JP2016540519A

JP2016540519A - アッセイ認識のための多重ｐｃｒ反応のコード化法

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Publication number: JP2016540519A
Application number: JP2016541017A
Authority: JP
Inventors: グプタアマル; ジャンセンケビン; ニュートンニコラス; シェーンブルナーナンシー
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2016-12-28
Anticipated expiration: 2034-12-18
Also published as: JP6673832B2; EP3083992A1; WO2015091756A1; CA2932352A1; US20150176060A1; CN105793440A; EP3083992B1; CN105793440B; CA2932352C

Abstract

本発明は、ＰＣＲアッセイを行うために使用される試薬と溶液の同定のために蛍光色素を使用する、方法と組成物とを提供する。

Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイによる核酸増幅の分野に関する。特に、本発明は、ＰＣＲアッセイを行うために使用される試薬の同定のための蛍光色素の使用に関する。

ＰＣＲは、広範な種々の目的に使用できるＤＮＡ又はＲＮＡを増幅するための強力な技術である。ＰＣＲの無数の応用には、ウイルス又は細菌遺伝子の診断のための使用、及び遺伝子変異の同定のための使用がある。現在ＰＣＲアッセイは、リアルタイムの均一フォーマット（例えば、TaqMan（登録商標）アッセイ）で、最大４個の核酸配列を同時に検査することができる装置を使用して、行うことができる。典型的なTaqMan（登録商標）アッセイでは、標的核酸は、ＰＣＲ増幅中に切断され、その結果として蛍光シグナルの増加を引き起こす、クエンチされた蛍光プローブの使用により検出される。しかし、ＰＣＲ中に起こり得る変動を制御するために、及び特定のＰＣＲアッセイの感度の最適化のために、しばしば、種々の酵素、種々の金属補助因子、及びＰＣＲを行うために必要な成分の種々の濃度が使用される。実際、これらの成分の多くは、アッセイ毎に、マスターミックスと呼ばれる単一の溶液中にあらかじめ混合される。このために、同じ蛍光物質を用いるが異なる成分を用いるアッセイが平行して（例えば、マルチウェルプレート上の隣接ウェル中で）、かつあらかじめ同定することなく行なわれ、これらの反応は区別することができず、これは、陽性の蛍光シグナルが、間違った標的核酸の陽性結果として間違って解釈される可能性があることを意味する。

現在、ある標的核酸についてのＰＣＲアッセイで、正しいマスターミックスが使用されることを保証することの困難さに対処できる方法は存在しない。この問題は、ユーザーによるエラーが起きていないことを保証すべき臨床検査室では、特に重要である。これらのエラーの発生率は低いはずであるが、その発生は、偽陽性又は偽陰性結果の生成を引き起こし得るため、これを少なくすることは極めて重要である。

本発明は、ＰＣＲアッセイで使用され、このようなＰＣＲアッセイから生成されるデータのより高い信頼性につながる、試薬及びマスターミックス溶液の正しい調製の確実性を生み出すニーズに取り組む。ある態様において本発明は、複数の標的核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うための複数の反応混合物を調製する方法であって、第１の標的核酸のＰＣＲ増幅を行うために必要な少なくとも１つの物質を含み、第１のマスターミックス溶液について特有である所定の濃度比で存在する第１の蛍光色素と第２の蛍光色素とをさらに含む、前記第１のマスターミックス溶液を提供する工程と；第２の標的核酸のＰＣＲ増幅を行うために必要な少なくとも１つの物質を含み、前記第１のマスターミックス溶液中の比率とは異なり、第２のマスターミックス溶液について特有である所定の濃度比で存在する、前記第１の蛍光色素と前記第２の蛍光色素とをさらに含む、前記第２のマスターミックス溶液を提供する工程と、前記第１のマスターミックス溶液を第１の反応混合物に加えて、前記第１の標的核酸のＰＣＲ増幅を行う工程と、前記第２のマスターミックス溶液を第２の反応混合物に加えて、前記第２の標的核酸のＰＣＲ増幅を行う工程とを含む、前記方法を提供する。

