JP2016531099A - 安定性が改善され迅速に発光する親水性高量子収率アクリジニウムエステル - Google Patents

Abstract

光出力が増大し、安定性が改善され、発光が迅速で、非特異的な結合性が低下した親水性且つ高量子収率の化学発光性アクリジニウム化合物を開示する。この化学発光性アクリジニウムエステルは、アクリジニウム核のＣ２及び／又はＣ７位に、親水性で分岐した電子供与性の官能基を有する。【選択図】図１

Description

この出願は、２０１３年７月８日に出願された米国仮出願第１１／８４３，５２８に基づく優先権を主張し、該仮出願の全体を、参照することにより、この出願に取り入れる。

本発明は、光出力が増大し、安定性が改善され、迅速に発光する、非特異的な結合性の低い、親水性の、高量子収率の化学発光性アクリジニウム化合物に関する。これらの化合物は、その高められた量子収率と親水性の故に、アッセイの感度を向上させるのに役立つ。これらの化合物の改善された安定性は、これらの化合物を用いる試薬の貯蔵寿命を延ばし、経時によりアッセイパフォーマンスが変化するのを最小限にするのに役立つ。これらの化合物の高められた発光動力学は、また、特に自動化分析器におけるアッセイにおいて、光学測定をより速くすることを可能にする。

化学発光性のアクリジニウムエステル（ＡＥ類）は、免疫学的アッセイ及び核酸アッセイにおいて、広範囲に用いられてきた非常に有用な標識である。非特許文献１には、この種の化学発光性化合物における過去および最新の進展が要約されている。

非特許文献２及び３には、アクリジニウム塩のエステルからの化学発光がアルカリ性過酸化物により引き起こされることが開示されている。これらの初期の研究以来、その標識としての有用性の故に、アクリジニウム化合物に対する関心が高まってきた。免疫学的アッセイにおけるアクリジニウムエステル：９−カルボキシフェニル−Ｎ−メチルアクリジニウムブロマイドの適用が非特許文献４により開示された。しかしながら、このアクリジニウムエステルは、実に不安定であり、そのため、その商業的有用性が限られている。この不安定性は、フェノールとアクリジニウム環との間の９−カルボキシフェニルエステル結合の加水分解に起因する。

アクリジニウム化合物の安定性を増大させる別の方策が非特許文献５に記述されている。ローらは、この結合を安定化させるべく、アクリジニウムエステル部分を防御する２つのメチル基を導入した。その結果得られる、立体的に安定化されたアクリジニウムエステル：ＤＭＡＥ−ＮＨＳ［２’，６’−ジメチル−４’−（Ｎ−サクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル １０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート］は、２つのメチル基のないアクリジニウムエステルと同様の発光出力を有することが見出された。免疫グロブリンと結合したときの前者化合物の安定性は、途方もなく優秀であり、ｐＨ７において３７℃で１週間経過した後でさえ、化学発光活性は、何ら、失われることがなかった。対照的に、非置換のアクリジニウムエステルは、同様の処理に付したときに、その活性の１０％しか保持しなかった。特許文献１及び２には、ＤＭＡＥ及びその応用について記述がある。

特許文献３において、ローらは、Ｎ−メチル基をＮ−スルホプロピル（ＮＳＰ）基で置換したＤＭＡＥの親水性版（ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳエステルと名付けられている）を開示している。これらの２つの化合物の構造及びアクリジニウム環の番号系を下に示す。

ＤＭＡＥ−ＮＨＳの構造

アクリジニウムスルホンアミドの一般構造（Ｒ_２及びＲ_３は、アルキル基又はアリール基である）

ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳの構造

ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタレート−ＮＨＳの構造

ナトラヤンらは、特許文献４で、フェノールに結合した親水性修飾基を有するＮＳＰ−ＤＭＡＥ誘導体を開示した。そのような化合物の１つ、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタレート−ＮＨＳ（ＨＥＧ−ＡＥと略称する）の構造を上に示す。この化合物において、ジアミノヘキサ（エチレン）グリコール（ジアミノ−ＨＥＧ）部分が、フェノールに結合しており、アクリジニウムエステルの水性溶解性を増大する。グルタレート部分は、ＨＥＧの末端に付加してＮＨＳエステルに変換されており、種々の分子の標識を可能にする。

別な種類の安定な化学発光性のアクリジニウム化合物が非特許文献６及び７並びに特許文献５に記載されている。これらの種類の化合物において、フェノールエステル結合は、スルホンアミド部分により置換されており、このスルホンアミド部分が、発光出力を損なうことなく加水分解に対する安定性を付与すると報告されている。アクリジニウムエステルにおいて、フェノールは「脱離基」であり、他方、アクリジニウムスルホンアミドにおいて、スルホンアミドはアルカリ性過酸化物との化学発光反応の際の「脱離基」である。

アクリジニウム化合物からの発光は、通常、アルカリ性過酸化物により引き起こされる。全体の発光出力、これは化学発光量子収率とも呼ばれるが、励起状態のアクリドンの生成に至る化学反応の効率と後者の量子収率との結合である。

最近、ナトラヤンらは、特許文献６（この開示を、参照によって本明細書に取り込む。）において、親水性のアルコキシ基（ＯＲ^＊）をアクリジニウム環のＣ２及び／又はＣ７に有する親水性の高量子収率のアクリジニウム化合物を開示している。ここで、Ｒ^＊は、スルホプロピル部分若しくはエチレングリコール部分又はこれらの組合せを含有する基である。このような化合物からの増強された発光出力及びその親水性により、これらの化合物は、免疫学的アッセイの感度を改善するのに有用である。このような化合物の１つ、ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−ＤＭＡＥ−ＡＣ−ＮＨＳ（ＨＱＹＡＥと略称する。）の構造を以下に図示する。

ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−ＤＭＡＥ−ＡＣ−ＮＨＳの構造

米国特許第４，９１８，１９２号明細書 米国特許第５，１１０，９３２号明細書 ローら、米国特許第５，６５６，４２６号明細書 ナトラヤンら、米国特許第６，６６４，０４３Ｂ２号明細書 米国特許第５，４６８，６４６号明細書 ナトラヤンら、米国特許第７，３０９，６１５Ｂ２号明細書

Ｍ．Ｊ．プリングルによる総説、ジャーナル オブ クリニカル リガンド アッセイ、第２２巻、第１０５−１２２頁（１９９９年） マカプラら、テトラヘドロン レターズ、第４３巻、第３１６７−３１７２頁（１９６４年） ラハットら、ジャーナル オーガニック ケミストリ、第３０１巻、第３５８７−３５９２頁（１９６５年） Ｊ．Ｓ．Ａ．シンプソン、ネイチャー、第２７９巻、第６４６−６４７頁（１９７９年） ローら、ジャーナル オブ バイオルミネッセンス アンド ケミルミネッセンス、第４巻、第８８−８９頁（１９８９年） キンケルら、ジャーナル オブ バイオルミネッセンス アンド ケミルミネッセンス、第４巻、第１３６−１３９頁（１９８９年） マッティングリーら、ジャーナル オブ バイオルミネッセンス アンド ケミルミネッセンス、第６巻、第１０７−１１４頁（１９９１年）

驚くべきことに、アクリジニウム環のＣ２及び／又はＣ７に、ＯＧ（Ｇは、分岐した親水性置換基である。）の形の電子供与性官能基を有する、親水性の高量子収率の化学発光性のアクリジニウムエステルは、アッセイにおいて、発光出力が増大し、安定性が改善され、発光が迅速であり及び／又は非特異性結合性が低いことが判明した。

本発明の一側面において、式（Ｉ）の構造を有する親水性の高量子収率アクリジニウムエステルが提供される。

ここで、Ｒ_１は、メチル基又はスルホプロピル基であり；各Ｇは、互いに独立して、（ｉ）及び（ｉｉ）から選ばれる分岐基である。

ここで、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７は、それぞれ独立に、メチル基又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_３基であり、ｎは、１〜５の整数であり；Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。

式（Ｉ）によるいくつかの実施態様において、Ｇは、いずれか一方又は両方が、基：

であり、

ここで、各Ｒ_２及びＲ_３は、独立に、メチル基又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_３基であり、ｎは、１〜５の整数であり；特に、Ｇは、いずれか一方又は両方が、基：

であってもよく；或いは他の実施態様においては、Ｇは、いずれか一方又は両方が、基：

であってもよい。

関連する態様において、Ｇは、いずれか一方又は両方が、基：

である。

式（Ｉ）による他の実施態様において、Ｇは、いずれか一方又は両方が、基：

であり、

ここで、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７は、それぞれ独立に、メチル基又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_３基であり、ｎは、１〜５の整数である。この実施態様による１つの変形例において、Ｒ_４〜Ｒ_７はメチル基であり、従って、Ｇは、いずれか一方又は両方が、基：

である。

式（Ｉ）による１つの実施態様において、Ｇは、いずれか一方又は両方が、基：

である。

式（Ｉ）によるアクリジニウムエステルにおいて、Ｒ_１２は、例えば、下記からなる群から選ぶことができる。
（１）−ＯＨ；
（２）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル；
（３）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル；
（４）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−ＣＯＯＨ；
（５）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル（ここで、ｎは、１〜５である。）；
（６）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）−ＣＯＯＨ（ここで、ｎは、１〜５である。）；
（７）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ_２（ここで、ｎは、１〜５である。）；及び
（８）−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＲ（ここで、Ｒは、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアラルキルであり；Ｒは、２０までのヘテロ原子を含んでいてもよい。）

種々の例示的実施態様において、Ｒ_１２は、−ＯＨであり、又は、Ｒ_１２は、基：−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ_２（ここで、ｎは、１〜５である。）であり、又は、Ｒ_１２は、基：−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ”（ここで、ｎは、１〜５であり、Ｒ”は、水素又は−Ｎ−サクシンイミジルである。）である。

式（Ｉ）による１つのアクリジニウムエステルは、下記の構造を有する。

ここで、Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。

式（Ｉ）によるもう１つのアクリジニウムエステルは、下記の構造を有する。

ここで、Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。

式（Ｉ）による更にもう１つのアクリジニウムエステルは、下記の構造を有する。

ここで、Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。

式（Ｉ）によるもう１つのアクリジニウムエステルは、下記の構造を有する。

ここで、Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。

式（Ｉ）による更にもう１つのアクリジニウムエステルは、下記の構造を有する。

ここで、Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。

式（Ｉ）によるアクリジニウムエステルの例示的な実施態様において、Ｒ_１２は、−ＯＨを表わす。

本発明のもう１つの側面において、下記のステップを有する被検体の検出又は定量のためのアッセイが提供される。
（ａ）（ｉ）被検体に特異的な結合分子及び（ｉｉ）式（Ｉ）による親水性、高量子収率で迅速に発光するアクリジニウムエステルを含有してなる接合体を用意するステップ；
（ｂ）その上に前記被検体に特異的な第２の結合分子が固定された固体支持体を用意するステップ；
（ｃ）前記接合体、前記固相、及び、前記被検体を含有すると推測される試料を混合して結合コンプレックスを形成するステップ；
（ｄ）前記固体支持体の上に捕捉された前記結合コンプレックスを分離するステップ；
（ｅ）化学発光惹起試薬を添加することにより、ステップ（ｄ）からの結合コンプレックスの化学発光を引き起こすステップ；
（ｆ）発光量をルミノメーターで測定するステップ；及び
（ｇ）反応混合物からの発光量と、前記被検体の発光量を既知濃度に関連付ける標準用量レスポンス曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｏｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅ）とを、比較することにより、被検体の存在を検出し又はその濃度を計算するステップ。

