JP2016530890A - エンベロープウイルスの産生方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、弱酸性培地中でエンベロープウイルスを産生するための方法に関する。本発明の方法を、適正製造規範（すなわちＧＭＰ）を満たす条件下でエンベロープウイルスを大規模に産生及び回収するために使用することができる。

Description

本発明は、弱酸性培地中で細胞培養により産生されたエンベロープウイルスを産生するためのプロセスに関する。本発明のプロセスは、特に、大規模に、かつ適正製造規範（ＧＭＰ）を遵守する条件下で実施された場合に産生収量を高める目的で生物医学又は生物工学研究での適用のためにこれらの粒子を産生するために有用である。

技術的背景
エンベロープウイルスベクター、特にヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）由来のベクターなどのレンチウイルスベクターは、遺伝子療法アプローチの範囲内で有望なツールである。しかし、臨床用等級のそのようなベクターの大量産生は、現時点で難題のままである。それらの産生を改善するためにいくつかのアプローチ：宿主細胞においてベクターを産生するために必要なプラスミドのトランスフェクションの最適化（例えば、トランスフェクション剤、細胞密度、プラスミドの比率などの最適化）又は特定の細胞代謝経路に焦点を当てた細胞培養条件（例えば、脂質、コレステロール、クロロキン、酪酸ナトリウムなどの添加）が提唱されている（Ansorge et al. 2010; Schweizer and Merten 2010）。

本発明者らは、この分野を拡張し、物理化学的パラメーターを最適化するという考えをもち、より詳細にはｐＨ条件に関心があった。培地のｐＨが中性であることは、哺乳動物細胞を培養するための重大なパラメーターとして見なされる。そのうえ、研究によって、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を有するシュードタイプレンチウイルスが、ｐＨ６のリン酸緩衝液中で不安定であることが報告された（Higashikawa and Chang 2001）。これらの要素を考慮すると、当業者は、培地中のｐＨ低下がエンベロープウイルスの産生にマイナスの影響を及ぼすと考えたであろう。

発明の概要
本発明は、エンベロープウイルスを産生している細胞が弱酸性培地中で培養されたとき、前記ウイルスの産生に改善が観察されることに起因する。全く驚くべき方法で、前記弱酸性条件は、従来使用された中性培地で得られた感染力価の２〜３倍の感染力価を有するウイルスを産生する可能性を与えた。

したがって、本発明の目的は、エンベロープウイルスを産生するための弱酸性条件の使用である。より詳細には、本発明は、エンベロープレンチウイルスベクターを産生するためのプロセスであって、前記ベクターを産生する宿主細胞を培養するために使用される培地が弱酸性培地であることを特徴とするプロセスに関する。

発明の詳細な説明
したがって、本発明は、エンベロープベクターを産生するためのプロセスであって、前記ベクターが、弱酸性条件下で産生されることを特徴とするプロセスに関する。

表現「弱酸性条件」は、５から６．６の間、特に５．５から６．６の間、又は５から６．２の間、より詳細には５．８から６．２の間に含まれる水溶液のｐＨを表す。ｐＨは、特に５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１又は６．２に等しい。特定の一実施態様によると、ｐＨは約６である。選択されたｐＨは、また、使用される培地の緩衝力に依存し、当業者は、それを自分の一般知識を考慮して容易に決定することができる。

当業者は、溶液のｐＨ、特に細胞培地のｐＨを改変することができる。当業者は、特に酸、特に塩酸などの強酸の溶液を前記溶液に導入してもよい。ｐＨを再調整して所望の値にするために、必要ならば、塩基、特に水酸化ナトリウムなどの強塩基の溶液を使用してもよい。

本発明の目的である弱酸性条件を除き、エンベロープウイルスを産生するために使用されるプロセスは、当技術分野において周知のプロセス及び材料を適用する。当業者は、特に（Ansorge et al. 2010; Schweizer and Merten 2010; Rodrigues et al. 2011）によって例証される、エンベロープウイルスの産生における自分の一般知識を参照してもよい。

