JP2017222659A - ジャスモネート化合物の組成物および使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】種々の疾患および障害の治療および予防に有用なジャスモネート化合物(例えば、ナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物)の医薬組成物の提供。【解決手段】医薬として許容される溶媒、及びメチルジヒドロジャスモネート(MDJ)を含有する複数のナノキャリア又はマイクロキャリアを含む医薬組成物であって、ナノキャリア又はマイクロキャリアが、シクロデキストリン又はデンドリマーから形成される、或いはリン脂質層に囲まれたコレステリルエステルのコアを含む合成ナノエマルジョン粒子であり、ナノキャリアが、1〜500nmの範囲のサイズを有し、或いはマイクロキャリアが、1〜100μmの範囲のサイズを有し、そして医薬組成物は、1〜1Μの範囲の濃度のMDJを有する、医薬組成物。【選択図】図24
Description
関連出願
本出願は、2011年9月16日に出願された米国仮特許出願第61/535,836号;2011年11月4日に出願された米国仮特許出願第61/555,690号;2012年2月24日に出願された米国仮特許出願第61/603,042号;2012年3月6日に出願された米国仮特許出願第61/607,318号;及び2012年3月19日に出願された米国仮特許出願第61/612,774号;並びに2012年2月27日に出願された国際出願第PCT/IB2012/000364号の優先権および利益を主張する。上記出願のそれぞれの全内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本出願は、2011年9月16日に出願された米国仮特許出願第61/535,836号;2011年11月4日に出願された米国仮特許出願第61/555,690号;2012年2月24日に出願された米国仮特許出願第61/603,042号;2012年3月6日に出願された米国仮特許出願第61/607,318号;及び2012年3月19日に出願された米国仮特許出願第61/612,774号;並びに2012年2月27日に出願された国際出願第PCT/IB2012/000364号の優先権および利益を主張する。上記出願のそれぞれの全内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本発明は、種々の疾患および障害の治療および予防に有用なジャスモネート化合物(例えば、ナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物)の医薬組成物に関する。
ジャスモネート化合物またはジャスモネートは、シクロペンタノン環を有することを特徴とし、植物がストレスの多い状況に直面すると生成する植物ストレスホルモンとして知られている。ジャスモネートの例として、ジャスモン酸(JA)、ジャスモン酸メチル(MJ)、およびシス/トランスジャスモン(例えば、米国特許第6,469,061号およびWO2007/066337号参照)が挙げられるが、これらに限定されない。MJおよびJAは両者とも、腫瘍細胞に対し効果的かつ選択的であることが示されている(例えば、Flescher,Anti−Cancer Drugs 2005、16:901〜916および米国特許出願第2002/0173470号参照)。しかし、ジャスモネートは、インビボで投与した場合、通常、標的癌細胞に到達する前に、例えば、エステラーゼによって代謝されるため、抗がん剤としてあまり魅力がない。
本発明は、部分的に、ナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネート、特に、種々の疾患、例えば、血管新生関連疾患および炎症性疾患の治療または予防の用途にナノ担持またはマイクロ担持されたメチルジヒドロジャスモネート(MDJ、メチル2−(3−オキソ−2−ペンチルシクロペンチル)アセテートとしても知られる)を提供する。以下にMDJの化学構造を示す。
一の態様において、本開示は、医薬として許容される溶媒ならびにMDJを含有する複数のナノキャリアおよび/またはマイクロキャリアを含む医薬組成物を提供する。ナノキャリアおよび/またはマイクロキャリアは、シクロデキストリンもしくはデンドリマー、またはリポソームから形成される、あるいはリン脂質外層に囲まれたコレステリルエステルのコアを含む合成ナノエマルジョン粒子(LDE)であり;当該ナノキャリアは、1ナノメートル(nm)から1000nm(例えば、1〜900nm、1〜800nm、1〜700nm、1〜600nm、1〜500nm、1〜400nm、1〜300nm、1〜200nm、1〜100nm、1〜90nm、1〜80nm、1〜70nm、1〜50nm、1〜30nm、または1〜10nm)の範囲のサイズを有し;当該マイクロキャリアは1ミクロンから50ミクロン(例えば、1ミクロンから約40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1.5ミクロン)の範囲のサイズを有し、そして当該医薬組成物は、1nMから1M(例えば、1nMから10nM、1nMから100nM、1nMから1μM、1nMから10μM、1nMから100μM、100μΜから1mM、100μΜから10mM、100μΜから100mM、または100mMから1M)の範囲の濃度のMDJを有する。
この医薬組成物は、以下の特徴の一つ以上を有していてもよい。
当該医薬組成物は、1nMから10〜100μΜ(例えば、1nMから10nM、10nMから100nM、100nMから1μM、1μΜから10μM、または10μΜから100μΜ)、あるいは100μΜから1mΜ(例えば、100μΜから、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、または900μΜまで)、あるいは100μΜから10mΜ(例えば、100μMから200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、または、900μΜから1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、もしくは10mMまで)、あるいは100μΜから100mΜ(例えば、100μMから、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、または1mMから、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、もしくは100mMまで)、あるいは10μΜから1mΜ(例えば、10μMから、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、または90μΜから0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、もしくは1mMまで)、あるいは1から100mΜ(例えば、1〜10mM、1〜20mM、1〜30mM、1〜40mM、1〜50mM、1〜60mM、1〜70mM、1〜80mM、または1〜90mM)、あるいは100mMから1M(例えば、0.2Μから、0.3Μ、0.4Μ、0.5Μ、0.6Μ、0.7Μ、0.8Μ、0.9Μ、1Mまで)の範囲の濃度のMDJを有する。
当該ナノキャリアは、シクロデキストリンから形成され、そして3nmから100nm、例えば、3.5〜11nm、10〜20nm、10〜30nm、10〜40nm、10〜50nm、10〜60nm、10〜70nm、10〜80nm、10〜90nm、20〜30nm、20〜40nm、20〜50nm、20〜60nm、20〜70nm、20〜80nm、20〜90nm、30〜40nm、30〜50nm、30〜60nm、30〜70nm、30〜80nm、30〜90nm、40〜50nm、40〜60nm、40〜70nm、40〜80nm、40〜90nm、または50〜60nm、50〜70nm、50〜80nm、50〜90nm、または50〜100nmの範囲のサイズを有する。
当該ナノキャリアは、リポソームまたはLDEであり、そして30nmから500nm、例えば、50nm〜110nm、30nm〜50nm、30nm〜100nm、30nm〜150nm、30nm〜200nm、30nm〜250nm、30nm〜300nm、30nm〜350nm、30nm〜400nm、または30nm〜450nmの範囲のサイズを有する。
当該マイクロキャリアは、リポソームまたはLDEであり、そして約2μmから30μm(例えば、2〜5μm、2〜10μm、2〜15μm、2〜20μm、または2〜25μm)、約5μmから20μm(例えば、5〜7.5μm、5〜10μm、5〜12.5μm、5〜15μm、または5〜17.5μm)の範囲、あるいは約10μmのサイズを有する。更に、MDJの濃度の範囲は、10〜100μΜから100mΜ(例えば、50〜100μΜ、または100μMから、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、または900μΜから1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、もしくは10mΜまで、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、もしくは100mMまで)あるいは100mMから1M(例えば、0.2Μ、0.3Μ、0.4Μ、0.5Μ、0.6Μ、0.7Μ、0.8Μ、0.9Μ、1M)の範囲のサイズを有する。
当該ナノキャリアは、デンドリマーから形成され、そして1nmから500nm(例えば、2〜10nm、2〜20nm、2〜50nm、2〜100nm、2〜150nm、2〜200nm、2〜250nm、2〜300nm、2〜350nm、2〜400nm、2〜450nm、10〜100nm、10〜200nm、10〜300nm、10〜400nm、10〜500nm、50〜100nm、50〜200nm、50〜300nm、50〜400nm、50〜500nm、100〜300nm、100〜500nm、200〜500nm、300〜500nm、または400〜500nm)の範囲のサイズを有する。
当該デンドリマーは、ポリアミドアミン(PAMAM)である。
ΜDJの濃度の範囲は、1nMから10〜100μΜ(例えば、1nMから10nM、10nMから100nM、100nMから1μM、1μΜから10μM、または10μΜから100μΜ)、10〜100μΜから100mΜ(例えば、50〜100μΜまたは100μMから200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、または900μΜから1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、または10mΜまで、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、または100mMまで)、あるいは100mMから1Μ(例えば、0.2Μから、0.3Μ、0.4Μ、0.5Μ、0.6Μ、0.7Μ、0.8Μ、0.9Μ、1Mまで)の範囲のサイズを有する。例えば、MDJの濃度は、100μΜから1mM、または50nMから70nMである。
当該ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、更に、2−アミノエチルリン酸二水素(もしくはホスホエタノールアミン)、3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナール(もしくはシトラール)、サリチル酸メチル、アブシジン酸、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む。3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナールは、シスまたはトランス異性体のいずれかであり得る。
当該医薬として許容される溶媒は、水、アルコール、またはそれらの混合物である。
別の態様において、本開示は、医薬として許容される溶媒ならびにジャスモネート化合物を含有する複数のナノキャリアおよび/またはマイクロキャリアを含む医薬組成物を提供する。ナノキャリアおよび/またはマイクロキャリアは、シクロデキストリンもしくはデンドリマー、またはリポソームから形成される、あるいは、ナノキャリアおよび/またはマイクロキャリアは、リン脂質層に囲まれたコレステリルエステルのコアを含む合成ナノエマルジョン粒子(LDE)である。当該ナノキャリアは、1nmから1000nm(例えば、1〜900nm、1〜800nm、1〜700nm、1〜600nm、1〜500nm、1〜400nm、1〜300nm、1〜200nm、1〜100nm、1〜90nm、1〜80nm、1〜70nm、1〜50nm、1〜30nm、または1〜10nm)の範囲のサイズを有し;当該マイクロキャリアは、1ミクロンから50ミクロン(例えば、1ミクロンから約40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1.5ミクロン)の範囲のサイズを有し、そして当該医薬組成物は、1nMから1M(例えば、1nMから10nM、1nMから100nM、1nMから1μM、1nMから10μM、1nMから100μM、100μΜ、1mM、100μΜから10mM、100μΜから100mM、または100mMから1Μ)の範囲のジャスモネート化合物の濃度を有する。
この医薬組成物は、以下の特徴の一つ以上を有していてもよい。
当該ジャスモネート化合物は、ジャスモン酸、7−イソ−ジャスモン酸、9,10−ジヒドロジャスモン酸、9,10−ジヒドロ−イソジャスモン酸、2、3−ジデヒドロジャスモン酸、3,4−ジデヒドロジャスモン酸、3,7−ジデヒドロジャスモン酸、4,5−ジデヒドロジャスモン酸、4,5−ジデヒドロ−7−イソジャスモン酸、ククルビン酸、6−エピ−ククルビン酸、6−エピ−ククルビン酸−ラクトン、12−ヒドロキシ−ジャスモン酸、12−ヒドロキシ−ジャスモン酸−ラクトン、11−ヒドロキシ−ジャスモン酸、8−ヒドロキシ−ジャスモン酸、ホモ−ジャスモン酸、ジホモ−ジャスモン酸、11−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、8−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、ツベロン酸、ツベロン酸−O−β−グルコピラノシド、ククルビン酸−O−β−グルコピラノシド、5,6−ジデヒドロ−ジャスモン酸、6,7−ジデヒドロ−ジャスモン酸、7,8−ジデヒドロ−ジャスモン酸、シスジャスモン、ジヒドロジャスモン、およびこれらの低級アルキルエステルからなる群より選択される。
当該医薬組成物は、1nMから1μΜ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、または9nMから10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、または950nMまで)、あるいは1nMから100μΜ(例えば、1nMから10nM、10nMから100nM、100nMから1μM、1μΜから10μM、または10μΜから100μΜ)、あるいは1nMから1mΜ(例えば、50nM、100nM、200nM、500nM、1000nMから、または50μM、100μΜ、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、または900μΜまで)、あるいは10μΜから100mΜ(例えば、50μΜから、または90μΜから、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、10mM、20mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、または90mMまで)、あるいは100μΜから1mΜ(例えば、100μΜから、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μΜ)、あるいは100μΜ〜10mΜ(例えば、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、または900μΜから1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、または10mMまで)、あるいは100μΜから100mΜ(例えば、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μMから、または1mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、または100mMまで)、あるいは10μΜから1mΜ(例えば、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、または90μΜから、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、または1mMまで)、あるいは1〜100mΜ(例えば、1〜10mM、1〜20mM、1〜30mM、1〜40mM、1〜50mM、1〜60mM、1〜70mM、1〜80mM、または1〜90mM)、あるいは100mMから1M(例えば、0.2Μから、0.3Μ、0.4Μ、0.5Μ、0.6Μ、0.7Μ、0.8Μ、0.9Μ、1Mまで)の範囲のジャスモネート化合物の濃度を有する。
当該ナノキャリアは、シクロデキストリンから形成され、そして3nmから100nm、例えば、3.5〜11nm、10〜20nm、10〜30nm、10〜40nm、10〜50nm、10〜60nm、10〜70nm、10〜80nm、10〜90nm、20〜30nm、20〜40nm、20〜50nm、20〜60nm、20〜70nm、20〜80nm、20〜90nm、30〜40nm、30〜50nm、30〜60nm、30〜70nm、30〜80nm、30〜90nm、40〜50nm、40〜60nm、40〜70nm、40〜80nm、40〜90nm、または50〜60nm、50〜70nm、50〜80nm、50〜90nm、または50〜100nmの範囲のサイズを有する。
当該ナノキャリアは、リポソームまたはLDEであり、そして30nmから500nm、例えば、50nm〜110nm、30nm〜50nm、30nm〜100nm、30nm〜150nm、30nm〜200nm、30nm〜250nm30nm〜300nm、30nm〜350nm、30nm〜400nm、または30nm〜450nmの範囲のサイズを有する。
当該マイクロキャリアは、リポソームまたはLDEであり、そして約2μmから30μm(例えば、2〜5μm、2〜10μm、2〜15μm、2〜20μm、または2〜25μm)、約5μmから20μm(例えば、5〜7.5μm、5〜10μm、5〜12.5μm、5〜15μm、または5〜17.5μm)の範囲、あるいは約10μmのサイズを有する。更に、当該ジャスモネート化合物は、MDJであり、そしてMDJの濃度の範囲は、100mMから1M(例えば、0.2Μから、0.3Μ、0.4Μ、0.5Μ、0.6Μ、0.7Μ、0.8Μ、0.9Μ、1Mまで)である。
当該ナノキャリアは、デンドリマーから形成され、そして2nmから500nm(例えば、2〜10nm、2〜20nm、2〜50nm、2〜100nm、2〜150nm、2〜200nm、2〜250nm、2〜300nm、2〜350nm、2〜400nm、2〜450nm、10〜100nm、10〜200nm、10〜300nm、10〜400nm、10〜500nm、50〜100nm、50〜200nm、50〜300nm、50〜400nm、50〜500nm、100〜300nm、100〜500nm、200〜500nm、300〜500nm、または400〜500nm)の範囲のサイズを有する。
当該デンドリマーは、ポリアミドアミン(PAMAM)である。
当該ジャスモネート化合物は、MDJであり、そしてMDJの濃度の範囲は、1nMから10〜100μM、10〜100μΜから100mM、または100mMから1M、例えば、100μΜから1mΜまたは50nMから70nMである。
当該ジャスモネート化合物は、MJであり、そしてMJの濃度の範囲は、1nMから1μM、10〜100μΜから100mM、または100mMから1M、例えば、100μΜから1mΜまたは50nMから70nMである。
当該ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、更に、2−アミノエチルリン酸二水素(またはホスホエタノールアミン)、3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナール(またはシトラール)、サリチル酸メチル、アブシジン酸またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む。3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナールは、シスまたはトランス異性体のいずれかであり得る。
当該医薬として許容される溶媒は、水、アルコール、またはそれらの混合物である。本明細書に記載の化合物のいずれかは、更に、一つ以上の非ジャスモネート化合物、例えば、2−アミノエチルリン酸二水素(またはホスホエタノールアミン)、3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナール(またはシトラール)、サリチル酸メチル、アブシジン酸、天然アミノ酸、Ca2+、Zn2+、またはこれらの誘導体もしくは類似体、を含み得る。
更に別の態様において、本開示は、本明細書に記載のナノ担持および/またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物あるいはそれらの医薬組成物を、癌または炎症性疾患(例えば、炎症性腸疾患、急性皮膚炎、骨盤内炎症性疾患、もしくは扁桃炎)といった血管新生関連疾患の治療または予防のために使用することについて記載する。
更に別の態様において、本開示は、本明細書に記載のナノ担持および/またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物あるいはそれらの医薬組成物を、ウイルス、細菌、または真菌感染症といったNF−κΒ関連疾患の治療または予防のために使用することについて記載する。