別の態様において本発明は、標的核酸のＰＣＲ増幅のために使用されるマスターミックス溶液の同一性をコード化する方法 (method for encoding the identity of a mastermix solution used for PCR amplification of a target nucleic acid)であって、所定の濃度比で存在する第１の蛍光色素と前記第２の蛍光色素とを、前記マスターミックス溶液中で一緒に混合する工程であって、前記所定の濃度比は、前記第２の蛍光色素を超える前記第１の蛍光色素の蛍光比を生成し、前記蛍光比は他のマスターミックス溶液から生成される蛍光比と区別できる、前記工程と、前記第１の蛍光色素からの蛍光及び前記第２の蛍光色素からの蛍光を検出する工程と、前記蛍光比を決定し、それにより前記マスターミックス溶液を同定する工程とを含む、前記方法を提供する。

さらに別の態様において本発明は、複数のマスターミックス溶液を含む、複数の標的核酸のＰＣＲ増幅を行うためのキットであって、複数のマスターミックス溶液からの各１つのマスターミックス溶液は、特異的標的核酸のＰＣＲ増幅を行うために必要な少なくとも１つの物質を含み、第１の蛍光色素と第２の蛍光色素とをさらに含み、各１つのマスターミックス溶液について、前記第１の蛍光色素と前記第２の蛍光色素は、前記複数のマスターミックス溶液からの他のすべてのマスターミックス溶液とは異なる濃度比で存在し、かつ区別できる蛍光比を生成する、前記キットを提供する。

図１は、実施例１で行われた実験のグラフであり、ＪＡ２７０／Ｃｙ５．５についての濃度比と蛍光比との相関を示す。左のグラフは、濃度比０〜１．６６における右のグラフのクローズアップ図である。

定義
本明細書において用語「試料」は、核酸を含む検体又は培養物（例えば、微生物培養物）を含む。用語「試料」はまた、生物学的試料と環境試料の両方を含むことを意味する。試料は、合成起源の検体を含むことができる。生物学的試料は、全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、髄液、洗浄液（例えば、気管支洗浄液、胃洗浄液、腹膜洗浄液、管洗浄液、耳洗浄液、関節鏡洗浄液）、生検試料、尿、便、痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳房流体、胚細胞、及び胎児細胞を含む。好適な実施態様において、生物学的試料は、血液、より好ましくは血漿である。本明細書において用語「血液」は、通常定義されるように、全血又は血液の任意の画分、例えば血清及び血漿などを包含する。血漿は、抗凝固剤で処理された血液の遠心分離に由来する全血の画分を指す。血清は、血液試料が凝固した後に残っている液体の水部分を指す。環境試料は、例えば表面物質、土壌、水及び産業試料、ならびに食品及び乳製品加工機器、装置、設備、器具、使い捨て及び非使い捨ての物品から得られる試料などの環境材料を含む。

本明細書において用語「標的」又は「標的核酸」は、その存在を検出又は測定すべき任意の分子、又は、その機能、相互作用、若しくは特性を検討すべきである任意の分子を意味することを意図する。従って標的は、検出可能なプローブ（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）又はアッセイが存在するか、又はこれを当業者が製造することができる、基本的に任意の分子を含む。例えば標的は、検出可能なプローブ（例えば、抗体）と結合又は他の方法で接触することが可能な、生体分子、例えば核酸分子、ポリペプチド、脂質、又は炭水化物であってよく、ここで、検出可能なプローブはまた、本発明の方法によって検出することができる核酸を含む。本明細書において「検出プローブ」は、目的の標的生体分子にハイブリダイズ又はアニーリングすることができ、本明細書に記載の標的生体分子の特異的検出を可能にする、任意の分子又は薬剤を意味する。本発明のある態様において、標的は核酸であり、検出可能なプローブはオリゴヌクレオチドである。用語「核酸」及び「核酸分子」は、本開示全体にわたって交換可能に使用される。この用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴ、ポリヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、細菌ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ＲＮＡ、メッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、触媒性ＲＮＡ、クローン、プラスミド、Ｍ１３、Ｐ１、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、増幅された核酸、アンプリコン、ＰＣＲ産物、及び他の種類の増幅された核酸、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、及びポリアミド核酸（ＰＮＡ）を指し、これらのすべては、１本鎖又は２本鎖形態であることができ、そして特に別の指定がなければ、天然に存在するヌクレオチド、及びこれらの組み合わせ及び／又は混合物と同様の様式で機能することができる、天然のヌクレオチドの既知の類似体を包含するであろう。従って用語「ヌクレオチド」は、天然の及び修飾された／非天然のヌクレオチドの両方を指し、ポリ核酸又はオリゴヌクレオチド内に存在するトリ、ジ、及びモノリン酸塩、ならびにモノリン酸塩モノマーを含む。ヌクレオチドはまた、リボ、２’−デオキシ、２’，３’−デオキシ、ならびに当技術分野でよく知られている広範囲の他のヌクレオチド模倣物でもよい。模倣物は、鎖終結ヌクレオチド、例えば３’−Ｏ−メチル、ハロゲン化塩基、又は糖置換物；非糖、アルキル環構造を含む代替的糖構造物；イノシンを含む代替的塩基；デアザ修飾；カイ、及びプサイ、リンカー修飾；質量標識修飾；例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボラノホスフェート、アミド、エステル、エーテルを含むホスホジエステル修飾又は代替物；及び、例えば光開裂性ニトロフェニル成分などの切断結合を含む基本的又は完全なヌクレオチド間代替物、を含んでよい。

