CN116814421A - 用于多组织共培养的器官芯片与对多组织功能调节作用的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种用于多组织共培养的器官芯片和对多组织功能调节作用的检测方法。器官芯片包括依次层叠设置的密封层、培养层以及连接层，连接层上设置有连接入口组、连接出口组；培养层上设置有培养入口组、培养出口组、血管外组织流道组、第一组培养室、血管培养室；密封层上设置有血管内流入口、血管内流出口、血管内流道组；连接入口组、培养入口组、血管外组织流道组、血管培养室以及第一组培养室、培养出口组、连接出口组形成血管外组织培养通道；连接入口组、培养入口组、血管内流入口、血管内流道组、人工血管、血管内流出口、培养出口组以及连接出口组形成血管内培养通道，概括了活体器官的多细胞结构，并提供体外血管灌注。
Description
技术领域
本发明属于生物组织工程和生物医药技术领域，具体涉及一种用于多组织共培养的器官芯片与一种对多组织功能调节作用的检测方法。
背景技术
人体不同器官或整个系统的毒性检测是药代动力学和药效学研究的重要部分，传统方法主要为采用动物实验以及二维细胞培养模式对其进行检测，虽取得了诸多成就，但受周期、成本、精准度、伦理等因素的限制，难以预测人体对于各种药物的响应。例如，目前采用动物模型进行细胞培养实验，其实验周期长，成本高，且动物组织器官与人体组织器官差异较大，动物模型并不能有效预测人类的药物反应，以及并不能满足体外人类毒性和功效测试的需求。其次，还有采用细胞二维培养，这仍为单一细胞研究，缺乏系统性，不能全面分析作用机理和对其他组织的毒性影响。
而人体器官芯片通过与细胞生物学、工程学和生物材料等多种学科的方法相结合，通过体外模拟多种活体细胞、组织器官微环境，可以反映人体组织器官的主要结构和功能特征，能准确地控制多个系统参数，与传统的毒理学动物实验相比更能反映人体真实情况，在新药筛选方面更具特异性。因此，利用微加工技术建立更接近人体环境的仿生系统成为体外生理模型的研究热点。
然而，随着器官芯片技术的发展，其应用仍然存在一定的局限性，例如，采用细胞三维培养虽然能够构建器官组织的三维芯片结构，为药物研发提供了新模型，但依然是单器官静态研究，单器官芯片无法全面反映机体器官功能的复杂性、功能变化和完整性，无法概括活体器官关键功能单元的多细胞结构、组织界面和相关的物理微环境，不能模拟人体通过血液流通和血管过滤等功能流通实现营养和药物吸收，或人体肿瘤转移侵袭的真实环境。
因此，针对上述技术问题，本发明提出一种用于多组织共培养的器官芯片与一种对多组织功能调节作用的检测方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种用于多组织共培养的器官芯片与一种对多组织功能调节作用的检测方法。
本发明的一方面，提供一种用于多组织共培养的器官芯片，包括依次层叠设置的密封层、培养层以及连接层，所述连接层上设置有连接入口组、连接出口组；所述培养层上设置有培养入口组、培养出口组、血管外组织流道组、用于放置三维细胞或组织或体外仿真器官的第一组培养室、用于放置人工血管的血管培养室；所述密封层上设置有血管内流入口、血管内流出口、血管内流道组；
所述连接入口组、所述培养入口组、所述血管外组织流道组、所述血管培养室在放置人工血管后构成的血管外通道、所述第一组培养室、所述培养出口组以及所述连接出口组形成血管外组织培养通道；
所述连接入口组、所述培养入口组、所述血管内流入口、所述血管内流道组、所述血管培养室在放置人工血管后的血管内通道、所述血管内流出口、所述培养出口组以及所述连接出口组形成血管内培养通道。
优选地，所述培养层上还设置有独立流道组与用于放置三维细胞或组织或体外仿真器官的第二组培养室；
所述连接入口组、所述培养入口组、所述独立流道组、所述第二组培养室、所述培养出口组以及所述连接出口组形成独立培养通道。
优选地，所述血管外组织流道组包括血管外组织入口流道、血管外组织出口流道、血管培养室出口流道、微混流道以及第一组培养室入口流道；其中，
所述培养入口组、所述血管外组织入口流道、所述血管培养室、所述血管培养室出口流道、所述微混流道、所述第一组培养室入口流道、所述第一组培养室、所述血管外组织出口流道以及所述培养出口组依次连通。
优选地，所述血管外组织入口流道、所述血管外组织出口流道以及所述微混流道均设置在所述培养层朝向所述密封层的一侧，所述血管培养室出口流道、所述第一组培养室入口流道设置在所述培养层背离所述密封层的一侧，所述血管培养室、所述第一组培养室穿设在所述培养层上；以及，
所述培养层上还穿设有第一流体转换孔与第二流体转换孔，所述血管培养室出口流道与所述微混流道通过所述第一流体转换孔连通，所述微混流道与所述第一组培养室入口流道通过所述第二流体转换孔连通。
优选地，所述血管内流道组包括血管内入口流道、血管内出口流道；其中，
所述血管内流入口、所述血管内入口流道、所述人工血管、所述血管内出口流道、所述血管内流出口依次连通。
优选地，所述独立流道组包括独立入口流道、独立出口流道以及第二组培养室出口流道；
所述培养入口组、所述独立入口流道、所述第二组培养室、所述第二组培养室出口流道、所述独立出口流道以及所述培养出口组依次连通。
