JP2017158577A - シアル酸産生を増加させて、シアル酸に関連した病状を治療する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）によるシアル酸産生の減少に対し、対象の細胞中でＵＤＰ−Ｇ１ｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼ酵素（ＧＮＥ）ペプチドを発現させる方法の提供。【解決手段】ＧＮＥペプチド又はその治療的に活性な断片をコードする核酸配列に機能的に結合したプロモーターを含む単離した核酸発現コンストラクトを対象の細胞に送達するステップを含み、前記ＧＮＥペプチドは特定のアミノ酸配列を有し、対象の細胞に送達するステップの後、核酸発現コンストラクトがＧＮＥペプチド又はその治療的に活性な断片の発現を開始する、また、細胞中でＧＮＥペプチドを生成する方法。ＧＮＥペプチド又はその治療的に活性な断片をコードする核酸配列に機能的に結合したプロモーターを含み、単離した核酸コンストラクトを該細胞に感染させるステップを含む、方法。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年２月１日にＤａｒｖｉｓｈらによって出願された米国仮特許出願第６１／４３８，５８５号に優先権を主張し、図面を含むその全ての開示が参照によって本明細書に組み入れられる。

本発明は、シアル酸生合成（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、ＧＮＥ）の鍵酵素のＤＮＡコード領域を送達することによって生物系においてシアル酸産生を増加させる遺伝子治療法および組成物の分野に関する。

遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）は、若年成人発症の進行性骨格筋消耗疾患であり、重度の身体障害を引き起こすが、現在のところ、ＨＩＢＭに対する有効な治療方法が存在しない。ＨＩＢＭは、ＧＮＥ遺伝子の変異に起因する常染色体劣性遺伝疾患である。ＧＮＥ遺伝子は、二機能性酵素、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼ（ＧＮＥ／ＭＮＫ）をコードする。これは、細胞シアル酸産生の最初の２つの反応を触媒する鍵となる律速酵素である。したがって、シアル酸産生の減少は、α−ジストログリカン（α−ＤＧ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）などの重要な筋肉タンパク質を含む種々の糖タンパク質またはネプリライシンのシアリル化の低下を引き起こす、またはガングリオシド（ＧＭ３）合成酵素などの他の遺伝子の発現変化を引き起こす。これにより、次に筋変性が引き起こされる。ＨＩＢＭは、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー、埜中ミオパチー、四頭筋を残す空胞型ミオパチー、またはＧＮＥ関連ミオパチーとしても知られている。

対象の細胞中でＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼ酵素（ＧＮＥ）を発現させる方法が本明細書に開示され、該対象の細胞に、ＧＮＥペプチドをコードする核酸配列に機能的に結合されたプロモーターまたはその治療的に活性な断片を含む単離した核酸発現コンストラクトを送達することを含み、ＧＮＥペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を有し、該対象の細胞に送達されると、該核酸発現コンストラクトはＧＮＥペプチドまたはその治療的に活性な断片の発現を開始する。

また、コードされたＧＮＥ酵素を送達する方法が開示され、該方法は、
ａ）対象の肢の膝下または肘下のあるポイントで静脈内アクセスを作製すること；
ｂ）該静脈内アクセスポイントよりも対象の体の他の部分に対して近位のポイントで止血帯を施すこと；
ｃ）単離した核酸発現コンストラクトの単回用量を該静脈内アクセスを通して肢に導入すること
を含み、該単回用量はポリヌクレオチドの血管外漏出のために血管内圧を上昇させるのに十分な量であり；単離した核酸コンストラクトは、ＧＮＥペプチドまたはその治療的に活性な断片をコードする核酸配列に機能的に結合したプロモーターを含み、該ＧＮＥペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を有する。

さらに、細胞中でＧＮＥペプチドを生成する方法が開示され、該方法は、ＧＮＥペプチドまたはその治療的に活性な断片をコードする核酸配列に機能的に結合したプロモーターを含む単離した核酸コンストラクトを該細胞に感染させることを含み、該ＧＮＥペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を有する。

明細書に記載するＮＴＣ８６８５−ＧＮＥ発現ベクターの図である。 ＮＴＣ８６８５−ＧＮＥベクターのヌクレオチド配列である（配列番号１）。 ＵＭＶＣ３−ＧＮＥベクターの図である。 ＵＭＶＣ３−ＧＮＥベクターのヌクレオチド配列である（配列番号２）。 ＧＮＥタンパク質酵素のアミノ酸配列である（配列番号３）。 ＧＮＥアイソフォームおよびアロステリックドメインのアミノ酸配列である。より高いシアル酸産生を可能にする一般のアロステリックドメインの変異を示す（Ｒ２６３Ｑ／Ｗ／ＬおよびＲ２６６Ｑ／Ｗ）。 ＧＮＥ−ｎｕｌｌ ＣＨＯ細胞でのシアル酸産生の棒グラフである。未処置の細胞（「溶媒」、「空ベクター」）と比較して、シアル酸産生は、ＧＮＥプラスミドでトランスフェクトした細胞で著しく高かった。 ＵＭＶＣ３ベクターとＮＴＣ８６８５ベクターを比較し、シアル酸ＧＮＥ−ｎｕｌｌ ＣＨＯ細胞を示す棒グラフである。 ＵＭＶＣ３ベクターとＮＴＣ８６８５ベクターを比較し、ＧＮＥ−ｎｕｌｌ ＣＨＯ細胞のシアル酸含有の細胞分画の棒グラフである。 ＧＮＥベクター対ＭａｎＮＡｃの相対的ｉｎ ｖｉｔｒｏ用量の比較を示す棒グラフである。

シアル酸生合成（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、ＧＮＥ）の鍵酵素のＤＮＡコード領域を送達することによって生物系においてシアル酸の産生を増加させる遺伝子治療法および組成物を本明細書に開示する。細胞性シアル酸産生の増加、またはＧＮＥ機能の向上から恩恵を受けることになる病状には、遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）または縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）が挙げられるがこれらに限定されない。本方法および組成物は、ヒト細胞または組織から非ヒトシアル酸（例えば、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎｅｕ５Ｇｃ）を減少させるまたは除去することにも関する。非ヒトシアル酸は、種々のヒト疾患の一因となり得、かつ非ヒトシアル酸の細胞レベルが長期にわたり減少すると、それらの疾患の進行を抑え、かつ治療する際に有効であると立証し得る（国際公開第ＷＯ／２０１０／０３０６６６号）（Varki 2009）。アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の細胞産生を増加させると、非ヒトシアル酸の細胞内含量を減少させることができる。

個人的にＨＩＢＭに罹患している本発明者は、過去７年にわたるｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を通して、遺伝子治療ベクター（プラスミド、ネイキッドポリ核酸）を開発し、検証してきた。長年、医学文献を調べ、ｉｎ ｖｉｖｏ送達方法とベクターに関するデータを評価することで、簡潔かつ容易な送達方法を、「Ｂｉｅｒブロック」として知られている方法のバリエーションを用いて選択した。Ｂｉｅｒブロックは、１００年以上にわたり、医療において支障なく用いられてきた（dos Reis 2008）。

後述するように、特定の疾患の進行、該プラスミドおよび送達方法の組み合わせには、今まで記述されている他のいずれにも勝る多くの利点がある。これらの利点は、ヒトおよび動物モデルで実用的に用いる容易な翻訳を可能にする。

医薬品の成分および該医薬品を動物またはヒト患者（例えば、ＨＩＢＭに罹患した患者）の骨格筋または他の臓器（例えば肝臓）に送達する方法を本明細書に開示する。医薬品は、ＧＮＥタンパク質の無修飾型または修飾型をコードするポリヌクレチド、ポリペプチドもしくはアミノ酸配列および／または組換えタンパク質、ＧＮＥヌクレオチドの無修飾型または修飾型によってコードされたポリペプチドもしくはアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態において、送達方法は、（１）標的器官系、器官／組織の群、または体部の血管分離を達成するための主要血管（動脈、静脈および／またはリンパ系）の外部または内部閉鎖、および（２）血管（例えば静脈内）アクセスを用いる治療薬の投与が挙げられる。一部の実施形態において、分離される体器官／組織／体部（標的器官）は、送達される成分にさらされるが、他の実施形態では、体器官／組織／体部は、そのような曝露から保護される。

