JP2017169573A - 機能性核酸分子、及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献1に開示された機能性核酸分子は、当該機能性核酸分子から転写されたRNA分子が実質的に抗ウイルス応答活性を引き起こさずに優れたターゲット特異性を持つ遺伝子発現抑制技術として利用されることが述べられている。
(a)タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするRNAにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含むターゲット決定配列と;
(b)上記タンパク質合成効率を向上させる活性を有する制御配列と、を備える。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNA(AS Uchl1におけるSINE/B2)
(2)配列番号2に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNA(AS Uchl1における、SINE/B2、下線で示した39ntのスペーサー、およびSINE/Alu)
(3)配列番号3に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNA(AS UxtにおけるSINE/B2)
(4)(i)配列番号1、2または3に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNAと少なくとも25%の類似性を有し、かつ、(ii)タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸
(5)(i)配列番号1、2または3に示される塩基配列において、1以上で200以下の塩基が欠失、置換、付加、および/または挿入されたDNAによってコードされ、かつ、(ii)タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸。
(機能性核酸分子の構成)
本発明に係る機能性核酸分子は、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするRNAにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含むターゲット決定配列と;上記タンパク質合成効率を向上させる活性を有する制御配列と、を備えるという特徴を有する。本発明に係る機能性核酸分子は、本書の記載に基づいて、適宜、当業者において設計し、製造することができる。
本発明に係る機能性核酸分子によりタンパク質合成効率が向上する、タンパク質をコードするRNAは、5’末端の開始コドンおよび3’末端の終止コドンを有している翻訳領域(コード領域)を含んでいるRNAであれば特にその配列、由来等は限定されない。具体的には、本発明に係る機能性核酸分子によりタンパク質合成効率が向上する、タンパク質をコードするRNA(ターゲットとなるRNA)は、5’キャップ構造、5’非翻訳領域(5’−UTR)および/または3’非翻訳領域をさらに含んでいてもよい。これらの領域は、細胞における内因性配列に由来してもよいし、人工的に合成した配列に由来してもよい。発現ベクターに遺伝子のオープンリーディングフレーム(コード配列)が位置しているORFeomeは、その一例である。
マウス(Mus musculus)ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1(Uchl1) RefSeq: NM_011670.2
Uchl1 RNAをコードするUchl1 DNAの配列を配列番号4に示す。
マウス(Mus musculus)ubiquitously expressed transcript(Uxt) RefSeq: NM_013840.3
Uxt RNAをコードするUxt DNAの配列を配列番号5に示す。
GFP(pEGFPベクター由来の配列)
GFP RNAの配列をコードするGFP DNAの配列を配列番号6に示す。
上記ターゲット決定配列は、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするRNAにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含む配列である。ターゲット配列は、本発明においてタンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするRNAの部分配列から任意に選択される。ターゲット配列は、タンパク質をコードするcDNAが挿入されかつ最初の5’末端の開始コドンを囲むプラスミドDNAから転写されるRNA配列に由来してもよい。アンチセンス配列の長さは特に限定されない。しかしながら、異なるRNAsが含まれる系において、ターゲットとなるRNAに対する特異性を向上させる観点では、アンチセンス配列の長さは、7塩基より長いことが好ましく、10塩基より長いことがより好ましく、15塩基より長いことがより好ましい場合がある。さらに、アンチセンス配列の長さは、250塩基より短いことが好ましく、200塩基より短いことがより好ましく、150塩基より短いことがより好ましく、100塩基より短いことがより好ましく、90塩基より短いことがより好ましく、80塩基より短いことがより好ましく、77塩基より短いことがより好ましく、70塩基より短いことがより好ましく、60塩基より短いことがより好ましく、50塩基より短いことがより好ましく、40塩基より短いことがより好ましく、30塩基より短いことがより好ましい場合がある。