標的の有無は、定量的又は定性的に測定することができる。標的は種々の異なる形態、例えば単純な又は複雑な混合物、又は実質的に精製された形態、で存在することができる。例えば、標的は、他の成分を含有する試料の一部、又は試料の唯一の若しくは主要な成分でもよい。従って標的は、全細胞又は組織の成分、細胞抽出物又は組織抽出物、その分画溶解物、又は実質的に精製された分子でもよい。また標的は、既知の又は未知の配列又は構造を有してもよい。

用語「増幅反応」は、核酸の標的配列のコピーを増やすための任意のインビトロの手段を指す。

「増幅する」ことは、増幅を可能にするのに充分な条件に溶液を供する工程を指す。増幅反応の成分は、特に限定されないが、プライマー、ポリヌクレオチド鋳型、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド、ｄＮＴＰなどを含む。用語「増幅する」は典型的には、標的核酸の「指数的」増加を指す。しかし本明細書において「増幅する」はまた、選択された核酸の標的配列の数の直線的増加であるが、一回の単一プライマー伸長工程とは異なる増加を指すこともある。

「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、標的の２本鎖ＤＮＡの特異的セグメント又はサブ配列が等比級数的に増幅される方法を指す。ＰＣＲは当業者に公知である；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号、及び PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. 編, 1990 を参照されたい。

本明細書において「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合又はその類似体により連結された、天然の又は修飾されたヌクレオシドモノマーの線状オリゴマーを指す。オリゴヌクレオチドは、標的核酸に特異的に結合することができるデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、これらのアノマー型、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。モノマーは通常、ホスホジエステル結合又はその類似体により連結されて、数個のモノマー単位、例えば３〜４個から数十個のモノマー単位、例えば４０〜６０個のサイズの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列によって表される時はいつでも、ヌクレオチドは５’−３’の順序で左から右へと理解され、特に別の指定がなければ、「Ａ」はデオキシアデノシン、、「Ｃ」はデオキシシチジン、「Ｇ」はデオキシグアノシン、「Ｔ」はデオキシチミジン、「Ｕ」はリボヌクレオシドであるウリジンを表すと理解される。オリゴヌクレオチドは通常、４つの天然のデオキシヌクレオチドを含むが、これらはまた、リボヌクレオシド又は非天然のヌクレオチド類似体を含むことができる。酵素が、活性のために特異的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質の要件、例えば１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ２本鎖などを有する場合、そのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質のための適切な組成物の選択は十分に当業者の知識の範囲内である。

本明細書において「オリゴヌクレオチドプライマー」又は単に「プライマー」は、標的核酸鋳型上の配列にハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドプローブの検出を促進するポリヌクレオチド配列を指す。本発明の増幅実施態様においてオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸合成の開始点として機能する。非増幅実施態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、切断物質により切断され得る構造を作成するために使用することができる。プライマーは種々の長さがあり、しばしば５０ヌクレオチド未満、例えば１２〜２５ヌクレオチドの長さである。ＰＣＲで使用されるプライマーの長さと配列は、当業者に公知の原理に基づいて設計することができる。

