JP2017201920A - 肺癌治療のための抗癌剤の効果の検査法 - Google Patents
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Abstract
Description
非小細胞癌(Non-small cell lung cancer: NSCLC): (肺癌の約75%)
小細胞癌(Small cell lung cancer: SCLC)
[1] チロシンキナーゼ阻害剤に対する癌の感受性を判定し、チロシンキナーゼ阻害剤が癌に対して治療効果を有するかを判定するための補助的データを取得する方法であって、ヒト被験体由来の生物学的試料における、
(1)Gli1発現率を検出する工程、
(2)PRMT5発現率を検出する工程、および
(3)MEP50発現率を検出する工程
によりGli1発現率、PRMT5発現率およびMEP50発現率を求め、Gli1発現率、PRMT5発現率およびMEP50発現率に基づいて、チロシンキナーゼ阻害剤に対する癌の感受性を判定し、チロシンキナーゼ阻害剤が癌に対して治療効果を有するかを判定するための補助的データを取得する方法。
[2] ヒト被験体由来の生物学的試料の(1)Gli1発現率がコントロールレベルに比較して亢進していること、
(2)PRMT5発現率がコントロールレベルに比較して亢進していること、および
(3)MEP50発現率がコントロールレベルに比較して亢進していること、
に基づいて、前記ヒト被験体の癌は、チロシンキナーゼ阻害剤による治療に効果がないと判定する、[1]の方法。
[3] Gli1発現率、PRMT5発現率、およびMEP50発現率を免疫組織化学染色または免疫細胞化学染色を行いHスコア法で判定する、[1]または[2]の方法。
[4] 癌が非小細胞肺癌である、[1]〜[3]のいずれかの方法。
[5] 抗Gli1タンパク質抗体、抗PRMT5タンパク質抗体および抗MEP50抗体を含む、[1]〜[4]のいずれかの方法を行うためのキット。
本発明の方法により、癌患者の適切な治療法を決定することができる。
染色強度0:染色なし、1:弱い染色、2:中程度の染色、3:強い染色
株式会社 LSIメディエンス(旧: 三菱化学メディエンス)が提供する、EGFR遺伝子変異解析受託サービスを利用した。本解析は新鮮組織、凍結病理標本、パラフィン包埋切片病理標本、胸水のいずれかのサンプルを用い、ゲフィチニブ(イレッサ(登録商標))に対する感受性ならびに耐性変異に関与するexon18、19、20、21の遺伝子変異を解析する。本検査には正常型遺伝子の増幅を抑制するプライマー(PNAプライマー)と変異型遺伝子特異的プローブ(LNAプローブ)を使用したPNA‐LNA PCR Clamp法により遺伝子変異を高感度(約1%)に検出可能である(受託解析説明書類より引用)。
(1)パラフィン包埋組織切片作製方法
手術によって切除された肺癌患者の原発腫瘍を包埋カセットに入れ、包埋装置を使ってパラフィン包埋病理組織サンプルを作製した。包枚装置は腫瘍組織中の水分を溶解パラフィンと置換するための装置であった。手順としては腫瘍組織をエタノールに浸して、組織中の水分をエタノールと置換した。その後、組織をキシレンに漬け、エタノールをキシレンに置換した。最後に溶解パラフィンに漬け、キシレンを溶解パラフィンと置換した。この工程を全自動で行ってパラフィン包埋病理組織サンプルを作製した。
(2-1) 脱パラフィン処理
すべての操作は室温で行った。
(a) サンプルをキシレンで3分ごとに交換しながら5回インキュベーションした。
(b) 100%エタノールで2分間ごとに交換しながら3回インキュベーションした。
(c) 約80%エタノールで2分間インキュベーションした。
(d) 70%エタノールで2分間インキュベーションした。
(e) 水道水で5分間洗浄した。
(f) 超純水でスライドをリンスした。
(a) 0.3%過酸化水素水入りのメタノールでサンプルを室温で30分間インキュベーションした。
(b) イムノセイバー (日新EM株式会社製)入り10 mMクエン酸ナトリウムバッファー (pH6.0)にサンプルを浸し、95℃で45分間インキュベーションした。
サンプルを室温で30分ほど冷却した。
(c) リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でサンプルを室温で5分間、3回洗浄した。
(d) スライドおよびスライド周辺の水気をキムワイプでできるだけ拭き取り湿潤チャンバーに静置して、免疫組織用ブロッキング剤(Blocking One Histo: ナカライテスク製)を組織切片上に注ぎ、室温で10分間インキュベーションした。
(e) サンプルをPBSで5分ごとに交換しながら、3回洗浄した。
(f) スライドおよびスライド周辺の水気をキムワイプでできるだけ拭き取り、0.1% ウシ胎児血清アルブミン(BSA)入りのPBSで希釈した一次抗体を組織切片上に注ぎ、湿潤チャンバーに静置して、4℃で一晩インキュベーションした。
(g) 使用した抗体は次の通り。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗PRMT5抗体: ATLAS ANTIBODIES社製の抗体(カタログ番号: HPA005525)を150倍希釈して使用。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗MEP50抗体: Brthyl Laboratories社製の抗体(カタログ番号: A301-561A)を1000倍希釈して使用。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗Gli1抗体: AbCam社製の抗体(カタログ番号: ab134906)を100倍希釈して使用した。