优选地，所述独立入口流道与独立出口流道设置在所述培养层朝向所述密封层的一侧，所述第二组培养室出口流道设置在所述培养层背离所述密封层的一侧，所述第二组培养室穿设在所述培养层上；以及，
所述培养层上还穿设有第三流体转换孔，所述第二组培养室出口流道与所述独立出口流道通过所述第三流体转换孔连通。
优选地，所述第一组培养室与所述第二组培养室对应设置。
优选地，所述培养层在所述血管培养室的两端还穿设有固定槽，所述固定槽内容置有固定连接组件，所述人工血管的端部与所述固定连接组件固定连接；以及，
所述固定连接组件内设置有连接流道，所述血管内入口流道、所述血管内出口流道均通过所述连接流道与所述人工血管连通。
本发明的另一方面，提供一种对多组织功能调节作用的检测方法，采用前文记载的所述器官芯片对多组织功能调节作用进行检测，所述检测方法包括：
向各培养通道引入各培养基，以培养三维细胞或组织或体外仿真器官，以及人工血管；
向血管内培养通道引入待测物；
对所述三维细胞或所述组织或所述体外仿真器官进行至少一次活性检测分析，得到所述待测物对多组织功能的调节结果。
本发明的器官芯片包含由人体器官特异性细胞构成的单独的人工血管和培养室，培养室在体外重新概括了活体器官关键功能单元的多细胞结构、组织界面和相关的物理微环境，同时提供体外血管灌注，可在体外充分体现内皮细胞促进药物吸收、分布、代谢、排泄(ADME)和毒性的作用。
附图说明
图1为本发明一实施例的器官芯片的分解图；
图2为本发明一实施例的器官芯片中培养层的结构示意图；
图3为本发明一实施例的器官芯片中密封层的结构示意图；
图4为本发明一实施例的器官芯片中连接层的结构示意图；
图5为本发明一实施例的培养层中人工血管固定的结构示意图；
图6为本发明一实施例的培养层中固定连接组件的结构示意图；
图7为本发明另一实施例的培养系统的结构示意图；
图8为本发明另一实施例的一种器官组织的血管内皮图像；
图9为本发明另一实施例的一种器官组织的心肌细胞微球图像；
图10为本发明另一实施例的一种器官组织的心肌细胞微球跳动频率随培养基浓度变化图；
图11为本发明另一实施例的一种器官组织的NCI-H23肿瘤微球图像；
图12为本发明另一实施例的一种器官组织的NCI-H23肿瘤微球的细胞活性随药物作用天数变化曲线图；
图13为本发明另一实施例的一种器官组织的NCI-H23肿瘤微球随药物作用天数变化图像；
图14为本发明另一实施例的一种器官组织的心肌细胞微球跳动频率随药物作用天数变化曲线图；
图15为本发明另一实施例的一种器官组织的NCI-H23肿瘤微球的细胞活性随药物作用天数变化曲线图；
图16为本发明另一实施例的一种器官组织的NCI-H23肿瘤微球随药物作用天数变化图像。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
如图1至图6所示，本发明提出一种用于多组织共培养的器官芯片，该芯片包括依次层叠设置的密封层C、培养层B以及连接层A，连接层A上设置有连接入口组、连接出口组；培养层B上设置有培养入口组、培养出口组、血管外组织流道组、用于放置三维细胞或组织或体外仿真器官的第一组培养室、用于放置人工血管的血管培养室；密封层C上设置有血管内流入口、血管内流出口、血管内流道组。其中，连接入口组、培养入口组、血管外组织流道组、血管培养室在放置人工血管后构成的血管外通道以及第一组培养室、培养出口组以及连接出口组形成血管外组织培养通道。连接入口组、培养入口组、血管内流入口、血管内流道组、血管培养室在放置人工血管后的血管内通道、血管内流出口、培养出口组以及连接出口组形成血管内培养通道。
一并结合图7所示，将第一培养基71引入至血管外组织培养通道，将第二培养基72引入至血管内培养通道，第二培养基72含有待测物质，第二培养基72和第一培养基71在血管培养室由于浓度差、压力差等原因，经人工血管吸收、过滤等作用后待测物会发生物质交换，人工血管外的第一培养基71将人工血管内的第二培养基72渗出的待测物输送至第一组培养室，以对第一组培养室内的三维细胞或组织或体外仿真器官作用，即相当于血管内培养通道与血管外组织培养通道通过人工血管相连接。
需要说明的是，本实施例对于待测物不做具体限定，例如，作用于组织的药物。
本实施例通过在血管培养室放置人工血管后形成血管外通道与血管内通道，待测物经人工血管形成的血管内通道吸收、过滤在血管培养室与血管外通道发生物质交换，例如，药物交换，将药物与第一培养基充分混合后作用到第一组培养室的三维细胞或组织或体外仿真器官，实现了体外模拟人体内药物经血管运输、吸收、过滤后作用到器官的过程；并且基于人工血管与连接入口组连通，可以直接通过连接入口组向人工血管内加入待测物，可以实现提高待测物添加过程的便捷性。
具体的，如图1至图7所示，本实施例的连接入口组包括血管外连接入口A2、血管内连接入口A3、独立连接入口A5，连接出口组包括血管外连接出口A1、血管内连接出口A4、独立连接出口A6；培养入口组包括血管外培养入口B2、血管内培养入口B3、独立培养入口B5，培养出口组包括血管外培养出口B1、血管内培养出口B4、独立培养出口B6。其中，血管外连接入口A2、血管外培养入口B2对应连通，血管外连接出口A1与血管外培养出口B1对应连通，以将第一培养基71由血管外连接入口A2引入血管外培养入口B2并进入至血管外组织培养通道，再由血管外培养出口B1引出至血管外连接出口A1排出返回至第一培养基对应的培养瓶。其次，血管内连接入口A3、血管内培养入口B3、血管内流入口C3对应连通，血管内流出口C4、血管内培养出口B4、血管内连接出口A4相对应连通，以将第二培养基72由血管内连接入口A3经血管内培养入口B3引入血管内流入口C3，并进入至血管内培养通道，再由血管内流出口C4经血管内培养出口B4引出至血管内连接出口A4排出返回至第二培养基对应的培养瓶，以形成系统连接区。