本明細書において用語「オリゴヌクレオチドプローブ」は、目的の標的核酸にハイブリダイズ又はアニーリングすることができ、標的核酸の特異的検出を可能にするポリヌクレオチド配列を指す。

用語「試薬溶液」は、ＰＣＲの目的に必要な又は使用される少なくとも１つの試薬を含有する任意の溶液である。最も典型的な成分は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、イオン、マグネシウム、塩、ｐＨ緩衝剤、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、プローブ、蛍光色素（プローブに結合していてもい）、核酸結合剤、核酸鋳型である。試薬はまた、ポリメラーゼ反応又はそのモニタリングに影響を与える、他のポリメラーゼ反応添加剤でもよい。

用語「マスターミックス」は、ＰＣＲが起きるのに必要なすべて又はほとんどの成分又は因子の混合物を指し、ある場合には、試料特異的な及びアンプリコン特異的な鋳型とプライマー以外のすべてを指す。市販のマスターミックスは通常、濃縮溶液である。マスターミックスは、多くの試料に共通したすべての試薬を含有することができるが、これはまた、１つの試料のみのために構築されてもよい。マスターミックスを使用することは、ピペッティングエラーを減らし、ピペッティング容量間の差による試料の変動を低減させるのに有用である。

「核酸ポリメラーゼ」は、核酸へのヌクレオチドの取り込みを触媒する酵素を指す。核酸ポリメラーゼの例には、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼなどが挙げられる。

「熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ」は、選択された時間高温に供された時、安定（すなわち、分解又は変性に耐える）であり、充分な触媒活性を保持するＤＮＡポリメラーゼを指す。例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、２本鎖核酸を変性するのに必要な時間高温に供された時、以後のプライマー伸長反応を進めるための充分な活性を保持する。核酸変性に必要な加熱条件は当該分野で公知であり、米国特許第４，６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号に例示されている。本明細書において熱安定性ポリメラーゼは典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）などの温度サイクリング反応で使用するのに適している。熱安定性核酸ポリメラーゼの例には、サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、サーマス（Thermus）種Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラブス（Thermus flavus）ポリメラーゼ、サーマス・マリチマ（Thermus maritima）ポリメラーゼ、例えばＴＭＡ−２５及びＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。

「修飾された」ポリメラーゼは、未変性型又は野生型のポリメラーゼなどの基準配列又は他の修飾型のポリメラーゼとは少なくとも１つのモノマーが異なるポリメラーゼを指す。修飾の例は、モノマー挿入、欠失、及び置換が挙げられる。修飾ポリメラーゼはまた、２種以上の親に由来する同定可能な成分配列（例えば、構造又は機能ドメインなど）を有するキメラポリメラーゼを含む。また修飾ポリメラーゼの定義には、基準配列の化学的修飾を含むものがある。修飾されたポリメラーゼの例には、Ｇ４６ＥＥ６７８ＧＣＳ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６ＥＬ３２９ＡＥ６７８ＧＣＳ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６ＥＬ３２９ＡＤ６４０ＧＳ６７１ＦＣＳ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６ＥＬ３２９ＡＤ６４０ＧＳ６７１ＦＥ６７８ＧＣＳ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６ＥＥ６７８ＧＣＳ６ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ、ΔＺ０５ポリメラーゼ、ΔＺ０５−Ｇｏｌｄポリメラーゼ、ΔＺ０５Ｒポリメラーゼ、Ｅ６１５ＧＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ６７８ＧＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、Ｅ６７８ＧＴＭＡ−３０ポリメラーゼなどが挙げられる。

用語「５’→３’ヌクレアーゼ活性 (5' to 3' nuclease activity)」又は「５’−３’ヌクレアーゼ活性」は、典型的には核酸鎖合成に関連する核酸ポリメラーゼの活性を指し、こうしてヌクレオチドは核酸鎖の５’末端から除去され、例えば大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩはこの活性を有し、クレノウ (Klenow)断片はこの活性を有さない。５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する一部の酵素は、５’−３’エキソヌクレアーゼである。このような５’−３’エキソヌクレアーゼの例には、枯草菌（B. subtilis）のエキソヌクレアーゼ、脾臓からのホスホジエステラーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、酵母からのエキソヌクレアーゼＩＩ、酵母からのエキソヌクレアーゼＶ、及びノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）からのエキソヌクレアーゼが挙げられる。

