JP2017105725A - 光音響イメージング用造影剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】有機色素の濃度当りの信号が大きい、光音響イメージング用造影剤の提供。【解決手段】アルブミンに少なくとも１つの有機色素が共有結合してなる複合体を複数有する光音響イメージング用造影剤であって、該有機色素が下記式（１）で表わされる化合物又はその塩である光音響イメージング用造影剤。［Ｒ１〜Ｒ８は各々独立にＨ、Ｃ１〜３のアルキル基、スルホン酸基；Ｒ９〜Ｒ１２は各々独立にＨ、Ｃ１〜３のアルキル基；Ｒ１３及びＲ１４は各々独立に置換／非置換のＣ１〜５のアルキル基、前記置換基はカルボキシル基、スルホン酸基或いはホスホン酸基；ｎ１及びｎ２は各々独立に０又は１；Ｌ１〜Ｌ７はメチン基、Ｌ１〜Ｌ７は４員〜６員の環を形成していてもよい；Ｒ１００は、フェニル基、ピリジル基又は置換／非置換のＣ１〜５のアルキル基、前記置換基はアリール基等］【選択図】なし
Description
本発明は、光音響イメージング用造影剤に関する。
非侵襲的に生体内部の情報を可視化する方法として、光学イメージング法が知られている。光学イメージング法では、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する音響波や蛍光などの信号を測定して画像化する。被検体に光を照射して音響波を測定して画像化する技術を光音響イメージング（Ｐｈｏｔｏ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ、以下ＰＡＩと略すことがある）と呼ぶ。
また、Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｇｒｅｅｎ（以下ＩＣＧと略すことがある）などの近赤外波長領域の光を吸収する有機色素を生体に投与することで、生体内でその有機色素が発する音響波を測定することも可能である。したがって、ＩＣＧのような有機色素は、光音響イメージング用造影剤として利用できる。
ここで、有機色素を腫瘍の造影剤として用いるために、有機色素にポリマーや蛋白質などの高分子化合物を結合させることが好ましい。なぜなら、有機色素は一般的に低分子であるため、腫瘍に集積する前に血中から速やかに排出されてしまうが、高分子化合物を結合させておくことで排出されにくくなり、血中を循環するうちに腫瘍に集積し、結果的に腫瘍集積量を高めることができるからである。
特許文献１では、ＩＣＧの誘導体を人血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、以下ＨＳＡと略すことがある）に結合させた複合体とすることで、血中から排出されにくくしている。
ここで、光音響イメージングにおいて、腫瘍部位がより明確となる画像を得るためには、より大きな光音響信号を得られることが好ましい。造影剤が有する有機色素を多くすれば大きな信号を得られるが、人体への負担の観点から、造影剤が有する有機色素の量は少ない方が好ましい。そこで、従来よりも、有機色素の濃度あたりの信号が大きい、光音響イメージング用造影剤を提供することを目的とする。
本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、アルブミンに少なくとも１つの有機色素が共有結合してなる複合体を複数有する光音響イメージング用造影剤であって、前記有機色素が下記式（１）で表わされる化合物又はその塩である。
（１）
上記式（１）において、Ｒ１乃至Ｒ８は各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数１以上３以下のアルキル基、スルホン酸基のいずれかを表し、Ｒ９乃至Ｒ１２は、各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数１以上３以下のアルキル基のいずれかを表し、Ｒ１３及びＲ１４は同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよい炭素数１以上５以下のアルキル基を表し、該置換基はカルボキシル基、スルホン酸基及びホスホン酸基のいずれかであり、ｎ１及びｎ２は同一でも異なってもよく、０又は１を表し、Ｌ１乃至Ｌ７はメチン基であり、Ｌ１乃至Ｌ７は４員環乃至６員環を形成していてもよく、Ｒ１００は、フェニル基、ピリジル基及び置換基を有していてもよい炭素数１以上５以下のアルキル基の少なくともいずれかを表し、該置換基はアリール基、アリールアルキル基、スルホアルキル基、アルキルチオ基、スルホアルキルチオ基、複合環基、アシルアミノ基、アリールアミノ基、Ｎ−アリール−Ｎ−アルキルアミノ基、アリールチオ基、アリールオキシ基、ハロゲン原子、及びアシルアミノアリールオキシ基のいずれかである。
本発明に係る光音響イメージング用造影剤によれば、有機色素の濃度あたりの光音響信号を大きくすることができる。
本発明の実施形態に係る光音響イメージング（ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ、以下ＰＡＩと略すことがある）用造影剤について説明するが、本発明はこれに限られない。
（光音響イメージング用造影剤）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、アルブミンに少なくとも１つの特定の有機色素が共有結合してなる複合体を複数有する。複合体が、特定の有機色素すなわち、嵩高い官能基を有し、疎水性の高い有機色素を有するため、複合体同士が集まりやすくなる結果、濃度消光が生じ、大きな光音響信号を得ることができると考えられる。そのため、光音響イメージング用として好適である。
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、アルブミンに少なくとも１つの特定の有機色素が共有結合してなる複合体を複数有する。複合体が、特定の有機色素すなわち、嵩高い官能基を有し、疎水性の高い有機色素を有するため、複合体同士が集まりやすくなる結果、濃度消光が生じ、大きな光音響信号を得ることができると考えられる。そのため、光音響イメージング用として好適である。