应当理解的是，本实施例的血管外连接入口、血管内连接入口、独立连接入口、血管外连接出口、血管内连接出口、独立连接出口、血管外培养入口、血管内培养入口、独立培养入口、血管外培养出口、血管内培养出口、独立培养出口可以为通孔，以形成对应的连通关系。
在一些优选实施例中，血管外培养入口、血管内培养入口、独立培养入口、血管外培养出口、血管内培养出口、独立培养出口设置为直径为1mm的通孔。
在一些优选实施例中，血管内流入口与血管内流出口为直径1mm，深0.5mm的圆形槽。
进一步地，如图1和图2所示，血管外组织流道组包括血管外组织入口流道B2-1、血管外组织出口流道B1-1、血管培养室出口流道B2-2、微混流道B10以及第一组培养室入口流道(该第一组培养室入口流道相当于第一组培养室的子流道B12-2)；其中，血管外培养入口B2、血管外组织入口流道B2-1、血管培养室B13在放置人工血管E后的血管外通道、血管培养室出口流道B2-2、微混流道B10、第一组培养室入口流道、第一组培养室B12、血管外组织出口流道B1-1以及血管外培养出口B1依次连通。
需要说明的是，本实施例对于各流道如何设置不作具体限定，只要能实现各流道连通即可，例如，可以在培养层上设置凹槽。
在一些优选实施例中，如图1和图2所示，血管外组织入口流道B2-1、血管外组织出口流道B1-1以及微混流道B10均设置在培养层B朝向密封层C的一侧(培养层的下表面)，血管培养室出口流道B2-2、第一组培养室入口流道设置在培养层B背离密封层C的一侧(培养层的上表面)，血管培养室B13、第一组培养室B12穿设在培养层B上。此外，培养层B上还穿设有第一流体转换孔B9与第二流体转换孔B11，血管培养室出口流道B2-2与微混流道B10通过第一流体转换孔B9转换流体方向，以实现流道的相连通，微混流道B10与第二连接流通通过第二流体转换孔B11转换流体方向，以实现流道的相连通。
在一些优选实施例中，如图2所示，第一组培养室B12包括五个子培养室，分别为第一子培养室、第二子培养室、第三子培养室、第四子培养室、第五子培养室，其中，第一子培养室的一端与通过子流道B12-2与微混流道连通，另一端通过子流道B12-1与第二子培养室连通，第三子培养室的一端通过子流道B12-2与第二子培养室连通，另一端通过子流道B12-1与第四子培养室连通，第五子培养室的一端通过子流道B12-2与第四子培养室连通，另一端与血管外组织出口流道B1-1连通，以作为药物试验区。
在一些优选实施例中，子流道B12-2设置在培养层背离密封层的一侧，子流道B12-1设置在培养层朝向密封层的一侧。
需要说明的是，本实施例对于各子流道、血管外组织流道组中的各流道、第一组培养室、血管培养室以及流体转换孔的尺寸不作具体限定。
在一些优选实施例中，各子流道以及血管外组织流道组中的各流道均设置为宽0.5mm、深0.5mm的槽，其具体长度及形状可根据实际需要进行设置，与密封层的上表面，或者连接层的下表面连接后形成封闭的流体通道。
在一些优选实施例中，第一组培养室中的各子培养室均为直径4mm的通孔。
在一些优选实施例中，血管培养室为贯穿培养层厚度的长方形槽，用来安装人工血管，将培养层与连接层的下表面、密封层的上表面连接后形成密闭的血管培养室，以作为血管培养区，其中，由血管培养室中的人工血管形成血管内通道，血管培养室的其余空间形成血管外通道，可与人工血管形成的血管内通道发生物质交换。
在一些优选实施例中，第一流体转换孔与第二流体转换孔为直径2mm的通孔，用来转换流体的方向，将培养层下层流道的流体引入上层流道，或者将培养层上层流道的流体引入下层流道，以实现流道连通。
更进一步地，如图1至图3所示，血管内流道组包括血管内入口流道C3-1、血管内出口流道C4-1；其中，血管内流入口C3、血管内入口流道C3-1、血管内出口流道C4-1、血管内流出口C4依次连通。
在一些优选实施例中，如图1和图3所示，血管内入口流道C3-1、血管内出口流道C4-1均设置在密封层C朝向培养层B的一侧，即密封层的上表面，另外，由于人工血管设置在培养层上的血管培养室，这样，在密封层C上表面还设置有第一连接孔C3-2、第二连接孔C4-2，第一连接孔C3-2位于血管内入口流道C3-1靠近人工血管E的一端，第二连接孔C4-2位于血管内出口流道C4-1靠近人工血管E的一端，通过上述两个连接孔将人工血管分别与血管内入口流道、血管内出口流道连通。
需要说明的是，本实施例对于各流道以及连接孔的尺寸不作具体限定。
在一些优选实施例中，血管内入口流道、血管内出口流道均为宽0.5mm、深0.5mm的槽，其具体长度及形状可根据实际需要进行设置，与密封层的上表面、或者连接层的下表面连接后形成封闭的流体通道。
在一些优选实施例中，第一连接孔以及第二连接孔为直径1mm，深0.5mm的圆形槽。
