JP2017036369A - 可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法、リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法、ポリウレタン発泡体を製造する方法、複合体、リン酸化コラーゲンを製造する方法およびリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】不溶性の生体高分子、特にはキチンおよびコラーゲン、をリン酸化して可溶化する方法を提供すること。【解決手段】特定の分散媒の中にキチンまたはコラーゲンを懸濁し、触媒の存在下で、前記懸濁したキチンまたはコラーゲンをリン酸化し、リン酸化したキチンまたはコラーゲンを分離することにより、キチンおよびコラーゲンをリン酸化して可溶化することができる。上記特定の分散媒は、キチンまたは不溶性のコラーゲンをリン酸化するときは非プロトン性溶媒であり、コラーゲンをリン酸化するときは濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下であるリン酸緩衝液である。【選択図】図２

Description

本発明は、可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法、リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法、ポリウレタン発泡体を製造する方法、複合体、可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法およびリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法に関する。

生体由来の高分子化合物（以下、単に「生体高分子」ともいう。）には、特異な性質を有するが、一方で化学的には製造が難しい化合物が多く含まれる。また、生体高分子は、自然界に豊富に存在する材料であり、かつ、生体への害が少ないかまたは無害であることが多い。そのため、生体高分子の医学的な応用が研究されている。

たとえば、リン酸化したタンパク質とチタンまたはチタン合金との間で複合体を形成させると、チタンまたはチタン合金を短期間で、かつ強固に、骨に結合させることができることが知られている（特許文献１など）。

生体高分子をリン酸化する方法の例として、プルランとアルカリ化合物とを水に溶解させた水溶液と、リン酸化試薬と、を混合して反応させることで、プルランをリン酸化する方法が知られている（特許文献２など）。特許文献２によれば、リン酸化されて可溶化されたプルランは、生体組織に対して親和性が高く、また、生体硬組織の補綴材料である金属にも吸着性を示す。

しかし、生体高分子の多くは、水にも医学分野で通常用いられる溶媒にも不溶または難溶であることが多い。このような不溶性または難溶性（以下、不溶性と難溶性をあわせて単に「不溶性」ともいう。）の生体高分子の例には、エビ、カニ、昆虫（特に甲虫など）の外骨格を構成するキチンや、生体タンパク質であるコラーゲンなどが含まれる。タンパク質を解離して溶解させる溶液として、６Ｍグアニジン塩酸塩溶液および６Ｍ尿素溶液が知られているが、キチンおよびコラーゲンは、６Ｍグアニジン塩酸塩溶液にも６Ｍ尿素溶液にも、数％程度しか溶解しない。

これらの不溶性の生体高分子の医学的な応用を進めるために、生体高分子を可溶化する方法の開発が求められている。たとえば、キチンは、人工的に脱アセチル化してキトサンにすることで、弱酸に溶解することが知られている（特許文献３など）。また、コラーゲンは、メチレン鎖の両端にイミドエステル基を有するアルキルジイミデート二価性架橋試薬で架橋することによって、水に可溶化することが知られている（特許文献４など）。

また、生体硬組織の補綴材料としては、アパタイトで被覆したポリウレタン発泡体や、チタン粉末などを含有するポリウレタン発泡体を焼結してなる材料が知られている（特許文献５、特許文献６など）。

特開２０１４−００４３２７号公報 特許第５７０６５７９号公報 特表２００５−５００４１０号公報 特開平０７−０９７４５４号公報 特許第５５５３５９６号公報 特許第５６３４０４２号公報

Kuboki et al., "Calcified Honeycomb-shaped Collagen Maintains its Geometry in Vivo and Effectively Induces Vasculature and Osteogenesis," Nano Biomedicine, 2009, Vol.1(2), pp. 85-94

しかし、特許文献３などの方法で得られるキトサンは、キチンとは異なり、免疫原性（抗原性）が強いことが明らかになっている。そのため、キトサンの医学的な応用（たとえば、生体内に埋植する材料への応用）には、限界がある。また、特許文献４などの方法で可溶化されたコラーゲンは、化学的修飾等によって、その性質が変わっていることも多く、そのまま医学的に用いることができるか否かは不明である。

これに対し、特許文献１および特許文献２にも記載のような、リン酸化した生体高分子は、水溶性であり、かつ、もとの生体高分子の性質を損なうことなく有することが多いため、医学的への応用が期待できる化合物である。特許文献１では、生体内でリン酸化したタンパク質を抽出して、リン酸化した生体高分子を得ている。これに対し、より多様な生体高分子を医学的に応用するため、生体高分子を人工的にリン酸化して可溶化する技術の開発が望まれている。特許文献２では、水溶性のプルランを水に溶解させてリン酸化することで、リン酸化プルランを得ている。これに対し、水溶性の化合物のみならず、不溶性の生体高分子も、リン酸化して可溶化する技術の開発が望まれている。

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、不溶性の生体高分子、特にはキチンおよびコラーゲン、をリン酸化して可溶化する方法を提供することをその目的とする。また、本発明は、リン酸化して可溶化した上記不溶性の生体高分子を、チタンとの複合体や、ポリウレタン発泡体などに応用し、医学的、産業的に広い用途を提供することをその目的とする。

本発明は、以下の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法、リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法、ポリウレタン発泡体を製造する方法、リン酸化コラーゲンを製造する方法およびリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法に関する。