本発明の範囲内で、「ウイルス」という用語は、自然界で見られるような天然ウイルスと、由来する親ウイルスのゲノムに比べてゲノムが改変を含む改変ウイルスとの両方を意味する。これは、由来する天然ウイルスに比べて病原力の全て又は一部を欠如した弱毒ウイルスであり得る。そのゲノムは、細胞培養物又は生きた生物における連続継代の間にインビボで改変される。用語「ウイルス」は、ゲノムが遺伝子工学技法によってインビトロで改変された組換えウイルスも表し得る。改変は、例えばウイルス複製のための少なくとも１種の必須遺伝子の不活性化（ウイルスを複製欠損にする）及び／又はタンパク質若しくは（普通は天然ウイルスによってコードされない）異種ＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントの挿入を可能にし得る。後者の場合、これは、「ウイルスベクター」と呼ばれる。挿入は、標的細胞において異種ＤＮＡを発現させるようにウイルスゲノムの適切な領域内に行われる。用語「ウイルス」は、シュードウイルス粒子、すなわち表面のエンベロープ糖タンパク質又はゲノムのいずれかを有さず、かつウイルスの構造タンパク質及び／又は酵素タンパク質の自然集合によって得られるウイルス粒子も表す。

特定の一実施態様によると、エンベロープウイルスはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、特にレトロウイルス、例えばレンチウイルスから得られる。本発明により産生されるレトロウイルスベクターは、特に、アルファレトロウイルス（トリ白血病ウイルスにあたるＡＬＶなど）から、ベータレトロウイルス（マウス乳癌ウイルスにあたるＭＭＴＶなど）から、ガンマレトロウイルス（マウス白血病ウイルスにあたる様々な種類のＭＬＶなど）から、デルタレトロウイルス（ヒトＴリンパ球向性ウイルスにあたる様々な種類のＨＴＬＶなど）から、イプシロンレトロウイルス（ウォールアイ皮膚肉腫ウイルスにあたるＷＤＳＶなど）から、スプーマウイルス（ヒトフォーミーウイルスにあたるＨＦＶ及びサルフォーミーウイルスにあたるＳＦＶなど）から、様々な種類のヒト免疫不全ウイルス（ヒト免疫不全ウイルスにあたるＨＩＶ）、様々な種類のサル免疫不全ウイルス（サル免疫不全ウイルスにあたるＳＩＶ）などの霊長類レンチウイルスから、又はウマ伝染性貧血ウイルス（ウマ伝染性貧血ウイルスにあたるＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ネコ免疫不全ウイルスにあたるＦＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ヤギ関節炎脳炎ウイルスにあたるＣＡＥＶ）、若しくはヒツジビスナ−マエディウイルス（ビスナ−マエディウイルスにあたるＶＭＶ）などの非霊長類性哺乳類レンチウイルスから得られる。

特定の一実施態様によると、レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターは、シュードタイプ化されており、すなわち、それは、レトロウイルス粒子が得られるウイルスとは異なるウイルスから得られるエンベロープ糖タンパク質、改変エンベロープ糖タンパク質又はキメラエンベロープ糖タンパク質を含む。特定の一実施態様によると、レトロウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス由来エンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）又はテナガザル白血病ウイルス（テナガザル白血病ウイルスにあたるＧＡＬＶ）由来エンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化されるものの、当業者は、他のウイルス性エンベロープ糖タンパク質の使用を考えてもよい（Frecha et al. 2008）。特定の一実施態様によると、レトロウイルスベクター、より詳細にはレンチウイルスベクターは、ＧＡＬＶＴＲ（ビリオン内Ｃ末端が両種指向性ヒト白血病誘発ウイルスＡ−ＭＬＶのエンベロープ糖タンパク質のＣ末端と置換されていることで、レンチウイルス粒子内へのエンベロープ糖タンパク質の高効率組み込みが可能になるＧＡＬＶのエンベロープ糖タンパク質）などの改変エンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化されている（Christodoulopoulos and Cannon 2001）。特定の一実施態様によると、レトロウイルスベクター、より詳細にはレンチウイルスベクターは、標的細胞表面での所与の受容体の特異的ターゲティングを可能にするために、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の様々な領域をコードする融合タンパク質（単鎖可変フラグメントにあたるｓｃＦｖ）又はリピートアンキリンドメインを有するタンパク質（設計アンキリンリピートタンパク質にあたるＤＡＲＰｉｎ）が挿入されている麻疹ウイルスのエンベロープ糖タンパク質などのキメラエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化される（Anliker et al. 2010; Munch et al. 2011）。

