JP2016539650A - 微調整された超特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブ - Google Patents
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Abstract
高度に特異的な核酸プローブ及びプライマーのための組成物及び方法が提供される。プローブ系は、部分的に二本鎖のプローブを形成する相補鎖及びプロテクター鎖を含む。式１（ΔG°rxn=ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)）によって決定されるプローブと標的核酸の間のハイブリダイゼーションの反応標準自由エネルギーは、約−４ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約＋４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。あるいは、プローブと標的核酸の間のハイブリダイゼーションの反応標準自由エネルギーは、式２（-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)]）によって決定される標準自由エネルギーの５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内であると式１によって決定され、ここで、式２の[P]0項は、プロテクター鎖の濃度に等しく、式２の[C]0項は、相補鎖の濃度に等しい。さらに、本プローブを使用した反応のオンザフライ微調整の方法が提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１３年１２月１６日に出願された米国仮出願第６１／９１６，３２１号の優先権を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１３年１２月１６日に出願された米国仮出願第６１／９１６，３２１号の優先権を主張する。
ＤＮＡ及びＲＮＡ配列のわずかな差が、健康の大きな差につながり得る。例えば、細菌ゲノムの一塩基変化は、抗生物質抵抗性につながり得、ヒトゲノムの一塩基変化は、がん寛解につながり得る。ゲノム分野の成熟及びそれに伴う多くの核酸バイオマーカー配列及び分子の発見と共に、バイオテクノロジー産業からは、信頼できる、頑強な、安価な、且つ正確な、一塩基変化を区別できる核酸アッセイの開発の強い要求がある。核酸配列差に関する酵素に基づく区別方法は、酵素が特定の温度及び緩衝液条件を必要とするので、多種多様なテクノロジーと統合するのが困難である。
それらの相補物への核酸の高度に特異的なハイブリダイゼーションを保証するための酵素を含まない技法は、従来より融解温度の最適化に依存してきたが、これは、正確に予測し、制御することが困難である。最近、核酸配列の一塩基変化が広範囲の温度及び塩分濃度にわたって頑強に区別され得るトーホールドハイブリダイゼーションプローブが実証された。これらのプローブは、ゼロに近い反応標準自由エネルギー（ΔG°rxn）を有するそれらの意図された標的と反応するように設計されており、その結果、ハイブリダイゼーション収率は、意図された標的に関して５０％に近い。単一ヌクレオチドが異なる標的のバリアントさえも、著しく低い収率（中央値２％）でプローブに結合することになる。
ΔG°rxn≒０性質を達成するために、これらのプローブは、標的−非相同「バランス」領域の結合エネルギーと標的−特異的「トーホールド」領域の結合エネルギーのバランスを保つ。ＤＮＡプローブは、ＤＮＡ標的を区別するように頑強に機能することが実験的に実証され、ＲＮＡプローブは、ＲＮＡ標的を区別するように頑強に機能することが実験的に実証された。
しかしながら、これらのプローブは、いくつかの制限を受ける。例えば、ＤＮＡプローブがＲＮＡ標的に特異的に設計されている場合、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブがＲＮＡ標的に結合するように設計されている場合、及びＬＮＡプローブがＤＮＡ標的に特異的に結合するように設計されている場合など、プローブと標的が異なる形のものである場合、異なる形の核酸分子間のハイブリダイゼーション熱力学の差は、特異度が低く又は感度が低い貧弱なプローブ設計をもたらす。さらに、個々の塩基対／スタックの熱力学的結合強度が比較的大きく、反応ΔG°rxnの微調整を実質的に妨げ、これは次に、プローブ系の特異度と感度の間のトレードオフの調整可能性を限定する。さらに、公表されたＤＮＡ及びＲＮＡハイブリダイゼーション熱力学的パラメーターは、いくつかの条件で不完全及び／又は不正確であることが既知である。インシリコ設計プローブ系は、計算されたΔG°rxnとは著しく異なる実際のΔG°rxnを有し得；プローブパフォーマンスを微調整する方法がなければ、試行錯誤の繰り返しが望ましいΔG°rxnを有する最適プローブ設計を達成するために用いられなければならない。
本開示は、いくつかの例によれば、標的核酸中の一塩基変化を確実に区別する高度に特異的な核酸ハイブリダイゼーションプローブ系を提供する。以前の研究と比較して、本開示において記載されたプローブ系は、（１）ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び他の核酸プローブでＤＮＡ、ＲＮＡ、及び修飾核酸標的を確実に探索すること、及び（２）感度と特異度の間のトレードオフの微調整を可能にすることに優れている。本開示の組成物及び方法は、とりわけ、ＤＮＡ及びＲＮＡの検出及び定量化に基づく分子がん診断学、感染症診断学、食の安全診断学、及び研究発見ツールに有用であり得る。
一例では、標的核酸分子との選択的相互作用のための組成物が提供される。組成物は、第１の領域、第２の領域、及び第３の領域を含む、第１の濃度の第１の核酸鎖、並びに第４の領域及び第５の領域を含む、第２の濃度の第２の核酸鎖を含む。標的核酸は、それぞれ、完全ではないとしても少なくとも部分的に第１及び第２の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列の第６及び第７の領域を含む。第１及び第２の濃度は、標的核酸と組成物の間の相互作用が式２（-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)]）によって決定される標準自由エネルギーの５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内の式１［ΔG°rxn=ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)］によって決定される標準自由エネルギー（ΔG°rxn）を有するようなものであり、ここで、式２の[P]0項は、第２の濃度に等しく、式２の[C]0項は、第１の濃度に等しく、Rは、一般気体定数８．３１４Ｊ／ｍｏｌ・Ｋに等しく、τは、ケルビンでの温度に等しい。この例では、式１のΔG°t-TC項は、第６の領域と第１の領域の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを表し；式１のΔG°nh-PC項は、第５の領域と第３の領域の間のハイブリダイゼーションの自由エネルギーを表し；式１のΔG°v-TC項は、第７の領域と第２の領域の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを表し；式１のΔG°h-PC項は、第４の領域と第２の領域の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを表す。ΔG°値を計算する方法は、説明において後で詳細に記載される。いくつかの例では、標的核酸の濃度は、第１の濃度よりも小さい。いくつかの他の例では、標的核酸の濃度は、第１の濃度以上である。
別の例では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び第７の領域の配列は、標的核酸と組成物の間の相互作用が約−４ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び＋４ｋｃａｌ／ｍｏｌの式１［ΔG°rxn=ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)］によって決定される標準自由エネルギー（ΔG°rxn）を有する一方、［ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC］は、−１ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜＋１ｋｃａｌ／ｍｏｌではないようなものである。他の例では、ΔG°t-TC及びΔG°nh-PCの値は、お互いの１０％以内ではない。
別の例では、標的核酸は、第８の領域ヌクレオチド配列が第３の領域ヌクレオチド配列に相補的ではなく、整列したヌクレオチドの５０％未満が第８と第３の領域間で平衡で対になるように、第７の領域に隣接した第８の領域をさらに含む。
別の例では、核酸プローブを創出するための方法が提供される。方法は、以下のステップ：核酸分子中の標的ヌクレオチド配列を選択するステップであって、標的ヌクレオチド配列が第６のヌクレオチド部分配列及び第７のヌクレオチド部分配列を含むステップ；第１のヌクレオチド部分配列、第２のヌクレオチド部分配列、及び第３のヌクレオチド部分配列を含む第１のヌクレオチド配列を選択するステップ；並びに第４のヌクレオチド部分配列及び第５のヌクレオチド部分配列を含む第２のヌクレオチド配列を選択するステップを含む。この例では、第１の、第２の、及び標的ヌクレオチド配列を選択するステップは、式１［ΔG°rxn=ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)］によって決定される約−４ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約＋４ｋｃａｌ／ｍｏｌの標準自由エネルギーのこのような有の間にある相互作用に基づき、ここで、式１のΔG°t-TC項は、第６の領域と第１の領域の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°nh-PC項は、第５の領域と第３の領域の間のハイブリダイゼーションの自由エネルギーを表し、式１のΔG°v-TC項は、第７の領域と第２の領域の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°h-PC項は、第４の領域と第２の領域の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを表す。方法は、第１のヌクレオチド配列を含む第１のヌクレオチド鎖及び第２のヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド鎖を合成するステップをさらに含む。
式１に基づく関連するヌクレオチド配列の選択に加えて、方法は、式２（-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)）によって決定される標準自由エネルギーが式１（ΔG°rxn）によって決定される標準自由エネルギーの５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内であるように、第１及び第２の濃度を選択するステップを代わりに又はさらに含み得、ここで、式２の[C]0及び[P]0項は、それぞれ、第１のヌクレオチド鎖及び第２のヌクレオチド鎖の所定の濃度を表し、Rは、一般気体定数８.３１４Ｊ／ｍｏｌ・Ｋに等しく、τは、ケルビンでの温度に等しい。一例では、式１によって決定される標準自由エネルギーが式２によって決定される標準自由エネルギーの５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内ではない場合、第１の核酸鎖又は第２の核酸鎖の少なくとも１つの所定の濃度は、この条件が満たされるまで改変され得る。代わりに、最適化は、方法のステップを反復すること及び望ましい自由エネルギー条件を満たす修飾ヌクレオチド配列を選択することによって生じ得る。
試料中の標的ヌクレオチド配列を有する核酸分子の存在又は量を同定するための方法が提供される。方法は、標的核酸分子をおそらく含む試料にプローブを適用するステップ、及び約４℃〜約７５℃、約２５℃〜約７０℃、又は約３７℃〜約６５℃の温度、又はそれらの間の任意の温度範囲でハイブリダイゼーション反応を操作して、標的核酸分子が試料に存在する場合、標的核酸分子へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にするステップを含む。この例では、プローブは、第１の核酸鎖及び第２の核酸鎖を含む。第１の核酸鎖は、第１の領域、第２の領域、及び第３の領域を含み、ここで、第１の領域が標的核酸分子の第６の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有し、第２の領域が標的核酸分子の第７の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する。第２の核酸鎖は、第４の領域及び第５の領域を含み、ここで、第４の領域が第２の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有し、第５の領域が第３の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する。一例では、標的核酸分子は、ＲＮＡである。
試料からの標的核酸配列を選択的に増幅するための方法であって、酵素プライマーとしてのプローブを試料、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、及びヌクレオチド三リン酸の混合物を含む混合物に適用するステップを含む方法。一部の例では、混合物は、追加のＤＮＡ若しくはＲＮＡプライマー、又はニック形成酵素、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、制限酵素、ヌクレアーゼ、若しくはリガーゼなどの追加の酵素をさらに含む。一部の例では、プローブ及び混合物の組合せは、１分〜７２時間等温的に反応させておかれる。一部の例では、プローブ及び混合物の組合せは、５〜２００のサイクル変動するいくつかの温度サイクルを通して反応させておかれる。
本開示の特性及び利点は、以下の例の説明を読めば当業者には容易に明らかとなろう。
本開示の一部の特定の例は、部分的に、以下の説明及び添付の図面を参照すれば、理解され得る。