なお、本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、上記複合体以外に分散媒、薬理上許容できる添加物（例えば血管拡張剤）、アルブミン等を有していてもよい。また、本実施形態におけるアルブミンにさらに、後述する捕捉分子が結合していてもよい。
以下、本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤を構成する材料について詳細に説明する。
（有機色素）
本実施形態における有機色素は、下記式（１）で表わされる化合物又はその塩である。なお本明細書において、塩は医薬上許容しうる塩であることが好ましい。
本実施形態における有機色素は、下記式（１）で表わされる化合物又はその塩である。なお本明細書において、塩は医薬上許容しうる塩であることが好ましい。
（１）
上記式（１）において、Ｒ１乃至Ｒ８は各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数１以上３以下のアルキル基、スルホン酸基のいずれかを表す。好ましくは、Ｒ１乃至Ｒ８が水素原子の場合である。
上記式（１）において、Ｒ９乃至Ｒ１２は、各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数１以上３以下のアルキル基のいずれかを表す。好ましくは、Ｒ９乃至Ｒ１２がメチル基の場合である。
上記式（１）において、Ｒ１３及びＲ１４は同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよい炭素数１以上５以下のアルキル基を表す。この置換基はカルボキシル基、スルホン酸基及びホスホン酸基のいずれかである。好ましくは、置換基を有するプロピル基であり、好ましい置換基はカルボキシル基である。
上記式（１）においてｎ１及びｎ２は同一でも異なってもよく、０又は１を表すが、ｎ１及びｎ２が１であることが好ましい。
上記式（１）において、Ｌ１乃至Ｌ７はメチン基であり、Ｌ１乃至Ｌ７は４員環乃至６員環を形成していてもよい。
上記式（１）において、Ｒ１００は、フェニル基、ピリジル基及び置換基を有していてもよい炭素数１以上５以下のアルキル基の少なくともいずれかを表す。この置換基はアリール基、アリールアルキル基、スルホアルキル基、アルキルチオ基、スルホアルキルチオ基、複合環基、アシルアミノ基、アリールアミノ基、Ｎ−アリール−Ｎ−アルキルアミノ基、アリールチオ基、アリールオキシ基、ハロゲン原子、及びアシルアミノアリールオキシ基のいずれかである。好ましくは、Ｒ１００がメチル基、エチル基、フェニル基、ピリジル基、ベンジル基のいずれかであることが好ましい。
上記式（１）で表わされる構造はメチン鎖に、嵩高い置換基を有するため、アルブミンとの親和性が高い。そのため、この有機色素をアルブミンと結合させる際に、有機色素がアルブミンと接近しやすくなるため、結果的に多くの有機色素をアルブミンに結合させることができる。また、Ｒ１乃至Ｒ８のうち複数がスルホン酸基である場合、水溶液中での分散性が高い。それにより、アルブミンとの反応性が向上し、アルブミン１分子に多数の有機色素を共有結合させることが可能となる。これにより、アルブミン１分子に多数の有機色素を共有結合させることにより、有機色素同士もしくは複合体同士が集まりやすくなることにより濃度消光が起こると考えられる。このため、光を吸収した有機色素から蛍光が発せられにくくなり、吸収した光のエネルギーが熱エネルギーへと変換されやすくなるため、音響波が大きくなる。また、上記式（１）で表わされる構造はアルブミンとの親和性が高いために、アルブミンに共有結合させた複合体において、色素を介して、複合体同士が集まりやすくなることが考えられる。このため、光を吸収した有機色素から蛍光が発せられにくくなり、吸収した光のエネルギーが熱エネルギーへと変換されやすくなるため、音響波が大きくなる。
本実施形態における有機色素は、例えば、下記の式（２）乃至（６）で表わされる。
上記式（２）乃至（６）において、Ｘは水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、ヨウ素原子のいずれかである。
また、本実施形態における有機色素が、下記式（７）で表わされる化合物（以下１５２Ｃ色素と略すことがある）又はその塩であることが好ましい。
（７）
本実施形態における有機色素は、近赤外波長領域の光を吸収して音響波を発する有機色素であることが好ましい。なお、本明細書において近赤外波長領域の光とは６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長の光を意味する。
（アルブミン）
本実施形態におけるアルブミンは、血中に多量に存在（３５〜５０ｇ／Ｌ程度）し、分子サイズが約６６．５ｋＤａ、全配列５８５アミノ酸程度からなるタンパク質である。アルブミンは生体内において浸透圧制御などの多くの役割を果たしている。本実施形態におけるアルブミンとしては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）などが挙げられるが、ＨＳＡまたはＢＳＡなどの改変体であってもよい。また、これらの断片であってもよい。本実施形態におけるアルブミンとしては、人体との親和性が高いと考えられる、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの改変体、ヒト血清アルブミンの断片、ヒト血清アルブミンの改変体の断片のいずれかであることが好ましい。また、本実施形態におけるアルブミンはヒト血液からの抽出物であってもよいし、大腸菌等からの生産物でもあっても構わない。本実施形態におけるアルブミンはＨＳＡの全配列あるいは全配列中から取り出してきた部分配列と比較して少なくとも９５％以上の相同性を有する。アルブミンは有機色素がアクセスできる位置に複数のリジン残基、あるいは遊離のシステイン残基を有している。アルブミンと有機色素との化学結合の一例として、アルブミンのリジン残基のアミノ基と近赤外色素のカルボキシル基とによるアミド結合が挙げられる。