更に、本発明は、本明細書に記載のナノ担持および/またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物あるいはそれらの医薬組成物を、インビトロまたはインビボにおける癌細胞の増殖を阻害するために使用することを特徴とする。例えば、本発明の方法での使用に適した癌細胞株としては:UACC62−黒色腫、ΜCF7−癌耐性、NCIADR−多剤耐性乳癌、7860−腎臓癌、NC1460−肺癌、PC03−前立腺癌耐性、OVCAR03−卵巣癌、HT29−結腸癌、K562−白血病、TCP−1003(トリプルネガティブ乳癌、パネル3)、Caco−2−結腸癌、間葉様または管腔状の形態を共通にする18トリプルネガティブ乳腫瘍細胞株のパネル;乳癌細胞株HCC38(ATCC(登録商標)番号:CRL−2314(商標))およびMCF7(ATCC(登録商標)番号:HTB−22(商標));前立腺腺癌細胞株PC−3(ATCC(登録商標)番号:CRL−1435(商標));前立腺癌細胞株VCaP(ATCC(登録商標)番号:CRL−2876(商標));前立腺癌腫細胞株22Rvl(ATCC(登録商標)番号:CRL−2505(商標));前立腺癌腫細胞株DU145(ATCC(登録商標)番号:HTB−81(商標));前立腺癌腫細胞株LNCaPクローンFGC(ATCC(登録商標)番号:CRL−1740(商標));白血病細胞株MOLT−4(ATCC(登録商標)番号:CLR−1582(商標));白血病(AML)細胞株KG−1(ATCC(登録商標)番号:CCL−246(商標));白血病(CML)細胞株K−562(ATCC(登録商標)番号:CCL−243(商標));白血病ヒト細胞株CCRF−CEΜ(ATCC(登録商標)番号:CCL−119(商標));CLL白血病細胞株Hs.505.T(ATCC(登録商標)番号:CRL−7306(商標));Jurkat細胞株(白血病、ATCC(登録商標)番号:TIB−156(商標));Μolm細胞株(白血病、例えば、Molm−13、Μolm−14、Μolm−16、Μolm−17、およびMolm−18)、Nomo細胞株(白血病、例えば、NOMO−1)、ならびにRas変異細胞が挙げられる。
本明細書に記載のナノ担持および/またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物(例えば、MDJ)あるいはこれらの医薬組成物には、次のような利点がある。これらは、インビトロおよび/またはインビボで、例えば前立腺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、白血病などにわたる癌では抗癌活性を示すが、一方、インビボで健康な細胞に対する毒性をほとんどまたは全く示さない。それらの新規な作用機構は、前立腺癌用に確立された他の薬物療法を補完するものであってもよい。例えば、進行した疾患に対し、本発明の組成物は、副作用を有する積極的療法の使用を減らし、そして、局所的な疾患に対し、本発明の組成物は、ホルモン療法に対する感受性の効果を延長し転移性疾患に進行することを遅らせるものであってもよい。
また、本開示は、本明細書に記載のナノ担持および/またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物あるいはそれらの医薬組成物を合成する方法についても記載する。
用語「A−14」および「A14」は、図面中で交換可能に使用され、測定に使用するMDJ−ナノキャリア複合体を指す。
ジャスモネートは、ヒト癌細胞のミトコンドリアに直接かつ選択的に作用する有力な抗癌剤であることが見出されている(例えば、RoteΜら、Cancer Res2005;65:1984〜1993;Costantiniら、JNCI2000;90:1042〜1053参照)。ジャスモネートのメンバーおよびこれらの合成誘導体のいくつかは、インビトロおよびインビボでの抗癌活性を示すことが報告されている。例えば、ジャスモネートは、EL−4リンパ腫を有するマウスの寿命を延ばし、MJは、化学療法抵抗性のBリンパ腫細胞に有効であり、また、予備的なデータにより、MJは、アポトーシス経路を介した細胞毒性を示すことが示唆されている(例えば、Flescher、Cancer Lett.2007;245(1〜2):1〜10;Fingrutら、Br J Pharmacol.2005;146(6):800〜808;Fingrutら、Leukemia,2002;16:608〜616参照)。ジャスモネートの抗癌活性を説明する機構が提案されている(同文献および図37参照)。しかしながら、抗がん剤のこの新しいファミリーが直面する大きな問題は、化合物をインビボで投与することが困難なことである。ジャスモネートはエステルなので、インビボで投与した場合、通常標的癌細胞に到達する前に、例えば、エステラーゼによって代謝されるため、抗がん剤としての魅力があまりない。
本発明は、ナノ担持および/またはマイクロ担持されたジャスモネートの医薬組成物を提供する。本発明の組成物は「医薬」組成物であることを意図しており、つまり、それらが医薬用途に適していることを意味する。従って、本明細書で使用する用語「組成物」は、「医薬」についての明確な記載がなくとも医薬組成物を包含することを意味する。本発明の組成物は、好ましくは、インビボで標的細胞に到達する前のジャスモネートの分解に対して安定性を与える。本発明は、部分的に、ナノ担持および/またはマイクロ担持されたジャスモネート、特に、ナノ担持および/またはマイクロ担持されたMDJが抗血管新生活性を示すという予想外の発見に基づく。また、本発明は、部分的に、ナノ担持および/またはマイクロ担持されたMDJは、腫瘍細胞に対してナノ担持されたMJよりもかなり効果的、例えば、少なくとも103倍効果的であり、正常な細胞および血管に対する毒性はより低いという予想外の発見にも基づく。また、本発明は、部分的に、ナノ担持および/またはマイクロ担持されたジャスモネート、特に、ナノ担持および/またはマイクロ担持されたMDJまたはMJは、用量または濃度の違いに基づき抗血管新生活性または血管新生活性のいずれかを示すという予想外の発見にも基づく。例えば、1nΜから約10〜100μMという低濃度では、ナノ担持および/またはマイクロ担持されたMDJは血管新生効果を示すが、一方100μMを超える濃度では、ナノ担持および/またはマイクロ担持されたMDJは抗血管新生効果を示す。MJでは、1nMから約1μMという低濃度でナノ担持および/またはマイクロ担持されたMJは血管新生効果を示し、一方、1μΜを超える濃度(例えば、2μΜ超または5μΜ超)ではナノ担持および/またはマイクロ担持されたMJは抗血管新生効果を示す。
上記の予想外の発見は、ナノ担持された/マイクロ担持されたジャスモネートが新規および有望な標的抗癌治療として使用されることを示唆している。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「a」「an」および「the」は、文脈で明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「ジャスモネート化合物(単数形)」であれば、単一のジャスモネートのみならず、プロドラッグ、エステル、塩、それらの代謝産物を含む2以上の異なるジャスモネートの組合せまたは混合物をも包含する。
本明細書で使用する語句「例えば」、「例として」、「といった」、または「含む」といった語句は、対象をより一般的に明確化するための例として導入するという意味である。これらの例示は、本開示を理解するための一助としてのみ提供され、いかなる様式でも限定的であることを意味しない。
本発明の明細書および特許請求の範囲では、以下の用語を下記の定義に従って使用する。
本明細書で使用する語句「含有する」、「から形成される/成る」、「含む」、「組成を有する」、または「構造を有する」は、限定的であることを意図しておらず、文脈で明確に指示しない限り、一般的に用いられる「含む」という用語と同様に使用する。
本明細書で使用する用語「ナノキャリア」とは、標的細胞、組織、または臓器に有効成分(例えば、薬物)を担持および送達するのに適したキャリアまたはビヒクルを指し、そして、ビヒクルは、約1ナノメートル(nm)から約1000nmの範囲のサイズを有する。本明細書で使用する用語「マイクロキャリア」は、標的細胞、組織、または臓器に有効成分(例えば、薬物)を担持および送達するのに適したキャリアまたはビヒクルを指し、そして、ビヒクルは、約1ミクロンから約100ミクロンの範囲のサイズを有する。一の実施形態では、マイクロキャリアは、ナノキャリアの集団から形成される、例えば、LDEマイクロキャリアはLDEナノキャリアの集団から形成される。好ましくは、ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、医薬として許容されるキャリアである。
本明細書で使用する用語「ナノ担持された/マイクロ担持された化合物」または用語「化合物を含有するナノキャリア/マイクロキャリア」とは、化合物に会合または結合したナノキャリア/マイクロキャリアの複合体を指す。会合または結合とは、化学結合(例えば、共有結合)、水素結合、ファンデルワールス力、クーロン相互作用等を介して成されるものである。一の実施形態では、化合物は、ナノキャリア/マイクロキャリア中にカプセル化されている。別の実施形態では、化合物は部分的にナノキャリア/マイクロキャリア中にカプセル化されているか、またはナノキャリア/マイクロキャリアの表面に存在する(例えば、ナノキャリア/マイクロキャリアの表面の一部として存在する、もしくは表面の外側に存在するが表面に付着しているかのいずれか)。
用語「エマルジョン」は、第二液(連続相)中に分散した第一液(分散相)の小球または粒子の懸濁液を指し、第一液は通常非混和性である。
本明細書で使用する用語「ナノエマルジョン」は、約1nmから約50μm(例えば、1nm〜50μm、1nm〜40μm、1nm〜30μm、1nm〜20μm、1nm〜10μm、1〜5000nm、1〜4000nm、1〜3000nm、1〜2000nm、1〜1000nm、1〜900nm、1〜800nm、1〜700nm、1〜600nm、1〜500nm、1〜400nm、1〜300nm、1〜200nm、1〜150nm、1〜100nm、1〜90nm、1〜80nm、1〜70nm、1〜60nm、1〜50nm、1〜40nm、1〜30nm、1〜20nm、1〜10nm、1〜5nm、50〜100nm、3〜150nm、または3〜20nm)の範囲のサイズの分散粒子を有するエマルジョンを指す。ナノエマルジョンは、分散相のサイズが小さいため透明に見えがちである。
用語「LDE」は、組成物および挙動において低密度リポタンパク質(LDL)に類似するナノエマルジョン粒子を指す。例えば、一旦循環系に導入されると、様々な血漿タンパク質(例えば、アポE)が、LDE粒子の表面上に吸着し、続いてLDEがLDL受容体(LDLR)を発現する細胞へと向かう。LDEは、タンパク質を含まず、そして典型的にはリン脂質単層によって囲まれたコレステリルエステルのコアから成る。LDEおよびそれらの調製物のより詳細な説明については、例えば、Ginsburgら(1982)、J Biol Chem 257:8216〜8227;Μaranhaoら(1993)、Lipids 28:691〜696;およびFaveroら(2010)、Biol Res 43:439〜444を参照のこと。本明細書で使用する用語「LDE」は、例示の発明に応じて使用可能なリポソーム様ナノキャリアおよびまたはマイクロキャリアの一例を指す。他の適当なリポソーム様ナノキャリアおよび/またはマイクロキャリアを決定するのは、当該技術分野において通常のレベル内である。
用語「コレステリルエステル」は、コレステロールのエステルを指す。例えば、エステル結合が、脂肪酸のカルボキシレート基とコレステロールのヒドロキシル基との間に形成される。コレステリルエステルの例としては、コレステリルオレエート、コレステリルネルボネート等が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「リン脂質」とは、脂質二重層を形成する能力があるため全細胞膜の主成分となる脂質のクラスを指す。ほとんどのリン脂質は、ジグリセリド、リン酸基、およびコリンのような単純な有機分子を含有する。この法則の唯一の例外は、グリセロールの代わりにスフィンゴシンに由来する、スフィンゴミエリンである。リン脂質の例として、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスホイノシチド(例えば、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸、およびホスファチジルイノシトール三リン酸)が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の化合物は、非芳香族二重結合および1以上の不斉中心を含有してもよい。従って、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオマーの混合物、およびシスまたはトランス異性体の形態として生じ得る。そのような異性体の全ての形態を意図する。例えば、本明細書に記載のジャスモネート化合物は、不斉炭素に基づきそして光学的に純粋な任意の光学異性体、種々の光学異性体の任意の混合物、又はラセミ体の形態の全てを含む。MDJの立体異性体の例としては、例えば、(lR,2R)−ジヒドロメチルジャスモネート、(1R,2S)−ジヒドロメチルジャスモネート、(lS,2R)−ジヒドロメチルジャスモネート、および(1S,2S)−ジヒドロメチルジャスモネートが挙げられる。ジャスモン酸メチルの異性体の例として、シスまたはトランス(lR,2R)−ジャスモン酸メチル,シスまたはトランス(lR,2S)−ジャスモン酸メチル、シスまたはトランス(lS,2R)−ジャスモン酸メチル、およびシスまたはトランス(lS,2S)−ジャスモン酸メチルが挙げられる。
本発明は、本化合物中に存在する原子の同位体の全てを含むことを意図する。同位体には、同じ原子番号を有するが質量数が異なる原子を含む。一般的な例として、水素の同位体にはトリチウムおよび重水素が挙げられ、そして炭素の同位体にはC−13およびC−14が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する用語「アルキル」は、必ずしも必須ではないが、典型的に、1〜約24個の炭素原子を有する分枝または非分枝の飽和炭化水素基を指し、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル、オクチル、デシル等、加えてシクロペンチルおよびシクロヘキシル等のシクロアルキル基が挙げられる。必ずしも必須ではないが、一般的に、本明細書のアルキル基は1〜約18個の炭素原子を含むことがあり、当該アルキル基は1〜約12の炭素原子を有することもある。用語「低級アルキル」は、1〜6個の炭素原子、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、または6個の炭素原子を有する基を意図する。
医薬組成物
また、本発明は、ジャスモネート化合物および少なくとも1つの医薬として許容される賦形剤またはキャリア、例えば、本明細書に記載のナノキャリア/マイクロキャリアを含む医薬組成物も提供する。
また、本発明は、ジャスモネート化合物および少なくとも1つの医薬として許容される賦形剤またはキャリア、例えば、本明細書に記載のナノキャリア/マイクロキャリアを含む医薬組成物も提供する。
一の実施形態では、本発明の組成物に使用するナノキャリアは、シクロデキストリンから形成される。シクロデキストリン(CD)は、α−1,4−C−O−C鎖によって連結されたD−L(+)−グルコースユニットから形成される環状オリゴ糖である。CDは、酵素変換によりデンプンから製造される。天然のCDは、グルコース単位により形成され、例えば、α−、β−、およびγ−CDはそれぞれ、6、7、および8グルコース単位からなる。より多くの本発明に適したCDの例が、例えば、WO2010/006392号、US2008/044364号、およびEP392608号に記載されている。
別の実施形態では、本発明の組成物に使用するナノキャリア/マイクロキャリアは、LDEである。特に、本発明で使用するLDEは、ホスファチジルコリン、オレイン酸、コレステロール、およびトリオレインを含む。他のリポソーム様キャリアを使用することもできる。
別の実施形態では、本発明の組成物に使用するナノキャリアは、PAMAMといったデンドリマーから形成される。下の表は各世代の特徴としてPAMAMデンドリマーのサイズを示している。より多くのデンドリマーの例が、例えばWO2010/006392号に記載されている。
更に別の実施形態では、ナノキャリア/マイクロキャリアはリポソームである(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的とするリポソームを含む)。本発明の化合物のリポソーム製剤は、少なくとも1つのポリマー、油、少なくとも一つの表面活性剤および溶媒を含む。当業者は、任意の好適なポリマー、油、表面活性剤および/または溶媒を、リポソーム製剤のために用いることができることを認識するだろう。本発明での使用に適したリポソーム製剤を決定するのは、当該技術分野において通常の範囲内である。リポソーム製剤用のポリマーの例として、例えば、ポリカプロラクトン、PHB−ポリヒドロキシ酪酸、PMMA−ポリ(メチルメタクリレート)、キトサン、およびβ−シクロデキストリンが挙げられる。油相に使用される油の例として、例えば、イソデシルオレエート、鉱油、およびEMU油が挙げられる。表面活性剤の例として、例えば、モノステアリン酸ソルビタン、レシチン(例えば、大豆レシチン)、およびポリソルベート80が挙げられる。レシチンは、任意の天然および/または合成レシチンならびに/あるいはそれらの混合物であり得る。リポソーム製剤に使用される溶媒の例として、アセトン、エタノール、および超純水が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で用いられるリポソームの非限定的な例の1つは、大豆または卵ホスファチジルコリン(またはレシチン)から形成されるリポソームである。これらは、当業者に公知の方法に従って、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されるように、調製することができる。よって、使用するリポソーム製剤そのものは、治療中の癌に応じて選択することになるだろう。特定のリポソーム製剤は、ある種の癌に対し、他の製剤に比べて効きが良い。
一の実施形態では、ナノキャリアのサイズは、1nmから1000nm、例えば、900〜1000nm、1〜900nm、1〜800nm、1〜700nm、1〜600nm、1〜500nm、1〜400nm、1〜300nm、1〜200nm、1〜150nm、1〜100nm、1〜90nm、1〜80nm、1〜70nm、1〜60nm、1〜50nm、1〜40nm、1〜30nm、1〜20nm、1〜10nm、1〜5nm、2〜300nm、20〜200nm、50〜150nm、または3.5〜11nmの範囲にある。
一の実施形態では、マイクロキャリアのサイズは、2μmから50μm、例えば、2〜5μm、2〜10μm、2〜15μm、2〜20μm、2〜25μm、2〜30μm、2〜40μm、2〜50μm、5〜20μm、5〜10μm、または7.5〜10μmの範囲にある。
一の実施形態では、医薬組成物中のジャスモネート化合物は、ジャスモン酸、7−イソ−ジャスモン酸、9,10−ジヒドロジャスモン酸、9,10−ジヒドロ−イソジャスモン酸、2,3−ジデヒドロジャスモン酸、3,4−ジデヒドロジャスモン酸、3,7−ジデヒドロジャスモン酸、4,5−ジデヒドロジャスモン酸、4,5−ジデヒドロ−7−イソジャスモン酸、ククルビン酸、6−エピ−ククルビン酸、6−エピ−ククルビン酸−ラクトン、12−ヒドロキシ−ジャスモン酸、12−ヒドロキシ−ジャスモン酸−ラクトン、11−ヒドロキシ−ジャスモン酸、8−ヒドロキシ−ジャスモン酸、ホモ−ジャスモン酸、ジホモ−ジャスモン酸、11−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、8−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、ツベロン酸、ツベロン酸−O−β−グルコピラノシド、ククルビン酸−O−β−グルコピラノシド、5,6−ジデヒドロ−ジャスモン酸、6,7−ジデヒドロ−ジャスモン酸、7,8−ジデヒドロ−ジャスモン酸、シスジャスモン、ジヒドロジャスモン、およびこれらの低級アルキルエステルからなる群より選択される。好ましくは、本発明の組成物は、メチルジヒドロジャスモネートを含む。本発明に適したジャスモネート化合物の他の例は、例えば、WO02/080890号およびGfellerら Sci. Signal.2010,Vol.3,Issue109,pp.cm3に見ることができる。
一の実施形態では、本発明の組成物は、1nMから100mM、例えば、1nMから99mM、1nMから90mM、1nMから80mM、1nMから70mM、1nMから60mM、1nMから50mM、1nMから40mM、1nMから30mM、1nMから20mM、1nMから10mM、1nMから5mM、1nMから1mM、1nMから900μM、1nMから800μM、1nMから700μM、1nMから600μM、1nMから500μM、1nMから400μM、1nMから300μM、1nMから200μM、1nMから100μM、1nMから90μM、1nMから80μM、1nMから70μM、1nMから60μM、1nMから50μM、1nMから40μM、1nMから30μM、1nMから20μM、1nMから10μM、1nMから5μM、1nMから1μM、1nMから900nM、1nMから800nM、1nMから700nM、1nMから600nM、1nMから500nM、1nMから400nM、1nMから300nM、1nMから200nM、1nMから100nM、1nMから90nM、1nMから80nM、1nMから70nM、1nMから60nM、1nMから50nM、1nMから40nM、1nMから30nM、1nMから20nM、1nMから10nM、1nMから5nM、1nMから1mM、100nMから1mM、100nMから100μM、1〜100μM、10〜50μM、20〜30μM、100μΜから10mM、100μΜから100mM、1〜100mM、1〜100nM、および59〜64nMの範囲の濃度のジャスモネート化合物(例えば、MDJ)を有する。