［１］非プロトン性溶媒の中にキチンまたは不溶性のコラーゲンを分散させる工程と、触媒の存在下で、分散した前記キチンまたは分散した前記不溶性のコラーゲンをリン酸化する工程と、リン酸化した前記キチンまたはリン酸化した前記不溶性のコラーゲンを分離する工程とを含む、可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
［２］前記非プロトン性溶媒はヘキサンの単一溶媒である、［１］に記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
［３］前記非プロトン性溶媒はヘキサンとジメチルホルムアミドとの混合溶媒であり、前記混合溶媒におけるヘキサンとジメチルホルムアミドとの体積比（ヘキサン：ジメチルホルムアミド）は、２５：７５〜１００：０の範囲内（ただし、１００：０を含まない）である、［１］に記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
［４］前記分離する工程は、水に対する透析および遠心分離をこの順に行う、［１］〜［３］のいずれかに記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
［５］前記分離する工程において、前記透析の後に、透析内液に残った水に不溶性の成分を有機溶媒に溶解させ、さらに、アルコールを加えて水に対する透析を行う、［４］に記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
［６］上記リン酸化する工程を、不溶性のコラーゲンが分散した分散液の液温を４０℃以上５０℃以下にして行い、さらに、前記分離する工程の後に、残存した不溶性のコラーゲンを再分散させる工程と、触媒の存在下で、再分散した前記不溶性のコラーゲンを含む分散液の液温を６０℃以上９０℃以下にして、前記再分散した不溶性のコラーゲンをリン酸化させ、リン酸化ゼラチンとする工程と、前記リン酸化ゼラチンを分離する工程を行う、［１］〜［５］のいずれかに記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
［７］さらに、前記分離する工程の後に、前記リン酸化したキチンまたは前記リン酸化した不溶性のコラーゲンをその性質ごとに分離する工程を含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
［８］前記リン酸化したキチンまたは前記リン酸化した不溶性のコラーゲンをその性質ごとに分離する工程は、チタンビーズを固定相とするアフィニティクロマトグラフィーを行う工程である、［７］に記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の方法で製造した可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを含む溶液と、チタン基材と、を接触させる工程を含む、リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法。
［１０］さらに、前記可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを含む溶液に接触させたチタン基材を、石灰化溶液に浸漬する工程を含む、［９］に記載のリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法。
［１１］チタンまたはチタン合金からなる基材と、前記基材の表面の少なくとも一部を被覆するリン酸化キチン含有層またはリン酸化コラーゲン含有層とを有する、複合体。
［１２］前記リン酸化キチン含有層またはリン酸化コラーゲン含有層はヒドロキシアパタイトを含む、［１１］に記載の複合体。
［１３］［１］〜［８］のいずれかに記載の方法で製造した可溶性のリン酸化キチン、ポリオール類およびポリイソシアネート類を含有する混合液を調製する工程と、前記混合液に発泡剤を混和して撹拌および混合する工程とを含む、ポリウレタン発泡体を製造する方法。
［１４］ポリオール類とポリイソシアネート類とを反応させて末端にイソシアネート基を有するプレポリマーを製造する工程と、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法で製造した可溶性のリン酸化キチン、前記プレポリマー、過剰の水およびポリオール類を含有する混合液を調製する工程と、前記混合液に発泡剤を混和して撹拌および混合する工程とを含む、ポリウレタン発泡体を製造する方法。
［１５］濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下であるリン酸緩衝液の中に可溶性のコラーゲンを分散させる工程と、触媒の存在下で、分散した前記可溶性のコラーゲンをリン酸化する工程と、リン酸化した前記可溶性のコラーゲンを分離する工程とを含む、リン酸化コラーゲンを製造する方法。
［１６］さらに、前記分離する工程の後に、前記リン酸化した可溶性のコラーゲンをその性質ごとに分離する工程を含む、［１５］に記載のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
［１７］前記リン酸化した可溶性のコラーゲンをその性質ごとに分離する工程は、チタンビーズを固定相とするアフィニティクロマトグラフィーを行う工程である、［１６］に記載のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
［１８］［１５］〜［１７］のいずれかに記載の方法で製造した可溶性のリン酸化コラーゲンを含む溶液と、チタン基材と、を接触させる工程を含む、リン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法。

本発明によれば、不溶性の生体高分子、特にはキチンおよびコラーゲン、をリン酸化して可溶化することが可能となる。また、本発明によれば、リン酸化して可溶化した上記不溶性の生体高分子を、チタンとの複合体や、ポリウレタン発泡体などに応用し、医学的、産業的に広い用途を提供するが可能となる。

図１は、実施例１において得た、リン酸化を行って可溶化したキチン試料について測定した赤外吸収スペクトルである。 図２は、実施例１において得た、リン酸化を行って可溶化したキチン試料と、リン酸化を行わなかったキチンについて測定した赤外吸収スペクトルである。 図３は、実施例３において得た、リン酸化を行って可溶化したコラーゲン試料と、リン酸化を行わなかったコラーゲン試料の赤外吸収スペクトルである。 図４は、実施例４におけるチタン粒子を詰めたカラムに対する、リン酸化を行ったキチンの溶出パターンを示すクロマトグラムである。 図５は、実施例５におけるチタン粒子を詰めたカラムに対する、リン酸化を行ったコラーゲンの溶出パターンを示すクロマトグラムである。 図６は、実施例５におけるチタン粒子を詰めたカラムに対する、リン酸化を行わなかったコラーゲンの溶出パターンを示すクロマトグラムである。 図７Ａおよびそれを部分的に拡大した図７Ｂは、実施例６における実施例のインプラントを埋植したラットからの組織標本である。図７Ｃおよびそれを部分的に拡大した図７Ｄは、実施例６における比較例のインプラントを埋植したラットからの組織標本である。 図８Ａおよびそれを部分的に拡大した図８Ｂは、ヒドロキシアパタイト析出処理をする前のリン酸化キチンとチタンとの複合体の表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による写真である。図８Ｃおよびそれを部分的に拡大した図８Ｄは、ヒドロキシアパタイトが析出したリン酸化キチンとチタンとの複合体の表面のＳＥＭによる写真である。 図９は、実施例９におけるヒドロキシアパタイトを析出させる前のポリウレタン発泡体の平均質量、ならびに試験片１、試験片２および試験片３の質量を示すグラフである。

［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態は、可溶性のリン酸化キチンおよび可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法に係る。本実施形態は、特定の分散媒の中にキチンまたはコラーゲンを分散させる工程と、触媒の存在下で、前記分散したキチンまたはコラーゲンをリン酸化する工程と、リン酸化したキチンまたはコラーゲンを分離する工程と、を含む。本実施形態は、さらに、リン酸化したキチンまたはコラーゲンを、その性質ごとに分離する工程を含んでもよい。なお、可溶性とは、水または有機溶媒への溶解度が生体由来のキチンまたはコラーゲンよりも高くなった状態を意味する。本実施形態は、分散したキチンまたはコラーゲンを触媒の存在下で少なくとも部分的にリン酸化することで、可溶性のリン酸化したキチンまたはコラーゲンを製造するものである。なお、リン酸化コラーゲンとは、グリシンが３塩基ごとに繰り返すいわゆるコラーゲン配列を有する３本のペプチド鎖がらせん構造を形成しているタンパク質が、少なくとも部分的にリン酸化しているものを意味する。この限りにおいて、リン酸化コラーゲンを構成するコラーゲンは、ゼラチン等に変性してもよい。

（特定の分散媒の中にキチンを分散させる工程）
本工程では、特定の分散媒の中にキチンまたはコラーゲンを分散させる。上記特定の分散媒とは、キチンまたは不溶性のコラーゲンの場合は非プロトン性溶媒であり、可溶性のコラーゲンの場合は濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下であるリン酸緩衝液である。

キチンまたは不溶性のコラーゲンを分散させるために用いる、上記非プロトン性溶媒とは、プロトン供与性を持たない溶媒を意味する。非プロトン性溶媒の例には、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ペンタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、アセトンおよびテトラヒドロフランが含まれる。

これらのうち、非プロトン性溶媒は、ヘキサンの単一溶媒であるか、またはヘキサンとジメチルホルムアミドとの混合溶媒であることが好ましい。非プロトン性溶媒が、ヘキサンとジメチルホルムアミドとの混合溶媒であるとき、混合溶媒におけるヘキサンとジメチルホルムアミドとの体積比（ヘキサン：ジメチルホルムアミド）は、２５：７５〜１００：０の範囲内（ただし、１００：０を含まない）であることが好ましい。

非プロトン性溶媒は、得ようとするリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンの性質に応じて選択することができる。たとえば、非プロトン性溶媒がヘキサンの単一溶媒であるとき、得られるリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンの大部分は水溶性の性質を示す。一方で、非プロトン性溶媒がヘキサンとジメチルホルムアミドとの混合溶媒であり、上記ヘキサンとジメチルホルムアミドとの体積比が２５：７５〜５０：５０の範囲内であるとき、得られるリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンは、水溶性の性質を示すものと、水には不溶だが有機溶媒（たとえば、ジメチルホルムアミド）に可溶な性質を示すものと、の混合物となる。

