JP2017503859A - 腱治癒を調節するための物質および方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、腱傷害および腱の生体力学的特性の調節におけるマイクロＲＮＡ２９ならびにその前駆体およびミミックの使用に関する。本発明は特に、テノサイトでの１型コラーゲン合成の方が、３型コラーゲンの合成よりもｍｉＲ−２９に対する感受性が低く、このため、コラーゲンサブタイプ間のバランスを１型コラーゲンに傾くよう調節し、治癒過程での生体力学的特性の低下を軽減することが可能であるという発見に由来するものである。【選択図】なし

Description

本発明は、腱傷害の治療および腱の生体力学的特性の調節のためのマイクロＲＮＡ２９ならびにその前駆体およびミミックの使用に関する。
腱の障害を含めたよくみられる筋骨格の病理の多くは、組織修復および炎症の調節不全が特徴となっている１。腱障害は初期治療の筋骨格診察の原因としてよくみられるものであり２〜３、スポーツ外傷全体の３０〜５０％を占めている３。腱障害は、コラーゲン産生がサブタイプ１から３に変化することにより、臨床的腱断裂の前兆となり得る引張り強度の低下が生じることを特徴とする４。
腱障害の発生および永続化には炎症性メディエーターが極めて重要であると考えられている５。炎症細胞系およびテノサイトには様々なサイトカインが発現することが明らかにされており、このことは、浸潤する集団と常在する集団の両方が病理に関与することを示唆している６〜９。ＩＬ−６欠損マウスは正常対照と比較して腱治癒の力学的特性が劣っている１０が、ラット腱傷害モデルではＴＮＦ−α遮断により腱−骨治癒力の改善がみられる１１。これらのデータは、サイトカイン標的化が治療的に有用であるという興味深い可能性をもたらすものであるが、現時点では、腱疾患におけるサイトカイン／マトリックスの生物学的機構に関する理解は不十分であり、この可能性を実際に実現するには至っていない。
インターロイキン３３はＩＬ−１サイトカインファミリーのメンバーであり、自然免疫応答に重要な役割を果たしている。ＩＬ−３３は内皮細胞および線維芽細胞に発現し、核内にクロマチンと共局在している１２。ＩＬ−３３は細胞損傷１３および生体力学的過負荷１４が加わると放出され、このため、「アラーミン」の１つであると考えられている１５。ＩＬ−３３は、肺疾患、皮膚疾患および関節疾患を含めた様々な病理に関与すると考えられている１６。ＩＬ−３３は、膜結合型（ｍＳＴ２）または可溶型（ｓＳＴ２）で存在するその同族受容体ＳＴ２のほか、古典的なＩＬ−１Ｒシグナル伝達カスケードを介して機能する。サイトカインは多くの場合、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制および不安定化によって遺伝子発現を制御するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）により転写後レベルで調節される１７。幹細胞生物学、炎症、低酸素応答および血管新生において提唱される基本的役割を有し、組織修復の鍵となる恒常性調節因子として、マイクロＲＮＡネットワークが浮上しつつある１８。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、翻訳の抑制（翻訳の阻害またはｍＲＮＡ分解の誘導のいずれかを介するもの）を介して細胞機能に大きな影響を及ぼす小分子非コードＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩによって合成され長さ数千ヌクレオチドになり得る一次ＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）から生じる。単一のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写産物から活性なｍｉＲＮＡが２つ以上生じ得る。
核内では、Ｔｙｐｅ ＩＩＩ型ＲＮアーゼ酵素であるＤｒｏｓｈａによってｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写産物がプロセシングされて、ステムループまたはヘアピン構造からなり長さが通常７０〜１００ヌクレオチド前後の前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）になる。次いで、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは細胞質に輸送され、そこでＲＮアーゼであるＤｉｃｅｒによってさらにプロセシングを受けてループが除去され、全体または一部が相補的な「パッセンジャー」鎖とハイブリダイズした活性な「ガイド」鎖（通常、長さ１５〜２５ヌクレオチド）を有する、成熟二本鎖ｍｉＲＮＡ分子が生じる。
次いで、この成熟二本鎖ｍｉＲＮＡがＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体に組み込まれ、そこでガイド鎖が標的ｍＲＮＡの結合部位とハイブリダイズする。
ガイド鎖は標的結合部位と完全には相補的でなくてもよい。しかし、ガイド鎖の「シード配列」と呼ばれる領域は通常、標的結合部位の対応する配列と完全に相補的である。シード配列は通常、長さが２〜８ヌクレオチドであり、ガイド鎖の５’末端またはその付近（１または２ヌクレオチド以内）に位置する。
対を形成していない一本鎖のガイド鎖でもＲＩＳＣに組み込まれ得ると考えられている。このほか、パッセンジャー鎖にそのＲＩＳＣへの組込みを阻害する修飾（例えば、糖、塩基または骨格構造への修飾）を施しても二本鎖ｍｉＲＮＡによる標的阻害の効率が増大し得ると考えられている。
腱傷害の治癒は、少なくとも一部の理由として、腱障害時にコラーゲン合成が１型から３型に変化することにより、最適以下になることが多い。３型コラーゲンは力学的に１型コラーゲンに劣るため、腱の引張り強度の低下が生じる。コラーゲンサブタイプのバランスを調節して１型コラーゲンに戻すことができれば、腱の生体力学的特性が改善されるものと考えられる。
ｍｉＲ−２９はこれまで、線維症および強皮症などの様々な生物学的過程におけるコラーゲン合成の調節因子であると考えられてきた。しかし、本発明者らは、テノサイトには代わりにスプライス型の１型コラーゲン転写産物が含まれていることを初めて発見した。１ａ１型および１ａ２型コラーゲンに優勢な転写産物は、ｍｉＲ−２９結合部位を含まない短い３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を有するものであるのに対し、３型コラーゲンの転写産物は、長いｍｉＲ−２９感受性型で存在するものが圧倒的に多い。
このため、テノサイトでの１型コラーゲンの合成がｍｉＲ−２９によって受ける影響は、３型コラーゲンの合成よりもはるかに小さい。さらには、驚くべきことに、ｍｉＲ−２９活性をアップレギュレートすることにより、コラーゲンサブタイプのバランスを１型コラーゲンに有利になるよう調節し、これにより、腱の引張り強度の低下を軽減または抑制し、腱の最終破断強度などの生体力学的特性を調節することが可能である。
本発明は、その最も広範な形態では、腱の治癒および腱の生体力学的特性を調節するためのマイクロＲＮＡ−２９（ｍｉＲ−２９）ならびにその前駆体、ミミックおよびアゴニストの使用に関する。
したがって、本発明は、腱治癒を調節するための方法を提供し、この方法は、腱細胞のｍｉＲ−２９の発現または活性を増大させることを含む。これは、ｍｉＲ−２９の送達を標的細胞に方向付けることにより、ｍｉＲ−２９ミミックを送達することにより、あるいは標的細胞内でプロセシングを受けて活性なｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９ミミックになる前駆体分子を送達することにより達成され得る。
この方法は、腱細胞にｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体を送達する段階を含み得る。
ｍｉＲ−２９、ミミックまたは前駆体は、薬学的に許容される脂質またはポリマーなどの適切な担体分子とともに（例えば、担体分子と複合体を形成するか、それに封入されて）送達され得る。
担体分子は、標的細胞の表面に結合することが可能な標的化剤をさらに含み得る。
この方法は、腱細胞にｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体が発現するように、腱細胞に前記ｍｉＲ−２９、ミミックまたは前駆体をコードする核酸を送達する段階を含み得る。
あるいは、この方法は、内因性のｍｉＲ−２９活性をアップレギュレートすることが可能なアゴニストを腱細胞に送達する段階を含み得る。
記載される方法はいずれも、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施され得る。最も典型的には、この方法は、対象に適切な組成物を投与することによりｉｎ ｖｉｖｏで実施される。
本発明はこのほか、腱治癒を調節する方法に使用するｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体を提供する。
本発明はこのほか、腱治癒を調節する薬物の製造におけるｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体の使用を提供する。
本発明はこのほか、腱治癒を調節する方法に使用するｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体をコードする核酸を提供する。
本発明はこのほか、腱治癒を調節する薬物の製造におけるｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体をコードする核酸の使用を提供する。
いずれの態様でもｍｉＲ−２９は、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ（ｂ１および／またはｂ２）、ｍｉＲ−２９ｃまたはその組合せであり得る。ｍｉＲ−２９は、ｍｉＲ−２９ａまたはｍｉＲ−２９ａを含む組合せであるのが望ましいものであり得る。
ｍｉＲ−９６、ミミックまたは前駆体をコードする核酸は、裸の核酸として送達され得る。あるいは、ｍｉＲ−９６、ミミックまたは前駆体をコードする核酸は、適切な担体分子、例えば薬学的に許容される脂質もしくはポリマーまたはその組合せなどとともに（例えば、それと複合体を形成するか、それに封入されて）送達され得る。いずれの場合も、核酸は通常、ＤＮＡである。
担体分子は、標的細胞の表面に結合することが可能な標的化剤をさらに含み得る。
あるいは、ウイルスベクターを介して、ｍｉＲ−９６、ミミックまたは前駆体をコードする核酸を送達し得る。
アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルス（特にレンチウイルス）ベクターおよびヘルペスウイルスベクターを含めた任意の適切な種類のウイルスベクターを使用し得る。アデノウイルスおよびレンチウイルスは、活発に分裂していない細胞に送達した遺伝子（１つまたは複数）の発現を達成することが可能であることから、特に好ましいものであり得る。
ｍｉＲ−２９およびその前駆体
ヒトの３つの主要なアイソフォームはｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ１、ｍｉＲ−２９ｂ２およびｍｉＲ−２９ｃである。
「ｍｉＲ−２９」という用語は、本明細書では、上記３つのアイソフォームのいずれか１つの成熟「ガイド鎖」配列からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドを指すのに使用される。
成熟ヒトｍｉＲ−２９ａ（「ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ」）は配列：
ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ
を有する。
成熟ｍｉＲ−２９ｂ１とｍｉＲ−２９ｂ２（「ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ１」と「ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ２」）は同一のものであり、配列：
ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵ
を有する。
成熟ヒトｍｉＲ−２９ｃ（「ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ」）は配列：
ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ
を有する。
マイクロＲＮＡの命名には、マイクロＲＮＡが由来する種を表す３文字の接頭辞を含めるのが従来の方法である。したがって、「ｈｓａ」はヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を表す。上記の成熟ｍｉＲ２９の配列は、馬を含めたほとんどの哺乳動物で同じようにみられるものである。
４つの成熟ガイド鎖はいずれも、標的ｍＲＮＡと結合し配列：
ＡＧＣＡＣＣＡ
を有する同じ「シード」領域を共通に持つ。
ｍｉＲ−２９ガイド鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖であるか、あるいは「パッセンジャー鎖」と呼ばれる第二のＲＮＡオリゴヌクレオチとハイブリダイズしたものであり得る。ハイブリダイズした複合体では、ガイド鎖とパッセンジャー鎖が互いに逆並行になっており、「二本鎖ｍｉＲ−２」と呼ばれることがある。（ガイド鎖が分離して存在する場合、「一本鎖ｍｉＲ−２９」と呼ばれることがある。）
パッセンジャー鎖とガイド鎖には多数のミスマッチが含まれている場合があり、その結果、一方または両方の鎖のヌクレオチドがすべて他方の鎖の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズするわけではない。したがって、二本鎖ｍｉＲ−９６は、１つまたは複数のバルジ（バルジとは、１本のみの鎖にみられる対形成していない１つのヌクレオチドまたは対形成していない複数の連続するヌクレオチドのことである）または内部ループ（両鎖で相対する対形成していないヌクレオチド）を含み得る。ほかにも、末端の１つまたは複数のヌクレオチドが対形成していない場合がある。
パッセンジャー鎖は、ガイド鎖のシード配列に１００％相補的であり得る。
天然のヒトパッセンジャー鎖は配列：
ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ（ｍｉＲ２９ａ）
ＧＣＵＧＧＵＵＵＣＡＵＡＵＧＧＵＧＧＵＵＵＡＧＡ（ｍｉＲ−２９ｂ１）；
ＣＵＧＧＵＵＵＣＡＣＡＵＧＧＵＧＧＣＵＵＡＧ（ｍｉＲ−２９ｂ２）；および
ＵＧＡＣＣＧＡＵＵＵＣＵＣＣＵＧＧＵＧＵＵＣ（ｍｉＲ−２９ｃ）
を有する。
二本鎖ｍｉＲ−２９の一方または両方の鎖が、例えば１ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドの３’オーバーハングを含み得る。つまり、鎖の３’末端にある１つまたは２つのヌクレオチドが相補鎖の最も５’側のヌクレオチド（対形成していない任意の末端ヌクレオチドを含む）を超えて伸長しており、このため、相補鎖に対応するヌクレオチドがない。例えば、両方の鎖が１ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドの３’オーバーハングを含み得る。あるいは、複合体は、一端または両端が平滑末端であり得る。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と同じ長さであるか、あるいは２本の鎖の間のミスマッチの程度および任意の３’オーバーハングの長さに応じて、長さが例えば最大５ヌクレオチドまたはそれ以上異なる。
ｍｉＲ−２９の前駆体は、３つのアイソフォームのうちのいずれかのｐｒｅ−ｍｉｒ−２９およびｐｒｉ−ｍｉｒ−２９ならびにプロセシングを受けて成熟ｍｉＲ−２９（一本鎖であるか二本鎖であるかを問わない）になり得るそのフラグメントおよび変異体を含む。
「ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９」という用語は、任意の完全長哺乳動物ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９配列またはループ配列によって全体もしくは一部がガイド配列に相補的な対応するパッセンジャー配列と接続された成熟ｍｉＲ−２９ガイド配列を含むそのフラグメントもしくは変異体からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドを指すのに使用され、ここでは、オリゴヌクレオチドは、ガイド配列とパッセンジャー配列が互いにハイブリダイズするステムループ構造（または「ヘアピン」）を形成することが可能である。
ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９は、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼ（ＩＩＩ型ＲＮアーゼ酵素）であるＤｉｃｅｒの基質としての役割を果たし、プロセシングを受けて成熟二本鎖ｍｉＲ−２９になることが可能である。
完全長哺乳動物ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９配列はヒト配列：
ＡＵＧＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧＡＧＵＣＡＡＵＡＵＡＡＵＵＵＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡＵ（ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ａ：選択肢（ｉ））；
ＡＵＧＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧＡＧＵＣＡＡＵＡＵＡＡＵＵＵＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡＵＡＡＵＧＡＵＵＧＧＧＧ（ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ａ：選択肢（ｉｉ））；
ＣＵＵＣＡＧＧＡＡＧＣＵＧＧＵＵＵＣＡＵＡＵＧＧＵＧＧＵＵＵＡＧＡＵＵＵＡＡＡＵＡＧＵＧＡＵＵＧＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵＣＵＵＧＧＧＧＧ（ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ｂ１）；
ＣＵＵＣＵＧＧＡＡＧＣＵＧＧＵＵＵＣＡＣＡＵＧＧＵＧＧＣＵＵＡＧＡＵＵＵＵＵＣＣＡＵＣＵＵＵＧＵＡＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵＵＵＡＧＧＡＧ（ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ｂ２）；および
ＡＵＣＵＣＵＵＡＣＡＣＡＧＧＣＵＧＡＣＣＧＡＵＵＵＣＵＣＣＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧＡＧＵＣＵＧＵＵＵＵＵＧＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡＵＧＡＵＧＵＡＧＧＧＧＧＡ（ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ｃ）
を含む。
対応する成熟ガイド鎖配列には下線が施されている。
ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９は、示される配列と比較して、成熟配列外に１つまたは複数の改変を有し得る。