関連する側面において、被検体の検出又は定量のためのアッセイは、以下のステップを有する。
（ａ）被検体と式（Ｉ）による親水性、高量子収率で迅速に発光するアクリジニウムエステルとの接合体を用意するステップ；
（ｂ）被検体に特異的な結合分子で固定された固体支持体を用意するステップ；
（ｃ）前記接合体、固体支持体、及び、前記被検体を含有すると推測される試料を混合して結合コンプレックスを形成するステップ；
（ｄ）前記固体支持体の上に捕捉された前記結合コンプレックスを分離するステップ；
（ｅ）化学発光惹起試薬を添加することにより、ステップ（ｄ）からの前記結合コンプレックスの化学発光を引き起こすステップ；
（ｆ）発光量をルミノメーターで測定するステップ；及び
（ｇ）前記反応混合物からの発光量と前記被検体の発光量を既知濃度に関連付ける標準用量レスポンス曲線とを比較することにより、前記被検体の存在を検出し又はその濃度を計算するステップ。

本発明のこれら及びその他の側面は、本発明についての以下の詳細な説明及び添付の請求項を参照することにより、より明確に理解されるであろう。

図１は、親核性官能基を含有するタンパク質又は他の分子の接合体を調製するのに適切な親電子性Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル（ＮＨＳ）官能基を有するＢ−ＡＥ群の構造を示す図である。 図２は、親電子性官能基を含有する分子にアクリジニウム化合物を接合させるのに有用な親核性のヘキサエチレングリコールアミン（ＨＥＧ−ＮＨ_２）官能基を有するＢ−ＡＥ群の構造である。 図３は、図２のＢ−ＡＥを用いて調製されたエストラジオール接合体群（「Ｂ−ＡＥ−Ｅ２」と略称する。）の構造を示す。

アクリジニウム環のＣ２及び／又はＣ７へ、ＯＲ^＊のような電子供与性の官能基を、導入することにより、対応する化学発光性のアクリジニウム化合物の量子収率が向上する。Ｒ^＊基が、スルホプロピル基又はメトキシポリ（エチレン）グリコールのように、親水性である場合は、対応するアクリジニウム化合物は、その発光出力が増大するだけではなく、免疫学的アッセイにおける非特異的結合が減少する。これらの２つの特性が相俟って、免疫学的アッセイの感度を向上させる。

本発明の主たる目的は、（ａ）ＮＳＰ−ＤＭＡＥ及び誘導体並びにＨＱＹＡＥと比較したときに、発光がより速く、（ｂ）特にＨＱＹＡＥと比較したときに、安定性が改良されており、（ｃ）ＨＱＹＡＥに匹敵する高発光出力を発揮し、及び（ｄ）ＨＱＹＡＥに匹敵する低い非特異的結合性を示すアクリジニウム化合物の構造的特性を確認することであった。

本発明による、Ｂ−ＡＥ（分岐アクリジニウムエステル）化合物と略称する、親水性のアクリジニウム化合物は、増大した発光出力だけではなく、改善された安定性及びより迅速な発光を示す。安定性とは、アクリジニウム化合物の化学発光活性を意味する。従って、安定性の増大は、時間の関数としての化学発光活性の持続増大として現れる。アクリジニウム化合物の安定性の増大は、そのような化合物から誘導された試薬は、時間の関数として、アッセイパフォーマンスが劣化する可能性が少なく、更に、そのような化合物から誘導された試薬の貯蔵寿命が延長され、従って、浪費される可能性が少ないので、有用である。典型的には、アクリジニウム化合物から誘導されたアッセイ試薬は、タンパク質又は小分子の接合体を含む。アクリジニウム化合物の第２の特性は、より迅速な発光であり、これは、これらの化合物が、本発明のアクリジニウム化合物の独特の構造特徴を欠くアクリジニウム化合物に比較して、著しく短い時間内に、その全光を発することを意味する。より迅速な発光により、アッセイにおいてより迅速な測定が可能になり、自動化分析器の効率を増大させる潜在能力を有する。自動化分析器の効率は、通常、その分析器が一定の時間内に達成できる試験の数として定義される。本発明のアクリジニウム化合物の第３及び第４の特性は、その増大した光出力及び低い非特異性結合であり、これらのいずれもがアッセイ感度を改善するのに非常に有用である。

予期しなかったことだが、アクリジニウム環のＣ２及び／又はＣ７位に−ＯＧ（ここで、Ｇは、分岐官能基である。）の型のグリセロールから誘導された分岐官能基を配置すると、対応するアクリジニウム化合物の安定性が顕著に増大し、より迅速な発光が起きるようになる。同時に、これらの分岐官能基の存在により、量子収率が増加し、対応するアクリジニウム化合物及びその接合体の非特異的結合を減少させる。粒子又はマイクロタイタープレート等の固相を用いたアッセイにおける非特異的結合は、これらの固相に対する接合体の望ましくない相互作用である。これらの望ましくない結合相互作用は、典型的には、アッセイのバックグラウンドを増大させ、これが、アッセイにおける信号／バックグラウンド比の正味の低下につながり、これにより、アッセイ感度を減少させる。

本発明のアクリジニウム化合物は、一般式（Ｉ）で表わされる。

ここで、Ｒ_１は、メチル基又はスルホプロピル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_３ ⁻）基であり；Ｇは、

として、定義され、ここで、Ｒ_２及びＲ_３は、同一又は異なって、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＭｅ（ここで、ｎは、１〜５である。）であり；Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７は、同一又は異なって、メチル基であるか又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＭｅ（ここで、ｎは、１〜５である。）であり；Ｒ_１２は、親電子性又は親核性の基である。

より詳細には、本発明のアクリジニウム化合物は、下記式で表わされる。

ここで、Ｒ_２及びＲ_３は、同一又は異なって、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＭｅ（ここで、ｎは、１〜５である。）であり；Ｒ_１２は、
（１）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル；
（２）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル；
（３）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル（ここで、ｎは、１〜５である。）；及び
（４）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ_２（ここで、ｎは、１〜５である。）
からなる群から選ばれる。

本発明のアクリジニウム化合物は、また、下記式によって表わされる。

ここで、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７は、同一又は異なって、メチル基であるか又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＭｅ（ここで、ｎは、１〜３である。）であり；Ｒ_１２は、
（１）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル（ＮＨＳ）；
（２）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル；
（３）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル（ここで、ｎは、１〜５である。）；及び
（４）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ_２（ここで、ｎは、１〜５である。）
からなる群から選ばれる。

上記一般的構造の代表的な例を、伝統的な有機化学技法を用いて、別個の構造として合成した。これらの化合物の構造を、その略称と共に、図１及び図２に示した。図１には、親電子性のＮ−ヒドロキシサクシンイミジル（ＮＨＳ）官能基を有するＢ−ＡＥ化合物の構造を、他方、図２には、親核性のヘキサエチレングリコールアミン（ＨＥＧ−ＮＨ_２）官能基を有するＢ−ＡＥの構造を示した。前者の化合物は、親核性官能基を有するタンパク質又は他の分子の接合体を調製するのに適切である。後者の化合物は、また、親電子性官能基を有する分子にアクリジニウム化合物を接合するのに有用である。図３は、図２のＢ−ＡＥを用いて調製されたエストラジオール接合体（「Ｂ−ＡＥ−Ｅ２」と略称する。）の構造を示す。エストラジオールは、免疫学的アッセイにおいて一般的に測定されるステロイドホルモンである。

図１のＢ−ＡＥ化合物、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタレート−ＮＨＳ（「ＨＥＧ−ＡＥ」と略称する。）及び高量子収率アクリジニウムエステル：ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）２−ＤＭＡＥ−ＡＣ−ＮＨＳ（「ＨＱＹＡＥ」と略称する。）を使用して、ネズミ科動物のモノクローナル抗ＴＳＨ抗体（ＴＳＨ＝甲状腺刺激ホルモン）の接合体を、実施例９で述べるように調製した。２つの試薬を添加することにより、各接合体の発光を引き起こした。第１の試薬は。１００ｍＭ硝酸中、０．５％過酸化水素を含有し、他方、第２の試薬は、０．２５Ｎ水酸化ナトリウム中、界面活性剤を含有する。発光を、検出器として光電子倍増管を備えたルミノメーターを用いて測定した。各アクリジニウム化合物接合体により発せられた光の量を、ルミノメーターにより、相対的光単位（ＲＬＵ）として、報告した。発光の総量（１００％ＲＬＵ）を種々の接合体について測定した。より短い測定時間における発光は、この数値に対する比率として表わし、表１に百分率で示した。これらの測定に関する詳細は、実施例部分に見出すことができる。

測定時間の関数としてのアクリジニウム化合物−抗ＴＳＨ抗体接合体の％ＲＬＵ

表１から、ＨＥＧ−ＡＥ及びＨＱＹＡＥが、１秒間で、その全光の６５％及び６１％の発光しか示さないのに対して、全てのＢ−ＡＥ接合体は、遥かに迅速な発光を示し、１秒間で８９％以上の発光を示す。Ｂ−ＡＥ化合物における独特の構造特徴が、タンパク質に接合したときのこれらの化合物からの発光速度を速めている。

同様に、図３に示したＢ−ＡＥ−Ｅ２接合体群からの発光の動力学を、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｅ２及びＨＱＹＡＥ−Ｅ２のＥ２接合体からの発光と比較した。後者の化合物は、両方とも、同じＨＥＧリンカーを導入している。これらの測定の結果を、表２にまとめた。

測定時間の関数としてのＥ２接合体の％ＲＬＵ

エストラジオール接合体について、再び、全てのＢ−ＡＥ化合物は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−Ｅ２接合体に比較して、より迅速な発光を示す。