可溶性のコラーゲンを分散させるために用いる、上記濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下であるリン酸緩衝液は、たとえば、リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムとで調製したリン酸緩衝液、またはリン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素カリウムとで調製したリン酸緩衝液とすることができる。このとき、リン酸緩衝液のｐＨは７未満であることが好ましく、ｐＨの調整を容易にする観点からは、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素カリウムとで調製したリン酸緩衝液が好ましい。

分散は、公知の方法で行うことができる。たとえば、乾燥したキチンまたはコラーゲンの粉末と上記特定の分散媒とを密閉容器内に入れて、撹拌または振とうすることで、キチンまたはコラーゲンを分散させることができる。このとき、キチンまたはコラーゲンの分散による濁りが非プロトン性溶媒に生じたことが、目視で確認できれば、キチンまたはコラーゲンが十分に分散したと判断してよい。

（触媒の存在下で、分散したキチンまたはコラーゲンをリン酸化する工程）
生体内で高分子をリン酸化する方法として知られているリン酸化酵素（キナーゼ）を触媒とする方法は、この種の酵素の特異性が高いために一般に困難である。そのため非酵素的触媒を用いた化学的なリン酸化法が追究されているが、いまだに十分有効な方法が開発されていない。

これに対し、本発明における分散したキチンまたはコラーゲンのリン酸化は、生体高分子をリン酸化する方法として知られている、公知の触媒を用いる方法で行うことができる。生体高分子をリン酸化する公知の方法には、上記触媒として酵素を用いる酵素的方法、ならびにリン酸化試薬およびそれによるリン酸化に適した触媒を用いる化学的方法が含まれる。

キチンまたはコラーゲンのリン酸化の可能性あるリン酸化酵素の例には、特異性の広いサイクリックＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＥＣ２．７．１．３７）などが含まれる。

上記酵素的方法における撹拌時の温度は、上記酵素の活性温度近辺とすることが好ましい。

化学的方法の例には、公知のリン酸化試薬およびそれによるリン酸化に用いることができる触媒を前記分散液に投入し、撹拌する方法が含まれる。

キチンまたはコラーゲンのリン酸化に用いることができるリン酸化試薬は、５酸化リンが好ましい。そのほかの上記リン酸化試薬の例には、第一リン酸ナトリウム（リン酸二水素ナトリウム）、第二リン酸ナトリウム（リン酸水素二ナトリウム）、第三リン酸ナトリウム（リン酸三ナトリウム）、トリポリリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、第一リン酸カリウム（リン酸二水素カリウム）、第二リン酸カリウム（リン酸水素二カリウム）、第三リン酸カリウム（リン酸三カリウム）、トリポリリン酸カリウム、トリメタリン酸カリウム、およびオキシ塩化リンが含まれる。

上記リン酸化試薬の量は、得られるリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンに所望する性質に応じて適宜調整すればよい。キチンまたはコラーゲンを十分に可溶化し、かつ、生体への影響を少なくする観点からは、上記リン酸化試薬は、キチンまたはコラーゲンに対するリン酸イオンの量が、１０質量％以上２００質量％以下となる量で投入されることが好ましい。

上記化学的方法によるキチンまたはコラーゲンのリン酸化に用いることができる触媒の例には、メタンスルフォン酸が含まれる。

上記化学的方法における撹拌時の温度は、キチンまたはコラーゲンの変性等が生じず、かつ、キチンまたはコラーゲンのリン酸化が十分に生じる温度とすればよい。キチンまたはコラーゲンを十分にリン酸化して可溶化する観点からは、上記撹拌時の温度は、４０℃以上５０℃以下であることが好ましい。

不溶性のコラーゲンをリン酸化するときは、上記温度ではすべてのコラーゲンが可溶化せず、一部のコラーゲンが不溶性のまま残存することがある。この可溶化しなかったコラーゲンは、さらに上記方法により非プロトン性溶媒に分散（再分散）させ、上記方法により６０℃以上９０℃以下、好ましくは７０℃でリン酸化させてリン酸化ゼラチンにして、さらに後述する方法により分離することで、リン酸化したゼラチンとして回収することができる。

上記化学的方法における撹拌時間は、キチンまたはコラーゲンのリン酸化が十分に生じる時間とすればよく、たとえば、２時間以上５時間以下とすることができる。

（リン酸化したキチンまたはコラーゲンを分離する工程）
上記方法でリン酸化したキチンまたはコラーゲンは、水または有機溶媒に可溶である。そのため、上記方法でリン酸化したキチンまたはコラーゲンを、水または有機溶媒に分離することで、可溶性のリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンを含む溶液を得ることができる。

分離は、公知の方法で行うことができる。分離方法の例には、透析および遠心分離が含まれ、水（たとえば、蒸留水）に対する透析および遠心分離を、この順に行うことが好ましい。分離の精度を高める観点からは、透析は、透析後の外液の電気伝導度に変化がなくなるまで、複数回行うことが好ましい。

分離の精度をさらに高める観点からは、透析の後に得られた沈渣を有機溶媒（たとえば、ジメチルホルムアミド）に溶解させ、その後、アルコールを加えてさらに水に対する透析を行うことが好ましい。上記アルコールの例には、メタノールおよびエタノールが含まれる。

（リン酸化したキチンまたはコラーゲンを、その性質ごとに分離する工程）
上記方法でリン酸化したキチンまたはコラーゲンには、おそらくはリン酸基の結合量やリン酸基間の距離などの違いによる、様々な性質を有するキチン誘導体またはコラーゲン誘導体が含まれる。本実施形態は、これらの性質の異なるリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンを、その性質ごとに分離する工程を含んでもよい。たとえば、アフィニティクロマトグラフィーを行うことで、前記リン酸化したキチンまたはリン酸化したコラーゲンから、カラムの固定相に結合または吸着する化合物を分離することができる。

上記カラムの固定相には、得ようとする性質を有するリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンが結合または吸着する物質を用いればよい。たとえば、固定相をチタンビーズとすることで、チタン結合性の性質を有するリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンを分離して得ることができる。

リン酸化した生体高分子には、チタンへの結合能を有するものがあることが知られている（たとえば、特許文献１および特許文献２を参照。）。また、チタンは、骨の再建材料として人工骨、人工関節の軸または人工歯根に用いられている。そのため、本実施形態に係る方法によって分離された、チタンに結合または吸着する性質を有するリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンは、チタンに結合させて、骨の再建材料に応用することができる（後述する第２の実施形態および第３の実施形態を参照。）。

（効果）
このようにして製造した、可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンは、水または有機溶媒に可溶であるため、他の物質との混合または反応、および生体への投与等を容易に行うことが可能であり、工業的、医学的な応用に適している。また、この可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンは、もとのキチンまたはコラーゲンの性質を損なうことなく有しているため、生体への悪影響が少なく、医学的な応用に適している。

［第２の実施形態］
本発明の第２の実施形態は、リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体、およびこのような複合体を製造する方法に係る。本実施形態に係る方法は、前記第１の実施形態に係る方法で製造した可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを含む溶液と、チタン基材と、を接触させる工程を含む。本実施形態に係る方法によって製造されるリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体は、チタンまたはチタン合金からなる基材と、前記基材の表面の少なくとも一部を被覆するリン酸化キチン含有層またはリン酸化コラーゲン含有層とを有する。

リン酸化キチン含有層またはリン酸化コラーゲン含有層にチタン基材をより十分に被覆させる観点からは、前記可溶性のリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンは、チタンに結合または吸着する性質を有するもののみを分離したものであることが好ましい。