成熟配列の上流（５’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
例えば、ｍｉＲ−２９ａ成熟配列の上流（５’）にある配列は、対応する５’ヒト配列と最適に整列させたとき、これと最大２０ヌクレオチド、例えば１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチドまたは２０ヌクレオチド異なり得る。
ｍｉＲ−２９ｂ１またはｍｉＲ−２９ｂ２成熟配列の上流の配列は、対応する５’ヒト配列と最適に整列させたとき、これと最大２５ヌクレオチド、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチドまたは２５ヌクレオチド異なり得る。
ｍｉＲ−２９ｃ成熟配列の上流にある配列は、対応する５’ヒト配列と最適に整列させたとき、これと最大２５ヌクレオチド、例えば１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチドまたは２５ヌクレオチド異なり得る。
成熟配列の下流（３’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
ｍｉＲ−２９ａ成熟配列の下流（３’）にある配列は、３’ヒト配列と同じであっても異なっていてもよい。この配列は、上に示した２つの配列のうち短い方の配列、すなわち選択肢（ｉ）にみられるヌクレオチドと異なるヌクレオチドであり得る。この配列は、選択肢（ｉ）に示される配列よりも長いものであり得る。例えば、この配列は、上に示した（ｉｉ）の対応する３’配列と最大６ヌクレオチド異なり得る。
ｍｉＲ−２９ｂ１またはｍｉＲ−２９ｂ２成熟配列の下流（３’）にある配列は、対応する３’ヒト配列と最適に整列させたとき、これと最大４ヌクレオチド、例えば１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチドまたは４ヌクレオチド異なり得る。
ｍｉＲ−２９ｃ成熟配列の下流（３’）にある配列は、対応する３’ヒト配列と最適に整列させたとき、これと最大７ヌクレオチド、例えば１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチド異なり得る。
「ｐｒｉ−ｍｉｒ−２９」という用語は、任意の完全長哺乳動物ｐｒｉ−ｍｉｒ−２９配列またはｐｒｅ−ｍｉｒ−２９配列を含み、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼ（ＩＩＩ型ＲＮアーゼ酵素）であるＤｒｏｓｈａによるプロセシングを受けてｐｒｅ−ｍｉｒ−２９配列になることが可能なそのフラグメントもしくは変異体からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドを指すのに使用される。
単一の転写産物は、プロセシングを受けて２つ以上のｍｉｒ−２９分子、そのミミックまたは前駆体になることが可能なものであり得る。
ｈｓａ−ｍｉｒ２９ａおよびｍｉｒ２９ｂ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ１５４３５３（ＥＵ１５４３５３．１ ＧＩ：１６１８２４３７７）を有する転写産物の最終エキソンにコードされている。ｍｉｒ２９ａおよびｍｉｒ２９ｂ１をコードする領域とこれに隣接する配列を下に示す。（Ｈｓａ−ｍｉｒ２９ａは太字の大文字フォントで示されており、成熟ｍｉＲ−２９ａ配列には下線が施されている。Ｈｓａ−ｍｉｒ２９ｂは太字フォントで示されており、ｍｉＲ−２９ｂには下線が施されている。）
Figure 2017503859
ｈｓａ−ｐｒｉ−ｍｉＲ２９ｂ２およびｈｓａ−ｐｒｉ−ｍｉｒ２９ｃは下に示す単一の転写産物にコードされている。ｈｓａ−ｍｉｒ２９ｂ２は太字フォントで示されており、成熟ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ２には下線が施されている。ｈｓａ−ｍｉｒ２９ｃは太字の太字フォントで示されており、成熟ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃには下線が施されている。
Figure 2017503859
Figure 2017503859
したがって、ｐｒｉ−ｍｉｒ−２９は２つ以上の成熟ｍｉＲ−２９またはミミック配列を含み得る。例えば、ｐｒｉ−ｍｉｒ−２９は、ｍｉＲ−２９ａとｍｉＲ−２９ｂ１もしくはそのミミックまたはｍｉＲ−２９ｂ２とｍｉＲ−２９ｃもしくはそのミミックを含み得る。
あるいは、ｐｒｉ−ｍｉｒ−２９は、そのミミックの成熟ｍｉＲ−２９配列を１つのみ含み得る。
ｐｒｉ−ｍｉｒ−２９は、上に示したｐｒｉ−ｍｉｒ−２９配列のいずれかまたは成熟ｍｉＲ−２９配列のうちの１つを含むこれらの配列のうちの１つのフラグメントと少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
ｐｒｉ−ｍｉｒ−２９は、示される配列と比較して、成熟配列外または天然のｐｒｅ−ｍｉｒ−２９配列外に１つまたは複数の改変を有し得る。
例えば、成熟配列の上流（５’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９配列の上流（５’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
成熟配列の下流（３’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
天然のｐｒｅ−ｍｉｒ−２９配列の下流（３’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
ｍｉＲ−２９前駆体は、それがプロセシングを受けて成熟ｍｉＲ−２９（一本鎖であるか二本鎖であるかを問わない）になり得る限り、任意の適切な長さであってよい。したがって、ｍｉＲ−２９ａ前駆体は、長さが少なくとも２３ヌクレオチドであり、ｍｉＲ２９ｂ前駆体は、長さが少なくとも２４ヌクレオチドであり、ｍｉＲ−２９ｃ前駆体は、長さが少なくとも２５ヌクレオチドである。
ｍｉＲ２９前駆体は、長さが少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも４５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも５５ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも６５ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも７５ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも８５ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチド、少なくとも９５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１１０ヌクレオチド、少なくとも１２０ヌクレオチド、少なくとも１３０ヌクレオチド、少なくとも１４０ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも２５０ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも３５０ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも４５０ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチドまたは少なくとも２０００ヌクレオチドであり得る。
あるいは、前駆体は、長さが最大２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１５００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチドまたは２５００ヌクレオチドであり得るが、さらに長い前駆体転写産物も考えられる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、任意の特定の長さを示すことを意図するものではなく、単に任意の単一の連続して連結されたヌクレオチド鎖を指すのに使用されるものであることに留意するべきである。
ｍｉＲ−２９ミミックおよびその前駆体
ｍｉＲ−２９ミミックとは、天然に存在するｍｉＲ−２９と比較して、構造または配列に１つまたは複数の改変を有するが、ｍｉＲ−２９によって調節されるｍＲＮＡのｍｉＲ−２９結合部位とハイブリダイズする能力およびこのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害するか、その分解を促進して、例えば、そのｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を阻害する能力を保持している、オリゴヌクレオチドのことである。ｍｉＲ−２９によって調節されるｍＲＮＡとしては３型コラーゲン（Ｃｏｌ３ａ１）が挙げられる。
ｍｉＲ−２９結合部位としては：
ＣＣＡＵＵＵＵＡＵＡＣＣＡＡＡＧＧＵＧＣＵＡＣ（Ｃｏｌ１ａ１ ｍＲＮＡ由来）；
ＵＧＵＵＣＡＵＡＡＵＡＣＡＡＡＧＧＵＧＣＵＡＡ（Ｃｏｌ１ａ２ ｍＲＮＡ由来）；および
ＵＵＣＡＡＡＡＵＧＵＣＵＣＡＡＵＧＧＵＧＣＵＡ（ｃｏｌ３ａ１ ｍＲＮＡ由来）
が挙げられる。
ｍｉＲ−２９ミミックオリゴヌクレオチドは通常、長さが１５〜３５ヌクレオチド、例えば、長さが１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２５ヌクレオチド、１８〜２５ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、例えば２０〜２３ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチドまたは２３ヌクレオチドである。
ｍｉＲ−２９ミミックは、天然のｍｉＲ−２９成熟配列のうちの１つと比較して、塩基配列、ヌクレオチドの構造および／または骨格の結合が異なり得る。
ｍｉＲ−２９ミミックは、天然のシード配列：
ＡＧＣＡＣＣＡ
と同一であり得るか、天然のシード配列と最大３つの位置、例えば２つ以下の位置、例えば１つ以下の位置で異なり得る、シード配列を含む。好ましくは、シード配列は示されるシード配列と同一である。
ｍｉＲ−２９ミミックは、天然の成熟ｍｉＲ−２９ガイド配列、例えば：
ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ）；
ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ１およびｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ２）；もしくは
ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ）；など
（上記の各配列のシード配列には下線が施されている）；
を有するオリゴヌクレオチドまたは天然の成熟配列と：
（ｉ）シード配列内の３つ以下の位置；および
（ｉｉ）シード配列外の５つ以下の位置
で異なるオリゴヌクレオチドを含むか、これよりなるものであり得る。
したがって、ミミックシード配列は、天然のシード配列と３つ以下の位置、例えば２つ以下の位置、例えば１つ以下の位置で異なる。好ましくは、シード配列は天然のシード配列と同一である。
上記のものに加えて、またはこれに代えて、ミミックは、シード配列外の天然の配列と５つ以下の位置、例えば４つ以下の位置、３つ以下の位置、２つ以下の位置、例えば１つ以下の位置で異なる。
ｍｉＲ−２９ミミックは第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし得る。天然のｍｉＲ−２９と同じく、活性なオリゴヌクレオチドは「ガイド鎖」、その結合オリゴヌクレオチドは「パッセンジャー鎖」と呼ばれ得る。ハイブリダイズした複合体は、二本鎖ｍｉＲ−２９ミミックと呼ばれ得る。
ミミックパッセンジャー鎖の配列は、天然のパッセンジャー鎖の配列と同一であっても、あるいは天然のパッセンジャー鎖と１つまたは複数の位置で異なっていてもよい。例えば、ミミックパッセンジャー鎖の配列は、天然のパッセンジャー鎖と１０個以下の位置、９つ以下の位置、８つ以下の位置、７つ以下の位置、６つ以下の位置、５つ以下の位置、４つ以下の位置、３つ以下の位置、２つ以下の位置または１つ以下の位置で異なり得る。
二本鎖ｍｉＲ−２９ミミックの一方または両方の鎖が、１ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含み得る。例えば、両方の鎖が２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含み得る。あるいは、複合体は、一端または両端が平滑末端であり得る。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と同じ長さであるか、長さが１ヌクレオチドまたは２ヌクレオチド異なる。
ｍｉＲ−２９ミミックの前駆体とは、標的細胞内で通常、酵素Ｄｉｃｅｒの作用によって、あるいは酵素ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒの連続的な作用によってプロセシングを受けて、上で定義したｍｉＲ−２９ミミックになり得る、任意の分子のことである。
したがって、前駆体は、ミミック配列の上流（５’）および／または下流（３’）に追加のオリゴヌクレオチド配列を有し得る。
前駆体は、ループ配列によって全体または一部がガイド配列に相補的な対応するパッセンジャー配列と接続されたｍｉＲ−２９ミミックガイド配列を含み得るものあり、ここでは、オリゴヌクレオチドは、ガイド配列とパッセンジャー配列が互いにハイブリダイズするステムループ構造（または「ヘアピン」）を形成することが可能である。このようなオリゴヌクレオチドはｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ミミックと見なされ得るものであり、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼ（ＩＩＩ型ＲＮアーゼ酵素）であるＤｉｃｅの基質としての役割を果たし、プロセシングを受けて、分離したガイド鎖とパッセンジャー鎖とを含む二本鎖ｍｉＲ−２９ミミックになることが可能である。
成熟配列の上流（５’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
成熟配列の下流（３’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
あるいは、前駆体は、ｐｒｉ−ｍｉｒ−２９ミミックであり（すなわち、ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ミミック配列の上流（５’）および／または下流（３’）に追加のオリゴヌクレオチド配列を有する）、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼ（ＩＩＩ型ＲＮアーゼ酵素）であるＤｒｏｓｈａによるプロセシングを受けてｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ミミック配列になることが可能なものであり得る。
例えば、成熟ｍｉＲ−２９ミミック配列の上流（５’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ミミック配列の上流（５’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
成熟ｍｉＲ−２９ミミック配列の下流（３’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ミミック配列の下流（３’）にある配列は、対応するヒト配列と例えば、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
ｍｉＲ−２９ミミック前駆体は、それがプロセシングを受けて成熟ｍｉＲ−２９ミミック（一本鎖であるか二本鎖であるかを問わない）になり得る限り、任意の適切な長さであってよい。したがって、前駆体は、長さが少なくとも２３ヌクレオチドであるほか、長さが少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも４５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも５５ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも６５ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも７５ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも８５ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチド、少なくとも９５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１１０ヌクレオチド、少なくとも１２０ヌクレオチド、少なくとも１３０ヌクレオチド、少なくとも１４０ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも２５０ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも３５０ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも４５０ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチドまたは少なくとも２０００ヌクレオチドであり得る。
あるいは、前駆体は、長さが最大２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１５００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチドまたは２５００ヌクレオチドであり得る。
構造改変
上記の配列改変に加えて、またはこれに代えて、ｍｉＲ−２９ミミックまたはその前駆体は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して１つまたは複数の構造改変を含み得る。
ｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体は、改変糖残基、すなわちリボース残基以外の糖を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。このような改変糖残基の例としては、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース、２’−フルオロ−リボースおよび４−チオ−リボースならびに二環式糖が挙げられる。二環式糖は通常、環をＣ３’エンド構造に制限する２’，４’架橋（例えば、メチレン架橋）を有するフラノシル環を含む。二環式糖を含むヌクレオチドはロックト核酸（「ＬＮＡ」）残基と呼ばれることが多い。
ｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体は、上に挙げた種類の改変糖残基のいずれかまたはすべてのうちの１つまたは複数を独立して含み得る。例えば、ミミックは、改変糖残基を１個、２個、３個、４個、５個、最大１０個、最大１５個、最大２０個またはそれ以上含み得る。ある特定の実施形態では、全ヌクレオチドが改変糖残基を含む。