特定の一実施態様によると、レトロウイルスベクター、より詳細にはレンチウイルスベクターをシュードタイプ化するために使用されるウイルスエンベロープ糖タンパク質は、ラブドウイルス科、特にベシクロウイルス属（例えばＶＳＶ−Ｇ）又はリッサウイルス属（例えば、狂犬病ウイルス、モコラウイルス）；アレナウイルス科（例えばリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ））；トガウイルス科、より詳細にはアルファウイルス属（例えばロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）；フィロウイルス科、最も詳細にはフィロウイルス属（例えば、エボラウイルス、ラッサウイルス）；レトロウイルス科、より詳細にはアルファレトロウイルス属（例えば、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、ベータレトロウイルス属（例えばヤーグジークテヒツジレトロウイルス）、ガンマレトロウイルス属（例えば、様々なマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、野生型ヒヒ内在性ウイルス（ＢＡＥＶ）又は改変型（ＢＡＥＶＴＲ）、野生型テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）又は改変型（ＧＡＬＶＴＲ））、デルタレトロウイルス属（例えばヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１）、スプーマウイルス属（例えばヒトスプーマウイルス（spumous virus））、レンチウイルス属（例えばマエディ−ビスナウイルス（ＭＭＶ））；コロナウイルス科、より詳細にはコロナウイルス属（例えばＳａＲＳ−ＣｏＶ）；パラミクソウイルス科、より詳細にはレスピロウイルス属（例えば、センダイウイルス、ヒトパラインフルエンザ３型ウイルス）、ヘニパウイルス属（例えばニパーウイルス）、モルビリウイルス属（例えば麻疹ウイルス）；フラビウイルス科（flaviridae）、より詳細にはヘパシウイルス属（例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））；オルトミクソウイルス科、より詳細にはＡ型インフルエンザウイルス属（例えばインフルエンザウイルス）；バキュロウイルス科、より詳細には核多角体ウイルス属（例えばオートグラファカリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス）に属するウイルスのエンベロープ糖タンパク質から得られる。シュードタイプ化のために使用されるエンベロープ糖タンパク質は、より詳細には改変型エンベロープ糖タンパク質、例えば麻疹−ＳｃＦＶ、ツパイ−ＳｃＦＶ、シンドビス−ＳｃＦＶエンベロープ糖タンパク質などの単一可変鎖ＳｃＦＶを有する抗体フラグメントと融合されたエンベロープタンパク質；麻疹／ＤＡＲＰｉｎエンベロープタンパク質などのアンキリンリピートドメインと融合されたエンベロープタンパク質；又はさらに欠陥結合タンパク質を用いたＶＳＶ−Ｇ＋ナノボディーディスプレイである。

特定の一実施態様によると、本発明により産生されたレトロウイルス、より詳細にはレンチウイルスは、ＶＳＶ−Ｇ、麻疹、ＧＡＬＶ若しくはＢＡＥＶ（ウイルスがレトロウイルスの場合）、ＧＡＬＶＴＲ若しくはＢＡＥＶＴＲ（ウイルスがレンチウイルスの場合）又はバキュロウイルスｇｐ６４糖タンパク質でシュードタイプ化されている。

そのうえ、エンベロープウイルスは、そのゲノムに導入された関心対象の導入遺伝子を含み得る。もちろん、関心対象の導入遺伝子は、エンベロープウイルスベクターを充てることになっている特定の使用に依存する。例証として、治療用ＲＮＡをコードする関心対象の導入遺伝子（例えば、標的ＲＮＡ若しくはＤＮＡ配列の相補的アンチセンスＲＮＡをコードする関心対象の導入遺伝子）、病態に冒された被験体における欠損若しくは不在タンパク質をコードする遺伝子療法用導入遺伝子、又はＤＮＡのワクチン接種のために使用される導入遺伝子、すなわちタンパク質をコードする導入遺伝子であって、その発現が、受入れ側生物に前記タンパク質に対するワクチン接種を引き起こす導入遺伝子が挙げられよう。したがって、本発明によるプロセスは、遺伝子療法に使用され得るエンベロープウイルスベクターの産生を可能にする。本発明によるプロセスは、有利には、医薬品安全性試験実施基準に適合し、エンベロープウイルスベクター、特にレンチウイルスベクター、特にシュードタイプ化レンチウイルスベクター（特にＶＳＶ−Ｇ又はＧＡＬＶＴＲエンベロープタンパク質を用いた）の大規模産生を考慮する可能性を与える。