本発明に係る機能性核酸分子では、上記制御配列が上記タンパク質合成効率を向上する活性を有している。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNA
(2)配列番号2に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNA
(3)配列番号3に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNA
(4)(i)配列番号1、2または3に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNAと少なくとも25%の類似性を有し、かつ、(ii)タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸
(5)(i)配列番号1、2または3に示される塩基配列において、1以上で200以下の塩基が欠失、置換、付加、および/または挿入されたDNAによってコードされ、かつ、(ii)タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸。
本発明では、ターゲットとなるタンパク質が翻訳される方向(センス鎖方向)を「正方向」と定義し、正方向と反対の方向を「逆方向」と定義する。本発明に係る機能性核酸分子では、ターゲット決定配列と制御配列との位置的関係は特に限定されない。しかしながら、上記ターゲット決定配列が、上記制御配列よりも、上記機能性核酸分子における正方向側に近接して配置されるものが好ましい。上記ターゲット決定配列と上記制御配列とは直結してもよい。あるいは、上記ターゲット決定配列と上記制御配列との間に、両者を連結するリンカー配列および/またはそのような配列が挿入されていてもよい。
本発明に係る機能性核酸分子の製造方法は、上述のRNA分子を調製する工程を含む。機能性核酸分子は、公知の核酸生合成法によって調製されてもよいし、あるいは、例えば、(i)当該機能性RNA分子をコードするDNA分子を作成し、(ii)当該DNA分子を当該機能性RNA分子へと転写する方法によって調製してもよい。機能性核酸分子のサイズは特に限定されないが、例えば、核酸生合成法で製造するという観点では、2000塩基以下のサイズが好ましく、250塩基以下のサイズがより好ましい。
本発明に係るDNA分子は、何れか1つの上述の本発明に係る機能性核酸分子をコードする。また、本発明に係る発現ベクターは、何れか1つの上述の本発明の機能性RNA分子を含むRNAベクター、または、本発明に係る上記DNA分子を含むDNAベクターである。また、本発明に係るタンパク質合成効率を向上させる組成物は、何れか1つの上述の機能性核酸分子または上述の発現ベクターを含む。
(タンパク質合成効率向上方法)
本発明に係るタンパク質合成効率向上方法は、本発明に係る機能性核酸分子または上述の発現ベクターと、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするRNAとを共存させる工程を含む。この工程は、インビボで行うこともできるし、タンパク質無細胞合成系を用いたインビトロで行うこともできる。本発明において、「インビボ」は具体的には細胞培養または動物全体を用いる系を意味し、「インビトロ」は具体的には無細胞アッセイを用いる系を意味する。上記工程をインビボで行う場合は、単離した細胞または組織において、上記機能性核酸分子または上述の発現ベクターと、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするRNAとを共存させてもよい。あるいは、生体において、上記機能性核酸分子または上述の発現ベクターと、タンパク質合成効率を向上させる対象であるRNAとを共存させてもよい。
、またはオオムギであってもよいが、これらの例に限定されない。
上述の本発明に係るタンパク質合成効率向上方法は、タンパク質合成方法として用いることができる。すなわち、本発明に係るタンパク質の合成方法は、ターゲットとなるタンパク質の製造方法であって、上記何れかのタンパク質合成効率向上方法によってタンパク質合成効率を向上する工程を含む製造方法である。好ましくは、上記ターゲットとなるRNAからのタンパク質翻訳効率の向上によって、上記ターゲットとなるタンパク質を効率的に合成する。
本発明に係るタンパク質合成効率向上方法は、例えば、所定の正常タンパク質の量的減少に起因する疾患の治療に利用可能である。当該疾患は特に限定されないが、例えば、筋ジストロフィー等の筋変性疾患;アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、およびタンパク質のコードのレベルにおける三塩基反復性疾患(すなわち、ハンチントン病)またはDNA/RNAレベルにおける三塩基反復性疾患(すなわち、脆弱X)等の神経変性疾患;等が挙げられる。
