JP2017160248A - アニオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の精製 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも270I.U./mg FIX Agの比活性を有する、組換えFIX、10pg/ml未満のCHO DNAを含む、組換えFIXを含む医薬組成物、又は1mU未満のFIXa(活性化FIX)活性/単位のFIX凝固活性を含む、組換えFIX組成物。
【選択図】なし
Description
(a)二価カチオンが存在しないか、または低濃度で存在するローディングバッファー中の二価カチオン結合タンパク質を第一アニオン交換樹脂材料にロードし、つづいて任意で1ないし3回の洗浄工程を行い;
(b)二価カチオン結合タンパク質を、二価カチオンおよび対アニオンを含む溶離液で溶出し、二価カチオン結合タンパク質を含有する溶出液を形成し;
(c)得られた溶出液のプールを希釈し、((1)導電性を適宜下げてもよく、)二価カチオンの濃度を上げ;
(d)第二アニオン交換樹脂材料に、工程(c)を行って得られた溶出液をロードし;および
(e)二価カチオン結合タンパク質を含有するフロースルーを採集する
工程を含む、方法に関する。
(a)二価カチオンが存在しないか、または低濃度で存在するローディングバッファー中の二価カチオン結合タンパク質を第一アニオン交換樹脂材料にロードし、つづいて任意で1ないし3回の洗浄工程を行い;
(b)二価カチオン結合タンパク質を、二価カチオンおよび対アニオンを含む溶離液で溶出し、二価カチオン結合タンパク質を含有する溶出液を形成し;
(c)得られた溶出液のプールを希釈し、((1)導電性を適宜下げてもよく、)二価カチオンの濃度を上げ;
(d)第二アニオン交換樹脂材料に、工程(c)で得られた溶出液をロードし;および
(e)二価カチオン結合タンパク質を含有するフロースルーを採集する
工程を含む、方法に関する。
それで、そのカルシウムは生成物の結合を干渉しない。他方で、遊離カルシウムは生成物の結合を干渉しうる。
トリス:pH=8.06±1.0のバッファー;
HEPES:pH=7.7±1.0のバッファー;
MOPS:pH=7.3±1.0のバッファー;
トリシン:pH=8.3±1.0のバッファー;
ヒスチジン:pH=7.6±1.0のバッファー;
Gly−Gly:pH=7.4±1.0のバッファー;
ビス−トリス:pH=6.35±1.0のバッファー;
ACES(N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸):pH=7.0±1.0のバッファー;
ADA(N−(2−アセトアミド)−イミノジ酢酸):pH=7.0±1.0のバッファー;
MES:pH=約6.0のバッファー。
a)第一アニオン交換カラムには、出発材料、すなわち、好ましい実施態様において、細胞培養材料がロードされる。これは不純度が高い出発材料である。第二アニオン交換カラムでは、それは溶出(および補填)工程の後に得られる材料であるため、既にある程度精製されている材料がロードされる。
b)第一アニオン交換工程は、二価カチオンの不在下で第一アニオン交換カラムをロードした後に、生成物を溶出するのに、二価カチオンで実施される。
c)第二アニオン交換についてのロードの二価アニオンのpHおよび濃度は、好ましい実施態様にて、ロード(d)のpHが、ロード(a)の後の洗浄(酸性洗浄、例えば洗浄2)のpH、または洗浄工程が用いられないとした場合のロード(a)そのもののpHよりも高いように選択される。さらには、ロード(a)の導電性は酸性洗浄のそれと対比可能であるが、この洗浄が実施されるとした場合には、低いことが好ましい。二価カチオン濃度、すなわちCa++濃度は、工程(b)の溶出バッファーでのpHよりもロード(d)において高い。
d)従って、第一アニオン交換カラムでは、生成物は該カラムと結合するが、第二アニオン交換カラムでは、生成物は結合しない。
本発明者らは、CHO DXB11非経口(parenteral)細胞系に基づいて、組換えヒト第IX因子を発現する組換えCHO細胞系を開発した。組換えヒトフューリンを共発現し、プロFIXのFIXへの細胞内変異を改善するように、細胞系を遺伝子操作した。生成プロセスでは、ケモスタットモードにて懸濁中に細胞を培養させ、それらを、哺乳類または血漿由来のタンパク質が添加されていない合成培地に順応させた。大豆ペプトンを該培地に加え、クローンの産生を改善した。
