部の実施形態では、哺乳類はマウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、サル、チンパンジーおよび類人猿およびヒトなどの霊長類からなる群から選択される。ゼブラフィッシュなどの魚細胞または魚全体もこれらのウェルに使用されてもよい。

一部の実施形態では、組織は幹細胞から抽出された細胞を備える。他の実施形態では、組織は成熟細胞株を備える。一部の実施形態では、細胞、例えば最初のまたは冷凍保存されたサンドイッチ培養における幹細胞は、各ウェル内で増殖される。他の実施形態では、組織は他の場所で増殖され、次いで分析のためにＤＭＯＰのウェルの中に移送される。さらに他の実施形態では、組織は他の場所においてウェル内で増殖され、次いでウェルは分析のためにプレートの中に挿入される。

システムはより大きい質量の細胞を増殖することができるので、細胞への化学的効果または薬物効果を決定するために使用できる、標準の生化学的終点および分子の終点を測定することが可能である。一部の実施形態では、プレートはヒト組織の位置付けおよび血流を擬態する方法で編成される。

図２は、その中でウェル１０４が互いに流体連通するＤＭＯＰ１００の一実施形態を示す。すべての内部構成要素、すなわちウェル１０４および管２０８（下記参照）は、プレート本体１０２内に含まれる。この実施形態では、本体１０２の外側に配置され、入口管２０４を通って流体、例えば水、生理食塩水、血液または模擬血液をシステムの中にポンプ供給するぜん動ポンプ２０２が提供される。この実施形態では、流体は心臓組織を有する第１のウェル２０６に入る。このウェル２０６から、流体は、血液脳関門を擬態するために管２０８を通ってトランスウェル・プラットフォーム上に増殖された脳組織を有するウェル２１０に移動する。人体内では血液は心臓から脳に移動し、次いで脳から心臓に戻るので、示されたＤＭＯＰではトランスウェル管２０８は流体を脳ウェル２１０から心臓ウェル２０６に戻す。またこれは肺組織を有するウェル２１２にも当てはまる。心臓ウェル２０６から肺ウェル２１２に流れる流体は双方向である、すなわち流体は心臓ウェル２０６から肺ウェル２１２に移動し、次いで心臓ウェル２０６に戻る。さらに人体内では肺および脳への血流は互いに独立している。同様に示されたＤＭＯＰでは、肺ウェル２１２および脳ウェル２１０への流体流れは独立した管２０８によって実行される。

しかしある特定の臓器を備えた状態、例えば胃腸（ＧＩ）組織および肝臓組織は異なる。人体において、血液は心臓からＧＩ系に流れ、最初の通過中にＧＩ系から肝臓に行き、肝臓から心臓に戻る。同様に示されたＤＭＯＰでは、流体は心臓ウェル２０６からＧＩウェル２１４に一方向に流れ、次いで肝臓ウェル２１６に流れ、次いで心臓ウェル２０６に戻る。したがって心臓ウェル２０６とＧＩウェル２１４と肝臓ウェル２１６との間のトランスウェル管２０８により、極性をもつ組織（すなわち一方向の流体流れの下で機能する組織、例えばＧＩ路細胞、肺細胞、および腎臓細胞）を輸送体の機能を評価できる方法で培養できる。

図２の実施形態は、１つのウェルから別のウェルに双方向および一方向の両方に流れる流体を示す。一部の実施形態では、すべてのウェルは双方向流れの下にある一方で、他の実施形態では、すべてのウェルは一方向流れの下にある。一部の実施形態では、操作者が導入できるトランスウェル管２０８が挿入される。したがってこれらの実施形態では、ＤＭＯＰは、操作者がプレート上のウェルの数および／または場所を選択し、次いでトランスウェル管の挿入部を位置付けることにより１つのウェルから別のウェルへの流体流れを決定するモジュラーである。