本実施形態におけるアルブミンは、血中に多量に存在（３５〜５０ｇ／Ｌ程度）し、分子サイズが約６６．５ｋＤａ、全配列５８５アミノ酸程度からなるタンパク質である。アルブミンは生体内において浸透圧制御などの多くの役割を果たしている。本実施形態におけるアルブミンとしては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）などが挙げられるが、ＨＳＡまたはＢＳＡなどの改変体であってもよい。また、これらの断片であってもよい。本実施形態におけるアルブミンとしては、人体との親和性が高いと考えられる、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの改変体、ヒト血清アルブミンの断片、ヒト血清アルブミンの改変体の断片のいずれかであることが好ましい。また、本実施形態におけるアルブミンはヒト血液からの抽出物であってもよいし、大腸菌等からの生産物でもあっても構わない。本実施形態におけるアルブミンはＨＳＡの全配列あるいは全配列中から取り出してきた部分配列と比較して少なくとも９５％以上の相同性を有する。アルブミンは有機色素がアクセスできる位置に複数のリジン残基、あるいは遊離のシステイン残基を有している。アルブミンと有機色素との化学結合の一例として、アルブミンのリジン残基のアミノ基と近赤外色素のカルボキシル基とによるアミド結合が挙げられる。
（色素標識率（Ｄ／Ｐ））
本実施形態における色素標識率は、光音響イメージング造影剤に含まれる複合体に結合している有機色素の平均の数である。本実施形態において色素標識率は、光音響イメージング用造影剤に含まれる有機色素の濃度およびアルブミンの濃度をそれぞれ求め、それらの比（有機色素の濃度／アルブミンの濃度）から算出することができる。なお、有機色素の濃度は、その有機色素の特異的な吸収波長における吸光度から算出できる。特異的な吸収波長として例えば、上記式（７）で示される化合物を用いた場合は７６５ｎｍを採用することができる。また、アルブミンの濃度はｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＣＡ）アッセイによって求めることができる。
本実施形態における色素標識率は、光音響イメージング造影剤に含まれる複合体に結合している有機色素の平均の数である。本実施形態において色素標識率は、光音響イメージング用造影剤に含まれる有機色素の濃度およびアルブミンの濃度をそれぞれ求め、それらの比（有機色素の濃度／アルブミンの濃度）から算出することができる。なお、有機色素の濃度は、その有機色素の特異的な吸収波長における吸光度から算出できる。特異的な吸収波長として例えば、上記式（７）で示される化合物を用いた場合は７６５ｎｍを採用することができる。また、アルブミンの濃度はｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＣＡ）アッセイによって求めることができる。
以下では、色素標識率をＤ／Ｐ（Ｄｙｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎ）と略すことがある。
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤において、Ｄ／Ｐは、３以上１５以下であるであることが好ましく、４以上１０以下であることがさらに好ましい。
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤において、Ｄ／Ｐは、３以上１５以下であるであることが好ましく、４以上１０以下であることがさらに好ましい。
（複合体）
本実施形態における複合体は、アルブミンに少なくとも１つの有機色素が共有結合してなる。ここで、アルブミンと有機色素が共有結合してなる、とは、アルブミンの一部を除いた部位と、有機色素の一部を除いた部位とが共有結合していることを意味する。例えば、アルブミンのアミノ基のＨを除いた−ＮＨと、有機色素が上記式（１）で表わされ、Ｒ１３又はＲ１４がカルボキシル基の場合、ＯＨを除いた−ＣＯと、が共有結合していることを意味する。
また、「複合体」は別の見方をすれば「化合物」や「分子」ということもできる。上記式（２）乃至（６）で表わされる有機色素１個とアルブミン１個とが結合してなる複合体（化合物ということもできる）は以下のように表わすこともできる。
本実施形態における複合体は、アルブミンに少なくとも１つの有機色素が共有結合してなる。ここで、アルブミンと有機色素が共有結合してなる、とは、アルブミンの一部を除いた部位と、有機色素の一部を除いた部位とが共有結合していることを意味する。例えば、アルブミンのアミノ基のＨを除いた−ＮＨと、有機色素が上記式（１）で表わされ、Ｒ１３又はＲ１４がカルボキシル基の場合、ＯＨを除いた−ＣＯと、が共有結合していることを意味する。
また、「複合体」は別の見方をすれば「化合物」や「分子」ということもできる。上記式（２）乃至（６）で表わされる有機色素１個とアルブミン１個とが結合してなる複合体（化合物ということもできる）は以下のように表わすこともできる。
上記式（ｉ）乃至（ｖ）において、Ｘは水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、ヨウ素原子のいずれかである。
上記式（ｉ）乃至（ｖ）において、Ａはアルブミンうち、１つのアミノ基を除いた構造を表す。
（分散媒）
本実施形態における分散媒として例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）、ブドウ糖水溶液が挙げられる。また本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、上記の分散媒に予め分散させておいてもよいし、キットにしておき、生体内に投与する前に分散媒に分散させて使用してもよい。