更进一步地，为了将人工血管固定在血管培养室内，培养层在血管培养室的两端还穿设有固定槽，固定槽内容置有固定连接组件，人工血管的端部与固定连接组件固定连接；以及，固定连接组件内设置有连接流道，血管内入口流道、所述血管内出口流道均通过连接流道与人工血管连通。
需要说明的是，本实施例对于固定连接组件与人工血管如何固定以及人工血管与其他流道如何连通不做具体限定。
示例性地，如图5和图6所示，固定连接组件包括两个固定块与两个连接管，分别为第一固定块D1、第二固定块D3、第一连接管D2、第二连接管D4。其中，第一固定块D1和第二固定块D3容置在对应的固定槽内，第一固定块D1、第二固定块D3朝向人工血管的一侧分别设置有第一连接管D2和第二连接管D4。两个连接管的第一端分别插置在人工血管E的两个端部，第一连接管D2的第二端固定在第一固定块D1中，第一固定块D1中还设置有第一连接流道，第一连接流道与第一连接管连通，以通过第一连接流道、第一连接管实现将血管内入口流道与人工血管连通。另外，第二连接管D4的第二端固定在第二固定块D3中，第二固定块D3中还设置有第二连接流道，第二连接流道与第二连接管连通，以通过第二连接流道、第二连接管实现将血管内出口流道与人工血管连通。
在一些优选实施例中，第一连接管和第二连接管可以采用外径2mm内径1mm长度10mm的硬管，该硬管可由高分子材料加工或注塑而成，也可有玻璃、不锈钢等没有生物毒性的材料加工而成。
更进一步地，为了真实反映待测物对第一组培养室内组织器官的作用，在同样外部条件下应当设置对照实验组，即本发明还设置有独立培养区，具体如下：如图1至图4所示，第三培养层B上还设置有独立流道组与用于放置三维细胞或组织或体外仿真器官的第二组培养室，连接入口组、培养入口组、独立流道组、第二组培养室、培养出口组以及连接出口组形成对照区的独立培养通道。
需要说明的是，本实施例对于第一组培养室以及第二组培养室中放置的三维细胞或组织或体外仿真器官不做具体限定，例如，可以是心肌细胞微球，也可以是肿瘤微球，还可以是两者的组合。
示例性地，如图1至图4所示，独立流道组包括独立入口流道B5-1、独立出口流道B6-1以及第二组培养室出口流道，这样，第三培养基经独立连接入口A5引入至独立培养入口B5、并进一步依次流入独立入口流道B5-1、第二组培养室B7、第二组培养室出口流道(该第二组培养室出口流道相当于第二组培养室的子流道B7-2)、独立出口流道B6-1，再经独立培养出口B6引出至独立连接出口A6。
一并结合图7所示，将第三培养基73引入至独立培养通道，第三培养基73经独立入口流道流入至第二组培养室，以对第二组培养室内的三维细胞或组织或体外仿真器官作用。
在一些优选实施例中，如图1和图2所示，独立入口流道B5-1与独立出口流道B6-1设置在培养层B朝向密封层C的一侧(培养层的下表面)，第二组培养室出口流道设置在培养层B背离密封层C的一侧(培养层的上表面)，第二组培养室B7穿设在培养层B上，培养层B上还穿设有第三流体转换孔B8，第二组培养室出口流道与独立出口流道B6-1通过第三流体转换孔B8转换流体方向，以使各流道相连通。
需要说明的是，为了真实反映待测物对三维细胞或组织或体外仿真器官的作用，第一组培养室与第二组培养室在培养层上对应设置，包括位置和数量的相对应，两组培养室对称设置在培养层沿其宽度方向的两侧，以及两组培养室均包括五个子培养室。
具体地，如图2所示，第二组培养室包括五个子培养室，分别为第六子培养室、第七子培养室、第八子培养室、第九子培养室、第十子培养室，其中，第六子培养室的一端与独立入口流道连通，另一端通过子流道B7-2与第七子培养室连通，第八子培养室的一端通过子流道B7-1与第七子培养室连通，另一端通过子流道B7-2与第九子培养室连通，第十子培养室的一端通过子流道B7-1与第九子培养室连通，另一端通过子流道B7-2与独立出口流道连通，以作为独立培养区。
在一些优选实施例中，如图2所示，子流道B7-2设置在培养层背离密封层的一侧，子流道B7-1设置在培养层朝向密封层的一侧。
需要说明的是，本实施例对于子流道、独立流道组中的各流道、第二组培养室以及第三流体转换孔的尺寸不作具体限定。
在一些优选实施例中，各子流道以及独立流道组中的各流道均为宽0.5mm、深0.5mm的槽，其具体长度及形状可根据实际需要进行设置，与密封层的上表面，或者连接层的下表面连接后形成封闭的流体通道。
在一些优选实施例中，第二组培养室中的各子培养室设置为直径4mm的通孔。
需要说明的是，本实施例密封层、培养层、连接层以及固定块的材料均可由PMMA、PC、COC、PE、PP等没有生物毒性的高分子材料加工或注塑而成，也可由玻璃、不锈钢等没有生物毒性的材料加工而成，当然，对于本领域技术人员来说，还可以采用其他材料制作形成。
进一步需要说明的是，对于密封层、培养层、连接层以及固定块之间具体如何连接到一起并没有做出限定。
示例性的，固定块、连接管预先装配，并由无生物毒性的粘结剂密封。其次，密封层C的上表面与培养层B的下表面、固定块的下表面可有双面胶粘贴，生物胶粘贴，超声波键合、激光键合等方式连接，组成封闭的流道和半封闭的培养室。再者，连接层A的下表面与培养层B的上表面，在器官芯片内装入人工血管和3D组织器官的细胞微球后，由双面胶或粘贴剂等快速方式连接，组成封闭的流道和培养室。当然，除此以外，本领域技术人员还可以根据实际需要，采取其他一些连接方式将密封层C、培养层B以及连接层A连接到一起，本实施例对此并不具体限制。