レンチウイルスベクターを産生するための好ましい一実施態様によると、以下の４つのエレメント：レンチウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子を含む発現カセット、レンチウイルスｒｅｖ遺伝子を含む発現カセット、レンチウイルスＬＴＲ−５’とＬＴＲ−３’との間に含まれる関心対象の導入遺伝子の発現カセット、及びエンベロープ糖タンパク質の発現カセットが宿主細胞に導入される。

特定の一実施態様では、エンベロープウイルス、特にレトロウイルスベクター、より詳細にはレンチウイルスベクターは、エンベロープウイルスを産生するために必要な１つ以上のエレメントを発現している安定系統（Miller 2001; Rodrigues et al. 2011）、例えば、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化されたＨＩＶ−１から得られたレンチウイルスベクターを構成的に産生するヒト産生系統ＧＰＲＧ−ＥＦ１α−ｈχ_ｃＯＰＴ（Greene et al. 2012）、又は例えばＧＡＬＶエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化されたガンマレトロウイルスベクターＭＬＶを構成的に産生するマウス産生系統ＰＧ１３−ＭＦＧ−ＧＦＰ（Merten 2004）などから産生される。特定の一実施態様では、エンベロープウイルスは、ウイルスを産生するために必要なエレメントをコードする１つ以上のプラスミドが一過性トランスフェクトされた哺乳類宿主細胞から産生される。レンチウイルスベクターを産生させる一代替によると、前記エレメントは、４つのプラスミド：レンチウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子を含む発現カセットを有するプラスミド、レンチウイルスｒｅｖ遺伝子を含む発現カセットを有するプラスミド、レンチウイルスＬＴＲ−５’とＬＴＲ−３’との間に含まれる関心対象の導入遺伝子の発現カセットを含む伝達プラスミド、及びエンベロープ糖タンパク質の発現カセットを有するプラスミドによって細胞内に導入される。

当業者は、本開示から、ウイルスの産生が開始されるとすぐに、本発明に従って弱酸性培地中の培養が実施されることを理解している。すなわち、産生細胞と接触する前にｐＨが弱酸性である培地中で、産生細胞が培養される。特定の一実施態様によると、細胞は、トランスフェクションの５〜２４時間後に、より詳細にはトランスフェクションの１０〜２０時間後に、なおより詳細にはトランスフェクションの１６〜２０時間後に、弱酸性培地中で培養される。

宿主細胞は、エンベロープウイルスの産生を可能にする任意の細胞より選択してもよい。特定の一実施態様によると、前記細胞は、ヒト細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、Ｔｅ６７１、ＨＴ１０８０、ＣＥＭ）、ネズミ科細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）、イタチ科細胞（Ｍｐｆ）、イヌ科細胞（Ｄ１７）（Miller 2001; Miller and Chen 1996; Merten 2004; Rodrigues et al. 2011; Stacey and Merten, 2011）より選択される。

細胞は、哺乳動物細胞の培養及びエンベロープウイルスの産生に適切な培地中で培養される。そのうえ、培地は、適切な濃度で添加される抗生物質、血清（特にウシ胎児血清等）などの、当技術分野において周知の添加剤が補充され得る。使用される培地は、特に、血清を含む又は無血清であってもよい。哺乳動物細胞を培養するための培地は、当技術分野において周知である。ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地、ＲＰＭＩ１６４０又は様々な培地の混合物、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２など、又はｏｐｔｉＭＥＭ（登録商標）、ｏｐｔｉＰＲＯ（登録商標）、ｏｐｔｉＰＲＯ−ＳＦＭ（登録商標）、ＣＤ２９３（登録商標）、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ１７（登録商標）（Life Technologies）若しくはＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）２９３（Sigma-Aldrich）などの無血清培地が挙げられ得る。