本実施形態における分散媒として例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）、ブドウ糖水溶液が挙げられる。また本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、上記の分散媒に予め分散させておいてもよいし、キットにしておき、生体内に投与する前に分散媒に分散させて使用してもよい。
（捕捉分子）
本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、ペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された複合体を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、ペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された複合体を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
（複合体の調製方法）
本実施形態において、アルブミンと有機色素とは、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、またはヒドロキシル基を介して公知のカップリング反応によって共有結合させることができる。特に、アミノ基を介して結合させることが好ましい。アミノ基はアルブミン中に複数存在し、弱アルカリ性のｐＨ領域において効率的かつ選択的に反応する。前記反応によりアルブミンと結合した有機色素は、限外濾過法、サイズ排除カラムクロマトグラフィー法等の公知のタンパク質精製法により洗浄、精製することができる。アルブミンと有機色素との結合はアルブミン表面に存在する前記アミノ基、チオール基、カルボキシル基、またはヒドロキシル基と有機色素の誘導体とで直接結合されていても良いし、種々の架橋材（クロスリンカー）を介して結合させても良い。
本実施形態において、アルブミンと有機色素とは、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、またはヒドロキシル基を介して公知のカップリング反応によって共有結合させることができる。特に、アミノ基を介して結合させることが好ましい。アミノ基はアルブミン中に複数存在し、弱アルカリ性のｐＨ領域において効率的かつ選択的に反応する。前記反応によりアルブミンと結合した有機色素は、限外濾過法、サイズ排除カラムクロマトグラフィー法等の公知のタンパク質精製法により洗浄、精製することができる。アルブミンと有機色素との結合はアルブミン表面に存在する前記アミノ基、チオール基、カルボキシル基、またはヒドロキシル基と有機色素の誘導体とで直接結合されていても良いし、種々の架橋材（クロスリンカー）を介して結合させても良い。
なお、アルブミンの有するアミノ基と有機色素の有するカルボキシル基とを反応させる場合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）でカルボキシル基を活性化させてからアミド結合させることが好ましい。以下では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをＮＨＳと略すことがある。
また、ＨＳＡの仕込み量に対する上記有機色素の仕込み量を、３０以上１００以下とすることが好ましく、４０以上８０以下とすることがさらに好ましい。なぜなら後述する実施例からわかるように、アルブミンに対する色素標識率を高くできるからである。
（光学イメージング方法）
本実施形態における光学イメージング方法は、被検体に光を照射して蛍光を測定する蛍光イメージングと、検体に光を照射して音響波（超音波ということもできる）を測定する光音響イメージングとがある。各々の手法における造影剤をそれぞれ、蛍光イメージング用造影剤、光音響イメージング用造影剤と呼ぶことができる。
本実施形態における光学イメージング方法は、被検体に光を照射して蛍光を測定する蛍光イメージングと、検体に光を照射して音響波（超音波ということもできる）を測定する光音響イメージングとがある。各々の手法における造影剤をそれぞれ、蛍光イメージング用造影剤、光音響イメージング用造影剤と呼ぶことができる。
（光音響イメージング方法）
生体内に投与された本実施形態に係る光音響イメージング（ＰＡＩ）用造影剤を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を検出する方法は以下の（ａ）、（ｂ）の工程を有する。但し、本実施形態に係る 光音響イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
生体内に投与された本実施形態に係る光音響イメージング（ＰＡＩ）用造影剤を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を検出する方法は以下の（ａ）、（ｂ）の工程を有する。但し、本実施形態に係る 光音響イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｂ）前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程
また、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、前記（ｂ）で得られた音響波の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記（ｂ）の工程で得られた光音響信号の波長、位相および時間情報を基に３次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば３次元空間上に光音響信号強度が表現されるようなもの構わないし、２次元平面上に光音響信号強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。
（ｂ）前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程