本实施例的芯片培养层上主要设置有5个区域，第一区域为由培养入口组、培养出口组形成的系统连接区，以实现培养层与连接层以及密封层的连接；第二区域为由第二组培养室以及独立流道组形成的独立培养区；第三区域为由血管培养室和其内放置的人工血管形成的血管培养区，以基于浓度差进行药物交换；第四区域为由微混流道形成的微混区，以将待测物与培养基混合；第五区域为由第一组培养室形成的药物试验区。这5个区域与上述层叠的密封层、连接层又形成3个独立控制的循环培养通道，即对照试验的培养通道、含有待测物的血管内培养通道以及血管外组织培养通道。
本发明的器官芯片实现了同时进行多条循环培养通道并与培养系统的多个培养基连接，这些培养室在体外重新概括了活体器官关键功能单元的多细胞结构、组织界面和相关的物理微环境，同时提供体外血管灌注。可在体外充分体现内皮细胞促进药物吸收、分布、代谢、排泄(ADME)和毒性的作用，可以反映出待测物(例如、药物)对培养室内组织器官的作用。
本发明的另一方面，提供一种对多组织功能调节作用的检测方法，采用前文记载的器官芯片对多组织功能调节作用进行检测，检测方法为在器官芯片的无菌环境中执行下述步骤：
第一、向各培养通道引入各培养基，以培养三维细胞或组织或体外仿真器官，以及人工血管。
具体地，如图7所示，向血管外组织培养通道引入第一培养基71，以对第一组培养室中的三维细胞或组织或体外仿真器官进行培养。
在一些优选实施例中，如图7所示，为了真实反映待测物对第一组培养室内三维细胞或组织或体外仿真器官的作用，在同样外部条件下应当设置对照实验组，即在独立培养通道内引入第三培养基73，以对第二组培养室中的三维细胞或组织或体外仿真器官进行培养。
第二、向血管内培养通道引入待测物。
具体地，如图7所示，向血管内组织培养通道引入第二培养基72，该培养基含有待测物，本实施例对该待测物不做具体限定，可以是作用于组织的药物。
当然，为了确定三维细胞或组织或体外仿真器官具有良好的功能性特征，在一些优选实施例中，第二培养基72可以为不含有待测物的培养基，采用该第二培养基72培养一段时间，之后将第二培养基72更换为含有待测物的培养基。
需要说明的是，本实施例的待测物在血管培养室发生物质交换，人工血管内的第二培养基72在血管培养室渗出待测物，人工血管外的第一培养基71掺杂该待测物并将其输送至第一组培养室，以对第一组培养室内的三维细胞或组织或体外仿真器官作用。
第三、对三维细胞或组织或体外仿真器官进行至少一次活性检测分析，得到待测物对多组织功能的调节结果。
在一些优选实施例中，先对未加待测物的第二培养基72培养的人工血管以及组织器官进行第一次活性分析，以保证血管和心肌微球具备良好的功能性特征。之后，对加入待测物的第二培养基72的组织器官进行第二次活性分析，以得到待测物对组织器官的影响结果。
应当理解的是，在各培养通道引入各培养基之前，需要将器官芯片与培养系统进行装配、灭菌处理等过程，例如，将装配好的器官芯片部件，培养层、连接层和培养系统，使用环氧乙烷灭菌后备用。
进一步地，还需要提前培养人工血管以及组织器官，将人工血管培养至表现出功能性特征，以及，制作组织器官的细胞微球，并将细胞微球培养至表现出功能性特征。之后，将人工血管放入血管培养室，并将人工血管插入连接块上的硬质连接管上，实现密封连接，之后，在第二组培养室B7和第一组培养室B12的各子培养室内分别放入一个细胞微球。
更进一步地，还需要将人工血管与组织器官的细胞微球装配完成后，利用无生物毒性的双面胶将连接层和培养层快速密封连接，之后，将器官芯片与培养系统连接。
本发明的器官芯片通过人工血管、培养室以实现组织细胞微球等多细胞组织共培养，可体外模拟体内为微环境，以及可通过人工血管过滤、吸收、屏蔽等，实现对人工器官组织或肿瘤组织的药物测试。
本发明提出一种用于多组织共培养的器官芯片与对多组织功能调节作用的检测方法，具有以下有益效果：
第一、本发明的器官芯片可适用于多组织器官和类器官的三维培养；
第二、本发明的器官芯片的培养室在体外重新概括了活体器官关键功能单元的多细胞结构、组织界面和相关的物理微环境，同时提供体外血管灌注，可模拟人体通过血液流通和血管过滤等功能流通实现营养和药物吸收，或人体肿瘤转移侵袭的真实环境；
第三、本发明的器官芯片可在体外充分体现内皮细胞促进药物吸收、分布、代谢、排泄(ADME)和毒性的作用。
下面将以具体实施例对用于多组织共培养的器官芯片的作用原理及应用进行说明：
实施例1
本示例对器官芯片灌注培养的系统原理进行说明，具体如下：
如图1至图7所示，器官芯片与培养系统组成3个独立控制的循环培养通道，具体如下：
第一个培养通道：第一培养基71由泵M1驱动，经管路进入血管外连接入口A2，向下经血管外培养入口B2、进入血管外组织入口流道B2-1，进入血管培养室B13在放置人工血管后的血管外通道，经血管培养室出口流道B2-2进入第一流体转换孔B9，经B9向下进入微混流道B10，流过微混流道B10通道后，经第二流体转换孔B11向上进入第一组培养室入口流道依次流过第一组培养室B12的5个子培养室进入血管外组织出口流道B1-1，经过血管外培养出口B1向上，经血管外连接出口A1和管路返回第一培养基对应的培养瓶，组成血管外和药物测试区培养室的循环灌注培养通道。