本発明における使用のための適した核酸プローブ系１０の一実施形態を提供する図である。プローブ系１０は、標的核酸Ｔ（「標的核酸分子」又は「標的核酸鎖」とも称される）に関して設計された相補鎖Ｃ（本明細書で「第１の鎖」とも称される及びプロテクター鎖Ｐ（本明細書で「第２の鎖」とも称される）を含む。相補鎖Ｃは、標的−トーホールド−相補領域１（本明細書で「第１の領域」とも称される）、標的−相同相補領域２（本明細書で「第２の領域」とも称される）、及び標的−非相同−相補領域３（本明細書で「第３の領域」とも称される）を含む。プロテクターは、標的−相同領域４（本明細書で「第４の領域」とも称される）及び標的−非相同領域５（本明細書で「第５の領域」とも称される）を含む。標的は、標的−トーホールド領域６（本明細書で「第６の領域」とも称される）及び標的−バリデーション領域７（本明細書で「第７の領域」とも称される）を含む。ある特定の実施形態では、標的は、標的上流領域８、及び／又は追加の無名の上流及び下流領域をさらに含み得る。プロテクターＰの標的相同領域４は、配列が標的Ｔの標的バリデーション領域７とは異なり得、例えば、例では、プロテクターＰ及び標的Ｔは、核酸の異なる型（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）である。本明細書では、「領域」という用語は、プローブ系又は標的核酸を参照する場合、ハイブリダイゼーション及び解離における機能単位として働く連続するヌクレオチド塩基の群を定義する。
図２Ａは、例示的プローブ系１０及び標的核酸Ｔとのその反応を提供する図であり、図２Ｂは、例示的プローブ系１０及び標的バリデーション領域７において標的Ｔと比較して一塩基差１２を有するバリアント標的Ｖとのその反応を提供する図である。ここで、図２Ａを参照すると、プローブ系１０は、意図された標的Ｔとのプローブ系１０のハイブリダイゼーション反応の標準自由エネルギー（ΔG°rxn）がおよそ（-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)）（式２）に等しく、標的Ｔに結合した相補鎖Ｃの中程度から高い収率を保証するように設計されている。ここで、図２Ｂを参照すると、プローブ系１０は、ΔΔG°SNPによってΔG°rxnより正である標準自由エネルギーΔG°Vでバリアント標的Ｖと反応し（すなわち、ΔG°V=ΔG°rxn+ΔΔG°SNP）、ここで、ΔΔG°SNPは、一塩基変化の相対的熱力学的ペナルティーを意味する。これは、意図された標的Ｔと比較して、一塩基ミスマッチ１２によるバリアント標的Ｖに関するはるかに低い結合収率を有するプローブ系１０をもたらす。
反応標準自由エネルギー（ΔG°rxn）を計算するために本発明において使用される結合領域構成要素の様々な標準自由エネルギーを提供する図である。
第１の核酸分子と第２の核酸分子は、どちらもＤＮＡであると仮定した、種々の温度でのＢＲＡＦ発現（エキソン）ｍＲＮＡの４６の異なる５０ｎｔ非オーバーラップ部分配列に関する（ΔG°v-TC-ΔG°h-PC）値の分布を提供する図である。明らかなように、最も大きい値は、最も小さい値よりも２０ｋｃａｌ／ｍｏｌを超えて大きく、広範にわたっている。ΔG°rxnの１.４ｋｃａｌ／ｍｏｌの差が特異度又は感度の１０倍の差につながり得ることを考慮すると、ここでの結果は、ΔG°v-TC-ΔG°h-PC項が本明細書で記載されたプローブの設計において考慮されるべきであり、それによって、従来技術設計パラメーターを改善するということを実証している。
差次的標識熱力学の標準自由エネルギー寄与を提供する図である（ΔG°label=ΔG°F-ΔG°FQ）。この例では、プロテクター鎖Ｐの標識は、相補鎖ＣのフルオロフォアＦに特異的であるクエンチャーＱである。
プローブ系挙動を調整するための本方法の一態様の提示である。特に、塩基スタックの追加又は除去を通した反応標準自由エネルギー（ΔG°rxn）の調節（式１の値の改変）に加えて、化学量論（Ｐ対Ｃの濃度比）の調節がプローブの特異度と感度の間のトレードオフを制御するために利用され得、そのようにする（式２の値を改変する）より効果的な方法を提供する。ここで、標的濃度は、第１の濃度よりも小さいと仮定され、感度は、意図された標的の平衡結合収率[TC]/([T]+[TC])として計算され、特異度は、１引く標的バリアントの結合収率1-[VC]/([V]+[VC])=[V]/([V]+[VC])として計算される。この図では、バリアントは、標的とは一塩基異なり、３７℃でΔΔG°SNP＝＋２ｋｃａｌ／ｍｏｌを有する。Ｐ対Ｃ化学量論を調節することは、それらの計算されたΔG°rxnとは最大５ｋｃａｌ／ｍｏｌ異なる実際のΔG°rxnを有するプローブ系の救出を可能にすることにより、ΔG°rxnがインシリコで正確に計算され得ない場合にも有益である。
バリアントプローブ系設計を表す図である。図７Ａは、反対の５’／３’向きを有するプローブ系を表す。図７Ｂは、領域１が領域２内に埋め込まれている、又は領域１が領域２と３の間に存在するプローブ系を表す。図７Ｃは、領域２と４が完全には相補的でない、又は領域３と５が完全には相補的でないプローブ系を表す。
標的結合に関する異なる望ましい収率、及び特異度と感度の間のトレードオフのグラフ表示を提供する図である。式１（又は標識が使用される場合、式３）によって決定される反応標準自由エネルギーΔG°rxnが自由エネルギー逸脱Ｘによって（式２又は-Rτln（（[P]0-[C]0)/[C]0)］）から逸脱する場合、標的結合の収率は、同様に変換することになる。Ｘの正の値に関して、特異度（標的バリアントＶに対する）は、改善されることになるが、感度（収率）は、減少することになる。Ｘの負の値に関して、感度は、改善されることになるが、特異度は、減少することになる。特定の適用に関して、特異度又は感度のいずれかがより重要であり得、本明細書で示された方法を通して熱力学を微調整する能力は、従来技術を改善する。
τ＝３７℃、［Ｎａ＋］＝１Ｍでヌクレオチド１１〜３０にあるＢＲＡＦ発現ｍＲＮＡ部分配列を標的とする本開示（実施例１）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーターに基づいて、ΔG°rxnは、＋０.１５ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝０．７８がＸ＝０を達成するために推奨される。([P]0-[C]0)/[C]0＝７．８で、Ｘは、＋１.４２ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、([P]0-[C]0)/[C]0＝０．１０で、Ｘは、−１.２７ｋｃａｌ／ｍｏｌである。
τ＝３７℃、［Ｎａ＋］＝１Ｍでヌクレオチド７１〜９０にあるＢＲＡＦ発現ｍＲＮＡ部分配列を標的とする本開示（実施例２）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーターに基づいて、ΔG°rxnは、−０.６１ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝２．６９がＸ＝０を達成するために推奨される。
τ＝３７℃、［Ｎａ＋］＝１Ｍでヌクレオチド１３１〜１６０にあるＢＲＡＦ発現ｍＲＮＡ部分配列を標的とする本開示（実施例３）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーターに基づいて、ΔG°rxnは、−１.５４ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝１２．１４がＸ＝０を達成するために推奨される。
τ＝５２℃、［Ｎａ＋］＝１Ｍでヌクレオチド１９１〜２２０にあるＢＲＡＦ発現ｍＲＮＡ部分配列を標的とする本開示（実施例４）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーターに基づいて、ΔG°rxnは、−０.４６ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝２．１１がＸ＝０を達成するために推奨される。
τ＝６５℃、［Ｎａ＋］＝１Ｍでヌクレオチド２５１〜２８０にあるＢＲＡＦ発現ｍＲＮＡ部分配列を標的とする本開示（実施例５）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーターに基づいて、ΔG°rxnは、−１.４９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝１１．２がＸ＝０を達成するために推奨される。
τ＝５２℃、［Ｎａ＋］＝１Ｍでヌクレオチド３１１〜３５０にあるＢＲＡＦ発現ｍＲＮＡ部分配列を標的とする本開示（実施例６）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーターに基づいて、ΔG°rxnは、−０.２２ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝１．４３がＸ＝０を達成するために推奨される。
τ＝６５℃、［Ｎａ＋］＝１Ｍでヌクレオチド４３１〜４６０にあるＢＲＡＦ発現ｍＲＮＡ部分配列を標的とする本開示（実施例７）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーターに基づいて、ΔG°rxnは、＋１.０３ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝０．１９がＸ＝０を達成するために推奨される。
τ＝３７℃、［Ｎａ＋］＝１Ｍでヌクレオチド４９１〜５２０にあるＢＲＡＦ発現ｍＲＮＡ部分配列を標的とする代替の向きを有する本開示（実施例８）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーターに基づいて、ΔG°rxnは、−０.２７ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝１．５５がＸ＝０を達成するために推奨される。
τ＝３７℃、［Ｎａ＋］＝１Ｍでヌクレオチド５５１〜５８０にあるＢＲＡＦ発現ｍＲＮＡ部分配列を標的とする、プロテクター鎖の標的−相同−領域（第４の領域）における意図的な単一ヌクレオチドミスマッチを有する本開示（実施例９）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーターに基づいて、ΔG°rxnは、−０.３７ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝１．８２がＸ＝０を達成するために推奨される。
τ＝２５℃、［Ｎａ＋］＝１Ｍでヌクレオチド６１１〜６３０にあるＢＲＡＦ発現ｍＲＮＡ部分配列を標的とする本開示（実施例１０）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーターに基づいて、ΔG°rxnは、−０.６６ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝３．０がＸ＝０を達成するために推奨される。
τ＝２５℃、［Ｎａ＋］＝１Ｍ、３０％ホルムアミドでヌクレオチド６７１〜７００にあるＢＲＡＦ発現ｍＲＮＡ部分配列を標的とする本開示（実施例１１）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーター及び１％ホルムアミドが０.６℃の温度増加と等価であるという仮定に基づいて、ΔG°rxnは、０.３２ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝０．５８がＸ＝０を達成するために推奨される。
τ＝６２℃、［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭでヌクレオチド６７１〜７００にあるＤＮＡ配列を標的とする本開示（実施例１２）の例示的プローブを提供する図である。文献パラメーターに基づいて、ΔG°rxnは、−３.０７ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算され、([P]0-[C]0)/[C]0＝１００がＸ＝０を達成するために推奨される。
プライマーとして本開示のプローブを使用したホットスポット多重化ＰＣＲの図式的概観を提供する図である。望ましい標的核酸分子２２を含む試料２０が酵素２３、順方向プライマー２４、及びリバーサープライマーセット１０ａ〜１０ｄと混合される。標的核酸分子２２は、互いに近い座位に属する一塩基変異（「ホットスポット」）を含み、典型的に標準ＰＣＲプライマーを通して検出することが困難である。本プローブがプライマーの全長に沿って単一ヌクレオチドミスマッチへの選択性を有するという事実により、本プローブは、ホットスポット多重化ＰＣＲプライマーにおいてユニークに有利であり得る。さらに、主に二本鎖である、ＰＣＲプライマーとしての本プローブの使用は、ＰＣＲに関する多重化増幅能力をしばしば限定するプライマー二量体の形成を抑制することになる。種々の蛍光チャネル（１、２、３、及び４）を使用することによって、各標的は、望ましくない交差相互作用がほとんどなく定量化される。
４つの様々なＮＲＡＳコドン６１変異を標的とする本開示のプローブを使用した例示的ホットスポット多重化ＰＣＲ逆方向プライマーセットを提供する図である。配列設計及びエネルギー計算は、上記の設計の説明に基づき、理論的にＸ＝０を達成する[P]0/[C]0比は、各プライマー系に関して計算される。
[P]0/[C]0比を改変することによるＤＮＡ標的に向けられたプローブの微調整を提供する図である。この図におけるプローブは、種々の反応標準自由エネルギーで同じＤＮＡ標的に結合するように設計された。各相補物鎖は、３’末端でのＴＡＭＲＡフルオロフォアによって修飾された一方、各プロテクター鎖は、５’末端でのＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱクエンチャーによって修飾された。ハイブリダイゼーション収率は、蛍光を通して種々の([P]0-[C]0)/[C]0比で実験的に得られた。結果は、この図に示された各プローブが特異度及び感度において調整可能であることを示している。全ての実験を２５℃で１×ＰＢＳで行なった。
[P]0/[C]0比を改変することよるＲＮＡ配列（合成ｍｉＲ−１２２）を標的とするプローブの微調整を提供する図である。プローブ設計プロセスは、ＲＮＡ−ＤＮＡ結合パラメーターが使用されたことを除いて、図２２のものと類似していた。実験手順は、ＤＮＡ標的と同じであった。結果は、ＲＮＡ標的に関するプローブの感度／特異度トレードオフも調節可能であることを示している。
自己報告プライマーとして本開示のプローブを使用した標的核酸分子を選択的に増幅する図式的概観を提供する図である。プライマー１０の第１の核酸鎖は、一方の末端にフルオロフォアＦを含み、プライマーの第２の核酸鎖は、他方の末端にクエンチャーＱを含む。増幅プロセス３０中に、望ましい標的核酸分子２５へのハイブリダイゼーション時に、プライマーＰの第２の核酸鎖が拡散するにつれて蛍光シグナルが増加し、アンプリコン２６の形成を示す。