一の実施形態では、本発明の組成物は、100mMから1Μ、例えば、0.2Μ、0.3Μ、0.4Μ、0.5Μ、0.6Μ、0.7Μ、0.8Μ、0.9Μから1M、100mMから1Μ、200mMから750mM、または約0.8〜1Μの範囲の濃度のジャスモネート化合物(例えば、MDJ)を有する。
一の実施形態では、この組成物を白血病の治療に用いるとき、該組成物に含まれるジャスモネート化合物(例えば、MDJ)の濃度は、100μΜから5mM、100μΜから4mM、100μΜから3mM、100μΜから2mM、100μΜから1mM、100μΜから0.5mM、0.01mΜから約2mM、または約1mM、10μΜから5mM、10μΜから4mM、10μΜから3mM、または10μΜから2mMの範囲にある。別の実施形態では、この組成物を固形腫瘍の治療に用いるとき、該組成物に含まれるジャスモネート化合物(例えば、MDJ)の濃度は、1nMから1Μ(例えば、1nMから0.5M、1nMから0.1M、1nMから50mM、1nMから10mM、1nMから5mM、10nMから1M、または1nΜから約1mM、または1μΜから1M、または1〜1000nM、1〜500nM、1〜250nM、約1〜100nM、1〜50nM、1〜10nM、または1〜5nM)の範囲にある。
ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、ジャスモネート化合物に加えて、更に、非ジャスモンネート分子またはイオンを含有してもよい。例えば、2−アミノエチルリン酸二水素(またはホスホエタノールアミン)、3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナール(またはシトラール)、サリチル酸メチル、アブシジン酸、天然アミノ酸、Ca2+、Zn2+、またはこれらの誘導体もしくは類似体が挙げられる。3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナールは、シスまたはトランス異性体のいずれかであり得る。これらの非ジャスモンネート分子またはイオンは、ジャスモネート化合物またはナノ/マイクロキャリアと会合または結合することができる。いくつかの実施形態では、非ジャスモネート化合物は、ジャスモネート化合物として同一のナノ/マイクロキャリアに含有させることができる。しかしながら、他の実施形態では、非ジャスモネート化合物は、ジャスモネート化合物とは異なるナノ/マイクロキャリアに含有させて、これらのキャリアの両方を同時に投与することができる。会合または結合とは、化学結合(例えば、共有結合)、水素結合、ファンデルワールス力、クーロン相互作用等を介して成されるものである。一の実施形態では、非ジャスモネート化合物は、ナノキャリア/マイクロキャリア中にカプセル化されている。別の実施形態では、化合物は部分的にナノキャリア/マイクロキャリア中にカプセル化されているか、またはナノキャリア/マイクロキャリアの表面に存在する(例えば、ナノキャリア/マイクロキャリアの表面の一部として存在する、もしくは表面の外側に存在するが表面に付着しているかのいずれか)。
一の実施形態では、ナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物(例えば、MJまたはMDJ)は、例えばシトラールおよび/またはホスホリルエタノールアミン分子と共有結合させるといった合成的修飾を施すことができる。具体的には、反応は、ジャスモネート化合物の任意のカルボニル基、例えば、ジャスモネート化合物(例えば、MJ又はMDJ)のシクロペンチル環上のケトン(E1)またはジャスモネート化合物のエステル(E2)のカルボニル、で行うことができる。ジャスモネートのケトン(またはエステル基)とホスホリルエタノールアミンのアミン基(R1)との反応により、イミンまたはヘミアミナール(またはアミド)の形成が可能である。ジャスモネートとシトラールとの間の反応の収率は、まず、シトラールのアルデヒド基を還元して還元シトラール化合物(「R2」)を形成するか、または(C−6)二重結合を水和してR3を形成することにより改善できる。これらの予備的な工程によりR2またはR3中にヒドロキシル基がもたらされ、これらはジャスモネート化合物のケトン(E1)と反応してケタールもしくはエステルを形成し、または、ジャスモネート化合物のエステル(E2)基と反応して新しいエステルを形成する。
これらの化合物、すなわち、ジャスモネート(例えば、MJまたはMDJ)、ホスホリルエタノールアミンRl、シトラール、R2、およびR3間の反応により:R1−(E1)MJ;R1−(E2)MJ;R1−(E1)MJ(E2)−Rl;R2−(E1)MJ;R2−(E2)MJ;R2−(E1)MJ(E2)−R2;R3−(E1)MJ;R3−(E2)MJ;R3−(E1)MJ(E2)−R3、並びにこれらの混合物、例えばR1−(E1)MJ(E2)−R2;R2−(E1)MJ(E2)−R1;R1−(E1)MJ(E2)−R3;R3−(E1)MJ(E2)−R1;R2−(E1)MJ(E2)−R3;R3−(E1)MJ(E2)−R2を含む生成物を生成できるが、これらに限定されない。一の実施形態では、15のジャスモン酸メチルの誘導体分子が上記の方法によって合成された。
「医薬組成物」とは、本発明のナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物を対象への投与に適した形態で含有する製剤のことである。一の実施形態では、医薬組成物は、バルクまたは単位剤形である。単位剤形は、例えば、カプセル、IVバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器の単一ポンプ、またはバイアルを含む様々な形態のいずれかである。組成物の単位用量中の有効成分(例えば、開示されたナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物またはそれらの塩、水和物、溶媒和物、もしくは異性体の製剤)の量は、有効な量であり、関与する特定の治療に応じて変化する。当業者は、患者の年齢および状態によって投与量を日常的に変更することが必要な場合があることを理解するであろう。投与量もまた、投与経路に依存するであろう。経口、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、口腔、舌下、胸膜内、髄腔内、鼻腔内などを含む様々な経路が考えられる。本発明の化合物の局所または経皮投与用の剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤が挙げられる。一の実施形態では、ナノ担持および/またはマイクロ担持された活性化合物を、無菌条件下で、医薬として許容されるキャリア(例えば、ナノキャリア/マイクロキャリア)及び必要な任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と混合する。
本明細書で使用する語句「医薬として許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なく、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適しており、妥当な利益/リスク比に見合う化合物、材料、組成物、キャリア、および/または剤形を意味する。
「医薬として許容される賦形剤またはキャリアまたは溶媒」とは、一般に、安全、非毒性でありかつ生物学的そして他のいずれの基準でも不適切なものではない医薬組成物を調製するのに有用である賦形剤、キャリア、または溶媒を意味し、そしてヒトの医薬用途に加え獣医学的な用途にも許容される賦形剤を含む。ここで使用する「許容される賦形剤」には、1つまたは1つ以上のかかる賦形剤を含む。
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように調合される。投与経路の例としては、例えば、静脈内といった非経口、皮内、皮下、経口(例えば吸入)、経皮(局所)、および経粘膜投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下用に用いられる溶液または懸濁液には、以下の成分を含むことができる:例えば、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液;および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性調節剤である。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアルに封入することができる。
本明細書で使用する用語「治療有効量」とは、同定された疾患または状態を治療、改善、または予防するため、あるいは検出可能な治療効果または阻害効果を発揮するための薬剤の量を指す。効果は、当技術分野で公知の任意のアッセイ方法によって検出できる。対象に対する正確な有効量は、対象の体重、大きさ、および健康状態;症状の性質および程度;治療薬及び投与用に選択した治療薬の組み合わせに依存するであろう。所与の状況に対する治療有効量は、臨床医の技術および判断の範囲内で通常の実験によって決定できる。好ましい態様において、治療すべき疾患または状態は、ウイルス感染である。
任意の化合物(例えば、本明細書中に開示される、ナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物)に関し、治療的有効量は、まず、例えば、新生細胞または動物モデル、通常はラット、マウス、ウサギ、イヌ、またはブタ等のいずれかの細胞培養アッセイにおいて推定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのに使用してもよい。そのような情報を、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために使用できる。予防的/治療的有効性および毒性を、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定してもよく、例えば、ED50(集団の50%において治療的に有効な用量)およびLD50(集団の50%に対して致死的な用量)などが挙げられる。毒性効果および治療効果間の用量比が治療指数であり、これはLD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。投与量は、この範囲内で、使用する剤形、患者の感受性、および投与経路に応じて変更してもよい。
投与量および投与法は、十分な活性剤のレベルをもたらすため、または所望の効果を維持するために調整する。考慮され得る要因としては、疾患状態の重症度、対象の一般的健康状態、年齢、体重、性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、および治療への耐性/反応が挙げられる。長時間作用型医薬組成物を3〜4日ごと、毎週、または2週間に1回、特定の製剤の半減期および除去速度に応じて投与してもよい。
本発明のナノ担持および/またはマイクロ担持された活性化合物を含有する医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスなどの一般的に知られている方法で製造できる。医薬組成物は、ナノ担持および/またはマイクロ担持された活性化合物を医薬として使用できる製剤に加工するのを容易にする賦形剤および/または補助剤を含む医薬として許容されるキャリアの一つ以上を用いて従来の方法で製剤化してもよい。もちろん、適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
注射用途に適した医薬組成物として、無菌注射溶液または分散液を即時調製するための滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散液および滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与に適切なキャリアとして、生理食塩水、静菌水、CremophorEL(商標)(BASF,Parsippany,NJ)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が挙げられる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射針を通過できる程度に流動的であるべきである。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、例えば、細菌および真菌といった微生物の混入作用が起こらないように保存しなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって防止できる。多くの場合、組成物中に例えば糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムといった等張剤を含むことが好ましいであろう。組成物中に例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅らせる薬剤を含ませることにより、注射用組成物の持続吸収をもたらすことができる。
無菌の注射用溶液は、上に列挙した成分の1つ又は組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量のナノ担持および/またはマイクロ担持された活性化合物を加え、必要に応じろ過滅菌することにより調製できる。一般に、分散液は、基礎分散媒および上記に列挙したもののうち必要なその他の成分を含む滅菌ビヒクル中へナノ担持および/またはマイクロ担持された活性化合物を加えることにより調製する。滅菌注射溶液の調製に滅菌粉末を用いる場合、調製方法は、有効成分に加え、予め濾過滅菌した溶液由来の任意の所望の追加成分を粉末にする真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食の医薬として許容されるキャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入または錠剤に圧縮することができる。経口治療で投与する目的で、ナノ担持および/またはマイクロ担持された活性化合物を賦形剤と共に組み合わせ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用できる。また、流体キャリアを用いて、経口組成物をマウスウォッシュとして使用するのに調製でき、流体キャリア中の化合物は、経口的に用いられ、口の中ですすがれ、そして吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤および/またはアジュバント物質を組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含んでもよい:微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンのような結合剤;デンプンまたはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、Primogel、またはコーンスターチのような崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesのような潤滑剤;コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤;スクロースまたはサッカリンのような甘味剤;またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーなどの香味剤である。
吸入投与用に、ナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物は、例えば、二酸化炭素などのガスのような適切な噴射剤を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
経粘膜または経皮手段により全身投与をすることもできる。経粘膜または経皮投与用としての製剤には浸透すべきバリアに適切な浸透剤が使用される。このような浸透剤は当技術分野で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与用としては、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは座薬を使用することによって達成され得る。経皮投与用としては、ナノ担持および/またはマイクロ担持された活性化合物は、当技術分野で一般に知られる軟膏、膏薬、ゲル、またはクリーム剤に製剤化される。
ナノ担持および/またはマイクロ担持された活性化合物の医薬組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤等の、身体から急速に消失しないよう化合物を保護する医薬として許容されるキャリアを用いて調製することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。また、材料は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.から市場入手可能である。
投与の容易化および投与量の均一化のために、経口または非経口組成物を単位剤形で製剤化すると特に有利である。本明細書で使用する単位剤形とは、治療されるべき対象の単位用量として適する物理的に別個の単位を指し;各単位には、必要な医薬キャリアとの関係で所望の治療効果を生じるように計算されたナノ担持および/またはマイクロ担持された活性化合物の所定量が含まれる。本発明の単位剤形の仕様は、ナノ担持および/またはマイクロ担持された活性化合物独自の特性および達成されるべき特定の治療効果により決定されそして直接的に依存する。
医薬組成物は、投与のための説明書と一緒に容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
本発明の組成物に使用するジャスモネート化合物として、これらの塩が挙げられる。また、これらの形態の全てが本発明の範囲内であると意図する。
本明細書で使用する「医薬として許容される塩」とは、親化合物がこれらの酸または塩基塩を形成することにより修飾される本発明の化合物の誘導体を指す。医薬として許容される塩の例として、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸の塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩等が挙げられるが、これらに限定されない。医薬として許容される塩には、例えば、非毒性の無機または有機酸から成る、親化合物の従来の非毒性塩または四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、このような従来の非毒性塩としては、2−アセトキシ安息香酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、1,2−エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリルアルサニル酸(glycollyarsanilic)、ヘキシルレゾルシン酸(hexylresorcinic)、ヒドラバム酸(hydrabamic)、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、スバセチン酸(subacetic)、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び一般のアミン酸、例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、アルギニンなどから選択される無機及び有機酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
医薬として許容される塩の他の例としては、ヘキサン酸、シクロシクロペンタンプロピオン酸、ピルビン酸、マロン酸、3−(4−ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、桂皮酸、4−クロロベンゼンスルホン酸、2−ナフタレンスルホン酸、4−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、4−メチルビシクロ−[2.2.2]−オクト−2−エン−1−カルボン酸、3−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、三級ブチル酢酸、およびムコン酸等が挙げられる。本発明はまた、親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、又はアルミニウムイオンによって置換されるか;あるいは有機塩基、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N−メチルグルカミン、ジエチルアミン、ジエチルアミノエタノール、エチレンジアミン、イミダゾール、リジン、アルギニン、モルホリン、2−ヒドロキシエチルモルホリン、ジベンジルエチレンジアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、ピロリジン、ベンジルアミン、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド等と配位するかのいずれかのときに形成される塩にも及ぶ。
医薬として許容される塩に対する全ての言いまわしは、本明細書で定義する場合、同じ塩の溶媒付加形態(溶媒和物)又は結晶形(多形)を含むことが理解されるべきである。
また、本発明の医薬組成物において使用されるジャスモネート化合物は、例えば、医薬として許容されるエステル等のエステルとして調製できる。例えば、化合物中のカルボン酸官能基を、それに対応するエステル、例えば、メチル、エチル、または他のエステルに変換できる。また、化合物中のアルコール基を、それに対応するエステル、例えば、アセテート、プロピオネート、または他のエステルに変換できる。