第二个培养通道：第二培养基72经泵M2驱动后进血管内连接入口A3，向下经血管内培养入口B3、血管内流入口C3，过血管内入口流道C3-1，经第一连接孔C3-2、连接管D2向上进入人工血管E，再经连接管D4、第二连接孔C4-2向下进入血管内出口流道C4-1到血管内流出口C4，向上经血管内培养出口B4、血管内连接出口A4由管路放回第二培养基对应的培养瓶，组成血管内第二培养基72循环通道。
第三个培养通道：第三培养基73由泵M3驱动，经管路进入独立连接入口A5，向下经独立培养入口B5、进入独立入口流道B5-1，依次流过第二组培养室B7的5个子培养室进入第三流体转换孔B8孔向下，进入独立出口流道B6-1通道，过独立培养出口B6向上，经独立连接出口A6和管路返回第三培养基对应的培养瓶，组成独立培养对照区的循环培养通道。
基于上述各培养通道，含有药物的血管内培养通道中的第二培养基72和血管外组织培养通道中的第一培养基71在血管培养室B13由于浓度差、压力差等原因，经人工血管吸收、过滤等作用后会发生药物交换，血管外组织培养通道的第一培养基71将血管内培养通道的第二培养基72渗出的药物带入微混流道B10，在微混流道B10通道内充分混合后作用到第一组培养室B12培养室内三维细胞或组织或体外仿真器官，此过程在体外模拟了人体内药物经血管运输、吸收、过滤后作用到器官的过程。此外，独立培养通路内第二组培养室B7的5个子培养室与第一组培养室B12的5个子培养室对应放置同样的三维细胞或组织或体外仿真器官，作为同样外部条件下，药物作用器官的对照，以反映药物对第一组培养室B12培养室内三维细胞或组织或体外仿真器官的作用。
实施例2
本示例提供一种对多组织功能调节作用的检测方法，采用前文记载的器官芯片，在进行培养时，需要将该芯片接入培养系统，如图7所示，该培养系统包括第一培养基71、第二培养基72和第三培养基73，泵M1、泵M2和泵M3，在图7中，第一培养基71经由泵M1与血管外组织培养通道相连，第二培养基72经由泵M2与血管内培养通道相连，第三培养基73经由泵M3与独立培养通道相连。具体培养方法如下：
将上述装配好的芯片接入培养系统，并采用环氧乙烷对芯片及培养系统进行灭菌；
使用Huvec内皮细胞培养人工血管，培养至人工血管出现功能性特征；
使用诱导人源多功能干细胞，促使其分化成人源心肌细胞，使用心肌细胞制作心肌细胞微球，并培养至心肌细胞微球表现出功能性特征，心肌具备18次/分钟的规律性搏动；
在无菌培养环境下，取灭菌后的芯片和培养后的人工血管以及心肌细胞微球，并将培养后的人工血管放入至血管培养室，并将人工血管插入固定块及连接管上，实现密封连接，以及，将培养后的心肌细胞微球依次放入至第一组培养室和第二组培养室中；
利用无生物毒性的双面胶将连接层和培养层密封连接；
在无菌环境中，将芯片和培养系统连接，并在每个培养瓶中分别放入15mL对应的培养基，启动培养系统，当各培养基充满对应的培养室并形成流动灌注回路后，将芯片连同培养系统一起放入37℃无菌培养箱内；
连续灌注培养24h，将芯片连同培养系统一起取出，使用高内涵图像分析系统对芯片内人工血管和心肌细胞微球进行活性分析，保证人工血管和心肌细胞微球具备良好的功能性特征，血管内皮排列紧密，连续灌注培养后具有一定的方向性，心肌微球蠕动频率为18次/分钟，其高内涵系统采集的血管图像及心肌微球图像见图8、图9；
在无菌环境中，将人工血管对应的第二培养基替换成包含肾上腺素的培养基，肾上腺素浓度依次为10-10mol/L、10-9mol/L、2x10-9mol/L，将芯片连同培养系统一起放入37℃无菌培养箱内灌注培养1h，得到器官组织；
采用高内涵系统对得到的器官组织进一步分析，如图10所示，控制组为原第二培养基，即未替换肾上腺素的对照组，通过对比发现心肌细胞微球的跳动频率随肾上腺素的浓度的升高明显提高，心肌细胞微球搏动频率的增加符合肾上腺素对心脏组织的影响规律，这说明肾上腺素可经过人工血管的吸收、过滤、屏蔽等作用后，可以对心肌微球组织产生影响。
实施例3
本示例提供一种对多组织功能调节作用的检测方法，采用前文记载的器官芯片，在进行培养时，需要将该芯片接入培养系统，如图7所示，该培养系统包括第一培养基71、第二培养基72和第三培养基73，泵M1、泵M2和泵M3，在图7中，第一培养基71经由泵M1与血管外组织培养通道相连，第二培养基72经由泵M2与血管内培养通道相连，第三培养基73经由泵M3与独立培养通道相连。具体培养方法如下：
将上述装配好的芯片接入培养系统，并采用环氧乙烷对芯片及培养系统进行灭菌；
使用Huvec内皮细胞培养人工血管，培养至人工血管出现功能性特征；
使用人源肺癌细胞NCI-H23制作3D肿瘤微球，并培养至NCI-H23肿瘤微球表现出功能性特征；
在无菌培养环境下，取灭菌后的芯片和培养后的人工血管以及NCI-H23肿瘤微球，并将培养后的人工血管放入至血管培养室，并将人工血管插入固定块及连接管上，实现密封连接，以及，将培养后的肿瘤微球依次放入至第一组培养室和第二组培养室中；
利用无生物毒性的双面胶将连接层和培养层密封连接；