Claims (30)
- (a)二価カチオンが存在しないか、または低濃度で存在するローディングバッファー中の二価カチオン結合タンパク質を第一アニオン交換樹脂材料にロードし、つづいて任意で1ないし3回の洗浄工程を行い;
(b)二価カチオン結合タンパク質を、二価カチオンおよび対アニオンを含む溶離液で溶出し、二価カチオン結合タンパク質を含有する溶出液を形成し;
(c)得られた溶出液のプールを希釈し、((1)導電性を適宜下げてもよく、)二価カチオンの濃度を上げ;
(d)第二アニオン交換樹脂材料に、工程(c)で得られた溶出液をロードし;および
(e)二価カチオン結合タンパク質を含有するフロースルーを採集する
工程を含む、二価カチオン結合タンパク質の精製方法。 - ローディング工程の後で、1回または複数回の洗浄工程(1)、(2)および/または(3)を、洗浄バッファー(1)、(2)および/または(3)を用い、二価カチオンは不在であるが、対アニオンの存在下で行う、請求項1記載の方法。
- ローディングバッファーおよび/または洗浄バッファーの少なくとも1つが工程(b)の溶離液のpHよりもpH単位で少なくとも0.5低いpHを有し、好ましくはローディングバッファーおよび/または洗浄工程(2)のバッファーのいずれかが工程(b)の溶離液のpHよりもpH単位で少なくとも0.5低いpHを有する、請求項1または2記載の方法。
- 工程(b)の溶離液が、工程(a)のローディングバッファーおよび任意の洗浄バッファーの導電性よりも高い導電性を有し、工程(c)にて補充される、すなわち希釈される溶出液が工程(b)の溶離液の導電性よりも低い導電性を有する、請求項1〜3のいずれか一のまたは複数の請求項に記載の方法。
- 工程(b)の少なくとも一つの二価カチオンがCa2+、Be2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Sr2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、およびCu2+からなる群より、またはその組み合わせより選択される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 第一および第二アニオン交換樹脂材料が、各々、ジエチルアミノエタン(DEAE)、ジメチルアミノエタン(DMAE)、トリメチルアミノエチル(TMAE)、ポリエチレンイミン(PEI)、四級アミノアルキル、四級アミノエタン(QAE)、および四級アンモニウム(Q)からなる群より独立して選択される正に帯電した基を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 第一および第二アニオン交換樹脂材料が、各々、アミノヘキシル、ベンズアミジン、リシンおよびアルギニンからなる群より独立して選択される、一級アミンを配位子として担持する、項目1〜6のいずれか一つに記載の方法。
- 二価カチオン結合タンパク質がカルシウム結合タンパク質である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 二価カチオン結合タンパク質がビタミンK−依存性タンパク質である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 二価カチオン結合タンパク質が、第II因子、第VII因子、第IX因子、第X因子、プロテインC、プロテインS、アネキシンおよびカルモジュリンからなる群より、特に好ましくは第IX因子(FIX)、第VII因子(FVIIa)およびアネキシンVからなる群より選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)のpHが、任意の洗浄工程が行われる場合で、6.8〜7.5、好ましくは7.0〜7.4であり、任意の洗浄工程が行われない場合では、pHが5.5〜6.5、好ましくは5.9〜6.1である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 任意の洗浄工程(3)におけるpHが7.0〜8.2、好ましくは7.3〜8.0、さらにより好ましくは7.3〜7.5である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 任意の洗浄工程(1)におけるpHが7.3〜7.5であり、任意の洗浄工程(2)におけるpHが好ましくは5.5〜6.5、より好ましくは5.9〜6.1である、請求項2〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)における溶出バッファー(すなわち、溶離液)がカルシウムを含有し、7.5〜8.5(好ましくは7.8〜8.2)のpHを有する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- ローディング工程(d)におけるローディングバッファーのpHが、ローディング工程(a)におけるローディングバッファーのpH、またはローディングの後になされる洗浄におけるpHのいずれかよりも高い、上記の請求項1〜14のいずれかに、特に請求項3に記載の方法。