治療遺伝子（ＧＮＥ）の説明および改善

一部の実施形態において、本明細書に開示される治療薬品はポリヌクレオチド（ＤＮＡ）分子であるが、他の実施形態では、治療薬はポリペプチド（タンパク質、タンパク質断片、アミノ酸配列）分子である。一部の実施形態において、直鎖または環状のいずれかであるポリヌクレオチド分子は、ＧＮＥタンパク質、またはＧＮＥタンパク質の修飾型をコードする、すなわちまたは生物系内で生物学的に活性になるコード配列に加えて、種々のエレメントを含むこともある。ＧＮＥタンパク質は、配列を有する（図３）。

一部の実施形態において、本明細書に開示される治療方法は、「遺伝子治療」として一般に知られており、かつ、上記のポリヌクレオチド分子の投与を含む。他の実施形態において、本明細書に開示される治療方法は、「酵素補充療法（ＥＲＴ）」として一般に知られており、かつＧＮＥタンパク質、またはＧＮＥタンパク質の修飾型の投与を含む、すなわちまたは生物系内で生物学的に活性になる。

ＧＮＥは、シアル酸産生（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ）の鍵酵素をコードする。いくつかの病状は、ＧＮＥ発現の増加から恩恵を受けることができる。ＧＮＥ関連ミオパチーとして知られている衰弱が激しい進行性骨格筋消耗疾患で最も注目すべきものは、遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）およびＩＢＭ２として知られているＨＩＢＭの異型の１種、または空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）である。

ＧＮＥ酵素成分またはドメイン（例えば、１０以上の連続的なアミノ酸の一連）を組み換えて、ＧＮＥ遺伝子の所望の機能を向上させ、望ましくない機能を減少させるか、または除去してもよい。例えば、多量のシアル酸（ＮｅｕＡｃ）産生が生物有機体、例えば、原核生物または真核生物で望まれる場合、ＧＮＥ遺伝子のエピメラーゼドメインを最適化して、アロステリック阻害性のドメイン機能を除去するまたは減少させてもよい。重複したＭａｎＮＡｃキナーゼ活性、例えば、ＭａｎＮＡｃのリン酸化を効率的に行うことができる他の酵素類を有する生物および動物において、ＧＮＥキナーゼドメインを減少させるか、または除去して、投与量サイズ、最低有効投与量を減少させ、および／またはある生物系での最大耐投与量を最大にしてもよい。

ＧＮＥ酵素またはその種々の成分もしくはドメインが、シアル酸産生の他に細胞機能を有することも知られている（Hinderlich, Salamaら2004；Broccolini, Gliubizziら2005；Krause, Hinderlichら2005；Salama, Hinderlichら2005；Penner, Manteyら2006；Wang, Sunら2006；Amsili, Shlomaiら2007；Amsili, Zerら2008；Kontou, Weidemannら2008；Kontou, Weidemannら2009；Paccalet, Coulombeら2010）が、重要な細胞分子の低シアリル化はヒト疾患の進行において重要な役割を果たしている（Huizing, Rakocevicら2004；Noguchi, Keiraら2004；Saito, Tomimitsuら2004；Tajima, Uyamaら2005；Ricci, Broccoliniら2006；Galeano, Klootwijkら2007；Sparks, Rakocevicら2007；Nemunaitis, Maplesら2010）。

生物系においてシアル酸とＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃの割合を上昇させることは、ヒト対象においていくつかの既知の理由のために望ましい。哺乳類は、２つ異なるシアル分子を産生する：（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡまたはＮｅｕ５Ａｃ）および（２）Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）。ＣＭＰ−ＮＡＮＡは、ＣＭＰ−ＮＡＮＡヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）によって、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃに変わる。他の霊長類および哺乳類（ウシを含む）とは異なり、ヒトはＣＭＡＨのＡｌｕ媒介の不活性化変異に起因して、Ｎｅｕ５Ｇｃが遺伝的に欠損している（Chou, Hayakawaら2002）。したがって、Ｎｅｕ５Ａｃはヒトによって産生される唯一のシアル酸であり、および多くのヒトはＮｅｕ５Ｇｃに対して抗体を産生する（Tangvoranuntakul, Gagneuxら2003）。ヒト組織および細胞で見られるＮｅｕＧｃは、食物または細胞培地に由来すると考えられている。ヒトは、慢性炎症および慢性炎症が重要因子と考えられる種々の一般的な障害（例えば、癌、アテローム動脈硬化症、自己免疫障害）の一因となる可能性のあるＮｅｕＧｃに対して抗体を産生する（Hedlund, Padler-Karavaniら2008；Varki 2009）。ＮｅｕＧｃは、例えば、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）などのヒト疾患を促進することもできる。ＨＵＳの主な原因は、滋賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）感染症である。毒性の強い志賀毒素サブチラーゼ細胞毒（ＳｕｂＡＢ）は、ＮｅｕＧｃで終わるグリカンに結合するのを好む（Lofling, Patonら2009）。この情報から、ＮｅｕＧｃが一部の感染病原体に対するヒト感受性も増加させ得るのではとの我々の懸念が高まった。

したがって、食物中のＮｅｕＡｃ（ヒトシアル酸）の含有量を増加させて、肉および乳製品で見いだされるＮｅｕＧｃの比率を低下させることが望ましい。これを達成する潜在的に有効な方法は、ＧＮＥ発現を増加させて、ヒトまたは動物いずれかの食物（例えば、ミルク、肉、乳製品および他の動物をベースにした生成物）として使用される生物系または生物においてＣＭＡＨの発現を減少させるまたは除去することである。ＣＭＡＨは、遺伝子技術または代謝技術のいずれかで減少させてもよく、該技術は、ＣＭＡＨノックアウトまたはノックダウン動物を生成するための動物の遺伝子修飾、ポリヌクレオチド技術（抑制性ＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして発現する）によるＣＭＡＨ酵素発現の低減、または代謝基質類似体によるＣＭＡＨ酵素の抑制が挙げられるがこれらに限定されない。また、ＮｅｕＧｃは生物系において、ＮｅｕＧｃをＮｅｕＡｃに変換する酵素の過剰発現によって減少し得る。

ほとんど例外なく、植物は一般的にシアル酸を生成しない。ＧＮＥ酵素および他のシアル酸経路酵素を植物、野菜および果実作物で用いて、食物中のシアル酸を増加させることができる。

ポリヌクレオチドのエレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、反復要素）の修飾、添加および／または除去を用いて、種々の組織／器官で、または発生段階で発現を向上させることができる。これは、薬理分野、食品産業および化粧品産業を含むがこれらに限定されないバイオテクノロジーの種々の分野で望まれ得る。

骨格筋は容易に到達可能であり、かつ非常に血管新生化される重要な組織なので、治療的価値を有するタンパク質を生産する工場として使われ得る（Lu, Bou-Ghariosら2003；RatanamartおよびShaw 2006）に概説される）。実際に、例えば、血友病、ポンペ病、ファブリー病、貧血症、肺気腫および家族性高コレステロール血症などの障害を伴う症状を軽減するために、機能的な治療用タンパク質が骨格筋によって合成されて、十分な量で血液循環に分泌され得ることが示されている。骨格筋中で組換えタンパク質を発現させる能力は、デュシェンヌ型および肢帯型の筋ジストロフィーなどの神経筋障害の治療のための重要な問題でもある。これらの障害は、必須の筋肉タンパク質を生成する遺伝子の変異によって起こる。そのような障害に対する有望な治療の一つは、遺伝子導入であり、その目的は、変異している遺伝子の正常なコピーおよび機能コピーを筋肉に導入することである。

したがって、一態様において、シアル酸を過剰産生して、分泌するタンパク質工場として筋肉を利用する方法が、本明細書に開示される。一部の実施形態において、本明細書に開示される複数の方法は、血漿中でＮｅｕ５ＡＣの生合成の増加、および細胞由来のＮｅｕ５Ｇｃ濃度の低下をもたらす。

治療薬の説明と改善

一部の実施形態において、治療薬はポリヌクレオチドであるが、他の実施形態では、治療薬はポリペプチドである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡ分子であり、タンパク質の全長翻訳領域、タンパク質のドメインの翻訳領域、またはタンパク質の識別されかつ同定されたドメインよりも短いタンパク質断片の翻訳領域を含むことができる。したがって、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、長さが少なくとも１５塩基対のオリゴマーから、タンパク質の全長翻訳領域を含むＤＮＡ分子までに及ぶ。