また、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、前記（ｂ）で得られた音響波の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記（ｂ）の工程で得られた光音響信号の波長、位相および時間情報を基に３次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば３次元空間上に光音響信号強度が表現されるようなもの構わないし、２次元平面上に光音響信号強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。
上記（ａ）の工程において、経口投与や注射等の方法によって本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を投与された検体を用いることができる。
また、上記（ｂ）の工程において、検体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤から発せられる光音響信号を検出する装置は特に限定されない。
上記（ｂ）の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射させることのできるものであれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４ ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。
音響波を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ Ｉｎｃ．製）を用いて行うことができる。
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を用いたイメージング方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍、リンパ節あるいは血管などの目的とする部位を造影することができる。
なお、ＰＡＩは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。
なお、ＰＡＩは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、造影剤を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波を正常部位から発せられる音響波よりも大きくすることができる。したがって、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は腫瘍の造影に用いられることが好ましい。
また、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤はリンパ節の造影に用いることもできる。さらに、センチネルリンパ節の造影剤に用いることが特に好ましい。ＩＣＧなどの有機色素をセンチネルリンパ節の造影剤として用いた場合、体内に投与した有機色素は速やかに血中へと移行して体外へ排出されてしまうために観察時間が制約されてしまうという欠点があった。本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、有機色素と比べて分子サイズが大きく、組織内の拡散スピードが低下する結果、センチネルリンパ節での滞留時間が長くなると期待される。したがって、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤はリンパ節の造影、特にセンチネルリンパ節の造影に用いられることが好ましい。
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する色素修飾アルブミンが得られる範囲で自由に変えることができる。
（色素標識率Ｄ／Ｐの算出）
本発明の実施例においてアルブミンに対する色素標識率はサンプル（光音響イメージング用造影剤）の吸光度測定により算出した。サンプル中の色素濃度は用いた色素に特異的な吸収波長（７６５ｎｍ）における吸光度から算出した。具体的には、サンプルを０．９％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）で希釈して吸光度を測定し、予め作成しておいたＳＤＳ中での色素の検量線から算出した。また、アルブミンの濃度はＢＣＡアッセイから算出した。
本発明の実施例においてアルブミンに対する色素標識率はサンプル（光音響イメージング用造影剤）の吸光度測定により算出した。サンプル中の色素濃度は用いた色素に特異的な吸収波長（７６５ｎｍ）における吸光度から算出した。具体的には、サンプルを０．９％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）で希釈して吸光度を測定し、予め作成しておいたＳＤＳ中での色素の検量線から算出した。また、アルブミンの濃度はＢＣＡアッセイから算出した。
（実施例）
（１５２Ｃ−ＨＳＡ（複合体）の調製）
ヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ，ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ：ＨＳＡ、ＳＩＧＭＡ社製、以下単にＨＳＡと略す）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解してＨＳＡ溶液とした。
（１５２Ｃ−ＨＳＡ（複合体）の調製）
ヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ，ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ：ＨＳＡ、ＳＩＧＭＡ社製、以下単にＨＳＡと略す）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解してＨＳＡ溶液とした。