また、本発明の医薬組成物において使用されるジャスモネート化合物は、例えば、医薬として許容されるプロドラッグ等のプロドラッグとして調製できる。用語「プロ−ドラッグ」及び「プロドラッグ」は、本明細書において互換可能に使用され、インビボで活性な親薬剤を放出する任意の化合物を指す。プロドラッグは医薬品として望ましい品質(例えば、溶解性、バイオアベイラビリティ、製造性など)の多くを向上することが知られているので、本発明のナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物はプロドラッグの形態で送達できる。よって、本発明は、本特許請求の範囲に記載の化合物のプロドラッグ、ならびに当該プロドラッグおよびこれを含有する組成物を送達する方法をも包含すると意図する。「プロドラッグ」とは、そのようなプロドラッグを対象に投与すると、本発明の活性な親薬剤をインビボで放出する任意の共有結合キャリアをも含むことを意図する。本発明におけるプロドラッグは、日常的な操作またはインビボのいずれかで当該修飾を切断できるように、親化合物に対し化合物中に存在する官能基を修飾することにより調製する。プロドラッグは、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ、またはカルボニル基が、インビボで切断するとそれぞれ遊離ヒドロキシル、遊離アミノ、遊離スルフヒドリル、遊離カルボキシ、または遊離カルボニル基を形成し得る任意の基に結合している本発明の化合物を含む。
プロドラッグの例として、本発明の化合物中のエステル(例えば、酢酸エステル、ジアルキルアミノ酢酸エステル、ギ酸エステル、リン酸エステル、硫酸エステル、および安息香エステルの誘導体)、ヒドロキシ官能基のカルバメート(例えば、Ν、Ν−ジメチルアミノカルボニル)、カルボキシル官能基のエステル(例えば、エチルエステル、モルホリノエタノールエステル)、N−アシル誘導体(例えば、N−アセチル)N−マンニッヒ塩基、シッフ塩基、およびアミノ官能基のエナミノン、オキシム、アセタール、ケタール、並びにケトンおよびアルデヒド官能基のエノールエステル(Bundegaard, H., Design of Prodrugs、p1〜92, Elesevier, New York−Oxford(1985)参照)などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明の医薬組成物において使用されるジャスモネート化合物は、これらの代謝産物であってもよく、例えば、酸および/または塩基性触媒作用から得られる代謝産物、例えば、シスジャスモン酸、トランスジャスモン酸、ヒドロキシメチルシスジャスモネート、ヒドロキシメチルトランスジャスモネート、ヒドロキシルシスジャスモン酸、ヒドロキシルトランスジャスモン酸、エステル交換反応から得たラクトン等;酸化反応から得た代謝物、例えば、ケトメチルシスジャスモネート、ケトメチルトランスジャスモネート、ヒドロキシメチルシスジャスモネート、ヒドロキシメチルトランスジャスモネート、酸化反応から得たジオール、酸化反応から得た立体異性体(例えば、鏡像異性体またはジアステレオマー)、酸化反応から得たエポキシド、および酸化反応から得たラクトン等;ジャスモン酸メチル、ジャスモン酸、およびジヒドロメチルジャスモネートの脱水物;ならびに細胞内プロセス、例えば、リン酸化(例えば、キナーゼを介するもの)または任意の受容体(例えばAKR2受容体およびG−タンパク質共役受容体)との反応、並びに細胞小器官との相互作用、を介して形成された代謝産物等が挙げられる。MDJ代謝物の例としては、ジャスモン酸メチル、ククルビン酸メチル、メチル7−イソ−ジャスモネート、2,3−ジデヒドロ−MDJ、3,4−ジデヒドロ−MDJ、3,7−ジデヒドロ−MDJ、4,5−ジデヒドロ−MDJ、12−ヒドロキシ−MDJ、11−ヒドロキシ−MDJ、8−ヒドロキシ−MDJ、ツベロン酸メチル、12−O−グルコシル−MDJ、11−O−グルコシル−MDJ、12−O−グルコシル−MJ、11−O−グルコシル−MJ、7,8−ジデヒドロ−MDJ、シスジャスモン、ジヒドロジャスモン、サリチル酸メチル、およびアブシジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
追加的にまたは代わりとして、他のジャスモネート関連化合物を本発明の医薬組成物に使用でき、例えば、リノレン酸(LA)由来のシクロペンタノンまたはシクロペンテノン系化合物から形成されたものが挙げられる(例えば、Annals of Botany 100:681〜697,2007;およびAnnu. Rev. Plant Physiol. PlantΜol. Biol.1997. 48:355〜81参照)。
ナノ担持および/またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物、あるいはそれらの医薬として許容される塩、エステル、プロドラッグ、または代謝産物を含む医薬組成物は、経口、経鼻、経皮、肺、吸入、頬側、舌下、腹腔内、皮下、筋肉内、静脈内、直腸内、胸膜内、髄腔内、および非経口的に投与される。一の実施形態では、当該組成物は注射可能な組成物である。当業者は、特定の投与経路に利点があることを認識するであろう。
投与レジメンは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別、および健康状態;治療すべき病状の重症度;投与経路;患者の腎機能および肝機能;ならびに採用する特定の化合物またはその塩に応じて選択される。当該技術分野の医師または獣医は容易に、病状の進行を予防し、対抗し、または停止するために必要な薬物の有効量を決定し処方できる。本発明の方法において使用できる投与レジメンは、毎日、1週間に3回(断続的)、1週間に2回、毎週、または14日に1回を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、投与レジメンは、毎月の投薬または6〜8週毎の投薬を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、投与量は、治療期間中に変化する。例えば、はじめの3〜7日間は、ナノ/マイクロキャリア中に1mMから1M(例えば、1〜1000mM、1〜900mM、1〜800mM、1〜700mM、1〜600mM、1〜500mM、1〜400mM、1〜300mM、1〜200mM、1〜100mM、1〜50mM、1〜40mM、1〜30mM、1〜20mM、1〜10mM、100mMから1Μ)の範囲の高濃度のジャスモネート化合物(例えば、MDJ)を投与してから、より低濃度(例えば、100μΜから5mM、100μΜから4mM、100μΜから3mM、100μΜから2mM、100μΜから1mM、0.01mMから約2もしくは約1mM、10μΜから5mM、10μΜから4mM、10μΜから3mM、または10μΜから2mM)のナノ/マイクロ担持された化合物を投与しても良い。別の実施形態では、組成物を固形腫瘍の治療に用いるとき、該組成物に含まれるジャスモネート化合物(例えば、MDJ)の濃度は、癌の治療用に1nMから1Μの範囲(例えば、1nMから0.5M、1nMから0.1M、1nMから50mM、1nMから10mM、1nMから5mM、10nMから1M、または1nΜから約1mM、または1μΜから1M、あるいは1〜1000nM、1〜500nM、1〜250nM、約1〜100nM、1〜50nM、1〜10nM、または1〜5nM)である。この投与レジメンは、特定の種類の癌(例えば、白血病)の治療では他の種類の癌に対するものより有効であってもよい。
あるいは、最初に低用量を投与し、続いて高用量のナノ/マイクロ担持ジャスモネートを投与してもよい。
あるいは、最初に低用量を投与し、続いて高用量のナノ/マイクロ担持ジャスモネートを投与してもよい。
開示された本発明のナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物の調合および投与の技術は、Remington:the Science and Practice of Pharmacy, 19th edition,Μack Publishing Co., Easton, PA(1995)で見ることができる。一の実施形態では、本明細書に記載のナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物、およびそれらの医薬として許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、またはエステルは、医薬として許容される賦形剤、溶媒、または希釈剤と組み合わせて医薬製剤に使用される。適切な医薬として許容される賦形剤として、不活性固体充填剤または希釈剤および滅菌水溶液または有機溶液が挙げられる。ナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物は、そのような医薬組成物中に、本明細書に記載の範囲内で所望の投与量を供するのに十分な量で存在するであろう。
ナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネートの合成方法
本明細書に記載のナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物およびそれらの組成物は、当該技術分野で公知の技術または本明細書に記載の方法を用いて調製できる。
本明細書に記載のナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物およびそれらの組成物は、当該技術分野で公知の技術または本明細書に記載の方法を用いて調製できる。
例えば、シクロデキストリンをナノキャリアとして用いる場合、本発明のナノ担持された化合物は、適切な溶液(例えば、水溶液)中で、好ましくは高温で、シクロデキストリンと目的のジャスモネート化合物を混合することによって調製できる。本発明の一実施形態では、このように形成されたナノキャリアおよびまたはマイクロキャリアは、1モルのシクロデキストリンあたり約1〜100モル(例えば、1〜90モル、1〜80モル、1〜70モル、1〜60モル、1〜50モル、1〜40モル、1〜30モル、1〜20モル、1〜10モル、または1〜5モル)のジャスモネート化合物を含有する。より詳細な説明は、例えば、US2008/044364号、EP392608号、およびWO2007/145663号で見ることができる。シクロデキストリンマイクロキャリアは、シクロデキストリンナノキャリアの集団から形成できる。
別の例として、LDE(またはリポソーム)をナノキャリアまたはマイクロキャリアとして用いる場合、本発明のナノ担持された又はマイクロ担持された化合物は、予め形成したLDE(またはリポソーム)における目的のジャスモネート化合物を適切な溶液(例えば、水溶液)中で室温より低い温度(例えば、約4℃)でインキュベートし、次いで得られたエマルジョンを、所望のLDEに担持された(またはリポソームに担持された)ジャスモネート化合物を得るための適切な緩衝液で透析することによって調製できる。本発明の一実施形態では、このように形成されたナノキャリアおよびまたはマイクロキャリアは、1モルのLDE(またはリポソーム)あたり約1〜100モル(例えば、1〜90モル、1〜80モル、1〜70モル、1〜60モル、1〜50モル、1〜40モル、1〜30モル、1〜20モル、1〜10モル、または1〜5モル)のジャスモネート化合物を含有する。
一の実施形態では、LDEナノキャリアを次のように調製する。まず、ホスファチジルコリン(例えば、40mg)、コレステリルオレエート(例えば、20mg)、トリオレイン(例えば、1mg)、およびコレステロール(例えば、0.5mg)からなる脂質混合物を4℃で16時間真空乾燥させる。その後、pH8.0の0.01Μ Tris−HCl中で、例えば、51〜55℃の温度範囲の窒素雰囲気下において、ブランソン装置450A型(Ultrasound Arruda,Sao Paulo,Brazil)用いて125ワットの電力で3時間超音波照射を行い、脂質のエマルジョンを調製する。MDJをカプセル化するのに望ましい直径範囲またはサイズ範囲のLDEを得るために、エマルジョンを二工程の遠心分離(例えば、Beckman rotor SW−41による超遠心)で精製する。第一工程では、4℃で30分間200,000gの遠心分離を行い、得られた上部チューブの画分を、吸引除去(1mL)して廃棄する。その後、残りの懸濁液中に、臭化カリウム(KBr)を添加して密度を1.21g/mLに調整する。第二遠心分離(4℃で2時間、200,000×g)後、LDEをチューブの最上部から吸引により回収する。過剰のKBrを、1000倍量のpH8の0.01Μ Tris HClを2回変えた透析により除去する。最後に、このエマルジョンを、層流中で0.22mmの気孔を有するミリポア膜濾過により滅菌し、そして、4℃で30日まで保存する。懸濁液中のLDE粒子のサイズは、光散乱および顕微鏡測定によって決定できる。懸濁液中のLDE粒子の表面電位は、ゼータ電位測定装置ZetaPALS器(Brookhaven Instruments Corporation)(Lima&Μaranhao,2004)により測定できる。
一の実施形態では、ジャスモネート化合物(例えば、MDJ)のLDEキャリア中への取り込みを、次のように行う。MDJを有する50mLのエタノール溶液を500mLのLDEエマルジョン(例えば、上記で調製したものなど)に添加して、1mLあたり3mgのMDJ濃度を有する混合物を作製する。この混合物を15分間室温で撹拌し、次いで4℃で72時間インキュベートする。次いで、このインキュベートした混合物を、200mLの滅菌緩衝液(例えば、Tris−HCl、0.01M)に対し2回透析する。次いで、透析後のエマルジョンを、GC−MSを用いて分析することでLDEキャリア中にカプセル化または結合したMDJの量を決定できる。
特定の実施形態では、本発明のナノエマルジョンは、ジャスモネート化合物に加えて、ポリマー、例えば、平均分子量65000のポリマーポリ(ε−カプロラクトン)またはPCL、シトラール、ホスホリルエタノールアミン、モノステアリン酸ソルビタン(Span(登録商標)60)、およびポリソルベート80(Tween(登録商標)80)から選択される一つ以上の成分から形成される。エマルジョンは、Fessiら、Drug Des Deliv 4(4):295〜302(1989)に記載された方法と同様の方法により調製することができる。簡単に言うと、油(例えば、10.0g)および活性化合物(例えば、MDJ)のみ、または水中(キャリア中に含有される内部の構成要素が)0.05から0.50gの範囲内の混合物中(例えば、400mL)で、Ultra−Turrax Homogenizer(IKA T10 basic Ultra−turrax(登録商標),Ika−Werke,Staufen,Germany)を用いて、例えば、15,000rpmで1分間激しく撹拌して、油/水(O/W)エマルジョンを作成する。次いで例えば、ポリマー(例えば、0.2および2.0gの間のPCL)をアセトン(400mL)に溶解することで調製した有機溶液を、蠕動ポンプ(PumpPro TPΜ600 55RPM,Waton−Marlow,Wilmington,UK)を10%で使用して適度な磁気攪拌の下でO/Wエマルジョン中に注ぐ。10分間撹拌した後、例えば、水(200mL)に1.0gのTween(登録商標)80を溶解することで調製した水溶液も、適度な磁気攪拌下でエマルジョン相に注いだ。蠕動ポンプは、再度、例えば10%で使用する。添加終了後、反応混合物を更に、例えば、10分間、撹拌してもよい。最後の工程で、有機溶媒を除去し、ナノエマルジョンの体積を減圧下で(例えば、Btichi R−21,Switzerlandのようなロータリーエバポレーターを使用して)例えば500mLに濃縮する。第二段階、すなわち、エマルジョンにポリマー溶液を添加することは任意である。
ナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物を特徴づける方法として、半経験的手法を用いたHYPERCHEΜソフトウェアを応用した理論的定性的構造の分析相関(QSAR)が挙げられる。この意味でQSARは、ジャスモン酸またはメチルジヒドロジャスモネートおよび天然シクロデキストリン(CD)から形成されるナノ担持された化合物の安定性を推定するために用いられる。一の実施形態では、計算は、0.1kcal(angstron.mol)-1のrms値でポラック−・リビエールの共役勾配法を用いたAM1の半経験的手法を用いて行った。
定性的に、ΔΗ(=Ebinding)の測定値は、ナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物の形成(すなわち、ナノ/マイクロキャリアおよびジャスモネート化合物の間の会合または結合)が起こるときの系の全エネルギーの最小値を反映する。
したがって、Ebindingにより表される反応の安定性は、形成されたナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物のエネルギーと、ナノ/マイクロキャリアおよび化合物の全エネルギーとの差分から推定できる。
以下の表2は、ジャスモン酸またはメチルジヒドロジャスモネートと天然CD間の会合におけるEbindingの計算結果を示す。
表2に示すように、α−CDとメチルジヒドロジャスモネート間の複合体を除く他の全てのナノ担持された化合物は安定である。また、ジャスモネート化合物とβ−CD間の会合で最も安定なナノ担持された化合物が生成される。
治療方法
本発明は、その過程において異常な血管新生により影響を受ける疾患(または「血管新生関連疾患」)を治療するための方法を提供する。この方法は、そのような治療の必要がある対象に、本発明のナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物、あるいはその医薬として許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、溶媒和物、またはそれらの立体異性体を治療有効量投与することを含む。
本発明は、その過程において異常な血管新生により影響を受ける疾患(または「血管新生関連疾患」)を治療するための方法を提供する。この方法は、そのような治療の必要がある対象に、本発明のナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物、あるいはその医薬として許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、溶媒和物、またはそれらの立体異性体を治療有効量投与することを含む。
本明細書で使用する「その必要がある対象」とは、異常な血管新生が何らかの作用を果たしている疾患を有する対象、または全体の人口に対しそのような疾患を発症するリスクが高い対象のことである。その必要がある対象は、前癌状態を有することがある。好ましくは、その必要がある対象は、癌を有する。「対象」には、哺乳動物が含まれる。哺乳動物は、例えば、ヒト、霊長類、鳥類、マウス、ラット、ニワトリ、犬、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ、又はブタ等の任意の哺乳動物であり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
血管新生関連疾患の一例は癌である。本明細書で用いる用語「癌」は、固形腫瘍ならびに血液がんおよび/または悪性疾患を含む。癌の例として、副腎皮質癌、AIDS関連癌、AIDS関連リンパ腫、肛門癌、肛門直腸癌、肛門管の癌、虫垂癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞癌、皮膚癌(非黒色腫)、胆道癌、肝臓外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、膀胱癌、骨および関節の癌、骨肉腫および悪性線維性組織球腫、脳癌、脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星細胞腫/悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、乳癌、気管支腺腫/カルチノイド、カルチノイド腫瘍、消化器の癌、神経系の癌、神経系リンパ腫、中枢神経系の癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、リンパ系新生物、菌状息肉腫、セザリー症候群、子宮内膜癌、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、目癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃(胃腸)癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、頭頸部癌、肝細胞(肝臓)癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、眼癌、島細胞腫瘍(内分泌膵臓)、カポジ肉腫、腎臓癌、腎性癌、腎臓癌、喉頭癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、口唇および口腔癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、AIDS関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、Waldenstromマクログロブリン血症、髄芽腫、黒色腫、眼内(目)黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、悪性中皮腫、転移性扁平上皮頸部癌、口腔癌、舌癌、多発性内分泌腫瘍症候群、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口腔癌、口腔咽頭癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、プラズマ細胞新生物/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌(多剤抵抗性前立腺癌を含む前立腺癌又は前立腺腺癌)、直腸癌、腎盂及び尿管、移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイング肉腫腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮癌、子宮肉腫、皮膚癌(非黒色腫)、皮膚癌(黒色腫)、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃(胃腸)癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管および他の泌尿器の移行上皮癌、妊娠性絨毛腫瘍、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、子宮体がん、膣がん、外陰癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