増幅を通して形成された望ましいアンプリコンの量を定量化するための、フルオロフォア標識プローブとして本開示のプローブを使用した標的核酸分子を増幅する図式的概観を提供する図である。望ましい標的核酸分子２２をおそらく含む試料が酵素２３、順方向プライマー２７、逆方向プライマー（示さず）、及びフルオロフォア標識プローブ１０と混合される。プローブＣの第１の核酸鎖は、内部的にフルオロフォアＦ及び３’末端でのクエンチャーで機能的にされ、プローブは、フルオロフォア及びクエンチャーが極めて接近していることにより天然に暗い。順方向プライマー及びプローブＣの第１の核酸鎖は、アニーリングプロセス３１中に望ましい標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズする一方、第２の核酸鎖は、標的核酸分子で置き換えられる。伸長プロセス３２中に、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素２３がプライマーを伸長し、第１の核酸鎖のホスホジエステル結合を切断し、蛍光シグナルの増加をもたらす。
本開示は、様々な変更形態及び代替の形が可能であるが、特定の例が図において示され、本明細書でさらに詳細に記載される。しかしながら、特定の例の説明は、開示された特定の形に本発明を限定することが意図されておらず、それどころか、本開示は、添付の特許請求の範囲によって部分的に例証された全ての変更形態及び均等物を包含するものであることが理解されよう。
本明細書で記載された核酸プローブ系は、以前報告された系に対していくつかの利点を有する。第１に、本明細書で記載された方法及び組成物は、特定の配列のＲＮＡ標的をアッセイするためのより経済的なＤＮＡプローブを提供し；ＲＮＡハイブリダイゼーションは、一般に、ＤＮＡハイブリダイゼーションよりも特異性が低いので、ＲＮＡ標的に対するＤＮＡプローブは、特異性の改善も示し得る。さらに、ここで、方法及び組成物は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを組み込んだもの又はロックド核酸（ＬＮＡ）などの修飾核酸プローブが頑強な単一ヌクレオチド特異性から利益を得ることを可能にし；これらの修飾核酸プローブは、ヌクレアーゼ抵抗性などの望ましい性質を有し得る。第２に、本明細書で記載された方法及び組成物は、プローブ系におけるプロテクター及び相補物の相対濃度の改変によって微調整され得る特異度及び感度パフォーマンスを提供する。さらに、プローブ系は、２つの他の望ましい特性も有し：本明細書で記載されたプローブは、極度に特異的であり、本明細書で記載されたプローブは、広範囲の温度及び塩濃度にわたって使用可能であり、したがって、多くの異なる実験条件下で機能的に信頼できる。例えば、一塩基変化は、１０℃〜７０℃の温度にわたって約３０倍異なる結合収率をもたらす。最後に、本明細書で記載されたプローブは、動力学的に速い。例えば、本開示のプローブは、ハイブリダイゼーションの１０倍以内で標的核酸分子と相互作用する。
その意図された標的Ｔと反応する本開示と一貫したプローブ系１０の概観が図２Ａ及びＢに示される。この例では、プローブ系１０は、プロテクターオリゴヌクレオチド／鎖Ｐ及び相補物Ｃより過剰に存在するプロテクターＰを有する相補物オリゴヌクレオチド／鎖Ｃからなる。プロテクターＰ及び相補物Ｃは、ハイブリダイズして、部分的に二本鎖の複合体を形成し得；これは、プロテクターＰ及び相補物Ｃが標的Ｔに別々に導入される、又は複合体を形成するために予備反応されるかどうかにかかわらず真実である。さらに、一部の例では、プロテクター及び相補物の部分的に二本鎖の複合体に加えて、過剰な鎖が一本鎖の分子として存在し得るように、過剰量の相補物Ｃ又はプロテクターＰがあり得る。図２Ａでは、濃度比[P]0/[C]0は、標的Ｔとプローブ系１０の間の反応が（-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)]）に等しい反応標準自由エネルギー（ΔG°rxn）を有するように選択される。これにより、一部の例では、試料中の全ての標的分子Ｔの半分が平衡で相補鎖Ｃに結合する。ここで、図２Ｂを参照すると、標的−バリデーション７又は標的−トーホールド６領域において標的Ｔとは潜在的に一塩基の配列が異なる標的バリアントＶは、より正の標準自由エネルギー（ΔG°V）で結合し、著しく低い平衡収率（例えば２％）を有することになる。
プロテクター鎖Ｐ及び相補鎖Ｃの配列は、意図された標的Ｔの配列に基づいて設計される。各鎖は、図１に示されたように、概念的にいくつかの非オーバーラップ領域に分けられる。標的−バリデーション領域７（本明細書で「第７の領域」とも称される）及び標的−相同領域４（本明細書で「第４の領域」とも称される）は、どちらも標的−相同−相補領域２（本明細書で「第２の領域」とも称される）に部分的又は完全に相補的であるが、種々の配列を有し得ることに注目することは重要である。例えば、ＲＮＡ標的は、ウラシルを含有する標的−バリデーション領域７を有することになるのに対して、ＤＮＡプロテクターＰは、標的−相同領域４においてチミンを含むことになる。別の例として、領域４は、いくつかの位置で領域２に部分的にミスマッチし得るのに対して、領域７は、領域２に完全にマッチしている。別の例として、領域４と領域７の両方は、領域２に部分的にミスマッチし得るが、異なるヌクレオチド塩基である。
標識を有さないプローブ系に関する反応標準自由エネルギーは、本明細書で、及び添付の特許請求の範囲において「式１」とも称される、ΔG°rxn=ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)によって提供される。機能化基又は標識を有するプローブ系に関する反応標準自由エネルギーは、本明細書で、及び添付の特許請求の範囲において「式３」と称される、ΔG°rxn=ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)+ΔG°labelによって提供される。本明細書で使用される全ての標準自由エネルギー項は、組成物が標的核酸分子に適用される温度及び緩衝液条件で評価されることが理解されよう。
図３及び５に示されるように、式１及び３は、プロテクター／相補／標的核酸鎖の様々な領域間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを表すいくつかの構成要素からなる。その中に示されるように、ΔG°t-TC項は、プローブ系１０の標的核酸Ｔの標的−トーホールド領域６と相補鎖Ｃの標的−トーホールド相補領域１の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを表す。これらの領域は、部分的に相補的であり得るか又は完全に相補的であり得る。この例では、「部分的に相補的」という用語は、第６の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、第１の領域におけるヌクレオチドの６０％より多くを有することと定義される。しかしながら、他の対配列に関する「部分的に相補的」という用語は、異なる意味を有し得ることが理解されよう。
ΔG°nh-PC項は、プロテクター鎖Ｐの標的−非相同領域５と相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを表す。これらの領域は、部分的に相補的又は完全に相補的のいずれかであり得る。この例では、「部分的に相補的」という用語は、第５の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、第３の領域におけるヌクレオチドの６０％より多くを有することと定義される。
ΔG°v-TC項は、標的核酸Ｔの標的−バリデーション領域７と相補鎖Ｃの標的−相同−相補領域２の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを表す。これらの領域は、部分的に相補的又は完全に相補的のいずれかであり得る。この例では、「部分的に相補的」という用語は、第７の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、第２の領域におけるヌクレオチドの６０％より多くを有することと定義される。
ΔG°h-PC項は、プロテクター鎖Ｐの標的−相同領域４と相補鎖Ｃの標的−相同−相補領域２の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを表す。これらの領域は、部分的に相補的又は完全に相補的のいずれかであり得る。この例では、「部分的に相補的」という用語は、第４の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、第２の領域におけるヌクレオチドの６０％より多くを有することと定義される。
項ΔG°labelは、相補鎖（ΔG°F）上の標識の標準自由エネルギー引くプロテクター上の任意の他の機能化基を含めた、標識とプロテクターの間の相互作用の標準自由エネルギーに等しい。図５の例では、プロテクター鎖の標識（Ｑ）は、相補鎖のフルオロフォア（Ｆ）に特異的なクエンチャーである。
引き続き図１を参照すると、いくつかの例では、プローブ系配列の設計は、（１）標的−トーホールド−相補領域１における二次構造がほとんど又は全くない、且つ（２）標的−上流領域８と標的−非相同−相補領域３の間の結合がほとんど又は全くないようなものである。ここで、標的−トーホールド−相補領域における「二次構造がほとんど又は全くない」は、操作上の温度及び塩分濃度条件において算出すると、領域におけるヌクレオチドの５０％未満が評価された最小自由エネルギー構造において二本鎖状態にあることと定義される。ここで、標的−上流領域と標的−非相同−相補領域３の間の「結合がほとんど又は全くない」は、操作上の温度及び塩分濃度条件において算出すると、標的−非相同−相補領域３におけるヌクレオチドの５０％未満が評価された最小自由エネルギー構造において二本鎖状態にあることと定義される。
例えば、式１によって定義される反応標準自由エネルギー（ΔG°rxn）に加えて、本プローブ設計は、プローブのプロテクター及び相補鎖の相対濃度の考慮を含む。これは、プロテクター鎖対相補鎖の比をプローブの配列設計とは独立して改変することによる、反応の微調整を可能にする。したがって、一例では、本核酸ハイブリダイゼーションプローブ系の設計は、以下のものに基づき：
ΔG°rxn=ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)=-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)+X
又は
ΔG°rxn=ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)+ΔG°label=-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)+X
ここで、Ｘは、−５ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜＋５ｋｃａｌ／ｍｏｌの値である。Ｘの値は、使用者が高い分子感度と高い分子特異度の間のトレードオフを制御することをさらに可能にし、Ｘのより正の値がより高い特異度を支持する。
ΔG°rxn=ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)=-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)+X
又は
ΔG°rxn=ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)+ΔG°label=-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)+X
ここで、Ｘは、−５ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜＋５ｋｃａｌ／ｍｏｌの値である。Ｘの値は、使用者が高い分子感度と高い分子特異度の間のトレードオフを制御することをさらに可能にし、Ｘのより正の値がより高い特異度を支持する。
ΔG°項の値は、現在入手可能な文献値に基づいておおよそのみ計算され得るのに対して、特許請求されたプローブは、実際のΔG°項によって記載され、制約されることが理解されよう。ΔG°値の我々の実験的研究に基づいて、現在入手可能なパラメーター及びソフトウェアに基づく計算は、実際の値とは最大３ｋｃａｌ／ｍｏｌ又は１５％のどちらか大きい方だけ異なり得る。
対照的に、国際公開第２０１２／０５８４８８号パンフレットは、主要な設計制約が本開示の用語でΔG°t-TC≒ΔG°nh-PCである核酸ハイブリダイゼーションプローブの設計を報告しており、ここでおおよそ等しいは、互いの１０％以内と定義される。一実施形態では、Ｘの望ましい値は、０とは著しく異なるので、本発明のプローブに関する標準自由エネルギーΔG°t-TCとΔG°nh-PCは、１０％を超えて異なる。別の実施形態では、（ΔG°v-TC-ΔG°h-PC）は、０とは著しく異なるので、本発明のプローブに関する標準自由エネルギーΔG°t-TCとΔG°nh-PCは、１０％を超えて異なる。別の実施形態では、([P]0-[C]0)/[C]0は、１とは著しく異なるので、本発明のプローブに関する標準自由エネルギーΔG°t-TCとΔG°nh-PCは、１０％を超えて異なる。別の実施形態では、ΔG°labelは、０とは著しく異なるので、本発明のプローブに関する標準自由エネルギーΔG°t-TCとΔG°nh-PCは、１０％を超えて異なる。
したがって、本プローブ系は、ΔG°v-TC、ΔG°h-PC、ΔG°label、Ｘ、及び
項を考慮すると従来技術から逸脱する。ΔG°v-TC、ΔG°h-PC項の過失は、領域４と領域７のヌクレオチド配列が同一でない多くの設定における貧弱なプローブ設計につながり、ΔG°label項の過失は、フルオロフォア又は他の標識が使用される場合、貧弱なプローブ設計につながり、Ｘ項の過失は、特異度と感度の間の種々のトレードオフを妨げ、化学量論比項の過失は、配列設計と独立したプローブ系挙動の微調整を妨げ、さらに、プローブをＰ及びＣのいくつかの化学量論において貧弱に機能させる。これらのそれぞれは、以下でより詳細に考察されることになる。
第１に、図２Ａに戻って参照すると、標的Ｔの標的−バリデーション領域７とプロテクターＰの標的−相同領域４は、重要なことに、ＴとＰが核酸の異なる型である例では、いくつかの理由により、配列及び熱力学的性質が異なり得る。例えば、標的Ｔは、科学的／臨床的利益によりＲＮＡ分子とすることができるのに対して、プロテクターＰは、経済／合成能力によりＤＮＡ分子とすることができる。別の例として、プロテクターＰは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド又はロックド核酸（ＬＮＡ）などの修飾核酸を含み得る。別の例として、領域４と領域７は、どちらもＤＮＡであるが、動態学的応答の増加又は不必要な生物学的応答の低下から利益を得るために、ヌクレオチド配列が異なり得る。