上記のものに加えて、またはこれに代えて、ｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体は、１つまたは複数の骨格改変、例えば、改変ヌクレオシド間結合を含み得る。
したがって、１つまたは複数の隣接したヌクレオチドが、リン酸部分の代わりに代替的結合部分を介して結合し得る。
改変ヌクレオシド間結合は、ｍｉＲ−２９ミミックの一端または両端、すなわち、５’末端ヌクレオチドとこれに隣接するヌクレオチドとの間および／または３’末端ヌクレオチドとこれに隣接するヌクレオチドとの間に存在するのが特に好ましいものであり得る。
ヌクレオシド間結合として用いるのに適した部分としては、ホスホロチオアート部分、モルホリノ部分およびホスホノカルボキシラート部分のほかにも、シロキサン部分、スルフィド部分、スルホキシド部分、スルホン部分、アセチル部分、ホルムアセチル部分、チオホルムアセチル部分、メチレンホルムアセチル部分、チオホルムアセチル部分、アルケニル部分、スルファマート部分、メチレンイミノ部分、メチレンヒドラジノ部分、スルホナート部分およびスルホンアミド部分が挙げられる。
ホスホロチオアート部分では、非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換わっている。ホスホロチオアート基は、血清タンパク質結合を促進し得るため、ミミックのｉｎ ｖｉｖｏ分布およびバイオアベイラビリティを改善し得る。このことは、ミミックを被投与者に全身投与する場合に望ましいものであり得る。
上記のものに加えて、またはこれに代えて、ｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体は、天然に存在するアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルに代わるものとして、１つまたは複数の改変塩基を含み得る。このような改変塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルをはじめとするアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルをはじめとするアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンをはじめとするピリミジン塩基のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルをはじめとする８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（５−ブロモ、５−トリフルオロメチルをはじめとする５−置換ウラシルおよびシトシンを含む）、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。
パッセンジャー鎖の改変が多いほど、それがＲＩＳＣ複合体に組み込まれる可能性が低くなり、このため、ガイド鎖の効果が高くなることが示唆されている。したがって、ガイド鎖が天然のｍｉＲ−２９であっても、パッセンジャー鎖が１つもしくは複数の改変、例えば、１つもしくは複数の改変糖残基、１つもしくは複数の改変ヌクレオシド間結合および／または１つもしくは複数の改変塩基を含むのが望ましいものであり得る。
上記のものに加えて、またはこれに代えて、ｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体は、標的細胞の細胞膜を横断して通過するのを促進する膜通過部分を含み得る。この部分は、特に限定されないがコレステロール部分およびステアロイル部分を含めた、適切な脂質部分をはじめとする脂肪部分であり得る。
これ以外の膜通過部分としては、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」、例えばＨＩＶ−１のＴＡＴおよびＭＰＧ、ペネトラチン、ポリアルギニンなど）および膜融合ペプチド（例えば、ＨＩＶ−１エンベロープ（ＨＧＰ）のエンドドメイン誘導体またはインフルエンザ膜融合ペプチド（ｄｉＩＮＦ−７））が挙げられる。膜通過部分をｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体そのものと非共有結合的に結合する担体分子とコンジュゲートしてもよい。あるいは、膜通過部分をｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体そのものとコンジュゲートしてもよい。
膜通過部分は、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖のいずれとコンジュゲートしてもよいが、ガイド鎖の機能を損なわないためにはパッセンジャー鎖が好ましい。５’末端でのコンジュゲーションまたは３’末端でのコンジュゲーションのいずれも好ましいものであり得るが、内部の残基とのコンジュゲーションも可能である。
誤解を避けるために、ｍｉＲ−２９分子（すなわち、ほかに天然の分子と構造的にも配列的にも全く差がない）は、膜通過部分と連結されている場合、ｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体であると見なされる。
ｍｉＲ−２９ミミックの一例にはガイド鎖：
５’−ｒＵｒＡｒＧｒＣｒＡｒＣｒＣｒＡｒＵｒＣｒＵｒＧｒＡｒＡｒＡｒＵｒＣｒＧｒＧｍＵｍＵｍＡ−３’
であり、配列中、「ｒ」はリボース糖を表し、「ｍ」は２’−Ｏ−メチルリボースを表す。
ガイド鎖は、パッセンジャー鎖と組み合わさった二本鎖ｍｉＲ−２９ミミックの一部であり得る。適切なパッセンジャー鎖の例には：
５’ｍＡｍＣｒＣｍＧｒＡｍＵｒＵｍＵｒＣｍＡｒＧｍＡｒＵｍＧｒＧｍＵｒＧｍＣｒＵＡ−３’
および
５’−ｍＡｍＣｒＣｍＧｒＡｍＵｒＵｍＵｒＣｍＡｒＧｍＡｒＵｍＧｒＧｍＵｒＧｍＣｒＵｍＡｄＧ−３’
がある。
ｍｉＲ−２９、ミミックおよび前駆体の送達
ｍｉＲ−２９、ミミックおよび前駆体が適切な担体と結合した（例えば、担体と複合体を形成しているか、担体に封入された）組成物が提供され得る。
適切な担体としては、薬学的に許容される脂質およびポリマーならびにその組合せが挙げられる。例えば、組成物は、リポソーム、脂質小胞、脂質複合体またはポリマー複合体の形態を有し得る。
例えば、脂質小胞およびリポソームは、オリゴヌクレオチドカーゴを含んだ水性コアを有する脂質二重層粒子である。
脂質複合体（または「リポプレックス」）およびポリマー複合体（「ポリプレックス」）には通常、正に帯電した脂質またはポリマーが含まれており、これが負に帯電したオリゴヌクレオチドと相互作用して複合体を形成する。
カチオン性のポリマーまたは脂質はほかにも、標的細胞の表面にある負荷電分子と相互作用し得る。脂質および頭部基を適切に選択することにより、標的細胞の細胞膜または選択した内部膜（エンドソーム膜または核膜など）との融合を容易にするよう複合体を適合させて、しかるべき細胞内区画へのオリゴヌクレオチドカーゴの送達を容易にすることができる。リポプレックスおよびポリプレックスによる遺伝子送達については、例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．４０（２０１０）１５９−１７０でＴｒｏｓ ｄｅ Ｉｌａｒｄｕｙａらにより概説されている。
ほかにも、中性脂質エマルジョンを用いて、直径がナノメートルの桁となるｍｉＲＮＡとの粒子状複合体を形成させ得る。
しかるべき脂質は、用途、カーゴおよび標的細胞に応じて当業者により選択され得る。単一の脂質を用いても、あるいはより一般的に、脂質を組み合わせて用いてもよい。
例えば国際公開第２０１１／０８８３０９号およびそこに引用されている参考文献には、適切な脂質が記載されており、これには以下のものが含まれる：
−中性脂質およびリン脂質、例えばスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファトジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＯＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、スフィノゴミエリン（ｓｐｈｉｎｏｇｏｍｙｅｌｉｎ）（ＳＭ）、カルジオリピン、ホスホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトオレオイル−ＰＥ、ジフィタノイル−ＰＥ、ＤＳＰＥ、ジエライドイル−ＰＥ、ジリノレオイル−ＳＭおよびジリノレオイル−ＰＥなど；
−ステロール、例えばコレステロール；
−ポリマー修飾脂質、例えば、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンおよびＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンを含めたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質。特に適切なものとして、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロール、例えば、ＰＥＧ−ジジミリストイルグリセロール（ｄｉｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、ＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）およびＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン（ＰＥＧ−ｃＤＭＡ）；
−カチオン性脂質、例えばＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃ１」）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１−リノレオイル−２−リノエイルオキシ（ｌｉｎｏｅｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）および２，２−ジリノレイル−４−１０ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）など。市販されているカチオン性脂質の調製物としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥとを含む、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社から入手可能）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥとを含む、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社から入手可能）が挙げられる。
−ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノロアミン（ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンおよびリシルホスファチジルグリセロールを含めたアニオン性脂質。
国際公開第００７１０９６号には、ＤＯＴＡＰ：オリゴヌクレオチド送達に効率的に使用し得るコレステロールまたはコレステロール誘導体などの様々な製剤が記載されている。
ｍｉＲＮＡを肺に良好に送達することが可能な市販の組成物には、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリンと、スクアレン油と、ポリソルベート２０と、抗酸化剤とからなる中性脂質エマルジョン、ＭａｘＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ＲＮＡＬａｎｃｅｒＩＩ（ＢＩＯＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、オースティン、テキサス州）がある。この組成物は、合成ｍｉＲＮＡとの複合体において直径がナノメートルの範囲内のナノ粒子を形成する。
適切なポリマーとしては、ヒストンおよびプロタミン（およびその他のＤＮＡ結合タンパク質）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーなどのカチオン性デンドリマー、２−ジメチル（アミノエチル）メタクリラート（ｐＤＭＡＥＭ）、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、キトサンなどの炭水化物系ポリマーなどが挙げられる。概説については、Ｔｒｏｓ ｄｅ ＩｌａｒｄｕｙａらのＥｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．４０（２０１０）１５９−１７を参照されたい。
このほか、アテロコラーゲンなどのタンパク質およびペプチドを使用することができる。アテロコラーゲンは、プロテアーゼ処理、特にペプシン処理した仔ウシ真皮由来Ｉ型コラーゲンによって得られる水溶性型のコラーゲンである。
このほか、シクロデキストリンを送達に用いてもよい。
標的化剤
担体分子はほかにも、標的細胞の表面に結合することが可能な標的化剤を運搬し得る。例えば、標的化剤は、標的腱細胞の表面に発現する分子と特異的に結合することが可能な特異的結合パートナーであり得る。適切な結合パートナーとしては、細胞表面分子またはこのような細胞表面分子のリガンドもしくは受容体に対する抗体などが挙げられる。腱細胞への標的化を補助し得る表面マーカーとしては、テネイシンＣ、ＣＤ５５およびテノモジュリンが挙げられる。
「特異的結合ペア」という用語は、互いに特有の特異性を有し、通常条件では他の分子との結合よりも優先的に互いに結合する特異的結合メンバー（ｓｂｍ）とその結合パートナー（ｂｐ）とを含む、１対の分子を表すのに使用される。特異的結合ペアの例には、抗体とそのコグネイトエピトープ／抗原、リガンド（ホルモンなど）と受容体、アビジン／ストレプトアビジンとビオチン、レクチンと炭水化物および相補的なヌクレオチド配列がある。
全抗体のフラグメントが抗原結合機能を発揮し得ることはよく知られている。機能的結合フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ，ＶＨ，ＣＬおよびＣＨ１の各ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬドメインとＶＨドメインとからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインとを結合させて抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーによって両ドメインが連結された、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号）ならびに（ｉｘ）遺伝子融合により構築された多価または多重特異性フラグメントである「ダイアボディ」（国際公開第９４／１３８０４号；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４−６４４８，１９９３）がある。
抗体は多数の方法で改変することができるため、したがって、「抗体」という用語は、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有する任意の特異的結合物質に適用されるものとして解釈されるべきである。したがって、この用語は、上記の抗体フラグメントのほかにも、天然であるか合成であるかを問わず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含めた、抗体の誘導体、機能的同等物およびホモログに適用される。したがって、免疫グロブリン結合ドメインまたはその同等物を含み、別のポリペプチドと融合したキメラ分子が包含される。キメラ抗体のクローニングおよび発現については、欧州特許出願公開第０１２０６９４号および同第０１２５０２３号に記載されている。
抗体の代替物が利用できるようになってきている。いわゆる「親和性タンパク質」または「設計されたタンパク質足場」を特定の標的に対する親和性に合わせて常法により作製することができる。これらは通常、立体構造的に安定または強固なコアを有し、標的に対する親和性を有するよう改変された非免疫グロブリン足場タンパク質を土台とするものである。改変には、足場タンパク質表面における１つまたは複数の表面残基の置換および／または１つまたは複数の残基の挿入が含まれ得る。例えば、標的に対して親和性を有するペプチドを、足場タンパク質の表面ループに挿入しても、あるいは足場タンパク質表面ループの一部または全部の代わりに置き換えてもよい。適切な足場および設計されたその同等物としては：
−ＢＰＴＩ、ＬＡＣ−ＤＩ、ＩＴＩ−Ｄ２（クニッツドメイン足場）；
−ＥＴＩ−ＩＩ、ＡＧＲＰ（Ｋｎｏｔｔｉｎ）；
−チオレドキシン（ペプチドアプタマー）；
−Ｆｎ３（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）；
−リポカリン（ＢＢＰ）（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）；
−アンキリン反復（ＤＡＲＰｉｎ）；
−プロテインＡのＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）；
−ガンマ−Ｂ−クリスタリン／ユビキチン（Ａｆｆｉｌｉｎ）；
−ＬＤＬＲ−Ａ−ドメイン（Ａｖｉｍｅｒ）
が挙げられる。
例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ，ＭおよびＳｋｅｒｒａ，Ａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００９，１３：２４５−２５５ならびにＦｒｉｅｄｍａｎ，ＭおよびＳｔａｈｌ，Ｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）５３：１−２９ならびにそこに引用されている参考文献を参照されたい。
ｍｉＲ−２９、ミミックおよび前駆体をコードする核酸
ｍｉＲ−２９オリゴヌクレオチド、ミミックおよび前駆体を標的細胞に直接送達する代わりに、ｍｉＲ−２９オリゴヌクレオチド、そのミミックまたはいずれかの前駆体をコードする核酸を標的細胞に送達して、標的細胞内でｍｉＲ−２９オリゴヌクレオチド、ミミックまたは前駆体を発現させることが可能である。このような方法は「遺伝子治療」と見なされ得る。
当業者には、核酸が、ＲＮＡからなる、すなわち、改変された塩基、糖およびヌクレオシド間結合のいずれも含まず、ＲＮＡの天然に存在する４つのヌクレオチド成分からなるｍｉＲ−２９、そのミミックおよび前駆体をコードするためのみに使用され得ることが容易に明らかになるであろう。
核酸は通常、ｍｉＲ−２９オリゴヌクレオチド、ミミックまたは前駆体をコードし発現を容易にするしかるべき制御配列と作動可能に連結された核酸配列を含む、発現構築物を含む。制御配列は標的細胞に応じて選択してもよいが、通常、しかるべきプロモーターのほか、任意選択で、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を指令するエンハンサーおよび転写ターミネーター（通常、ポリアデニル化シグナルを含む）を含むものである。
プロモーターは、他の種類の細胞または組織に対して標的細胞または標的組織で優先的または排他的に転写を駆動する、組織特異的プロモーターであり得る。
したがって、プロモーターは、腱細胞で優先的または排他的に転写を駆動するプロモーターであり得る。コラーゲン１ａ１（ｃｏｌ１ａ１）プロモーターが適切なプロモーターの１つであり得る。
標的細胞への核酸の送達
ｍｉＲ−２９、ミミックおよび前駆体をコードする核酸は、任意の好都合な経路によって送達され得る。