流体はウェルの１つを通ってプレート本体１０２から出る。示された実施形態では、流体は出口管２１８を通って肝臓ウェル２１６から出る。出口管２１８はぜん動ポンプまたはマイクロシリンジポンプ２０２と再連結する。一部の実施形態では、ウェルポート２２０が提供される。開示されたＤＭＯＰの一部の実施形態は、２つ以上のウェルポート２２０を備える。例えば図２に示された実施形態は２つのウェルポート２２０を備える。示された実施形態では、ウェルポート２２０は出口管２１８上にあるが、ウェルポート２２０は到達に便利なシステム上のいずれの場所にも置くことができることが当業者には認識される。例えばウェルポート２２０は入口管２０４上か、またはトランスウェル管２０８の１つの上に置くことができる。ウェルポート２２０の開放端は、外因性物質をシステムの中に導入できるように構成される。一部の実施形態では、ウェルポート２２０の開放端はゴム栓もしくは隔壁または類似の材料を備える。次いでシリンジを使用して外因性物質をシステムの流体の中に注入することができる。一部の実施形態では、ホースまたは管をウェルポート２２０に連結することができ、ホース／管は他端において、代謝を増加させるためにバイオリアクターユニットなどの外因性物質を備える貯蔵容器に連結される。一部の実施形態では、ポンプを使用して外因性物質をシステムの中に導入する。

一部の実施形態では、入力／出力線２２２はウェルポート２２０の中に挿入される。ある特定のこれらの実施形態では、入力／出力線２２２は、流れが入口ホース２２６を通ってシステムの中に入るか、または出口ホース２２８を通ってシステムから出るように制御する接合部２２４を備える。一部の実施形態では、接合部２２４は三方弁である。他の実施形態では、接合部２２４は入口ホース２２６および出口ホース２２８がその中に挿入されるゴム隔壁に過ぎない。このシステムにより、入口ホース２２６を通って外因性物質をシステムの中に導入することができ、出口ホース２２８を通って一定量の内液を取り出すことができる。

一部の実施形態では、外因性物質は薬物、タンパク質、または研究中の他の化学物質である。

一部の実施形態では、システムは、心拍への外因性化学物質または薬物の効果を観察するためにマイクロアレイ電極技術を組み込む。これらの実施形態では、マイクロアレイ２３０は心臓ウェル２０６内に置かれる。これらの電極は心臓ウェル２０６内の心臓組織の心電図を測定する。一部の実施形態では、模擬血流／流体流れを可能とするために挿入されたＭＥＡ内に穴が存在する。これらの実施形態の一部では、システムが開始され、心臓組織の拍が測定される。次いで外因性物質がウェルポート２１８を通って導入される。次いで心臓組織の拍が再度測定され、外因性物質の効果が決定される。

一部の実施形態では、システム内の一定量の流体が、化学分析、例えばガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、液体クロマトグラフィ／質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）などのためにウェルポート２１８を通って抽出される。分析は、例えば代謝物生成、組織損傷、組織への拡散率、ならびに他の薬理学的パラメータおよび生化学的パラメータの即時の測定結果を提供できる。

図３Ａはウェル１０４の一実施形態の拡大平面図を示す。ウェル１０４は外殻３０２（外側の斜線空間）、および挿入部３０４（内側の斜線空間）、および流体空間３０６（点線空間）を備える。一部の実施形態では、外殻３０２は中実片であり、ウェル１０４の形状を画定する。挿入部３０４は、ウェル１０４の流体空間３０６と内部３０８との間に化学物質、気体、および流体の拡散を可能にする半透壁を備える。流体空間３０６はトランスウェル管２０８（例えば培養ウェルの中に拡散できる入口チューブと出口チューブとの間の透析膜）と流体連通する。半透障壁３０４を通る拡散は、人体内の組織の毛細血管と細胞との間の気体および化学物質の拡散を模している。

図３Ｂは開示されたＤＭＯＰの一実施形態内のウェル１０４の側面図を示す。流体空間３０６内の挿入部３０４の下および周囲の流体流れが明確に示されている。一部の実施形態では、システム内の流体量は模擬血液量および表面積を操作するために増加される。これらの実施形態の一部では、流体空間３０６はより多くの流体がシステム内に導入されるにつれて大きくなる一方で、挿入部３０４は縮小する。したがってシステム内の流体量を増加させることにより、組織と流体との間の接触表面積が小さくなり、逆も同様である。このことは実際の生理的条件と酷似している。入口チュービングと出口チュービングとの間のウェル内の透析面積を変えることにより、流体と質量の比を変え、異なる程度の血液潅流の臓器を模擬することができる。

一部の実施形態では、より正確な肺チャンバを開発するために、再構成されたヒトの肺組織（Ｅｐｉｔｈｅｌｉｘ（スイス、ジュネーブ）によって開発されたものなど）を使用してヒトの肺を擬態することができる。この組織は空気と液の界面で増殖され、この界面は蒸気およびエアロゾルの肺への曝露に続いて血液への移動を可能にする。一部の実施形態では、肺ウェルは吸入チャンバを擬態する中空チャンバを装着される。吸入チャンバの使用により、操作者が吸入曝露および毒性モデルを開発できる。