５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用する標的核酸の検出は、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、及び第５，８０４，３７５号、及びHolland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280に記載されているように、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」又は「５’−ヌクレアーゼアッセイ」により行うことができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイでは、増幅反応中に、増幅領域内にハイブリダイズする標識された検出プローブが存在する。このプローブは、プローブがＤＮＡ合成のプライマーとして作用することを防ぐように、修飾される。増幅は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して行われる。増幅の各合成工程中に、伸長されるプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズする任意のプローブは、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。すなわち、新しい標的鎖の合成はまた、プローブの分解を引き起こし、分解生成物の蓄積は、標的配列の合成の尺度となる。

５’ヌクレアーゼアッセイでは、分解産物を検出するのに適した任意の方法を使用することができる。検出プローブはしばしば２つの蛍光色素により標識され、その１つは他の色素の蛍光をクエンチすることができる。これらの色素は、典型的には５’末端に結合したレポーター色素又は検出色素、及び内部部位に結合したクエンチ色素を用いて、プローブに結合しており、従って、プローブがハイブリダイズしていない状態の時クエンチが起き、及びＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの切断が、２つの色素の間で起きる。増幅により色素間のプローブの切断が起き、同時にクエンチと最初にクエンチされた色素から観察される蛍光の上昇が排除される。分解産物の蓄積は、反応蛍光の上昇を測定することにより追跡される。米国特許第５，４９１，０６３号及び第５，５７１，６７３号は、増幅と同時に起きるプローブの分解を検出するための代替法を記載する。

蛍光色素は、フルオレセイン群の色素などの陰性荷電した色素、又はローダミン群の色素などの中性荷電の色素、又はシアニン群などの陽性荷電した色素が挙げられる。フルオレセイン群の色素には、例えば６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、及びＺＯＥが挙げられる。ローダミン群の色素には、例えばテキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡ、又はローダミン誘導体ＪＡ２７０（米国特許第６，１８４，３７９号を参照）が挙げられる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡは、例えばPerkin-Elmer, Inc. (Wellesley, MA, USA)から販売されており、テキサスレッドは、例えばMolecular Probes, Inc. (Eugene, OR)から販売されている。シアニン群の色素には、例えばＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７が挙げられ、例えばAmersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ, USA) から販売されている。

標的核酸の検出のための５’ヌクレアーゼアッセイには、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する任意のポリメラーゼを使用することができる。すなわちいくつかの実施態様において、５’−ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、熱安定性で熱活性核酸ポリメラーゼである。このような熱安定性ポリメラーゼには、特に限定されないが、真正細菌目のサーマス（Thermus）属、サーマトガ（Thermatoga）属、及びサーモシフォ（Thermosipho）属の種々の種、及びこれらのキメラ型が挙げられる。例えば本発明の方法で使用できるサーマス（Thermus）種のポリメラーゼには、サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス（Thermus）種Ｚ０５（Ｚ０５）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス（Thermus）種ｓｐｓ１７（ｓｐｓ１７）、及びサーマス（Thermus）種Ｚ０５がある（例えば、米国特許第５，４０５，７７４号；第５，３５２，６００号；第５，０７９，３５２号；第４，８８９，８１８号；第５，４６６，５９１号；第５，６１８，７１１号；第５，６７４，７３８号、及び第５，７９５，７６２号）。本発明の方法で使用できるサーモトガ（Thermotoga）ポリメラーゼには、例えばサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・ネアポリターナ（Thermotoga neapolitana）ＤＮＡポリメラーゼがあり、一方、使用できるサーモシフォ（Thermosipho）ポリメラーゼの例は、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）ＤＮＡポリメラーゼである。サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）ＤＮＡポリメラーゼ及びサーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）ＤＮＡポリメラーゼは、国際公開第ＷＯ９２／０６２００号に公開されている。サーモトガ・ネアポリターナ（Thermatoga neapolitana）の配列は、国際公開第ＷＯ９７／０９４５１号に見いだされる。

５’ヌクレアーゼアッセイにおいて、増幅検出は典型的には増幅と同時（すなわち、リアルタイム）である。いくつかの実施態様において、増幅検出は定量的であり、増幅検出はリアルタイムである。いくつかの実施態様において、増幅検出は定性的（例えば、標的核酸の有無の終点検出）である。いくつかの実施態様において、増幅検出は増幅の後である。いくつかの実施態様において、増幅検出は定性的であり、増幅検出は増幅の後である。