FANNTOM2クローンRik6430596G22は、推定のスプライスされたアンチセンス(AS)ノンコーディングRNA(ユビキチンC末端水素化酵素1(UCHL1) 遺伝子7のncRNA9)として特定された(実験1)。Uchl1は脱ユビキチン化酵素、ユビキチンライゲース、もしくはモノユビキチンスタビライザーとして働く神経特異的タンパク質である(参照1;Liu, Y., Fallon, L., Lashue1, H.A., Liu, Z. & Lansbury, P.T., Jr. The UCH-L1 gene encodes two opposing enzymatic activities that affect a1pha-synuc1ein degradation and Parkinson'sdisease susceptibility. Cell 111, 209-218 (2002).、参照2;Osaka, H., et al. Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and stabilizes monoubiquitin in neuron. Hum Mol Genet 12,1945-1958 (2003).)。これは、パーキンソン病(PARK5)の常染色体優位性の変異である(参照3;Leroy, E., et al. The ubiquitin pathway in Parkinson's disease. Nature 395, 451-452 (1998))。散発性の死後脳の黒質(SN)においてUchL1の発現は減少しており、aSYN凝集体の形成と相関していることが発見された。またUchl1
活性の欠失はレビー小体型認知症(DLB)とアルツハイマー病(AD)とも関連している。Uchl1の異所性発現はマウスモデルにおけるβアミロイドに起因するシナプス機能の損失と文脈依存記憶を回復するため、Uchl1発現の増加はADへの治療戦略として提唱されている(参照1、参照4;Butterfield, D .A., et al. Redox proteomics identification of oxidatively modified hippocampal proteins in mild cognitive impairment: insights in to the development of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis 22, 223-232 (2006).、参照5;Castegna, A., et al. Proteomic identification of oxidatively modified proteins in Alzheimer's disease brain. Part II: dihydropyrimidinase-related protein 2, alpha-enolase and heat shock cognate 71. J Neurochem 82, 1524-1532 (2002).、参照6;Choi, J., et al. Oxidative modifications and down-regulation of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 associated with idiopathic Parkinson's and Alzheimer's diseases. J BioI Chern 279, 13256-13264 (2004).)。
ノンコーディングcDNAのFANTOM3コレクションから、正方向でのSINEB2エレメント(B3サブクラスと、タンパク質をコードする遺伝子と5‘末端で直接対応でのオーバーラップを含む、自然界のAS転写産物の他の例を生物情報学的に探索した。これにより、Uchl1/AsUchl1の構造と同様な31のS/AS対を特定した(実験7)。
マウス成体組織パネルと肉眼で切り取った脳領域と神経細胞株におけるマルチプレックスRT-PCTにより、AS Uchl1発現は中脳腹側部、皮質とMN9Dドーパミン作動性細胞に限られ、神経組織でない組織、細胞株では見られないことが分かった。Uchl1のオーバーラップ領域ではない部分を標的としたリボプローブでのダブルインサイチューハイブリダイゼーションにより、mRNAは、脊椎や中脳腹側部と同様に、海馬、皮質、皮質下領域の細胞の細胞質に多く分布していることが示された。抗チロシンヒドロキシラーゼの免疫組織蛍光染色とダブルインサイチューハイブリダイゼーションの組み合わせにより、Uchl1とASのmRNAはSNの同じDA神経において発現していることが示された。興味深いことに、S/AS対の転写物は、二つの異なる細胞小器官に広く局在化していた。成熟Uchl1 mRNAは主に細胞質で観察されたが、AS RNAは細胞核、特に核内領域に凝集していた(実験9)。近年、50%の細胞の転写物は細胞核内に拡充し、おもに機能の不明なノンコーディングRNAからなることが発見された。細胞核に留まっているRNAは、paraspeckleと呼ばれる領域に凝集する傾向があり、AS Uchl1の局在部位や関連性が埋め込まれたSINEによって制御されている点において、きわめて似通っている。(参照7;Chen, L.L., DeCerbo, J.N. & Carmichael, G.G. Alu element-mediated gene silencing. Embo J 27, 1694-1705 (2008).)