一部の実施形態において、ポリペプチドは全長タンパク質、例えば、酵素または受容体であるが、他の実施形態では、ポリペプチドはタンパク質断片である。

一部の実施形態において、タンパク質断片は、全長タンパク質の識別されかつ同定されたドメインに相当するが、他の実施形態では、ポリペプチドはタンパク質の識別されかつ同定されたドメインよりも短い。したがって、本明細書に開示されるポリペプチドは、長さが少なくとも５個のアミノ酸のオリゴマーから、全長タンパク質に及ぶことができる。一部の実施形態において、タンパク質断片は、治療的に活性なタンパク質断片である。「治療的に活性なタンパク質断片」とは、生理的条件下でそのタンパク質断片が、野生型ＧＮＥタンパク質と同一の生化学的活性（例えば、同じ反応を触媒する）を有するが、その機能を異なる速度で行い得ることを意味する。

一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは直鎖ＤＮＡ分子であるが、他の実施形態において、ポリヌクレオチドは環状ＤＮＡ分子である。

一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは所望の生物系でＧＮＥ遺伝子を発現させることができる環状ＤＮＡ（プラスミド、ミニプラスミドまたはミニサークル）である。本出願に記載するＮＴＣ８６８５ベクターには、ほとんど利点がないが、サイズの減少、細菌配列の含有量の減少および抗生物質の自由選択を含む。当技術分野の当業者にとって既知の他のベクターも、本明細書に記載の方法とともに用いられることができる。

一部の実施形態において、直鎖または環状のいずれかであるポリヌクロチド治療薬は、ネイキッドＤＮＡとして、種々のカチオン性粒子もしくはアニオン性粒子を生成するために他の分子と組み合わせて投与される、または治療効果を最大化して、患者の不快感を最小化するために他の薬理作用のある物質（例えば賦形剤、血管拡張剤、鎮痛剤等）と同時投与される。ポリヌクレオチドの代わりに、他の薬理学的製品は、記載の送達方法を用いて投与されてもよい。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験とは異なり、正味の正電荷のゼータ電位がポリヌクレオチドのより効率的な細胞侵入である場合、骨格筋のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入は、正味の負電荷を有するポリヌクレオチドを用いるとより効率的なようである（国際出願国際公開第ＷＯ／２００４／０６２３６８号）。

一実施形態では、筋特異的プロモーターを用いて、導入遺伝子に対して宿主免疫応答の可能性を減らし、導入遺伝子の筋肉内発現の継続時間を上げ得る。プラスミド骨格のエレメントを変えて、筋特異的発現を可能にすることができる。骨格筋での遺伝子導入の後、高レベルかつ長期の組換えタンパク質発現を達成する能力は、多くの病状で望まれている。これは、筋特異的なプロモーターおよびエンハンサーを用いて達成することができる。

現在まで、いくつかの異なる筋特異的プロモーターが記述されている。使用されている最も一般的な筋特異的プロモーターは、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターおよび切断型プロモーターである（Hauser, Robinsonら2000；Yuasa, Sakamotoら2002；Sun, Zhangら2005；Sebestyen, Heggeら2007；Wang, Liら2008）。合成Ｃ５−１２プロモーターおよび同様のプロモーターは、導入遺伝子を高度に発現させるが、筋特異的である兆候を示す（Li, Eastmanら1999）。このＣ５−１２プロモーターは、ＡＡＶベクター中で、発現レベルを遍在するＣＭＶプロモーターと同様のレベルで発現を進める（Gonin, Arandelら2005）。Ｃ５−１２は、ＭＣＫエンハンサー（Ｅ−Ｓｙｎプロモーター）（Wang, Liら2008）を付加することによって、さらに改善されることができる。ハイブリッドα−ミオシン重鎖エンハンサープロモーター／ＭＣＫエンハンサー−プロモーター（ＭＨＣＫ７）も、筋肉での高度な発現のために用いられた（Salva, Himedaら2007）。最近では、デスミンプロモーターも、筋細胞で高レベルの発現を進めることができる筋特異的プロモーターとして記載されている（Pacak, Sakaiら2008；Talbot, Waddingtonら2010）。トロポニンなどの遺伝子の上流エンハンサーエレメント（ＵＳＥ、ＵＳＥｘ３／ΔＵＳＥｘ３）も、筋特異的プロモーターを開発するための有望な候補である（国際公開第ＷＯ２００８／１２４９３４、２００８／１０２３；Zengら2010）。

本明細書に開示されるように、ＧＮＥコード配列および／またはそれとともに用いられる関連した送達ビヒクルは、特定の細胞型、例えば筋細胞、筋組織等を標的にし得る。例えば、ＧＮＥコード配列と関連したプロモーターを作製して、特定の組織内または発生段階だけにＧＮＥを発現させることもできる。あるいは、発現カセットに、他の分子、化合物または生体部分（例えば、分子、抗体分子の一部または全体、サイトカイン分子の一部または全体、ウイルスキャプシド）を入れて、特定の細胞型に結合および侵入するように設計された生体混合物または特定の生体粒子を作製することができる。この結合または親和性は、細胞へのＤＮＡ取り込みを容易にすることができる。筋肉への送達ために、特に、アニオン、非リポソーム、ＤＮＡを含む粒子が適切である。しかし、カチオン性（リポソーム）並びに他のＤＮＡを含む生体混合物または粒子も、細胞壁が損なわれているミオパチー性筋肉への取り込みに適している。一部の実施形態において、これらのタンパク質、炭水化物および／または脂質を含む分子標的部分は、微生物、植物、微生物、または合成化合物（例えば、抗体、サイトカイン、レクチン、他の大分子もしくは小分子であるが、これらに限定されない。

一部の実施形態において、本明細書に記述するポリヌクレオチド産物は、以下のエレメントを含む：１）細菌調節エレメント、これは選択および増殖プロセスの目的で細菌中で活性である、２）真核生物調節エレメント、これは治療用遺伝子または組換えタンパク質の発現の目的で真核細胞または哺乳類細胞中で活性である、および３）ＧＮＥ翻訳領域、これは治療遺伝子産物または組換え遺伝子である。一部の実施形態において、原核生物／細菌選択マーカーは、抗生物質抵抗性（例えば、ＵＭＶＣ３ベクター中に存在するカナマイシン抵抗性、図３）またはＲＮＡベース（ＮＴＣ８６８５上に存在する、ＲＮＡ−ＯＵＴ、図１）に基づいている。他の実施形態において、他のエレメントが、効率的なプラスミド産生で用いられている（例えば、ＵＭＶＣ３（図３）およびＮＴＣ８６８４（図１）の両方に示したｐＵＣオリジン）。ＮＴＣ８６８５−ＧＮＥベクターのヌクレオチド配列は、図２、配列番号１に記載しているが、ＵＭＶＣ３−ＧＮＥベクターのヌクレオチド配列は図４に記載している。
さらなる実施形態では、真核生物プロモーター、エンハンサー、イントロンまたは他のエレメントは、ＧＮＥ遺伝子によってコードされる治療用タンパク質の効率的な転写および翻訳で用いている。

抗生物質抵抗性の潜在的な拡散を最小化するために、抗生物質抵抗性に基づかない原核生物選択マーカーは、世界保健機関（ＷＨＯ）、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品審査庁（ＥＭＥＡ）等の規制機関によって好まれている（Williams, Carnesら2009）。