図４は、肺ウェル２１２の上に装着されたチャンバ４００の一実施形態を示す。チャンバ４００は本体４０２を備える。一部の実施形態では、操作者が流体および他の物質をチャンバの中に導入できる開口４０４が提供される。一部の実施形態では、開口４０４はゴム栓または隔壁などによって封止される。

一部の実施形態では、チャンバ４００はＪ型管などの蒸気発生器に接合される。蒸気発生器（図示せず）は入口ポート４０６によりチャンバに連結される。気体は出口ポート４０８を通ってチャンバ４００から出る。一部の実施形態では、チャンバ４００は２つの個別の片を備える。下部片４１０は肺ウェル２１２の上に装着されるように構成される一方で、上部片４１２は入口ポート４０６および出口ポート４０８を備える。一部の実施形態では、Ｏリング封止４１４は２片の間に気密封止を提供する。線４１６およびすべての図内の対応する線は、適用できる場合にシステム内の液体線を示す。

Claims (20)

1. 細胞または組織を培養増殖するように構成された２つ以上のウェルと、
   前記２つ以上のウェルと流体連通する少なくとも１つのトランスウェルチューブと、
   前記少なくとも１つのトランスウェルチューブと流体連通するポンプとを備える、
   動的多臓器プレート。
2. 第１のトランスウェルチューブは前記ポンプを第１のウェルと連結させ、
   第２のトランスウェルチューブは前記第１のウェルを第２のウェルと連結させ、
   第３のトランスウェルチューブは前記第２のウェルを前記ポンプと連結させる、請求項１に記載のプレート。
3. ウェルに入出する流体流れは一方向である、請求項１に記載のプレート。
4. ウェルに入出する流体流れは双方向である、請求項１に記載のプレート。
5. 前記トランスウェルチューブの壁は極性を与えられ、前記トランスウェルチューブの壁を横切る流体または栄養の一方向の流れを提供する、請求項１に記載のプレート。
6. 前記ウェルおよび前記トランスウェルチューブは前記プレート上に予め組み立てられる、請求項１に記載のプレート。
7. 前記ウェルおよび前記トランスウェルチューブは使用者により前記プレート上に配置される、請求項１に記載のプレート。
8. トランスウェルチューブはウェルポートを備え、前記ウェルポートを通って物質は前記トランスウェルチューブ管腔の中に導入され、または前記ウェルポートを通って前記トランスウェルチューブ管腔内の一定量の流体は取り除かれる、請求項１に記載のプレート。
9. 前記物質は有機小分子またはタンパク質である、請求項８に記載のプレート。
10. 心臓組織は１つのウェル内に存在し、前記ウェルは前記心臓組織の電気活動を測定するように構成されたマイクロアレイ電極を備える、請求項１に記載のプレート。
11. 少なくとも１つのウェルは外殻および挿入部を備え、流体用空間は前記外殻と前記挿入部との間に存在する、請求項１に記載のプレート。
12. 前記挿入部は、前記流体空間と前記ウェルの前記内部との間で化学物質、気体、および流体の拡散を可能にする半透壁を備える、請求項１１に記載のプレート。
13. 前記流体空間は前記トランスウェルチューブと流体連通する、請求項１１に記載のプレート。
14. １つのウェルは肺組織を備える、請求項１に記載のプレート。
15. 前記肺ウェルは前記肺ウェルの上に装着されたチャンバをさらに備える、請求項１４に記載のプレート。
16. 前記チャンバは、操作者が流体または他の物質を前記チャンバの中に導入するように構成された開口を備える、請求項１５に記載のプレート。
17. 前記トランスウェルチューブは透析膜を備える、請求項１に記載のプレート。
18. 細胞または組織を培養増殖するように構成された２つ以上のウェルと、
    前記２つ以上のウェルの間に流体連通を提供するように構成された、前記２つ以上の細胞の間の少なくとも１つのチャネルと、
    前記少なくとも１つのトランスウェルチューブと流体連通するポンプとを備える、動的多臓器プレート。
19. 前記チャネルは開口チャネルである、請求項１８に記載のプレート。
20. 前記チャネルは閉鎖チャネルである、請求項１８に記載のプレート。

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