核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に送達する方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＮＡ負荷リポソーム、超音波処理および核酸でコートした微粒子（例えば、金またはタングステンマイクロビーズ）を用いるボンバードメントが挙げられる。上記の様々な技術は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの使用に適合させることに成功しているものである。
したがって、核酸は、裸の状態で投与しても、ポリマーまたは脂質などの適切な担体（本明細書の他の箇所に記載されている）とともに（例えば、担体と複合体を形成させるか、それに封入して）投与しても、粒子表面にコーティングして投与してもよい。このような実施形態では、核酸は通常、ＤＮＡである。核酸または担体はこのほか、本明細書の他の箇所に記載されている標的化部分または膜輸送部分を含み得る。これらの方法はいずれも、必要に応じてｍｉＲ９６、前駆体およびミミックそのものの送達に適合させてもよい。
核酸は通常、発現ベクターの形態をとる。当業者であれば、治療的使用（および本明細書に記載される他の用途）に適した核酸発現ベクターを設計することが可能であろう。ベクターには通常、ｍｉＲ−２９、ミミックまたは前駆体をコードし、プロモーター配列および転写終止配列を含めたしかるべき制御配列と作動可能に連結した核酸配列を、具体的な用途に応じて、任意選択でエンハンサー配列、マーカー遺伝子およびその他の配列とともに含む、発現構築物が含まれている。ベクターは、宿主細胞の染色体に組み込むことを目的とするものであっても、エピソーム、例えばプラスミドとして宿主染色体とは独立して存在し複製するものであってもよい。
あるいは、ウイルスベクターを用いて核酸を送達してもよい。
遺伝子送達媒体として任意の適切な種類のウイルスベクターを用い得る。このようなウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルス（特にレンチウイルス）ベクターおよびヘルペスウイルスベクターが挙げられる。アデノウイルスおよびレンチウイルスは、活発に分裂していない細胞内に送達した遺伝子（１つまたは複数）の発現を達成することが可能であることから、特に好ましいものであり得る。
ウイルスベクターは通常、ウイルス構造タンパク質と、標的細胞または標的組織内で遺伝子を発現する機能を有する形態で所望の発現構築物を含む核酸ペイロードとを含む。したがって、遺伝子は通常、プロモーターをはじめとするしかるべき転写調節シグナルと作動可能に連結されている。
アデノウイルスベクターでは、核酸ペイロードは通常、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子である。レトロウイルスベクターでは、核酸ペイロードは通常、一本鎖ＲＮＡである。
核酸ペイロードは通常、それが遺伝子送達媒体にパッケージングされ、標的細胞または標的組織内で適宜プロセシングを受けるのに必要な要素をさらに含む。
アデノウイルスベクターでは、これらはアデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、しかるべきパッケージングシグナルとを含み得る。
レトロウイルスベクターでは、これらは特有の末端配列（いわゆる「Ｒ−Ｕ５」配列および「Ｕ３−Ｒ」配列）とパッケージングシグナルとを含む。末端配列は、逆転写によって生じるプロウイルスの両端に直接反復配列（「長い末端反復配列」または「ＬＴＲ」）を生じさせ、次いでこの配列が宿主細胞ゲノム内へのプロウイルスの組込みを容易にし、それに続く発現を指令する。
核酸ペイロードはほかにも、選択マーカー、すなわち、形質導入細胞の容易な検出を可能にする産物をコードする遺伝子を含み得る。その例としては、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）の遺伝子、可視反応産物（例えば、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）を生じる酵素の遺伝子および抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
ウイルスベクターは通常、複製能がない。つまり、核酸ペイロードには、ウイルスの複製に必要なウイルス遺伝子（およびその他の遺伝子要素）がすべて含まれているわけではない。それでも、ウイルスベクターには、宿主細胞内にペイロードを導入し、コードされるｍｉＲ−２９、ミミックまたは前駆体が発現できるようにペイロードがしかるべきプロセシングを受けるのに必要な構造タンパク質および酵素活性がすべて含まれている。これらが核酸ペイロードによってコードされていない場合は通常、パッケージング細胞系によってこれを補給する。当業者であれば、しかるべきウイルス送達媒体の作製に使用し得る適切な細胞系に精通しているであろう。
したがって、アデノウイルスベクターでは、核酸ペイロードは通常、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３またはＥ４の各領域由来の１つまたは複数の機能的アデノウイルス遺伝子が欠けている。これらの遺伝子は、欠失していてもよく、あるいは別の方法で、例えば、異種遺伝子または選択マーカーを含む転写単位の挿入によって不活性化されていてもよい。
いくつかの実施形態では、核酸は機能的ウイルス遺伝子を全く含まない。したがって、アデノウイルスベクターでは、存在する唯一のウイルス成分がＩＴＲおよびパッケージングシグナルであり得る。
機能的ウイルス遺伝子を全く持たない核酸は、ウイルスタンパク質が合成されたことにより形質導入した標的細胞または標的組織に対する宿主免疫応答が発現するリスクを低下させることから、このような核酸が好ましいものであり得る。
標的細胞上のマーカーと結合することが可能な改変表面タンパク質を有するようにウイルスベクターを設計し、これにより所望の標的細胞に形質導入される可能性を増大させ、他の種類の細胞または組織の非特異的形質導入の可能性を低下させ得る。この方法はシュードタイピングと呼ばれることがある。したがって、ウイルスベクターは、腱細胞上の表面マーカーと結合することが可能な表面タンパク質を含み得る。腱細胞への標的化に役立ち得る表面マーカーとしては、テネイシンＣおよびＣＤ５５が挙げられる。
腱および腱損傷
腱は筋肉と骨とを結びつける結合組織である。筋肉の収縮により生じた力を筋肉そのものから少し離れて付着している骨格構造に伝達する１。
腱は体系的に組織化された複雑な組織であり、いくつかの異なる層を含む。
腱そのものは、様々な種類の細胞、特にテノサイトを含む細胞外マトリックスに埋め込まれた形で約３０％のコラーゲンと２％のエラスチン（湿重量）を含む、ほぼ一軸性の複合体である３。
主要なコラーゲンは直径が大きい（４０〜６０ｎｍ）１型コラーゲンであり、互いに結び付いて強固な線維束を形成している。ほかにも３型コラーゲンが存在し、このコラーゲンはＩ型よりも直径が小さく（１０〜２０ｎｍ）、緩い網状の束を形成している。
コラーゲンは細線維、線維、線維束、束へと（複雑性を増しながら）組織化され、緩くラーゲン性で脂質に富むエンドテノンとして知られる結合組織マトリックスの層がこれを取り囲む４。同じ材料からなるエピテノンと呼ばれる層が腱全体の表面を覆っている。エピテノンは、１型および３型コラーゲン細線維、少しの弾性細線維および滑膜細胞層を含むパラテノンと呼ばれる結合組織に取り囲まれている。一部の腱はさらに腱鞘に取り囲まれている。
腱内にある主要な細胞型はテノサイトと腱芽細胞であり、ともに線維芽細胞様細胞である１４。２つの細胞型はともにコラーゲンを産生し細胞外マトリックスを維持しているため、健常な腱の維持にはその両方が重要である１５。したがって、本明細書で使用される「腱細胞」という用語は、テノサイトと腱芽細胞の両方を包含する。
テノサイトは平坦で先が細くなった細胞であり、縦方向に紡錘形をなし、断面は星状であり、コラーゲン線維の間に列をなしているのがわずかに検出される。テノサイトには細胞外マトリックス全体に及ぶ三次元ネットワークを形成する精巧な細胞突起があり、テノサイトは細胞突起を介してコミュニケートし、また運動性があると思われる。
腱芽細胞はテノサイトの前駆体である。この細胞は紡錘形または星状の細胞であり、長く先細りでエオシン好性の平坦な核を持つ。テノサイトは運動性であり、増殖性が高い。
胚発生の過程で、腱芽細胞、したがってテノサイトは、骨格筋芽細胞、軟骨細胞および骨芽細胞と同じように中胚葉区画から生じる１６。この区画から生じる多能性間葉系前駆細胞の一部は、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子であるスクレラキシスを発現する。しかし、特定の組織を構成する細胞になることが決定されると、スクレラキシスを発現する能力を保持する細胞は腱芽細胞とテノサイトのみとなる。したがって、スクレラキシス遺伝子は、発生の過程で腱系の確立に不可欠であることが明らかになった最初のマスター遺伝子である。テノモジュリンは、発達段階後期（胚令［Ｅ］１７．５）にマウス腱で誘導されるＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、ほかにも成体の腱に観察される。したがって、スクレラキシスは腱芽細胞およびテノサイトの両方のマーカーになるのに対し、テノモジュリンは成熟テノサイトの表面マーカーである１９。
腱損傷は、（特に限定されないが）外傷、機械的ストレス（過使用を含む）、変性、炎症およびその組合せを含めた多数の因子によって引き起こされ得る、あるいはこれらを原因とし得るものであり、「腱障害」と呼ばれることが多い。
「腱傷害」という用語は一般に、外傷および腱断裂（すなわち、腱の完全な破損）を含めた単発的な外傷事象による急性傷害を指すのに使用される。
腱障害は多因子性で、急性から慢性までのスペクトルがあり、多くの場合、瞬間的なものであるか長期間にわたるものであるかを問わず腱の過使用が原因である。腱障害では、顕微鏡ないし肉眼レベルでのコラーゲンの変性をはじめとする機械的損傷（「腱症」と呼ばれることもある）、炎症またはその両方の組合せ（「腱炎」と呼ばれることもある）が起こり得る。
腱の生体力学的特性、特に腱の引張り強度は、断面積（すなわち、太さ）、コラーゲン含有量および異なる種類のコラーゲン間の比と関係がある。急性傷害後、腱障害時および腱損傷の治癒過程では、１型コラーゲンから３型コラーゲンへのコラーゲン合成の変化が起こる。１型コラーゲン合成は最初に低下した後、正常レベルまで回復し得るが、３型の合成の増大が持続すると、長期的なコラーゲン比の不均衡を招く。このことは、腱の生体力学的特性に重大かつ有害な作用を及ぼす。具体的には、腱の引張り強度が低下し、腱の最終破断強度が低下し、ひいてはその後も断裂を起こしやすくなる。
本発明の方法は、損傷を受けたあらゆる腱に適用され得る。ヒトで腱障害が起こる主要な腱には、アキレス腱、棘上筋腱、総屈筋腱および総伸筋腱がある。ウマ対象で腱障害が起こる主要な腱には浅屈筋腱がある。これらは特に重要な治療標的となり得る。
ｍｉＲ−２９、ミミックおよび前駆体の治療的適用
本発明者らは、腱細胞のｍｉＲ−２９活性を増大させることにより、コラーゲンバランスを１型コラーゲン合成に傾き３型コラーゲン合成から離れるよう変化させることが可能であることを明らかにした。
したがって、本発明は、ｍｉＲ−２９の治療的適用によって腱の治癒を調節する方法を提供する。本明細書に記載される方法は、腱における相対的コラーゲン組成および／または合成、特に、腱における１型コラーゲンと３型コラーゲンの相対的含有量および合成を調節する方法と見なされ得る。バランスは、１型コラーゲンに傾くよう、すなわち、腱内のコラーゲン１の合成または含有量が３型コラーゲンよりも増大するよう調節されると考えられる。ｍｉＲ−２９が１型コラーゲン合成を阻害し得ることから、この調節が必ずしも、１型コラーゲンの合成または含有量の純粋な増大を含むものではないことが理解されよう。しかし、３型コラーゲンの合成の方が１型コラーゲンの合成よりも大きく阻害される。
生理的レベルでは、本明細書に記載される方法は、腱の生体力学的特性を調節する、好ましくは腱の生体力学的特性を改善する、例えば腱の引張り強度を改善または増大させる方法と見なされ得る。
本発明の方法は、腱障害のあらゆる段階で、あるいは受傷した腱の治癒過程のあらゆる段階で適用され得る。例えば、腱障害の治癒過程または腱断裂などの急性腱傷害の治癒過程で、この方法を用いてコラーゲン比、ひいては腱の生体力学的特性を調節し得る。
したがって、本発明の方法は同様に、腱傷害および腱障害に起因する損傷を含めた腱損傷を治療する方法と見なされ得る。
受傷後の短い期間および腱障害の初期段階では、腱にＩＬ−３３が観察され得る。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＩＬ−３３は１型コラーゲン合成から３型コラーゲン合成への切替えに関与すると考えられる。しかし、最初にＩＬ−３３が関与した後もコラーゲン合成の不均衡が継続すると考えられる。本発明の方法は、腱傷害の初期段階の治療に限定されず、後期段階の傷害または疾患、例えば慢性腱障害にも同様に適用可能である。
したがって、症状発生後または腱に損傷を引き起こす外傷事象後のあらゆる段階で治療を実施し得る。例えば、症状発生または外傷事象から１日後、２日後、３，日後、４，日後、５日後、６日後、７日後またはそれよりも後に治療を実施し得る。症状発生または外傷事象から１週間後、２週間後、３週間後、４週間後またはそれよりも後に治療を実施し得る。症状発生または外傷事象から１か月後、２か月後、３か月後、４か月後、５か月後、６か月後またはそれよりも後に治療を実施し得る。
治療の対象
治療の対象として最も一般的なのはヒトであるが、本発明の方法は、ヒト以外の霊長類（特に、ゴリラ、チンパンジーおよびオランウータンなどの大型類人猿のほかにも、旧世界ザルおよび新世界ザル）およびげっ歯類（マウスおよびラットを含む）をはじめとする一般的な実験動物、飼育動物および農業動物（特に限定されないが、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどを含む）を含めた他のあらゆる動物に及び得る。
この方法は、特にウマ対象、すなわちウマに適用され得る。ウマ、特に競走馬などの純血馬は特に腱傷害を起こしやすい。関心のある動物の多くに価値があることを考えると、効果的な治療法が長年の間必要とされている。
医薬組成物および治療方法
本明細書に記載される分子は医薬組成物に製剤化することができる。これらの組成物は、上記物質のうちの１つに加えて、薬学的に許容される補形剤、担体、緩衝剤、安定剤をはじめとする当業者に周知の材料を含み得る。このような材料は、無毒性でなければならず、また有効成分の効果に干渉するものであってはならない。担体をはじめとする材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮内または皮下、経鼻、筋肉内および腹腔内の各経路によって左右され得る。投与に適した組成物および方法の例については、ＥｓｓｅｋｕおよびＡｄｅｙｅｙｅ（２０１１）ならびにＶａｎ ｄｅｎ Ｍｏｏｔｅｒ Ｇ．（２００６）に記載されている。
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたは補助剤などの固体担体を含み得る。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理的食塩水、デキストロースをはじめとする糖類の溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含ませてもよい。
静脈内、皮内もしくは皮下への注射または患部への注射には、有効成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態となる。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張溶媒を用いて、適切な溶液を調製することが十分可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／またはその他の添加剤を含ませてもよい。
治療する病態の局所性を考慮すると、局所注射による投与が特に適切なものであり得る。注射は罹患腱に実施しても、罹患腱のごく近傍に実施してもよい。
個体に投与する活性薬剤の性状（例えば、本発明による細胞、ポリペプチド、核酸分子、その他の薬学的に有用な薬剤）に関係なく、投与は、個体に対して有益性を示すのに十分な量である「予防有効量」または「治療有効量」（場合によるが、予防は治療と見なされ得る）であるのが好ましい。実際の投与量、投与の速度および経時変化は、治療するものの性状および重症度に左右される。治療の処方、例えば用量の決定などは、一般開業医をはじめとする医師および獣医師の責任の範囲内にあり、通常、治療する障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法をはじめとする医師に公知の因子が考慮に入れられる。上記の技術およびプロトコルの例については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第２０版，２０００年出版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに記載されている。
これより、限定するものではなく例として、添付図面および実施例を参照しながら、本発明をさらに詳細に説明する。