血管新生関連疾患他の例としては、眼疾患(例えば、加齢性黄斑変性症または眼の後部の血管新生関連疾患)、心臓血管疾患(例えば、アテローム性動脈硬化症)、慢性炎症(例えば、リウマチ性関節炎またはクローン病)、糖尿病(例えば、糖尿病性網膜症)、乾癬、子宮内膜症、および肥満が挙げられる(例えば、Pharmacological Reviews 52:237 268,2001参照)。
本発明は、ウイルス、細菌、または真菌感染症といったNF−κΒ関連疾患を治療するための方法を提供する。この方法は、そのような治療の必要がある対象に、本発明のナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物、あるいはその医薬として許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、溶媒和物、またはそれらの立体異性体を治療有効量投与することを含む。
本明細書で使用する「治療する」または「治療」とは、疾患、状態、または障害に対抗する目的で患者の管理およびケアすることを言い、そしてその疾患、状態、または障害の症状もしくは合併症を緩和するために、あるいはその疾患、状態、または障害を排除するために、本発明のナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物、あるいはその医薬上許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、または溶媒和物を投与することを含む。
本発明のナノ担持および/またはマイクロ担持された化合物、あるいはその医薬上許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、または溶媒和物は、疾患、状態、または障害を予防するために使用する場合もある。本明細書で使用する「予防する」または「予防」とは、疾患、状態、または障害の症状または合併症の発症を低減または排除することを言う。
本明細書で使用する用語「緩和する」とは、疾患の兆候または症状の重症度を減少させるプロセスを言うことを意味する。重要なのは、兆候または症状は解消されなくとも緩和できるということである。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物の投与により、兆候または症状が、解消される必要がないにしても解消される。兆候または症状の重症度を低減するのに有効な投与量が見込まれる。例えば複数の箇所で起こる癌等の疾患については、複数の箇所のうち少なくとも一箇所において癌の重症度が低減されれば、兆候または症状の重症度が緩和されるということである。
本明細書で言及する全ての特許、特許出願、および刊行物は、その全体を参照することにより援用する。しかしながら、明示定義を含む特許、特許出願、または刊行物を参照により援用する場合において、それらの明示定義は、それらが見られる当該援用特許、特許出願、または刊行物には適用されるが、本願の文中のその他部分、特に本願の特許請求の範囲には適用されないと理解すべきである。
本発明をその好ましい特定の実施態様と共に説明したが、前述の説明ならびに以下の実施例は例示であり、本発明の範囲を限定するものでないという意図であることを理解すべきである。当該技術分野の当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更および均等物への置換が可能であると理解するであろうし、そして、更に他の態様、利点、および改変は、本発明が関係する当該技術分野の当業者にとって明らかであろう。
特に明記しない限り、本明細書で使用される全てのパーセントおよび比率は、重量基準である。本発明の他の特徴および利点は、様々な実施例より明らかである。ここに挙げる実施例は、本発明の実施に有用な様々な成分および方法を例示するものである。これらの実施例は、請求する発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明を実施するのに有用な他の成分および方法を特定および採用することができる。
実施例1:LDEに担持されたΜDJの合成
まず、40mgのホスファチジルコリン、20mgのオレイン酸コレステロール、1mgのトリオレイン、および0.5mgのコレステロールからなる脂質混合物を、4℃で16時間真空乾燥した。次いで、pH8.0の0.01Μ Tris−HCl中で、51〜55℃の温度範囲の窒素雰囲気下において、ブランソン装置450A型(Ultrasound Arruda,Sao Paulo,Brazil)用いて125ワットの電力で3時間超音波照射を行い、脂質のエマルジョンを調製した。MDJをカプセル化するのに望ましい直径範囲またはサイズ範囲のLDEを得るために、エマルジョンを二工程の遠心分離(例えば、Beckman rotor SW−41による超遠心)において精製した。第一工程では、4℃で30分間200,000gの遠心分離を行い、得られた上部チューブの画分を、吸引除去(1mL)して廃棄した。その後、残りの懸濁液中に、臭化カリウム(KBr)を添加して密度を1.21g/mLに調整した。第二遠心分離(4℃で2時間、200,000×g)後、LDEをチューブの最上部画分から吸引により回収した。過剰のKBrを、1000倍量のpH8の0.01Μ Tris−HClを2回変えた透析により除去した。最後に、このエマルジョンを、層流中で0.22mmの気孔を有するミリポア膜濾過により滅菌し、そして、4℃で30日間まで保存した。懸濁液中のLDE粒子のサイズを、光散乱および顕微鏡測定によって決定したところ、29〜400nmであった。懸濁液中のLDE粒子の表面電位を、ゼータ電位測定装置ZetaPALS器(Brookhaven Instruments Corporation)(Lima&Μaranhao,2004)で測定したところ、略−5.43mVと−7.42mVの間であった。
まず、40mgのホスファチジルコリン、20mgのオレイン酸コレステロール、1mgのトリオレイン、および0.5mgのコレステロールからなる脂質混合物を、4℃で16時間真空乾燥した。次いで、pH8.0の0.01Μ Tris−HCl中で、51〜55℃の温度範囲の窒素雰囲気下において、ブランソン装置450A型(Ultrasound Arruda,Sao Paulo,Brazil)用いて125ワットの電力で3時間超音波照射を行い、脂質のエマルジョンを調製した。MDJをカプセル化するのに望ましい直径範囲またはサイズ範囲のLDEを得るために、エマルジョンを二工程の遠心分離(例えば、Beckman rotor SW−41による超遠心)において精製した。第一工程では、4℃で30分間200,000gの遠心分離を行い、得られた上部チューブの画分を、吸引除去(1mL)して廃棄した。その後、残りの懸濁液中に、臭化カリウム(KBr)を添加して密度を1.21g/mLに調整した。第二遠心分離(4℃で2時間、200,000×g)後、LDEをチューブの最上部画分から吸引により回収した。過剰のKBrを、1000倍量のpH8の0.01Μ Tris−HClを2回変えた透析により除去した。最後に、このエマルジョンを、層流中で0.22mmの気孔を有するミリポア膜濾過により滅菌し、そして、4℃で30日間まで保存した。懸濁液中のLDE粒子のサイズを、光散乱および顕微鏡測定によって決定したところ、29〜400nmであった。懸濁液中のLDE粒子の表面電位を、ゼータ電位測定装置ZetaPALS器(Brookhaven Instruments Corporation)(Lima&Μaranhao,2004)で測定したところ、略−5.43mVと−7.42mVの間であった。
MDJを有する50mLのエタノール溶液を、上述の通り調製した500mLのLDEエマルジョンに添加して、1mLあたり3mgのMDJ濃度を有する混合物を作製した。この混合物を15分間室温で撹拌し、次いで4℃で72時間インキュベートした。次いで、このインキュベートした混合物を、200mLの滅菌、0.01M Tris−HCl緩衝液に対し2回透析した。透析後のエマルジョンを、GC−MSを用いて分析することでLDEキャリア中にカプセル化または結合したMDJの量を決定した。ΜDJに対するLDEのモル比は1/10および1/5の間であると決定された。
実施例2:大豆ホスファチジルコリンリポソームに担持されたΜDJおよびポリマーに担持されたΜDJの合成
リポソームに担持されたΜDJ
蓋付の透明な瓶に、適切な量の非イオン性界面活性剤である硬化ヒマシ油ポリオキシエチレン40(ORPH)(EUMULGIN(登録商標)HRE40)および大豆ホスファチジルコリン(FS)(Epikuron(登録商標)200)を、ORPH/FSモル比が1:1になるように加えた。次いで1:1のモル比のオレイン酸ナトリウムおよびコレステロールを、オレイン酸ナトリウム/ORPHモル比が1:5になるように加えた。得られた混合物を0.22μmの膜で濾過した。濾過した溶液を滅菌ボトルに添加し、次いでMDJ(96%、Sigma−Aldrichから購入)を加え、得られるナノエマルジョン1mLあたり10mgの濃度となるようにした(この量はナノエマルジョン1mLあたりのMDJが7mgからの21mgの間で変えてもよい)。ボルテックスによる攪拌と休止期間を交互にはさむことにより、均質化されたナノエマルジョンを生成した。具体的には、滅菌ボトル内の混合物を、不連続に動作するSonic(登録商標)Ultrasonic Liquid Processor(model XL2020TΜ 220ワット)を使用して室温で20分間、超音波処理した。超音波処理後、ナノエマルジョンを、15分間10,000rpmで遠心分離して、チタンロッドソニケータから放出された廃棄物を除去した。得られた混合物をpH7.2のTris−HCl緩衝液(水相)に対して透析した。ナノエマルジョンのリポソームのサイズを測定したところ、50〜500nmであった。また、MDJに対するリポソームのモル比を決定したところ、1/10〜1/5の間であった。
リポソームに担持されたΜDJ
蓋付の透明な瓶に、適切な量の非イオン性界面活性剤である硬化ヒマシ油ポリオキシエチレン40(ORPH)(EUMULGIN(登録商標)HRE40)および大豆ホスファチジルコリン(FS)(Epikuron(登録商標)200)を、ORPH/FSモル比が1:1になるように加えた。次いで1:1のモル比のオレイン酸ナトリウムおよびコレステロールを、オレイン酸ナトリウム/ORPHモル比が1:5になるように加えた。得られた混合物を0.22μmの膜で濾過した。濾過した溶液を滅菌ボトルに添加し、次いでMDJ(96%、Sigma−Aldrichから購入)を加え、得られるナノエマルジョン1mLあたり10mgの濃度となるようにした(この量はナノエマルジョン1mLあたりのMDJが7mgからの21mgの間で変えてもよい)。ボルテックスによる攪拌と休止期間を交互にはさむことにより、均質化されたナノエマルジョンを生成した。具体的には、滅菌ボトル内の混合物を、不連続に動作するSonic(登録商標)Ultrasonic Liquid Processor(model XL2020TΜ 220ワット)を使用して室温で20分間、超音波処理した。超音波処理後、ナノエマルジョンを、15分間10,000rpmで遠心分離して、チタンロッドソニケータから放出された廃棄物を除去した。得られた混合物をpH7.2のTris−HCl緩衝液(水相)に対して透析した。ナノエマルジョンのリポソームのサイズを測定したところ、50〜500nmであった。また、MDJに対するリポソームのモル比を決定したところ、1/10〜1/5の間であった。
ポリマーに担持されたΜDJ/シトラール/ホスホリルエタノールアミン
平均分子量65000のポリ(ε−カプロラクトン)、モノステアリン酸ソルビタン(Span(登録商標)60)、およびポリソルベート80(Tween(登録商標)80)を、Sigma−Aldrich(St.Louis,USA)より入手した。使用した有機溶媒の全てはJ.T.Baker(Ecatepec,Μexico)から購入したHPLCグレードであった。超純水は、Μilli−Q System(18ΜΩ)(Millipore Corporation,Bedford,ΜA,USA)により当方で製造した。シトラール(3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナール)、ホスホリルエタノールアミンおよび/またはジャスモン酸メチルを含有するナノ粒子を次のようにして得た。まず、油(10.0g)および活性化合物のみ、または水中(キャリア中に含有される内部の構成要素が)0.05から0.50gの範囲内の混合物(400mL)中で、15,000rpmのUltra−Turrax Homogenizer(IKA T10 basic Ultra−turrax(登録商標),Ika−Werke,Staufen,Germany)を用いて、1分間激しく撹拌して、油/水(OAV)エマルジョンを作成した。第二段階では、ポリマー(0.2および2.0gの間)をアセトン(400mL)に溶解することで調製される有機溶液を、蠕動ポンプ(PumpPro TPΜ600 55RPM,Waton−Marlow,Wilmington,UK)を10%で使用して適度な磁気攪拌の下でエマルジョン相に注いだ。10分間撹拌した後、水(200mL)に1.0gのTween(登録商標)80を溶解することで調製した水溶液も、適度な磁気攪拌下でエマルジョンに注いだ。蠕動ポンプを再度、10%で使用した。添加終了後、反応混合物を更に10分間撹拌した。最後の工程で、有機溶媒を除去し、ナノ粒子分散液の体積を減圧下で(例えば、Btichi R−21,Switzerlandを使用して)500mLに濃縮した。第一段階で作成したO/Wエマルジョンは、ポリマーがなくとも安定していた。いくつかの異なるナノエマルジョンを調製して分析した。
平均分子量65000のポリ(ε−カプロラクトン)、モノステアリン酸ソルビタン(Span(登録商標)60)、およびポリソルベート80(Tween(登録商標)80)を、Sigma−Aldrich(St.Louis,USA)より入手した。使用した有機溶媒の全てはJ.T.Baker(Ecatepec,Μexico)から購入したHPLCグレードであった。超純水は、Μilli−Q System(18ΜΩ)(Millipore Corporation,Bedford,ΜA,USA)により当方で製造した。シトラール(3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナール)、ホスホリルエタノールアミンおよび/またはジャスモン酸メチルを含有するナノ粒子を次のようにして得た。まず、油(10.0g)および活性化合物のみ、または水中(キャリア中に含有される内部の構成要素が)0.05から0.50gの範囲内の混合物(400mL)中で、15,000rpmのUltra−Turrax Homogenizer(IKA T10 basic Ultra−turrax(登録商標),Ika−Werke,Staufen,Germany)を用いて、1分間激しく撹拌して、油/水(OAV)エマルジョンを作成した。第二段階では、ポリマー(0.2および2.0gの間)をアセトン(400mL)に溶解することで調製される有機溶液を、蠕動ポンプ(PumpPro TPΜ600 55RPM,Waton−Marlow,Wilmington,UK)を10%で使用して適度な磁気攪拌の下でエマルジョン相に注いだ。10分間撹拌した後、水(200mL)に1.0gのTween(登録商標)80を溶解することで調製した水溶液も、適度な磁気攪拌下でエマルジョンに注いだ。蠕動ポンプを再度、10%で使用した。添加終了後、反応混合物を更に10分間撹拌した。最後の工程で、有機溶媒を除去し、ナノ粒子分散液の体積を減圧下で(例えば、Btichi R−21,Switzerlandを使用して)500mLに濃縮した。第一段階で作成したO/Wエマルジョンは、ポリマーがなくとも安定していた。いくつかの異なるナノエマルジョンを調製して分析した。
シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物のうち1つのみを含有し、ポリマーを有さないナノエマルジョン;
シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物のうち任意の2つの混合物を含有し、ポリマーを有さないナノエマルジョン;
3つの化合物、すなわち、シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物を全て含有し、ポリマーを有さないナノエマルジョン;
シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物のうち1つのみを含有するポリマーナノ粒子;
シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物のうち任意の2つの混合物を含有するポリマーナノ粒子;
3つの化合物、すなわち、シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物を全て含有するポリマーナノ粒子;
全てのナノエマルジョンは、高い絶対回収率(>90%)、封入効率(>85%)、そして使用した活性化合物(シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびΜJまたはMDJのようなジャスモネート化合物)の全てに対するコロイド安定性を示した。
実施例3:シクロデキストリンに担持されたΜDJの合成
メチルジヒドロジャスモネートの水性またはアルコール溶液(1×10-3体積モル濃度から1×10-2体積モル濃度)に等量のシクロデキストリンを有するシクロデキストリン溶液を混合することにより、ΜDJ−シクロデキストリンナノエマルジョンを調製した。得られた混合物を、均質なエマルジョンが得られるまで撹拌した。
メチルジヒドロジャスモネートの水性またはアルコール溶液(1×10-3体積モル濃度から1×10-2体積モル濃度)に等量のシクロデキストリンを有するシクロデキストリン溶液を混合することにより、ΜDJ−シクロデキストリンナノエマルジョンを調製した。得られた混合物を、均質なエマルジョンが得られるまで撹拌した。
実施例4:マウスで化学的に誘発した結腸腫瘍の治療用としてシクロデキストリンに担持されたMDJの毒性試験および前臨床評価
上記実施例3で作成したシクロデキストリンに担持されたMDJの効果を、マウスの結腸癌実験モデルにおいて調べた。アポトーシスおよび細胞増殖という腫瘍増殖に関連する2つの最も重要な事象について調査した。結腸腫瘍、隣接する非癌組織、および正常な結腸組織のアポトーシスおよび増殖の指標を決定した。アポトーシスは、アポトーシス核計数およびCASPASE−3免疫染色によって定量し、一方増殖はPCNA免疫染色によって決定した。
上記実施例3で作成したシクロデキストリンに担持されたMDJの効果を、マウスの結腸癌実験モデルにおいて調べた。アポトーシスおよび細胞増殖という腫瘍増殖に関連する2つの最も重要な事象について調査した。結腸腫瘍、隣接する非癌組織、および正常な結腸組織のアポトーシスおよび増殖の指標を決定した。アポトーシスは、アポトーシス核計数およびCASPASE−3免疫染色によって定量し、一方増殖はPCNA免疫染色によって決定した。
材料と方法
動物は国立衛生研究所(米国)の国立研究評議会の実験動物の管理および使用に関する委員会のガイドラインに従い保持した。マウスは、食物および水を不断給餌し、12時間の明/暗サイクル下で広葉樹の寝具上に保持した。動物は実験の間、毎週体重を測定した。全ての実験は、USP動物倫理委員会によって承認された。
動物は国立衛生研究所(米国)の国立研究評議会の実験動物の管理および使用に関する委員会のガイドラインに従い保持した。マウスは、食物および水を不断給餌し、12時間の明/暗サイクル下で広葉樹の寝具上に保持した。動物は実験の間、毎週体重を測定した。全ての実験は、USP動物倫理委員会によって承認された。
簡単に言うと、Balb/cマウスを週2回、2週間(XX)、発癌物質N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG)の直腸内点滴注入により処理し、処理開始から24週間後に屠殺した。実験終了の10日前から、A群の動物(n=10)は、シクロデキストリンに担持されたMDJ(10μLの食塩水中に1体積モル濃度のΜDJ)を体重あたり60グラムで毎日腹腔内に注射することにより処理した。B群の動物(n=10)は、同じ用量のシクロデキストリンに担持されたMDJを毎日直腸内点滴注入することで処理した。C群(n=10)は、MNNGで処理し、MDJ(100μLの生理食塩水中に10%で希釈)を毎日腹腔内に注射した。D群の動物はMNNGで処理し、同じ用量のMDJを毎日直腸内点滴注入した。対照のE群は、MNNG処理のみを行った。対照のFおよびG群は、生理食塩水およびシクロデキストリンに担持されたMDJをそれぞれ腹腔内および直腸内に投与した。対照のHおよびI群には、生理食塩水およびMDJをそれぞれ腹腔内および直腸内に投与した。シクロデキストリンに担持されたMDJおよびMDJの用量は、先に行った動物パイロット研究に基づくものであった。