標的Ｔの標的−バリデーション領域７とプロテクターＰの標的−相同領域４が異なる場合、ΔG°v-TCとΔG°h-PC項は、等しくなく、ΔG°rxn駆動プローブ系設計プロセスにおいて考慮されなければならない。ΔG°v-TC-ΔG°h-PCの値は、ゼロから著しく逸脱し得る。ここで、図４を参照すると、Sugimoto et al.[7]によって与えられたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション熱力学値及びSantaLucia and Hicks[8]によって与えられたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション熱力学値を使用した、ＤＮＡ相補物への結合におけるＢＲＡＦ転写ＲＮＡ（各５０ｎｔ長）対相同ＤＮＡ配列の４６の異なる非オーバーラップ部分配列に関するこれらの値の分布が示されている。そこで明らかなように、ΔG°v-TC-ΔG°h-PCの値が−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜＋２０ｋｃａｌ／ｍｏｌにわたるだけでなく、値は、温度依存性でもある。対照的に、ΔG°rxnの１ｋｃａｌ／ｍｏｌ差さえも、感度及び／又は特異度の著しい変化につながり得る。
ＤＮＡプローブ（Ｐ及びＣ）を使用した、ＲＮＡ標的Ｔの検出は、ΔG°v-TC-ΔG°h-PCが考慮されなければならない唯一の適用である。Ｔ及びＰが核酸の異なる型（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ホスホロチオエートＤＮＡ、２’−メトキシ核酸など）であるから、又は配列の小さい変化のために、プロテクターＰの標的−相同領域が標的Ｔの標的−バリデーション領域とは異なる場合、プローブ系の他の変形形態が存在し、これは、以下に本明細書でさらに詳細に考察されることになる。
ΔG°v-TC-ΔG°h-PC項を無視することによって、この項の総計値は、０ｋｃａｌ／ｍｏｌであると仮定されなければならない。この仮定は、ＤＮＡプロテクターを使用したＤＮＡ標的の適用に関するなど、プロテクターＰの標的−相同領域４が標的Ｔの標的−バリデーション領域７と同一特徴及び配列のものであり、領域７及び４が同一ヌクレオチド配列を有する場合にのみ満たされる。
第２に、核酸の検出又はイメージングの多くの適用は、標識を使用して、標的核酸の存在又は量を可視化するのを助ける。これらの標識は、抗体を動員する有機フルオロフォア、金属ナノ粒子、又はハプテンとすることができる。しばしば、これらの標識は、著しい熱力学的効果を有し得、核酸ハイブリダイゼーションを安定化又は不安定化する。標識を利用するプローブ系の適切な設計は、図５に示されるように、プロテクターとの及び標的との標識の差次的標準自由エネルギーを説明すべきである。
第３に、上記のように、プロテクターＰ及び相補物Ｃの相対濃度は、プローブ系の配列設計とは独立して存在する、本プローブ系に関する重要な調整パラメーターである。ＤＮＡ及びＲＮＡハイブリダイゼーション熱力学及び標識熱力学の現時点での理解が不完全であるということを考えると、設計及び合成後に特定のプローブ系のパフォーマンスを調節する能力は、これらのプローブ系に関わる実際の適用に極めて重要である。
プローブ系のパフォーマンスを調整することにおけるＰ及びＣの相対濃度の役割を理解するために、標的とプローブ系の間の反応の平衡が考慮されるべきである。全体的な化学反応は、以下の式のように書かれ得る。
Ｔ＋ＰＣ⇔ＴＣ＋Ｐ
典型的に、標的（生物学的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）は、プローブ構成要素Ｐ及びＰＣよりも濃度がはるかに低く；Ｐ及びＰＣのより高い濃度は、反応を平衡に急速に駆動するのを助ける。反応の挙動を判断するための１つの有用な測定規準は、標的Ｔに対するプローブ系の収率又は感度であり、これは、
Ｔ＋ＰＣ⇔ＴＣ＋Ｐ
典型的に、標的（生物学的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）は、プローブ構成要素Ｐ及びＰＣよりも濃度がはるかに低く；Ｐ及びＰＣのより高い濃度は、反応を平衡に急速に駆動するのを助ける。反応の挙動を判断するための１つの有用な測定規準は、標的Ｔに対するプローブ系の収率又は感度であり、これは、
として表され得る。感度がおよそ５０％である場合、つまり、非結合Ｔの平衡濃度がＣに結合しているＴの平衡濃度に等しい（[T]=[TC]）場合、バリアント標的Ｖに対する倍数変化識別（[TC]/[VC]）は、最適の２倍以内である。[T]=[TC]を可能にする平衡定数Ｋｅｑの値は、以下の式によって分析的に解かれ得る。
反応の標準自由エネルギーは、以下の式による反応平衡定数に関連があり得る。
上記の方程式では、[P]0は、プロテクターの最初の濃度を意味し、[C]0は、相補物の最初の濃度を意味する。標的濃度[T]は、典型的に、プロテクター又はプローブの濃度よりもはるかに低いので、[P]及び[PC]の平衡濃度は、それぞれ、[P]0-[C]0及び[C]0に近似し得る。項
は、スケールが不変であり、したがって、[P]0及び[C]0に使用される濃度は、試料に加えられた高ストック濃度、又は試料による希釈後に達成される最終濃度とすることができる。[P]０及び[C]０が部分的に二本鎖のＰＣ種に存在するものを含めた、Ｐ及びＣの総濃度を表すことに注目されたい。この式を書く代替の方法は、（[Pfree]0/[PC]0）であり、ここで、[Pfree]0は、遊離のＰの最初の濃度を意味し、[PC]0は、ＰＣの最初の濃度を意味する。
本プローブ系における使用に関して、[P]0に関する濃度は、[C]0に関する濃度よりも低い、同じ、又はこれより大きくてもよいが、一般に、これより大きい。例えば、[P]0に関する濃度は、[C]0の濃度の約１.０１倍〜約１０，０００倍、[C]0の濃度の約１.１倍〜約１，０００倍、又は[C]0の濃度の約１.２倍〜約１００倍とすることができ、上記で提供された範囲のいずれかの間の任意の中間の範囲を含む。
一例では、プローブ挙動は、ΔG°rxnが０に近い、又は約−５ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約＋５ｋｃａｌ／ｍｏｌであるようにプローブ系を設計し、次いで、[P]0及び[C]0を
が満たされるように調節することによって、約５０％の感度を達成するように調整され得る。重要なことに、塩基対／スタックの追加又は除去を通してΔG°rxnを調節することの粗視化性質により、[P]0及び[C]0を通してプローブ系を調整することなしに、５０％の感度（又は任意の他の望ましい感度）を得ることは実際に不可能になる。
図６は、単一の追加の塩基対がΔG°rxnの値を３７℃、１Ｍ Ｎａ＋で−０.６ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−２.２ｋｃａｌ／ｍｏｌ変化させることを実証している。
したがって、本開示では、プロテクターＰ対相補物Ｃの化学量論比を通したΔG°rxnの微調整の新規な概念が提供される。ＰとＣの間の化学量論比の精度は、液体取扱いシステムの精度（例えばピペッター精度）によってのみ限定され、典型的に、２％以内に制御され得る。化学量論のこの２％精度は、次には、プローブパフォーマンス-Rτln(1.02)＝−０．０１２ｋｃａｌ／ｍｏｌを調整するΔG°rxnにおける解決と同じ正確さをもたらす。したがって、Ｐ対Ｃ化学量論を通して熱力学を調整することは、追加の塩基対を通して熱力学を調整する従来技術方法よりも５０倍を超えてきめの細かい（−０.０１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ対−０.６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。Ｐ及びＣ化学量論の調整は、設計段階で、又はプローブが特定の適用に反復して最適化されているので動的に生じ得る。
図２２及び２３に提供された実験的結果は、特異度／感度トレードオフを調整するために、比([P]0ｏ-[C]0)/[C]0を調節する有効性を実証している。図２２は、ＤＮＡ標的に向けられた４つの異なるプローブの配列設計を示し、それぞれ異なるΔG°rxn及び([P]0-[C]0)/[C]0の異なる値に関する各プローブへのＤＮＡ標的の観察された収率で設計されている。図２３は、ＲＮＡ標的に向けられた５つの異なるプローブの配列設計を示し、それぞれ異なるΔG°rxn及び([P]0ｏ-[C]0)/[C]0の異なる値に関する各プローブへのＲＮＡ標的の観察された収率で設計されている。以前教示したように、([P]0-[C]0)/[C]0のより大きい値は、標的とプローブの間のハイブリダイゼーションの収率を単調に低下させる。
別の態様では、本開示は、
が満たされないが、その代わりに、特異度と感度の間の異なるトレードオフを達成するために、値が等しくないわずかな変動を提供するプローブ系を提供する。この目的のために、本プローブ系の熱力学的性質は、以下の
によって表され得、ここで、Ｘは、０からの逸脱である。一例では、Ｘの値は、約−５ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約＋５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。Ｘの正の値に関して、特異度（標的バリアントＶに対する）は、改善させることになるが、感度（収率）は、減少することになる。図８に実証されるように、Ｘの負の値に関して、感度は、改善されることになるが、特異度は、減少することになる。実際には、いくつかの適用（まれな対立遺伝子を扱うものなど）は、感度を犠牲にしてより高い特異度を必要とし得、逆の場合も同様である。熱力学を微調整する本方法は、感度及び特異度の複雑な制御を必要とするこれらの適用に特に有用である（バリアントも参照されたい）。
さらに別の態様では、本開示は、標的−バリデーションと標的−相同領域の間の少数の配列差を提供する。（標的Ｔの）標的−バリデーション領域及び（プロテクターＰの）標的−相同領域は、どちらも（相補物Ｃの）標的−相同−相補領域に相補的であることが意図されている。しかしながら、標的−バリデーション及び／又は標的−相同領域が標的−相同−相補領域に部分的にのみ相補的であるように、標的−バリデーション及び／又は標的−相同領域における少数の配列修飾を有することが望ましい場合があり得る。この目的のために、６０％を超える標的−相同−相補領域における塩基が標的−バリデーション領域に相補的であり、６０％を超える標的−相同−相補領域における塩基が標的−相同領域に相補的である例では、生じるプローブは、本明細書で記載されたプローブ構築の原則との一貫性を維持する。
さらに、本開示は、図７に示されるように、プロテクター及び相補物の５’から３’向きが非相同及びトーホールド領域の位置に関して逆にされたプローブ系を提供する。現代の核酸合成は、３’末端から５’末端に生じ、５’末端に集中したトランケーション及び欠失をもたらす。プロテクター及び相補物上のトランケーションは、エネルギー的に互いにバランスを保つ傾向があり、望ましいΔG°rxnを維持することになるので、結果的に、図１〜６に示された本来の向きが望ましいことが予想される。対照的に、図７に示された設計向きでは、プロテクターと相補物の両方におけるトランケーションは、ΔG°rxnをより負にし、プローブ系の信頼性及び特異性を減少させることになる傾向がある。これらの効果は、プロテクター及び相補オリゴヌクレオチドが高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）などによって合成後に精製される場合、軽減される。
反応標準自由エネルギー（ΔG°rxn）の分析では、非構造化オリゴヌクレオチドの形成ΔG°の標準自由エネルギーは、０であると定義される。標的Ｔとプローブ系（Ｐ及びＣ）の間の反応の平衡定数（Ｋｅｑ）は、以下の式を通して反応の標準自由エネルギーΔG°rxnから直接計算され得：
ここで、Ｒ＝８．３１４Ｊ／ｍｏｌＫは、理想気体定数（代わりに、Boltzmann定数）であり、τは、ケルビンでの周囲温度である。
本プローブ系の設計では、反応ΔG°rxnは、相補鎖から標的鎖への及び相補鎖からプロテクター鎖への様々な領域のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを意味するいくつかのΔG°項の和に分解される（例えば、ΔG°nh-PCは、標的−非相同−相補物領域への標的−非相同領域のハイブリダイゼーションを意味する）。現在の文献提供標準自由エネルギー値は、不完全であり、限定された精度のものであるけれども、これらの項の値は、本明細書で以下にさらに詳細に記載される塩基スタックの標準自由エネルギーを加えることによっておよそ計算され得る。実験的試験が各プローブに関するΔG°rxnの真の値を決定するために必要であるが、文献ガイド値は、ΔG°rxnのおおよその（典型的に、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ又は１５％以内）概算を提供する。
一例では、本プローブ系の領域間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーは、塩基対スタッキング手法に基づいて計算される。この方法では、２つの隣接する塩基対は、定義されたエンタルピー（ΔH°）及びエントロピー（ΔS°）値を有する１つのスタックを含む。特定の温度τ（ケルビンでの）での各スタック（ΔG°）の標準自由エネルギーは、方程式ΔG°=ΔH°-τΔS°から計算され得る。いくつかのスタックの標準自由エネルギーは、結合領域の標準自由エネルギーを評価するために合計され得る。例えば、「GAG」領域と対になる「CTC」領域の標準自由エネルギーは、スタック「CT/GA」の標準自由エネルギープラススタック「TC/AG」の標準自由エネルギーである。３７℃で１Ｍ Ｎａ＋では、スタック「CT/GA」の標準自由エネルギーは、−１.２８ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、スタック「TC/AG」の標準自由エネルギーは、−１.３０ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、その結果、「GAG」と対になる「CTC」の標準自由エネルギーは、−２.５８ｋｃａｌ／ｍｏｌである。