プラスミドＤＮＡを使用するための理論的根拠：治療遺伝子を発現させるためのネイキッドＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の臨床用途は、ＩＢＭ２に起因する筋肉疾患を治療する有望な方法である。遺伝子治療ビヒクルとしてのネイキッドＤＮＡは、優れた安全記録を有し、かつ同一対象での反復投与によって、より高い発現レベルを達成することができる（Hagstrom, Heggeら2004；Wolff, Lewisら2005；Wolff, Budker ら200；HerweijerおよびWolff 200；Braun 2008；Duan 2008； Zhang, Wooddellら2009）。送達方法にもよるが、齧歯動物または霊長類の骨格筋に送達されるｐＤＮＡは、筋線維で保持されて、何ヵ月もの間、コードされた遺伝子産物を発現させる（Danko, Fritzら1993；Danko, Williamsら1997；Sebestyen, Heggeら2007）。細胞性免疫または液性免疫を誘発することができるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および他のウイルスベクターと異なり（Yuasa, Yoshimura ら2007；Mingozzi, Meulenbergら2009）、ｐＤＮＡは、典型的には該ベクターに対して免疫応答を誘発し（Hagstrom, Heggeら 2004；Romero, Braunら2004；Glover, Lippsら2005；Wolff, Budkerら2005）、これによって同一の対象において投与を繰り返すことが可能になる。さらに、ウイルスベクターまたはウイルスをベースにしたベクターと比較して、ｐＤＮＡは大量生産費が比較的安価であり、かつ何ヵ月もの間、安定した状態を保つ（Walther, Steinら2003；Urthaler, Ascherら2007；Voss 2007）。
送達方法。該送達方法の説明および改善

ハイドロダイナミクス注入の一実施形態において、外部止血帯をヒトまたは動物の肢に配置し、次いで末梢静脈アクセスを用いて、特定量の時間または体積流量（典型的には１〜３ｍＬ／秒）で、比体積（典型的には、止血帯下の肢体積の３０〜５０％）を用いて治療薬を投与する。これは、薬理化合物の曝露および用量を減少させるために、１世紀以上にわたって、安全かつ効果的に用いられてきた「Ｂｉｅｒブロック」として知られている一般的に用いられる医療方法と非常に類似している。Ｂｉｅｒブロックは、腕または手の手術において静脈内局所麻酔（全身麻酔の必要性を除去する）を誘導するのに用いられてきた（dos Reis 2008；VlassakovおよびBhavani 2010）。同様の方法は、腫瘍学分野で、特定の肢への化学療法化合物の投与ために「四肢分離注入」という名前で用いられており、内部器官への用量および曝露の減少を可能にしている（Kroon およびThompson 2009）。また、止血帯を四肢に配置することは、数世紀もの間、効果的に用いられており、重篤な外傷後の出血を低減し、または曝露（例えば、有毒蛇および他の動物の咬傷）後、内部器官の毒素への曝露を減少させた。

同一の送達方法または非常に類似した送達方法を用いて、遺伝子治療または生体を投与する場合、送達方法は、医学文献では複数の名前で記載されており、「ハイドロダイナミクス」、「経細静脈」、「経静脈」、「経血管」、「血管」、「逆行性」、「四肢静脈」、「末梢静脈」、「静脈内」、「血管内」、「逆行性」、「血管外漏出」、「高圧」、「加圧」、「四肢分離」、「血管分離」、「血管閉塞」、「血流閉塞」、またはその任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない（Su, Gopalら2005；Zhang, Wooddellら2009；Haurigot, Mingozziら2010；Hegge, Wooddellら2010；Powers, Fanら 2010）。具体的に懸念されていたにもかかわらず、静脈炎後症候群または術後血管障害は、イヌ（犬）の試験に続いて血管閉塞処置を行った後に認められなかった(Haurigot, Mingozziら2010)。

一部の実施形態において、本明細書に開示した送達方法を改善した。同じ体積のヒトおよび動物の四肢は、筋肉と非筋肉（例えば脂肪質または瘢痕）組織の様々な割合で構成され得る。筋肉はより血管性であることが多く、脂質または瘢痕組織よりもより高い血流を必要とする。したがって、比体積を用いた治療薬を投与することは、個人の四肢に治療薬を最適な分配で付与しない恐れがある。より高い筋肉／非筋肉組織を有する四肢は、同じ治療効果を達成するためにより高い注入量を必要とすることもある。血管内（または輸液回路）圧および注入継続時間に基づいて注入を制御することで、目標肢に治療薬を改善された分配でもたらし得る。したがって、記載した方法に関する以下の変更は、この送達方法を改善する：
１）特定圧、おおよそ２〜４×収縮期圧（例えば、ヒト患者に対しては３２０ｍｍＨｇ）の止血帯を施すこと、
２）典型的には、止血帯圧より低い特定の血管内（または輸液回路）圧を達成する（例えば、止血帯圧を３２０ｍｍＨｇで維持する場合、輸液回路圧を２８０〜３００ｍｍＨｇに維持する）ためには、血流を迅速に高める、
３）注入流速を制御することによって輸液回路圧を維持すること、
４）特定の継続時間（１５分）の間、輸液回路内圧を維持すること、
５）上記１および２に記載のパラメータを安全に達成するために、具体的に設計された装置を用いること。そのような装置は、取り付けた止血帯圧に基づき輸液回路の流速および内圧を自動的に制御し得る。安全性のために、そのような装置は、輸液回路内圧の急落、該輸液回路内の気泡、または注入される液体を保持している容器内の液体レベルなどのパラメータが検出されると、注入を自動的に停止するであろう（０ｍＬ／秒の流速）。

血管閉塞の部位の遠位または近位の血管投与部位を選択することによって、標的器官、組織または体部を曝露するまたは保護することができる。

ＨＬＶ送達方法を使用するための理論的根拠：ＤＮＡワクチン接種試験で一般的に用いられているが、筋肉内（ＩＭ）方法によって送達されるｐＤＮＡは、肢全体または全身に治療薬を送達することを求められる筋疾患に対しては非効率的である（Jiao, Williamsら1992）。静脈内(ＩＶ)プラスミドは、肝臓によって、急速に排除される（Liu, Shollenbergerら2007）。だが、ハイドロダイナミクス肢静脈（ＨＬＶ）送達方法と組み合わせて、ＩＶ投与されたｐＤＮＡは、非ヒト霊長類を含む小動物および大型動物の肢全体の骨格筋に効果的かつ均一にトランスフェクトし（Hagstrom, Heggeら2004）、微小血管系の可逆損傷をもたらしている（Toumi, Heggeら2006；Vigen, Heggeら2007）。単回投与は長期の遺伝子発現をもたらすことができ、反復投与が容易なために、ＩＢＭ２患者の四肢にＧＮＥ導入遺伝子を送達するのにＨＬＶを好適にする。止血帯を使用すると、腕または脚の血流は一時的に閉塞されて、プラスミドＤＮＡ溶液は静脈内に急速に注入される。これにより、閉塞領域内の圧が上昇し、遺伝子ビヒクルが隣接する筋線維に著しく効果的に移動することになる。血流は、１０〜２０分以内に正常に再開し、不可逆的または持続的な悪影響がない。同様の静脈高圧方法が採用され、ＤＮＡ。おそらく他の可能性のある治療分子の種々の器官への送達に適応されている（Al-Dosari, Knappら2005；Arruda, Stedmanら2005；Wolff, Lewisら2005；HerweijerおよびWolff 2007；Toromanoff, Cherel ら2008）。

以下の理由から、ＩＢＭ２／ＤＭＲＶは、ＨＬＶを用いるｐＤＮＡ遺伝子送達によって治療されるべく理想的な希少障害である：

低ＧＮＥ発現は治癒を促し得る：ＧＮＥ遺伝子は、比較的小さく（ｃＤＮＡのサイズは２，１６９ｂｐ、７２２アミノ酸をコードする）、骨格筋内で、低レベルで発現するタンパク質酵素として機能する。野生型発現が低いため、またはＧＮＥのシアル酸尿症型の発現が極めて低いため、著しく効果的である、または治療的でさえあることを証明し得る。さらに、ＧＮＥ遺伝子の高次形態（シアル酸尿症）を用いることが可能であり、ＧＮＥ遺伝子の発現が極めて低いために著しい治療効果につながることが可能なる。これは、治療効果を理解するためには比較的大量のジストロフィン（または切断型ミニジストロフィン）が必要とされるＤｕｃｈｅｎｎｅ型またはＢｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーなどの他の筋疾患とはかなり異なっている。

ただ肢だけを治療することで、充分な治療になり得る：ＩＢＭ２は、腕および脚の筋肉に著しく影響を及ぼす。体幹筋肉は、疾患経過の後期に臨床的に影響を受ける。心臓および肺を含む重要臓器は、大部分の患者において臨床的に影響を受けない。腕および脚の機能を救うことによって、我々は生活の質を著しく改善することができ、かつ自立性の喪失を遅らせることができる。