RACEの優位性により、AS Uchl1遺伝子の正確な転写開始点(TSS)をMN9D細胞においてマッピングした。実験2に示すように、TSSはこれまでに注釈付けされた配列の上流250bp、Uchl1の2番目のイントロンの中に位置している。
次に、マウスゲノム網羅的なAS UchL1遺伝子座における70-kb領域を、Genome Vist alignment(http;//genome.lbl.gov/cgi-bin/GenmeVista)を使ってヒトゲノム配列と比較した。CSTピークと対応するヒト配列上にデザインされたプライマーを用いて、1.6kbのノンコーディングRNA転写物、ヒトUCHL1遺伝子に5'末端で直接対応するアンチセンスを、ヒト脳RNAからクローニングした。ヒトAS UCHL1遺伝子の解剖学的構成は、埋め込まれたリピートエレメントの存在と同様にS/AS対のオーバーラップ領域を含むマウスのそのカウンターパートと酷似していた。ヒトAS UCHL1の発現は、マウスで確認されたように神経組織では高度に制限されていた。
10;Malagelada,C., Ryu, E.J., Biswas, S.C., Jackson-Lewis, V. & Greene, L.A. RTP801 is elevated in Parkinson brain substan tia nigral neurons and mediates death In cellular models of Parkinson's disease by a mechanism involving mammalian target of rapamycln inactivation. J Neurosci 26, 9996-10005 (2006).).)。近年、ラパマイシンは、パーキンソン病治療の一般的な重篤な運動副作用であるL-DOPA誘導型の運動障害の予防も示されている(参照11;Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E. & Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal 2, ra36 (2009).)。
成長中の細胞において、mTORC1シグナルは、増殖と下流の基質である4E-BPとS6Kのリン酸化を介したCAP依存型翻訳機構の制御に必要である。細胞増殖抑制剤であるラパマイシンはmROTC1活性を阻害し、CAP依存型の翻訳の阻害を引き起こす。ここで、本発明者らはこれらの条件でAS 転写物は選択されたmRNAのタンパク質合成において必要であることを示す。ラパマイシン添加において、細胞核に拡充したncRNA AS Uchl1は、Sタンパク質をコードするmRNAを翻訳のためポリソームとパートナーを組ませる場である細胞質に輸送される。
本発明者らは、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)に対する72塩基長のターゲット決定配列アンチセンスをAS Uchl1における適切な配列位置に挿入した合成RNAで、タンパク質合成が達成されるか否かを検証した。実験14の通りに、EGFPを発現上昇させる人工ASの発現を設計した。人工ASをコードする断片をpcDNA3.1ベクター(Invitrogen)にクローニングした。これにより、ターゲット決定配列と制御配列を持つ機能性核酸分子はいかなる目的遺伝子のタンパク質合成効率を向上できることを証明した。本発明について、以下の実施例、及び比較例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
プラスミド
RACE フラグメント:Uchl1の5’UTRをRACE PCR(GeneRacer, Invitrogen)によりNM9Dの総RNAから増幅し、pGEM(登録商標)-T Easyベクター(Promega)にクローニングした。
完全長AS Uchl1:ASの完全長DNAを、RACEフラグメントとFANTOMクローンRik6430596G22から、以下のプライマーを用いてのプライマーセットを用いてフージョンPCRを行い増幅した。
mAS Uchl1fl 5’- ACAAAGCTCAGCCCACACGT-3’(SEQ ID No:13)およびRev mAS Uchl1 fl 5’- CATAGGGTTCATT-3’(SEQ ID No:14)
Uchl1: マウスUchl1 mRNAを、以下のプライマーセットによりFANTOMクローン2900059022からクローニングした:
mUchl1用5’-TTAAGCTGCTTTGCAGAGAGC-3’(SEQ ID No:15)およびRev mUchl1 5’-TTAAGCTGCTTTGCAGAGAGC-3’(SEQ ID No:16)