本発明は、ＰＣＲアッセイで使用される各反応混合物を内部的にコード化して、正しい反応物調製の確実性、並びに得られるデータのより高い確実性（例えばより信頼できる）を作り出す機会を提供する。本発明の方法は、蛍光シグナルを検出できる装置による、プレ混合したマスターミックス同定の自動化を可能にするであろう蛍光ベースの手法を利用する。

本発明は、異なる濃度比で存在し、これが２つの色素の特有である蛍光比を生み出す２つの異なるクエンチされていない蛍光色素の利用である。これらの色素は、プローブがクエンチャー分子の存在下でも弱い蛍光を発するため、ＰＣＲプローブにより使用される蛍光色素とは特有に異なっていなければならない。あらかじめ作成したマスターミックスの少なすぎるピペッティング又は多すぎるピペッティングなどのエラーが起きても、この蛍光比は変化しないため、生の蛍光より蛍光比の使用が強調される。このようなエラーは生の蛍光値の変化を引き起こすが、蛍光比は一定のままであろう。すなわち、特異的標的核酸のＰＣＲ増幅を行うためのマスターミックスは、第１の蛍光色素と第２の蛍光色素との所定の比率で指定することができ、例えば、その比率は０〜５、又は１単位の第１の色素対４単位の第２の色素である。蛍光は、蛍光シグナルを検出できるＰＣＲ装置、例えばLightCycler（登録商標）装置 (Roche Diagnostics)により読まれ、２つの色素にそれぞれについて約１対４の比率の蛍光値を与える。これは、特異的マスターミックスが使用される標的特異的アッセイを、PCR装置が同定することを可能にする。第１の色素と第２の色素との広範な濃度比を使用することができ、任意の所定のマスターミックスの濃度比が他のマスターミックスの濃度比と近すぎないように、注意が払われる。本発明の方法を使用することにより、LightCycler（登録商標）480 装置 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) などのＰＣＲ装置は、標的特異的アッセイを実施し報告して、自動化された有用な情報を、確認と品質管理目的のために臨床検査室に送ることができる。

第１の色素と第２の色素との間における使用される濃度比には、ゼロ量 (zero amount)の第１の色素、ゼロ量の第２の色素、及び／又はゼロ量の第１と第２の色素が含まれる。LightCycler（登録商標）装置は、生の蛍光量がその色素の検出限界の充分に下であることにより、色素のゼロ量を認識するであろう。バックグランドノイズを最小にし、ピペッティング量が少なすぎる状況でも、マスターミックスがLightCycler（登録商標）装置により正確に同定されるであろうことを確実にするために、使用される色素の最も低い濃度でも、検出限界のはるかに上のはずである。

以下の例と図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲により設定される。

ＪＡ２７０及びＣｙ５．５の使用
ＰＣＲ分析及び検出装置（例えば、Roche DiagnosticsのLightCycler（登録商標）装置）又は蛍光リーダーが、異なる濃度比を区別し同定することを可能にするであろう蛍光比を、２つの色素（ＪＡ２７０とＣｙ５．５）の異なる濃度比が与えることができるかどうかを調べるために、実験が行われた。１００μｌの水中で０ｐｍｏｌ〜２０ｐｍｏｌの範囲の量を用いて、ＪＡ２７０とＣｙ５．５との１２の異なる濃度比が使用された。試験された異なる濃度比は表１に示される。

正確性と再現性とを調べるために、９６ウェルマイクロタイタープレート中で三つの複製物(replicate)が調製された。蛍光は、BMG PolarStar装置で、ＪＡ２７０について６１０ｎｍの励起波長と６５０ｎｍの発光波長を、そしてＣｙ５．５について６７０ｎｍの励起波長と７１０ｎｍの発光波長を使用して測定された。この実験の結果は図１に示され、右のグラフは、ｘ軸上の０〜５のＪＡ２７０／Ｃｙ５．５濃度比を示し、左のグラフは０〜１．６のＪＡ２７０／Ｃｙ５．５濃度比のクローズアップ図を示す。これらのデータに基づいて、最大の可能な予測変動を測定するために、各複製物のセットからの最大ＪＡ２７０蛍光値を、各対応する複製物のセットからの最小Ｃｙ５．５蛍光値と比較した。これはまた、最小ＪＡ２７０蛍光値とを最大Ｃｙ５．５値と比較することにより行われた。データは、最大値又は最小値間に重複は無いことを示し、これは、試験した各濃度比が、蛍光比により同定される他の濃度比から区別できることを意味し、従って、ＰＣＲマスターミックスなどの異なる溶液を同定するためのこの方法の使用の有効性を証明している。