導入遺伝子に対する宿主免疫応答は、起こりそうもない：既知の患者の９９％以上は、１つのアミノ酸（ミスセンス変異）によって野生型と異なるＧＮＥタンパク質を発現させる。さらに、ＧＮＥは、アミノ酸レベルでマウスと男性の間に９８％の相同性で進化的に保存されている。したがって、ＧＮＥ導入遺伝子に対する宿主免疫応答の変化または生じている中和抗体の産生は、ごく少ない。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）などの筋肉特異的プロモーターとＧＮＥを結合させると、宿主抗体応答の機会がさらに減少する（Fabre, Bigeyら2006）。

有益な傍観者効果または遠隔効果の可能性：ジストロフィンとは異なり、筋線維内のジストロフィン（大構造タンパク質）の発現によって、注射部位だけが恩恵を受けると思われる場合、ＩＢＭ２においてＮｅｕ５Ａｃ（小分子、９炭素糖）が、筋線維の限定された領域内に残らないであろうという可能性がある。１つの筋線維が産生するＮｅｕ５Ａｃは、隣接する筋線維に恩恵をもたらすこともあり、血清中のＭａｎＮＡｃまたはＮｅｕ５Ａｃは、その血清に晒される筋線維に恩恵をもたらすこともある。以下のデータは、さらに本仮説を裏付けている：（ａ）Ｓｉａ欠損マウスモデルは、血清中に存在するＮｅｕ５Ａｃを使用することができる（Malicdan, Noguchiら 2009）、（ｂ）低シアル酸化細胞は、それらの増殖培地にＭａｎＮＡｃを補充すると、再シアル酸化した（Schwarzkopf, Knobeloch ら2002）および（ｃ）該培地にＧｌｃＮＡｃは添加せず、５ｍＭのＭａｎＮＡｃまたはＮｅｕ５Ａｃを添加すると、初代ＤＭＲＶの線維芽細胞または筋管細胞のシアル酸含有量が、対照の６０〜７５％から正常レベルまで回復した（Noguchi, Keiraら2004）。傍観者効果、および遠隔効果の可能性は、最近の一回の患者試験で観察された。（Nemunaitis, Maplesら2010）。患者は、前腕（長橈側手根伸筋（ＥＣＲＬ））にＧＮＥ−リポプレックス筋肉内注射を受けた。一過性の強度の増加、組換えＧＮＥ（ｒＧＮＥ）の発現、および細胞表面シアル酸の増大は、注射部位および隣接する区画筋肉で観察された。また、遠隔効果の可能性は、遠位筋肉群（僧帽筋および四頭筋）が左ＥＣＲＬ ｒＧＮＥ導入遺伝子発現およびシアル酸化の増加の相互関係において一時的に改善したという意外な観察の後に示唆された（Nemunaitis, Maplesら2010）。
安全性／毒性

利用できる情報に基づき、ＧＮＥプラスミドは、ＩＢＭ２患者で用いられる極めて安全なベクターであると思われる。通常、遺伝子治療ビヒクルとしてネイキッドＤＮＡは、優れた安全記録を有し、同一の対象において反復投与すると、より高い発現レベルを達成することができる（Hagstrom, Heggeら2004；Wolff, Lewisら2005；Wolff, Budker ら2005；HerweijerおよびWolff 2007；Braun 2008; Duan 2008; Zhang, Wooddellら2009）。

ＧＮＥプラスミドの安全性：現在、ＧＮＥ-プラスミドを用いての齧歯目の毒性試験が、進行中である。予備データは、ネイキッドプラスミドがヒト患者にすでに投与されているＧＮＥ−リポプレックスよりもかなり安全なことを証明するであろうと示唆している（Phadke, Jayら2009；Nemunaitis, Maplesら2010）。我々は、１２匹のマウス（Ｂ６：ＦＢＶ混合型近交系、４〜１０月齢の６匹の雄と６匹の雌）で、１４日間の最新前臨床ＧＬＰ毒性試験を実行した。雄および雌のマウスは、実験群と対照群に均等かつランダムに分けた。実験群には、ＩＶ尾部から投与された高用量のＧＮＥプラスミド（０．１ｍＬの標準食塩水中で０．６ｍｇを懸濁）が与えられ、対照群には、標準食塩水０．１ｍＬのみが与えられた。各群をさらに、以下の通り、２匹のマウス（雌１匹、雄１匹）からなる３つの投与回数群に分けた：１）１４日間、毎日投与、２）一日置きに投与、および３）週１回投与。すべての動物は、実験を乗り切った。測定したすべてのパラメータに関して、実験群と対照群との間に有意な変化は観察されなかった。該パラメータには、体重、体温、飼料と水の摂取量、ＣＢＣ血液検査（１日目の投与前および１５日目の剖検で行った）が含まれた。脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、胃、腸、膀胱、生殖器、リンパ節および筋肉を含む１２の臓器に関して、実験群と対照群との間に有意な変化は観察されなかった。
一日のヒト等価用量（ＨＥＤ）は１２０ｍｇであった。１４日の最大総ＨＥＤは１４４０ｍｇであった。

ＧＮＥ−リポプレックスの安全性：ネイキッドプラスミドＧＮＥと比較して、ＧＮＥ−リポプレックス型はより毒性がある。リポプレックスを生成するために、プラスミドベクターを、１，２−ジオロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）とコレステロール（ＧＮＥ−リポプレックス）で構成されるカチオン性リポソームにカプセル化した。プラスミドベクターをＢａｌｂ／ｃマウスに注射した。ＧＮＥ−リポプレックスの単回静脈内（ＩＶ）注入は、１００μｇ（０．１ｍｇ）用量で、動物の３３％が死に至り、４０μｇコホートでごく一部の動物は一時的毒性を示した（Phadke, Jayら2009）。２０１０年のＡＳＧＣＴ会議で提示されたポスター（Phadke, Jayら2010）に基づいて、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＧＮＥ−リポプレックスの複数回の注射投与の最大耐量は、（１）１注射あたり２０μｇ（ヒト等価用量（ＨＥＤ）＝５．２ｍｇ）、または（２）８０μｇの蓄積量（ＨＥＤ＝２０．８ｍｇ）であった。進行中の用量漸増試験では、患者は１〜３ヵ月間隔で数回の注入を投与され（０．４、０．４、１．０ｍｇ）、各注入から１２時間以内に、グレード１、２の一時的な頻拍および発熱が観察された。患者の肝機能試験でも、一時的な上昇が報告されたが、抄録には正確な数値が報告されてなかった（Nemunaitis, Jayら 2010）。

ハイドロダイナミクス肢静脈（ＨＬＶ）送達方法の安全性：ハイドロダイナミクス送達方法の潜在的副作用は、非ヒト霊長類において、本試験のために提案された２倍の止血帯圧で試験した。この方法は、いかなる非可逆性または持続性の副作用もなく、安全であると決定された（Vigen, Heggeら2007; Hegge, Wooddellら2010）。その方法は、局所麻酔および外科ホメオスターシスで用いられるＢｉｅｒブロックに類似しており、１世紀以上にわたり安全かつ効果的に用いられてきた。主な違いは、瀉血が不必要であり、かつ処置の継続時間は通常は、ＨＬＶで１５分である（Hegge, Wooddellら2010）。非ヒト霊長類での組織学的検査は、ＨＬＶ方法は一時的な筋浮腫を引き起こすが、著しい筋損傷を起こさなかったことを示した（Hagstrom, Heggeら2004；Toumi, Heggeら2006）。非ヒト霊長類でのＴ２強調ＭＲＩ画像も、この方法は一時的な筋浮腫を引き起こしたが、筋区画症候群などの持続性の筋肉の混乱がないことを示した。非ヒト霊長類での核磁気共鳴血管撮影は、毛細管透過性への一時的な影響と一致する血管作用を明らかにしたが、懸念の長期の異常は見られなかった（Vigenら 2007）。これらの初期の試験は、我々が提案している（３１０ｍｍＨｇ）より非常に高い止血帯圧（７００ｍｍＨｇ）を使用して行われた。また、これらの試験では、肢体積の４５〜５０％の注射量が使用されているが、我々は３５％の注射／肢体積を提案している。筋細胞壁の完全性が低下したためにプラスミドが正常な筋肉より効果的にミオパチー性線維に入ると、我々は考え、このように減圧と注射量を説明する。これらの類似する圧を使用して、筋ジストロフィーを患っている成人患者での量漸増試験が、ノースカロライナ大学、チャペルヒル校で進行中である（Powers, Fanら2010）。