迅速な発光を示すことに加えて、本発明のアクリジニウムエステルは、良好な安定性をも示す。「安定性」とは、これらの化合物又は接合体を、水溶液中、典型的には、生理学的ｐＨ範囲内である７−８のｐＨ範囲で貯蔵したときにＲＬＵの損失を基に測定した化学発光活性の最小損失を意味する。力学的な観点からは、フェノールエステルの加水分解が、化学発光アクリジニウムエステルが非化学発光となる主たる経路である。安定な接合体により、アクリジニウムエステル試薬の長い貯蔵寿命が保証され、また、アッセイパフォーマンスが一定の期間に亘って大きくは変化しないことが保証される。本発明の種々のアクリジニウムエステル接合体の安定性を表３及び４に掲げた。接合体の水溶液を３７℃でｐＨ７．７の水性緩衝液中に貯蔵し、ＲＬＵをルミノメーターにより定期的に記録した。開始時点（０日ともいうが）で測定されたＲＬＵを１００％値と決める。他の時点で測定されたＲＬＵは、この数値の百分率で示す。これらの測定に関するその他の詳細は、実施例部分に見出すことができる。

％ＲＬＵとして示した抗ＴＳＨ抗体接合体の安定性

％ＲＬＵとして示したＥ２接合体の安定性

表３及び表４から明らかなように、Ｂ−ＡＥ接合体群は、その化学発光活性の大半を保持しており、ＨＱＹＡＥ接合体に比較して、より安定である。例えば、ＨＱＹＡＥの抗ＴＳＨ抗体接合体は、３７℃で３３日後に６８％の化学発光安定性を保持し、Ｂ−ＡＥ接合体群は、同じ期間に、７９％以上の化学発光活性を保持している。同様の傾向は、エストラジオール（Ｅ２）接合体についても認められ、Ｂ−ＡＥ群は、３７℃で３３日後に、７５％以上の化学発光活性を維持しているのに対して、ＨＱＹＡＥ接合体の化学発光活性は、同じ期間に、６０％に低下した。

迅速な発光を示すことに加えて、本発明のＢ−ＡＥ群は、ＨＱＹＡＥに匹敵する乃至それより良好な増大した発光出力を示す。表５に、抗ＴＳＨモノクローナル抗体に接合したときの種々のＢ−ＡＥ群の相対的量子収率を纏めた。この表において、ＨＥＧ−ＡＥの量子収率を値「１」とし、そのほかの全ての接合体の量子収率は、この化合物の接合体に対する相対値である。

抗ＴＳＨ抗体のＡＥ接合体の相対的量子収率

表５から読み取れるように、全てのＢ−ＡＥ接合体は、ＨＥＧ−ＡＥ接合体より大きな発光出力（より高い量子収率）を示し、ＨＱＹＡＥ接合体の発光出力に匹敵するか、より大きい。

最後に、本発明のＢ−ＡＥ化合物は、また、固相に対する非特異性結合性が低い（表６）。前述したように、粒子やマイクロタイタープレート等の固相を用いたアッセイにおいて、非特異性結合は、これらの固相に対する接合体の望ましくない結合相互作用である。これらの望ましくない非特異性相互作用は、典型的には、アッセイのバックグラウンドを増加させ、これがアッセイにおける信号／バックグラウンド比の正味の低下につながり、これによりアッセイ感度を低下させる。表６に載せた抗ＴＳＨ抗体の種々のアクリジニウム接合体について、２種の異なる粒子；常磁性粒子（ＰＭＰ）及び磁性ラテックス粒子（ＭＬＰ）への、非特異性結合を測定した。これらの粒子は、その固有の組成が異なっている。ＰＭＰは、主に、アミン含有シランコーティングをした酸化鉄粒子で、できている。アミンは、グルタルアルデヒド等の試薬を用いて粒子表面にタンパク質を結合させるために用いられている。他方、ＬＭＰは、ポリスチレンでできている。表６で用いられたＭＬＰは、磁気分離を可能にするための磁鉄鉱の薄層及びタンパク質と接合するためのポリアクリル酸を含んでいる。この２つのタイプの粒子を、一定時間、接合体溶液と混合し、その後、粒子を磁気分離し、一度、洗浄し、次いで、粒子に備わった化学発光を測定した。（実験の詳細は、実施例１１に見ることができる。）全化学発光入力に対するこの化学発光値の比率を、非特異性結合分率（ｆＮＳＢ）と称する。低い非特異性結合性を有する接合体は、低いｆＮＳＢ値を有するであろう。表６を点検すると、全てのＢ−ＡＥ接合体が、両方のタイプの粒子について、ＨＥＧ−ＡＥよりも低い非特異性結合性を有することが明らかである。Ｂ−ＡＥ接合体のｆＮＳＢ値が前述した親水性ＨＱＹＡＥに匹敵することも、分かる。

粒子に対する抗ＴＳＨ抗体−アクリジニウム接合体の非特異性結合分率（ｆＮＳＢ）

加水分解に対して安定で、発光の迅速な、親水性で量子収率の高い本発明のアクリジニウム化合物は、被検体の決定又は定量のためのアッセイにおける標識として有用である。そのようなアッセイにおいて測定される典型的な被検体は、何らかの臨床関連性を有する物質であることがしばしばであり、タンパク質、核酸、ウイルス、バクテリア等の大きな分子から、エタノール、ビタミン、ステロイド、ホルモン、治療薬等の小さな分子まで、広範囲の分子に亘る。「サンドイッチ」免疫学的アッセイは、典型的には、抗体のような２つの結合分子を用いる、高分子被検体とも称される大きな分子の検出に関連する。１つの抗体は、粒子、ビーズ、膜、マイクロタイター等の固相又はその他の任意の固相に不動化されるか付着される。抗体のような結合分子を固相に付着させる方法は、当業界においてよく知られている。例えば、抗体は、その表面にアミンを含有する粒子に、グルタルアルデヒドのような架橋性分子を用いて、共有結合により付着させることができる。付着は、また、非共有結合性であってもよく、ポリスチレンビーズやマイクロタイタープレートのような固相の表面への、結合粒子の単純な吸着によるものであってもよい。第二の抗体は、しばしば標識と称される化学発光性の又は蛍光性の分子に、共有結合的に付着されることがしばしばである。抗体や他の結合性タンパク質のような結合分子の標識化は、当業界においてよく知られており、一般的に接合反応と呼ばれ、標識化された抗体は、しばしば、接合体と称される。典型的には、標識上のアミン反応性の部分は、抗体上のアミンと反応して、アミン連鎖を形成する。抗体と標識との間の、チオエーテル、エステル、カルバミン酸エステル等々の、他の連鎖も、よく知られている。アッセイにおいて、２つの抗体は、高分子被検体の異なる領域に結合する。高分子被検体は、例えば、タンパク質、核酸、オリゴサッカライド、抗体、抗体断片、細胞、ウイルス、受容体、又は合成ポリマーであってよい。例えば、葉酸エステル結合タンパク質（ＦＢＰ）は、被検体葉酸エステルと結合する。種々の被検体と結合できる合成分子が、モスバッハらにより、「バイオテクノロジー」第１４巻、第１６３−１７０頁（１９９５年）に開示されている。

不動化された抗体と標識化された抗体とを有する固相が被検体を含有する試料と混合されると、被検体と２つの抗体との間に結合コンプレックスが形成される。この型のアッセイは、固相が関与する故に、しばしば、不均質アッセイと呼ばれる。結合コンプレックスに伴う化学発光又は蛍光信号が測定され、被検体の存在又は非存在が推論される。通常、結合コンプレックスは、信号発生に先立って、余剰の標識化抗体等の結合反応成分の残りから、分離される。例えば、もし、結合コンプレックスが磁性ビーズに結合していると、磁石を用いて、バルク溶液からビーズが結合した結合コンプレックスを分離することができる。一連の「標準」、即ち、被検体の既知濃度、を用いて、２つの抗体を用いて用量−レスポンス曲線を発生させることができる。かくして、用量−レスポンス曲線は、測定された信号の一定量と被検体の特定の濃度とを関連付ける。サンドイッチアッセイにおいて、被検体の濃度が上昇するに連れ、信号の量も、また、増加する。未知の試料における被検体の濃度は、高分子被検体を含有する未知の試料における被検体により発生される信号と用量−レスポンス曲線とを対比することにより計算できる。

同様の手法で、２つの結合成分は、核酸被検体の異なる領域に結合又は混成した複数の核酸であってもよい。核酸被検体の濃度は、同様な方法で推定することができる。

ステロイド、ビタミン、ホルモン、治療薬又は小さなペプチド等の小分子被検体の免疫学的アッセイのもう１つのクラスでは、一般に競合アッセイと呼ばれるアッセイ形式が採用される。典型的には、競合アッセイにおいては、対象の被検体と化学発光又は蛍光標識とから、これら２つの分子を共有結合することにより、接合体が作られる。小分子被検体は、そのままで使用することができるし、また、標識への接合体に先立って変化させることもできる。変化した構造を有する被検体は、類似体と呼ばれる。標識を被検体に結合させる化学反応を可能にするため、しばしば、被検体の類似体を使用することが必要になる。時には、被検体の構造類似体を使用して、抗体等の結合分子への結合を増幅し又は強化する。そのような手法は、当業界において、よく知られている。抗体又は対象の被検体への結合タンパク質は、直接又はビオチン−アビジン系の如き副次的な結合相互作用によって、しばしば、固相上に不動化される。

試料中の被検体の濃度は、競合アッセイにおいて、限定量の固相−不動化結合分子に対して被検体含有試料と被検体−標識接合体とを競合させることにより、推定することができる。試料中の被検体濃度が増加するにつれ、固相上の結合分子によって捕捉される被検体−標識接合体の量が減少する。一連の「標準」、即ち、被検体の既知濃度を採用することにより、固相上の結合分子により捕捉された被検体−標識接合体からの信号が被検体の濃度と逆相関している用量−レスポンス曲線を構築することができる。一旦このようにして用量−レスポンス曲線が案出されると、未知の試料中の同じ被検体の濃度を、未知の試料から得られた信号と用量−レスポンス曲線中の信号とを比較することにより、推定することができる。

小分子被検体のための競合アッセイのもう１つの形式には、対象の被検体又は被検体類似物で不動化された固相、及び、化学発光若しくは蛍光標識と接合した被検体に特異的な抗体又は結合タンパク質、の使用が関与する。この形式においては、抗体−標識接合体が、固相上の被検体又は被検体類似物との結合相互作用により、固相上に捕捉される。その後、試料中に存在する対象の被検体が抗体−標識接合体に「選択的に」結合し、かくして、抗体−標識接合体の固相との相互作用を禁止するか置き換える。このやり方で、固相上に捕捉された抗体−標識接合体からの信号の量は、試料中の被検体の量に相関する。