チタン基材は、チタンまたはチタン合金を少なくともその表面に有する基材であればよい。基材の形状は、前記複合体の用途に応じて適宜選択することができる。たとえば、本実施形態で製造される複合体を生体インプラントに適用する場合、基材の形状の例には、柱状（ロッド状）、板状、シート状、ブロック状、ワイヤ状、繊維状、粉末状などが含まれる。また、本実施形態で製造される複合体を細胞培養基材に適用する場合、基材の形状の例には、メッシュ状（不織布（titanic web：ＴＷ）を含む）、平板状などが含まれる。

前記可溶性のリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンを含む溶液は、第１の実施形態におけるリン酸化したキチンまたはリン酸化したコラーゲンを分離する工程で得られた溶液をそのまま、または濃縮もしくは希釈して用いてもよいし、前記分離する工程で得られた溶液を乾燥させて得られたリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンを、別の溶媒に溶解させたものを用いてもよい。

前記接触させる工程は、公知の方法で行い得る。たとえば、前記可溶性のリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンを含む溶液にチタン基材を浸漬してもよいし、前記可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを含む溶液をチタン基材の表面に塗布してもよい。

前記接触させる工程は、たとえば、以下の工程によって行うことができる。なお、以下の工程における操作は、すべて無菌条件下のクリーンベンチ内で行われる。終濃度が０.１〜１.０％となるように前記可溶性のリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンを生理的緩衝液（例えば、ダルベッコ生理的緩衝液）に溶解させた後、無菌ろ過して、リン酸化キチン溶液またはリン酸化コラーゲン溶液を調製する。基材の表面に前記リン酸化キチン溶液またはリン酸化コラーゲン溶液を塗布するか、基材を前記リン酸化キチン溶液またはリン酸化コラーゲン溶液に浸漬して、基材の表面に前記リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンを吸着させる。次いで、過剰量の液体を吸引除去した後、基材の表面を乾燥させる。前記リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンが吸着した基材（チタン−リン酸化キチン複合体またはチタン−リン酸化コラーゲン複合体）は、無菌容器内において、乾燥状態かつ１０℃以下で保存される。

リン酸化キチン含有層またはリン酸化コラーゲン含有層は、リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンに加え、用途に応じて他の成分を含んでいてもよい。この場合、リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンによる骨への結合性をより十分に発揮させるためには、リン酸化キチン含有層中のリン酸化キチンの量またはリン酸化コラーゲン含有層中のリン酸化コラーゲンの量は、８０質量％以上であることが好ましい。

（効果）
このようにして製造した複合体は、チタン基材の表面がチタンおよび骨に含まれる各種細胞の両方に対して親和性が高いリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンで被覆されている。したがって、本実施形態に係る方法で製造された複合体を生体インプラント（例えば、人工骨や人工歯根など）として使用した場合には、短期間でかつ強固に骨と結合させることができる。また、本実施形態に係る方法で製造された複合体を細胞培養基材として使用した場合には、骨に含まれる各種細胞を好適に培養することができる。

［第３の実施形態］
本発明の第３の実施形態は、リン酸化キチンとチタンとの複合体またはリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体、およびこのような複合体を製造する別の方法に係る。本実施形態は、前記第２の実施形態に係る方法において、前記リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンに、細胞接着性のタンパク質またはその部分ペプチドを結合させる工程を含む。

上記細胞接着性のタンパク質の例には、細胞接着に関与するＲＧＤ配列を分子表面に有するタンパク質、および同配列を含む合成ペプチドが含まれる。ＲＧＤ配列は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの３残基よりなる配列であり、細胞のα_Ｖβ_３インテグリンにより認識され、特異的に結合する。ＲＧＤ配列を分子表面に有するタンパク質の例には、オステオポンチン（osteopontin：ＯＰＮ）、骨シアロタンパク質（bone sialoprotein：ＢＳＰ）および象牙質マトリックスタンパク質−１（dentin matrix protein 1：ＤＭＰ１）が含まれる。

上記細胞接着性のタンパク質は、公知のタンパク質架橋剤によって、前記リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンに結合させることができる。たとえば、タンパク質架橋剤を適切に選択すれば、前記リン酸化キチンが有する、脱アセチル化して露出したアミノ基と、上記細胞接着性のタンパク質のカルボキシル基とを、結合させることができる。また、タンパク質架橋剤を適切に選択すれば、前記リン酸化コラーゲンの分断等によって生じたアミノ基と、上記細胞接着性のタンパク質のカルボキシル基とを、結合させることができる。

結合は、公知の方法で行うことができる。たとえば、前記リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンと上記細胞接着性のタンパク質とを、タンパク質架橋剤で架橋させればよい。

タンパク質架橋剤としては、開発されている多種多様な試薬を、目的に応じて用いることができる（たとえばフナコシ株式会社のカタログを参照）。その中で２分子間の異なった反応基、たとえばアミノ基とスルヒドリル基を架橋する試薬の例には、マレイミド−プロピルオキシ−スクシニイミドなどが含まれる。

（効果）
このようにして製造した複合体は、チタン基材の表面を被覆する前記リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンが、さらに上記細胞接着性のタンパク質と結合している。そのため、細胞接着性のタンパク質がチタン基材と骨との間での骨形成をさらに促進して、チタン基材をさらに短期間で、かつ強固に、骨に結合させることができる。本発明者らの知見によれば、本実施形態に係る方法で製造した複合体は、前記複合体を形成しないチタン基材と比較して、１００倍近い速さで、骨に結合することができる。

［第４の実施形態］
本発明の第４の実施形態は、表面にヒドロキシアパタイトが析出したリン酸化キチンとチタンとの複合体、およびこのような複合体を製造する方法に係る。本実施形態は、前記第２の実施形態または第３の実施形態に係る方法で可溶性のリン酸化キチンを含む溶液に接触させたチタン基材を、石灰化溶液に浸漬する工程を含む。この工程により、前記複合体の表面を被覆するリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンにヒドロキシアパタイトが結合し、ヒドロキシアパタイトを析出させることができる。

石灰化溶液は、リン酸イオンおよびカルシウムイオンを準安定濃度に含む溶液とすることができ、たとえば、１５ｍＭ／Ｌのカルシウムイオンおよび９ｍＭ／Ｌのリン酸イオンを含有する、久保木ら（非特許文献１）に記載の溶液とすることができる。

前記石灰化溶液に浸漬する工程は、たとえば、非特許文献１に記載の、以下の工程によって行うことができる。１５ｍＭ／Ｌの塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、９ｍＭ／Ｌのリン酸二カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ４）、０．７Ｍ／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および０．０２Ｍ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）を含有する石灰化溶液を用意する。二酸化炭素ガスのバブリングによりｐＨを６．０１〜６．０５、好ましくは６．０１に調整した上記石灰化溶液に、前記第２の実施形態または第３の実施形態に係る方法で得られた複合体を浸漬し、２０℃〜５０℃、好ましくは３７℃で、１２時間〜４８時間、好ましくは４８時間インキュベートする。その後、チタン基材を取り出して脱塩水で洗浄し、凍結乾燥させる。凍結乾燥したチタン基材を、新しい上記石灰化溶液に再び浸漬し、１日おきに石灰化溶液を交換しつつ、１〜２週間インキュベートする。その後、チタン基材を取り出して脱塩水で洗浄し、凍結乾燥させる。このようにして得られたヒドロキシアパタイトが析出したチタン基材は、無菌容器内において、乾燥状態かつ１０℃以下で保存される。