一過性トランスフェクトされた細胞を使用するプロセスにおいて、プラスミドのトランスフェクションを可能にする任意の薬剤を使用してもよい。特に、リン酸カルシウム又はポリエチレンイミンを特に使用してもよいものの、他の薬剤が当業者によって考慮され得る（Ansorge et al. 2010）。条件（特にプラスミドの量、プラスミド間の比、プラスミドとトランスフェクション剤との比、培地の種類等）及びトランスフェクション時間は、産生されるウイルス及び／又は伝達プラスミドに導入される導入遺伝子の特徴に応じて当業者によって適応され得る。

次に、エンベロープウイルスは、当技術分野において周知の方法により培養上清から採集される。

特定の一実施態様によると、本発明によるプロセスは、以下の：
− 前記エンベロープベクターを産生するために必要なエレメントをコードする１つ以上のプラスミドによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクトする段階；
− ｐＨが約６の適切な培地中で前記細胞を培養する段階；
− 培養上清中のエンベロープウイルスを採集する段階
を含む。

この実施態様の一代替によると、産生されたエンベロープウイルスは、４つのプラスミド：レンチウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子を含む発現カセットを有する１つのプラスミド、レンチウイルスｒｅｖ遺伝子を含む発現カセットを有する１つのプラスミド、レンチウイルスのＬＴＲ−５’とＬＴＲ−３’との間に含まれる関心対象の導入遺伝子の発現カセットを含む１つの伝達プラスミド、及びエンベロープ糖タンパク質の発現カセットを有する１つのプラスミドによる細胞のトランスフェクション後に産生されたレンチウイルスである。一代替によると、エンベロープタンパク質は、ＶＳＶウイルス（特にＶＳＶ−Ｇエンベロープ）又はＧＡＬＶウイルス（特にレンチウイルスベクターについてのＧＡＬＶＴＲ改変糖タンパク質）から得られる。

次に、産生されたウイルス又はウイルスベクターを、当業者に周知のプロセスに従って精製してもよい（Segura et al. 2011）。

そのうえ、本発明は、哺乳動物細胞を培養するための培地であって、弱酸性である培地に関する。特に、培地は、５．５から６．６の間、より詳細には５．８から６．２の間に含まれるｐＨである。より詳細には、本発明による培地のｐＨは、約６である。別の特定の実施態様によると、培地は、弱酸性ＤＭＥＭ、特に本明細書において前記と同義のｐＨを有する培地である。特に、本発明による培地は、ｐＨが５．８から６．２の間に含まれるＤＭＥＭ培地、特にｐＨ６のＤＭＥＭ培地である。本発明による培地は、細胞を培養する前の弱酸性ｐＨによって特徴付けられることが理解される。

そのうえ、本発明は、弱酸性培地、又は培地のｐＨを弱酸性値にするために有用な１つ以上の溶液を伴う前記培地を含む、上記と同義のエンベロープウイルスを産生するためのプロセスを適用するためのキットであって、さらに：
（ａ）エンベロープウイルスを産生するために適切な１つ以上のプラスミド；及び／又は
（ｂ）前記ウイルスを産生するために適切な細胞
を含むキットに関する。

本発明のキットは、本発明によるエンベロープウイルスを産生するためのものである。したがって、キットは、さらに、本発明によるエンベロープウイルスの産生を可能にするキットの様々な成分を使用するための説明書を含み得る。特に、これらの説明書は、産生のための細胞が、どのように適切なプラスミドでトランスフェクションされ、培地中で培養されなければならないかを示し得る。特に、説明書は、エンベロープウイルスを産生する細胞が、上に詳述したように弱酸性ｐＨを有する培地中で培養されなければならないことを示す。

本発明は、また、上記と同義のエンベロープウイルスを産生するためのプロセスを適用するためのキットであって、（ｉ）前記プロセスを適用するための手段及び（ｉｉ）該プロセスを適用するために従うべき説明書、を含むキットに関する。特定の一実施態様によると、キット中に含まれる手段は、以下の手段：
（ａ）エンベロープウイルスを産生するために適切な１つ以上のプラスミド；
（ｂ）前記ウイルスを産生するために適切な細胞；及び
（ｃ）弱酸性培地、又は培地のｐＨを弱酸性値にするために有用な１つ以上の溶液を伴う前記培地
の１つ以上より選択される。