前述のとおりに、被検体の検出又は定量のためのアッセイは、本発明の１実施態様に従って、以下のステップを含む。
（ａ）（ｉ）被検体に特異的な結合分子；及び（ｉｉ）本発明による親水性、高量子収率で迅速に発光する任意のアクリジニウムエステルを含有する接合体を用意し；
（ｂ）前記被検体に特異的な第２の結合分子をその上に不動化した固相を用意し；
（ｃ）前記接合体、前記固相及び前記被検体を含有していると推測される試料を混合して結合コンプレックスを形成し；
（ｄ）前記固相上に捕捉された前記結合コンプレックスを分離し；
（ｅ）化学発光を引き起こす試薬を添加することによって、ステップ（ｄ）からの結合コンプレックスの化学発光を引き起こし；
（ｆ）ルミノメーターで、発光量を測定し；そして、
（ｇ）反応混合物からの発光量を、被検体の既知濃度に発光量を関連づける標準用量−レスポンス曲線と、対比することにより、被検体の存在を検出し又は被検体の濃度を計算する。

もう１つの実施態様において、非検体の検出又は定量のためのアッセイは、以下のステップを含む。
（ａ）被検体と本発明による親水性で、高量子収率で迅速に発光する任意のアクリジニウムエステルとの接合体を用意し；
（ｂ）前記被検体に特異的な結合分子で不動化された固相を用意し；
（ｃ）前記接合体、前記固相及び前記被検体を含有していると推測される試料を混合して結合コンプレックスを形成し；
（ｄ）前記固相上に捕捉された前記結合コンプレックスコンプレックスを分離し；
（ｅ）化学発光を引き起こす試薬を添加することによって、ステップ（ｄ）からの結合コンプレックスの化学発光を引き起こし；
（ｆ）ルミノメーターで、発光量を測定し；そして、
（ｇ）反応混合物からの発光量を、被検体の既知濃度に発光量を関連づける標準用量−レスポンス曲線と、対比することにより、前記被検体の存在を検出し又はその濃度を計算する。

高分子被検体は、タンパク質、核酸、オリゴサッカライド、抗体、抗体断片、細胞、ウイルス、合成ポリマー、その他であってよい。小分子被検体は、ステロイド、ビタミン、ホルモン、治療薬、小ペプチド、その他であってよい。アッセイにおける結合分子は、抗体、抗体断片、結合タンパク質、核酸、ペプチド、受容体又は合成結合分子であってよい。

（実施例１）
［Ｂ１−ＡＥ−ＮＨＳエステル：１ｉの合成］
ａ）１，３−ビス（メトキシエトキシ）−２−プロピル トルエンスルホネート：１ｂ
化合物１ａ：１，３−ビス（メトキシエトキシ）−２−プロパノールを、Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１９９８年、第１０号、１３０９−１３１９（Ｃｏｒｍｉｅｒ及びＧｒｅｇｇ）の記載に従って合成した。１ａ（２ｇ，９．６ミリモル）の無水ピリジン溶液（１０ｍＬ）を４−ジメチルアミノピリジン（０．２３４ｇ，１．９２ミリモル）、次いで、塩化パラトルエンスルホニル（３．６７ｇ，１９．２５ミリモル）で処理した。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で、３日間撹拌した。次いで、減圧下に溶媒を除去し、残渣を酢酸エチル（７５ｍＬ）及び１０％ＨＣｌ（１００ｍＬ）に分割した。酢酸エチル層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に濃縮した。粗生成物（４．０５ｇ）をシリカゲル上、フラッシュクロマトグラフィーにより、溶離剤として酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を用いて精製した。生成物は、淡黄色オイルとして回収された。収量２．４２ｇ（７０％）．

ｂ）化合物１ｄ
２，７−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル：１ｃ（０．２ｇ，０．４８ミリモル），（米国特許第７，３０９，６１５号），化合物１ｂ（０．８６８ｇ，２．３９ミリモル）及び炭酸セシウム（０．３９ｇ，１．２ミリモル）を無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中で、窒素雰囲気下、１００℃で４〜５時間加熱した。反応混合物の少部分を、フェノメネックスＣ_１８ ４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムを用いて、１０→１００％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、流速１．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、ＨＰＬＣ分析した。生成物は、Ｒｔ＝２５分で溶離するのが観測され、主たる成分であった。その後、反応物を室温に冷却し、減圧下に濃縮した。残渣を酢酸エチル（５０ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）に分割した。酢酸エチル層を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に濃縮した。粗生成物（０．４８ｇ）をシリカゲル上、フラッシュクロマトグラフィーにより、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製した。収量０．１３４ｇ（３４％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ７９７．８。

ｃ）化合物１ｆ
化合物１ｄ（６０ｍｇ，７５．３マイクロモル），蒸留１，３−プロパンサルトン （１ｇ，８．２ミリモル）及び重炭酸ナトリウム（６５ｍｇ，０．７７ミリモル）の混合物を、窒素雰囲気下、１５０℃で１時間加熱した。反応混合物の一部を抜き出し、メタノールで希釈し、セクションｂ）で記述したようにＨＰＬＣにより分析した。アクリジニウムエステル１ｅがＲｔ＝１９分に溶離するのが観察された。反応物を室温に冷却し、２０ｍＬの酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を添加した。混合物を簡単に超音波処理して、粘着性の固体を分散させ、次いで、溶媒をデカンテーションで除去した。粗生成物を減圧下に乾燥した。この粗生成物を１Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬ）に懸濁させ、窒素雰囲気下に２時間還流した。粗反応混合物のＨＰＬＣ分析により、生成物がＲｔ＝１６分に溶離し、反応混合物が完全に加水分解していることが示された。生成物を、ＹＭＣ，Ｃ_１８ ３０ｘ３００ｍｍカラムを用いた予備ＨＰＬＣにより、セクションｂ）で述べたと同様の勾配で、２０ｍＬ／分の溶媒流速で、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、精製した。生成物を含むＨＰＬＣフラクションを合一し減圧下に濃縮した。収量５５ｍｇ（８１％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ９０４．７。

ｄ）化合物１ｇ
化合物１ｆ（５３ｍｇ，５８．２マイクロモル）の無水ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液をジイソプロピルエチルアミン（１５．２マイクロリットル，８７．３マイクロモル）及びＴＳＴＵ（２０ｍｇ，６４マイクロモル）で処理した。反応混合物を室温で撹拌した。３０分後、セクションｂ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１８分で溶離するＮＨＳエステルに完全に転化していることが示された。この反応物を撹拌下の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（８６マイクロリットル，０．５８２ミリモル）の無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）溶液に滴下添加した。３０分後、セクションｂ）に述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１３．６分に溶離する生成物１ｇへ完全に転化していることが示された。生成物をセクションｃ）で述べたようにして、予備ＨＰＬＣで精製した。収量５０ｍｇ（８３％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １０３５．６。

ｅ）Ｂ１−ＡＥ−ＮＨＳ：化合物１ｉ
化合物１ｇ（４７．５ｍｇ，４６マイクロモル）の無水メタノール（３ｍＬ）溶液をジイソプロピルエチルアミン（４０マイクロリットル，０．２３ミリモル）及びグルタル酸無水物（２６ｍｇ，０．２３ミリモル）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、セクションｂ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析をしたところ、Ｒｔ＝１４．８分で溶離するグルタル酸エステル誘導体：１ｈに完全に転化していることが示された。反応混合物を無水トルエン（３ｍＬ）で希釈し、減圧下に濃縮した。粗生成物を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（８０マイクロリットル，０．４６ミリモル）及びＴＳＴＵ（１３８ｍｇ，０．４６ミリモル）で処理した。３０分間撹拌後、セクションｂ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析をしたところ、Ｒｔ＝１６分に溶離する生成物１ｉへ８０％超転化していることが示された。生成物をセクションｃ）で述べたようにして、予備ＨＰＬＣで精製した。生成物を含むフラクションを−８０℃で凍結させ、凍結乾燥した。凍結乾燥生成物を無水ＭｅＣＮに溶解し、風袋秤量済の丸底フラスコに移し、減圧下に濃縮した。収量３２ｍｇ（５６％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １２４７．１。

以下の反応式は、Ｂ１−ＡＥ−ＮＨＳ：化合物１ｉの合成を示す。

（実施例２）
［Ｂ２−ＡＥ−ＮＨＳエステル：２ｈの合成］
ａ）１，３−ビス（３，６−ジオキサヘプタニル）グリセロール−２−トルエンスルホネート：２ｂ
化合物１，３−ビス（３，６−ジオキサヘプタニル）グリセロール：２ａをＡｄｖ． Ｍａｔｅｒ．１９９５年，第７巻，７９７−８００頁において、Ｖａｃｕｓ及びＳｉｍｏｎによって述べられているように合成した。粗２ａ（１６ｇ，０．０５４モル）を無水ピリジン（５０ｍＬ）中に溶解し、４−ジメチルアミノピリジン（１．３２ｇ，０．０１１モル）で、次いで、塩化ｐ−トルエンスルホニル（１２．４ｇ，０．０６５モル）で処理した。反応物を窒素雰囲気下に１６時間撹拌した。その後、溶媒を減圧下に除去し、残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）及び２Ｎ塩酸（１００ｍＬ）に分割した。酢酸エチル層を飽和重炭酸ナトリウム溶液で、次いでブラインで、洗浄した。その後、硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に濃縮した。粗生成物（１４ｇ）をシリカゲル上、フラッシュクロマトグラフィーにより、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（１：４）を用いて精製した。収量６．３ｇ。淡黄色オイル。観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ４７３．４（Ｍ＋Ｎａ^＋）。

ｂ）化合物２ｃ
１ｃ（０．２ｇ，０．４８ミリモル）、２ｂ（１．０８ｇ，２．４ミリモル）及び炭酸セシウム（０．３９ｇ，０．１２ミリモル）の混合物の無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液を、窒素雰囲気下、オイルバス中、１００℃で加熱した。５時間後、反応物を室温に冷却し、減圧下に濃縮した。残渣を酢酸エチル（７５ｍＬ）及び水（７５ｍＬ）に分割した。酢酸エチル層をブラインで洗浄し硫酸マグネシウム上で乾燥した。次いで、減圧下に溶媒を除去して、０．９７４ｇの粗生成物を得、これを、シリカゲル上、溶離液として、酢酸エチル中３％のメタノールを用いてフラッシュクロマトグラフィーで精製した。収量９９．４ｍｇ（２１％）。淡黄色オイル。観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ９７４．４。

ｃ）化合物２ｅ
化合物２ｃ（５８ｍｇ，６０マイクロモル），蒸留１，３−プロパンサルトン（０．７５ｇ，６．１５ミリモル）及び重炭酸ナトリウム（５０ｍｇ，０．５９ミリモル）を窒素雰囲気下１５０℃で加熱した。１時間後、小部分を抜き出し、メタノールで希釈し、フェノメネックス，Ｃ_１８ ４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムを用いて、１０→１００％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、流速１．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、ＨＰＬＣ分析した。生成物は、Ｒｔ＝１８．５分（８０％を超える転化率。出発物質のＲｔ＝２３．５分）で溶離するのが観測された。反応物を室温に冷却し、２０ｍＬの酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を添加した。簡単な超音波処理により粘着性の生成物を分散させ、溶媒をデカンテーションにより除去して生成物２ｄを真空下に乾燥した。