SantaLucia and Hicksによる公開された研究に基づくＤＮＡ−ＤＮＡスタックのΔH°及びΔS°値が表１に示される。Sugimoto et al.による公開された研究に基づくＲＮＡ−ＤＮＡスタックの標準エンタルピー変化及び標準エントロピー変化が表２に示される。Turner et al.による公開された研究に基づくＲＮＡ−ＲＮＡスタックの標準エンタルピー変化及び標準エントロピー変化が表３に示される。塩基スタックに関するΔH°の値は、塩分濃度にかかわらず同じであると文献において認められている。対照的に、塩基スタックのΔS°は、カチオンの静電遮蔽性質により、ヌクレオチド塩基同一性にかかわらず０．３６８＊ｌｎ（［Ｎａ＋］）ｃａｌ／ｍｏｌ＊Ｋによって調節される。さらに、二価カチオン（Ｍｇ２＋など）も反応溶液において使用され得；塩基対形成熱力学に及ぼす二価カチオンの効果がOwczarzy, Biochemistry, 2008によるものなどの文献に報告されている。最後に、ホルムアミドなどの変性剤が、特にインサイツのハイブリダイゼーション適用に関してハイブリダイゼーション反応を促進するために使用され得る。核酸塩基対形成熱力学の目的に関して、水がホルムアミドと置き換えられる各パーセント（％）が温度を０.６℃効果的に増加させることが文献で報告されており、Blake and Delcourt, Nucleic Acids Research, 1996を参照されたい。
一例では、本プローブ系の様々な領域に関するハイブリダイゼーションの反応標準自由エネルギー（式１又は３からのΔG°rxn）が以下に記載されたように計算される。
ΔG°t-TC（標的−トーホールド−相補領域（領域１）への標的−トーホールド−領域（領域６）のハイブリダイゼーション）は、２つの核酸分子をハイブリダイゼーションに向けるエントロピック損失により、全てのトーホールド領域核酸スタック、隣接するスタックの標準自由エネルギー及び開始エネルギーペナルティー（ΔG°ini）を合計することによって構成される。ΔG°iniの値は、ΔG°=ΔH°-τΔS°を通してΔH°ini及びΔS°iniから計算され得る。
表１に提供されたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションに関して、ΔH°ini＝０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ及びΔS°ini＝−５．７ｃａｌ／（ｍｏｌ・Ｋ）。表２に提供されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションに関して、ΔH°ini＝１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ及びΔS°ini＝−３．９ｃａｌ／（ｍｏｌ・Ｋ）。表３に提供されたＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに関して、ΔH°ini＝０．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ及びΔS°ini＝−１０．８ｃａｌ／（ｍｏｌ・Ｋ）。
一例では、本明細書で記載されたプローブは、操作条件で約−２ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−１６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−５ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−１３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は約−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔG°t-TCを有する。
ΔG°nh-PC（相補物Ｃの標的−非相同−相補領域３へのプロテクターＰの標的−非相同領域５のハイブリダイゼーション）は、非相同領域における全てのスタックの標準自由エネルギー、相同領域上の隣接するスタック、及びハイブリダイゼーション開始エネルギーΔG°iniを合計することによって構成される。各スタック標準自由エネルギー項及び開始標準自由エネルギー項は、上で考察された方法に基づいて計算される。
ΔG°v-TC（相補物Ｃの標的−相同−相補領域２への標的Ｔの標的−バリデーション領域７のハイブリダイゼーション）は、標的−バリデーション領域における全ての核酸スタックの和に等しい。各標準自由エネルギー項は、本明細書で上で考察された方法に基づいて計算される。この例では、開始エネルギーΔG°iniは、この項の計算に適用されない。
ΔG°h-PC（相補物Ｃの標的−相同−相補領域２へのプロテクターＰの標的−相同領域４のハイブリダイゼーション）は、標的−相同領域における全ての核酸スタックの和に等しい。各標準自由エネルギー項は、本明細書で上で考察された方法に基づいて計算される。この例では、開始エネルギーΔG°iniは、この項の計算に適用されない。
一例では、標的−トーホールド−相補領域（領域１）と標的−トーホールド領域（領域６）間及び標的−相同−相補領域（領域２）と標的−バリデーション領域（領域７）の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーの和（ΔG°t-TC+ΔG°v-TC）は、−７ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも負、例えば、約−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−７０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、及び−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌである。この例又は他の例では、標的−非相同−相補領域（領域３）と標的−非相同領域（領域５）の間及び標的−相同領域（領域４）と標的−相同−相補領域（領域２）の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーの和（ΔG°nh-PC+ΔG°h-PC）は、−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも負、例えば、約−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−７０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、及び−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌである。
酵素を含まない核酸検出系に加えて、本開示のプローブは、例えば、ホットスポット多重化ＰＣＲ反応におけるプライマーとして、ＰＣＲ適用又は他の等温性増幅系に有用である。プローブをＰＣＲ反応に適用する場合、望ましくない増幅は、慎重な設計及び微調整後に最小化され得る。したがって、非同一標的に関する２又は３以上のプライマー系がホットスポット多重化ＰＣＲのための１つの溶液中に組み合わされ得る。ホットスポット多重化ＰＣＲの概略図が図２１に示される。１つの多重化群における標的の配列は、プライマー系の高特異性特徴により、高度に類似し得る。プライマーセットにおける各プライマー系に関する設計プロセスは、上記のプローブのものと同じである。各プライマー系の特異度及び感度は、実験的結果に従って調節される。ホットスポット多重化ＰＣＲに関するプライマー系の例が図２２に示される。
一実施形態では、ＰＣＲ又は他の等温性増幅系に関するシグナル発生方法は、フルオロフォア修飾相補物及びクエンチャー修飾プロテクターを使用することである。プロテクターは、増幅が進行するにつれて相補物から脱離するので、蛍光シグナルは、増幅された標的のコピー数と比例する。種々の標的が、スペクトル非オーバーラップフルオロフォアを使用することによって同時に定量化され得る。類似したシグナル発生方法は、図２５に示されるように、自己報告プライマーとしてフルオロフォア修飾相補物及びクエンチャー修飾プロテクターを使用することである。従来のTaqManプローブに類似している別のシグナル発生方法は、図２６に示されるように、検出プローブとしてフルオロフォア−及びクエンチャー修飾相補物並びに非修飾プロテクターを使用することである。多重化の設定では、種々のフルオロフォアを有するプローブが種々の望ましい標的に使用され得る。各TaqManプローブが１つの標的にのみ特異的に結合し、他の標的の反応に干渉しないように、望ましい標的が高度に異なる場合のみ適用され得る従来のTaqManプローブとは異なり、本開示で示されたTaqMan様プローブは、類似した標的を識別するのにユニークに有利であり得る。
本明細書で記載された各プローブ系は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそのアナログ、及び／又はその組合せからなり得る。いくつかの例では、プローブ系は、１又は２以上の非天然ヌクレオチドを含む。プライマー中の非天然ヌクレオチドの組込みは、塩基あたりの結合親和性の改善及びヌクレアーゼ抵抗性の増加を提供することなどによって、プローブ系のパフォーマンスをさらに増大させ得る。
本明細書で記載されたプローブ系は、酵素反応の開始との関連でも適用され得；かかる使用では、組成物及び作用の方法は同じままであるけれども、プローブ系は、プライマー系と称される。本開示で記載されたプライマー系は、高特異性及びパフォーマンスの微調整に関する能力を有し、核酸の酵素アッセイへの利点を提供する。
いくつかの例では、本明細書で記載されたプライマーは、ＤＮＡ鋳型の複製のためのポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの産生のための転写、及びＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの産生のための逆転写、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ，Nucleic Acid Sequence Based Amplification）、ループ媒介等温性増幅（ＬＡＭＰ，Loop mediated isothermal Amplification）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ，Helicase-Dependent Amplification）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ，Recombinase Polymerase Amplification）、等温性指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ，isothermal Exponential Amplification Reaction）、ニック形成酵素増幅反応（ＮＥＡＲ，Nicking Enzyme Amplification Reaction）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ，Rolling Circle Amplilfication）、及び転写媒介増幅（ＴＭＡ，Transcription Mediated Amplification）などの等温性ＤＮＡ及びＲＮＡ増幅方法を含むが、これらに限定されない、ポリメラーゼ伸長のための起始点として役立つ。本明細書で開示されたプライマーの高特異性性質により、それらは、特定の配列を有する核酸のサブセットのみが伸長され、増幅される研究及び臨床適用に適したものとなる。
本明細書で記載されたプローブ系に関する「標的」は、熱ショック、不斉増幅、競合的結合、及び当技術分野で標準的な他の方法を通して一本鎖にされた二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを含めた一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡなどの任意の一本鎖核酸とすることができる。プライマー系に関する「標的」は、任意の一本鎖（ｓｓ）又は二本鎖（ｄｓ）核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は逆転写に供されたＲＮＡのＤＮＡ産物とすることができる。一部の例では、標的は、ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物（キメラ）とすることができる。他の例では、標的は、人工的核酸アナログ、例えば、ペプチド核酸（Nielsen et al. Science 254(5037): 1497-500 (1991)）又はロックド核酸（Alexei et al. Tetrahedron 54(14): 3607-30 (1998)）を含む。一部の例では、標的は、自然発生（例えば、ゲノムＤＮＡ）であっても、又はそれは、合成（例えば、ゲノムライブラリーから）であってもよい。本明細書では、「自然発生」核酸配列は、ヒトの介入の非存在下で天然に存在する生物又はウイルスの核酸分子に存在する配列である。一部の例では、標的は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、プロマイクロＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、後成的に修飾されたＤＮＡ、後成的に修飾されたＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ又はｐｉｗｉ−ＲＮＡである。いくつかの例では、標的核酸は、生物又はウイルスに天然に生じる核酸である。一部の例では、標的核酸は、病原性生物又はウイルスの核酸である。いくつかの例では、対象における標的核酸の存在又は非存在は、対象が疾患又は障害を有する、又は疾患若しくは障害にかかりやすい素因をもっていることを示す。いくつかの例では、対象における標的核酸の存在又は非存在は、対象が疾患又は障害を処置するための薬物などの処置に対してよく又は貧弱に応答することになることを示す。いくつかの例では、対象における標的核酸の存在又は非存在は、以前がんに関して処置され、寛解にある対象ががん再発のリスクにあり得ることを示す。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸分子」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそのアナログの多量体型を表す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、任意の機能を行い得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード又は非コード領域、連鎖分析から定義される座位、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾が多量体の構築前又は後に行なわれ得る。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素とのコンジュゲーションなどによって、さらに修飾され得る。「組換え」ポリヌクレオチドという用語は、天然に生じない又は非天然配置の別のポリヌクレオチドに連結しているゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。「単離核酸」という用語は、（１）「単離核酸」が天然に見出される細胞と結合していない、及び／又は（２）それが天然に連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結している天然若しくは合成起源又はそのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを表す。