AS Uchl1 shRNA:As Uchl1のTSS周辺の -14/+4の配列を含むオリゴCGCGCAGTGACACAGCACAAA (SEQ ID No:17)をpSUPER.retro.puroベクターにクローニングし、スクランブル配列をコントロールとして使用した。
Δ5’: mAS Uchl1 flおよびRev Δ用5’AS Uchl1 5’ TACCATTCTGTGCGGTGCA-3’(SEQ ID No:18)
Δ3’ : mAS Uchl1およびRev mAS Ichl1 fl.用 GACCTCCTCTAGCACTGCACA-3’(SEQW ID No:19)
明確な欠失変異体のため、PCRフラグメント I をpcDNA3.1-のNheI-EcoRI位置およびPCRフラグメントIIを続くEcoRI-HindII位置にクローニングした。
AS Uchl1 Δ(Alu+SINEB2):
PCRフラグメント I : mAS Uchl1 flおよびRev pre-SINE B2 用5’- CAATGGATTCCATGT-3’(SEQ ID No:20). PCRフラグメントII:For post-ALU 用5’-GATATAAGGAGAATCTG-3’(SEQ ID No:21)およびRev mAS fl。
AS Uchl1 Δ(Alu):
PCRフラグメントI: mAS Uchl1 flおよびRev pre-Alu
5'- TTATAGTATGTGTTGTC-3' (SEQ ID:22)。PCRフラグメントII: post-ALU用5'-GATATAAGGAGAATCTG-3'(SEQ ID No:23)およびRev mAS flをEcoRI-HindII位置にクローニングした。AS Uchl1 Δ(SINEB2):
PCRフラグメントI : mAS Uchl1 flおよびRev pre-SINE B2用5'-CAATGGATTCCATGT-3' (SEQ ID No:24)。PCRフラグメントII: post-SINE B2用5'- GAATTCCTCCAGTCTCTTA -3'(SEQ ID No:25) およびRev mAS fl。
AS uchl1 (Alu+SINEB2) フリップ:PCRフラグメントI: SINE B2 内部用 5'-TGCTAGAGGAGG-3' (SEQ ID No:26)およびRev Alu flip 5'- GTCAGGCAATCC -3' (SEQ ID No:27)をAS Uchl1Δ(Alu+SINEB2)の単一のEcoRI位置にクローニングした。
AS uchl1 SINEB2フリップ:PCRフラグメントをSINE B2内部用5'-TGCTAGAGGAGG-3' (SEQ ID No:28)およびRev SINE フリップ5'-AAAGAGATGGC-3' (SEQ ID No:29)をAS Uchl1Δ(SINEB2)の単一のEcoRI位置へクローニングした。
MN9D細胞を10mmペトリ皿に、10% ウシ胎仔血清FBSペニシリン(50 units/ml)および、ペニシリン(50ユニット/ml)、ストレプトマイシン(50ユニット/ml)を含むダルベッコ変法イーグル培地に播種した。処理は、ラパマイシン(R0395, Sigma)を最終濃度1μg/mlにて新鮮な培地に45分添加することにより行った。
MN9D安定細胞株(siRNA -15/+4、スクランブルsiRNA、pcDNA3.1-およびΔSINE B2)を樹立するため、MN9D細胞を100mmペトリ皿に播種し、製造元提供の取扱説明書に従ってリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いてトランスフェクトし、翌日に細胞を500μMのネオマイシン(#N1142, Sigma)により選択した。
HEK-293T細胞は、10%ウシ胎仔血清(Sigma-Aldrich)、100 ユニット/mlペニシリン、そして100μm/mLストレプトマイシン(Sigma)を含むDMEM(GIBCO)にて37℃で湿式CO2培養器にて増殖させた。
PCR分析: 総RNAをTrizol試薬(Invitrogen)を用いて製造元説明書に従い抽出した。DNAseI(Ambion)処理された後、1μgをiScriptcDNA synthesis Kit(BioRad)を用いて逆転写した。リアルタイムqRT-PCRをSybr 緑色蛍光色素(2x iQ5 SYBR Green supermix, BioRad)を用いて行った。アクチンとGAPDHを内部標準として用いた。相対定量は比較Ct法を用いて行った。
アクチン:センス 5'- CACACCCGCCACCAGTTC-3' (SEQ ID No:30)、アンチセンス 5'-CCCATTCCCACCATCACACC-3'(配列番号31)