粗アクリジニウムエステル２ｄを１ＮのＨＣｌ（１０ｍＬ）中に懸濁させ、窒素雰囲気下に２時間還流した。上述のようにＨＰＬＣ分析を行なったところ、１６分で溶離する生成物２ｃに完全に転化していることが示された。生成物を、ＹＭＣ，Ｃ_１８ ３０ｘ３００ｍｍカラムを用いた予備ＨＰＬＣにより、上述と同様の勾配で、２０ｍＬ／分の溶媒流速で、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、精製した。生成物を含むＨＰＬＣフラクションを合一し減圧下に濃縮した。収量４２ｍ（６５％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １０８３．３。

ｄ）化合物２ｆ
化合物２ｅ（４２ｍｇ，３９マイクロモル）の無水ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液をジイソプロピルエチルアミン（１０マイクロリットル，５９マイクロモル）及びＴＳＴＵ（１４ｍｇ，４６．５マイクロモル）で処理した。反応混合物を室温で撹拌した。１５分後、セクションｃ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析を行なったところ、Ｒｔ＝１７．７分で溶離するＮＨＳエステルに完全に転化していることが示された。この反応物を、無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（５８マイクロリットル，０．３９ミリモル）の撹拌溶液に滴下添加した。３０分後、セクションｂ）で述べたようにして反応混合物のＨＰＬＣ分析を行なったところ、Ｒｔ＝１３．６分で溶離する生成物２ｆに完全に転化していることが示された。収量３７ｍｇ（７９％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １２１７．９。

ｅ）Ｂ２−ＡＥ−ＮＨＳエステル：化合物２ｈ
化合物２ｆ（３７ｍｇ，３０マイクロモル）の無水メタノール（３ｍＬ）溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２６マイクロリットル，０．１５ミリモル）及びグルタル酸無水物（１７ｍｇ，０．１５ミリモル）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、セクションｃ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析を行なったところ、Ｒｔ＝１５分で溶離するグルタル酸エステル誘導体２ｇに完全に転化していることが示された。反応混合物を無水トルエン（３ｍＬ）で希釈し、減圧下に濃縮した。粗生成物を無水ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（５２マイクロリットル，０．３ミリモル）及びＴＳＴＵ（８９ｍｇ，０．３ミリモル）で処理した。３０分撹拌後、セクションｃ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１６分で溶離する生成物２ｈに、８０％を超える転化率で転化していることが示された。生成物をセクションｃ）で述べたようにして、予備ＨＰＬＣで精製した。生成物を含むＨＰＬＣフラクションを−８０℃で凍結させ、凍結乾燥した。凍結乾燥生成物を、無水ＭｅＣＮに溶解し、風袋秤量済の丸底フラスコに移し、減圧下に濃縮した。収量３９ｍｇ（９１％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １４２５．４。

以下の反応式は、Ｂ２−ＡＥ−ＮＨＳ：２ｈの合成を示す。

（実施例３）
ａ）１，３−ビス（３，６，９−ジオキサデカニル）グリセロール−２−トルエンスルホネート：３ｂ
化合物１，３−ビス（３，６，９−ジオキサデカニル）グリセロール：３ａを、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９８，１９９，２１２９−２１４０においてＬａｕｔｅｒらによって述べられているように、合成した。アルコール（７ｇ，０．０１８２モル）を、無水ピリジン（３０ｍＬ）に溶解し、４−ジメチルアミノピリジン（０．４４４ｇ，３．６ミリモル）及び塩化ｐ−トルエンスルホニル（３．８５ｇ，０．０２モル）で処理した。反応物を窒素雰囲気下、３日間、撹拌した。次いで、溶媒を減圧下に除去し、残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）及び１０％ＨＣｌ（１００ｍＬ）に分割した。酢酸エチル層を飽和重炭酸ナトリウム及びブラインで洗浄した。次いで、これを無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に濃縮した。粗生成物を、シリカ上、ヘキサン／酢酸エチル／メタノール（５：４．５：０．５）を用いて、フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量＝４．４７ｇ（４５％）；淡黄色オイル。

ｂ）化合物３ｃ
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の１ｃ（０．２ｇ，０．４８ミリモル），３ｂ（１．３ｇ，２．４ミリモル）及び炭酸セシウム（０．３５ｇ，０．１１ミリモル）の混合物を、窒素雰囲気下、オイルバス中、１００℃で加熱した。６時間後、反応混合物を室温に冷却し、減圧下に濃縮した。残渣を酢酸エチル（７５ｍＬ）及び水（７５ｍＬ）に分割した。酢酸エチル層をブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。次いで、溶媒を減圧下に除去して、１．３ｇの粗生成物を得た。この粗生成物を、酢酸中５％のメタノールを溶離剤として使用して、シリカゲル上、フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量１３４ｍｇ（２２％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １１４８．９。

ｃ）化合物３ｅ
化合物３ｃ（４５ｍｇ，３９マイクロモル）、蒸留した１，３−プロパンサルトン （０．５ｇ，４．１ミリモル）及び重炭酸ナトリウム（３３ｍｇ，０．３９ミリモル）を、窒素雰囲気下、１５０℃に加熱した。２時間後、小部分を抜き出し、メタノールで希釈し、フェノメネックス，Ｃ_１８ ４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムを用いて、１０→１００％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、流速１．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、ＨＰＬＣ分析した。生成物は、Ｒｔ＝１８．３分で溶離する（８０％を超える転化率。出発材料のＲｔ＝２２．５分）のが観察された。反応物を室温に冷却し、２０ｍＬの酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を添加した。簡単な超音波処理により、粘着性の生成物を分散させた後、溶媒をデカンテーションで除去し、生成物３ｄを真空下に乾燥した。

粗アクリジニウムエステル３ｄを１Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬ）に懸濁させ、窒素雰囲気下に２時間還流した。上述のようにＨＰＬＣ分析をした結果、１６．３分に溶離する生成物３ｅに完全に転化していることが分かった。生成物を、ＹＭＣ、Ｃ_１８ ３０×３００ｍｍカラムで、溶媒流速２０ｍＬ／分で上述と同じ勾配を用い、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、予備的ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有するＨＰＬＣフラクションを合一し、減圧下に濃縮した。収量＝２８ｍｇ（５７％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １２５５．９。

ｄ）化合物３ｆ
化合物３ｅ（２８ｍｇ，２２．３マイクロモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液をジイソプロピルエチルアミン（６．４マイクロリットル，３３．５マイクロモル）及びＴＳＴＵ（８ｍｇ，２６．６マイクロモル）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、セクションｃ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１７．７分で溶離するＮＨＳエステルに完全に転化していることが示された。この反応物を、撹拌下の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（３２マイクロリットル，０．２２ミリモル）の無水ＤＭＦ溶液に滴下添加した。１時間後、セクションｃ）で述べたようにして、反応混合物をＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１４分で溶離する生成物３ｆに完全に転化していることが示された。生成物を、セクションｃ）で述べたようにして予備的ＨＰＬＣにより精製した。収量＝２８ｍｇ（９０％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １３８８．６。

ｅ）Ｂ３−ＡＥ−ＮＨＳ：化合物３ｈ
化合物３ｆ（２８ｍｇ，２０マイクロモル）の無水メタノール（２ｍＬ）溶液をジイソプロピルエチルアミン（１７．６マイクロリットル，０．１ミリモル）及びグルタル酸無水物（１１．５ｍｇ，０．１ミリモル）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、セクションｃ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１５．２分で溶離するグルタル酸エステル誘導体３ｇに完全に転化していることが示された。反応混合物を無水トルエン（３ｍＬ）で希釈し、減圧下に濃縮した。粗生成物を無水ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（３５マイクロリットル，０．２ミリモル）及びＴＳＴＵ（６０ｍｇ，０．２ミリモル）で処理した。３０分撹拌後、セクションｃ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１６．２分で溶離する生成物３ｈに、７０％超、転化していることが示された。生成物を、セクションｃ）で述べたようにして予備的ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有するＨＰＬＣフラクションを−８０℃で凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥物を無水ＭｅＣＮに溶解し、風袋秤量済の丸底フラスコに移し、減圧下に乾燥した。収量＝１７．６ｍｇ（５５％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １５９８。

以下の反応式は、Ｂ３−ＡＥ−ＮＨＳ：３ｈの合成を示す。

（実施例４）
Ｂ４−ＡＥ−ＮＨＳ エステル：４ｈ
ａ）化合物４ａ
１，３−ビス（メトキシエトキシ）−２−プロパノール、１ａ（１２ｇ，０．０５８モル）及び水酸化カリウム（２．４３ｇ，０．０４３モル）を激しく撹拌し、エピクロルヒドリン（１．３３４ｇ，０．０１４４モル）を滴下添加した。反応混合物を８０℃で２４時間加熱し、その後、室温に冷却し、水（５０ｍＬ）を添加した。溶液をジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で抽出した。ジクロロメタン抽出物の合一物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に濃縮した。粗生成物（１０．８５ｇ）を、そのまま、次の反応に供した。

ｂ）化合物４ｂ
粗４ａ（１０．５ｇ，０．０２３モル）の無水ピリジン（２５ｍＬ）溶液を４−ジメチルアミノピリジン（０．５６ｇ，４．６ミリモル）及び塩化ｐ−トルエンスルホニル（０．０４６モル，８．８ｇ）で処理した。反応物を室温で窒素雰囲気下に１６時間撹拌した。その後、溶媒を減圧下に除去し、残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）及び２Ｎ ＨＣｌ（１００ｍＬ）に分割した。酢酸エチル層を飽和重炭酸ナトリウム及びブラインで洗浄し、次いで、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に乾燥した。粗生成物（１６．４ｇ）を、シリカゲル上、フラッシュクロマトグラフィーにより、酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を用いて１，３−ビス（メトキシエトキシ）−２−プロピル トルエンスルホネートを溶離させ、次いで、酢酸エチルで生成物を溶離させることにより、精製した。収量＝２．８２ｇ（３２％）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ６４８．６（Ｍ＋Ｎａ^＋）であった。

ｃ）化合物４ｃ
２，７−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル、１ｃ（０．２ｇ，０．４８ミリモル）、化合物４ｂ（１．５ｇ，２．４ミリモル）及び炭酸セシウム（０．３９ｇ，１．２ミリモル）の混合物の無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液を、窒素雰囲気下、１００℃で、４〜５時間、加熱した。その後、反応混合物の小部分を、フェノメネックスＣ_１８ ４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムを用いて、１０→１００％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、流速１．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、ＨＰＬＣ分析した。生成物は、Ｒｔ＝２３．５分に溶離するのが観察され、主成分であった。反応物を、その後、室温に冷却し、減圧下に濃縮した。残渣を酢酸エチル（５０ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）に分割した。酢酸エチル層を分離し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に乾燥した。粗生成物（１．３６ｇ）を、シリカゲル上、フラッシュクロマトグラフィーにより、溶離剤として酢酸エチル中５％メタノールを用いて、精製した。収量＝０．１５６ｇ（２５％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １３２５。