腱におけるＩＬ−３３／ＳＴ２発現を示す図である。腱試料における（Ａ）ＩＬ−３３、（Ｂ）可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）及ぼす（Ｃ）膜ＳＴ２（ｍＳＴ２）の遺伝子発現。対照（ｎ＝１０）、断裂棘上筋およびマッチした肩甲下筋ヒト腱試料（ｎ＝１７）におけるＩＬ−３３、可溶性／膜ＳＴ２の遺伝子発現の変化倍数。示されるデータの点はハウスキーピング遺伝子１８Ｓに対する相対発現量である（二連分析の平均値）。平均±ＳＤはｔ検定による患者集団比較を表す。（Ｄ）腱試料の改変Ｂｏｎａｒスコアリングを平均およびＳＥＭとともに示したもの。対照腱腱（Ｃｔｌ）はｎ＝１０、断裂腱および初期腱障害はｎ＝１７である。改変Ｂｏｎａｒスコアリング法は、１０例の高倍率視野に基づく１試料当たりの平均スコアを示す。０＝染色が認められない、１＝高倍率視野１例当たりのポジティブ染色細胞が１０％未満である、２＝同ポジティブ染色細胞が１０〜２０％である、３＝同ポジティブ染色細胞が２０％超である。（Ｅ）ＴＮＦα単独、ＩＬ−１β単独および両者の組合せをそれぞれ投与してインキュベートした２４時間後のＩＬ−３３およびＳＴ２の遺伝子発現の変化倍数。データは三連試料の平均±ＳＤで示されており、さらに３例の個々の患者試料で実施した実験の代表的なものである。対照試料と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。（Ｆ）５０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−３３を加えてインキュベートした２４時間後のｃｏｌ１およびｃｏｌ３の遺伝子発現の変化倍数。（Ｇ）１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３３とのインキュベーション後のｃｏｌ１遺伝子およびｃｏｌ３遺伝子発現の経時変化。（Ｈ）ｒｈＩＬ−３３を漸増させてインキュベートした２４時間後のコラーゲン１型および３型タンパク質の発現。Ｆ、ＧおよびＨでは、データは３連試料の平均±ＳＤで示されており、さらに３例の個々の患者試料で実施した実験の代表的なものである。対照試料と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。 ｉｎ ｖｉｖｏの腱治癒におけるＩＬ−３３／ＳＴ２系を示す図である。（Ａ、Ｂ）受傷後第１日、第３日、第７日および第２１日のＩＬ−３３遺伝子発現および可溶性ＳＴ２遺伝子発現。示されるデータは平均変化倍数±ＳＤである（１グループ当たり４匹のマウスに４回連続して実施して得られたデータをプールしたものであり、したがって、１条件当たりｎ＝１６である）。対照マウスと受傷マウスとの比較で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。（Ｃ、Ｄ）受傷後第１日および第３日におけるＷＴおよびＳＴ２−／−のｃｏｌ１ ｍＲＮＡおよびコラーゲン１型タンパク質のレベル。（Ｅ、Ｆ）受傷後第１日および第３日におけるＷＴおよびＳＴ２−／−のｃｏｌ３ ｍＲＮＡおよびコラーゲン３型タンパク質のレベル。示されるデータは二連試料の平均±ＳＤであり、１条件あたり４匹のマウス（ｎ＝１６）を用いた実験の代表的なものである。対照マウスと受傷マウスとの比較で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。ＷＴ受傷マウスとＳＴ２−／−受傷マウスとの比較で＋ｐ＜０．０５、＋＋ｐ＜０．０１である。（Ｇ）ＷＴおよびＳＴ２−／−の受傷腱および未受傷腱の受傷後第１日および第３日における腱強度の百分率変化。データは平均±ＳＤで示されており、１条件当たり４匹のマウス（ｎ＝１６）を用いた実験の代表的なものである。対照マウスと受傷マウスとの比較で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。ＳＴ２−／−受傷マウスとＷＴ受傷マウスとの比較で＃ｐ＜０．０５である。 ｉｎ ｖｉｖｏの腱損傷において、ＩＬ−３３はコラーゲン３型産生を促進し腱強度を低下させるのに対し、抗ＩＬ−３３はこれらの変化を弱めることを示す図である。ｒｈＩＬ−３３で処置したＷＴマウスおよびＳＴ２−／−マウスの受傷後第１日における（Ａ）ｃｏｌ１ ｍＲＮＡ、（Ｂ）コラーゲン１型タンパク質、（Ｃ）ｃｏｌ３ ｍＲＮＡおよび（Ｄ）コラーゲン３型タンパク質。データは二連試料の平均±ＳＤで示されており、１条件当たり４匹のマウス（ｎ＝１６）を用いた実験の代表的なものである。受傷マウスと未受傷マウスとの比較で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。ＷＴマウスとＳＴ２−／−マウスとの比較で＋ｐ＜０．０５である。（Ｅ）ｒｈＩＬ−３３による治療後第１日および第３日におけるＷＴ未受傷マウスの腱強度の百分率変化。データは平均±ＳＤで示されており、１群当たり４匹のマウス（ｎ＝１６）を用いた実験の代表的なものである。受傷マウスと未受傷マウスとの比較で＊＊ｐ＜０．０１である。ＷＴマウスの腱傷害後第１日および第３日における抗ＩＬ−３３による処置後の（Ｆ）ｃｏｌ１ ｍＲＮＡ、（Ｇ）コラーゲン１型タンパク質、（Ｈ）ｃｏｌ３ ｍＲＮＡおよび（Ｉ）コラーゲン３型タンパク質レベル。（Ｊ）抗ＩＬ−３３処置ＷＴマウスの受傷後第１日および第３日における腱強度の百分率変化。データは平均±ＳＤで示されており、１条件当たり４匹のマウス（ｎ＝１６）を用いた実験の代表的なものである。受傷マウスと未受傷マウスとの比較で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。Ａ〜Ｊでは、データは二連試料の平均±ＳＤで示されており、１条件当たり４匹のマウス（ｎ＝１６）を用いた実験の代表的なものである。 マイクロＲＮＡ２９が可溶性ＳＴ２を直接標的とし、腱疾患におけるコラーゲンマトリックス変化に影響を及ぼすことを示す図である。（Ａ）腱障害テノサイトにｍｉＲ−２９ファミリーの全メンバー（ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−２９ｃ）の発現が認められた（患者試料ｎ＝６）。ΔＣｔ値が低いほど発現レベルが高いことを示す。対照、断裂棘上筋（断裂腱）およびマッチした肩甲下筋腱（初期腱障害）におけるｍｉＲ−２９ファミリー遺伝子の発現。データは二連試料の平均±ＳＤで示されており、患者試料１０例で実施した実験の代表的なものである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−３３を加えた後のｍｉＲ−２９ａ発現の経時変化。（ＣおよびＤ）スクランブルミミック、ｍｉＲ−２９ａミミックまたはｍｉＲ２９ａアンタゴマーをトランスフェクトした後のｃｏｌ１ ｍＲＮＡおよびｃｏｌ３ ｍＲＮＡならびにコラーゲン１型タンパク質およびコラーゲン３型タンパク質の発現。（Ｅ）ｍｉＲ−２９ａミミック／アンタゴマーおよび１００ｎｇ ｒｈＩＬ−３３を加えた後のコラーゲン３型タンパク質レベル。Ｂ〜Ｅでは、示されるデータは二連試料の平均±ＳＤであり、腱外植試料５例で実施した実験の代表的なものである。（ｎ＝５）ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｆ）Ｃｏｌ １ａ１、Ｃｏｌ １ａ２またはＣｏｌ ３ａ１の３’ＵＴＲを含む前駆体ｍｉＲ−２９ａをトランスフェクトした初代ヒトテノサイトのルシフェラーゼ活性。活性は、スクランブルＲＮＡをトランスフェクトした対照を１００％とし、それに対して相対的に求めたものである。これを３つの独立した実験で繰り返した。スクランブル対照と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。（Ｇ）代替的ポリアデニル化部位を強調したｃｏｌ３ａ１およびｃｏｌ１ａ１／ｃｏｌ１ａ２の長型／短型上のｍｉＲ−２９ａ結合部位およびＭＲＥ。（Ｈ）テノサイト（Ｔ）にｍｉＲ−２９ａをトランスフェクトした後の長い／短いコラーゲン転写産物の割合。（Ｉ）スクランブルミミックおよびｍｉＲ−２９ａアンタゴマーをトランスフェクトした後のｃｏｌ１ａ１、ｃｏｌ１ａ２およびｃｏｌ３ａ１ ｍＲＮＡ。示されるデータは二連試料の平均±ＳＤであり、腱外植試料３例で実施した実験の代表的なものである。（ｎ＝３）ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 ＩＬ−３３／ＳＴ２がｉｎ ｖｉｖｏの腱治癒においてｍｉＲ−２９を調節することを示す図である。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞への可溶性ＳＴ２の３’ＵＴＲを含むｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ａと可溶性ＳＴ２の３’ＵＴＲのｍｉＲＮＡ調節エレメント（ＭＲＥ）との共トランスフェクションおよびルシフェラーゼ活性アッセイの結果。スクランブル対照と比較して＊＊＊ｐ＜０．００１（ｎ＝３）である。（Ｂ）スクランブルミミック、ｍｉＲ−２９ａミミックまたはｍｉＲ−２９ａアンタゴマーを加えた後のｓＳＴ２および膜結合ＳＴ２のｍＲＮＡレベル。（Ｃ）ｍｉＲ２９ａミミック／アンタゴマーとインキュベートした後のヒトｓＳＴ２タンパク質産生（ｎｇ／ｍｌ）。（ｎ＝５）ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）受傷後第１日および第３日におけるｍｉＲ−２９ａの平均変化倍数±ＳＤをＷＴ受傷個体とＷＴ未受傷個体とで比較して示した定量的ＰＣＲ。（Ｅ）受傷後第１日におけるｍｉＲ-２９のａｒｈＩＬ−３３またはＰＢＳで処置した後の平均変化倍数±ＳＤをＷＴマウスおよびＳＴ２−／−マウスのの受傷個体とで比較して示した定量的ＰＣＲ。（Ｆ）第１日および第３日における受傷ＷＴ個体の抗ＩＬ−３３を加えた後のｍｉＲ−２９ａ発現。データは二連試料の平均変化倍数±ＳＤで示されており、１グループ当たり４匹のマウスを用いた実験の代表的なものである。（ｎ＝１６）ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 腱病理におけるＩＬ−３３／ｍｉＲ−２９系を示す図である。腱病理におけるＩＬ−３３／ｍｉＲ−２９ａの役割を示す模式図。腱傷害または繰り返される微小断裂が腱細胞にストレスを生じさせることにより、ＩＬ−３３が放出され、下流でＮＦκＢがリン酸化され、次いでｍｉＲ−２９ａが抑制され、コラーゲン３型および可溶性ＳＴ２の産生増大が引き起こされる。コラーゲン３型が増大すると腱の最終引張り強度が低下して破断までの時間が短くなるのに対して、可溶性ＳＴ２はオートクリンで作用し、これが最終的には保護的機序となり得、この系から過剰なＩＬ−３３が除去される。 （Ａ）Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎで予測された２つのｍｉＲ−２９ａ ＭＲＥ部位のシード領域である２９−１および２９−２を示す図である。（Ｂ）Ｃｏｌ １またはＣｏｌ ３の３’ＵＴＲを含む前駆体ｍｉＲ−２９ａ／ｂ／ｃ（ｐｒｅ−ｍｉＲ−２９）とトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のルシフェラーゼ活性を示す図である。活性は、スクランブルＲＮＡをトランスフェクトした対照を１００％とし、それに対して相対的に求めたものである。これを３つの独立した実験で繰り返した。スクランブル対照と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。（Ｃ）可溶性ＳＴ２の３’ＵＴＲを含むｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ａ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｂ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｃのＨＥＫ２９３細胞への共トランスフェクトを示す図であり、ｍｉＲ−２９ａがスクランブルＲＮＡをトランスフェクトした対照に比して相対ルシフェラーゼ活性を有意に低下させることを示している（ｎ＝３）。（Ｄ）短いｃｏｌ３ａ１ ３’ＵＴＲ変異体に存在する残りのｍｉＲ−２９結合部位のｍｉＲ−２９ａに対する感受性をルシフェラーゼアッセイで試験し、完全に活性であることが明らかになったことを示す図である。（Ｅ）ヒトおよびウマ由来のテノサイトコラーゲン転写産物の３’ＲＡＣＥ産物の配列を示す図である。ポリアデニル化シグナルには下線が施されている。ヒトＣｏｌ３ａ１（短い３’ＵＴＲ）転写産物およびウマＣｏｌ３ａ１転写産物においてｍｉＲ２９ａ ＭＲＥがイタリック体で示されている。 ＷＴマウスを腱傷害後にｍｉＲ−２９ａミミックで治療した後の（Ａ）Ｃｏｌ３ ｍＲＮＡ、（Ｂ）コラーゲン３型タンパク質、（Ｃ）Ｃｏｌ１ ｍＲＮＡおよび（Ｄ）コラーゲン１型タンパク質のレベルを示す図である。ｍＲＮＡのデータは、二連試料の１８Ｓハウスキーピング遺伝子に対する遺伝子の総コピー数である。データは二連試料の平均±ＳＤであり、１グループ当たり６匹のマウスの代表的なものである。対照と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。（ＡＮＯＶＡ）。
発明の詳細な説明
材料および方法
腱障害のヒトモデル
手順およびプロトコルはいずれも、ＡＣＥＣ番号９９／１０１の下、倫理委員会の承認を受けたものである。肩の外科手術を受けている回旋筋腱板断裂の患者から棘上筋腱の試料１５例を採取した（表１）。回旋筋腱板断裂患者の平均年齢は５４歳（範囲３５〜７０歳）、断裂の平均の大きさは２．５ｃｍであった。同患者からほかにも、肩甲下筋腱を採取した。術前ＭＲＩスキャン時の肩甲下筋腱障害、関節鏡検査時の肩甲下筋腱の肉眼的損傷のいずれについても臨床的に検出可能な証拠が認められない患者のみを組み入れ、この基準により、患者は厳密に前臨床コホートとなった。回旋筋腱板断裂がなく肩の安定化のための関節鏡下手術を受けている患者から採取した肩甲下筋腱の試料１０例を含む独立した対照群を得た。関節鏡検査により回旋筋腱板断裂がないことを確認した。対照群の平均年齢は３５歳（範囲２０〜４１歳）であった。
組織採取および標本作成
既に記載されている標準的な３点法を用いて、回旋筋腱板の関節鏡下修復術を施行した。既に記載されている通りに、回旋筋腱板断裂の横断面の大きさを推定し記録した３９。関節鏡下、関節唇の側方１ｃｍの位置にある腱の上方境界から肩甲下筋腱を採取した。外科手術による修復を実施する前、断裂部の端１．５ｃｍ以内のところから棘上筋腱を採取した。免疫組織化学染色には、組織試料を直ちに１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンで４〜６時間固定した後、パラフィンに包埋した。Ｌｅｉｃａ−ＬＭミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ドイツ）を用いて厚さ５μｍの切片を薄切し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓガラススライド（Ｇｅｒｈａｒｄ Ｍｅｎｚｅｌ社、ドイツ）に載せた。既に確立されている方法論に従って、キシレンで組織切片からパラフィンを除去し、段階的に濃度を変化させたアルコールで脱水し、組織染色および免疫組織化学染色に用いた４０。
膝屈筋腱ＡＣＬ再建術を受けている患者５例（年齢１８〜３０歳）の膝屈筋腱組織からヒト腱由来細胞を外植した。培養物を５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で２８日間維持した。細胞を継代し、サブコンフルエントになった時点でトリプシン処理した。第三継代細胞および第四継代細胞を正常酸素圧条件下で用いた。
組織学法および免疫組織化学法
ヒト切片をヘマトキシリン／エオシンおよびトルイジンブルーで染色し、Ｂｏｎａｒスコアの改変版による評価で腱障害の程度を判定した４１（グレード４＝著明な腱障害、グレード３＝進行した腱障害、２＝中等度の変性、１＝軽度の変性、０＝正常な腱）。これには、浮腫および変性の有無とともに線維芽細胞の細胞充実性および類軟骨性化生の程度を含めた。次いで、切片を以下のマーカー：ＩＬ−３３（Ａｌｅｘｉｓ社、マウスモノクローナル）、ＳＴ２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、ウサギポリクローナル）、ＩＬ−１ＲａＣＰ（ＰｒｏＳｃｉ社、ウサギポリクローナル）、ＣＤ６８（汎マクロファージ）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ４（Ｔヘルパー細胞）、ＣＤ２０６（Ｍ２マクロファージ）および肥満細胞トリプターゼ（肥満細胞）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ社）に対する抗体で染色した。
３％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２で内因性ペルオキシダーゼ活性を停止させ、ＴＢＳＴ緩衝液に溶かした２．５％ウマ血清で３０分間、非特異的抗体結合をブロックした。マイクロ波中、０．０１Ｍクエン酸緩衝液で２０分間、抗原回復を実施した。切片を２．５％（ｗ／ｖ）ウマ血清／ヒト血清／ＴＢＳＴ中、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。２回洗浄した後、スライドをＶｅｃｔｏｒ ＩｍｍＰＲＥＳＳ Ｒｅａｇｅｎｔキットと製造業者の指示通りに３０分間インキュベートした。スライドを洗浄し、Ｖｅｃｔｏｒ ＩｍｍＰＡＣＴ ＤＡＢ色素原溶液を２分間インキュベートした後、十分に洗浄した。最後に、ヘマトキシリンで切片を対比染色した。それぞれの抗体染色法には、外科手術標本に加えて、ポジティブ対照（ヒト扁桃組織）およびネガティブ対照標本を含めた。一次抗体の省略およびネガティブ対照アイソタイプの使用により染色の特異性を確認した。
本発明者らは、免疫組織化学染色の定量化にこれまでの方法４２を土台としたスコアリング法を適用した。ランダムな１０の高倍率視野（×４００）を３名の無関係な査定者（ＮＬＭ、ＪＨＲ、ＡＬＣ）により評価した。各視野のポジティブ染色細胞とネガティブ染色細胞の数をカウントしてポジティブ細胞の割合を計算し、以下の半定量的段階に分けた；グレード０＝染色が認められない、グレード１＝ポジティブ染色細胞が１０％未満である、２＝ポジティブ染色細胞が１０〜２０％である、グレード３＝ポジティブ細胞が２０％超である。
上記プロトコルに以下のマーカー：ＩＬ−３３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、マウスモノクローナル）、ＳＴ２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、ウサギポリクローナル）、Ｆ４／８０（Ｓｅｒｏｔｅｃ社、マウスモノクローナル）および抗ヒスタミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、ウサギポリクローナル）に対する抗体を用いて、マウス切片を処理した。
マトリックス調節
テノサイトをコラーゲン１型およびコラーゲン３型の免疫細胞化学染色について評価して、テノサイトのマトリックス産生を評価した（Ａｂｃａｍ社）。Ｓｉｒｃｏｌアッセイキット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社、キャリクファーガス、北アイルランド）を製造業者のプロトコル通りに用いて、総可溶性コラーゲン量を測定した。被験試料１００μｌにＳｉｒｃｏｌ色素試薬１ｍｌを加え、室温で３０分間かき混ぜた。１０，０００×ｇで１０分間遠心分離することによりコラーゲン−色素複合体を沈殿させた、次いで、エタノール５００μｌで２回洗浄した。ペレットをアルカリ試薬５００μｌに溶かした。マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。製造業者によって提供されたコラーゲン標準品に基づき検量曲線を作成した。さらに、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトおよびマウスのコラーゲン１型および３型の濃度を評価し、製造業者（ＵＳＣＮＫ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）によって供給された標準品とともにマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける呈色変化を測定した。
シグナル伝達実験
ヒトホスホ−ＭＡＰＫ Ａｒｒａｙ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ社、英国）を製造業者の指示通りに用いて、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ１／２）、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびｐ３８アイソフォームのリン酸化状態を評価した。ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ社（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ社、ドイツ）からＥＲＫ阻害剤（ＦＲ１８０２０４）を購入し、既に本発明者らの研究室で用いてオフターゲット効果に比べ最適な特異的阻害をもたらすことが既に明らかになっている濃度４３、ＩＣ５０＝１０μＭで使用した。
処理済みおよび未処理のテンコサイト（ｔｅｎｃｏｃｙｔｅ）から得られた細胞溶解物にＩｎｓｔａｎｔＯｎｅ ＥＬＩＳＡを用いて、ＮＦκβ ｐ６５のリン酸化を評価した。製造業者によって供給されたポジティブ対照およびネガティブ対照を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。未刺激細胞に対する刺激細胞の相対吸光度を用いて、各試料の総ＮＦκβ ｐ６５量またはリン酸化ＮＦκβ ｐ６５量を評価した。
ＲＮＡ抽出および定量的ＰＣＲ