Claims

複数の標的核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うための複数の反応混合物を調製する方法であって、
第１の標的核酸のＰＣＲ増幅を行うために必要な少なくとも１つの物質を含み、第１の蛍光色素と第２の蛍光色素とをさらに含む第１のマスターミックスであって、前記第１の色素と前記第２の色素は、前記第１の試薬溶液について特有である所定の濃度比で存在する、前記第１のマスターミックス溶液を提供する工程と、
第２の標的核酸のＰＣＲ増幅を行うために必要な少なくとも１つの物質を含み、前記第１の蛍光色素と前記第２の蛍光色素とをさらに含む第２のマスターミックスであって、前記第１の色素と前記第２の色素は、前記第１のマスターミックス溶液についての濃度比とは異なり、前記第２のマスターミックス溶液について特有である所定の濃度比で存在する、前記第２のマスターミックス溶液を提供する工程と、
前記第１のマスターミックス溶液を第１の反応混合物に加えて、前記第１の標的核酸のＰＣＲ増幅を行う工程と、
前記第２のマスターミックス溶液を第２の反応混合物に加えて、前記第２の標的核酸のＰＣＲ増幅を行う工程と
を含む、前記方法。
前記第１のマスターミックス溶液及び前記第２のマスターミックス溶液のいずれかにおいて、前記所定の濃度比が、ゼロ量の前記第１の蛍光色素を有し得る、請求項１に記載の方法。
前記第１のマスターミックス溶液及び前記第２のマスターミックス溶液のいずれかにおいて、前記所定の濃度比が、ゼロ量の前記第２の蛍光色素を有し得る、請求項１に記載の方法。
前記第１のマスターミックス溶液及び前記第２のマスターミックス溶液のいずれかにおいて、前記所定の濃度比が０〜５である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の蛍光色素がＪＡ２７０であり、前記第２の蛍光色素がＣｙｓ５．５である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
標的核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のために使用されるマスターミックス溶液の同一性をコード化する方法であって、
所定の濃度比で存在する第１の蛍光色素と前記第２の蛍光色素とを、前記マスターミックス溶液中で一緒に混合する工程であって、前記所定の濃度比は、前記第２の蛍光色素を超える前記第１の蛍光色素の蛍光比を生成し、前記蛍光比は他のマスターミックス溶液から生成される蛍光比と区別できる、前記工程と、
前記第１の蛍光色素からの蛍光及び前記第２の蛍光色素からの蛍光を検出する工程と、
前記蛍光比を決定し、それにより前記マスターミックス溶液を同定する工程と
を含む、前記方法。
前記マスターミックス溶液がゼロ量の前記第１の蛍光色素を有する、請求項６に記載の方法。
前記マスターミックス溶液がゼロ量の前記第２の蛍光色素を有する、請求項６に記載の方法。
前記所定の濃度比が０〜５である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の蛍光色素がＪＡ２７０であり、前記第２の蛍光色素がＣｙｓ５．５である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
複数のマスターミックス溶液を含む、複数の標的核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うためのキットであって、前記複数のマスターミックス溶液からの各１つのマスターミックス溶液は、特異的標的核酸のＰＣＲ増幅を行うために必要な少なくとも１つの物質を含み、第１の蛍光色素と第２の蛍光色素とをさらに含み、前記各１つのマスターミックス溶液について、前記第１の蛍光色素と前記第２の蛍光色素は、前記複数のマスターミックス溶液からの他のすべてのマスターミックス溶液とは異なる濃度比で存在し、かつ区別できる蛍光比を生成する、前記キット。
前記第１の蛍光色素がＪＡ２７０であり、前記第２の蛍光色素がＣｙｓ５．５である、請求項１１に記載のキット。