ｄ）化合物４ｅ
化合物４ｃ（６０ｍｇ，４５．３マイクロモル）、蒸留１，３−プロパンサルトン（１．０ｇ，８．２ミリモル及び重炭酸ナトリウム（７６ｍｇ，０．９ミリモル）の混合物を、窒素雰囲気下、１５０℃で加熱した。２時間後、小部分を抜き出し、メタノールで希釈して、フェノメネックスＣ_１８ ４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムを用いて、１０→１００％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、流速１．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、ＨＰＬＣ分析した。生成物は、Ｒｔ＝１７．８分で溶離する（８０％を超える転化率。出発物質のＲｔ＝２３．５分）のが観察された。反応物を室温に冷却し、２０ｍＬの酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を添加した。簡単な超音波処理により、粘着性の生成物を分散させ、溶媒をデカンテーションにより除去し、生成物４ｄを真空下に乾燥した。

粗アクリジニウムエステル４ｄを１Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬ）中に懸濁し、窒素雰囲気下で２時間還流させた。上述のようにＨＰＬＣ分析を行なったところ、１７分に溶離する生成物４ｅに完全に転化していることが示された。生成物をＹＭＣ、Ｃ_１８ ３０×３００ｍｍカラムで、溶媒流速２０ｍＬ／分で上述と同じ勾配を用い、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、予備的ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有するＨＰＬＣフラクションを合一し、減圧下に濃縮した。収量＝３３．５ｍｇ（５２％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １４３３．１。

ｅ）化合物４ｆ
化合物４ｅ（３３．５ｍｇ，２３．４マイクロモル）の無水ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液をジイソプロピルエチルアミン（６．１マイクロリットル，３５マイクロモル）及びＴＳＴＵ（８．５ｍｇ，２８．２マイクロモル）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、セクションｃ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１８．７分で溶離するＮＨＳエステルに完全に転化していることが示された。この反応物を撹拌下の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（８６マイクロリットル，０．５８２ミリモル）の無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）溶液に滴下添加した。１時間後、セクションｃ）で述べたようにして反応混合物をＨＰＬＣ分析したところ、１４．５分に溶離する生成物４ｆに完全に転化していることが示された。生成物をセクションｄ）で述べたようにして予備的ＨＰＬＣで精製した。収量＝２２ｍｇ（５９％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １５６５．８。

ｆ）Ｂ４−ＡＥ−ＮＨＳ：化合物４ｈ
化合物４ｆ（２２ｍｇ，１４マイクロモル）の無水メタノール（２ｍＬ）溶液をジイソプロピルエチルアミン（１２．３マイクロリットル，７０マイクロモル）及び無水グルタル酸（８ｍｇ，７０ミリモルｅｓ）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、セクションｄ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１５．９分で溶離するグルタル酸エステル誘導体４ｇに完全に転化していることが示された。反応混合物を無水トルエン（３ｍＬ）で希釈し、減圧下に濃縮した。

粗生成物を無水ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（２４．６マイクロリットル，０．１４ミリモル）及びＴＳＴＵ（４２ｍｇ，０．１４ミリモル）で処理した。３０分後、セクションｃ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、７０％超がＲｔ＝１６．９分に溶離する生成物４ｈに転化していることが示された。生成物をセクションｄ）で述べたようにして、予備的ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有するＨＰＬＣフラクションを−８０℃で凍結し、凍結乾燥した、凍結乾燥物を無水ＭｅＣＮに溶解し、風袋秤量済の丸底フラスコに移し、減圧下に濃縮した。収量＝１８．８ｍｇ（７５％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １７７６．５。

以下の反応式は、Ｂ４−ＡＥ−ＮＨＳ：４ｈの合成を示す。

（実施例５）
Ｂ０４−ＡＥ−ＮＨＳ：５ｉ
ａ）化合物５ｂ
１，３−ジメトキシ−２−プロパノール：５ａを、Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，２７，１３６４−１３７０において、Ｋａｎｇらにより述べられているように合成した。粗１，３−ジメトキシ−２−プロパノール（１０．６６ｇ，０．０８９モル）及び水酸化カリウム（３ｇ，０．００５３４モル）を、窒素雰囲気下、８０℃で全ての水酸化カリウムが溶解するまで撹拌した。次いで、エピクロルヒドリン（１．６５ｇ，０．００１７８モル）を滴下添加し、反応物を、窒素雰囲気下、１００℃で２４時間加熱した。その後、反応物を室温に冷却し、酢酸エチル（７５ｍＬ）及び飽和塩化アンモニウム溶液（７５ｍＬ）に分割した。酢酸エチル層を分離し、水層を、もう１度、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。合一した酢酸エチル抽出物を無水硫酸マクネシウム乾燥し、減圧下に濃縮した。回収された淡褐色オイルを、そのまま、次の反応に用いた。

ｂ）化合物５ｃ
化合物５ｂ（３．７ｇ，０．０１２５モル）を無水ピリジンに溶解し、４−ジメチルピリジン（０．３８１ｇ，３．１ミリモル）及び塩化ｐ−トルエンスルホニル（４．８ｇ，０．００２５モル）で処理した。反応物を、窒素雰囲気下、室温で３日間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣を酢酸エチル（７５ｍＬ）及び１Ｎ ＨＣｌ（５０ｍＬ）に分割した。酢酸エチル層を分離し、２％水酸化ナトリウム溶液（５０ｍＬ）及び飽和塩化アンモニウム溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。その後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に濃縮した。粗生成物（６．６ｇ）をシリカゲル上、フラッシュクロマトグラフィーにより、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル／メタノール（７５：２４：１）を用いて精製した。収量１．７３ｇ。淡黄色オイル。

ｃ）化合物５ｄ
２，７−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル、１ｃ（０．１ｇ，０．２４ミリモル）、化合物５ｃ（０．５４ｇ，１．２ミリモル）及び炭酸セシウム（０．２ｇ，０．０６ミリモル）の混合物の無水ＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を、窒素雰囲気下、１００℃に４〜５時間加熱した。反応混合物の小部分を、フェノメネックスＣ_１８ ４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムを用いて、１０→１００％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、流速１．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、ＨＰＬＣ分析した。生成物はＲｔ＝２６．２分に溶離するのが観察され、主成分であった。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、減圧下に濃縮した。残渣を酢酸エチル（７５ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）に分割した。酢酸エチル層を分離し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に濃縮した。粗生成物（０．４５ｇ）を、溶離剤として１％メタノール／酢酸エチルを用いて、シリカゲル上、予備的ＴＬＣで精製した。収量＝６４ｇ（２８％）。観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ９７３．８。

ｄ）化合物５ｆ
化合物５ｄ（６４ｍｇ，６５．７マイクロモル）、蒸留した１，３−プロパンサルトン（１．６ｇ，１３．１ミリモル）及び重炭酸ナトリウム（１１０ｍｇ，１．３ミリモル）の混合物を、窒素雰囲気下、１５０℃で加熱した。２時間後、小部分を抜き出し、メタノールで希釈し、フェノメネックスＣ_１８ ４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムを用いて、１０→１００％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、流速１．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、ＨＰＬＣ分析した。生成物は、Ｒｔ＝２０．５分で溶離するのが観察された（転化率＞６０％）。反応物を室温に冷却し、２０ｍＬの酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を添加した。簡単な超音波処理により、粘着性の生成物を分散させ、溶媒をデカンテーションにより除去し、生成物５ｅを真空下に乾燥した。

粗アクリジニウムエステル５ｅを１Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬ）に懸濁させ、窒素雰囲気下に２時間還流した。上述したＨＰＬＣ分析により、１７．５分に溶離する生成物５ｆに完全に転化していることが示された。生成物を、ＹＭＣ，Ｃ_１８ ３０ｘ３００ｍｍカラムを用いて、上記と同じ勾配で、２０ｍＬ／分の溶媒流速で、２６０ｎｍでのＵＶ検出を用いる予備的ＨＰＬＣにより、精製した。生成物を含有するフラクションを合一し、減圧下に濃縮した。収量＝１２ｍｇ（１７％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １０８２．４。

ｅ）化合物５ｇ
化合物５ｆ（１２ｍｇ，１１．１マイクロモル）の無水ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液をジイソプロピルエチルアミン（４．０マイクロリットル，２２マイクロモル）及びＴＳＴＵ（５ｍｇ，１６．７マイクロモル）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、セクションｃ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１９．５で溶離するＮＨＳエステルに完全に転化していることが示された。反応物を無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１６マイクロリットル，０．１１ミリモル）溶液に、撹拌下に、滴下添加した。１時間後、反応混合物を、セクションｃ）で述べたようにして、ＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１４．７８分で溶離する生成物５ｇへ完全に転化していることが示された。生成物を、セクションｄ）で述べたようにして、予備的ＨＰＬＣで精製した。収量＝１５．４ｍｇ（定量的）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １２１２．９。

ｆ）Ｂ０４−ＡＥ−ＮＨＳ：化合物５ｉ
化合物５ｇ（１５．４ｍｇ，１２．７マイクロモル）の無水メタノール（２ｍＬ）溶液をジイソプロピルエチルアミン（１１マイクロリットル，６３．５マイクロモル）及びグルタル酸無水物（７．２ｍｇ，６３．５マイクロモル）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、セクションｃ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１６．２分で溶離するグルタレート誘導体５ｈに完全に転化したことが示された。反応混合物を無水トルエン（３ｍＬ）で希釈し、減圧下に濃縮した。粗生成物を、無水ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（２２マイクロリットル，０．１２６ミリモル）及びＴＳＴＵ（３８ｍｇ，０．１２６ミリモル）で処理した。１５分間撹拌した後、セクションｃ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１７．２で溶離する生成物５ｉに８０％を超える転化率で転化していることが示された。生成物をセクションｄ）で述べたようにして、予備的ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有するＨＰＬＣフラクションを−８０℃で凍結させ凍結乾燥した。凍結乾燥生成物を無水ＭｅＣＮに溶解し、風袋秤量済の丸底フラスコに移し、減圧下に濃縮した。収量＝１２．３ｍｇ（６８％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １４２３．８。