要約すると、ｐＤＮＡを用いるＨＬＶ送達方法は、非ヒト霊長類で効果的かつ安全であると証明された成熟した技術と考えられ、臨床治験で試験される準備ができている（Wells 2004；Al-Dosari, Knappら2005；HerweijerおよびWolff 2007）。この方法の主な欠点は、主要な内部血管を一時的にクランプする観血法（例えば、手術、腹腔鏡検査、または経皮的バルーン閉塞）なしに、容易に横隔膜、心臓、および体幹筋／頚筋をトランスフェクトすることができないことである。この欠点は多くの筋ジストロフィーにとって意味があるのだが、それはＩＢＭ２に罹患している患者におけるほどには重要でない。多くのＩＢＭ２患者は、最終学年まで生き、彼らの心臓と肺は臨床的に影響を受けるようになると報告されておらず、疾患経過の後期まで体幹／頚筋は強さを維持しているようである。傍観者効果または遠位効果に関しては大きな潜在的可能性が存在する。したがって、ＧＮＥ導入遺伝子を肢骨格筋に送達するためのｐＤＮＡのＨＬＶ送達は、ＩＢＭ２にとって魅力的な治療選択肢であり、身体的な独立性の喪失を遅延させる可能性があり、多くのＩＢＭ２患者にかなりの望みを与え得る。

ＧＮＢＥコード配列および関連する組成物は、従来の無毒性の薬剤的に許容される任意の担体、アジュバントまたはビヒクルを含み得る。場合によっては、製剤のｐＨは、製剤化された組成物またはその送達形態の安定性を高めるために、薬剤的に許容される酸、塩基またはバッファで調整されてもよい。例えば、無菌の水性注射液または油性懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて既知の技術によって製剤化されてもよい。無菌の注射用製剤は、無菌注射溶液、非経口的に許容される無毒の希釈剤もしくは溶媒中の懸濁液または乳濁液であてもよい。使用してもよい許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、米国薬局方(ＵＳＰ）、生理食塩水がある。加えて、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として使用される。このためには、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、刺激の少ない不揮発性油を使用してもよい。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を注射用製剤で用いてもよい。

特定の実施形態によれば、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）担体を利用して、ＧＮＥコード配列を送達するため、具体的には非経口注射用に用いてもよい（Baxter Laboratories, Inc., Morton Grove, Illinois）。Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）は、静脈内投与で用いてもよい無菌の非発熱性等張液である。各１００ｍＬの量には、塩化ナトリウム５２６ｍｇ、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）；グルコン酸ナトリウム５０２ｍｇ（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）；酢酸ナトリウム三水和物３６８ｍｇ、ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａO２Ｈ２０）；塩化カリウム３７ｍｇ、ＵＳＰ（ＫＣｌ）；および塩化マグネシウム３０ｍｇ、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ）が含まれる。抗菌剤は含まれない。ｐＨは、水酸化ナトリウムで約７．４（６．５〜８．０）に調整するのが好ましい。

ＧＮＥコード配列を送達するために用いる注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、または使用する前に、無菌水、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録）もしくは他の無菌の注射用溶媒中で溶解または分散される殺菌固形組成物の形態で殺菌剤を組み込むことによって、無菌化してもよい。

系内でＧＮＥコード配列の発現を延ばすために（またはその効果を延ばすために）、皮下注射または筋肉内注射からの組成物の吸収を遅くすることが望ましいこともある。これは、水溶性が低い結晶物質または非結晶物質の液体懸濁剤を用いて達成され得る。次いで、組成物の吸収速度は、その溶解速度に依存することもあり、次に、水晶のサイズおよび結晶形態に依存することもある。

あるいは、非経口的に投与されたＧＮＥコード配列の遅延吸収は、油性ビヒクル中で組成物を溶解または懸濁することで達成され得る。注射用デポ形態は、ポリ乳酸−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中にＧＮＥコード配列のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって調製されてもよい。ＧＮＥコード配列物質対ポリマーの割合および使用する特定のポリマーの性質によって、ＧＮＥコード配列放出の速度を制御できる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。上述のように、デポ注射製剤は、筋組織などの標的体組織と適合するリポソーム（またはマイクロエマルジョンでも）中にＧＮＥコード配列を封入することで調製され得る。

系中でシアル酸の産生を調節する方法に加えて、本発明は、系中で野生型ＧＮＥ生成する方法を包括する。そのような実施形態によれば、該系（例えば、ヒト患者の筋細胞）は、変異した内在性のＧＮＥコード配列（例えばＧＮＥ−Ｍ７１２Ｔ配列）を含むこともある。言い換えれば、本発明は、例えば、機能性野生型ＧＮＥコード配列とともに変異した（欠損した）ＧＮＥコード配列を持つ細胞または筋組織を提供することを含む。野生型ＧＮＥコード配列は、例えば、本明細書に記載するリポソームまたは脂質ナノ粒子を用いて、非経口注射を介して、そのような系に送達され得る。

本発明のさらなる関連した実施形態によれば、遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ２）の影響を治療、予防および／または改善する方法が提供される。そのような方法は、一般に患者に野生型ＧＮＥコード核酸配列の治療有効量を供給することを含む。特定の実施形態において、野生型ＧＮＥコード核酸配列は、望ましくは、脂質ナノ粒子およびＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）のそれに類似する担体と関連して、非経口注射を介し患者に投与されてもよい。

野生型ＧＮＥ-コード核酸配列の語句「治療有効量」とは、適切な対危険便益比で、野生型ＧＮＥを十分なレベルで発現させる、標的細胞中でシアル酸産生を増加させる、および／またはさもないと、患者においてＨＩＢＭ２の影響を処置、予防する、および／または回復させるための十分な量の配列を指す。しかし、当然のことながら、本発明の野生型ＧＮＥコード核酸配列および関連する組成物の一日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で、主治医によって決定されることになる。

本明細書に記載する方法の利点の一つは、全身投与とは対照的に、ポリヌクレオチドは罹患している肢に直接的に投与されるので、投与される治療有効量は前述の方法におけるそれよりも少ないことである。したがって、本方法は、前述の方法と関連する副作用の多くを前述の方法と関係している副作用の多数を排除する。

いかなる特定の患者に対する特定の治療有効用量のレベルでも、種々の要因に依存することもあり、それらの要因としては、患者のＨＩＢＭ２障害の重症度；使用される特定のＧＮＥコード配列の活性；使用される送達ビヒクル；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事;投与時間、投与経路および使用される特定のＧＮＥコード配列の排出速度；治療の継続期間：使用される特定のＧＮＥコード配列と併用してまたは同時に用いられる薬物；および医療分野で周知の同様の要因が挙げられる。

患者の状態が改善すると、必要に応じて、ＧＮＥコード配列の維持量を投与してもよい。その後、症状が所望のレベルまで軽減された場合、投与量もしくは投与頻度または両方とも、症状に応じて、改善された状態が維持されるレベルまで減少させてもよい。

本発明のさらなる実施形態によれば、新規の組成物は、系において野生型ＧＮＥを発現させるために提供される。該組成物は、野生型ＧＮＥコード核酸配列を含むことが望ましい。本明細書に記載したように、ＧＮＥコード核酸配列は、例えば、プロモーター、終止配列等、種々の転写調節因子を含み得る。本発明が包含する組成物の非限定例は、図３に示す、本明細書に記載のｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ発現ベクターを含む。そのように本発明の他の実施形態と関連して記載したように、ＧＮＥコード核酸配列は、リポソームまたは脂質ナノ粒子などの、系への送達のための適切なビヒクル内に、またはビヒクルに結合して配置されてもよい。さらに、かかる実施形態によれば、送達ビヒクルは、筋細胞もしくは筋組織などの標的細胞もしくは標的組織を認識してそれに結合することができる薬剤で任意に修飾されてもよい。
実施例
実施例１−ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞における外来性ＧＮＥの発現