(h) サンプルをPBSで5分ごとに交換しながら、3回洗浄した。
(i) スライドガラスおよびその周辺の水気をキムワイプでできるだけ拭き取り、ヒストファイン(二次抗体: ニチレイバイオサイエンス製)をスライド上の切片に滴下し、湿潤チャンバーに静置して室温で30分間インキュベーションする。サンプルをPBSで5分ごとに交換しながら、3回洗浄した。
(j) DAB溶液(DAB Peroxidase Substrate Kit, ImmPACT: Vector Laboratories社製)を調製(A液1 mlに対し、B液1滴)し、スライドおよびスライド周辺の水気をキムワイプでできるだけ拭き取り、DAB溶液をスライド上の切片に注ぎ、すぐに光学顕微鏡にセットして染色具合を確認する。PRMT5はDAB溶液を注ぎ、2分30秒で染色を終了させた。MEP50は30秒で染色を終了させた。Gli1は7分で染色を終了させた。
(k) 染色が終わったら水道水の入ったバットにスライドガラスを即座に浸した。
(l) 細胞の核を染色するため、ヘマトキシリン溶液に5回程度サンプルを浸けた。1回ごとの時間は3秒であった。
(m) 水道水の入ったバットにスライドガラスを浸して洗浄した。
(a) 80%エタノールで切片を2分間インキュベーションした。
(b) 90%エタノールで切片を2分間インキュベーションした。
(c) 100%エタノールで2分間ごとに交換しながら3回インキュベーションした。
(d) キシレンで2分ごとに交換しながら3回インキュベーションした。
(e) カバーガラスに封入剤を少量つけ、切片を覆った。
(f) 封入剤が乾燥したら、サンプルはケースに入れて室温で保存した。
染色強度0:染色なし、1:弱い染色、2:中程度の染色、3:強い染色
図3より、Gli1、PRMT5、MEP50の発現率はほぼ連動しているという結果が得られた。
Claims (5)
- チロシンキナーゼ阻害剤に対する癌の感受性を判定し、チロシンキナーゼ阻害剤が癌に対して治療効果を有するかを判定するための補助的データを取得する方法であって、ヒト被験体由来の生物学的試料における、
(1)Gli1発現率を検出する工程、
(2)PRMT5発現率を検出する工程、および
(3)MEP50発現率を検出する工程
によりGli1発現率、PRMT5発現率およびMEP50発現率を求め、Gli1発現率、PRMT5発現率およびMEP50発現率に基づいて、チロシンキナーゼ阻害剤に対する癌の感受性を判定し、チロシンキナーゼ阻害剤が癌に対して治療効果を有するかを判定するための補助的データを取得する方法。 - ヒト被験体由来の生物学的試料の(1)Gli1発現率がコントロールレベルに比較して亢進していること、
(2)PRMT5発現率がコントロールレベルに比較して亢進していること、および
(3)MEP50発現率がコントロールレベルに比較して亢進していること、
に基づいて、前記ヒト被験体の癌は、チロシンキナーゼ阻害剤による治療に効果がないと判定する、請求項1に記載の方法。 - Gli1発現率、PRMT5発現率、およびMEP50発現率を免疫組織化学染色または免疫細胞化学染色を行いHスコア法で判定する、請求項1または2に記載の方法。
- 癌が非小細胞肺癌である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 抗Gli1タンパク質抗体、抗PRMT5タンパク質抗体および抗MEP50抗体を含む、請求項1〜4のいずれか1項の方法を行うためのキット。
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JP2008533490A (ja) * | 2005-03-16 | 2008-08-21 | オーエスアイ・ファーマスーティカルズ・インコーポレーテッド | 上皮成長因子受容体キナーゼ阻害剤に対する抗癌応答を予測する生物学的マーカー |
US20160017431A1 (en) * | 2014-03-28 | 2016-01-21 | Driver Group | Methods for Predicting EGFR Tyrosine Kinase Inhibitor Efficacy |
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CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES, vol. 72, JPN6019046992, 7 February 2015 (2015-02-07), pages 2041 - 2059, ISSN: 0004165770 * |
CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 19, JPN6019046981, 2013, pages 279 - 290, ISSN: 0004273327 * |
CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 21, JPN6019046990, 2015, pages 4686 - 4697, ISSN: 0004165769 * |
HUMAN PATHOLOGY, vol. 45, JPN6019046994, 2014, pages 1397 - 1405, ISSN: 0004165771 * |
MOLECULAR MEDICINE REPORTS, vol. 11, JPN6019046984, 2015, pages 3259 - 3268, ISSN: 0004273328 * |
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