以下の反応式は、Ｂ０４−ＡＥ−ＮＨＳ：化合物５ｉの合成を示す。

（実施例６）
Ｂ１−ＡＥ−Ｅ２：６ｂ
ａ）化合物６ａ
無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物１ｆ（２６ｍｇ，２８．７マイクロモル）をジイソプロピルエチルアミン（７．５マイクロリットル，４３マイクロモル）及びＴＳＴＵ（１０．４ｍｇ，３５マイクロモル）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、フェノメネックスＣ_１８ ４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムを用いて、１０→１００％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、流速１．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、ＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１８．２で溶離するＮＨＳエステルに完全に転化していることが示された。反応物を、ジアミノヘキサ（エチレン）グリコール（米国特許第６，６６４，０４３号），（４０ｍｇ，０．１４２ミリモル）の無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）溶液に、撹拌下に滴下添加した。３０分後、反応混合物をＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１４．１分で溶離する生成物６ａに完全に転化したことが示された。生成物を、ＹＭＣ，Ｃ_１８ ３０ｘ３００ｍｍカラムを用いて、上記と同じ勾配で、２０ｍＬ／分の溶媒流速で、２６０ｎｍでのＵＶ検出を用いる予備的ＨＰＬＣにより、精製した。生成物を含有するＨＰＬＣフラクションを合一し、減圧下に濃縮した。収量２６ｍｇ（７８％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １１６８．６。

ｂ）Ｂ１−ＡＥ−Ｅ２：６ｂ
エストラジオール−６−カルボキシメチルオキシム（１ｍｇ，２．７８マイクロモル）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）溶液を化合物６ａ（（３．２５ｍｇ，２．７８マイクロモル）と合一しジイソプロピルエチルアミン（１マイクロリットル，５．５６マイクロモル）、次いで、ＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ溶液の０．１８４ｍＬ）として添加したＢＯＰ試薬（１．８４ｍｇ，４．１７マイクロモル）で処理した。反応物を室温で２時間撹拌した。セクションａ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１８．２分で溶離する生成物への８０％を超える転化が示された。生成物を、ＹＭＣ，Ｃ_１８ ２０ｘ２５０ｍｍカラムを用いた予備ＨＰＬＣにより、１０→７０％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、１６ｍＬ／分の溶媒流速で、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、精製した。生成物を含有するＨＰＬＣフラクションを合一し、−８０℃で凍結させ凍結乾燥した。収量＝２．８ｍｇ（６７％）；観察された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １５１１．２。

以下の反応式は、Ｂ１−ＡＥ−Ｅ２：６ｂの合成を示す。

（実施例７）
ａ）化合物７ａ
化合物２ｅ（３０ｍｇ，２８マイクロモル）の無水ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液をジイソプロピルエチルアミン（７．２マイクロリットル，４２マイクロモル）及びＴＳＴＵ（１０ｍｇ，３４マイクロモル）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、フェノメネックスＣ_１８ ４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムを用いて、１０→１００％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、流速１．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、ＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１７．７で溶離するＮＨＳエステルに完全に転化していることが示された。反応物を、ジアミノヘキサ（エチレン）グリコール（米国特許第６，６６４，０４３号），（４０ｍｇ，０．１４２ミリモル）の無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）溶液に、撹拌下に滴下添加した。３０分後、反応混合物をＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１４分で溶離する生成物７ａに完全に転化していることが示された。生成物を、ＹＭＣ，Ｃ_１８ ３０ｘ３００ｍｍカラムを用いた予備ＨＰＬＣにより、上述と同様の勾配で、２０ｍＬ／分の溶媒流速で、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、精製した。生成物を含有するＨＰＬＣフラクションを合一し、減圧下に濃縮した。収量＝２８．３ｍｇ（７６％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １３４５．４。

ｂ）Ｂ２−ＡＥ−Ｅ２：７ｂ
エストラジオール−６−カルボキシメチルオキシム（１ｍｇ，２．７８マイクロモル）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）溶液を化合物７ａ（３．７４ｍｇ，２．７８マイクロモル）と合一し、ジイソプロピルエチルアミン（１マイクロリットル，５．５６マイクロモル）、次いで、ＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ溶液の０．１８４ｍＬ）として添加したＢＯＰ試薬（１．８４ｍｇ，４．１７マイクロモル）で処理した。反応物を室温で２時間撹拌した。セクションａ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析をしたところ、Ｒｔ＝１８．１分に溶離する生成物への８０％を超える転化が示された。生成物を、ＹＭＣ，Ｃ_１８２０ｘ２５０ｍｍカラムを用いた予備ＨＰＬＣにより、１０→７０％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、１６ｍＬ／分の溶媒流速で、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、精製した。生成物を含有するＨＰＬＣフラクションを合一し、−８０℃で凍結させ凍結乾燥した。収量＝４．６ｍｇ（９８％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １６８８．４。

以下の反応式は、Ｂ２−ＡＥ−Ｅ２：７ｂの合成を示す。

ａ）化合物８ａ
化合物４ｅ（２６ｍｇ，１８マイクロモル）の無水ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液をジイソプロピルエチルアミン（４．０マイクロリットル，２７マイクロモル）及びＴＳＴＵ（６．６ｍｇ，２２マイクロモル）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、フェノメネックスＣ_１８ ４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムを用いて、１０→１００％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、流速１．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、ＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１８．７で溶離するＮＨＳエステルに完全に転化していることが示された。この反応物を、ジアミノヘキサ（エチレン）グリコール（米国特許第６，６６４，０４３号）（２５ｍｇ，０．０８９ミリモル）の無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）溶液に、撹拌下に滴下添加した。３０分後、反応混合物をＨＰＬＣ分析したところ、Ｒｔ＝１５．１分で溶離する生成物８ａに完全に転化していることが示された。生成物を、ＹＭＣ，Ｃ_１８３０ｘ３００ｍｍカラムを用いた予備ＨＰＬＣにより、上述と同様の勾配で、２０ｍＬ／分の溶媒流速で、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、精製した。生成物を含有するＨＰＬＣフラクションを合一し、減圧下に濃縮した。収量＝２２．５ｍｇ（７３％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １６９８．６。

ｂ）Ｂ４−ＡＥ−Ｅ２：８ｂ
エストラジオール−６−カルボキシメチルオキシム（１ｍｇ，２．７８マイクロモル）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）溶液を化合物８ａ（４．７２ｍｇ，２．７８マイクロモル）と合一し、ジイソプロピルエチルアミン（１マイクロリットル，５．５６マイクロモル）、次いで、ＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ溶液の０．１８４ｍＬ）として添加したＢＯＰ試薬（１．８４ｍｇ，４．１７マイクロモル）で処理した。反応物を室温で２時間撹拌した。セクションａ）で述べたようにしてＨＰＬＣ分析をしたところ、Ｒｔ＝１８．９分に溶離する生成物への８０％を超える転化が示された。生成物を、ＹＭＣ，Ｃ_１８ ２０ｘ２５０ｍｍカラムを用いた予備ＨＰＬＣにより、１０→７０％Ｂ（Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分勾配で、１６ｍＬ／分の溶媒流速で、２６０ｎｍでのＵＶ検出により、精製した。生成物を含有するＨＰＬＣフラクションを合一し、−８０℃で凍結させ凍結乾燥した。収量＝４．０ｍｇ（７０％）；観察されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ２０４０．９。

以下の反応式は、Ｂ２−ＡＥ−Ｅ２：８ｂの合成を示す。

（実施例９）
アクリジニウムエステルで抗−ＴＳＨ Ｍａｂを標識化するための一般的手順
抗体の原液（５ｍｇ／ｍＬ，５０マイクロリットル，０．５ｍｇ，３．４ナノモル）を０．１Ｍの燐酸緩衝液（ｐＨ８）（１５０マイクロリットル）又は０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９）（１５０マイクロリットル）で希釈して２．５ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。この溶液に２０当量のアクリジニウムＮＨＳエステルをＤＭＦ溶液として添加した。例えば、Ｂ１−ＡＥ−ＮＨＳを用いると、アクリジニウムエステルの１０ｍｇ／ｍＬＤＭＦ溶液の８．３μＬとして、添加される８３μｇの添加を伴う。

標識化反応物は、室温において３〜４時間穏やかに撹拌し、次いで、脱イオン化水（１．８ｍＬ）で希釈した。これらの希釈溶液を２ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ^ＴＭフィルター（ＭＷ３０，０００カットオフ）に移し、４，５００Ｇで遠心処理して体積を約０．２ｍＬに減少させた。このプロセスを更に３回繰り返す。ろ過した接合体を脱イオン水で希釈して最終的に全体積２００μＬとし、マススペクトル分析及びＲＬＵ測定に供する。

マススペクトルは、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量測定計で記録し、非標識化抗体を参照として用いた。接合体溶液の約２μＬを２μＬのシナピン酸マトリクス溶液（ＨＰ）と混合し、ＭＡＬＤＩプレート上にスポットした。完全に乾燥した後、マススペクトルを記録した。非標識化抗体と接合体についての質量値の相違から、ＡＥ導入の程度が測定できる。典型的には、これらの標識化条件において、３−６ＡＥ標識が抗体に導入された。

（実施例１０）
安定性測定
アクリジニウムエステルの安定性の最大化は、アッセイの正確さを強化する１つのパラメーターである。抗ＴＳＨ抗体に共有結合的に付着したいくつかのアクリジニウムエステルの化学発光の安定性を、アクリジニウムエステルの分子構造と化学発光安定性との関連について、名目上の貯蔵温度４℃及び高温貯蔵温度３７℃の両方で、分析した。異なるアクリジニウムエステルにそれぞれ接合したアクリジニウムエステル標識化抗ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）抗体の当量を、０．１Ｍ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸ナトリウム（ＨＥＰＥＳ）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、７．７ｍＭアジ化ナトリウム、１．０ｍＭエチレンジアミン四酢酸４ナトリウム（ＥＤＴＡ）、１２ｍＭ ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、７６μＭウシ血漿アルブミン（ＢＳＡ）及び７μＭマウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）、ｐＨ７．７からなるシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクスＴＳＨ３（甲状腺刺激ホルモン）Ｌｉｔｅ試薬緩衝液中に、０．２ナノモーラー濃度に希釈した。各アクリジニウムエステル溶液を２セットの貯蔵容器に分割した。貯蔵容器の１セットを４℃に、他の１セットを３７℃に保持した。当初に希釈した日から始めて、各アクリジニウムエステル−抗体溶液の１０マイクロリットルからの化学発光を、シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクスフラッシュ試薬１（０．１Ｍ硝酸及び０．５％過酸化水素及びシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクスフラッシュ試薬２（０．２５Ｍ水酸化ナトリウム及び０．０５％セチルトリメチルアンモニウムクロリド）を順次添加して、標準条件下で、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ Ａｕｔｏｌｕｍａｔ ＬＢ９５３ ルミノメーターにより測定した。

