JP2016539624A - 混合物から変異された核酸の富化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸化学及び核酸増幅の分野に関する。特に、本発明は、核酸における塩基対ミスマッチを検出できる化合物及び方法を用いての低量変異標的核酸の富化に関する。
ほとんどのヒト遺伝性疾患及び癌は、核遺伝子の突然変異により引起されることが知られている。一般的に、突然変異は、遺伝子座での特定の多型変異体であると思われる。突然変異は、しばしば点突然変異とも呼ばれる、単一のヌクレオチド差異であり得る。細胞及び組織レベルで、特定の遺伝子座での多型現象は、有意に変更された細胞挙動性を生じさせる可能性がある。しかしながら、比較的小さな細胞又は組織サンプルは、特定の遺伝子座を含む、数百万又は数十億のDNAを含むので、遺伝子座での多型変異体の範囲及び頻度の表示は、非常に低い頻度で潜在的に存在する対立遺伝子を検出する必要がある。ほとんどの場合、生物学的サンプルからの希突然変異の存在の検出は、莫大な過剰量の野生型DNAの同時存在のために、多大な課題を提供する。
本発明は、サンプル中の低量の対立遺伝子(例えば、変異体DNA)を富化し、そのような対立遺伝子の続く検出を可能にするための方法に向けられる。第1の側面によれば、本発明は、サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異体の富化方法に関し、前記核酸は単一のヌクレオチド位置で異なる、2種の変異体配列の形で存在し、ここで前記方法は、前記標的核酸を含むサンプルを提供し、ここで富化されるべき変異体が大過剰の他の変異体の中で低存在量でサンプルに存在し;標的核酸に対してモル過剰で存在する濃度で標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを提供し、ここが前記オリゴヌクレオチドは、親和性標的により結合され、そして好ましくは、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で一致し、そして他の変異体とは、単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し;標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、前記オリゴヌクレオチド及び前記標的核酸の何れかの変異体の一本鎖から成る二本鎖ポリヌクレオチドを生成し;前記二本鎖ポリヌクレオチドと、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドのみに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物とを接触させ、ここで前記化合物がさらに、前記ミスマッチ部位で前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を光により触媒することができ;前記二本鎖ポリヌクレオチドを光に供し、切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドをもたらし;切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド上の親和性標識を認識し、そしてそれに結合する親和性マトリックスに適用し;切断された二本鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、そして親和性マトリックスから前記変性された一本鎖を除去し;そして未切断ポリヌクレオチド二本鎖を変性する条件下で緩衝液を提供し;そして標的核酸の富化された変異体の一本鎖を含む緩衝液を集めることを含んで成る。1つの実施形態によれば、前記ミスマッチ層間化合物は、Rh(bpy)2(chrysi)3+、Rh(bpy)2(phzi)3+、又はそれらのそれぞれの類似体である。別の実施形態によれば、本発明は、標的核酸の富化された変異体を増幅し、そして検出する追加の工程に関する。
特にことわらない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者により通常理解される意味を有する。次の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的定義を、当業者に提供する:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);及びHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において使用される場合、次の用語は、特にことわらない限り、それらに与えられた意味を有する。
変異オリゴヌクレオチドに完全に一致し、そして野生型オリゴヌクレオチドと1塩基一致を有する、親和性標識されたアンチセンス鎖(AL−AS)オリゴヌクレオチドを用いることにより、センス鎖野生型(WT−S)オリゴヌクレオチドの存在下でセンス鎖変異(MU−S)オリゴヌクレオチドを富化するために、次の実験を用いる。オリゴヌクレオチドの配列は次の通りである(ミスマッチ部位は太字である):
MU−ASオリゴヌクレオチドに対して同一の配列を有し、そしてWT−ASオリゴヌクレオチドと1塩基一致を有する、親和性標識されたアンチセンス鎖(AL−AS)オリゴヌクレオチドを用いることにより、センス鎖野生型(WT−S)オリゴヌクレオチド、アンチセンス鎖野生型(WT−AS)オリゴヌクレオチド及びアンチセンス鎖変異(WT−AS)オリゴヌクレオチドの存在下でセンス鎖変異(MU−S)オリゴヌクレオチドを富化するために、次の実験を用いる。オリゴヌクレオチドの配列は次の通りである(ミスマッチ部位は太字である):
核酸、例えばヒトゲノムDNAの混合物が抽出され得るサンプルを供給する。サンプルは、組織、例えば皮膚、器官及び腫瘍、又は流体、例えば血液、血漿、血清、尿、又は核酸を含むか又は含むと推定される任意の組成物からであり得る。核酸のこの混合物から、目的の標的遺伝子、例えばヒトEGFR遺伝子は、特定の変動、例えば非変異又は野生型遺伝子である、大過剰の遺伝子の他の変異体中で小量で存在する点突然変異を含むことができる。癌の発生に臨床学的関連性を有するEGFR遺伝子変異の例は、T790Mの突然変異である。
Claims (11)
- サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異体の富化方法であって、前記核酸は単一のヌクレオチド位置で異なる、2種の変異体配列の形で存在し:
前記標的核酸を含むサンプルを提供し、ここで富化されるべき変異体が大過剰の他の変異体中に低存在量でサンプルに存在し;
標的核酸に対してモル過剰で存在する濃度で標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを提供し、ここで前記オリゴヌクレオチドは、親和性標的により結合され、そして好ましくは、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で一致し、そして他の変異体とは、単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し;
標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、前記オリゴヌクレオチド及び前記標的核酸の何れかの変異体の一本鎖から成る二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ;