一方、上記式（７）で示される化合物（１５２Ｃ色素）と、１５２Ｃ色素の３倍モル量のＮ−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ’−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）と、１５２Ｃ色素の１．５倍モル量のＮＨＳ（キシダ化学製）をジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、以下ＤＭＳＯと略すことがある）中で混合して、室温で２時間置いて、１５２Ｃ色素を含む溶液を得た。次に、１５２Ｃ色素がＨＳＡに対して、２、５、１０、２０、４０、６０、８０倍モルになるように、この１５２Ｃ色素を含む溶液をＨＳＡ溶液に添加して室温で３時間反応させた。なお、上記Ｎ−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ’−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅはｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＷＳＣ）と呼ぶこともある。
得られた反応混合溶液をゲルろ過（ＰＤ−１０、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）への置換、および未反応体の分離を行った。その結果、１５２Ｃ色素とＨＳＡが共有結合してなる複合体（１５２Ｃ−ＨＳＡ）を有する光音響イメージング用造影剤を調製得た。
得られた反応混合溶液をゲルろ過（ＰＤ−１０、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）への置換、および未反応体の分離を行った。その結果、１５２Ｃ色素とＨＳＡが共有結合してなる複合体（１５２Ｃ−ＨＳＡ）を有する光音響イメージング用造影剤を調製得た。
図１に、ＨＳＡの仕込み量（ｍｏｌ）に対する１５２Ｃ色素の仕込み量（ｍｏｌ）を変化させたときに得られた光音響イメージング用造影剤の色素標識率（Ｄ／Ｐ）を示す。
図１よりＨＳＡに対する有機色素（１５２Ｃ色素）の仕込み量を多くすることで、Ｄ／Ｐを大きくすることが出来ることがわかる。また、ＨＳＡの仕込み量に対する有機色素（１５２Ｃ色素）の仕込み量を、４０以上８０以下とすることで、Ｄ／Ｐの非常に大きい光音響イメージング用造影剤を得られることが分かる。
（比較例）
（ＩＣＧ−ＨＳＡ（複合体）の調製）
比較例として、ＩＣＧ誘導体とＨＳＡとが共有結合してなる複合体を調製した。調整するためにまず、１ｍｇのＩＣＧ誘導体（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ、ＤＯＪＩＮＤＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を０．１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記のＨＳＡ溶液に対してＨＳＡの７倍モル量添加して３７℃で１．５時間静置した。この反応混合溶液をゲルろ過（ＰＤ−１０）によりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）への置換、および未反応体の分離を行い、ＩＣＧ誘導体とＨＳＡが共有結合した化合物（ＩＣＧ−ＨＳＡ）を調製した。
（ＩＣＧ−ＨＳＡ（複合体）の調製）
比較例として、ＩＣＧ誘導体とＨＳＡとが共有結合してなる複合体を調製した。調整するためにまず、１ｍｇのＩＣＧ誘導体（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ、ＤＯＪＩＮＤＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を０．１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記のＨＳＡ溶液に対してＨＳＡの７倍モル量添加して３７℃で１．５時間静置した。この反応混合溶液をゲルろ過（ＰＤ−１０）によりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）への置換、および未反応体の分離を行い、ＩＣＧ誘導体とＨＳＡが共有結合した化合物（ＩＣＧ−ＨＳＡ）を調製した。
（光音響信号強度の測定）
上記、１５２Ｃ−ＨＳＡとＩＣＧ−ＨＳＡを含む光音響イメージング用造影剤の光音響波強度を測定した。光音響信号強度の測定は、パルスレーザー光をＰＢＳ中に分散したサンプル（光音響イメージング用造影剤）に照射し、サンプルから発生した光音響信号の強度を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。波長は７００〜１０００ｎｍで可変であり、測定時はサンプルの吸収極大値付近の波長を選択した。エネルギー密度はおよそ１０から２０ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返し周波数は１０Ｈｚの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサー（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ製）。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μｌであった。計測器は、ＤＰＯ４１０４（テクトロニクス製）を用いて、トリガー：パルスレーザー光をサンプルに照射する際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出、Ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ： １２８回（１２８パルス）平均の条件で測定を行った。得られた光音響信号強度は、レーザー強度と、測定した色素標識ＨＳＡ溶液中の色素濃度もしくはＨＳＡ濃度で規格化した。