正常酸素圧下および低酸素圧下での実験から細胞を分離した後、ｍＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ精製には、ＱＩＡｇｅｎミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、クローリー、英国）に製造業者の指示通りにオンカラムＤＮアーゼ段階を組み込んで用いた。ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州、米国）多温度ｃＤＮＡ合成キットを製造業者の指示通りに用いて、ＲＮＡ試料からｃＤＮＡを調製した。プローブをプライマーとともに使用するかどうかによってＳＹＢＲグリーンまたはＴａｑｍａｎ ＦａｓｔＭｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州、米国）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。ＲＮアーゼフリー水を用いてｃＤＮＡを５分の１に希釈した。各試料を三重反復で分析した。プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ベルギー）は以下の通りであった：ＧＡＰＤＨ、５’−ＴＣＧ ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＧＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＴＴ−３’（ｆ）および５’−ＡＣＣ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＡＣ ＴＣＣ ＧＡＣ ＣＴＴ−３’（ｒ）；ヒトＩＬ−３３、ＧＧＡ ＡＧＡ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＣＡ ＡＡＧ ＣＣＴ（ｆ）ＴＡＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＡＧＣ ＧＧＡ ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＡＡ（ｒ）；マウスＩＬ−３３、ＧＧＡ ＡＧＡ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＣＡ ＡＡＧ ＣＣＴ（ｆ）ＴＡＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＡＧＣ ＧＧＡ ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＡＡ（ｒ）；全ヒトＳＴ２、ＡＣＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＴＣ ＴＴＧ ＡＧＴ（ｆ）ＡＣＣ ＴＧＣ ＧＴＣ ＣＴＣ ＡＧＴ ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＴＴ（ｒ）；マウスｓＳＴ２、ＣＣＡ ＡＴＧ ＴＣＣ ＣＴＴ ＧＴＡ ＧＴＣ ＧＧ（ｆ）ＣＴＴ ＧＴＴ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＣＡ ＧＴＣ（ｒ）、ＴＣＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＣＴ ＴＡＡ Ｔ（プローブ）；マウスＳＴ２Ｌ、ＴＣＴ ＧＣＴ ＡＴＴ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＣＴ ＧＣＴ ＴＴＣ、ＴＣＴ ＧＴＧ ＧＡＧ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＡＣ Ｃ（ｒ）ＡＧＡ ＧＡＣ ＣＴＧ ＴＴＡ ＣＣＴ ＧＧＧ ＣＡＡ ＧＡＴ Ｇ（プローブ）；ヒトＳＴ２Ｌ、ＡＣＡ ＡＡＧ ＴＧＣ ＴＣＴ ＡＣＡ ＣＧＡ ＣＴＧ（ｆ）ＴＧＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＴＧ ＡＧＧ ＣＣＡ Ｃ（ｒ）；ＣＣＣ ＣＡＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＴＧＧ ＡＴＴ ＴＧＴ ＡＧＴ ＴＣＣ Ｇ（プローブ）；ヒトｓＳＴ２、ＧＡＧ ＡＣＣ ＴＧＣ ＣＡＣ ＧＡＴ ＴＡＣ ＡＣ（ｆ）ＴＧＴＴＡＡＡＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＣＡＣ（ｒ）、ＣＣＣ ＣＡＣ ＡＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＴＴ ＴＣＴ ＣＣＴ（プローブ）；ヒトＣｏｌ ３Ａ、ＴＴＧ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＣＧ ＡＣＡ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＴＧ（ｆ）ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡ ＧＧＧ ＴＣＡ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＴＴ（ｒ）マウスＣｏｌ ３Ａ、ＧＣＴ ＴＴＧ ＴＧＣ ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＧ（ｆ）ＣＡＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＣＡ ＡＴＴ ＣＡＴ（ｒ）；ヒトＣＯＬ １Ａ１、ＣＣＡ ＴＧＣ ＴＧＣ ＣＣＴ ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＣＣ ＴＴＴ（ｆ）ＣＡＣ ＴＴＧ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＧＡ ＧＣＡ ＴＴＧ ＣＣＴ（ｒ）マウスＣＯＬ １Ａ１、ＴＴＣ ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＡＧＡ ＣＧＧ ＡＣＴ ＣＡＡ（ｆ）ＧＧＡ ＡＧＣ ＴＧＡ ＡＧＴ ＣＡＴ ＡＡＣ ＣＧＣ ＣＡ（ｒ）。
ＲＮＡ単離およびｍｉＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ
ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）により全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ調製にｍｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いた。ヒトｍｉＲ−２９ａ（ＭＳ００００１７０１）、ｍｉＲ−２９ｂ（ＭＳ００００６５６６）およびｍｉＲ−ｃ（ＭＳ００００９３０３）ならびにマウス２９ａ（ＭＳ００００３２６２）、２９ｂ（ＭＳ００００５９３６）およびｃ（ＭＳ００００１３７９）発現の半定量的測定にＴａｑＭａｎ ｍＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）またはｍｉＳｃｒｉｐｔプライマーアッセイ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いた。内在性対照としてＵ６Ｂ小分子核ＲＮＡまたはベータ−アクチンの発現を用いた。
代替的ポリアデニル化コラーゲン転写産物の定量化
標準品と比較したｑ−ＰＣＲにより、長い３’ＵＴＲ型および短い３’ＵＴＲ型の１型および３型転写産物の絶対レベルを測定した。ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）にランダムヘキサマーおよびオリゴ−ｄＴプライマーの両方を用いてｃＤＮＡを作製した。以下のプライマーを用いてＳＹＢＲグリーン定量的ＰＣＲを実施し、試料はＧＡＰＤＨ内在性対照に対して正規化した。
Ｃｏｌ１ａ２＿Ｓ ＦＷ ５’ＧＣＣＴＧＣＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＡＴＴ ３’
Ｃｏｌ１ａ２＿Ｓ ＲＥＶ ５’ＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＴＧＧＧＣＣＡＡＴＧ ３’
ｃｏｌ１ａ２＿Ｌ ＦＷ ５’ＴＣＡＧＡＴＡＣＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧ ３’
ｃｏｌ１ａ２＿Ｌ ＲＥＶ ５’ＣＡＣＣＡＣＡＣＧＡＴＡＣＡＡＣＴＣＡＡＴＡＣ ３’
Ｃｏｌ１ａ１＿Ｓ ＦＷ ５’ＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＡＣＴ ３’
Ｃｏｌ１ａ１＿Ｓ ＲＥＶ ５’ＴＴＧＴＡＴＴＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＣＴＴＧＣＣ ３’
ｃｏｌ１ａ１＿Ｌ ＦＷ ５’ＣＣＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＴＣ ３’
ｃｏｌ１ａ１＿Ｌ ＲＥＶ ５’ＧＣＡＡＣＡＣＡＧＴＴＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＣ ３’
ＣＯＬ３Ａ１＿Ｓ ＦＷ ５’ＣＴＡＴＧＡＣＡＴＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＴ ３’
ＣＯＬ３Ａ１＿Ｓ ＲＥＶ ５’ＴＧＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＴ ３’
ＣＯＬ３Ａ１＿Ｌ ＦＷ ５’ＣＣＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＣ ３’
ＣＯＬ３Ａ１＿Ｌ ＲＥＶ ５’ＧＡＴＧＧＧＣＴＡＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＡ ３’
ｃＤＮＡ末端の３’迅速伸長（ＲＡＣＥ）
ヒト配列を特徴付けるため、ヒトテノサイトから単離した全ＲＮＡからＭｉＲｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて作製しておいたｃＤＮＡに３’ＲＡＣＥを実施した。以下に挙げる遺伝子特異的順方向プライマーをキットのＵｎｉｖｅｒｓａｌ逆方向プライマーとともに用いて、ｃＤＮＡ末端をＰＣＲにより増幅した。
ヒト３’ＲＡＣＥ遺伝子特異的順方向プライマー：
ＲＡＣＥ−Ｃｏｌ１ａ１−Ｌ ＦＷ ５’ＧＡＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＡＣＡＡＡＧ ３’
ＲＡＣＥ−Ｃｏｌ１ａ１−Ｓ ＦＷ ５’ＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡＡＣＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣ ３’
ＲＡＣＥ−Ｃｏｌ１ａ２−Ｌ ＦＷ ５’ＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧ ３’
ＲＡＣＥ−Ｃｏｌ１ａ２−Ｓ ＦＷ ５’ＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＡＣＣＴＴＴＧ ３’
ＲＡＣＥ−Ｃｏｌ３ａ１−Ｌ ＦＷ ５’ＣＴＡＴＧＡＣＡＴＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＴ ３’
ＲＡＣＥ−Ｃｏｌ３ａ１−Ｓ ＦＷ ５’ＧＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＡ ３’
ウマ配列を特徴付けるため、ｃＤＮＡ末端の３’迅速伸長（３’ＲＡＣＥ）を用いて、ウマテノサイトに発現するＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２およびＣｏｌ３ａ１転写産物の３’ＵＴＲを増幅した。増幅したｃＤＮＡフラグメントの配列を決定し、ポリＡ尾部の５’側１０ヌクレオチドおよび３０ヌクレオチドに位置するＡＡＴＡＡＡ標準ポリＡシグナルの位置に従って、ポリＡシグナルを特定した。
ウマ３’ＲＡＣＥプライマー：
ウマｃｏｌ１ａ１ ＧＳＰ１ ＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣ
ウマｃｏｌ１ａ１ ＧＳＰ２ ＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＴＧＡＡ

ウマｃｏｌ１ａ２ ＧＳＰ１ ＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧ
ウマｃｏｌａ２ ＧＳＰ２ ＡＣＡＴＴＧＧＣＣＣＡＧＴＣＴＧＴＴＴ

ウマｃｏｌ３ａ１ ＧＳＰ１ ＡＧＧＣＣＧＴＧＡＧＡＣＴＡＣＣＴＡＴＴ
ウマｃｏｌ３ａ１ ＧＳＰ２ ＣＴＡＴＧＡＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＴ

ウマｃｏｌ１ａ１ ｑ−ＰＣＲ ｆｗ ＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡＡＣＣＴＣＡＡＧＡＡ
ウマｃｏｌ１ａ１ ｑ−ＰＣＲ ｒｅｖ ＴＡＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＧＡＡ

ウマｃｏｌ１ａ２ ｑ−ＰＣＲ ｆｗ ＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴ
ウマｃｏｌ１ａ２ ｑ−ＰＣＲ Ｒｅｖ ＧＣＡＧＧＣＧＡＧＡＴＧＧＣＴＴＡＴＴＴ

ウマｃｏｌ３ａ１ ｑ−ＰＣＲ ｆｗ ＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＣＡＣＴＡＡＡ
ウマｃｏｌ３ａ１ ｑ−ＰＣＲ ｒｅｖ ＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＧＧＡＧＣＡＡＴＡ
得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングし、配列を決定した。
ｍｉＲＮＡトランスフェクション
Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標）ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）３ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、細胞に最終濃度２０ｎＭのｍｉＲ−２９ａおよびｍｉＲ−２９ｂに対する合成成熟ｍｉＲＮＡまたはネガティブ対照（Ｄｙ５４７で標識した線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ｍｉＲ−６７ミミック、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）をトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクション細胞溶解物を収集して、目的遺伝子の発現を解析した。
トランスフェクション効率を、標識Ｄｙ５４７ミミックを用いたフローサイトメトリーにより評価し、対照スクランブルミミックおよびそれぞれのｍｉＲ２９ファミリーミミックの定量的ＰＣＲにより確認した。
コラーゲン１型および３型ならびに可溶性ＳＴ２を標的化するルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＣＯＬ１および３ならびに可溶性ＳＴ２ ３’ＵＴＲに対してオリゴをアニーリングすることによりヒト２ ｍｉＲＮＡ標的部位を作製し、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴルシフェラーゼベクター（Ａｍｂｉｏｎ社）のルシフェラーゼ遺伝子下流にセンス方向およびアンチセンス方向にクローニングした。これらの構築物の配列を決定してインサートを確認し、ｐＭＩＲ−ＣＯＬ Ｉ／ＣＯＬ ＩＩＩ／ｓＳＴ２−ｍｉＲ２９ａ／ｂ／ｃおよびｐＭＩＲ（Ａ／Ｓ）−ＣＯＬ Ｉ／ＣＯＬ ＩＩＩ／ｓＳＴ２−ｍｉＲ２９ａ／ｂ／ｃを命名し、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションに用いた。ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートで培養し、ｐＭＩＲ−ＣＯＬ Ｉ／ＣＯＬ ＩＩＩ／ｓＳＴ２−ｍｉＲ２９ａ／ｂ／ｃ、ｐＭＩＲ（Ａ／Ｓ）−ＣＯＬ Ｉ／ＣＯＬ ＩＩＩ／ｓＳＴ２−ｍｉＲ２９ａ／ｂ／ｃまたはｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴのいずれか０．１μｇを、ウミシイタケルシフェラーゼを含むｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．０１μｇおよび４０ｎＭのｍｉＲ−１５５またはスクランブルｍｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標））とともにトランスフェクトした。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示通りに用いてトランスフェクションを実施した。トランスフェクションから２４時間後、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。以下のプライマー、ｓＳＴ２ｆｗ ５’ＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＧＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＣＣＧＴ３’およびｓＳＴ２ｒｅｖ ５’ＡＧＴＣＧＡＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＧ３’を用いて、ゲノムＤＮＡからヒトｓＳＴ２の３’ＵＴＲを増幅し、それぞれＰｍｅＩ部位およびＳａｌＩ部位を作製した。これらの部位を用いて、ＰＣＲ増幅産物をｐｍｉＲＧＬＯ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の同じ部位にクローニングした。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて、Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎで予測された２つのｍｉＲ２９ａ ＭＲＥ部位のシード領域である２９−１および２９−２を変異させた。Ａｔｔａｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造業者の指示通りに用いて、各ベクターをｍｉＲ２９ａまたはスクランブル対照ミミックをともにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。２４時間後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定し、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）に対して正規化した。正規化したルシフェラーゼ活性を同じ構築物のスクランブル対照に対する百分率で表した。
サイトカイン産生
２５−Ｐｌｅｘヒトサイトカインアッセイにより、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を用いた２５の別個のヒトサイトカインのｉｎ ｖｉｔｒｏ定量測定を評価した。上清（ｎ＝３）
膝蓋腱傷害モデル