前記二本鎖ポリヌクレオチドと、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドのみに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物とを接触させ、ここで前記化合物がさらに、前記ミスマッチ部位で前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を光により触媒することができ;
前記二本鎖ポリヌクレオチドを光に供し、切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを得;
切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド上の親和性標識を認識し、そしてそれに結合する親和性マトリックスに適用し;
切断された二本鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、そして親和性マトリックスから前記変性された一本鎖を除去し;そして、
未切断ポリヌクレオチド二本鎖を変性する条件下で緩衝液を提供し、そして標的核酸の富化された変異体の一本鎖を含む緩衝液を回収すること、
を含む、方法。 - 前記ミスマッチ層間化合物が、図1に示されるような、Rh(bpy)2(chrysi)3+、Rh(bpy)2(phzi)3+、又はそれらの類似体である、請求項1に記載の方法。
- 前記富化されるべき変異体が変異対立遺伝子であり、前記他の変体が野生型対立遺伝子である、請求項2に記載の方法。
- 前記変異対立遺伝子が変異EGFR対立遺伝子であり、前記野生型対立遺伝子が野生型EGFR対立遺伝子である、請求項3に記載の方法。
- 前記変異対立遺伝子を増幅し、そして検出する工程をさらに含む、請求項3又は4に記載の方法。
- サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異対立遺伝子の検出方法であって、前記変異対立遺伝子が単一のヌクレオチド位置で野生型対立遺伝子とは異なり、そし大過剰の野生型対立遺伝子中に低存在量でサンプルに存在し:
前記サンプル中の変異対立遺伝子を富化し、ここで前記富化が、
標的核酸に対してモル過剰で存在する濃度で標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを提供し、ここが前記オリゴヌクレオチドは、親和性標的により結合され、そして好ましくは、変異対立遺伝子と、単一のヌクレオチド位置で一致し、そして野生型対立遺伝子とは、単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し;
標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、前記オリゴヌクレオチド及び前記変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子の何れかの一本鎖から成る二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ;
前記二本鎖ポリヌクレオチドと、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドのみに対して結合することができるミスマッチ層間化合物とを接触させ、ここで前記化合物がさらに、前記ミスマッチ部位で前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を光により触媒することができ;
前記二本鎖ポリヌクレオチドを光に給し、切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを得;
切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド上の親和性標識を認識し、そしてそれに結合する親和性マトリックスに適用し;
切断された二本鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、そして親和性マトリックスから前記野生型対立遺伝子の変性された一本鎖を除去し;
未切断ポリヌクレオチド二本鎖を変性する条件下で緩衝液を提供し;そして標的核酸の富化された変異対立遺伝子の一本鎖を含む緩衝液を回収すること
により実施され;そして、
富化された変異対立遺伝子の生成物、又はその増幅された富化変異対立遺伝子から生成されるシグナルを検出すること、
を含む、方法。 - 前記ミスマッチ層間化合物が、図1に示されるような、Rh(bpy)2(chrysi)3+、Rh(bpy)2(phzi)3+、又はそれらの類似体である、請求項6に記載の方法。
- 前記変異対立遺伝子が変異EGFR対立遺伝子であり、そして前記野生型対立遺伝子が野生型EGFR対立遺伝子である、請求項7に記載の方法。
- 前記増幅工程が、対立遺伝子特異的プライマーにより実施される、請求項6〜8の何れか1項に記載の方法。
- サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異体を富化するための反応混合物であって、
前記標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチド、ここで前記標的核酸は、単一のヌクレオチド位置で異なる2種の変異体配列の形で存在し、前記オリゴヌクレオチドは、親和性標識により結合され、そして好ましくは、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で一致し、そして他の変異体と単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し;及び
ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物、ここで前記化合物はさらに、光により前記ミスマッチ部位で二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を触媒することができ、前記ミスマッチ層間化合物が図1に示されるような、Rh(bpy)2(chrysi)3+、Rh(bpy)2(phzi)3+、又はそれらの類似体である、
を含む、反応混合物。 - サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異体を富化するためのキットであって、
前記標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチド、ここで前記標的核酸は、単一のヌクレオチド位置で異なる2種の変異体配列の形で存在し、前記オリゴヌクレオチドは、親和性標識により結合され、そして好ましくは、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で一致し、そして他の変異体と単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し;及び
ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物、ここで前記化合物はさらに、光により前記ミスマッチ部位で二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を触媒することができ、前記ミスマッチ層間化合物が図1に示されるような、Rh(bpy)2(chrysi)3+、Rh(bpy)2(phzi)3+、又はそれらの類似体である、
を含む、キット。
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