以下の実施例では、ヒトｃＤＮＡ由来のいくつかのＧＮＥ発現ベクターを作製した。３つの異なるＧＮＥ型、すなわち野生型、Ｍ７１２ＴおよびＲ２６６Ｑは、ＧＮＥ欠損細胞中でしっかりと発現した（Ｌｅｃ細胞）。明瞭な酵素活性ではあるが、すべての酵素は同程度のタンパク質発現レベルを示した。以下が示すように、細胞系を発現表しているトランスフェクトしたＧＮＥは、非トランスフェクト細胞よりもかなり多くのシアル酸を産生した。
方法論
第１の方法：

ＧＮＥクローニング：ＧＮＥ ｃＤＮＡを含む親ベクターは、Ｄａｎｉｅｌ Ｄａｒｖｉｓｈ(HIBM Research Group, Encino, CA) から提供され、ｐＧＮＥ−ＮＢ８（野生型）、ｐＧＮＥ−ＭＢ１８（Ｍ７１２Ｔ変異体）およびｐＧＮＥ−Ｒ２６６Ｑ（Ｒ２６６Ｑ変異体)を含んでいた。デスティネーションベクター（ｐＵＭＶＣ３）は、Ａｌｄｅｖｒｏｎ（Fargo, ND）から購入した。サブクローニングベクター、ｐＤｒｉｖｅ (Qiagen, Valencia, CA）1を用いて、Ｒ２６６Ｑ変異体を親ベクターからデスティネーションベクターに往復させた。

ＧＮＥ ｃＤＮＡ挿入物（野生型およびＭ７１２Ｔ）を患者の全血から単離したＲＮＡ逆転写によって生成した。ＥｃｏＲ１とＢａｍＨｌ認識５’尾部を有する特異的に設計されたプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅し、続いてＴ４ライゲーション（Invitrogen）によってｐＵＭＶＣ３発現ベクター（Aldevron）中にサブクローニングした。次いで、有能な大腸菌細胞（E. coli）（Invitrogen）をｐＵＭＶＣ３発現ベクターで形質転換した。

製造者のプロトコールに従って、 陽性ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥクローンをＬＢブロス１７５ｍL＋Ｋａｎ５０μｇ／ｍL中一晩増殖させ、次いでＱｉａｇｅｎ (Valencia, CA) ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキットで培養物１５０ｍLを使用した。

ＤＮＡ、脂質複合体：本実施例で用いたＤＮＡ：脂質複合体は、１，２−ジオロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）と試験ＤＮＡ（ｕＭＶＣ３−ＧＮＥ）を室温で混合して生成した。ＤＯＴＡＰは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ． (Alabaster, Alabama)によって提供される市販の脂質粒子である。ＤＯＴＡＰは、所望の総量を達成する方法で、ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ ＤＮＡと混合した。該総量は、最終量１μＬ中、ＤＮＡ０．５μｇ：ＤＯＴＡＰ１ ４ｍＭの最終割合を示した。

細胞培養。ＧＮＥ欠損ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞は、アルベルト・アインシュタイン医学校によって提供された。この細胞は、Ｌ−グルタミン４ｍＭおよび熱失活した１０％ウシ胎仔血清を補充したα−ＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ_２下増殖させた。一過性トランスフェクションのため細胞を、６ウェルプレート内に１ウェルあたり１×１０^６細胞で播種して、一晩増殖させた。Ｌｅｃ３細胞は、１継代あたりＦＢＳを２．５％減らすことによって、血清減少条件下にしていった。

一過性のトランスフェクション：各ウェルのＯｐｔｉＭＥＭ（Invitrogen, Carlsbad CA）中で、ＤＮＡ：脂質複合体とともにＬｅｃ３細胞６時間トランスフェクトし、次いで培地を標準のα−ＭＥＭ増殖培地に変えて、Ｌｅｃ３細胞を一晩培養した。製造者のプロトコールに従って、ＤＮＡ４μｇ＋リポフェクタミン２０００（Invitrogen）１０μＬを混合することでＤＮＡ：脂質複合体を形成した。トランスフェクションから２４時間後、トリプシン消化によって細胞を収集し、続いて行うウェスタンブロットまたは酵素／糖アッセイの前に、ＰＢＳで１回洗浄した。

シアル酸定量化：チオバルビツール酸方法による膜結合シアル酸の定量化のためにおおよそ４×１０^６細胞を使用した。細胞を水に再懸濁させて、２５ゲージ針を通して２０回溶解せて、遠心分離した。ブラッドフォード・タンパク質評価のために上清を使用し、残留ペレットを２Ｍ酢酸１００μＬで再懸濁させ、８０℃で１時間インキュベートして、複合糖質に結合したシアル酸を放出させた。過ヨウ酸溶液１３７μＬ（Ｈ２ＳＯ４ ５７ｍＭ中２．５ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次に、亜ヒ酸ナトリウム溶液５０μＬ（ＨＣｌ ０．５Ｍ中２５ｍｇ／ｍＬ）を添加して、その試験管を勢いよく振盪させてその黄褐色の色を確実に完全に消した。このステップに続いて、１００μＬの２−チオバルビツール酸溶液（７１ｍｇ／ｍＬ、ＮａＯＨでｐＨ９．０に調整した）を添加し、この試料を７．５分間に１００℃まで加熱した。この溶液を１ｍＬのブタノール／５％ＨＣｌ １２Ｍで抽出させて、その相を遠心によって分離した。有機相の吸光度を５４９ｎｍで測定した。シアル酸の量をシアル酸ｎｍｏｌ／タンパク質ｍｇとして測定した。
第２の方法：

以下の方法は、上述の方法に代わるものである。

細胞培養およびバイオアッセイ試験：Ｄｒ．Ｐａｍｅｌａ Ｓｔａｎｌｅｙ(アルベルト・アインシュタイン医学校)から取得したＬｅｃ３ ＣＨＯ]細胞（Hong 2003）を初めに１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Invitrogen）を含むα−ＭＥＭ培地中で増殖させ、α−ＭＥＭ ＦＢＳ培地の培地の継代を２．５％ずつ減らして取り出し、トランスフェクションの前にトリプシン処理した。４組のトランスフェククション産物を、２．０×１０６ ＣＨＯ細胞、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｍｅｄｉａ２．５ｍＬ（Invitrogen)、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ５００μＬ(invitrogen）、リポフェクタミン１０μＬ、およびＤＮＡ４μｇ（ベクターセットを除く）を用いて３連で調製して、３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートした。調製した組に、ＧＮＥ野生型ｐＵＭＶＣ３ベクター、ＧＮＥ Ｍ７２１Ｔ ｐＵＭＶＣ３ベクター、ＧＮＥ Ｒ２６６Ｑ ｐＵＭＶＣ３ベクター、空ベクター、およびベクターを含まない培地を含めた。トランスフェクションから４８時間後に細胞を収集して、ＰＢＳで洗浄し、溶解バッファ中で再懸濁させた。シアル酸含有量をＬｅｏｎａｒｄ Ｗａｒｒｅｎ法（Warren 1959）の改変バージョンを用いて検出し、次いでＵＢＶ−Ｖｉｓモジュールを使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ−１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ (Thermo Fisher Scientific)によって５４９ｎｍで測定した。標準曲線を既知のシアル酸濃度で作製し、吸光度とシアル酸濃度間の線形関係を明確に示した。
結果

ＧＮＥクローン：試験したＧＮＥ ｃＤＮＡクローンには、ヒト野生型ｃＤＮＡおよび２つのヒト変異体ｃＤＮＡが含まれていた。この変異体は、Ｍ７１２Ｔ ＧＮＥ欠損クローンとＲ２６６Ｑシアル酸尿症クローンを含んだ。シアル酸尿症は、ＧＮＥのＣＭＰ−シアル酸結合部位での点変異によって引き起こされるヒト疾患であり、フィードバック阻害の喪失およびシアル酸の大量産生をもたらす。ＧＮＥ ｃＤＮＡをその最初のベクターから発現ベクター（ｐＵＭＶＣ３）へ制限消化クローニングによってサブクローニングした。クローンを方向制限酵素消化によってスクリーニングし、ＧＮＥ挿入断片が正しい方向にあることを確認した。陽性クローンを両方向で配列決定し、クローニングプロセスの間に変異が起こらなかったことを確認した。結果として生じたクロマトグラムをＧｅｎＢａｎｋ（受入番号ＮＭ＿００５４６７）からのＧＮＥ配列と比較したところ、野生型はいかなる変異も示さなかったが、Ｍ７１２ＴおよびＲ２６６Ｑのクローンは予想された点変異だけを含んでいた。マキシプレッププラスミド精製方法を用いて陽性ｐＵＭＶＣ３−ＧＥＮをスケールアップし、再度配列決定して変異が起こらなかったことを確認した。これらのＤＮＡμを以降のすべての実験で用いた。