外科的処置の準備には、マウスにイソフラン（３％）と酸素（１％）の混合物による麻酔を実施し、両後肢を剪毛した。外科的処置の間、酸素を用いてイソフランのレベルを１％に下げ、ノーズコーンから送達して麻酔を実施した。皮膚切開後、支帯の両側に腱と平行になるよう２つの切れ目を入れ、次いで、膝蓋腱の下に直剪刀を置いた。鋏の刃を支持体として、直径０．７５ｍｍの生検パンチ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、右膝蓋腱の全層にわたって部分断裂を生じさせた。左膝蓋腱には偽処置を実施し、この処置は、腱の下にプラスチック製の支持体を置くだけで、傷害を一切生じさせないものであった。皮膚創傷を皮膚ステープルで閉じ、術後１日目、３日目、７日目および２１日にマウスを屠殺した。マウスをＣＯ２吸入により屠殺し、直ちに体重を測定した。ＢＡＬＢ／ｃ対照（ＣＴＬ）およびＳＴ２−／−ＢＡＬＢ／ｃの２つのグループのマウスを用いた。１時点当たりのマウスは各グループとも１６匹（ＳＴ２−／−ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＡＬＢ／ｃそれぞれｎ＝８）とした。上記の実験を別々に４回繰り返した。
ＩＬ−３３が腱マトリックス調節異常を誘発するかどうかを試験するため、サイトカイン注射モデルを確立した。ＩＬ−２３またはＩＬ−２２の適用について最初に記載した既に報告されているモデル４４〜４５でＩＬ−３３を試験した。受傷３日前、受傷２日前、受傷１日前および受傷当日、ＳＴ２−／−マウス（ｎ＝４／グループ／治療／実験）にＩＬ−３３（マウス１匹当たり０．２μｇをＰＢＳ １００μＬで希釈したもの）を連日腹腔内投与した。最後に注射してから２４時間後、マウスをプロトコル通りに選別した。対照マウスには等体積のＰＢＳを同様に投与した。このほか、同じく４／グループ／治療／実験のＷＴマウスおよびＳＴ２−／−マウスに受傷直後にＩｇＧ対照を腹腔内注射することにより、ＩＬ−３３（０．５μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）に対する中和抗体を試験した。
生体力学的解析
生体力学的解析には、各グループのマウスの膝蓋腱を傷害し、３つの時点のうち１つの時点でマウス８匹を屠殺し、Ｌｉｎら１０により既に記載されている通りに力学的試験を実施した。簡潔に述べれば、膝蓋腱を解剖して付着物を取り除き、膝蓋、膝蓋腱および脛骨のみを１つの単位として残した。腱の幅と厚さを定量化し、この２つの数値の積として断面積を計算した。特別設計の備品に入れたＩｓｏｐｏｎ ｐ３８（Ｈｉｇｈ Ｂｕｉｌｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｌｌｅｒ）に脛骨を包埋し、金属鉗子で適切な位置に固定した。ＢＯＳＥ ＥｌｅｃｔｒｏＦｏｒｃｅ（登録商標）３２００試験機器に万力を用いて膝蓋を適切な位置に固定した。各腱標本を３７０Ｃの生理食塩水浴に浸漬して以下のプロトコルを実施した−０．０２Ｎに再負荷し、０．１％／秒（０．００３ｍｍ／秒ｓ）の速度で０．０２〜０．０４に１０サイクル前準備し、１０秒間保持した。直後、腱を２５％（０．７５ｍｍ／秒）の速度で５％（０．０１５ｍｍ）の歪みまでの伸長させた後、６００秒間弛緩させることにより応力緩和実験を実施した。最後に、破断するまで０．１％／秒（０．００３ｍｍ／秒）の速度で力を増大させながら加えた。これらの試験から、最大応力を求め、応力−歪み曲線のほぼ直線の領域から得られる線形回帰を用いて弾性率を計算した。
ｍｉＲ２９ａミミックのｉｎ ｖｉｖｏ投与
１５０ｎｇ／ｍｌ ｍｉＲ−２９ａミミック、９μｇ／ｍｌポリエチレンイミン（ＰＥＩ）および５％グルコースを含有するトランスフェクション複合体を調製した。この複合体５０μｌを外科手術の直後にマウスの膝蓋腱に注射した。１日後および３日後にマウスを屠殺し、ｃｏｌ１ａ１およびｃｏｌ３ａ１のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを測定した。蛍光標識したｍｉＲ−２９ａミミックを用いて、ファロイジン（細胞骨格構造を示す）および核（ＤＡＰＩ）に対する対比染色を用いた免疫蛍光法により、腱内のｍｉＲ−２９ａミミックのｉｎ ｖｉｖｏ分布を評価した。
ｍｉＲ２９ａミミックは以下の通りであった：
パッセンジャー鎖：
ｍＡｍＣｒＣｍＧｒＡｍＵｒＵｍＵｒＣｍＡｒＧｍＡｒＵｍＧｒＧｍＵｒＧｍＣｒＵｍＡｄＧ

ガイド鎖：
／５Ｐｈｏｓ／ｒＵｒＡｒＧｒＣｒＡｒＣｒＣｒＡｒＵｒＣｒＵｒＧｒＡｒＡｒＡｒＵｒＣｒＧｒＧｍＵｍＵｍＡ

／５Ｐｈｏｓ／＝５’リン酸
ｍＡ＝２’Ｏ−メチルアデノシンリボヌクレオチド；
ｍＣ＝２’Ｏ−メチルシトシンリボヌクレオチド；
ｍＧ＝２’Ｏ−メチルグアニンリボヌクレオチド；
ｍＵ＝２’Ｏ−メチルウラシルリボヌクレオチド；
ｒＡ＝アデノシンリボヌクレオチド；
ｒＣ＝シトシンリボヌクレオチド；
ｒＧ＝グアニンリボヌクレオチド；
ｒＵ＝ウラシルリボヌクレオチド；
統計解析
図の説明に示される通り、結果はいずれも平均＋／−標準誤差平均（ＳＥＭ）で表し、統計解析はいずれも、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを用いてスチューデントのＴ検定、ＡＮＯＶＡ検定またはマン・ホイトニーの検定のいずれかにより実施した。ｐ値が０．０５未満であれば統計的に有意であると見なした。
結果
ヒト腱障害におけるＩＬ−３３およびＳＴ２の発現
本発明者らはまず、本発明者らが既に開発したモデル２２を用いて、ヒト腱障害におけるＩＬ−３３発現を検討した。初期腱障害では、対照または断裂腱の生検に比して、ＩＬ−３３、可溶性の膜結合ＳＴ２の転写産物が有意にアップレギュレートされていた（図１Ａ〜１Ｃ）。初期腱障害の組織には、断裂腱または対象の生検に比して、ＩＬ−３３およびＳＴ２の有意に高い染色がみられた（図１Ｄ）。内皮細胞、特に線維芽細胞様細胞、すなわち、初期腱障害の調節に極めて重要であると考えられるテノサイトに顕著な染色がみられた（データ不掲載）。同時に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したテノサイトをＴＮＦおよびＩＬ−１βで刺激したところ、核ＩＬ−３３の発現がｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベル（図１Ｅおよびデータ不掲載）の両方でアップレギュレートされた。これに対して、休止テノサイトおよび未刺激テノサイトにはともに、ＳＴ２の恒常的発現がみられた（データ不掲載）。
ＩＬ−３３はテノサイトのコラーゲンマトリックスおよび炎症誘発性サイトカイン合成を調節する
コラーゲン３型発現に傾いたマトリックス調節異常は、腱障害において修復促進の鍵となる初期表現型変化であるが、コラーゲン３型は生体力学的に劣っている。ＩＬ−３３は、総コラーゲンタンパク質量の用量依存的および時間依存的上方制御を誘導した（データ不掲載）が、これは１型、特に３型コラーゲンのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現増大によって説明される（図１Ｆ、１Ｇ）。アレイ解析を実施したところ（データ不掲載）、ＩＬ−３３の下流シグナル伝達に関する報告１２、１６と同じく、この作用はＥＲＫ阻害によって打ち消された（データ不掲載）。ほかにも、ｒｈＩＬ−３３によってＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の産生が有意に増大し（データ不掲載）、この増大がＮＦ−κＢ阻害によって調節されたことから、ＩＬ−３３はテノサイトにおいてその標準的なＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路を介して作用することが示唆された（データ不掲載）。これに対し、他のサイトカインの産生に対しては、線維芽細胞で既に報告されているＩＬ−３３誘導性サイトカイン産生プロファイル２０〜２３と一致する効果は全く見られなかった。
腱傷害後のＩＬ−３３／ＳＴ２経路のｉｎ ｖｉｖｏでのモデル化
本発明者らは、上記の観察を十分に確立されたｉｎ ｖｉｖｏの腱傷害モデルまで広げた。ＷＴマウスでは、腱傷害後第１日および第３日にＩＬ−３３ ｍＲＮＡの増大がみられた（図２Ａ）。受傷ＳＴ２−／−マウスではこれが有意に減少したことから、オートクリン調節が示唆された。ＷＴマウスでは、可溶性ＳＴ２が受傷後のいずれの時点でも未受傷対照に比して有意にアップレギュレートされた（図２Ｂ）のに対し、膜ＳＴ２ ｍＲＮＡの増大がみられたのは、受傷後第３日までに限られた（データ不掲載）。受傷後第７日、第２１日ともに、ＷＴマウスにはＩＬ−３３およびＳＴ２の転写産物およびタンパク質の発現に有意な変化はみられず、ＳＴ２−／−マウスではＩＬ−３３発現に有意な変化はみられず、ＩＬ−３３発現の影響が現れるのは、腱の傷害／修復における「アラーミン」型活性と同じく初期であることが示唆された。
コラーゲン合成の解析から、ＷＴマウスでは、受傷後のいずれの時点でもコラーゲン３型の発現が未受傷対照または受傷ＳＴ２−／−マウス（図２Ｅと２Ｆおよびデータ不掲載）に比して有意に高いことが明らかになった。ＷＴ受傷マウスでは、コラーゲン１型は最初、ｍＲＮＡレベルでダウンレギュレートされた（第１日、第３日）（図２Ｃ）が、第７日および第２１日までに受傷前のレベルに戻り（データ不掲載）、これと同様の傾向がコラーゲン１型タンパク質の発現にもみられた（図２Ｄ）。これに対し、ＳＴ２−／−受傷マウスでは、コラーゲン１型の合成の減少がみられた期間が長く（第１日、第３日および第７日）、第２１日になって初めてベースラインに戻った（データ不掲載）。重要なのは、ＷＴマウスの腱が受傷すると、受傷後第１日に生体力学的強度がＳＴ２−／−に比して有意に低下し（図２Ｇ）、第７日および第２１日には回復する（データ不掲載）ということである。以上のデータから、ＳＴ２−／−マウスにおけるコラーゲンマトリックス合成の変化は、ＩＬ−３３／ＳＴ２が生体力学的に重要な腱傷害時のコラーゲン変化の初期モジュレーターであることを示すものであることが示唆される。
ＩＬ−３３の操作によりコラーゲン３型がｉｎ ｖｉｖｏで修正される
この可能性を裏付けるため、本発明者らは、ＩＬ−３３エフェクターの生物学的性質をｉｎ ｖｉｖｏで直接修正することを試みた。ｒｈＩＬ−３３の投与は、コラーゲン１型の合成には影響を及ぼさなかった（図３Ａ、３Ｂ）が、特に受傷腱におけるコラーゲン３型の合成が有意に増大した（図３Ｄ、３Ｅおよびデータ不掲載）。さらにＷＴマウスでは、ｒｈＩＬ−３３投与により、受傷後のいずれの時点でも最終腱強度の有意な低下がみられ（図３Ｅおよびデータ不掲載）、このような変化が機能的影響を及ぼすことが示唆された。治癒しつつあるＳＴ２−／−マウスの腱では、ＩＬ−３３の投与はコラーゲンマトリックス合成にも最終腱強度にも影響を及ぼさず、ＩＬ−３３がＳＴ２依存性経路を介して作用することが裏付けられた（データ不掲載）。
次に、本発明者らはｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ−３３を直接標的とした。ＷＴ受傷マウスでは、ＩＬ−３３に対する中和抗体により、受傷後第１日および第３日にコラーゲン１型から３型への切替えが弱まり（図３Ｆ〜３Ｉ）、受傷後第１日のＷＴマウス腱の生体力学的強度が有意に増大した（図３Ｊ）。この効果は、これより後の時点ではみられなかった（データ不掲載）。対照実験では、ＳＴ２−／−マウスに何ら効果は観察されず（データ不掲載）、傷害による腱障害には内因性ＩＬ−３３が寄与していることがさらに裏付けられた。
ＩＬ−３３はテノサイトにおけるｍｉＲ−２９を介したコラーゲン１型／３型の差次的調節を促進する
ＩＬ−３３がテノサイトにおけるコラーゲン１型および３型の差次的調節を駆動することが確認されたため、本発明者らは、この過程にｍｉＲＮＡネットワークが何らかの機構的役割を果たしていると仮定した。これまでの研究で、ｍｉＲ−２９ファミリーが１型および３型コラーゲンを含めた多数の細胞外トリックス遺伝子を直接標的とし２４〜２５、自然免疫および適応免疫の調節に関与していることが明らかにされている２６。コンピュータアルゴリズムでは、ｍｉＲ−２９がほかにもｓＳＴ２を標的とし得ることが予測される。本発明者らは、ヒト腱生検および外植テノサイトにｍｉＲ−２９ファミリーの全メンバーが発現し（図４Ａ）、ｍｉＲ−２９ａが最も発現の変化が大きいことを明らかにした。テノサイト培養物では、ＩＬ−３３がＮＦκＢ依存性シグナル伝達を介して作用することにより、６時間後、１２時間後および２４時間後にｍｉＲ−２９ａの発現が有意に低下する（図４Ｂ）のに対し、ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−ｃに対する効果には一致がみられなかった（データ不掲載）。ＩＬ−３３が仲介するコラーゲン３型マトリックスの変化がｍｉＲ−２９ａによって調節されたことから、本発明者らは、ｍｉＲ−２９ａの操作がｉｎ ｖｉｔｒｏでコラーゲンマトリックス合成に及ぼす機能的効果を分析した。まず、ルシフェラーゼアッセイを用いて、既に示されているように２７、ｍｉＲ−２９ａがｃｏｌ １ａ１およびｃｏｌ ３ａ１を直接標的とすることを確認した（図７Ｂ）。ほかにも、それまで確認されていなかったｃｏｌ １ａ２サブユニット転写産物との相互作用を観察した（図７）。ｍｉＲ−２９ａが実際に疾患関連細胞の標的ｍＲＮＡ候補のレベルを調節するかどうかを試験するため、テノサイトにｍｉＲ−２９ａのミミックおよびアンタゴマーをトランスフェクトした。初代テノサイトでは、ｍｉＲ−２９ａ操作によりコラーゲン３型のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が調節されたが、コラーゲン１型のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は調節されなかった（図４Ｃ、４Ｄ）。さらに、ｍｉＲ−２９ａの過剰発現により、ＩＬ−３３誘導によるコラーゲン３型のｍＲＮＡおよびタンパク質の合成が有意に阻害された（図４Ｅ）。さらに、ｍｉＲ−２９ａの阻害によりｃｏｌ ３ａ１発現が有意に増大し、ヒトテノサイトにおいてｍｉＲ−２９ａがこれらの転写産物を能動的に調節するだけでなく、その減少が腱障害にみられる３型コラーゲン産生の増大に重要な因子であること示された。これに対し、ｃｏｌ １ａ１転写産物のレベルには変化がみられなかった（図４Ｉ）。
ルシフェラーゼレポーターアッセイでは、ｍｉＲ−２９ａがコラーゲン３型以上の効率でｃｏｌ １ａ１およびｃｏｌ １ａ２を抑制することが可能であったことを考えると、このことが３型転写産物内のｍｉＲ−２９ａのＭＲＥに対する親和性の方が高いことに起因する可能性は低いと思われた（図４Ｆ）。転写産物がそのｍｉＲＮＡ調節に対する感受性を調節する機構を説明するもので十分に裏付けられたものの１つが、代替的ポリアデニル化シグナルを利用するというものである（図４Ｇ）。このことを試験するため、ｑ−ＰＣＲにより完全長（ｍｉＲ−２９ａを含む）転写産物のレベルと全体のレベルとを比較したところ（図４Ｈ）、ｃｏｌ １ａ１およびｃｏｌ １ａ２の転写産物のうち遠位のポリアデニル化シグナルを利用するものが５％未満であったのに対し、３ａ１ 転写産物では大部分が同シグナルを利用することが明らかになった。
ｃＤＮＡ末端の３’迅速増幅（ＲＡＣＥ）によりこのことが確認され（図７Ｅ）、ｃｏｌ １ａ１およびｃｏｌ １ａ２がともに、ｃｏｌ ３ａ１とは異なり、それまで確認されていないポリアデニル化シグナルを利用することが裏付けられた（図４Ｇ）。生じた短縮３’ＵＴＲにはｍｉＲ２９ａ ＭＲＥがない（図７Ｅに示される配列はｃＤＮＡ配列であり、対応するｍＲＮＡ配列には、当然のことながらＴではなくＵが含まれることが理解されよう）。以上のデータから、テノサイトでは、ｍｉＲ−２９ａがｃｏｌ ３ａ１を特異的に調節するのに対し、ｃｏｌ １ａ１およびｃｏｌ １ａ２はともに代替的ポリアデニル化シグナルを利用するため、ｍｉＲ−２９ａ阻害に非感受性であることが示唆される。この代替的ポリアデニル化シグナルの利用は、ＩＬ−３３の存在による影響を受けなかった（データ不掲載）。ＩＬ−３３シグナル伝達時にｍｉＲ−２９ａが減少するとコラーゲン３型が抑制され、これが受傷腱にみられるコラーゲン３型の増大に寄与する可能性が考えられる。
ヒトテノサイトで得られた３’ＲＡＣＥの結果から、２つのｃｏｌ ３ａ１ ＵＴＲのうち、短い方［図７ＥではＣｏｌ３ａ１（短い３’ＵＴＲ）と命名されている］にはｍｉＲ−２９ａ ＭＲＥが１つ含まれているのに対し、長い方には２つ含まれていることが明らかになった。図７Ｄに示されるように、ともにｍｉＲ−２９ａによって調節される。
ウマテノサイトに発現するＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌａ２およびＣｏｌ３ａ１転写産物の３’ＵＴＲの特徴付けでは、これらが、ヒトテノサイトに発現するオーソロガスなコラーゲン転写産物で用いられている同じ保存されたポリＡシグナルを利用していることが明らかになった。ｃｏｌ１ａ１およびｃｏｌａ２では、これらの近位のポリＡシグナルを用いることによって、長さ１００〜３５０ヌクレオチドで、ｍｉＲ−２９結合部位を含まず、したがって、このｍｉＲＮＡによる調節に非感受性の３’ＵＴＲを有する転写産物が生じる。これに対し、ｃｏｌ３ａ１ ３’ＵＴＲはともにｍｉＲ−２９結合部位を含むため、ｍｉＲ−２９による調節に感受性である。
可溶性ＳＴ２はｍｉＲ−２９の直接の標的である
コンピュータ解析では、可溶性ＳＴ２がｍｉＲ−２９ａの標的になり得ることが明らかになり、ＩＬ−３３エフェクター機能に何らかの調節的役割を果たしている可能性が示唆された。２つの有望なｍｉＲ−２９ａｂｃ結合部位を有することが予測されるヒトｓＳＴ２の３’ＵＴＲを含むルシフェラーゼレポーター遺伝子を作製した。ｓＳＴ２−ルシフェラーゼレポータープラスミドとｍｉＲ−２９ミミックとの共トランスフェクションにより、スクランブル対照に比してルシフェラーゼ活性の有意な低下がみられた（図７Ｂ）。さらに、ｓＳＴ２の両ｍｉＲ−２９ ＭＲＥのシード領域を変異させたところ、ルシフェラーゼ活性が完全に回復したことから、ｓＳＴ２がｍｉＲ−２９ａの直接の標的であることが確証された（図５Ａ）。ｍｉＲ−２９ａが実際にテノサイトにおいて標的ｍＲＮＡ候補のレベルを調節するかどうかを検討するため、再びヒトテノサイトにｍｉＲ−２９ａのミミックおよびアンタゴマーをトランスフェクトした。ｍｉＲ−２９ａミミック／アンタゴマーのトランスフェクションによって可溶性ＳＴ２のメッセージが有意に（ｐ＜０．０１）約５倍変化し（図５Ｂ）、これに対応して可溶性ＳＴ２タンパク質が有意に変化したことから、ｍｉＲ２９ａが可溶性ＳＴ２の標的であることが裏付けられた（図５Ｃ）。
ＩＬ−３３／ｓＳＴ２は腱治癒のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいてｍｉＲ−２９発現を調節する
最後に、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏの腱障害モデルにおけるｍｉＲ−２９ａ発現を検討した。ＷＴマウスの腱傷害では、ｍｉＲ２９ａが第１日に（ベースラインに対して）２２分の１に減少し、第３日までに６分の１の減少まで戻り（図５Ｄおよびデータ不掲載）、第７日には有意差が認められなかった。この効果はＳＴ２−／−マウスでは有意に阻害された（データ不掲載）。さらに、未受傷腱では、外来ｒｈ−ＩＬ−３３の投与により、いずれの時点でもＰＢＳ注射対照に比してｍｉＲ−２９ａ発現の減少がみられた（データ不掲載）。この効果は受傷ＷＴマウスに最も著明にみられ、ｒｈＩＬ−３３を加えると、ｍｉＲ−２９ａのさらに１０倍の減少が仲介された（図５Ｅ）。ＳＴ２−／−マウスにｒｈＩＬ−３３を加えたところ、同じく受傷腱にも未受傷腱にもｍｉＲ−２９ａ発現に対する有意な効果は認められず、ｍｉＲ−２９ａのダウンレギュレーションの一部はＩＬ−３３／ＳＴ２依存性シグナル伝達によって直接仲介されていることが示唆された。ＩＬ−３３に対する中和抗体を加えたところ、受傷後第１日および第３日にｍｉＲ−２９ａ遺伝子発現に対する傷害の効果の有意な低下がみられた（図５Ｆ）。
膝蓋腱傷害モデルにおけるｍｉＲ２９ａミミックのｉｎ ｖｉｖｏ投与