Gapdh:センス5'-GCAGTGGCAAAGTGGAGATT-3'(配列番号32)、アンチセンス5'-GCAGAAGGGGCGGAGATGAT-3'(配列番号33)。
AS Uchl1 オーバーラップ: センス5'-GCACCTGCAGACACAAACC-3'(配列番号34)、アンチセンス5'-TCTCTCAGCTGCTGGAATCA-3'(配列番号35)
AS Uchl1:5'CTGGTGTGTATCTCTTATGC (配列番号36)、アンチセンス5'CTCCCGAGTCTCTGTAGC (配列番号37)
Uchl1:センス 5'- CCCGCCGATAGAGCCAAG (配列番号38)、アンチセンス5'-ATGGTTCACTGGAAAGGG-3'(配列番号39)
AS Uchl1 プレRNA: 5'-CCATGCACCGCACAGAATG-3' (配列番号40)、アンチセンス 5'-GAAAGCTCCCTCAAATAGGC-3' (配列番号41)
プレA0ribosomal RNA :センス 5'-TGTGGTGTCCAAGTGTTCATGC-3' (配列番号42)、アンチセンス5'-CGGAGCACCACATCGATCTAAG-3 (配列番号43)
AS_Uxt:センス5'-CAACGTTGGGGATGACTTCT (配列番号44)、アンチセンス5'-TCGATTCCCATTACCCACAT(配列番号45)
Uxt:センス5'-TTGAGCGACTCCAGGAAACT-3'(配列番号46)、アンチセンス(配列番号47)
マルチプレックスRT-PCTは、Platinum(登録商標) Taq DNAポリメラーゼとSuperScript(登録商標)
III One-Step RT-PCR(Invitrogen)システムを用いて行った。DNAse処理された 500mgの総RNAをGapdh、Uchl1、As Uchl1のリバースプライマーとともにインキュベートした。
反応は、60℃、60分にて行った。
それぞれを3つに分注し、フォワードプライマーを最終濃度200nMになるように加えた。PCR反応は、95℃15秒、続いて60℃45秒、最後に68℃30秒のサイクルを40サイクル行った。
細胞は、SDSサンプルバッファー2x中で溶解した。タンパク質は15%SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離され、ニトロセルロース膜へ転写した。イムノブロッティングは一次抗体:抗Uchl1(#3524 Cell Signaling)1:300希釈、抗b-actin(A5441、Sigma)1:5000希釈を用いて行った。
Uchl1の検出は、推奨のホースラディッシュペルオキシダーゼで標識された二次抗体を用いた改良型の化学発光とECL検出試薬(RPN2105、GE Healthcare)で行った(#WBKLS0500 ImmobilionWestnChemioluminescent HRP 基質)。
核原形質の分画は、核原形質分離キット(Norgen)を製造元説明書に従って使用して行った。RNAを抽出してDNAseI処理をされた。細胞質分画の純度は、プレリボソーマルRNAでのリアルタイムqRT-PCRによって確認した。
試薬:抗DIG抗体D8156(Sigma);ストレプトアビジン HRP RPN1231-100UL (Amersham Bioscience);DIG ラベリングミックス#11 277 073 910(Roche)、BIOラベリングミックス#11685 597 910(Roche)、リボ核酸トランスファーパン酵母由来 R8759(Sigma)、デオキシリボ核酸一本鎖サケ精巣由来 D7656(Sigma)、ブロッキング試薬 #11 096 176 001(Roche)、TSA Cy3システム(Perkin Elmer, Heidelberg, Germany)。
4%ホルムアルデヒドによる灌流の後、マウスの脳を一晩30%スクロースにて凍結保護をした。インサイチューハイブリダイゼーションを凍結切片(16μm)で行った。
センスとアンチセンスプローブは、マウスUchl1 cDNAの末端600bpとマウスAS Uchl1の最後の1000bpをコードするcDNAからインビトロ転写にて作製した。Uchl1のプローブはジゴキシゲニンで標識し、AS Uchl1のプローブはビオチンで標識した。ビオチンとジゴキシゲニンの取り込みは、ノーザンブロットにて確認した。切片は3%過酸化水素水で30分にて前処理した。ハイブリダイゼーションは、1 mg/ml(Uchl1)およびAS Uchl1ための3 mg/mlの濃度でのプローブを用いて、60℃、16時間で行った。ビオチン化RNAの検出の検出には、ストレプトアビジン-HRPを1:250希釈、2時間、TNBバッファー(Tris HCl pH 7.5 100mM, NaCl 150mM, 0.5%ブロッキング試薬)で行い、TNTバッファー(Tris HCl pH 7.5、100mM、NaCl 150mM、0.05% tween)中での洗浄後にTSA Cy3システムを用いて可視化した。