結腸を採取してH&E用に組織学的処理を行い、化学的に誘発した腫瘍の病理組織学的な特徴を研究しアポトーシス指数をつけた。結腸腫瘍(T)、隣接する非腫瘍部位(NT)、および同じ処置群の非腫瘍ラットの巨視的に正常な結腸粘膜(N)を得た。免疫組織化学手法を実施し、増殖細胞性抗原(PCNA)染色による細胞増殖を調べ、アポトーシス小体の計数およびCASPASE−3染色の両方により細胞のアポトーシスを分析した。PCNA標識指数(PCNA−Li)、アポトーシス指数(AI)、およびCASPASE-3標識指数(CASPASE3−Li)についての結果が示された。また、標準的な血液学および臨床化学パラメータもモニターした。
アポトーシス指数の決定:アポトーシスは、アポトーシス核の計数により決定した。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、切片あたりのアポトーシス細胞の数を評価した。アポトーシス細胞を認識するのに用いる基準は:サイズの収縮、周辺組織との接触の損失(古典名でいうとハローの形成時期に起こる)、および先に記載の核凝縮(Yuら、Gut 2002,51:480〜484)である。5つのランダムな視野中で少なくとも1000細胞を計数し、次いでアポトーシスの特徴を有する細胞の割合(アポトーシス指数またはAI)を算出した。アポトーシス核の数を30のランダムに選択された領域におけるCASPASE−3免疫染色により得られたものと比較した。アポトーシス核の数およびCASPASE−3の結果の間には強い相関が見られた(r=0.83、P<0.001)。
増殖指数の決定:増殖は、先に記載のような増殖細胞核抗原(PCNA)の免疫染色によりアッセイした。簡単に言うと、クエン酸緩衝液中でマイクロ波による抗原賦活後に、各試料からのパラフィン包埋切片を、PCNA抗体で標識した。陰性対照は一次抗体を非免疫血清に置き換えて実施した。スライドを、3,3−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド(DAB,Dako,Denmark)で発色させ、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。増殖指数(PI)は、計数した合計核に対するPGVA陽性核の比率のパーセントとして表した。
統計的分析:結果は、平均+SEとして表した。異なる治療群間の比較を、ボンフェローニの多重比較試験を用いた(分散分析)ANOVAにより行った。P<0.05を統計学的に有意とみなした。全ての統計的計算は、SPSS統計ソフトウェアパッケージ(バージョン11.0、SPSS Inc.)を用いて行った。
結果
シクロデキストリンに担持されたMDJの抗腫瘍効果
(MDJを腹腔内投与した)実験群CおよびHは、早期兆候または腹膜炎のため外した。MNNGで処理したマウスは全て結腸腫瘍を発症したが、一方、対照群のマウスはいずれも結腸癌を発症しなかった。結腸癌を発症したマウスあたりの腫瘍の平均数(4.6)について、群間で統計的に有意な差は認められなかった。アポトーシス指数は、一般的に、隣接する非腫瘍部および正常な結腸組織に比べ結腸腫瘍部のほうが高かった(P<0.005、ANOVA)。各処置群における腫瘍の平均サイズ、並びに、AI、CASPASE−Li及びPCNA−Liを以下の表3にまとめる。
シクロデキストリンに担持されたMDJの抗腫瘍効果
(MDJを腹腔内投与した)実験群CおよびHは、早期兆候または腹膜炎のため外した。MNNGで処理したマウスは全て結腸腫瘍を発症したが、一方、対照群のマウスはいずれも結腸癌を発症しなかった。結腸癌を発症したマウスあたりの腫瘍の平均数(4.6)について、群間で統計的に有意な差は認められなかった。アポトーシス指数は、一般的に、隣接する非腫瘍部および正常な結腸組織に比べ結腸腫瘍部のほうが高かった(P<0.005、ANOVA)。各処置群における腫瘍の平均サイズ、並びに、AI、CASPASE−Li及びPCNA−Liを以下の表3にまとめる。
要約すると、シクロデキストリンに担持されたMDJで処理した動物における結腸癌腫は、E群と比較した場合、PCNA染色の測定による分裂指数の有意な減少(43%)を示した。更に、腹腔内(i.p.)注射したシクロデキストリンに担持されたMDJにより、(アポトーシス小体の計数およびCASPASE−3の発現の測定による)アポトーシス指数が顕著に3倍増加した。この群では、CASPASE−3の発現が強く、そして腫瘍内に均一分布していた(図2)。しかしながら、シクロデキストリンに担持されたMDJの直腸内投与およびMDJの直腸内投与と、上記の腫瘍マーカーの軽度だが有意な減少とが関連していたものの、組織病理学的分析により、CASPASE−3の発現は粘膜上皮の表面に限定されていたことが示された(図3)。
他の組織学的特徴により、AおよびB群において腫瘍に対する免疫防御が増加することが示唆される(腫瘍周辺のリンパ球の数が著しく増加したため計数はしていない)。
発癌物質MNNGで処理した動物およびΜNNG無処理の動物の両者において、MDJおよびシクロデキストリンに担持されたMDJによる処理は、正常結腸粘膜および腫瘍に隣接する粘膜における細胞増殖およびアポトーシスにおける有意な変化とは関連がなかった。
シクロデキストリンに担持されたMDJの毒性効果の欠如
腫瘍においてシクロデキストリンに担持されたMDJの効果が強いにもかかわらず、そしていくつかの挙動不安なシグナルがあったのであるが、組織病理学的分析ならびに標準血液学および臨床化学パラメータのいずれもにおいて、脳、肝臓、脾臓、腎臓、胃腸、および骨髄で毒性の兆候は観察されなかった。
腫瘍においてシクロデキストリンに担持されたMDJの効果が強いにもかかわらず、そしていくつかの挙動不安なシグナルがあったのであるが、組織病理学的分析ならびに標準血液学および臨床化学パラメータのいずれもにおいて、脳、肝臓、脾臓、腎臓、胃腸、および骨髄で毒性の兆候は観察されなかった。
本研究では、組織サンプルにおけるアポトーシスを測定するための簡単かつ定量的な技術としてcaspase−3活性の形態学的検出の使用を評価した。アポトーシス促進酵素であるcaspase−3は内因性および外因性アポトーシス誘導経路の収束点で活性化する(Nakopoulouら、Pathobiology2001,69:266〜273)。本研究の目的は、それらの抗腫瘍効果の根底にある機構についてより多くの洞察を得るために、シクロデキストリンに担持されたMDJおよびMDJで処理した後のマウスの結腸腫瘍および正常粘膜における細胞動態およびアポトーシス変化を特徴づけることである。本研究において、MDJではなくシクロデキストリンに担持されたMDJを用いた処理と、マウスにおけるMNNG誘導性の結腸腫瘍の平均サイズの縮小が関連していたことが実証された。シクロデキストリンに担持されたMDJ(i.p.)を用いた処理により、結腸腫瘍における増殖が軽度に阻害されたが、隣接または離れた正常組織では起こらなかったことがわかった。更に、この処理だけが顕著なアポトーシスの誘導と関連しており、また、これは腫瘍のみで起こっており離れた正常結腸粘膜周辺では起こっていなかったことが注目される。興味深いことに、MDJ処理した動物の腫瘍において高い増殖指数が見られたので、MDJはおそらく上皮細胞に対する細胞毒性効果により粘膜に刺激を与えている可能性が示唆される。
シクロデキストリンに担持されたMDJを処理すると、その結果、著しいアポトーシス誘導および増殖の抑制の両方が一緒にもたらされた。対照的に、MDJは、結腸腫瘍における細胞増殖も阻害せず、アポトーシスの穏やかな増加も誘導しないことが見出された。これらの知見により、シクロデキストリンに担持されたMDJの抗腫瘍効果の根底にあるメカニズムは、MDJ処理群およびシクロデキストリンに担持されたMDJ(i.r.)群では見られないシクロデキストリンに担持されたMDJが有する一腫瘍のあらゆる部分に到達可能な能力に関連している可能性があることが示唆される。重要なことに、シクロデキストリンに担持されたMDJの阻害効果は、非腫瘍細胞には影響を与えず腫瘍細胞にはアポトーシスを誘導したという意味で、癌特異的であることが確認された。
本研究により得られた結果により、全身に注入したシクロデキストリンに担持されたMDJは、少なくとも実施した実験条件において、結腸腫瘍に到達可能で、そして、重大な副作用なく化学的に誘導された結腸腫瘍の増殖を低減可能であることが示された。
実施例5:シクロデキストリンに担持されたΜDJによる癌のスイッチオフ
この実施例に記載の研究により、上記実施例3で作成したシクロデキストリンに担持されたMDJが、NOD−SCIDマウスに異種移植したヒトCaco2腫瘍の著しい収縮を誘発することが示された。更に、シクロデキストリンに担持されたMDJは、血管破壊を誘導し、血管新生および癌幹細胞を阻害した。マイクロアレイ解析により、シクロデキストリンに担持されたMDJは、同時に様々な重要なシグナル伝達経路に影響を与え、それは主にNFκB、HIF−1、およびメタロチオネインの阻害を伴うものであることが示された。結果は、定量的リアルタイムPCR法、ウエスタンブロット法、サウスウエスタン組織化学分析、および免疫組織化学分析により確認した。
この実施例に記載の研究により、上記実施例3で作成したシクロデキストリンに担持されたMDJが、NOD−SCIDマウスに異種移植したヒトCaco2腫瘍の著しい収縮を誘発することが示された。更に、シクロデキストリンに担持されたMDJは、血管破壊を誘導し、血管新生および癌幹細胞を阻害した。マイクロアレイ解析により、シクロデキストリンに担持されたMDJは、同時に様々な重要なシグナル伝達経路に影響を与え、それは主にNFκB、HIF−1、およびメタロチオネインの阻害を伴うものであることが示された。結果は、定量的リアルタイムPCR法、ウエスタンブロット法、サウスウエスタン組織化学分析、および免疫組織化学分析により確認した。
雄NOD−SCIDマウス(6〜8週齢)にCaco2ヒト結腸癌細胞(100μLのPBS中1.5×106)を皮下注射した。一週間後、マウスを無作為に2群に分けた。4週間後、触知可能な腫瘍(20〜25mm2)が確立されたとき、GT群の腹腔内に100μLのシクロデキストリンに担持されたΜDJを一日一回、4日間注射し、対照群にはPBSを投与した(GC群)。腫瘍の容積は以下の式に従って計算した:長さ2×幅/2、そして腫瘍をシクロデキストリンに担持されたMDJによる処理開始後5日目に除去した。先に記載の方法に従って、腫瘍から全RNAを得て定量化し、RNAの質を評価した。遺伝子発現解析を、マイクロアレイ実験プロトコル(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA,約40000プローブを含む)(Rizzattiら、2005)により行った。定量的リアルタイムPCR(q−PCR)を、標的遺伝子であるcyclin D1、HIF−1、メタロチオネインD3、およびVEGFAについて行った。倍率の変化は、2−ΔCt法を用いて計算した。ウエスタンブロット分析(WB)を、HIF−1a(Novus biologicals)およびNF−KB p−50(Santa Cruz Biotechnology,CA)について行った。β−チューブリン(CloneKMX−11:3000,Μillipore)を、ローディングコントロールとして用いた。サウスウエスタン組織化学分析(SW)を行い、腫瘍組織標本におけるNF−κBをin situで検出した。H&E切片を組織病理学的分析に用いた。
免疫組織化学分析(IHC)をPCNA cyclin Dl;CASPASE−3、CD31、VEGF、CD34、COX−2、TGFβ、HIF−1、CD133、Oct4およびMTについて行った。TUNELアッセイも行った。群の正体を知らされていない二つの研究者班が、独立してサンプルを評価した。染色細胞および微小血管密度を評価した。データは、統計プログラムGraphPad Prism 5(Graph Pad Software Inc.,San Diego,California,USA)を用いて分析し、その分析はマンホイットニー検定により行った。P<0.05の確率が統計的に有意であるとみなした。
免疫組織化学分析(IHC)をPCNA cyclin Dl;CASPASE−3、CD31、VEGF、CD34、COX−2、TGFβ、HIF−1、CD133、Oct4およびMTについて行った。TUNELアッセイも行った。群の正体を知らされていない二つの研究者班が、独立してサンプルを評価した。染色細胞および微小血管密度を評価した。データは、統計プログラムGraphPad Prism 5(Graph Pad Software Inc.,San Diego,California,USA)を用いて分析し、その分析はマンホイットニー検定により行った。P<0.05の確率が統計的に有意であるとみなした。
加えて、密接に関連し、それぞれが腫瘍の増殖を促進し、現在の癌治療に対する主要な抵抗システムを有すると現在考えられている腫瘍微小環境、血管新生、および癌幹細胞(CSC)に影響を及ぼすか否かを検証することを目的とした。統計分析は、マンホイットニー検定により行った。
ここに挙げる本研究の最も注目すべき発見は、実験期間中に対照動物(GC)の腫瘍では有意な増殖を示した(P<0.01)のに一方で、シクロデキストリンに担持されたMDJにより顕著な腫瘍収縮の効果が誘導されたことである(図4A)。
巨視的に、対照腫瘍と比較して、シクロデキストリンに担持されたMDJで処理した動物の腫瘍は、色が薄く固い外層および柔らかい核を示した(図4Bおよび4C)。このこと、シクロデキストリンに担持されたMDJにより腫瘍の血液の灌流が起こったことを示唆する。
巨視的に、対照腫瘍と比較して、シクロデキストリンに担持されたMDJで処理した動物の腫瘍は、色が薄く固い外層および柔らかい核を示した(図4Bおよび4C)。このこと、シクロデキストリンに担持されたMDJにより腫瘍の血液の灌流が起こったことを示唆する。
異種移植した腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)分析により、顕著な血管分布が示され、5種類の組織に分類できた:(1)分化に乏しく、多染色体性で、好塩基性、そして細胞質に乏しい丸形ないし卵形の細胞集団を有する腫瘍核;(2)凝固出血性壊死病巣;(3)「壊死周辺領域」(PN)と呼ばれる壊死病巣を取り囲む、新生偽柵状構造(neoplastic pseudopalisades surrounding necrotic foci);(4)腫瘍の境界における浸潤性前線(invasive front);および(5)通常、紡錘形の細胞からなり、腫瘍核内および周辺のいずれにも広がる間質要素(図4J)。
マイクロアレイ解析により、シクロデキストリンに担持されたMDJは、同時に、様々な重要なシグナル伝達経路に影響したことが示された(図6Aおよび6B)。アレイ中40000個の遺伝子のうち、シクロデキストリンに担持されたMDJによる処理により2016個の遺伝子のアップレギュレーションおよび1305個の遺伝子のダウンレギュレーション(2〜26.3倍)が起こった。マスター転写因子は、機能が未知の新しい遺伝子と同様、変化を見せた。図2に要約したものは、シクロデキストリンに担持されたMDJで処理された動物の腫瘍において、未処理のものと比較し2倍またはそれ以上アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされた主な遺伝子である。Ingenuity Pathways Analysisシステムを用いて、最も重要な遺伝子と発現変化とを相関させ、そして、それらの遺伝子産物の相互作用によって分類すると、非常に連結したネットワークが出現した(図6Cおよび6D)。マイクロアレイの調査結果およびqPCRとの間で矛盾は認められなかった(図6E)。
興味深いことに、例えば、PPARのような抗癌作用に関連することが知られている様々な遺伝子は、シクロデキストリンに担持されたMDJで処理した腫瘍ではアップレギュレーションされることが見出された。逆に、腫瘍増殖と関連しているいくつかの重要な遺伝子も、NFκB、VEGF、AKT、HIF−1、及びHoxのようにダウンレギュレーションされることが見出された。遺伝子発現の変化には、血管形成、炎症、アポトーシス、マトリックスメタロプロテアーゼ、細胞増殖、代謝、および薬物耐性に結びつく多数の経路が含まれていた。シクロデキストリンに担持されたMDJによる腫瘍遺伝子発現の変化の全てを、ここでは説明することはできないが、血管形成および癌幹細胞の調節に関与するメカニズムのいくつかの最も重要な所見の主要部を、形態学的データと共に示すことはできる。
シクロデキストリンに担持されたΜDJの抗血管新生効果:シクロデキストリンに担持されたΜDJで処理した群は、対照のGC群が示すものより284%も多くの出血性腫瘍壊死領域を示した(p<0.01)(それぞれ図4Dおよび4E)。更に、腫瘍壊死は明らかに周辺部にある腫瘍の外側からでなく、主に腫瘍の中心から発生しており(図4E)、これは、血管新生が阻害されたのみでなく、血管破壊現象が発生した可能性があることを示唆している。確かに、シクロデキストリンに担持されたMDJは、内皮細胞(EC)の集合を管腔のある組織的な血管(図4Fおよび4H)に構成することを防げるので、これが、無秩序な血管成長の形成をもたらし、袋小路で終わる多くの毛細血管を有する明らかに機能不全の血管を多く形成することになる(図4Gおよび4I)。これらの観察事項は、ニワトリ胚におけるシクロデキストリンに担持されたMDJによる血管密度の低減、および通常よりも漏出性で組織化されていない新血管の出芽について述べている先の調査結果と一致する(Braz J Biol. 2010;70:443〜449)。
SWでは、GT腫瘍におけるNFκB特異的な染色をした血管数が非常に特異的な増加を示したが(485%;p<0.01)、これは単に細胞損傷に対する反応性のシグナル伝達の表れである可能性がある(図7F)。これはまた、GT群においてアポトーシスマーカーであるCASPASE−3により陽性染色された微小血管が多数観察されたことと一貫する。更に、シクロデキストリンに担持されたMDJで処理したマウスの腫瘍には、対照マウスの腫瘍よりも少ないVEGFおよびCD31−陽性染色微小血管が含まれており、これは、シクロデキストリンに担持されたMDJは、腫瘍の血管新生を抑制することができるという考えと一致する(図4N、4Mおよび4O)。
更に、GTでは、骨髄由来の内皮前駆細胞のマーカーであるCD34陽性の細胞数の有意な減少を示した(図4J、4K、および4L)。この発見は、CCRI(CCL9/15受容体)のダウンレギュレーションがMAで観察されることを証明となり、CD34(+)未熟骨髄細胞(iMCS)を採用することに結びつく。Ccrlが欠如すると、劇的にマウスの肝臓における腫瘍の増殖が抑制される(Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2010;13063〜13068)。
シクロデキストリンに担持されたMDJ処理により、核におけるmRNA TKB1(NAK)の高発現により増強されるmRNA IkBのアップレギュレーション(2599)とともにp65/RelAに作用するSAT3及びNF−κB経路をダウンレギュレーション(Fc−2524)することがマイクロアレイにより示された。WBおよびSW分析の両方で、NFκBのレベルが有意に減少したことを確認することにより、マイクロアレイの結果を検証した(図8)。NFκBのおよびStat3はいずれも、VEGFおよび他の血管新生促進因子を増加させることにより、癌の進行における炎症および血管新生の間の関係を調整する主要な転写因子であると考えられている(CurrΜolΜed.2010;10:369〜373)。
このアッセイでTGFβはダウンレギュレーションされ、TGFBR1及びTGFBR2はアップレギュレーションされることが発見された。ΜA分析におけるTGFβのダウンレギュレーションは、qPCRおよびIHCにより確認された(図7H、7I、および7J)。TGFRの調節は、部分的に、SMAD複合体調節の変化(SMAD2の活性化およびSMAD3の抑制)、ならびにE2F7の活性化およびE2F6とE2F4の抑制に関連する可能性がある。これは、cyclin-B2およびCDK2AP1のアップレギュレーションに加え、cyclin-Cのダウンレギュレーションと関連する。TGFβはその他のメカニズムのうち、血管新生の刺激を通じて癌の進行を引き起こす(Tianら、Transforming growth factor−f3 and the hallmarks of cancer.cell Signal. 2010)。
mRNA HIFlaサブユニット阻害剤の著しいダウンレギュレーション(HIFlAN,FC3.713)に加えて、低酸素シグナル伝達経路の重要な仲介物質である低酸素誘導因子1(HIF−1)のダウンレギュレーション(Fc−2.464)がみられた。APEX1のダウンレギュレーション(Fc−2.387)は、おそらくHIFlaの存在量の減少、そしておそらくマトリックスメタロペプチド複合体MMP2およびMMP14の転写の減少(Fc−3.108)(Fc3.890)に関連する。HIFlの阻害は、検出不能なmRNA VEGF発現および血管新生誘導の低下に関連している可能性がある(FEBSJ.2009:509〜518)。WB及びIHC分析により、マイクロアレイ及びqPCRでの知見が確認された(図7K、7L、7N、7M、7O)。
おそらく核で検出不可能なmRNA STAT5の存在に関連するであろうPPARa発現の重要な増加(Fc7.007)がみられた。mRNA PPAR−gama発現の欠如は、おそらくc−Fosおよびc−Junのような転写因子の不存在と関連し、そしてこれは検出不可能なCOX−2 mRNAが存在する原因であり、そしてIHCによるCOX−2発現の急激な減少に応じたものである(図7P、7Q、および7R)。PPARαの活性化は、CD36eABCA1、ABCA2およびABCA10のアップレギュレーションに結びつく可能性がある。このシグナル伝達経路は、シクロデキストリンに担持されたMDJが血管新生を阻害するもう一つのメカニズムを支援している、というのは、PPARアゴニストが、抗血管新生応答の強力な媒介物質であるからである。そしてPPARアゴニストは現在、癌の治療における論理オプションとして研究中である(PPAR Res.2010;81:4609)。
よって、シクロデキストリンに担持されたMDJの血管破壊及び抗血管新生効果は、抗血管新生療法において複数の経路を標的とする傾向であるという提言に沿うものである。これは、単一の経路を遮断してもあまり効果的でなく、腫瘍細胞は抗血管新生薬に対する耐性を発展させるか、および/または他の血管新生メカニズムを採用するかいずれかを行うからである(CA Cancer J Clin.2010;60:222〜243)。