（効果）
このようにして製造した、表面にヒドロキシアパタイトが析出したチタン基材は、生体に対して親和性の高いヒドロキシアパタイトが均等に析出している。そのため、ヒドロキシアパタイトがチタン基材と骨との間で骨形成をさらに促進して、チタン基材をさらに短期間で、かつ強固に、骨に結合させることができる。

［第５の実施形態］
本発明の第５の実施形態は、発泡材料の製造方法に係る。本実施形態は、前記第１の実施形態で得られた可溶性のリン酸化キチンを含有するポリウレタン発泡体を製造する工程と、発泡材料を製造する工程とを含む。本実施形態は、さらに、上記ポリウレタン発泡体を石灰化溶液に浸漬する工程を含んでもよい。

（リン酸化キチンを含有するポリウレタン発泡体を製造する工程）
上記リン酸化キチンを含有するポリウレタン発泡体を製造する工程では、ワンショット法およびプレポリマー法を含む、従来の方法により、ポリウレタン発泡体を製造することができる。

ワンショット法は、上記リン酸化キチン、ポリオール類およびポリイソシアネート類を含有する混合液を調製する工程と、この混合液に発泡剤を混和して撹拌および混合する工程とを含む。上記撹拌および混合する工程において、上記原料がウレタン化反応および架橋反応などによって反応してウレタン化し、かつ、泡化反応によって発泡する。このとき、たとえば、上記混合液を調製する工程において、予めポリオール類に前記リン酸化キチンを添加し、撹拌して、リン酸化キチンが分散したポリオール類を調製し、このリン酸化キチンが分散したポリオール類とポリイソシアネート類とを混和すればよい。

プレポリマー法は、ポリオール類とポリイソシアネート類とを反応させて末端にイソシアネート基を有するプレポリマーを製造する工程と、上記リン酸化キチン、前記プレポリマー、過剰の水およびポリオール類を含有する混合液を調製する工程と、この混合液に発泡剤を混和して撹拌および混合する工程とを含む。上記撹拌および混合する工程において、上記プレポリマーとポリオール類とがウレタン化反応および架橋反応などによって反応してウレタン化し、かつ、泡化反応によって発泡する。このとき、たとえば、上記混合液を調製する工程において、上記過剰の水および上記ポリオール類に前記リン酸化キチンを添加し、撹拌して、リン酸化キチンが分散したポリオール類を調製し、このリン酸化キチンが分散したポリオール類と上記プレポリマーとを混和すればよい。

上記ポリオールの例には、ポリオキシエチレンジオール、ポリオキシエチレントリオール、ポリオキシエチレンテトロール、ポリオキシエチレンヘキソールおよびポリオキシエチレンオクトールなどのポリエーテル系ポリオール、ポリ（ブチレンアジペート）ジオールなどのアジペート系ポリオールおよびポリ−ε−カプロラクトンジオールなどのカプロラクトン系ポリオールを含むポリエステル系ポリオール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびグリセリンのプロピレンオキシド付加物などのポリオキシアルキレンポリオール、ならびにポリ（ヘキサメチレンカーボネート）ジオールなどのポリカーボネート系ポリオール等が含まれる。これらのポリオールは、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

上記ポリイソシアネートの例には、トルエンジイソシアネート（ＴＤＩ）、トリフェニル−メタン−４，４’，４”−トリイソシアネート、ベンゼン−１，３，５−トリイソシアネート、トルエン−２，４，６−トリイソシアネート、ジフェニル−２，４，４’−トリイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ）、キシレンジイソシアネート、クロロフェニレンジイソシアネート、ジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネート、ナフタレン−１，５−ジイソシアネート、キシレン−α，α’ジイソシアネート、３，３’−ジメチル−４，４’−ビフェニレン−ジイソシアネート、３，３’−ジメトキシ−４，４’−スルホニルビス（フェニルイソシアネート）、４，４’−メチレンジオール−トリイソシアネート、エチレンジイソシアネート、エチレンジイソチオシアネート、トリメチレンジイソシアネート、ジシクロヘキシルメタン−４，４’−ジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート、および２，２，４−トリメチル−１，６−ヘキサンジイソシアネートが含まれる。これらのポリイソシアネートは、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

上記発泡剤の例には、水のほかジクロロメタン（塩化メチレン）、ペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサンおよび炭酸ガスが含まれる。これらの発泡剤は、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

本工程は、触媒の存在下で行ってもよい。上記触媒の例には、トリエチレンジアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエタノール、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエチルピペラジンなどの第３級アミン（アミン触媒）、オクチル酸スズ（スズオクトエート）およびラウリン酸ジブチルスズ（ジブチルスズジラウレート）などの有機金属化合物（金属触媒）、酢酸塩、ならびにアルカリ金属アルコラート等が挙げられる。これらの触媒は、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。触媒の効果を高める観点からは、触媒は、アミン触媒と金属触媒との組み合わせであることが好ましい。

本工程は、整泡剤とともに行ってもよい。上記整泡剤の例には、シリコーン化合物、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムおよびラウリル硫酸ナトリウムなどのアニオン系界面活性剤、ポリエーテルシロキサン、ならびにフェノール系化合物等が含まれる。これらの整泡剤は、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

（ポリウレタン発泡体を石灰化溶液に浸漬する工程）
石灰化溶液は、前記第４の実施形態と同様のものを用いることができる。浸漬も、前記第４の実施形態と同様に行い得る。

（効果）
このようにして製造したポリウレタン発泡体は、従来のポリウレタン発泡体よりもヒドロキシアパタイトの付着率が高い。そのため、ヒドロキシアパタイトがポリウレタン発泡体と骨との間で骨形成をさらに促進して、ポリウレタン発泡体を従来よりも短期間で、かつ強固に、骨に結合させることができる。また、このようにして製造したポリウレタン発泡体は、従来のポリウレタン発泡体よりもより多くのヒドロキシアパタイトを析出させることができる。また、ポリウレタン発泡体にキチン由来の官能基を付与することにより、環境汚染物質の吸着材としても、従来の吸着材よりも高い吸着能を有することが期待される。

以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

［実施例１］可溶性のリン酸化キチンの製造
乾燥粉末状のキチン１０ｇを、１００ｍＬのヘキサンとジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）の比が体積比で５０／５０である混合液の中に分散させた。分散による分散媒の濁りが目視で認められた後、分散液を２５℃にて撹拌しつつ、１ｇのメタンスルフォン酸を触媒として加え、１０分間隔で、エタノールに溶解させた５ｇの５酸化リンを３回にわたり加えて、２時間、反応させた。その後、反応液に蒸留水を加えて、１Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨを中性にしてから蒸留水に対する透析を繰り返した。透析後の外液の電気伝導度に変化がなくなるまで透析を行った後、内液を凍結乾燥した。

図１は、上記方法を行った後の内液から得た、リン酸化を行って可溶化したキチン試料について測定した赤外吸収スペクトルである。９００〜１１５０ｃｍ^−１付近の、有機リン酸基に特徴的なピーク（図中、矢印部分）が観察された。