したがって、本発明によるキットは、特に手段（ａ）及び（ｂ）、（ａ）及び（ｃ）、（ｂ）及び（ｃ）又は（ａ）及び（ｂ）及び（ｃ）を含み得る。

本発明は、また、上に詳述したエンベロープウイルスを産生するためのプロセスを適用するためのキットであって、培地のｐＨを弱酸性値にするために有用な１つ以上の溶液を伴う前記培地を含むキットに関する。

ＧＡＬＶＴＲエンベロープでシュードタイプ化されたレンチウイルスベクター（ＬＶ）（ＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ）の多様なｐＨ条件下での産生を示す図である。（ａ）塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて、培地（ＤＭＥＭ／ＦＣＳ）を表示ｐＨに緩衝化した。培地中に含有されるｐＨ指示薬（フェノールレッド）は、黄色（ｐＨ６）から紫色（ｐＨ８）にわたる色を有する。（ｂ）ＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ粒子を、表示のｐＨ値のＤＭＥＭ／ＳＶＦ培地中で培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生した。感染力価（TU/ml）を、ＨＣＴ１１６細胞のトランスダクション及びフローサイトメトリーによるＧＦＰ導入遺伝子の発現レベルの定量後に決定した。物理的粒子ＧＡＬＶＴＲ−ＬＶの上清の含量を、市販のＥＬＩＳＡキットによりＨＩＶ−１のカプシドｐ２４の定量測定によって定量した。感染力価と物理的粒子の量との比に対応する比活性（ｐ２４のTU/ng）をヒストグラムの下に図示する。結果は、２つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。ｐＨ７．２又はｐＨ６の培地中でＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターの７つのバッチを産生し、それらの感染性粒子（ｃ）又は物理的粒子（ｄ）の含量について力価検定した。（ｅ）各ＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ上清の比活性を図示する。バーは、分布の平均値を示す。 中性又は弱酸性ｐＨ条件下でのＶＳＶ−Ｇ−ＬＶレンチウイルスベクターの産生を示す図である。（ａ）表示のｐＨのＤＭＥＭ／ＳＶＦ培地中で培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からＶＳＶ−Ｇ−ＬＶベクターの６つのバッチを産生した。図１ｂのように感染力価を決定した。（ｂ）物理的粒子の量を、市販のＥＬＩＳＡキットによりＨＩＶ−１のカプシドｐ２４の定量測定によって決定した。（ｃ）各ＶＳＶ−Ｇ−ＬＶ上清の比活性を図示する。バーは、分布の平均値を示す。 中性又は弱酸性ｐＨ条件下でのＧＡＬＶ−ＭＬＶガンマレトロウイルスベクターの産生を示す図である。表示のｐＨのＤＭＥＭ／ＳＶＦ培地中で培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からＶＳＶ−Ｇ−ＬＶベクターの６つのバッチを産生した。図１ｂのように感染力価を決定した。バーは、分布の平均値を示す。 数回の凍結／解凍サイクル後のＧＡＬＶＴＲ−ＬＶレンチウイルス粒子の安定性の研究を示す図である。（ａ）ベクターについての凍結／解凍手順の図示。（ｂ）ｐＨ７．２（黒色）又はｐＨ６（灰色）で産生されたＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターの数バッチを１又は２回の凍結／解凍サイクルに曝露した。図１ｂのように感染力価を決定した。データは、得られた様々な感染力価（左図）を表し、又は１回の凍結／解凍サイクルに対応する条件を１００％として規準化した（右図）。室温（Ｒ．Ｔ．）、凍結（Ｆｒｅｅｚ．）、解凍（Ｔｈａｗ．）。 温度３７℃に曝露後のＧＡＬＶＴＲ−ＬＶレンチウイルス粒子の安定性の研究を示す図である。ｐＨ７．２又はｐＨ６で産生されたＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ粒子１mlが入った凍結チューブを３７℃で０〜４日間インキュベートした。次に、図１ｂのように感染力価を決定した。（ａ）データを、３回の独立した実験から得られた感染力価、又は（ｂ）感染力価の平均±標準偏差のいずれかとして表し、対照条件（３７℃に暴露されていないＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターに対応する条件）を１００％として規準化した。 中性又は弱酸性ｐＨの培地中で培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の産生における細胞内ｐ５５ｇａｇの発現レベルの研究を示す図である。（ａ）ｐＨ７．２又はｐＨ６でＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターを産生しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解液（lyzate）中のｐ５５ｇａｇ発現のウエスタンブロット。ｐ５５ｇａｇの発現レベルをアクチンの発現レベルに対して規準化する。（ｂ）ヒストグラムは、４回の独立した実験におけるアクチンの発現レベルに対して規準化されたｐ５５ｇａｇの平均発現レベル±標準偏差を表す。