核酸は、一及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに修飾塩基、糖及び主鎖を含有する代替の核酸の任意の及び全ての形も包含し得る。したがって、「核酸」という用語は、一若しくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ（及び部分的に一本鎖又は部分的に二本鎖とすることができるその形）、ｃＤＮＡ、アプタマー、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）、２’−５’ＤＮＡ（ＤＮＡのＡコンフォメーションにマッチする塩基スペーシングを有する短縮された主鎖を有する合成物質；２’−５’ＤＮＡは、Ｂ形のＤＮＡと通常ハイブリダイズしないことになるが、それはＲＮＡと容易にハイブリダイズすることになる）、及びロックド核酸（「ＬＮＡ」）を含むが、これらに限定されないことが理解されよう。核酸アナログは、結合の類似又は改善、塩基対形成性質のハイブリダイゼーションを有する天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む。プリン及びピリミジンの「アナログ」形は、当技術分野で既知であり、アジリジニルシトシン、４−アセチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ．ｓｕｐ．６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、及び２，６−ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない。本明細書で提供されたＤＮＡ主鎖アナログは、米国特許第６，６６４，０５７号明細書において考察されているように、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネート結合又は交互のメチルホスホネート及びホスホジエステル結合（Strauss-Soukup, 1997, Biochemistry 36:8692-8698）、及びベンジルホスホネート結合を含み；OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES, A PRACTICAL APPROACH, edited by F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991)；Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, Eds. Baserga and Denhardt (NYAS 1992)；Milligan, 1993, J. Med. Chem. 36: 1923-1937；Antisense Research and Applications (1993, CRC Press)も参照されたい。本明細書で、核酸は、当業者に既知の任意の手段に従って、細胞から抽出又は合成的に調製され得る；例えば、核酸は、化学的に合成され得る、又は他の供給源の中でも、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡから転写又は逆転写され得る。
本明細書で利用される標的核酸は、任意の核酸、例えば、ヒト核酸、細菌核酸、又はウイルス核酸とすることができる。標的核酸試料又は標的核酸を含む試料は、例えば、全血、全血から抽出された核酸、血漿、血漿から抽出された核酸、痰、便、尿、頬若しくは鼻スワブ、細胞、組織、又は体液を含むが、これらに限定されない、１又は２以上の生物学的試料からの核酸試料とすることができる。標的生物学的試料は、真核生物、植物、動物、脊椎動物、魚、哺乳動物、ヒト、非ヒト、細菌、微生物、ウイルス、生物学的供給源、血清、血漿、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、羊水、生検材料、針穿刺吸引生検材料、がん、腫瘍、組織、細胞、細胞ライセート、粗細胞ライセート、組織ライセート、組織培養細胞、頬側スワブ、口腔洗浄薬、便、ミイラ化組織、法医学的源、剖検材料、考古学的源、感染体、院内感染体、産生源、薬物調製物、生物学的分子産物、タンパク質調製物、脂質調製物、炭水化物調製物、無生物、空気、土壌、汁液、金属、化石、掘り出された物質、並びに／又は他の地球若しくは地球外物質及び源を含むが、これらに限定されない、任意の供給源由来とすることができる。試料は、１つの供給源又は種々の供給源からの物質の混合物も含有し得る。例えば、感染細菌又はウイルスの核酸は、かかる感染した細胞又は組織からの核酸が開示された方法を使用して増幅される場合、ヒト核酸と共に増幅され得る。有用な標的試料の型は、真核生物試料、植物試料、動物試料、脊椎動物試料、魚試料、哺乳動物試料、ヒト試料、非ヒト試料、細菌試料、微生物試料、ウイルス試料、生物学的試料、血清試料、血漿試料、血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針穿刺吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞ライセート試料、粗細胞ライセート試料、組織ライセート試料、組織培養細胞試料、頬側スワブ試料、口腔洗浄薬試料、便試料、ミイラ化組織試料、剖検試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、産生試料、薬物調製物試料、生物学的分子産生試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、炭水化物調製物試料、無生物試料、空気試料、土壌試料、汁液試料、金属試料、化石試料、掘り出された物質試料、及び／又は他の地球若しくは地球外試料を含む。一部の例では、本明細書で利用される標的核酸は、反復配列、二次構造、及び／又は高G/C含有量を含む。
いくつかの例では、所望の標的核酸分子は、長さが約１９〜約１，０００，０００ヌクレオチド（ｎｔ）である。一部の例では、標的は、長さが約１９〜約１００、約１００〜約１０００、約１０００〜約１０，０００、約１０，０００〜約１００，０００、又は約１００，０００〜約１，０００，０００ヌクレオチドである。一部の例では、標的は、長さが約２０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１，０００、約２，０００、約３，０００、約４，０００、約５，０００、約６，０００、約７，０００、約８，０００、約９０００、約１０，０００、約２０，０００、約３０，０００、約４０，０００、約５０，０００、約６０，０００、約７０，０００、約８０，０００、約９０，０００、約１００，０００、約２００，０００、約３００，０００、約４００，０００、約５００，０００、約６００，０００、約７００，０００、約８００，０００、約９００，０００、又は約１，０００，０００ヌクレオチドである。標的核酸がより長い核酸（例えば、染色体又は染色体断片内のコード配列又は遺伝子など）との関連で提供され得ることが理解されるべきである。
いくつかの例では、所望の標的は、直鎖状である一方、他の例では、標的は、環状である（例えば、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又は色素体ＤＮＡ）。
一部の例では、プライマー−標的系が本明細書で提供される。プライマー−標的系は、１又は２以上の核酸標的、ポリメラーゼ、及び１又は２以上のプライマー（例えば、プライマー二重鎖）を含む。「プライマー」という用語は、本明細書で記載されたプライマー又はプライマー系のいかなるものも包含する。いくつかの例では、本明細書で記載されたプライマー−標的系は、複数の異なるプライマーを含む。一部の例では、プライマー−標的系は、標的核酸分子を同定し、例えば、増幅するために使用され得る少なくとも２つのプライマーを含み得る。標的核酸分子は、例えば、単一コピーとして又は低コピー数で複数の非標的核酸分子の中に存在し得る。本明細書で記載されたプライマー−標的系のいかなるものも、核酸増幅又は配列決定反応において使用されるものに類似した条件（例えば、類似した試薬、反応温度など）を含み得る。
（１）標的−相同−相補領域（領域２）、標的−非相同−相補領域（領域３）、及び標的−トーホールド−相補領域（領域１）を有する少なくとも１つの相補鎖、並びに（２）標的−相同領域（領域４）及び標的−非相同領域（領域５）を有する少なくとも１つのプロテクター鎖を含むキットが本明細書で提供される。（１）標的−相同−相補領域、標的−非相同−相補領域、及び標的−トーホールド−相補領域を有する少なくとも１つの相補鎖、並びに（２）標的−相同領域及び標的−非相同領域を有する少なくとも１つのプロテクター鎖を含む少なくとも１つのプライマー二重鎖を含むキットが本明細書で提供される。
本明細書で記載されたキットのいかなるものも逆転写酵素を含めたポリメラーゼをさらに含み得る。本明細書で提供されたキットのいかなるものも緩衝液（例えば、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、トリス−ＨＣｌ）、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、及び水から選択される１又は２以上の薬剤をさらに含み得る。本明細書で提供されたキットのいかなるものもプライマーのモル過剰であるプロテクター鎖を含み得る。本明細書で提供されたキットのいかなるものもキットの構成要素を使用するための説明書又は説明書を得るための指導（例えば、ウェブサイトから）をさらに含み得る。本明細書で提供されたキットのいかなるものも少なくとも１つの反応管、ウェル、チャンバーなどをさらに含み得る。
別段の指示がない場合、本明細書及び特許請求の範囲において使用される分子量、反応条件などの成分、性質の量を表す全ての数は、「約」という用語によって全ての例において改変されると理解されるべきである。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示された数的パラメーターは、本発明によって得られることが探求される望ましい性質に依存して変動し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲の均等物の学説の適用を限定する試みとしてではなく、各数的パラメーターは、報告された有効桁の数を踏まえ、通常の丸め技法を適用することによって少なくとも考慮されるべきである。
「ａ」又は「ａｎ」という単語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む」という用語と共に使用される場合、「１」を意味し得るが、それは、「１又は２以上」、「少なくとも１」及び「１又は１を超える」の意味とも一致する。本明細書では、「別の」は、少なくとも第２以上を意味し得る。
本明細書で考察されたいかなる例も本発明の任意の方法又は組成物に関連して実行され得、逆の場合も同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用され得る。
本適用にわたって、「約」という用語は、値がデバイスに関する誤差の固有の変動を含むことを示すために使用され、方法は、研究対象間に存在する値、又は変動を決定するために用いられる。
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを表すことが明確に示されない又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用される。
本明細書及び特許請求の範囲では、「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの含む（comprising）の任意の形）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」などの有する（having）の任意の形）、「含む（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」などの含む（including）の任意の形）、又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」などの含有する（containing）の任意の形）という単語は、包括的又は開放型であり、追加の、列挙されていないエレメント又は方法ステップを排除しない。
本発明のよりよい理解を促進するために、特定の例の以下の例が与えられる。以下の例は、決して、本発明の範囲全体を限定する又は定義すると解釈されるべきではない。
［実施例］
ＲＮＡ標的へのＤＮＡプローブ系の１２の例を図９〜２０に示す。
ＲＮＡ標的へのＤＮＡプローブ系の１２の例を図９〜２０に示す。
以下の例は、設計原則を実証し、種々の領域に関する反応標準自由エネルギー（ΔG°）計算の数学的処理を例示し、本開示において記載された方法において生成される典型的なプローブ系を例証する。これらの代表的な例は、種々の生物学的標的配列の範囲をカバーし、いくつかの異なる操作温度及び塩分濃度に関して算出される。実施例１１は、変性剤ホルムアミドの濃度において作動することが意図されたプローブの設計をさらに示す。式２の標準自由エネルギー値に等しい式１の標準自由エネルギー値を満たすために必要な化学量論比[P]0/[C]0も与える。
実施例１は、図９に示された、標的核酸ＢＲＡＦ １１〜３０に向けられたプローブを提供する。３７℃、１Ｍ Ｎａ＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°h-PC）；（２）プロテクト鎖Pの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。最後に、Ｘ値は、相当する化学量論比がそれぞれ、０．００、１．４２、及び−１．２７ｋｃａｌ／ｍｏｌであると仮定して、式１に等しい値を得るための式２における変動を提供する。