シクロデキストリンに担持されたΜDJおよび癌幹細胞:癌幹細胞(CSC)は、腫瘍の主な発生源であり(J Pathol. 1999;187:61〜81)、腫瘍塊を含む分化細胞と比較し、細胞毒性剤および放射線治療によるアポトーシス誘導に対する耐性が細胞の再生および提示により増加している(CurrΜed Chem.2008;3171〜3184)。したがって、CSCに着目した治療的アプローチは、現在、臨床における癌治療を改善するための関連戦略の代表的なものと考えられている(CurrΜed Chem.2008;3171〜3184;J Clin Invest.2010;120:41〜50)。
本研究では、患者の低生存率と相関する3種の腫瘍幹細胞の古典的なマーカー:CD133、Oct4、およびメタロチオネインを使用した(J Pathol.2000;191:306〜312;Ann Surg Oncol.2009;16:3488〜3498;World J. Surg.2002;26:726〜731;Μutat Res.2003;533:201〜209)。使用した3種の幹細胞マーカーは、対照腫瘍では主にPN領域および腫瘍の浸潤前線領域で見られた(図8A〜8N)。また、PN領域は、より強いHIF−1染色があった場所でもある。おそらくPN領域はより低酸素環境を含みがちで、そして、低酸素によりHIF−1αが活性化されCD133陽性細胞の自己再生活性が増強され、これによりそれらの細胞ががん幹細胞に転換され分化が阻害されることになる(Oncogene 2009;45:,3949〜3959)。興味深いことに、シクロデキストリンに担持されたMDJはCSC数の著しい下落と関連していたことが観察されたが、それにもかかわらず、この知見の基礎となるメカニズムは完全には解明されていない。血管変化による細胞壊死が直接その主要なメカニズムとなる可能性があるとするのはあまり妥当でない、というのは、CSCは低酸素状態に非常に耐性があるからである。
対照腫瘍では、壊死領域の周辺(PN)に多数の円形のメタロチオネイン−過剰発現細胞(MTOEC)が見られ、そして紡錘形のMTOECは、腫瘍の境界に並んでおり、相互に連結し新血管に密接に関与するコード内に組織化されている(図8I、J、L、N、およびM)。本研究において、マイクロアレイ解析により、シクロデキストリンに担持されたMDJに関連するMT発現の下落が示され、このことはqPCRおよびIHCにより検証された。更に、シクロデキストリンに担持されたMDJは、MTOECの外観および空間組織化も強く阻害した(図8I〜8N)。これが、重要なことに、血管新生に負の影響を及ぼしている可能性がある、というのは、MTは血管形成プロセスにおける主要な調節機能を有しているからである(J Cereb Blood Flow Μetab.2000;20:1174〜1189)。
CSCおよび内皮細胞間でシグナル伝達の主要なやりとりが存在し(Nat Rev Cancer 2007;7:733〜736)、そしていくつかの腫瘍では、CSCは優先的に、腫瘍血管に隣接あるいは灌流が不十分な低酸素領域由来の特定の場所(CSCニッチ)に存在し、CSCはそこに適応する(Nature2006;441:1075〜1079)。CSCは、それ自体が血管新生因子を生成可能であり、そしてそれ自身、血管系により生産される因子に依存して自己再生および長期的な成長を維持している(Nat Rev Cancer 2010;2:138〜146)。このため、CSCが酸化的ストレスから守るために低酸素ニッチを必要とすることを考慮して、CSCおよびそれらの微小環境を標的とする新規な癌治療法が、最近提案されている、というのは、活性酸素種はCSCの枯渇をもたらすp38−MAPK−媒介性増殖を誘導するからである(Nat Rev Cancer 2010;2:138〜146;Curr. Opin. Hematol.2008;522〜528)。これらの知見に基づくと、シクロデキストリンに担持されたMDJは、この種の治療にも適合するだとろうということが示唆される、というのは、シクロデキストリンに担持されたMDJは血管に関連したCSC数の減少に関連するのみならずMTOECの空間組織および新血管を破壊し、CSCニッチを乱すからである。シクロデキストリンに担持されたMDJなどのマルチシグナル伝達分子の作用によって、CSCの表現型および生物学的挙動が逆転またはスイッチオフされている可能性はありえないことではないと推定される。
シクロデキストリンに担持されたMDJとアポトーシスの誘導:2種のよく知られたアポトーシスのマーカー、すなわち、TUNEL法およびCASPASE−3で示されるように、シクロデキストリンに担持されたMDJで処理したマウスの腫瘍は、対照に比べてより多数のアポトーシス細胞を含んでいた(図8O〜8T)。おそらくこの知見は、これらの領域におけるNFκBおよびHIF−1阻害に関連する、というのは、両因子はアポトーシスの強力な阻害剤だからである。これはまた、これらの領域におけるCSC数の減少に関連する可能性もある。cyclin Dl発現の有意な増加にもかかわらず、PCNA染色により反映されるように、シクロデキストリンに担持されたMDJ処理による増殖指数への有意な効果はなかった(P=0.14)。
生存/抗アポトーシス経路の活性化は、癌細胞の共通の特徴であり、細胞毒性剤に対する耐性と関連している。薬物治療に対する細胞応答に関与する生存経路は、主にはPI3K/AktおよびRas/MAPKであり、これらは、また、成長因子によって活性化されるシグナル伝達を媒介し、そして細胞増殖、代謝、アポトーシス、および血管新生を含む重要なプロセスの調節における役割を果たす。我々の研究において、mRNA AKT1はダウンレギュレーションされており(FC−2021)、これはAKT複合体の高度なダウンレギュレーションと並行していた(Fc−2021;ΡΚΒα、ΡΚΒβ、RAC、RACα、PKB/AKT)。どうか、PI3K複合体の軽度なダウンレギュレーション(PIK3AP1−1,856;PIK3C3 1,549)がおそらくGAB複合体の活性化(GABl 1,511およびGAB2 1,569)によるもので、対照におけるp65/ReIAの活性化を促進するものであるというデータを集め関連付けていただきたい。FGFRL1およびFGFR1のアップレギュレーション、PIK3AP1およびFGF13の抑制がFGFR3の活性化およびPI4K2Aの順番に関係していた。これらのレギュレーションは全ておそらくPI3K複合体のダウンレギュレーション(PIK3AP1−1,856;PIK3C3 1,549)に関連しており、これはおそらくGAB複合体の活性化(GABl 1,511およびGAB2 1,569)そして主にAIFM2およびAIFM3複合体によって刺激されるcaspase2および9の発現の阻害の減少によるものである。Wntは、WIF1によりダウンレギュレーションされWnt5Aの著しい抑制を伴った。
更に、MAPK複合体の重要なダウンレギュレーションもまた、主にΜAP2Kl(Fc−3,155)、ΜAPKAPK2(Fc−2,501)、ΜAPK12(Fc−2,245)、ΜAP4K3(Fc−2,153)、ΜAP4K5(Fc−2,149)、およびMAPK14(Fc−2,082)について観察された。サイクリン複合体は、NF−κB複合体の調節に依存する可能性があるという結果を示した。よって、D3、Al、およびB2のようなサイクリン複合体は、cyclin Cのダウンレギュレーション(FC−1727)にもかかわらず、アップレギュレーションされた(Fc3,775、1,528、および1,676)。同時に、サイクリン活性化に対する直接的なバランスを保ちつつ、p19INK4Dおよびpl5INK4Bといった阻害剤複合体は活性化された(FC−1727)(1,523)。これは、mRNA Caspase3のスコアに変化がなかったにもかかわらず、tBIDおよびBIΜの増加と同等の13c1XL(Fc−1,601)の減少、加えて、mRNA BIDのアップレギュレーション(Fc1,505)、および最終的にCaspase9およびCaspase2の高度なアップレギュレーション(2,6343)(1,530)を伴っていた。SCIDマウスは免疫不全なので、シクロデキストリンに担持されたΜDJによるアポトーシスの誘導および腫瘍増殖の抑制には、宿主の免疫機能を必要とせず、シクロデキストリンに担持されたΜDJの抗血管新生または直接腫瘍細胞殺傷効果によるものである可能性が最も高い。
これは短期的な実験のため、治療に対する腫瘍防御システムを評価することは不可能であった。それにもかかわらず、ΜT、ABCB4、およびHSP70(HSPA1A)のような化学療法に対する抵抗性に関連した最も顕著な遺伝子のいくつかのダウンレギュレーション(Anticancer Res.2005;2661〜2668;Μolcell 2009;15〜27)により、シクロデキストリンに担持されたMDJで処理した腫瘍は、治療に対して重要な耐性を示さない可能性が非常に高い。
シクロデキストリンに担持されたMDJと腫瘍組織の構成:腫瘍組織は、通常、完全に非組織的で無秩序であると考えられている。それにもかかわらず、近年では、悪性腫瘍は、他の生物学的システムで知られた適応行動の進化に類似する多細胞性集団パターンを発達させることができる複雑に動的な自己組織化バイオシステムの表れであるという議論がされている。これは、集団的細胞移動が悪性腫瘍の浸潤の際に共通してみられるという証拠(BioEssays2009;31:190〜197)増加しつつあるように、環境条件の集団的感受および集団的意思決定を含む。よって、別の概念的に新たな戦略を提案し、細胞群の情報処理を「中断」するという目的に合うものになるだろう。つまり、細胞間コミュニケーションを治療的に停止または少なくとも大いに阻むことが可能なら、間違いなくこのシステムの全体が遅延するだろう。腫瘍細胞は、通常、主に浸潤最前線で血管の周辺および周囲の似通った構造と通じて吻合コードネットワークを形成するコード(ライン等)の中に自身を整列させることが対照において観察された(図4Fおよび4H)。興味深いことに、腫瘍組織の「崩壊」がシクロデキストリンに担持されたMDJの効果によるものであることが発見された。GT群では、腫瘍細胞はかなり頻繁に脊髄組織を欠き、そして微小血管は歪められまたは遮断されており、そして、細胞組織の重要な損失の特徴である赤血球の漏出を示した(図4Gおよび4I)。また、シクロデキストリンに担持されたMDJは、組織的な腫瘍シグナル伝達系をオフにしている可能性があることが示唆され、これにはさらなる調査を必要とする。興味深いことに、マイクロアレイ解析において、以下のような組織の構造組織に関連するいくつかの重要な遺伝子についてシクロデキストリンに担持されたMDJによるダウンレギュレーションが示された:いくつかの癌で高度に発現するタイトジャンクション構造の膜貫通タンパク質であるClaudin−4(CLDN4)(Cancer Sci.2009;1623〜1630);eIF4Eの阻害に対する腫瘍組織の感受性のため癌のアキレス腱であると考えられているEIF4E(Cancer Res.2008;631〜634);転移形成に貢献している可能性のある細胞接着分子の新しいセットに近年含まれるDSC2(デスモソーム蛋白質)(Cancer Res.2008;68:6092〜6099);腫瘍細胞の増殖および浸潤における役割を担うマトリックスメタロプロテアーゼMMP13(Oncol Rep.2010;1241〜1247);および、その発現が増加すると、標準的なWNTシグナル伝達経路の活性および癌成長の拡大を阻害する可能性のあるWnt−5a(Br J Cancer.2009;209〜214)である。
結論として、シクロデキストリンに担持されたMDJの抗癌効果は、単一の標的治療パラダイムでは説明できないのは明らかと思われる。シクロデキストリンに担持されたMDJの効果を理解するためには、図9に示すように、生存のための戦いにおけるそれらの遺伝子応答に適応する腫瘍を多細胞生物として包括的に検討する必要がある。この適応におけるシクロデキストリンに担持されたMDJの効果により、癌治療における新しいパラダイムに光が当たるかもしれない。JAは、遺伝的な調節因子である。それは何百万年の間、植物の進化種で非常に保存されており、そして、成長および非常に様々な生物的攻撃に対する防御応答の間の複雑なバランスを調節する働きをし、それによって急速に変化する環境における植物の適応を最適にする(Curr Opin Plant Biol.2008;11:428〜435)。
図9において、黒矢印は低酸素に駆動されるシグナルを示し、青い点線は低酸素で駆動されるシグナルに対するシクロデキストリンに担持されたMDJの妨害を示し、そして、青矢印はシクロデキストリンに担持されたMDJの誘導を示す。腫瘍の増殖中に、増殖する組織の需要と血管による供給との間の協調が欠如すると、いくつかの腫瘍領域における酸素供給不足が起こる。最も影響を受けると無酸素環境となり、最終的に組織壊死を示す。これらの壊死病巣の周りに、壊死領域周辺部(PNA)が存在し、これは、低酸素つまり薄い酸素濃度状態であり、この状態に細胞が適応しそして生存シグナル伝達が強烈に活性化されることにより生存が可能になる。そこで、我々はこの領域でNFκB、HIF−1、TGFβ、COX−2の高発現を示すことを観察した。高レベルのこれらの分子は、順番に、組織の成長を刺激する増殖因子を放出し、アポトーシスを低減させ、そして血管新生を促進する幹細胞の表現型を活性化する。このような理由から、古典的な癌幹細胞(CSC)マーカーであるCD133、Oct4、およびMTに対し陽性細胞の多数でアポトーシス指数が減少していたことが分かった(TUNELおよびCaspase−3による)。よって、PNAは、腫瘍の増殖並びに低酸素および治療に対する耐性を刺激するシグナル伝達工場として働く。
CSCはまた、浸潤最前線(IF)領域に蓄積し、血管の近くに移動して近隣組織への浸潤を支援することができる。CSCおよび内皮細胞の近くに、腫瘍の縁部における周辺分泌シグナル伝達ネットワークを確立する。この協力関係により、CSCによる刺激および腫瘍新生血管による比較的容易な血液供給の結果として、腫瘍細胞の浸潤性が向上する。
この理論モデルでは、酸素正常領域における腫瘍細胞の腫瘍核は、幹細胞および組織成長因子の存在が少ないので、非常に穏やかな代謝および成長に留まる。これらの細胞は、ある種の予備軍となる。低酸素または他の侵略がそれらの細胞に達すれば、それらのいくつかはCSC表現型に切り替わる可能性があるが、大部分は腫瘍の進行に従い徐々に増殖して空間を満たすのみである。
シクロデキストリンに担持されたΜDJは血管新生をブロックし、そして現存する血管を破壊して低酸素状態を増強し、これが腫瘍の生存および増殖のシグナル(HIF−1、NFκB、MT、MAPK、幹細胞因子)を引き起こす。それにもかかわらず、このことはシクロデキストリンに担持されたMDJがこれらの主要なシグナル伝達系の少なくとも大部分を同時に阻害するという事実によって回避される。よって、腫瘍は、増強された低酸素状態に反応できず、そして徐々に腫瘍組織が広大な面積の壊死に置き換わり、腫瘍が事実上排除されるまで腫瘍の収縮に最適な条件を提供する。
シクロデキストリンに担持されたMDJが腫瘍に接触すると、血管新生を阻害しアポトーシスおよび血管破壊を誘発するだけでなく、腫瘍が低酸素および組織損傷を提示するときに腫瘍によって活性化される主要な生存シグナル伝達系を阻害する。よって、我々は、シクロデキストリンに担持されたMDJが、腫瘍血管系に直接的な影響を引き起こし、それが広大な壊死領域の形成を引き起こし、そして、腫瘍防御的シグナル伝達系の阻害と結びついていたことを観察した。
CSCの数の減少は、少なくとも2つの主要な結果をもたらす。第一に、腫瘍はおそらく刺激因子の主要な供給源を失う。第二に、CSCは、癌治療および低酸素に対し非常に抵抗性なので、腫瘍は最初の衝撃から回復できず、そして治療に対する抵抗性を発達させることができない可能性が非常に高い。
実施例6:インビトロでの血管新生アッセイおよびインビボでの鶏卵漿尿膜(CAM)アッセイ
使用細胞株:非腫瘍性のヒト臍帯内皮由来細胞(HUVEC)および黒色腫B16F10マウス腫瘍の腫瘍細胞。HUVECは、Department of Clinical and Toxicological Analyses、FCF−USPのDulcinea Saes Parra Abdalla博士から提供され、B16F10マウス黒色腫細胞はDepartment of Physiology and Molecular Biology of UFSCarのΜarcia Cominetti教授から提供された。両株を、10%ウシ胎児血清を含むRPMI中で増殖させた。2種類の細胞型の形態学的観察により、一般的なメカニズムが示唆された。血管新生に対する効果の予備調査も、HUVECを用いてインビトロで行った。フローサイトメトリー(ヨウ化プロピジウム及びアクリジンオレンジ)による細胞周期の調査、共焦点顕微鏡(Mitotracker Red)によるミトコンドリア活性の評価、およびHUVECによるVEGFおよびPGE2産生を測定し、細胞培養の上清について市販の抗体を用いたELISAを行った。
使用細胞株:非腫瘍性のヒト臍帯内皮由来細胞(HUVEC)および黒色腫B16F10マウス腫瘍の腫瘍細胞。HUVECは、Department of Clinical and Toxicological Analyses、FCF−USPのDulcinea Saes Parra Abdalla博士から提供され、B16F10マウス黒色腫細胞はDepartment of Physiology and Molecular Biology of UFSCarのΜarcia Cominetti教授から提供された。両株を、10%ウシ胎児血清を含むRPMI中で増殖させた。2種類の細胞型の形態学的観察により、一般的なメカニズムが示唆された。血管新生に対する効果の予備調査も、HUVECを用いてインビトロで行った。フローサイトメトリー(ヨウ化プロピジウム及びアクリジンオレンジ)による細胞周期の調査、共焦点顕微鏡(Mitotracker Red)によるミトコンドリア活性の評価、およびHUVECによるVEGFおよびPGE2産生を測定し、細胞培養の上清について市販の抗体を用いたELISAを行った。
卵を用いた試験では、使用した卵白は、温度と湿度を制御した恒温インキュベーター内でインキュベートしたガルスガルスのものである。インキュベーションは、卵をgiragemに置くまたは置かずに行った。この手順を管理するために卵殻膜の上面に印を付して用いた。インキュベーションの4日目に卵の外殻を70%アルコールに浸した脱脂綿で慎重に洗浄した後、開卵した。開卵は、全ての卵について、孵化した所と同じ場所でプラスチックホルダーにて保持し上面に印を付してから、層流中で行った。実験手順は、20世紀前半の方法を応用し、本プロジェクトに沿うように改善した。当該方法の記載事項を発展させた。
開卵は、先端が尖ってカーブした外科鋏、マイクロ手術用の鉗子、透明テープ、処分用の容器、パスツールピペット、使い捨て注射針および注射器、卵用のプラスチックまたはボール紙を用いて行った。
卵膜下の中身を得るため開卵する最初の操作を行った。上面に窓を開けるPoDestaの方法だと、卵の中身をこぼすことなく観察位置に残すことが可能である。3mLシリンジと結合したBD25×8針を、初期角度を45度にして、卵の気室を通りながらゆっくりと、高純度のアルブミンのみを吸引し採取できるおよその位置まで導入した。割れないように注意しながらドリルを使用した。卵黄または空気と同様に厚いアルブミンを除去しないようした、さもなくば、卵黄を吸い込み胚の位置が変わりそして空気を除去すると元の位置に戻るようなことになり、胚の生存が危うくなるからである。
卵黄嚢の位置を低くしながらも胚が卵膜に接着しないように、そして開卵したら中身が見えるように各卵から約5mlのアルブミンを取り除いた。アルブミンは、針挿入の開口部を閉鎖するための数ミリリットルを残して、適切な容器に廃棄した。孔を、自身の卵アルブミンで塞ぎ、その箇所をアルコールの液滴により凝結させた。漏れを防止するために注意を払うのは、孵化場での汚染の危険を最小にするために重要である。必要なら、そこで膜を観察するまでアルブミンをもう1滴孔に垂らしそこにアルコールを滴下してもよい。
先端が尖ってカーブした鋏を用いて、卵殻を、グラファイト製の刀で慎重に穴をあけた。この箇所は、卵が発熱する際、表面上で最も高温になる部分である。ドリルでの開孔後、卵膜を割らないようにゆっくりと切断し「U」字状の切り込みを形成した。最後にクランプを用い膜の出発点まで導いてから引き抜き、窓の形成を終了した。この工程で注意すべきは、胚の損傷を防ぐようにはさみを導入し操作することである。胚が非常に若い場合、殻はより硬質であり、観察がより困難である。また、古い胚だと大きなCAMおよびほとんどのCAMは卵殻に付着しているので、操作中に損傷してしまうリスクが増加する。開卵するのに理想的な時間は、インキュベーションから4日というのが標準である。この間、損傷による中身の損失は回避され、そして卵殻の窓により、CAMの胚および胚体外組織ならびに動脈および静脈の配置の特徴を簡単に観察することが可能であった。
窓は、胚を保護するための透明なテープで閉じた。卵は、インキュベーション温度に戻した。生命のこの段階では、胚は自身で熱を生産する能力を持っていないため、育雛の中断期間を最小限にする必要がある。適切な生育は、温度及び湿度の環境条件に依存する。
窓の開けて閉じた後、全ての卵を典型的には初期条件と同じ条件のインキュベーター内に戻し、更に7日間保持した。この期間中に、インビボでの血管新生の検査、または腫瘍増殖の試験のための手順を行った。腫瘍細胞を接種した卵における血管新生の観察は、実質的に同じ血管新生検査モデルに従った。純粋なMDJ(Sigma製、シス/トランス96%純度)または上記の実施例3で作成したシクロデキストリンに担持されたMDJへの曝露は8日目に行い、残りの卵は14日目まで培養器中で保持した。黒色腫細胞の接種を4日目に行い、純粋MDJまたはシクロデキストリンに担持されたMDJによる卵への処理は8日目に行い、残り14日まで培養した。プロトコルの開発中に、接種および処理時間を調整した。画像の取得についての採取時の注意事項を全実験を通し標準化した。