実施例
装置及び方法
細胞培養
ヒト結腸直腸癌由来ＨＣＴ１１６細胞（ＣＣＬ−２４７; ATCC, Manassas, VA)、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Merten et al. 2011）、及びガンマレトロウイルスＧＡＬＶ−ＭＬＶ産生細胞（ＰＧ１３−ＭＦＧ−ＧＦＰ系統）（Fenard et al. 2013）を、２〜１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Life Technologies, St-Aubin, France）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ＋Glutamax）中にて３７℃で５％ ＣＯ_２を加えて培養した。塩酸又は水酸化ナトリウムを使用することによってＤＭＥＭ／ＦＣＳ培地を表示のｐＨ値に緩衝化し、次にフィルター滅菌した（０．２２μ）。

ウイルスベクターの産生及び力価検定
リン酸カルシウムを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に４種のプラスミド、すなわちｇａｇｐｏｌの発現プラスミド（ｐＫＬｇａｇｐｏｌ）、ｒｅｖの発現プラスミド（ｐＢＡｒｅｖ）、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする伝達プラスミド（ｐＣＣＬ−ｅＧＦＰ）及びＧＡＬＶＴＲエンベロープ糖タンパク質又はＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミド（ｐＢＡ．ＧＡＬＶ／Ａｍｐｈｏ−Ｋａｎａ又はｐＭＤＧ）を一過性トランスフェクトすることによって、ＨＩＶ−１由来レンチウイルスベクターを作製した（Fenard et al. 2013）。トランスフェクションの１６〜２０時間後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を洗浄し、６から８の間に含まれる表示のｐＨ値に緩衝化したＤＭＥＭ／ＳＶＦ培地中でインキュベートした。２４時間産生後に、ウイルス上清を収集し、濾過し（０．４５μ）、−８０℃で凍結した。物理的粒子の力価を、市販のＥＬＩＳＡキット（Perkin Elmer, Courtaboeuf, France）によりＨＩＶ−１のｐ２４カプシドの定量測定によって決定した。感染力価を、ＨＣＴ１１６細胞を用いてフローサイトメトリー（FACSCalibur, BD Biosciences, Le Pont de Claix, France）によりＧＦＰを検出することによって決定し、力価は１ミリリットルあたりのトランスダクションユニット（TU/ml）で表現した（Fenard et al. 2013）。

ウイルスベクターの温度３７℃及び複数の凍結／解凍サイクルへの曝露
ｐＨ７．２又は６で産生されたＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ上清（エンベロープ糖タンパク質ＧＡＬＶＴＲでシュードタイプ化されたレンチウイルスベクター）が入った１ml凍結チューブを３７℃で表示時間インキュベートした（チューブのスクリューキャップは閉じたまま）。次に、チューブを再度−８０℃で凍結させ、試験間変動を防ぐためにＨＣＴ１１６細胞を用いた力価検定を全条件について同時に行った。

凍結／解凍に対する安定性実験のために、最初及び２回目の凍結／解凍サイクルを、同じＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ産生からの２つの異なる試料を用いて並行して実施した。この手順により、あらゆる試験間変動を回避するためにＧＡＬＶＴＲ−ＬＶの全ての感染力価を同時に評価できるようになる。