- ローディング工程(d)における導電性が、ローディング(a)の後になされる洗浄における導電性以下である、上記の請求項1〜15のいずれかに、特に請求項3に記載の方法。
- 工程(d)におけるローディングバッファーでの二価カチオンの濃度が、工程(b)における溶出バッファーでの二価カチオンの濃度よりも高い、上記の請求項1〜16のいずれかに、特に上記の請求項3に記載の方法。
- 得られた溶出液のプールに低導電性を提供する工程が、適切な希釈バッファーで希釈することにより、別法としてバッファー組成を変更することにより、あるいはまた透析、透析濾過またはゲル濾過により行われる、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 上記の請求項1〜18のいずれか一つに記載の方法により得られる二価カチオン結合タンパク質。
- 上記の請求項1〜18のいずれか一つに記載の方法により得られる(r)FIX。
- 少なくとも270I.U./mg FIX Agの比活性、好ましくは270〜350I.U./mg FIX Agの比活性、より好ましくは270〜320I.U./mg FIX Agの比活性、特に好ましくは280〜300I.U./mg FIX Agの比活性を有する、請求項20に記載の(r)FIX。
- 約2.5−3の対数減少のCHO HCP減少比率を有する、請求項20または21に記載の(r)FIXを含む、医薬組成物。
- 50μg/mg未満のFIX Ag、好ましくは20μg/mg未満のFIX Ag、さらにより好ましくは10μg/mg未満のFIX AgのCHO HCP不純物を含む、請求項20または21に記載の(r)FIXを含む医薬組成物、および/または請求項22に記載の医薬組成物。
- 10pg/ml未満のCHO DNA、好ましくは5pg/ml未満のCHO DNA、さらにより好ましくは1pg/ml未満のCHO DNAを含む、請求項20または21に記載の(r)FIXを含む医薬組成物、および/または請求項22または23に記載の医薬組成物。
- (r)FIX組成物が、1mU未満のFIXa(活性化FIX)活性/単位のFIX凝固活性、好ましくは0.75mU未満のFIX活性/単位のFIX凝固活性、より好ましくは0.5mU未満のFIX活性/単位のFIX凝固活性、さらにより好ましくは0.3mU未満のFIX活性/単位のFIX凝固活性を含む、請求項20または21に記載の(r)FIXを含む医薬組成物、および/または請求項22−24のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 請求項1−18のいずれか一項に記載の方法を行うための手段を含むキット
- 1mU未満のFIXa(活性化FIX)活性/単位のFIX凝固活性、好ましくは0.75mU未満のFIX活性/単位のFIX凝固活性、より好ましくは0.5mU未満のFIX活性/単位のFIX凝固活性、さらにより好ましくは0.3mU未満のFIX活性/単位のFIX凝固活性を含む、請求項1−18のいずれか一項に記載の方法により得ることのできる(r)FIX組成物。
- 請求項20−24のいずれか一項に記載の1または複数の特性によりさらに特徴付けられる、請求項27に記載の(r)FIX組成物。
- 1mU未満のFIXa(活性化FIX)活性/単位のFIX凝固活性、好ましくは0.75mU未満のFIX活性/単位のFIX凝固活性、より好ましくは0.5mU未満のFIX活性/単位のFIX凝固活性、さらにより好ましくは0.3mU未満のFIX活性/単位のFIX凝固活性を含む、(r)FIX組成物。
- 請求項20−24のいずれか一項に記載の1または複数の特性によりさらに特徴付けられる、請求項29に記載の(r)FIX組成物。
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