在无菌环境中，将芯片和培养系统连接，并在每个培养瓶中分别放入15mL对应的培养基，启动培养系统，当各培养基充满对应的培养室并形成流动灌注回路后，将芯片连同培养系统一起放入37℃无菌培养箱内；
连续灌注培养24h，将芯片连同培养系统一起取出，使用高内涵图像分析系统对芯片内人工血管和肿瘤微球进行活性分析，保证人工血管和NCI-H23肿瘤微球具备良好的功能性特征，血管内皮排列紧密，连续灌注培养后具有一定的方向性，肿瘤微球中间颜色深，边缘浅且轮廓清晰，其高内涵系统采集的肿瘤微球图像见图11；
在无菌环境中，将人工血管对应的第二培养基替换成含多柔比星(Dox)的培养基，将芯片连同培养系统一起放入37℃无菌培养箱，连续培养灌注培养10天，得到器官组织。
进一步的，采用高内涵系统对得到的器官组织进一步分析，如图12所示，并分别在上述连续培养灌注培养的第1、3、5、7、10天，对药物测试区第一组培养室B12的5个子培养室内的NCI-H23肿瘤微球(对应图12中Dox-1)和独立对照区第二组培养室B7的5个子培养室内的NCI-H23肿瘤微球(对应图12中Dox-2)进行活性分析，分析数据和采集的图像见图12、图13，通过以上实验数据分析，发现经过药物作用10天后，第一组培养室B12药物测试区的5个NCI-H23肿瘤微球活性降低至第二组培养室B7对照组NCI-H23肿瘤微球活性的20％，这一实验现象符合多柔比星对人肺癌细胞NCI-H23的作用结果，说明多柔比星可经过人工血管的吸收、过滤、屏蔽等作用后，可以对NCI-H23肿瘤微球组织产生毒性影响。
需要说明的是，采用上述同样的方法，还可以用浓度40umol/L的多西他赛进行试验，同样得出的实验数据如图13，说明在本发明的芯片内多西他赛(对应图13中DMSO)也可以对NCI-H23肺癌细胞产生毒性作用。
实施例4
本示例提供一种对多组织功能调节作用的检测方法，采用前文记载的器官芯片，在进行培养时，需要将该芯片接入培养系统，如图7所示，该培养系统包括第一培养基71、第二培养基72和第三培养基73，泵M1、泵M2和泵M3，在图7中，第一培养基71经由泵M1与血管外组织培养通道相连，第二培养基72经由泵M2与血管内培养通道相连，第三培养基73经由泵M3与独立培养通道相连。具体培养方法如下：
将上述装配好的芯片接入培养系统，并采用环氧乙烷对芯片及培养系统进行灭菌；
使用Huvec内皮细胞培养人工血管，培养至人工血管出现功能性特征；
使用人源多功能干细胞，促使其分化成人源心肌细胞，使用心肌细胞制作心肌细胞微球，并培养至心肌细胞微球表现出功能性特征，心肌具备18次/分钟的规律性搏动；
使用人源肺癌细胞NCI-H23制作3D肿瘤微球，并培养至NCI-H23肿瘤心肌细胞微球表现出功能性特征；
在无菌培养环境下，取灭菌后的芯片和培养后的人工血管、心肌细胞微球以及NCI-H23肿瘤微球，将培养后的人工血管放入至血管培养室，并将人工血管插入固定块及连接管上，实现密封连接，以及，将培养后的心肌细胞微球(两个)、NCI-H23肿瘤微球(三个)依次连续放入至第一组培养室B12和第二组培养室B7中；利用无生物毒性的双面胶将连接层和培养层密封连接；
在无菌环境中，将芯片和培养系统连接，并在每个培养瓶中分别放入15mL对应的培养基，启动培养系统，当各培养基充满对应的培养室并形成流动灌注回路后，将芯片连同培养系统一起放入37℃无菌培养箱内；
连续灌注培养24h，将芯片连同培养系统一起取出，使用高内涵图像分析系统对芯片内人工血管、心肌细胞微球和NCI-H23肿瘤微球进行活性分析，保证人工血管、心肌细胞微球和NCI-H23肿瘤微球具备良好的功能性特征；在无菌环境中，将人工血管对应的第二培养基替换成含5-氟尿嘧啶(5-FU)的培养基，将芯片连同培养系统一起放入37℃无菌培养箱，连续培养灌注培养10天，得到器官组织。
采用高内涵系统对心肌细胞微球进一步分析，分别在上述连续灌注培养过程中，每隔24H对药物测试区第一组培养室B12的2个子培养腔室内的心肌细胞微球(对应图14中5-FU-1)和独立对照区第二组培养室B7的2个子培养腔室内的心肌细胞微球(对应图14中5-FU-2)进行跳动频率幅度的分析，分析数据的图像见图14。发现5-FU对第一组培养室B12药物测试区的2个子培养腔室内的心肌细胞微球跳动频率无显著影响，对心肌细胞微球的跳动有损伤的作用，但无显著性；5-FU对第二组培养室B7对照组心肌细胞微球跳动频率在24小时和48小时有显著性影响，对心肌球跳动幅度有降低作用。心肌球在第七天停跳，洗脱后不能恢复，这一实验现象符合5-FU对人心肌的作用结果，说明5-FU可经过人工血管的吸收、过滤、屏蔽等作用后，可以对心肌微球组织产生影响。
进一步的，采用高内涵系统对得到的器官组织进一步分析，如图15所示，并分别在上述连续灌注培养的第1、3、5、7、10天，对药物测试区第一组培养室B12的3个子培养室内的NCI-H23肿瘤微球(对应图15中5-FU-1)和独立对照区第二组培养室B7的3个子培养室内的NCI-H23肿瘤微球(对应图15中5-FU-2)进行活性分析，分析数据和采集的图像见图15、图16，通过以上实验数据分析，发现经过药物作用10天后，与第二组培养室B7对照组NCI-H23肿瘤微球活性相比，第一组培养室B12药物测试区的3个NCI-H23肿瘤微球活性降低了约25％，这一实验现象符合5-FU对人肺癌细胞NCI-H23的作用结果，说明5-FU可经过人工血管的吸收、过滤、屏蔽等作用后，可以对NCI-H23肿瘤微球组织产生毒性影响。