実施例２は、図１０に示された、標的核酸ＢＲＡＦ ７１〜９０に向けられたプローブを提供する。３７℃、１Ｍ Ｎａ＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°h-PC）；（２）プロテクト鎖Ｐの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。
実施例３は、図１１に示された、標的核酸ＢＲＡＦ １３１〜１６０に向けられたプローブを提供する。３７℃、１Ｍ Ｎａ＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°h-PC）；（２）プロテクト鎖Ｐの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。
実施例４は、図１２に示された、標的核酸ＢＲＡＦ １９１〜２２０に向けられたプローブを提供する。５２℃、１Ｍ Ｎａ＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°h-PC）；（２）プロテクト鎖Ｐの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。
実施例５は、図１３に示された、標的核酸ＢＲＡＦ ２５１〜２８０に向けられたプローブを提供する。６５℃、１Ｍ Ｎａ＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°h-PC）；（２）プロテクト鎖Ｐの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。
実施例６は、図１４に示された、標的核酸ＢＲＡＦ ３１１〜３５０に向けられたプローブを提供する。５２℃、１Ｍ Ｎａ＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°h-PC）；（２）プロテクト鎖Ｐの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。
実施例７は、図１５に示された、標的核酸ＢＲＡＦ ４３１〜４６０に向けられたプローブを提供する。６５℃、１Ｍ Ｎａ＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°h-PC）；（２）プロテクト鎖Ｐの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。
実施例８は、図１６に示された、標的核酸ＢＲＡＦ ４９１〜５２０に向けられたプローブを提供する。３７℃、１Ｍ Ｎａ＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（２）プロテクト鎖Pの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。
実施例９は、図１７に示された、標的核酸ＢＲＡＦ ５５１〜５８０に向けられたプローブを提供する。３７℃、１Ｍ Ｎａ＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°h-PC）；（２）プロテクト鎖Ｐの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。
実施例１０は、図１８に示された、標的核酸ＢＲＡＦ ６１１〜６３０に向けられたプローブを提供する。２５℃、１Ｍ Ｎａ＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°h-PC）；（２）プロテクト鎖Ｐの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。
実施例１１は、図１９に示された、標的核酸ＢＲＡＦ ６７０〜７００に向けられたプローブを提供する。３０％ホルムアミド中の２５℃、１Ｍ Ｎａ＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°h-PC）；（２）プロテクト鎖Ｐの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。
実施例１２は、図２０に示された、ＤＮＡ標的核酸に向けられたプローブを提供する。６２℃、３ｍＭ Ｍｇ２＋での標的へのプローブのハイブリダイゼーションに関する以下のΔG°値を表４に提供する：（１）プロテクター鎖Ｐの標的相同領域４への相補鎖Ｃの標的相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°h-PC）；（２）プロテクト鎖Ｐの標的−非相同領域５への相補鎖Ｃの標的−非相同−相補領域３のハイブリダイゼーション（ΔG°nh-PC）；（３）標的Ｔの標的−バリデーション領域７への相補鎖Ｃの標的−相同相補領域２のハイブリダイゼーション（ΔG°v-TC）；（４）標的Ｔの標的−トーホールド領域６への相補鎖Ｃの標的−トーホールド−相補領域１のハイブリダイゼーション（ΔG°t-TC）；及び（５）ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)（式１）であるΔG°rxn。さらに、式１によるΔG°rxnによって提供される値が式２によって与えられるものと同一である値を有することを可能にする化学量論比（[P]0/[C]0）も表４に提供する。
本発明の広範囲を定める数的範囲及びパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の例で定められた数的値が可能な限り正確に報告されている。しかしながら、いかなる数的値も、それらのそれぞれの試験測定値に見出される標準偏差及び文献報告値における実験誤差から必然的に生じるいくらかの誤差を本質的に含有する。
したがって、本発明は、言及された目的及び利点並びにそこに本来備わっているものを達成するためにうまく適応される。多数の変化が当業者によって加えられ得るが、かかる変化は、添付の特許請求の範囲によって部分的に例証される本発明の精神内に包含される。
Claims (80)
- 第１の領域、第２の領域及び第３の領域を含む、第１の濃度の第１の核酸鎖；
第４の領域及び第５の領域を含む、第２の濃度の第２の核酸鎖
を含む、標的核酸分子との選択的相互作用のための組成物であって、
前記標的核酸分子が、第６の領域及び第７の領域を含み、
前記第１及び第２の濃度が、前記組成物と前記標的核酸分子の間の相互作用が式２によって決定される標準自由エネルギーの５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内の、式１によって決定される標準自由エネルギーを有するようなものであり、ここで、式２の[P]0項が、前記第２の濃度に等しく、式２の[C]0項が、前記第１の濃度に等しく、
式１のΔG°t-TC項が、前記第６の領域と前記第１の領域の間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°nh-PC項が、前記第５の領域と前記第３の領域の間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°v-TC項が、前記第７の領域と前記第２の領域の間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°h-PC項が、前記第４の領域と前記第２の領域の間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表す、前記組成物。 - 第１の核酸鎖にコンジュゲートしている標識をさらに含む、請求項１に記載の組成物であって、前記標識が、有機フルオロフォア、ハプテン、ナノ粒子、及び放射性同位体からなる群から選択される、前記組成物。
- 第２の核酸鎖にコンジュゲートしている標識をさらに含む、請求項２に記載の組成物であって、前記標識が、有機フルオロフォア、ハプテン、ナノ粒子、及び放射性同位体からなる群から選択され、式３が式１の代わりに用いられる、前記組成物。
- 第２の濃度が、第１の濃度の約１.０１倍〜約１０，０００倍である、請求項１に記載の組成物。
- 第２の濃度が、第１の濃度の約１.１倍〜約１０００倍である、請求項１に記載の組成物。
- 第２の濃度が、第１の濃度の約１.２倍〜約１００倍である、請求項１に記載の組成物。
- 標的核酸分子がＲＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
- 第１の核酸鎖にコンジュゲートしている少なくとも２つの標識をさらに含む、請求項１に記載の組成物であって、前記標識が、前記第１の核酸鎖が天然に暗くなるように互いに極めて接近している、前記組成物。
- 標的核酸分子がＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
- 第１又は第２の核酸鎖が、ＬＮＡ、ＰＮＡ、２’−Ｏ−メチルで置換されたＲＮＡ、ホスホロチオエートで置き換えられたＤＮＡ又はＲＮＡ Ｌ−ＤＮＡ、及びシュピーゲルマーからなる群から選択される合成核酸アナログを含む、請求項１に記載の組成物。
- ΔG°t-TC及びΔG°nh-PCに関する値が１０％を超えて異なる、又は１ｋｃａｌ／ｍｏｌを超えて異なる、請求項１に記載の組成物。
- 第１又は第２の核酸鎖が、合成又は天然ヌクレオチドアナログを含み、前記合成ヌクレオチドアナログが、イノシン、５’−ニトロインドール、メチル化されたヌクレオチド、イソシトシン及びイソグアニン、シュピーゲルマーヌクレオチド、並びにｘＤＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
- ΔG°t-TC-ΔG°nh-PCの値が−１ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜＋１ｋｃａｌ／ｍｏｌではない、請求項１に記載の組成物。
- 第１又は第２の核酸鎖が、合成ＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
- 第１又は第２の核酸鎖が、合成ＲＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
- 第２の領域が、第４の領域に完全に相補的である、請求項１に記載の組成物。
- ６０％を超える第２の領域のヌクレオチドが第４の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載の組成物。
- 第２の領域が、第７の領域に完全に相補的である、請求項１に記載の組成物。
- ６０％を超える第２の領域のヌクレオチドが第７の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載の組成物。
- 第１の領域が、第６の領域に完全に相補的である、請求項１に記載の組成物。
- ６０％を超える第１の領域のヌクレオチドが第６の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載の組成物。
- 第３の領域が、第５の領域に完全に相補的である、請求項１に記載の組成物。
- ６０％を超える第３の領域のヌクレオチドが第５の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載の組成物。
- ΔG°t-TCが、約−２ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−１６ｋｃａｌ／ｍｏｌである、請求項１に記載の組成物。
- ΔG°t-TCが、約−５ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−１３ｋｃａｌ／ｍｏｌである、請求項１に記載の組成物。
- ΔG°t-TCが、約−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌである、請求項１に記載の組成物。
- 第１の核酸鎖と第２の核酸鎖とが、部分的に二本鎖の核酸プローブを形成する、請求項１に記載の組成物。
- 過剰量の第２の核酸鎖をさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
- 操作上の温度及び塩分濃度条件において算出すると、第１の領域におけるヌクレオチドの５０％未満が、評価された最小自由エネルギー構造において二本鎖状態にある、請求項１に記載の組成物。
- 第１の核酸鎖と第２の核酸鎖とが、部分的に二本鎖の核酸プライマーを形成する、請求項１に記載の組成物。
- 過剰量の第２の核酸鎖をさらに含み、プライマーが１又は２以上の酵素との関連で使用される、請求項３０に記載の組成物。
- 以下のステップを含む方法。
核酸分子中の標的ヌクレオチド配列を選択するステップであって、前記標的ヌクレオチド配列が、第６のヌクレオチド部分配列、第７のヌクレオチド部分配列、及び第８のヌクレオチド部分配列を含む、ステップ；
第１のヌクレオチド部分配列、第２のヌクレオチド部分配列、及び第３のヌクレオチド部分配列を含む第１のヌクレオチド配列を選択するステップ；
第４のヌクレオチド部分配列及び第５のヌクレオチド部分配列を含む第２のヌクレオチド配列を選択するステップ；
式１を使用して標準自由エネルギーを計算するステップであって、式１のΔG°t-TC項が、前記第６の領域と前記第１の領域の間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°nh-PC項が、前記第５の領域と前記第３の領域の間のハイブリダイゼーションの前記自由エネルギーを表し、式１のΔG°v-TC項が、前記第７の領域と前記第２の領域の間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°h-PC項が、前記第４の領域と前記第２の領域の間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表す、ステップ；
式１を使用して計算された前記標準自由エネルギーが、所定の条件を満たすかどうかを決定するステップ；並びに
前記所定の条件が満たされる場合、前記第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸鎖及び前記第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸鎖を合成するステップ； - 式２を使用して標準自由エネルギーを計算するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法であって、所定の条件が、式２を使用して計算される前記標準自由エネルギーの５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内であることを含み、式２の項[C]0及び[P]0が、第１の核酸鎖及び第２の核酸鎖の所定の濃度をそれぞれ表す、前記方法。