（実施例１１）
ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ非特異的結合の測定
アクリジニウムエステルの固相へのフラクショナル非特異的結合（ｆＮＳＢ）の最小化は、アッセイ感度を強める１つのパラメーターである。抗ＴＳＨ抗体に共有結合的に付着したいくつかのアクリジニウムエステルのフラクショナル非特異的結合について、アクリジニウムエステルの分子構造との相関を解析した。それぞれ異なるアクリジニウムエステルに接合したアクリジニウムエステル標識抗ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）抗体の当量を、０．１ＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸ナトリウム（ＨＥＰＥＳ）、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、７．７ｍＭのアジ化ナトリウム、１．０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（ＥＤＴＡ）、１２ｍＭのｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、７６μＭのウシ血漿アルブミン（ＢＳＡ）及び７μＭのマウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）からなるｐＨ７．７のシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス ＴＳＨ３（甲状腺刺激ホルモン）Ｌｉｔｅ試薬緩衝液中に、２ナノモーラーに希釈した。次いで、１００マイクロリットルのアクリジニウムエステル含有溶液の希釈を２００マイクロリットルのウマ血漿（シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス マルチ希釈剤１）及び２００マイクロリットルの２つの固相のいずれかで、行なった。第１の固相は、抗ＰＴＨ抗体で誘導体化した磁性ラテックスミクロ粒子（ＭＬＰ）５０マイクログラムを含有するシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス ＡＣＳ ＰＴＨ（パラ甲状腺ホルモン）固相２００マイクロリットルである。第２の固相は、抗ＴＳＨ抗体で誘導体化した常磁性ミクロ粒子（ＰＭＰ）６０マイクログラムを含有するシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス ＡＣＳ ＴＳＨ３（甲状腺刺激ホルモン）固相２００マイクロリットルである。粒子を磁気的に収集し、１０分間インキュベーションした後、水で洗浄し、アクリジニウムエステル標識化抗体と固相とを反応させた。粒子に結合したアクリジニウムエステルの化学発光を、標準条件下に、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ Ａｕｔｏｌｕｍａｔ ＬＢ９５３ ルミノメーターで、各３００マイクロリットルのシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクスフラッシュ試薬１（０．１Ｍの硝酸及び０．５％の過酸化水素）及びシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクスフラッシュ試薬２（０．２５Ｍの水酸化ナトリウム及び０．０５％の塩化セチルトリメチルアンモニウム）で順次添加して、測定した。化学発光は、５秒間測定した。フラクショナル非特異的結合（ｆＮＳＢ）は、全化学発光入力に対する粒子結合化学発光の比として計算した。総じて、アクリジニウムエステルの疎水性は、ｆＮＳＢを上昇させ、少量の特異的シグナルの少量を区別するときには望ましくない。逆に、アクリジニウムエステルの親水性は、ｆＮＳＢを低下させ、特異的シグナルの少量を区別するときに望ましい。

（実施例１２）
化学発光動力学の測定
アクリジニウムエステル化学発光速度の急速化は、それによってアッセイスループット速度が増加する１つのパラメーターである。抗ＴＳＨ抗体に共有結合的に付着したいくつかのアクリジニウムエステルの化学発光動力学をアクリジニウムエステルの分子構造とその化学発光発光速度との相関に関して解析した。各アクリジニウムエステル標識化抗体を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、６ｍＭのアジ化ナトリウム及び１ｇ／Ｌのウシ血漿セラム（ＢＳＡ）からなる緩衝液中０．２ナノモーラーの濃度に希釈した。試験した各アクリジニウムエステル−抗体接合体のアクリジニウムエステル１０マイクロリットルについての化学発光動力学を、シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクスフラッシュ試薬１（０．１Ｍの硝酸及び０．５％の過酸化水素）及びシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクスフラッシュ試薬２（０．２５Ｍの水酸化ナトリウム及び０．０５％の塩化セチルトリメチルアンモニウム）を、順次添加して、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ Ａｕｔｏｌｕｍａｔ ＬＢ９５３ ルミノメーターで、標準条件下に、０．１秒間隔で２０秒間集積した。試験したアクリジニウムエステルの化学発光動力学を発光の相対速度について比較した。

（実施例１３）
量子収率の測定
アクリジニウムエステル化学発光量子収率の増加は、アッセイ感度が上昇する１つのパラメーターである。抗ＴＳＨ抗体に共有結合的に付着したいくつかのアクリジニウムエステルを、アクリジニウムエステルの分子構造と化学発光発光出力の大きさとの相関について、試験した。各アクリジニウムエステル標識化抗体を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、６ｍＭのアジ化ナトリウム及び１ｇ／Ｌのウシ血漿セラム（ＢＳＡ）からなるからなる緩衝液中に、０．２ナノモーラー濃度に希釈した。試験した各アクリジニウムエステル−抗体接合体のアクリジニウムエステル１０マイクロリットルについての化学発光動力学を、各３００マイクロリットルのシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクスフラッシュ試薬１（０．１Ｍの硝酸及び０．５％の過酸化水素）及びシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクスフラッシュ試薬２（０．２５Ｍの水酸化ナトリウム及び０．０５％の塩化セチルトリメチルアンモニウム）を、順次添加して、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ Ａｕｔｏｌｕｍａｔ ＬＢ９５３ ルミノメーターで、標準条件下に、１０秒間測定した。化学発光量子収率を、化学発光の試験したアクリジニウムエステルの量に対する比として、計算した。

この明細書で参照した全ての特許文献及び非特許文献を参照により、ここに、導入する。

本発明を、好ましい態様の既述の記載により述べてきた。当業者は、以下のクレームに規定された本発明の精神及び範囲から逸れることなく、これらの態様の改変及び変更をなし得ると理解すべきである。

Claims (20)

1. 下記の構造を有する親水性の高量子収率アクリジニウムエステル。
   

   

   （式中、
   Ｒ_１は、メチル基又はスルホプロピル基であり；
   各Ｇは、互いに独立して、それぞれ、（ｉ）及び（ｉｉ）から選ばれる分岐基である。
   

   

   ここで、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７は、それぞれ独立に、メチル基又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_３基であり、ここで、ｎは、１〜５の整数であり；Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。）
2. Ｇの片方又は両方が下記の基である請求項１に記載のアクリジニウムエステル。
   

   

   （式中、各Ｒ_２及びＲ_３は、独立に、メチル基又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_３基であり、ｎは、１〜５の整数である。）
3. Ｇの片方又は両方が下記の基である請求項２に記載のアクリジニウムエステル。
   

   
4. Ｇの片方又は両方が下記の基である請求項２に記載のアクリジニウムエステル。
   

   
5. Ｇの片方又は両方が下記の基である請求項２に記載のアクリジニウムエステル。
   

   
6. Ｇの片方又は両方が下記の基である請求項１に記載のアクリジニウムエステル。
   

   

   （式中、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７は、それぞれ独立に、メチル基又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_３基であり、ｎは、１〜５の整数である。）
7. Ｇの片方又は両方が下記の基である請求項６に記載のアクリジニウムエステル。
   

   
8. Ｇの片方又は両方が下記の基である請求項６に記載のアクリジニウムエステル。
   

   
9. Ｒ_１２が下記の群から選ばれるものである請求項１に記載のアクリジニウムエステル。
   （１）−ＯＨ；
   （２）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル；
   （３）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル；
   （４）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−ＣＯＯＨ；
   （５）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−サクシンイミジル（ここで、ｎは、１〜５である。）；
   （６）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）−ＣＯＯＨ（ここで、ｎは、１〜５である。）；
   （７）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ_２（ここで、ｎは、１〜５である。）；及び
   （８）−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＲ（ここで、Ｒは、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアラルキルであり；Ｒは、２０までのヘテロ原子を含んでいてもよい。）
10. Ｒ_１２が−ＯＨである請求項９に記載のアクリジニウムエステル。
11. Ｒ_１２が−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ_２（ここで、ｎは、１〜５である。）である請求項９に記載のアクリジニウムエステル。
12. Ｒ_１２が−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ”（ここで、ｎは、１〜５であり、Ｒ”は、水素又は−Ｎ−サクシンイミジルである。）である請求項９に記載のアクリジニウムエステル。
13. 下記の構造を有する請求項１に記載のアクリジニウムエステル。
    

    

    （式中、Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。）
14. 下記の構造を有する請求項１に記載のアクリジニウムエステル。
    

    

    （式中、Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。）
15. 下記の構造を有する請求項１に記載のアクリジニウムエステル。
    

    

    （式中、Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。）
16. 下記の構造を有する請求項１に記載のアクリジニウムエステル。
    

    

    （式中、Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。）
17. 下記の構造を有する請求項１に記載のアクリジニウムエステル。
    

    

    （式中、Ｒ_１２は、被検体、被検体類似体又は被検体のための結合分子にアクリジニウム化合物を接合させるための親電子性基又は親核性基である。）
18. Ｒ_１２が−ＯＨである請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のアクリジニウムエステル。
19. 以下のステップを有してなる被検体の検出又は定量のためのアッセイ。
    （ａ）（ｉ）被検体に特異的な結合分子及び（ｉｉ）請求項１に記載の、式（Ｉ）による親水性、高量子収率で迅速に発光するアクリジニウムエステルを含有してなる接合体を用意するステップ；
    （ｂ）その上に前記被検体に特異的な第２の結合分子が固定された固体支持体を用意するステップ；
    （ｃ）前記接合体、前記固相、及び、前記被検体を含有すると推測される試料を混合して結合コンプレックスを形成するステップ；
    （ｄ）固体支持体の上に捕捉された結合コンプレックスを分離するステップ；
    （ｅ）化学発光惹起試薬を添加することにより、ステップ（ｄ）からの前記結合コンプレックスの化学発光を引き起こすステップ；
    （ｆ）発光量をルミノメーターで測定するステップ；及び
    （ｇ）前記反応混合物からの発光量と、前記被検体の発光量を既知濃度に関連付ける標準用量レスポンス曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｏｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅ）とを、比較することにより、前記被検体の存在を検出し又はその濃度を計算するステップ。
20. 以下のステップを有してなる被検体の検出又は定量のためのアッセイ。
    （ａ）被検体と請求項１に記載の式（Ｉ）による親水性、高量子収率で迅速に発光するアクリジニウムエステルとの接合体を用意するステップ；
    （ｂ）被検体に特異的な結合分子で固定された固体支持体を用意するステップ；
    （ｃ）前記接合体、固体支持体、及び、前記被検体を含有すると推測される試料を混合して結合コンプレックスを形成するステップ；
    （ｄ）前記固体支持体の上に捕捉された前記結合コンプレックスを分離するステップ；
    （ｅ）化学発光惹起試薬を添加することにより、ステップ（ｄ）からの前記結合コンプレックスの化学発光を引き起こすステップ；
    （ｆ）発光量をルミノメーターで測定するステップ；及び
    （ｇ）前記反応混合物からの発光量と濃度既知の前記被検体の発光量と関連付けられた標準用量レスポンス曲線とを比較することにより、前記被検体の存在を検出し又はその濃度を計算するステップ。

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