図２は、上記方法を行った後の内液から得た、リン酸化を行って可溶化した２種類のキチン試料と、上記方法を行わず、リン酸化していないキチン試料について測定した赤外吸収スペクトルである。非プロトン性溶媒を利用してリン酸化を行った試料は、いずれも図２に示すように、９００〜１１５０ｃｍ^−１付近の、有機リン酸基に特徴的なピークが明瞭に見られたが、リン酸化していないキチンには、上記特徴的なピークは明瞭には見られなかった。

リン酸化前後キチン１０ｍｇをケルダール・フラスコにとり、濃硫酸１．５ｍｌと過塩素酸０．５ｍｌを加えて透明化するまで加熱した。試料を定量的に蒸留水の希釈したのち、遊離したリン酸をモリブデン青比色法によって測定した。この結果、リン酸化前のキチン試料にはリンは含まれていないこと、並びに、リン酸化時に、均一のリン酸化が進行したと仮定すれば、キチンのＮアセチル・グルコサミン単位の約０．５％程度がリン酸化されていることがわかった。

この結果から、本発明に係る方法によって、キチンがリン酸化し、水またはＤＭＦに可溶化することがわかった。

［実施例２］可溶性のリン酸化コラーゲンの製造
ウシ皮膚由来のコラーゲン１ｇを３００ｍＬの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ３）に溶解し、昇温を避けるため氷冷または循環冷却装置を利用し（２５℃以下）撹拌しつつ、１ｇのメタンスルフォン酸を触媒として加えた後、１０分間隔で、１ｇの５酸化リンを３回にわたり加えて３時間、反応させた。その後も、反応物を冷却しつつ、ｐＨが７になるまで１Ｍ ＮａＯＨを添加した。その後、反応液に蒸留水を加えて、蒸留水に対する透析を行って反応試薬を除去したのち凍結乾燥した。

[実施例３]不溶性コラーゲンとゼラチンのリン酸化と可溶化法
不溶性コラーゲンが大部分を成すコラーゲン、たとえば、ウシ骨コラーゲン、成牛の皮膚コラーゲンのリン酸化は、キチンのリン酸化法を大部分そのまま用いる必要がある。すなわち、１〜５ｇの不溶性コラーゲンを、３００ｍＬのヘキサンとジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）の比が、体積比で５０／５０である混合液の中に分散させた。分散液を２５℃以下にて撹拌しつつ、１ｇのメタンスルフォン酸を触媒として加えた後、１０分間隔で、エタノールに溶解させた５ｇの５酸化リンを３回にわたり加えて、２時間、反応させた。溶解した成分を不溶性成分と遠心分離し、上清には、反応液に蒸留水を加えて、１Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨを中性にしてから蒸留水に対する透析を行った。透析後の外液の電気伝導度に変化がなくなるまで透析を行った後、内液を凍結乾燥した。

不溶性の成分は、再び上記の溶媒とリン酸化試試薬、触媒を用いて、ただし温度を６０℃にして、可溶化・リン酸化を行った。この操作によって、不溶性コラーゲンの大部分が可溶化され、リン酸化ゼラチンとして回収することができた。リン酸化ゼラチンも蒸留水に対して透析後、凍結乾燥した。

図３は、本実施例において得られた２種類のリン酸化コラーゲン試料、およびリン酸化を行わなかったウシ皮膚由来のコラーゲン試料、の赤外吸収スペクトルである。図３に示すように、本発明の方法でリン酸化したウシ由来コラーゲンに、有機リン酸基に特徴的な、９００〜１１５０ｃｍ^−１付近のピーク（図中、矢印部分）が、リン酸化を行わなかったウシ由来コラーゲンよりも顕著に見られた。本発明の方法によってリン酸化を行わなかったウシ由来コラーゲンでは、上記ピークは顕著には見られなかった。

この結果から、本発明に係る方法によって、コラーゲンがリン酸化し、水に可溶化することがわかった。

［実施例４］チタンに結合するリン酸化キチンの分離
実施例１で製造したリン酸化キチンを水に溶解した水溶液を用意した。直径４５μｍのチタン粒子（株式会社大阪チタニウムテクノロジーズ）を詰めたカラム（内径１６ｍｍ×高さ５ｃｍ）を準備した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７.４）で平衡化したカラムに５０ｍＬの上記水溶液を添加した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７.４）を添加して非吸着成分を溶出させた。次いで、２５ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を添加して、吸着成分（リン酸化キチン）を溶出させた。図４は、本実施例における溶出パターンを示すクロマトグラムである。図４中の矢印は、左からそれぞれ、上記水溶液、ＰＢＳ、水酸化ナトリウム水溶液および洗浄用のＰＢＳを添加したタイミングを示す。上記クロマトグラムの面積比から測定した、チタンへの非吸着成分（水溶液の添加後、水酸化ナトリウム水溶液の添加の直前まで）と吸着成分（水酸化ナトリウム水溶液の添加後、２回目のＰＢＳの添加の直前まで）との量比は、５０：５０だった。

この結果から、実施例１で製造したリン酸化キチンのうち、５０％がチタンに結合する性質を有することがわかった。

［実施例５］チタンに結合するリン酸化コラーゲンの分離
実施例２および実施例３で製造したリン酸化コラーゲンを水に溶解した水溶液を用意した。直径４５μｍのチタン粒子（株式会社大阪チタニウムテクノロジーズ）を詰めたカラム（内径１６ｍｍ×高さ５ｃｍ）を準備した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７.４）で平衡化したカラムに４ｍｇの上記水溶液を添加した後、塩酸（ｐＨ４.０）を添加して非吸着成分を溶出させた。次いで、２５ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を添加して、吸着成分（リン酸化キチン）を溶出させた。同様に、本発明の方法でリン酸化しなかったコラーゲンについて、同様の操作を行った。図５は、リン酸化を行ったコラーゲンにおける溶出パターンを示すクロマトグラムである。図６は、リン酸化を行わなかったコラーゲンにおける溶出パターンを示すクロマトグラムである。図５および図６中の矢印は、それぞれ、上記水溶液および水酸化ナトリウム水溶液を添加したタイミングを示す。上記クロマトグラムの面積比から測定した、チタンへの非吸着成分（水溶液の添加後、水酸化ナトリウム水溶液の添加の直前まで）と吸着成分（水酸化ナトリウム水溶液の添加後）との量比は、図５で６０：４０であり、図６で８５：１５だった。

この結果から、実施例２および実施例３で製造したリン酸化コラーゲンは、リン酸化処理を行わなかったコラーゲンよりもチタンへの親和性が強いことがわかった。

［実施例６］リン酸化キチンとチタンとの複合体の製造および生体内への埋植
直径５０μｍのチタン細繊維からなるチタン製不織布を、直径２ｍｍ、高さ３ｍｍの円盤状に切り出した。また、リン酸化キチン（実施例４のクロマトグラフィーにおける吸着成分）をＰＢＳに溶解させて、０.１％リン酸化キチン溶液を調製した。チタン製不織布の成形体をリン酸化キチン溶液に一定時間浸漬した後、乾燥させて、各チタン細繊維の表面をリン酸化キチンでコーティングして、実施例の生体インプラントである、リン酸化キチンとチタンとの複合体を製造した。一方、比較例の生体インプラントとして、リン酸化キチンでコーティングしていないチタン製不織布の成形体も準備した。