- 式１によって決定される標準自由エネルギーが式２によって決定される標準自由エネルギーの５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内ではない場合、
以下のステップの少なくとも１つをさらに含むように、式１によって決定される前記標準自由エネルギーが式２によって決定される前記標準自由エネルギーの５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内になるまで少なくとも部分的に反復される、請求項３３に記載の方法。
（１）ヌクレオチド配列及び部分配列の新しいセットを選択するステップ；及び
（２）第１の核酸鎖又は第２の核酸鎖の少なくとも１つの所定の濃度を改変するステップ； - 所定の条件が、式１によって計算される標準自由エネルギーが約−４ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約＋４ｋｃａｌ／ｍｏｌであることを含む、請求項３２に記載の方法。
- 標的核酸分子との選択的相互作用のための組成物であって、
第１の領域、第２の領域、及び第３の領域を含む第１の核酸鎖であって、前記第１の領域が、前記標的核酸分子の第６の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有し、前記第２の領域が、前記標的核酸分子の第７の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する、前記第１の核酸鎖；並びに
第４の領域及び第５の領域を含む第２の核酸鎖であって、前記第４の領域が前記第２の領域の前記ヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有し、前記第５の領域が前記第３の領域の前記ヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する前記第２の核酸鎖
を含み、
前記組成物が、約−４ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約＋４ｋｃａｌ／ｍｏｌの前記標的核酸分子とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーを有し、ハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーが式１によって決定され、式１のΔG°t-TC項が、前記第１の領域と前記第６の領域の間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°nh-PC項が、前記第３の領域と前記第５の領域の間のハイブリダイゼーションの前記自由エネルギーを表し、式１のΔG°v-TC項が、前記第７の領域と前記第２の領域の間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°h-PC項が、前記第４の領域と前記第２の領域の間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表す、前記組成物。 - 第１の濃度の第１の核酸鎖及び第２の濃度の第２の核酸鎖を含む、請求項３６に記載の組成物であって、式１によって決定される標的核酸分子に関する前記組成物のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーが、約−４ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約＋４ｋｃａｌ／ｍｏｌではないが、代わりに式２によって決定されるハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーの３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内であり、式２の項[C]0及び[P]0が、前記第１の濃度及び前記第２の濃度をそれぞれ表す、前記組成物。
- 第２の濃度が、第１の濃度の約１.０１倍〜約１００倍である、請求項３７に記載の組成物。
- 第２の濃度が、第１の濃度の約１.１倍〜約１０倍である、請求項３７に記載の組成物。
- ΔG°t-TC-ΔG°nh-PCの値が−１ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜＋１ｋｃａｌ／ｍｏｌではない、請求項３６に記載の組成物。
- 第２の領域が、第４の領域に完全に相補的である、請求項３６〜４０のいずれかに記載の組成物。
- ６０％を超える第２の領域のヌクレオチドが第４の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、請求項３６〜４０のいずれかに記載の組成物。
- 第２の領域が、第７の領域に完全に相補的である、請求項３６〜４２のいずれかに記載の組成物。
- ６０％を超える第２の領域のヌクレオチドが第７の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、請求項３６〜４２のいずれかに記載の組成物。
- 第１の領域が、第６の領域に完全に相補的である、請求項３６〜４４のいずれかに記載の組成物。
- ６０％を超える第１の領域のヌクレオチドが第６の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、請求項３６〜４４のいずれかに記載の組成物。
- 第３の領域が、第５の領域に完全に相補的である、請求項３６〜４６のいずれかに記載の組成物。
- ６０％を超える第３の領域のヌクレオチドが第５の領域の整列したヌクレオチドに相補的である、請求項３６〜４６のいずれかに記載の組成物。
- ΔG°t-TCが、約−５ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−１５ｋｃａｌ／ｍｏｌである、請求項３６〜４８のいずれかに記載の組成物。
- ΔG°t-TCが、約−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−１３ｋｃａｌ／ｍｏｌである、請求項３６〜４８のいずれかに記載の組成物。
- ΔG°t-TCが、約−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌである、請求項３６〜４８のいずれかに記載の組成物。
- 第１の核酸鎖と第２の核酸鎖とが、部分的に二本鎖の核酸分子を形成し、第１の領域が、二次構造をほとんど又は全く有しない、請求項３６〜５１のいずれかに記載の組成物。
- 第１の領域と第６の領域との間、及び第２の領域と第７の領域との間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーの和（ΔG°t-TC+ΔG°v-TC）が、−１５ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも負である、請求項３６〜５２のいずれかに記載の組成物。
- 第３の領域と第５の領域との間、及び第４の領域と第２の領域との間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーの和（ΔG°nh-PC＋ΔG°h-PC）が、−１５ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも負である、請求項３６〜５３のいずれかに記載の組成物。
- 以下のステップを含む方法。
プローブを試料に適用して、標的核酸分子の存在又は量を決定するステップであって、前記プローブが、第１の核酸鎖及び第２の核酸鎖を含み、前記第１の核酸鎖が、第１の領域、第２の領域、及び第３の領域を含み、前記第１の領域が、前記標的核酸分子の第６の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有し、前記第２の領域が、前記標的核酸分子の第７の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有し、前記第２の核酸鎖が、第４の領域及び第５の領域を含み、前記第４の領域が、前記第２の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有し、前記第５の領域が、前記第３の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する、ステップ；及び
約４℃〜約７５℃の温度で操作して、前記標的核酸分子への前記プローブの急速なハイブリダイゼーションを可能にするステップ； - 追加の量の第１の核酸鎖又は第２の核酸鎖を試料に適用するステップをさらに含む、請求項５５に記載の方法であって、前記追加の量が、平衡収率を２％〜９８％に改変するのに十分である、前記方法。
- 平衡収率が５％〜９５％である、請求項５５又は５６に記載の方法。
- 平衡収率が１０％〜９０％である、請求項５５又は５６に記載の方法。
- 平衡収率が２０％〜８０％である、請求項５５又は５６に記載の方法。
- 平衡収率が約５０％である、請求項５５又は５６に記載の方法。
- 標的核酸分子がＲＮＡを含む、請求項５５〜６０のいずれかに記載の方法。
- 標的核酸分子がＤＮＡを含む、請求項５５〜６０のいずれかに記載の方法。
- 操作上の温度及び塩分濃度条件において算出すると、第１の領域におけるヌクレオチドの５０％未満が、評価された最小自由エネルギー構造において二本鎖状態にある、請求項５５〜６２のいずれかに記載の方法。
- 試料が生物学的試料である、請求項５５〜６３のいずれかに記載の方法。
- 方法が、標識によって直接的又は間接的に発生したシグナルを測定するステップをさらに含むように、前記標識又は他の化学的部分が、第１の核酸鎖にコンジュゲートしている、請求項５５〜６４に記載の方法。
- 標識が有機フルオロフォア、ハプテン、ナノ粒子、又は放射性同位体である、請求項６５に記載の方法。
- 方法が、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、第１の標識及び第２の標識を分離するステップ、及び
前記標識によって直接的又は間接的に発生したシグナルを測定するステップ
をさらに含むように、前記第２の標識又は他の化学的部分が、第１の核酸鎖にコンジュゲートしている、請求項６５又は６６に記載の方法。 - 反応条件がポリメラーゼ連鎖反応に十分である、請求項６７に記載の方法。
- 第３の核酸鎖が第１の核酸鎖にハイブリダイズしており、標識が前記第３の核酸鎖にコンジュゲートしているか、又はさもなければ前記第１第３の核酸鎖の部位に直接的又は間接的に動員される、請求項６４に記載の方法。
- 方法が、第１の鎖にコンジュゲートしている標識又は第２の鎖にコンジュゲートしている標識によって直接的又は間接的に発生したシグナルを測定するステップをさらに含むように、前記標識又は他の化学的部分が、前記第２の核酸鎖にコンジュゲートしており、その結果前記２つの標識の共局在が前記シグナルの強度を調節する、請求項５５〜６９に記載の方法。
- 式３が、式１の代わりに用いられる、請求項７０に記載の方法。
- 試料の温度が約２０℃〜約７０℃である、請求項５５に記載の方法。
- 試料の温度が約２５℃である、請求項５５に記載の方法。
- 試料の温度が約３７℃である、請求項５５に記載の方法。
- 試料の温度が約６０℃である、請求項５５に記載の方法。
- 変性剤又はクラウディング剤を試料に適用するステップをさらに含む、請求項５５に記載の方法であって、変性剤又はクラウディング剤が、ホルムアミド、エタノール、メタノール、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデカ硫酸ナトリウム、ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール、及びデキストランからなる群から選択される、前記方法。
- 以下のステップを含む、複数の標的核酸分子を選択的に増幅するための方法。
第１のプライマー及び第２のプライマーを試料に適用して、第１の標的核酸配列及び第２の標的核酸配列の前記試料中での存在又は量を決定するステップであって、前記試料への前記第１及び第２のプライマーの前記適用により反応混合物を生じ、前記第１及び第２の標的核酸配列が、それぞれ該配列中に第６の領域及び第７の領域を含み、
前記第１及び第２の標的核酸配列が、少なくとも５ヌクレオチドオーバーラップしており、それによってオーバーラップ領域を提供し、前記オーバーラップ領域内で、前記第１の標的核酸配列が前記第２の標的核酸配列とは１又は２ヌクレオチド異なり、
前記第１及び第２のプライマーが
第１の領域、第２の領域及び第３の領域を含む第１の濃度の第１の核酸鎖；
第４の領域及び第５の領域を含む第２の濃度の第２の核酸鎖；
をそれぞれ含み、
前記第１及び第２の濃度が、式２によって決定される標準自由エネルギーの５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内の式１によって決定される標準自由エネルギーで、前記第１のプライマーが前記第１の標的核酸配列と相互作用し、かつ前記第２のプライマーが前記第２の標的核酸配列と相互作用するようなものであり、
式２の[P]0項が、前記第２の濃度に等しく、式２の[C]0項が、前記第１の濃度に等しく、
式１のΔG°t-TC項が、前記第６の領域と前記第１の領域との間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°nh-PC項が、前記第５の領域と前記第３の領域との間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°v-TC項が、前記第７の領域と前記第２の領域との間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表し、式１のΔG°h-PC項が、前記第４の領域と前記第２の領域との間のハイブリダイゼーションの前記標準自由エネルギーを表す、ステップ；並びに
前記反応混合物を前記第１及び第２の標的核酸配列を増幅するのに十分な反応プロトコールに供するステップ； - 反応条件が、ポリメラーゼ連鎖反応に十分である、請求項７７に記載の方法。
- 第１及び第２のプライマーの第１又は第２の核酸鎖に標識がコンジュゲートしており、式３が式１の代わりに用いられる、請求項７７又は７８に記載の方法。
- 標識が有機フルオロフォア、ハプテン、ナノ粒子、及び放射性同位体からなる群から選択される、請求項７９に記載の方法。
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