DIG標識プローブでのISHは、TSA反応の後、抗DIGモノクローナル抗体を用いて切片をインキュベートすることで行った。RNA ISHと免疫蛍光染色を組み合わせるため、切片を抗TH(#AB152 Chemicon)1:1000希釈とともにインキュベートした。シグナルは、次いで蛍光色素が結合されたヤギ抗ウサギ二次抗体405とヤギ抗マウス抗体488を用いて検出した。切片はその後洗浄し、Vectashield (Vector lab)マウント培地でマウントして共焦点顕微鏡(Leica)にて観察した。
脳サンプルは、Institute of Neuropathology, BellvitgeHospital(バルセロナ大学、スペイン)の脳バンクより入手した。サンプルは患者もしくはその家族のインフォームドコンセントとバルセロナ大学の倫理委員会の許可のもと、検死時に解剖された。脳は病理学的にPDの症例と確認され、対照群(Navarro et al., 2009)と年齢が一致したコーカサス人から得られた。簡潔に言えば、すべてPD症例は、典型的なPDを煩っており、認知障害をもった症例はなく、神経病理的な診断は確立された基準に従って行われた。健康な対照群は神経、代謝、循環器疾病の症状はなく、神経病理学研究によりアルツハイマー病やその他病理などを含む異常は見られないことが明らかにされている。死亡から組織標本の間は3時間から5時間の範囲である。
AS Uchl1のヒトホルトログ候補を特定するため、ヒトとマウスのAS UChl1相同領域の保存性をVISTA genome browserを用いて行った。本発明者らは、ヒトとマウスゲノム最小75%同一性をもつCTS(Conserved sequence tags)のパラメータを選択した。それぞれの保存エレメントに対して、ヒト相同領域の上にプライマーを設計した。
追加の翻訳アクチベーター候補の特定のために、本発明者らはノンコーディングRNAであって5’末端コーディング転写物と直接対応でオーバーラップするFANTOM3完全長cDNAから検索した[PMID: 1614072]。Nordstrom et al 2009(Nordstrom, K.J'J et al. Critical evaluation of the FANTOM3 non-coding RNA transcripts. Genomics 94, 169-176 (2009).)に記載された8535のFANTOM3 ncRNA転写物nの選別セットをスタート地点として使用した。これらのncRNA転写物のゲノム上の位置とREFSEQ(Maglott, D.R., Katz, K.S., Sicotte, H. & Pruitt, K.D. NCBI's LocusLink and Ref Seq. Nucleic Acids Res 28, 126-128 (2000))のコーディング転写物をUCSCのゲノムブラウザー(Kent, W.J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res 12, 996-1006 (2002))で抽出し、788のコーディングセンス:ノンコーディングアンチセンス対を特定した。その後ncRNAをrepeat maskerを用いて確認し、SINEB2関連の配列を特定した(Smit, AFA, Hubley, R & Green, P. RepeatMasker Open-3.0.1996-2010 <http://www.repeatmasker.org>)。これによりタンパク質コーディング転写物と5’末端のオーバーラップのペアは127まで減少した(うち60はリピートのセンス鎖のバージョンを持ち、53はアンチセンスのバージョンを持ち、14はセンスとアンチセンスの両方のバージョンを持つ)。
その後、SINEB2関連エレメントのアライメントを行った(http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html)。この解析により、Uchl1-ASと同様の方向性を持ったリピートを持つ転写物とオーバーラップするアンチセンスが実験試行(Uxt1-AS)に選択された。
例として、以下のものがタンパク質コーディングmRNAと相補的な配列のリストである。これらは対象を決定する配列を提供する断片[水色でハイライトしたnow] と制御配列[赤でハイライトhow]の例を含む。この例では自然界のアンチセンスのリスト中の制御配列は89塩基の短さである。アンチセンスRNAの抜粋リスト中の結合配列は44塩基の短さである。