生後８週齢のウイスター系ラットに８％抱水クロラールを腹腔内投与して麻酔した。歯科用ドリルを用いて脛骨に直径２.８ｍｍの穴をあけ、実施例および比較例のインプラントを埋植した。埋植２週間後および６週間後に、インプラントおよびその周辺部を摘出した。得られたサンプルの切片を作製し、Villanueva Osteochrome染色法で骨組織を染色し、インプラント周囲の骨の形成量を比較した。

図７Ａおよび図７Ｂは、実施例のインプラントを埋植したラットからの組織標本である。図７Ｂは図７Ａを部分的に拡大している。図７Ｃおよび図７Ｄは、比較例のインプラントを埋植したラットからの組織標本である。図７Ｄは図７Ｃを部分的に拡大している。図７Ａおよび図７Ｂでは、染色された骨組織の基質と骨細胞の旺盛な増殖（濃い色の部分）が観察された。図７Ｃおよび図７Ｄでは、一部に細胞の集合はあるものの、全体として図７Ａおよび図７Ｂのような旺盛な骨形成は見られなかった。チタン不織布内の新生骨の面積を比較すると、実施例と比較例とでは４．４倍の差があった。

この結果から、本発明の方法で製造したリン酸化キチンとチタンとの複合体は、体内に埋植したときに骨形成を促進することがわかった。そのため、この複合体は、チタン基材と骨との間で骨形成をさらに促進して、チタン基材をさらに短期間で、かつ強固に、骨に結合させることができると考えられる。

［実施例７］リン酸化キチンとチタンとの複合体の表面へのヒドロキシアパタイトの析出
１５ｍＭ／Ｌの塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、９ｍＭ／Ｌのリン酸二カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ４）、０．７Ｍ／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および０．０２Ｍ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）を含有する石灰化溶液を用意した。二酸化炭素ガスのバブリングによりｐＨを６．０１に調整した上記石灰化溶液に、前記実施例６で得られたリン酸化キチンとチタンとの複合体を浸漬し、３７℃で４８時間インキュベートした。その後、チタン基材を取り出して脱塩水で洗浄し、凍結乾燥させた。凍結乾燥したチタン基材を、新しい上記石灰化溶液に再び浸漬し、１日おきに石灰化溶液を交換しつつ、２週間インキュベートした。その後、チタン基材を取り出して脱塩水で洗浄し、凍結乾燥させた。このようにして得られたヒドロキシアパタイトが析出したチタン基材を、無菌容器内において、乾燥状態かつ１０℃以下で保存した。

図８Ａおよび図８Ｂは、上記処理を行う前の複合体の表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による写真である。図８Ｂは図８Ａを部分的に拡大している。図８Ｃおよび図８Ｄは、上記処理によりヒドロキシアパタイトが析出したチタン基材の表面のＳＥＭによる写真である。図８Ｄは図８Ｃを部分的に拡大している。

この結果から、本発明の方法で製造したリン酸化キチンとチタンとの複合体は、表面にヒドロキシアパタイトが均一に析出することがわかった。そのため、この複合体は、ヒドロキシアパタイトがチタン基材と骨との間で骨形成をさらに促進して、チタン基材をさらに短期間で、かつ強固に、骨に結合させることができると考えられる。

［実施例８−１］ポリウレタン発泡体の製造（ワンショット法）
以下の成分を用いて、ポリウレタン発泡体を製造した。

（ポリオール類）
ポリエーテルポリオール、Ｍｗ３０００、水酸基価５６ｍｇＫＯＨ／ｇ、官能基数３、品番：サンニックス ＧＰ−３０５０ＮＳ、三洋化成工業株式会社（「サンニックス」は同社の登録商標）
（イソシアネート類）
トルエンジイソシアネート（ＴＤＩ）、２−４ＴＤＩ／２−６ＴＤＩの混合物。比率は２−４ＴＤＩ／２−６ＴＤＩ＝８０／２０、品番：コスモネート Ｔ−８０、三井化学株式会社（「コスモネート」は同社の登録商標）
（リン酸化キチン）
実施例１で製造されたものを使用。
（触媒）
アミン触媒、品番：ＤＡＢＣＯ ３３−ＬＶ、エアープロダクツジャパン株式会社（「ＤＡＢＣＯ」は同社の登録商標）
金属（スズ）触媒、品番：ＭＲＨ−１１０、城北化学株式会社
（整泡剤）
シリコーン整泡剤、軟質用シリコーン整泡剤、品番：ＳＺ−１１３６、東レ・ダウコーニング株式会社

（混合液の調製）
１００質量部の上記ポリオール類に対し、１質量部の上記リン酸化キチンを添加および撹拌して、ポリオール類にリン酸化キチンが分散した混合液１を調製した。上記リン酸化キチンの量を３質量部、５質量部に変更した以外は同様にして、それぞれ、混合液２および混合液３を調製した。

（ポリウレタン発泡体の製造）
１０１質量部の上記混合液１に、４．４質量部の水（発泡剤）、１．０質量部のアミン触媒、１．５質量部の整泡剤および０．３質量部の金属（スズ）触媒を添加して、撹拌し、さらにイソシアネート５２．８質量部を加えて、混合撹拌し、ポリウレタン発泡体１を製造した。混合液１を、１０３質量部の上記混合液２、１０５質量部の上記混合液３に変更した以外は同様にして、それぞれ、ポリウレタン発泡体２およびポリウレタン発泡体３を製造した。混合液１を、リン酸化キチンを添加しない上記ポリオール類に変更した以外は同様にして、ポリウレタン発泡体４を製造した。

ポリウレタン発泡体１〜４の製造に用いた材料およびその質量部、ならびにポリウレタン発泡体１〜４中のリン酸化キチンの含有率を、表１に示す。なお、上記リン酸化キチンの含有率は、材料として用いたリン酸化キチンの質量を、すべての材料の質量で除算して求めた値である。

［実施例８−２］ポリウレタン発泡体の製造（プレポリマー法）
以下の成分を用いて、ポリウレタン発泡体を製造した。

（ポリオール類）
ポリエチレングリコール、品番：ＰＥＧ＃１０００、ライオン・スペシャリティ・ケミカルズ株式会社
（イソシアネート類）
トルエンジイソシアネート（ＴＤＩ）、２−４ＴＤＩ／２−６ＴＤＩの混合物。比率は２−４ＴＤＩ／２−６ＴＤＩ＝８０／２０、品番：コスモネート Ｔ−８０、三井化学株式会社
（発泡剤）
精製水
（整泡剤）
アデカプルロニックＬ６１、株式会社ＡＤＥＫＡ製
（その他）
精製グリセリン、花王株式会社製

（プレポリマーの製造）
開始剤をエチレングリコールとし、上記ポリオール類を６１．６９質量部とグリセリンを３．３２質量部配合し、上記イソシアネート類の３５質量部とを反応容器に入れ、１００℃で４時間混合反応させて、反応性イソシアネート基含有量８．５８質量％のウレタンプレポリマーを得た。

（混合液の調製）
１００質量部の発泡剤に対し、５質量部の上記リン酸化キチンおよび１質量部の上記整泡剤を添加および撹拌して、水にリン酸化キチンが分散した混合液４を調製した。上記リン酸化キチンの量を１０質量部に変更した以外は同様にして、混合液５を調製した。