上記、１５２Ｃ−ＨＳＡとＩＣＧ−ＨＳＡを含む光音響イメージング用造影剤の光音響波強度を測定した。光音響信号強度の測定は、パルスレーザー光をＰＢＳ中に分散したサンプル（光音響イメージング用造影剤）に照射し、サンプルから発生した光音響信号の強度を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。波長は７００〜１０００ｎｍで可変であり、測定時はサンプルの吸収極大値付近の波長を選択した。エネルギー密度はおよそ１０から２０ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返し周波数は１０Ｈｚの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサー（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ製）。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μｌであった。計測器は、ＤＰＯ４１０４（テクトロニクス製）を用いて、トリガー：パルスレーザー光をサンプルに照射する際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出、Ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ： １２８回（１２８パルス）平均の条件で測定を行った。得られた光音響信号強度は、レーザー強度と、測定した色素標識ＨＳＡ溶液中の色素濃度もしくはＨＳＡ濃度で規格化した。
図２に、１５２Ｃ−ＨＳＡを含む光音響イメージング用造影剤の色素標識率（Ｄ／Ｐ）と色素濃度当たりの光音響信号強度の関係を示した結果を示す。図２より、いずれのＤ／Ｐにおいても、ＩＣＧ−ＨＳＡよりも大きな光音響信号強度が得られることが分かる。また、図２より、１５２Ｃ−ＨＳＡは、高いＤ／Ｐ（８程度）の時に、１５２Ｃ色素に比べて、色素濃度当たりの光音響信号強度が約１．５倍高いことを確認した。これは、後述する図４より、Ｄ／Ｐが高いほど、蛍光強度が低下していることから説明できる。すなわち、Ｄ／Ｐが高いほど複合体同士が集まりやすくなる結果、濃度消光が大きくなり、１５２Ｃから発する蛍光がクエンチすることにより、光音響信号強度が向上していると考えられる。
図３より、１５２−ＨＳＡは、ＨＳＡの濃度当たりの光音響信号強度が、ＩＣＧ−ＨＳＡに比べて、約３．３倍高いことが分かった。
図３より、１５２−ＨＳＡは、ＨＳＡの濃度当たりの光音響信号強度が、ＩＣＧ−ＨＳＡに比べて、約３．３倍高いことが分かった。
（蛍光強度の測定）
１５２Ｃ−ＨＳＡの蛍光強度の測定を、ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）ＣＬｘ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）を用いて行った。１５２Ｃ−ＨＳＡの濃度が５０ｎＭになるように調製し、蛍光強度を測定した。図４に、１５２Ｃ−ＨＳＡの色素標識率（Ｄ／Ｐ）と蛍光強度の関係を示す。
１５２Ｃ−ＨＳＡの蛍光強度の測定を、ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）ＣＬｘ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）を用いて行った。１５２Ｃ−ＨＳＡの濃度が５０ｎＭになるように調製し、蛍光強度を測定した。図４に、１５２Ｃ−ＨＳＡの色素標識率（Ｄ／Ｐ）と蛍光強度の関係を示す。
（未反応色素の評価）
未反応色素の評価は以下のように行った。作製した１５２Ｃ−ＨＳＡをＳＤＳサンプルバッファーに希釈し、Ｔｒｉｓ―Ｇｌｙｃｉｎｅゲルにアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）電気泳動を行い、その後、ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）ＣＬｘ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）を用いて、未反応色素のバンドの蛍光強度を測定することにより、未反応色素の混入率を評価した。その結果、１５２Ｃ−ＨＳＡは未反応色素の混入率が１％未満と非常に少ないことを確認した。すなわち、上記実施例において測定した、光音響イメージング用造影剤からの光音響強度や蛍光強度は、ほぼアルブミンに共有結合した有機色素由来であるといえる。
（１５２Ｃ−ＨＳＡ（複合体）の調製の条件検討）
１５２Ｃ色素と、色素の１、又は３倍モル量のＷＳＣ（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ製）と、色素の１．５倍モル量のＮＨＳ（キシダ化学製）をＤＭＳＯ中で混合して、室温で２時間置いて、１５２Ｃ色素を含む溶液を得た。次に、１５２Ｃ色素がＨＳＡに対して、２、５、１０、２０倍モルになるように、この１５２Ｃ色素を含む溶液をＨＳＡ溶液に添加して室温で３時間反応させた。その結果、ＷＳＣを１倍モルとした条件では、色素仕込み量が２、５、１０、２０倍モルの時、色素標識率（Ｄ／Ｐ）はそれぞれ、０．３１、０．５８、１．２、２．５であった。一方、ＷＳＣを３倍モルとした条件では、色素仕込み量が２、５、１０、２０倍モルの時、Ｄ／Ｐはそれぞれ、０．８１、１．７、２．８、４．７であった。これより、ＷＳＣを１倍モル仕込んだ場合より３倍モル仕込んだ場合の方が、より多くの色素をＨＳＡに導入できることを確認した。
未反応色素の評価は以下のように行った。作製した１５２Ｃ−ＨＳＡをＳＤＳサンプルバッファーに希釈し、Ｔｒｉｓ―Ｇｌｙｃｉｎｅゲルにアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）電気泳動を行い、その後、ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）ＣＬｘ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）を用いて、未反応色素のバンドの蛍光強度を測定することにより、未反応色素の混入率を評価した。その結果、１５２Ｃ−ＨＳＡは未反応色素の混入率が１％未満と非常に少ないことを確認した。すなわち、上記実施例において測定した、光音響イメージング用造影剤からの光音響強度や蛍光強度は、ほぼアルブミンに共有結合した有機色素由来であるといえる。