下のそれぞれの配列は、Repeatmaskプログラムにより決定されたレトロトランスポゾンエレメントについてのアライメントの要約である。
Claims (16)
- (a)タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするRNAにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含むターゲット決定配列と;
(b)上記タンパク質合成効率を向上させる活性を有する制御配列と、
を含む、機能性核酸分子。 - 上記制御配列はSINE(Short Interspersed Element)由来の配列を含んでいる、請求項1に記載の機能性核酸分子。
- 上記SINE由来の配列が、SINE−B2由来の配列である、請求項2に記載の機能性核酸分子。
- 上記制御配列が以下の(1)〜(5)からなる群より選択される、請求項1に記載の機能性核酸分子;
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNA
(2)配列番号2に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNA
(3)配列番号3に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNA
(4)(i)配列番号1、2または3に示される塩基配列からなるDNAによってコードされるRNAと少なくとも25%の類似性を有し、かつ、(ii)タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸、および
(5)(i)配列番号1、2または3に示される塩基配列において、1以上で200以下の塩基が欠失、置換、付加、および/または挿入されたDNAによってコードされ、かつ、(ii)タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸。 - 上記ターゲット決定配列が当該機能性核酸分子における5’末端と制御配列との間に配置されている、請求項1〜4の何れか一項に記載の機能性核酸分子。
- 上記ターゲット決定配列が7塩基以上で250塩基以下の長さを有している、請求項1〜5の何れか一項に記載の機能性核酸分子。
- 上記ターゲット決定配列が、上記タンパク質をコードするRNAにおける対応配列と相補的な配列、または上記タンパク質をコードするRNAにおける最初の5’末端開始コドン付近の配列に対して、少なくとも60%の類似性を有する、請求項1〜6の何れか一項に記載の機能性核酸分子。
- 上記機能性核酸分子の上記制御配列が翻訳の方向に対して逆向きに配置されている、請求項1〜7の何れか一項に記載の機能性核酸分子。
- 上記ターゲット決定配列が、上記タンパク質をコードするRNAの5’−UTR(非翻訳領域)または上記タンパク質をコードするRNAにおける最初の5’末端開始コドン付近の配列にハイブリダイズするように設計された、請求項1〜8の何れか一項に記載の機能性核酸分子。
- (a)タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするRNAにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含むターゲット決定配列と;
(b)上記タンパク質合成効率を向上させる活性を有する制御配列と、
を含むRNA分子を調製する工程を含む、機能性核酸分子の製造方法。 - 請求項1〜9の何れか一項に記載の機能性核酸分子をコードするDNA分子。
- 請求項1〜9の何れか一項に記載の機能性核酸分子、または請求項11に記載のDNA分子を含む、発現ベクター。
- 請求項1〜9の何れか一項に記載の機能性核酸分子、請求項11に記載のDNA分子または請求項12に記載の発現ベクターを含む、タンパク質合成効率を向上させる組成物。
- (a)請求項1〜9の何れか一項に記載の機能性核酸分子を、一部が上記機能性核酸分子のターゲット決定配列と類似性を有する、タンパク質をコードするRNAと、インビボ(ヒト個体を除く)またはインビトロにおいて共存させる工程、を含むタンパク質合成効率向上方法。
- 上記工程(a)において、上記機能性核酸分子または請求項11に記載のDNA分子を、インビボ(ヒト個体を除く)またはインビトロにおいて細胞にトランスフェクトすることを含む、請求項14に記載のタンパク質合成効率向上方法。
- 請求項14または15に記載のタンパク質合成効率向上方法によってタンパク質合成効率を向上させる工程を含む、タンパク質の製造方法。
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