（ポリウレタン発泡体の製造）
１００質量部の上記ウレタンプレポリマーに対して、１０６質量部の上記混合液４を、液温２５℃で混合および撹拌し、その後、発泡容器へ注ぎ込んで、発泡体を得た。得られた発泡体をマイクロ波により１．５ｋＷで１０分間乾燥させて、ポリウレタン発泡体５を製造した。混合液４を、１１１質量部の上記混合液５に変更した以外は同様にして、ポリウレタン発泡体６を製造した。混合液４を、リン酸化キチンを添加しない発泡剤および上記界面活性剤の混合液に変更した以外は同様にして、ポリウレタン発泡体７を製造した。

ポリウレタン発泡体５〜７の製造に用いた材料およびその質量部、ならびにポリウレタン発泡体５〜７中のリン酸化キチンの含有率を、表２に示す。なお、上記発泡剤としての精製水は、乾燥により除去されるため、上記リン酸化キチンの含有率は、材料として用いたリン酸化キチンの質量を、精製水を除いたすべての材料（表中、「固形分」と表す。）の質量で除算して求めた値である。

［実施例９］ポリウレタン発泡体の石灰化
実施例８−１におけるリン酸化キチンを含有しないポリウレタン発泡体４を試験片１、ポリウレタン発泡体４に実施例６方法の方法に準じてリン酸化キチンをコーティングしたポリウレタン発泡体４’を試験片２、実施例８−１における１．８４％のリン酸化キチンを含有するポリウレタン発泡体２を試験片３とした。それぞれの試験片に対して、実施例７と同じ方法で、ヒドロキシアパタイトを析出させた。

図９は、ヒドロキシアパタイトを析出させる前のそれぞれのポリウレタン発泡体の平均質量（図中、「元試料」と示す。）、ならびに、それぞれヒドロキシアパタイトを析出させた後の、試験片１、試験片２および試験片３の質量を示すグラフである。上記平均質量（７．６ｍｇ）に対して、試験片１の質量は１．５倍、試験片２の質量は１．７倍、試験片３の質量は２．３倍、それぞれ増加していた。

この結果から、リン酸化キチンをコーティングしたポリウレタン発泡体は、リン酸化キチンをコーティングしないポリウレタン発泡体よりも、より多くのヒドロキシアパタイトを析出させ、リン酸化キチンを混合して製造したポリウレタン発泡体は、さらに多くのヒドロキシアパタイトを析出させることがわかった。

キチンおよびコラーゲンは、自然界に大量に存在する生体高分子である。これらの生体高分子をリン酸化することで可溶化すれば、生物学的機能性材料を創るための基本材料を新たに提供することができる。また、リン酸化したキチンおよびコラーゲンは、チタンとの複合体の形成や機能性ポリウレタンの調製を通しての医学的応用、再生医療の大量３次元細胞培養基盤の製造、環境浄化用の吸着剤、免疫療法のための大量細胞培養基盤の製造、ナノセルローズ・ファイバーとのハイブリッドによる新規機能性ナノファイバーの調製などの広範な分野において、その利用可能性を秘めている。

Claims (18)

1. 非プロトン性溶媒の中にキチンまたは不溶性のコラーゲンを分散させる工程と、
   触媒の存在下で、分散した前記キチンまたは分散した前記不溶性のコラーゲンをリン酸化する工程と、
   リン酸化した前記キチンまたはリン酸化した前記不溶性のコラーゲンを分離する工程とを含む、
   可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
2. 前記非プロトン性溶媒はヘキサンの単一溶媒である、請求項１に記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
3. 前記非プロトン性溶媒はヘキサンとジメチルホルムアミドとの混合溶媒であり、
   前記混合溶媒におけるヘキサンとジメチルホルムアミドとの体積比（ヘキサン：ジメチルホルムアミド）は、２５：７５〜１００：０の範囲内（ただし、１００：０を含まない）である、
   請求項１に記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
4. 前記分離する工程は、水に対する透析および遠心分離をこの順に行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
5. 前記分離する工程において、前記透析の後に、透析内液に残った水に不溶性の成分を有機溶媒に溶解させ、さらに、アルコールを加えて水に対する透析を行う、請求項４に記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
6. 上記リン酸化する工程を、不溶性のコラーゲンが分散した分散液の液温を４０℃以上５０℃以下にして行い、
   さらに、前記分離する工程の後に、
   残存した不溶性のコラーゲンを再分散させる工程と、
   触媒の存在下で、再分散した前記不溶性のコラーゲンを含む分散液の液温を６０℃以上９０℃以下にして、前記再分散した不溶性のコラーゲンをリン酸化させ、リン酸化ゼラチンとする工程と、
   前記リン酸化ゼラチンを分離する工程を行う、
   請求項１〜５のいずれか１項に記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
7. さらに、前記分離する工程の後に、前記リン酸化したキチンまたは前記リン酸化した不溶性のコラーゲンをその性質ごとに分離する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
8. 前記リン酸化したキチンまたは前記リン酸化した不溶性のコラーゲンをその性質ごとに分離する工程は、チタンビーズを固定相とするアフィニティクロマトグラフィーを行う工程である、請求項７に記載の可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法で製造した可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを含む溶液と、チタン基材と、を接触させる工程を含む、リン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法。
10. さらに、前記可溶性のリン酸化キチンまたは可溶性のリン酸化コラーゲンを含む溶液に接触させたチタン基材を、石灰化溶液に浸漬する工程を含む、請求項９に記載のリン酸化キチンまたはリン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法。
11. チタンまたはチタン合金からなる基材と、前記基材の表面の少なくとも一部を被覆するリン酸化キチン含有層またはリン酸化コラーゲン含有層とを有する、複合体。
12. 前記リン酸化キチン含有層またはリン酸化コラーゲン含有層はヒドロキシアパタイトを含む、請求項１１に記載の複合体。
13. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法で製造した可溶性のリン酸化キチン、ポリオール類およびポリイソシアネート類を含有する混合液を調製する工程と、
    前記混合液に発泡剤を混和して撹拌および混合する工程とを含む、
    ポリウレタン発泡体を製造する方法。
14. ポリオール類とポリイソシアネート類とを反応させて末端にイソシアネート基を有するプレポリマーを製造する工程と、
    請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法で製造した可溶性のリン酸化キチン、前記プレポリマー、過剰の水およびポリオール類を含有する混合液を調製する工程と、
    前記混合液に発泡剤を混和して撹拌および混合する工程とを含む、
    ポリウレタン発泡体を製造する方法。
15. 濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下であるリン酸緩衝液の中に可溶性のコラーゲンを分散させる工程と、
    触媒の存在下で、分散した前記可溶性のコラーゲンをリン酸化する工程と、
    リン酸化した前記可溶性のコラーゲンを分離する工程とを含む、
    リン酸化コラーゲンを製造する方法。
16. さらに、前記分離する工程の後に、前記リン酸化した可溶性のコラーゲンをその性質ごとに分離する工程を含む、請求項１５に記載のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
17. 前記リン酸化した可溶性のコラーゲンをその性質ごとに分離する工程は、チタンビーズを固定相とするアフィニティクロマトグラフィーを行う工程である、請求項１６に記載のリン酸化コラーゲンを製造する方法。
18. 請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法で製造した可溶性のリン酸化コラーゲンを含む溶液と、チタン基材と、を接触させる工程を含む、リン酸化コラーゲンとチタンとの複合体を製造する方法。