（１５２Ｃ−ＨＳＡ（複合体）の調製の条件検討）
１５２Ｃ色素と、色素の１、又は３倍モル量のＷＳＣ（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ製）と、色素の１．５倍モル量のＮＨＳ（キシダ化学製）をＤＭＳＯ中で混合して、室温で２時間置いて、１５２Ｃ色素を含む溶液を得た。次に、１５２Ｃ色素がＨＳＡに対して、２、５、１０、２０倍モルになるように、この１５２Ｃ色素を含む溶液をＨＳＡ溶液に添加して室温で３時間反応させた。その結果、ＷＳＣを１倍モルとした条件では、色素仕込み量が２、５、１０、２０倍モルの時、色素標識率（Ｄ／Ｐ）はそれぞれ、０．３１、０．５８、１．２、２．５であった。一方、ＷＳＣを３倍モルとした条件では、色素仕込み量が２、５、１０、２０倍モルの時、Ｄ／Ｐはそれぞれ、０．８１、１．７、２．８、４．７であった。これより、ＷＳＣを１倍モル仕込んだ場合より３倍モル仕込んだ場合の方が、より多くの色素をＨＳＡに導入できることを確認した。
Claims (11)
- アルブミンに少なくとも１つの有機色素が共有結合してなる複合体を複数有する光音響イメージング用造影剤であって、前記有機色素が下記式（１）で表わされる化合物又はその塩である光音響イメージング用造影剤。
（１）
上記式（１）において、Ｒ１乃至Ｒ８は各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数１以上３以下のアルキル基、スルホン酸基のいずれかを表し、Ｒ９乃至Ｒ１２は、各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数１以上３以下のアルキル基のいずれかを表し、Ｒ１３及びＲ１４は同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよい炭素数１以上５以下のアルキル基を表し、該置換基はカルボキシル基、スルホン酸基及びホスホン酸基のいずれかであり、ｎ１及びｎ２は同一でも異なってもよく、０又は１を表し、Ｌ１乃至Ｌ７はメチン基であり、Ｌ１乃至Ｌ７は４員環乃至６員環を形成していてもよく、Ｒ１００は、フェニル基、ピリジル基及び置換基を有していてもよい炭素数１以上５以下のアルキル基の少なくともいずれかを表し、該置換基はアリール基、アリールアルキル基、スルホアルキル基、アルキルチオ基、スルホアルキルチオ基、複合環基、アシルアミノ基、アリールアミノ基、Ｎ−アリール−Ｎ−アルキルアミノ基、アリールチオ基、アリールオキシ基、ハロゲン原子、及びアシルアミノアリールオキシ基のいずれかである。 - 前記光音響イメージング用造影剤における色素標識率が３以上１５以下である請求項１に記載の光音響イメージング用造影剤。
- 前記光音響イメージング用造影剤における色素標識率が４以上１０以下である請求項１または２に記載の光音響イメージング用造影剤。
- 前記Ｒ１００がメチル基、エチル基、フェニル基、ピリジル基、ベンジル基のいずれかである請求項１乃至３のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
- 前記有機色素が下記式（２）乃至（６）のいずれかで表わされる化合物又はその塩である請求項１乃至４のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
上記式（２）乃至（６）において、Ｘは水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、ヨウ素原子のいずれかである。 - 前記有機色素が下記式（７）で表わされる化合物又はその塩である請求項１乃至５のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
（７） - 前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの改変体、ヒト血清アルブミンの断片、ヒト血清アルブミンの改変体の断片のいずれかである請求項１乃至６のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
- 前記アルブミンに捕捉分子が結合している請求項１乃至７のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
- 下記式（ｉ）乃至（ｖ）で表わされる化合物又はその塩を複数有する光音響イメージング用造影剤。
上記式（ｉ）乃至（ｖ）において、Ｘは水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、ヨウ素原子のいずれかであり、上記式（ｉ）乃至（ｖ）において、Ａはアルブミンうち、１つのアミノ基を除いた構造を表す。 - 腫瘍の造影に用いられる請求項１乃至９のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
- リンパ節の造影に用いられる請求項１乃至９のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
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|---|---|---|---|---|
| JP2011046662A (ja) * | 2009-08-28 | 2011-03-10 | Fujifilm Corp | 近赤外蛍光造影剤 |
| JP2011046663A (ja) * | 2009-08-28 | 2011-03-10 | Fujifilm Corp | 近赤外蛍光造影剤 |
| JP2014129332A (ja) * | 2012-07-20 | 2014-07-10 | Canon Inc | 光音響イメージング用造影剤 |
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