各検査に定める期間が終わるまでに、卵をインキュベーターから取り出し、胚の心拍がもはや見られなくなるまで、少なくとも半時間、冷蔵庫で冷却した。この現象の確認後、テープをはがし、CAΜに少量の4%ホルムアルデヒドを滴下した。固定器を20分間維持した。その後、膜を採取し新鮮なうちに処理した。得られた画像の品質が容器の内容物の適切な保存性に依存したものは、造影剤の注入に使用しなかった。
簡単に固定した後、外殻を破り、不活性胚をシャーレに置いた。主要な血管を、胚の腹部で挿入部の近くに三つの結び目を作り木綿糸で縛った。CAMを他の組織から分離して引き離し、冷食塩水で素早く洗浄して不要な卵黄を取り除き、膜内に気泡、クラック、またはひだが形成しないよう最小限の流体を用いて顕微鏡スライド上に広げた。膜上に顕微鏡カバースリップを置いた後に観察を行い、形成された液膜中の気泡の形成を防いだ。拡大鏡を、明視野、フィルタなし、および多少の拡大倍率(通常、例えば、5〜10倍の拡大を詳細な観察に採用)での観察用に調整した。各検査において、同じ条件、調節可能な照明、および白黒バランスを保ちながら、画像をNikon SMZ1800実体顕微鏡拡大鏡を取り付けたDS−ULカメラ用のACT−2Uプログラムを用いて高解像度で取り込んだ後、TIFFファイルにスキャンした。各回毎に、分析材料の画像を標準化するための照明及び色調整を維持して画像を取り込んだ。同じ倍率で暗視野画像用の調整を繰り返し行った。
細部をより良く観察するために、同じ試料の各領域を、明視野および暗視野で撮像した。血管網の成長は、ImageJプログラムを用い、明視野像を二値化処理して分析した。この技術は、この可能性についても研究されていたが、明視野と暗視野の画像を組み合わせることにより計算に依存しない定量結果の収集を可能にした。この研究は、自己の収集および材料の前処理の改良に重要であった。次いで、可能な限り単純な解析アルゴリズムに置き換えて、二値画像を構築した。二値画像における背景画像に対し正規化された明視野の画像を処理する手順は、洗練かつ標準化された。ImageJ用のプラグインが開発され、二値化の閾値の調整を一回行う間に得られる画像の連続観察が可能になった。この共通アルゴリズム処理により各完全検査を分析し、そして二値化閾値を、順番に処理および分析した画像のバッチ毎に設定した。
定性分析および追加ドキュメントについては、画像を32×250×の倍率の対物光学顕微鏡Jenamedに取り付けたCanon PowerShot A640カメラより得た。
典型的な接種は、10mL未満の体積の培養培地中、卵あたり2×104cellsで行った。黒色腫の増殖は、CAM上の着色形成物を拡大鏡および顕微鏡下での目視により検査した。着色がまだほとんど目視できなくとも、拡大鏡および暗視野像における混濁物を観察して腫瘍細胞増殖の位置を決定した。細胞はチオニン又は0.1%トルイジンブルーで未固定の材料を染色した後に顕微鏡下で観察した。両方の色素は、酸とアルコールという違いがあるので正常組織とのコントラストが改善され、スライドのファイルが可能になった。アルコールによる材料の脱水により血管の直径が変化するので、現状得られる染色パターンの再現性および十分な質のコントラストが得られないため、この方法で染色した材料の定量分析は実施しなかった。
次に、細胞培養で検査したMDJおよびシクロデキストリンに担持されたMDJの用量を、卵1個あたり60mLが一定量であると考えて、卵モデルに投与した。
使用済みの卵を採取して測定したところ、60mLという平均体積は、試験期間を通じ10%未満の標準偏差をもって維持されていた。処理は、検査の目的に応じ異なる方法で行った。実現可能性検査では、開卵前かつインキュベーションの三日目に採取したアルブミンに対し処理を行い、溶液を調製してから同じ針穴を通じて卵に戻す日まで37℃に維持した。アルブミンの卵への再導入は、7日目に、流体圧力の増加およびその管外漏出を避けるために新たに一定量を取り除いてから行った。生存能力検査は、10日間までモニターした。抗腫瘍効果の調査では、CAMに対する処理をインキュベーションの11日目に単回用量で行った。CAMに対する処理の実現可能性は、アルブミンによる処理を行い生存率について比較した。
インビボでの血管新生への効果により、シクロデキストリンに担持されたMDJの抗腫瘍作用の新しいプロファイルが明らかになった。
MDJは、培養中の黒色腫細胞およびHUVECに対して毒性を有することが証明された。細胞培養物では、活性物質は非常に似通った濃度で抗血管新生及び抗癌作用を発揮することが発見された。各細胞種に対する毒性濃度を非常に明確に同定することが可能であった(図10および11)。毒性試験(MTT)において、保存されたミトコンドリア活性による色素の減少は、1mM未満の濃度のMDJでは一定の値に維持されていた。この挙動は、コンフルエントHUVECの細胞培養において非常に再現性があった。また、増殖曲線も、1mMの未満の濃度で、約20時間の折り畳み時間定数(folding time constant)を示した。より高い濃度では、ミトコンドリア活性が損なわれ折り畳み時間が無限大になる傾向があった、すなわち、細胞は分裂を停止し死亡した。マウス黒色腫の培養物における結果も非常に似通っており、毒性濃度も非常に近似していた。
毒性濃度のMDJにより2つの細胞種の細胞形態が変化し、多核巨細胞および液胞の擬中心核の形成へつながった。
これらのMDJの形態に対する効果により、アポトーシスおよび自食作用の誘導が腫瘍細胞のみではなく、内皮でも発生する可能性があることが示唆され、フローサイトメトリーによるHUVECの細胞周期のより詳細な研究につながった(図13)。この新しい結果により、毒性のターゲットが内皮細胞および腫瘍間で共通するという仮説が再確認された(図13および表4)。
加えて、血管成長因子VEGFへの効果が実証された。
培養中の内皮細胞のミトコンドリアはMDJの存在下で活性化したことが示された。この効果は、低密度プレートにおけるMTTにおいて、最も明白であった(図14)。これらの条件(1×104cells/mL)下でも、高密度プレート(2×105cells/mL)下でも、HUVECによるPGE2生産の増加はなかった。PGE2の生産は、通常、これらの細胞の集合がコンフルエントになったときに起こるが、MDJの間接的な効果を媒介している可能もある。
内皮細胞増殖に対する毒性効果が、インビトロおよびインビボでCAMモデルにおいて実証された。
黒色腫細胞が存在すると、卵の生存率が減少した。MDJは部分的に、この生存率を回復した。モデルにおけるCAMの結果により、黒色腫の本体にこの有効成分が作用して用量依存的な退縮を起こすことが確認された。
シクロデキストリンに担持されたΜDJの検査
シクロデキストリンに担持されたΜDJのインビトロ検査により、HUVECおよびB16F10に対する活性化合物の細胞毒性は保存され、非常に低い用量で起こることが実証された(図22)。ビヒクルは、製剤中に使用されるものと同等の濃度では不活性であった。また、シクロデキストリンに担持されたMDJを、ME1001ヒト癌細胞株および組織についても検査したところ、同様の細胞毒性が観察された。
シクロデキストリンに担持されたΜDJのインビトロ検査により、HUVECおよびB16F10に対する活性化合物の細胞毒性は保存され、非常に低い用量で起こることが実証された(図22)。ビヒクルは、製剤中に使用されるものと同等の濃度では不活性であった。また、シクロデキストリンに担持されたMDJを、ME1001ヒト癌細胞株および組織についても検査したところ、同様の細胞毒性が観察された。
シクロデキストリンに担持されたMDJをその後、インビボモデルで検査した。最初の研究で、血管構造に対する有効成分の用量の減少および黒色腫存在下での保護効果を確認した。
実施例7:実施例2のリポソームに担持されたΜDJを用いたインビトロでの抗細胞増殖アッセイおよびインビボでの抗血管新生実験
実施例2で調製したリポソームに担持されたΜDJを9種の癌細胞株:UACC62−黒色腫、ΜCF7−癌耐性、NCIADR−多剤耐性乳癌、7860−腎臓癌、NC1460−肺癌、PCO3−前立腺癌耐性、OVCAR03−卵巣癌、HT29−結腸癌、K562−白血病、において検査した。これらの細胞株を実施例2で製造した種々の濃度のΜDJを有するナノエマルジョンで処理した。図26に示すように、CDに担持されたΜDJは、用量依存的に腫瘍増殖を阻害した。図27は、インビボでの抗血管形成活性に対するナノキャリアのサイズの効果を示す。より具体的には、100nmのナノキャリアを有するナノエマルジョンは、50nmのナノキャリアを有するナノエマルジョンよりも優れた活性を示した。
実施例2で調製したリポソームに担持されたΜDJを9種の癌細胞株:UACC62−黒色腫、ΜCF7−癌耐性、NCIADR−多剤耐性乳癌、7860−腎臓癌、NC1460−肺癌、PCO3−前立腺癌耐性、OVCAR03−卵巣癌、HT29−結腸癌、K562−白血病、において検査した。これらの細胞株を実施例2で製造した種々の濃度のΜDJを有するナノエマルジョンで処理した。図26に示すように、CDに担持されたΜDJは、用量依存的に腫瘍増殖を阻害した。図27は、インビボでの抗血管形成活性に対するナノキャリアのサイズの効果を示す。より具体的には、100nmのナノキャリアを有するナノエマルジョンは、50nmのナノキャリアを有するナノエマルジョンよりも優れた活性を示した。
更に、図28に示すように、リポソームのサイズが100nm未満のとき、リポソームに担持されたMDJにより抗細胞増殖活性の増強が示された。
実施例8:インビトロ抗細胞増殖アッセイ
[この実施例は、ハーバード大学での研究について記述した原稿に基づく。]
ナノ担持されたMDJ(ナノキャリアはCD、リポソーム、またはLDE)につき、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から購入した以下の11種の細胞株(3種の白血病、2種の乳癌、1種のマクロファージ、および5種の前立腺癌)において検査した。細胞は、ATCCが提唱する各増殖培地(RPMI−1640、DMEM、EMEM、または10%ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したF12−k培地)中で増殖させた。細胞株の詳細について、以下の表5に示す。
[この実施例は、ハーバード大学での研究について記述した原稿に基づく。]
ナノ担持されたMDJ(ナノキャリアはCD、リポソーム、またはLDE)につき、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から購入した以下の11種の細胞株(3種の白血病、2種の乳癌、1種のマクロファージ、および5種の前立腺癌)において検査した。細胞は、ATCCが提唱する各増殖培地(RPMI−1640、DMEM、EMEM、または10%ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したF12−k培地)中で増殖させた。細胞株の詳細について、以下の表5に示す。
ナノ担持されたMDJ製剤をMilli−Q水に溶解し室温で保存した。製剤は、汚染回避のため使用前に0.22ミクロンのフィルターで精製した。
各細胞株から300万の細胞を6ウェルプレートの3つのウェルに均等に分配し、一晩増殖させた。翌日、1μΜのΜDJを含有するナノ担持されたMDJ製剤を、1つ目のウェルに加え、一方同じ濃度の空のナノキャリア(またはナノ粒子)を2つ目のウェルに加え、そして細胞を有する3つ目のウェルは、薬物または空ナノキャリアを加えずそのまま保持した(「対照」)。製剤のアポトーシス効果を、処理から6時間、12時間、および24時間後に倒立顕微鏡下で観察した。
ナノ担持されたMDJでは、検査癌細胞株におけるアポトーシス現象の優れた効果が示された。アポトーシス効果は検査した全ての細胞株において観察され、MDJ処理の6時間後に始まり、24時間後にピークに達した。TIB−512、CRL−2876、およびCRL−2314のようないくつかの癌細胞株は、24時間後に完全にまたはほぼ完全に死んでいた(図38〜40参照)が、他のものは平均60%〜70%の細胞死亡率を示した(図41参照)。残りの細胞は、前アポトーシス段階にあった。この分子は、癌細胞のみを標的とする作用を有していることから、ナノキャリアの癌細胞への効果的な薬物送達剤としての可能性が示唆される。空のナノ粒子しか有さない対照細胞では、アポトーシスがほんのわずかに見られるか又は全く見られなかった。
癌細胞は、健康な細胞に比べるとエネルギーを生成する方法が異なり、これはワールブルグ仮説としても知られている。この仮説では、癌細胞のエネルギーを生成するミトコンドリアは、健康な細胞が用いる酸化経路ではなく、非酸化経路を用いる。MJは、癌細胞におけるミトコンドリアのこの異常を標的とし、シトクロムCならびに他のプロテアーゼおよびカスパーゼの放出を引き起こすことが報告されている。MJは、Hep3B肝癌細胞から単離されたミトコンドリアの膨潤を誘導することは可能だが、3T3非形質転換細胞または正常リンパ球から単離されたミトコンドリアでは可能でない。チトクロムCの放出は、ミトコンドリア膜透過性遷移、膜の脱分極、浸透膨潤、従ってアポトーシスをもたらす。表5のリストに示すマクロファージ細胞株を非形質転換細胞として本研究に用いたが、アポトーシスの効果は広範囲に観察されなかった(図42参照)。
出願人が行った研究では、ナノ担持されたMDJは、転写、翻訳、およびp53とは独立した細胞毒性効果を発揮することが示唆されている(未公開)。先の研究(未公開)により、インビトロではMDJのみでも同様の結果を示すが、インビボだとこの薬剤は非常に迅速に分解するので効果を見るには非常に高用量が必要であることが示された。ナノ粒子中の分子をカプセル化することにより、MDJがインビボで分解せず、癌細胞の治療に非常に低用量、例えば、カプセル化していない分子で用いた用量の1000倍未満、で非常に効果的であったことが示された。
均等
本発明は、その主旨または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で実施することができる。前述の実施形態は、従って、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、むしろ全ての点で例示的なものと考えるべきである。本発明の範囲は、よって、上記の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更を含むことを意図する。
本発明は、その主旨または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で実施することができる。前述の実施形態は、従って、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、むしろ全ての点で例示的なものと考えるべきである。本発明の範囲は、よって、上記の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更を含むことを意図する。
Claims (26)
- 医薬として許容される溶媒、およびメチルジヒドロジャスモネート(MDJ)を含有する複数のナノキャリアまたはマイクロキャリアを含む医薬組成物であって、
ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、シクロデキストリンまたはデンドリマーから形成される、あるいはリン脂質層に囲まれたコレステリルエステルのコアを含む合成ナノエマルジョン粒子(LDE)であり;
ナノキャリアは、1ナノメートル(nm)から500nmの範囲のサイズを有する;あるいは
マイクロキャリアは、1ミクロンから100ミクロンの範囲のサイズを有する;そして
医薬組成物は、1nMから1Μの範囲の濃度のMDJを有する、前記医薬組成物。 - 前記ナノキャリアは、シクロデキストリンから形成され、そして3nmから100nmの範囲のサイズを有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記シクロデキストリンナノキャリアは、3.5nmから11nmの範囲のサイズを有する、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記シクロデキストリンナノキャリアは、50nmから100nmの範囲のサイズを有する、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記ナノキャリアはLDEであり、そして30nmから500nmの範囲のサイズを有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記LDEは50nmから110nmの範囲のサイズを有する、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記ナノキャリアは、デンドリマーから形成され、そして2nmから500nmの範囲のサイズを有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記デンドリマーはポリアミドアミン(PAMAM)である、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記MDJの濃度の範囲は1nMから100μΜである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記MDJの濃度の範囲は10μΜから100mMである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記MDJの濃度の範囲は100mMから1Μである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、更に2−アミノエチルリン酸二水素、3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナール、サリチル酸メチル、またはアブシジン酸を含有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬として許容される溶媒は、水、アルコール、またはそれらの混合物である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ナノキャリアまたはマイクロキャリアは更に非ジャスモネート化合物を含有する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 医薬として許容される溶媒、およびジャスモネート化合物を含有する複数のナノキャリアまたはマイクロキャリアを含む医薬組成物であって、
ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、シクロデキストリンまたはデンドリマーから形成される、あるいはリン脂質層に囲まれたコレステリルエステルのコアを含む合成ナノエマルジョン粒子(LDE)であり;
ナノキャリアは、1ナノメートル(nm)から500nmの範囲のサイズを有する;あるいは
マイクロキャリアは、1ミクロンから50ミクロンの範囲のサイズを有する;そして
医薬組成物は、1nMから1Μの範囲の濃度のジャスモネート化合物を有する、前記医薬組成物。 - 前記ジャスモネート化合物は、ジャスモン酸、7−イソ−ジャスモン酸、9,10−ジヒドロジャスモン酸、9,10−ジヒドロ−イソジャスモン酸、2,3−ジデヒドロジャスモン酸、3,4−ジデヒドロジャスモン酸、3,7−ジデヒドロジャスモン酸、4,5−ジデヒドロジャスモン酸、4,5−ジデヒドロ−7−イソジャスモン酸、ククルビン酸、6−エピ−ククルビン酸、6−エピ−ククルビン酸−ラクトン、12−ヒドロキシ−ジャスモン酸、12−ヒドロキシ−ジャスモン酸−ラクトン、11−ヒドロキシ−ジャスモン酸、8−ヒドロキシ−ジャスモン酸、ホモ−ジャスモン酸、ジホモ−ジャスモン酸、11−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、8−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、ツベロン酸、ツベロン酸−O−β−グルコピラノシド、ククルビン酸−O−β−グルコピラノシド、5,6−ジデヒドロ−ジャスモン酸、6,7−ジデヒドロ−ジャスモン酸、7,8−ジデヒドロ−ジャスモン酸、シスジャスモン,ジヒドロジャスモン、およびこれらの低級アルキルエステルからなる群より選択される、請求項15に記載の医薬組成物。
- 前記ジャスモネート化合物はジャスモン酸メチルであり、そして約1nMから1μΜの濃度を有する、請求項15に記載の医薬組成物。
- 前記ジャスモネート化合物はジャスモン酸メチルであり、そして約1μΜから100mMの濃度を有する、請求項15に記載の医薬組成物。
- 前記ナノキャリアまたはマイクロキャリアは更に非ジャスモネート化合物を含有する、請求項15に記載の医薬組成物。
- 血管新生関連疾患の治療の必要がある対象に、請求項1〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物を有効量投与することを含む、血管新生関連疾患を治療する方法。
- 前記血管新生関連疾患は癌である、請求項20に記載の方法。
- 前記癌は、白血病、結腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、皮膚癌、卵巣癌、黒色腫、または肉腫である、請求項21に記載の方法。
- 前記血管新生関連疾患は炎症性疾患である、請求項20に記載の方法。
- 前記炎症性疾患は炎症性腸疾患である、請求項23に記載の方法。
- NF−κB関連疾患の治療の必要がある対象に、請求項1〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物を有効量投与することを含む、NF−κB関連疾患を治療する方法。
- 前記NF−κB関連疾患は、ウイルス、細菌、または真菌感染症である、請求項25に記載の方法。
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Legal Events
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180601 |
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A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20181204 |