ＷＴマウスの膝蓋腱にｍｉＲ−２９ａ／ＰＥＩ複合体を直接注射することにより、ｍｉＲ−２９ａミミックをテノサイトに送達した。ファロイジン（緑、細胞骨格構造に対する染色）およびＤＡＰＩ（核を示す染色）で対比染色するミミック（赤）の免疫蛍光染色を用いて、ｍｉＲ−２９ａミミック注射の２４時間後におけるテノサイト周辺へのミミックの局在を可視化した（不掲載）。図８に示されるように、ｍｉＲ−２９ａミミックを注射した腱では、対照群に比してコラーゲン３型のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの有意な低下がみられた。これに対し、コラーゲン１型のレベルには変化がみられなかった。
考察
マイクロＲＮは、疾患および組織リモデリングに重要な役割を果たす多様な細胞プロセスの強力な調節因子として登場した。腱障害をモデル系として用いた上記の研究は、単一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２９）が複雑な初期の生物学的過程において炎症性サイトカインエフェクター機能および細胞外マトリックス調節を交差調節し、組織修復をもたらすことができることを初めて明らかにするものである。
本発明者らは、腱障害の重要な臨床的概念に導く最初の段階においてＩＬ−３３が何らかの役割を果たしていることを示す新たな証拠を本明細書に提供する。ＩＬ−３３は近年、筋骨格の病理と関係があることが明らかになりつつある１６。本発明者らのデータは、疾患の初期段階のヒト腱生検にはＩＬ−３３が存在するが、最終段階の生検ではメッセージおよびタンパク質レベルにおけるＩＬ−３３発現が有意に低下していることを示しており、ＩＬ−３３が腱傷害およびこれに続く組織リモデリングにおける初期組織メディエーターであるという概念を導くものである。細胞が受傷すると、壊死細胞により内因性の危険信号、いわゆる損傷関連分子パターンが放出され、このような分子パターンには熱ショックタンパク質２８、ＨＭＧＢ１２９、尿酸３０およびＩＬ−３３３３〜３４を含めたＩＬ−１ファミリーのメンバー３１〜３２が含まれる。次いで、これらの危険信号が様々な免疫細胞によって認識され、炎症応答および修復応答が引き起こされる。本発明者らのデータは、ＩＬ−３３が初期腱障害のアラーミンであることを示しており、重要なことに、本発明者らの生体力学的データから、このような発現が病理発生に重要な役割を果たしていることが示唆される。ｒｈＩＬ−３３を加えると、初期の時点でＷＴマウスの破断負荷が約３０％有意に減少し、推測ではあるが、これは同時に起こるコラーゲン３型マトリックスへの変化が力学的に劣る腱を生じさせる結果である３５。したがって、生体力学的に劣る初期腱修復を仲介する事象の妥当な機序の１つとして考えられるのは、微小な傷害が繰り返されると、ＩＬ−３３がアップレギュレートされ、次いで機械的応力／壊死を介してそれが放出され、次の段階ではマトリックス変性および炎症誘発性サイトカイン産生が促進され、腱が初期腱障害の生検にみられるような病理学的状態に進むとするものである。興味深いことに、受傷マウスに中和抗体を加えると、確かにコラーゲン３型表現型が逆転したが、これは受傷後第１日に腱の強度を一時的に改善することができるにとどまった。長期的なスポーツ傷害ではこれがＩＬ−３３遮断を打ち消すものと考えられるのに対し、病理的な腱変化による微小外傷が繰り返されると、逆に、ＩＬ−３３の中和が止め手綱として作用し、望ましくないマトリックス調節異常を促進するものと考えられる。
白血球機能およびサイトカインネットワークを調節すると同時に細胞外マトリックスの組成を決定する間質系の増殖および分化を統合する重要な因子としてのｍｉＲＮＡを強調する研究がみられるようになった３６。ｍｉＲ−２９ａがＩＬ−３３「アラーミン」仲介による作用の調節に果たす役割を新たに発見することにより、組織修復における炎症およびマトリックス調節に影響を及ぼすｍｉＲＮＡ交差調節ネットワークの機構に関する洞察が得られる。本発明者らのデータは、マウスおよびヒトの腱傷害においてｍｉＲ−２９がコラーゲンの転写後調節因子として機能的役割を果たしていることを示す確かな証拠を提供するものである。ｍｉＲ−２９ファミリーによるコラーゲンの調節を強調した研究はこれまでに数件ある３７、２７、３８。本発明者らの結果は現時点で、ｍｉＲ−２９が腱治癒におけるコラーゲン発現を調節する極めて重要なリプレッサーとして作用することを示唆するものである。さらに、ヒト生検にコラーゲン発現の減少がみられたことから、その機能的減少が腱障害の発生を許容することが示唆される。腱の病理がコラーゲン３型沈着の増大による生体力学的劣性および変性を特徴とするものであるにもかかわらず、このコラーゲン「切替え」の分子的根拠はこれまで明らかにされていない。本発明者らは、ＩＬ−３３によりｍｉＲ−２９ａの欠乏を誘導すると、コラーゲン３型が過剰に産生されると同時に、ＩＬ−３３によるｓＳＴ２阻害を介してこの初期修復過程の最終的な消失を始動させることを初めて記載する。ヒトテノサイトでの予想に反して、ｍｉＲ−２９が影響を及ぼすことが可能なのはｃｏ１ ３ａ１の発現にとどまり、１型コラーゲンの発現には影響を及ぼさなかった。次いで１型および３型コラーゲンの３’ＵＴＲの特徴付けから、１型の両サブユニットにはこれまでに報告されていない代替的ポリアデニル化パターンがあり、ｍｉＲ２９ａ結合部位がないためにこのｍｉＲＮＡによる抑制に非感受性である転写産物が生じることが明らかになった。３型コラーゲン転写産物は両ｍｉＲ−２９ａ結合部位を保持しており、このことは当てはまらなかった。ヒトテノサイトでは、ｍｉＲ−２９ａ阻害剤が、コラーゲン３型のレベルを有意に増大させると同時にＩＬ−３３の存在下でテノサイトにｍｉＲ−２９ａを供給する能力が、コラーゲン３型の産生増大を阻害するのに十分なものであったことからわかるように、ｍｉＲ−２９ａによってコラーゲン３型が能動的に抑制される。本発明者らのモデル系ではｍｉＲ−２９ａがさらにＩＬ−３３デコイ受容体ｓＳＴ２を標的としたことは重要である。したがって、ＩＬ−３３によりｍｉＲ−２９ａ発現を減少させると、コラーゲン３型とｓＳＴ２が同時に抑制され、それに続くＩＬ−３３の自己調節阻害により、即時のアラーミン応答の消失が促進される。
本発明者らは本研究に基づき、ＩＬ−３３は、初期腱傷害および腱障害の未だ対処されていない臨床分野に影響を及ぼし修復と変性との間のバランスに重要であると考えられるアラーミンであるとする説を提唱する。ｍｉＲ−２９の腱治癒および腱障害におけるマトリックス／炎症遺伝子の転写後調節因子としての新規な役割が明らかにされた。ｍｉＲＮＡを治療目的で利用するうえで最も有望な点の１つは、単一のマイクロＲＮＡには機能の集中した標的遺伝子を調節する可能性があることであった。本発明者らが初期組織治癒において単一のマイクロＲＮＡに依存する調節経路を発見したことは、有望な腱障害の治療選択肢としてのｍｉＲ−２９補充療法を強調し、マトリックス調節異常と関係がある他の多くのヒト病理に影響を及ぼすものである。
ここまで上記の例示的な実施形態とともに本発明を説明してきたが、本開示を読めば、当業者には同等な修正形態および変形形態が多数明らかになるであろう。したがって、記載されている本発明の例示的な実施形態は、例示的なものであって、限定的なものではないと見なされるべきである。記載されている実施形態には、本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく、様々な改変を施し得る。本明細書に引用される文献はいずれも、参照により明示的に組み込まれる。
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４０．ＭｃＩｎｎｅｓ，Ｉ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｎｄ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４，１５１９−１５２４（１９９６）．
４１．Ｋｈａｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｃｏｏｋ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｏｎａｒ，Ｆ．，Ｈａｒｃｏｕｒｔ，Ｐ．＆ Ａｓｔｒｏｍ，Ｍ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｔｅｎｄｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ．Ｕｐｄａｔｅ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ ２７，３９３−４０８（１９９９）．
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４３．Ｋｕｒｏｗｓｋａ−Ｓｔｏｌａｒｓｋａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．ＩＬ−３３ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＬ−５＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｌｌｅｒｇｉｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＩＬ−４．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８１，４７８０−４７９０（２００８）．
４４．Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２２，ａ Ｔ（Ｈ）１７ ｃｙｔｏｋｉｎｅ，ｍｅｄｉａｔｅｓ ＩＬ−２３−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｒｍａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４４５，６４８−６５１（２００７）．
４５．Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｍ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．ＣＣＲ６ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＩＬ−２３−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ−ｌｉｋｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１９，２３１７−２３２９（２００９）．

Claims (32)

  1. 対象の腱治癒を調節する方法であって、腱細胞のｍｉＲ−２９の発現または活性を増大させることを含む、方法。
  2. 腱細胞にｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体を送達する段階を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体が、１つまたは複数の改変糖残基を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体が、１つまたは複数の改変ヌクレオシド間結合を含む、請求項２または３に記載の方法。
  5. 前記ｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体が、１つまたは複数の改変塩基を含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ｍｉＲ−２９ミミックまたは前駆体が膜通過部分を含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記ｍｉＲ−２９、ミミックまたは前駆体が担体と結合している（例えば、担体と複合体を形成しているか、担体に封入されている）、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記担体が、薬学的に許容される脂質またはポリマーを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記担体分子が、標的細胞の表面に結合することが可能な標的化剤を含む、請求項７または８に記載の方法。
  10. 腱細胞にｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体が発現するように、前記腱細胞に前記ｍｉＲ−２９、ミミックまたは前駆体をコードする核酸を送達する段階を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記核酸が担体と結合している（例えば、担体と複合体を形成しているか、担体に封入されている）、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記担体が、薬学的に許容される脂質またはポリマーを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記担体分子が、前記標的細胞の表面に結合することが可能な標的化剤を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. ウイルスベクターを介して前記核酸を送達する、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ｍｉＲ−２９が、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ１、ｍｉＲ２９ｂ２もしくはｍｉＲ−２９ｃまたはその組合せである、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記組合せがｍｉＲ−２９ａを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ｍｉＲ−２９またはそのミミックが、シード配列ＡＧＣＡＣＣＡを含むガイド鎖を含む、請求項２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記ガイド鎖が、配列：
    ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ）；
    ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ２）；または
    ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ）．
    を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記前駆体がｐｒｅ−ｍｉｒ−２９である、請求項２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９が配列：
    ＡＵＧＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧＡＧＵＣＡＡＵＡＵＡＡＵＵＵＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡＵ（ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ａ：選択肢（ｉ））；
    ＡＵＧＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧＡＧＵＣＡＡＵＡＵＡＡＵＵＵＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡＵＡＡＵＧＡＵＵＧＧＧＧ（ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ａ：選択肢（ｉｉ））；
    ＣＵＵＣＡＧＧＡＡＧＣＵＧＧＵＵＵＣＡＵＡＵＧＧＵＧＧＵＵＵＡＧＡＵＵＵＡＡＡＵＡＧＵＧＡＵＵＧＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵＣＵＵＧＧＧＧＧ（ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ｂ１）；
    ＣＵＵＣＵＧＧＡＡＧＣＵＧＧＵＵＵＣＡＣＡＵＧＧＵＧＧＣＵＵＡＧＡＵＵＵＵＵＣＣＡＵＣＵＵＵＧＵＡＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵＵＵＡＧＧＡＧ（ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ｂ２）；または
    ＡＵＣＵＣＵＵＡＣＡＣＡＧＧＣＵＧＡＣＣＧＡＵＵＵＣＵＣＣＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧＡＧＵＣＵＧＵＵＵＵＵＧＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡＵＧＡＵＧＵＡＧＧＧＧＧＡ（ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉｒ−２９ｃ）
    （配列中、成熟ガイド鎖配列には下線が施されている）
    を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ｍｉＲ−２９ミミックが、配列：
    ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ）；
    ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ１および２）；もしくは
    ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ）
    （上記の各配列のシード配列には下線が施されている）；
    または前記配列と：
    （ｉ）前記シード配列内の３つ以下の位置；および
    （ｉｉ）前記シード配列外の５つ以下の位置
    で異なる配列
    を含むガイド鎖を含む、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記腱細胞がテノサイトまたは腱芽細胞である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記腱が腱傷害または腱障害に罹患している、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記対象がヒトまたはウマである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記罹患している腱が、アキレス腱、棘上筋腱、総屈筋腱、総伸筋腱または浅屈筋腱である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 腱治癒の調節が、腱の引張り強度を増大させることを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 腱治癒を調節する方法に使用する、ｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体。
  30. 腱治癒を調節するための薬物の製造における、ｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体の使用。
  31. 腱治癒を調節する方法に使用する、ｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体をコードする核酸。
  32. 腱治癒を調節するための薬物の製造における、ｍｉＲ−２９、そのミミックまたはいずれかの前駆体をコードする核酸の使用。
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