综上所述，待测药物可经过人工血管的吸收、过滤、屏蔽等作用后，可以对心肌细胞微球和肿瘤微球等组织产生影响。且与未通过人工血管作用的对照组相比，实验结果更接近于在实际临床研究过程中发现的结果。表明本发明的对多组织功能调节作用的检测方法能够更加真实的反应待测药物在人体内的作用效果。
本发明的对多组织功能调节作用的检测方法为药物筛选和疾病研究提供一种全新的模型，培养室在体外重新概括了活体器官关键功能单元的多细胞结构、组织界面和相关的物理微环境，同时提供体外血管灌注，可在体外充分体现内皮在地促进药物吸收、分布、代谢、排泄(ADME)和毒性的作用，以实现体外模拟药物、营养等在体内通过血管实现运输和吸收的真实过程，可替代动物实验作为药物筛选和药物毒性实验的重要平台。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于多组织共培养的器官芯片，其特征在于，包括依次层叠设置的密封层、培养层以及连接层，所述连接层上设置有连接入口组、连接出口组；所述培养层上设置有培养入口组、培养出口组、血管外组织流道组、用于放置三维细胞或组织或体外仿真器官的第一组培养室、用于放置人工血管的血管培养室；所述密封层上设置有血管内流入口、血管内流出口、血管内流道组；
所述连接入口组、所述培养入口组、所述血管外组织流道组、所述血管培养室在放置人工血管后构成的血管外通道、所述第一组培养室、所述培养出口组以及所述连接出口组形成血管外组织培养通道；
所述连接入口组、所述培养入口组、所述血管内流入口、所述血管内流道组、所述血管培养室在放置人工血管后的血管内通道、所述血管内流出口、所述培养出口组以及所述连接出口组形成血管内培养通道。
2.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于，所述培养层上还设置有独立流道组与用于放置三维细胞或组织或体外仿真器官的第二组培养室；
所述连接入口组、所述培养入口组、所述独立流道组、所述第二组培养室、所述培养出口组以及所述连接出口组形成独立培养通道。
3.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于，所述血管外组织流道组包括血管外组织入口流道、血管外组织出口流道、血管培养室出口流道、微混流道以及第一组培养室入口流道；其中，
所述培养入口组、所述血管外组织入口流道、所述血管培养室、所述血管培养室出口流道、所述微混流道、所述第一组培养室入口流道、所述第一组培养室、所述血管外组织出口流道以及所述培养出口组依次连通。
4.根据权利要求3所述的器官芯片，其特征在于，所述血管外组织入口流道、所述血管外组织出口流道以及所述微混流道均设置在所述培养层朝向所述密封层的一侧，所述血管培养室出口流道、所述第一组培养室入口流道设置在所述培养层背离所述密封层的一侧，所述血管培养室、所述第一组培养室穿设在所述培养层上；以及，
所述培养层上还穿设有第一流体转换孔与第二流体转换孔，所述血管培养室出口流道与所述微混流道通过所述第一流体转换孔连通，所述微混流道与所述第一组培养室入口流道通过所述第二流体转换孔连通。
5.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于，所述血管内流道组包括血管内入口流道、血管内出口流道；其中，
所述血管内流入口、所述血管内入口流道、所述人工血管、所述血管内出口流道、所述血管内流出口依次连通。
6.根据权利要求2所述的器官芯片，其特征在于，所述独立流道组包括独立入口流道、独立出口流道以及第二组培养室出口流道；
所述培养入口组、所述独立入口流道、所述第二组培养室、所述第二组培养室出口流道、所述独立出口流道以及所述培养出口组依次连通。
7.根据权利要求6所述的器官芯片，其特征在于，所述独立入口流道与独立出口流道设置在所述培养层朝向所述密封层的一侧，所述第二组培养室出口流道设置在所述培养层背离所述密封层的一侧，所述第二组培养室穿设在所述培养层上；以及，
所述培养层上还穿设有第三流体转换孔，所述第二组培养室出口流道与所述独立出口流道通过所述第三流体转换孔连通。
8.根据权利要求7所述的器官芯片，其特征在于，所述第一组培养室与所述第二组培养室对应设置。
9.根据权利要求2至5任一项所述的器官芯片，其特征在于，所述培养层在所述血管培养室的两端还穿设有固定槽，所述固定槽内容置有固定连接组件，所述人工血管的端部与所述固定连接组件固定连接；以及，
所述固定连接组件内设置有连接流道，所述血管内入口流道、所述血管内出口流道均通过所述连接流道与所述人工血管连通。
10.一种对多组织功能调节作用的检测方法，其特征在于，采用权利要求1至9任一项所述的器官芯片对多组织功能调节作用进行检测，所述检测方法包括：
向各培养通道引入各培养基，以培养三维细胞或组织或体外仿真器官，以及人工血管；
向血管内培养通道引入待测物；
对所述三维细胞或所述组织或所述体外仿真器官进行至少一次活性检测分析，得到所述待测物对多组织功能的调节结果。
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