Ｗｔ−ＧＮＥ ｍＲＮＡ定量化：ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞を１０−％血清中で増殖させて、ｐＵＭＶＣ３ーＧＮＥ−野生型ＤＮＡを２４時間、一時的にトランスフェクトし、発現した組換え型ＧＮＥ ＲＮＡの量を定量化した。全ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ｑＰＣＲを行い、ＧＮＥ転写物から２３０ｂｐの断片を増幅した。ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ野生型の連続希釈物を用いて、トランスフェクトしたＬｅｃ３で発現したＧＮＥ野生型の濃度が４．１ｐｇ／μＬに等しかったことを決定した。ｑＰＣＲのダイナミックレンジは、５ｎｇ〜５ｆｇであった。対照（非トランスフェクトした）ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞でＧＮＥ ｍＲＮＡ産物は検出されなかった（非トランスフェクト型細胞のｃＴ値は４２サイクルよりも多く、５ｆｇ未満である）。したがって、組換え型ＧＮＥ ｍＲＮＡ発現は、トランスフェクトしたＬｅｃ３細胞で検出されたが、非トランスフェクトした細胞のＧＮＥ ｍＲＮＡの量は検出できなかった。

シアル酸アッセイ：トランスフェクトしたＬｅｃ３細胞も、細胞表面シアル酸発現に対する試験をした。すべてのＬｅｃ３試料は、ほぼ６．０ｎｍｏｌ／ｍｇの膜結合シアル酸を有していたが、Ｒ２６６Ｑ ＧＮＥ１をトランスフェクトしたＬｅｃ３細胞は例外で、１．５倍高い量を有していた(図７）。Ｒ２６６Ｑ ＧＮＥはフィードバック阻害がなく、かつ細胞内シアル酸の過剰産生を引き起こすことが知られている。Ｌｅｃ３細胞は、低シアル酸化されるようであり、これは、シアル酸尿症変異体の発現によってのみ克服され得るが、野生型ＣＨＯ細胞と比較して、約１００倍の野生型ＧＮＥの発現によっては克服されない。野生型（ｗｔ）ＧＮＥとＭ７１２Ｔ ＧＮＥの間には著しい差は観察されなかった。

ＵＭＶＣ３およびＮＴＣ８６８５のＧＮＥプラスミドの比較：両ベクターのシアル酸産生を比較するトランスフェクション試験は、互いに十分に相関した（図８および９）。ＮＴＣ８６８５ベクターを用いた場合のシアル酸産生の方がわずかに高いことが見出された。他の細胞型を用いるさらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験およびｉｎ ｖｉｖｏ試験が行われることになる。

ＭａｎＮＡｃの供給によるシアル酸産生：細胞培地にＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）を補充することでシアル酸産生のレベルを測定した。ＭａｎＮＡｃの供給以外は、他の全ての細胞培養変数は、トランスフェクション試験と同一だった（図１０）。

予備高用量プラスミド毒性：我々は、１２匹のマウス（Ｂ６：ＦＢＶ混合型近交系、４〜１０月齢の６匹の雄と６匹の雌）で、１４日間の最新前臨床ＧＬＰ毒性試験を実行した。雄および雌のマウスは、実験群と対照群に均等かつランダムに分けた（表１）。マウスモデルの投与可能な最大用量（ＭＦＤ）は、１注射あたり６００μｇであった。限定は、プラスミドの溶解度（６μｇ／μＬ）および１注射あたりの総量（１００μＬ）に基づいた。マウス体重を３０ｇおよびヒト体重を７０ｋｇと考えると、６００μｇのマウス用量に対するヒト等価用量（ＨＥＤ）は１１３８２ｍｇである。

実験群には、尾部静脈近くでＩＶから投与された高用量のＧＮＥプラスミド（０．１ｍＬの標準食塩水中に０．６ｍｇを懸濁させた）が与えられ、対照群には標準食塩水０．１ｍＬのみが与えられた。各群をさらに、以下の通り、２匹のマウス（雌１匹、雄１匹）からなる３つの投与回数群に分けた：１）１４日間、毎日投与、２）一日置きに投与、および３）週１回投与。すべての動物は、実験を乗り切った。測定したすべてのパラメータに関して、実験群と対照群との間に有意な変化は観察されなかった。該パラメータには、体重、体温、飼料と水の摂取量、ＣＢＣ血液検査（１日目および１５日目に実施）が含まれた。１５日目の剖検の後、脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、胃、腸、膀胱、生殖器、リンパ節および筋肉を含む１２の臓器に関しての肉眼的所見において、実験群と対照群との間に有意な変化は観察されなかった。

本明細書に本発明の例示的な実施形態を記載したが、本発明が、記載されたものに限定されず、および本発明の範囲または精神から逸脱することなく、当業者によって他の種々の変更または改変がなされ得ると理解すべきである。

Claims (14)

1. ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼ酵素（ＧＮＥ）ペプチドまたはその治療的に活性な断片をコードする核酸配列に機能的に結合したプロモーターを含む単離された核酸発現コンストラクトであって、
   前記単離された核酸発現コンストラクトは、配列番号２に記載される配列を有し、対象の細胞においてＧＮＥペプチドを発現又は産生する方法において用いられ、
   前記方法は、前記単離された核酸発現コンストラクトを前記対象の細胞に送達することを含み、前記対象の細胞への送達において、前記核酸発現コンストラクトは前記ＧＮＥペプチドまたはその治療的に活性な断片の発現を開始させる、単離された核酸発現コンストラクト。
2. 前記対象の細胞が前記対象の肢に存在する、請求項１に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
3. 前記送達することが一時的な血管閉塞と組み合わせた血管送達方法を含む、請求項２に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
4. 前記送達方法は、
   ａ）血管内アクセスを通じて前記対象の肢に液体を注入することであって、注入される液体は核酸発現コンストラクトを含み、注入される液体は前記肢の骨格筋または標的組織の全体にわたって浸み込む、液体を注入することと、
   ｂ）前記注入される液体の量を増加させることによって、血管内および組織内の圧を増加させることと、
   を含む、請求項３に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
5. 前記核酸発現コンストラクトは、単回用量で送達される、請求項４に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
6. 前記単回用量は、注入される総量にかかわりなく産物の特定濃度または注入される総量にかかわりなく特定モル量を含む、請求項５に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
7. 前記単離された核酸発現コンストラクトは、トランスフェクションを促進するプロモーター／エンハンサーをさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
8. 前記トランスフェクションを促進するポリペプチドは、シアル酸を産生することが可能な酵素的に活性のポリペプチドを含む、請求項７に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
9. 前記単離された核酸発現コンストラクトによって発現されるトランスフェクションを促進するポリペプチドまたは組換えポリペプチドは、ＧＮＥの高次形態を含み、増加および／または向上したＧＮＥ機能を産生する、請求項８に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
10. 前記対象の細胞は二倍体細胞を含む、請求項１に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
11. 前記対象の細胞は筋細胞を含む、請求項１に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
12. 前記対象は、ヒト、反芻動物、食用動物または使役動物を含む、請求項１に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
13. 前記送達が、
    ａ）対象の肢の膝下または肘下のあるポイントで静脈内アクセスを作製すること；
    ｂ）前記静脈内アクセスポイントよりも前記対象の体の他の部分に対して近位のポイントに止血帯を施すこと；
    ｃ）単離された核酸発現コンストラクトの単回用量を、前記静脈内アクセスを通して肢に導入することであって、前記単回用量は、ポリヌクレオチドの血管外漏出のために血管内圧を上昇させるのに十分な量である、導入することと
    を含む、請求項１に記載の単離された核酸発現コンストラクト。
14. ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞中でＧＮＥペプチドを生成する方法であって、ＧＮＥペプチドまたはその治療的に活性な断片をコードする核酸配列に機能的に結合したプロモーターを含む、配列番号２の単離された核酸コンストラクトを前記細胞に感染させることを含む、方法。

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