ウエスタンブロット及び分析
産生細胞を洗浄し、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００mM ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、１０％ グリセロール、１mM ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（complete protease inhibitor cocktail, Roche Diagnostics, Meylan, France）を補充した１mM ＰＭＳＦを含有する緩衝液中で溶解させた。タンパク質濃度を、Bio-Rad DC Protein Assay kit I（Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France）により決定した。タンパク質（３０μg/トラック）を１０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲル（ＰＡＧＥ）で分離し、ニトロセルロース膜Hybond ECL（GE Healthcare Life Sciences, Velizy-Villacoublay, France）上に転写し、ヤギ抗ｐ２４抗体（Abd Serotec, Oxford, UK）及びマウス抗アクチン抗体（ＡＣ−１５クローン）（Sigma-Aldrich, St-Quentin-Fallavier, France）を組み合わせることによってイムノブロットを作った。ＩＲＤｙｅ ８００結合型のロバ抗ヤギ抗体及びＩＲＤｙｅ ６８０結合型のロバ抗マウス抗体を二次抗体として使用した（Eurobio, Courtaboeuf, France）。赤外Odysseyスキャナーを用いて免疫反応性のバンドを検出し、分析ソフトウェアOdyssey 3.0（LI-COR Biosciences, Lincoln, NE）を用いて定量した。

統計解析
Ｐ値を、GraphPad Prism 5ソフトウェアによるノンパラメトリックWilcoxon検定で決定した。

結果
弱酸性培地中でのＧＡＬＶＴＲ−ＬＶレンチウイルスベクターの産生
ＧＡＬＶＴＲエンベロープ糖タンパク質によりシュードタイプ化されたレンチウイルスベクター（ＬＶ）（ＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ）は、造血幹細胞を非常に効果的にトランスダクションする（Sandrin et al. 2002; Jacome et al. 2009）。しかし、この種のベクターの大規模産生は、大きな難問のままである。ｐＨ６〜８の様々な培地中でのＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターの産生効率を評価した（図１ａ）。図１ｂは、ｐＨ８で得られた感染力価が、典型的なｐＨ７．２での感染力価よりも大きく減少していることを示す。逆に、全く驚くことに、ｐＨ６の培地中で産生されたＧＡＬＶＴＲ−ＬＶの感染力価は、ｐＨ７．２で得られた力価よりも有意に大きい（２．３倍）（図１ｂ及び１ｃ）。本発明者らが、ｐＨ６で産生されたＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ上清中のｐ２４抗原の量にも同時に増加を観察していることに留意することが肝要である（図１ｂ及び１ｄ）。この正の相関関係は、中性又は弱酸性ｐＨで産生されたベクターの間で比活性が安定であることにつながり（図１ｂ及び１ｅ）、一方でこの比活性はｐＨ８で大きく減少する（図１ｂ）。したがって、弱酸性条件の利用は、大量のＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターを産生するために最適な条件に相当する。

ＶＳＶ−Ｇタンパク質でシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターの産生及びＧＡＬＶタンパク質でシュードタイプ化されたＭＬＶガンマレトロウイルスベクターに及ぼす弱酸性ｐＨ条件の効果
ＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターで得られた、励みになる結果は、当技術分野において非常に広く使用されているエンベロープ糖タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質でシュードタイプ化されたレンチウイルスベクター（ＶＳＶ−Ｇ−ＬＶベクター）を産生するためにこれらの同じ条件を試験するよう本発明者らを駆り立てた。図３は、ｐＨ６の培地が、感染性ＶＳＶ−Ｇ−ＬＶ粒子（図２ａ）及び物理的ＶＳＶ−Ｇ−ＬＶ粒子（図２ｂ）の産生を、平均で１．５倍有意に増加させ、比活性は安定である（図２ｃ）ことを示す。Higashikawaのチーム（前掲）によって報告された６に等しいｐＨの有害作用は、おそらく、中性ｐＨでレトロウイルス粒子を産生し、それらを濃縮し、次にｐＨ６に緩衝化された非イオン溶液中にそれらを希釈した、これらの著者によって利用された手順の結果であり、ウイルス上清の感染性を９０％喪失させた。予想外に、ＦＣＳを補充したｐＨ６の培地中で直接産生されたＶＳＶ−Ｇ−ＬＶ粒子は、安定なだけでなく、この種の産生に最適であると従来認識されているｐＨ７．２の培地から産生された場合よりも予想外に高いレベルで産生される。

観察された改善が、使用されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はただ１つのレンチウイルスベクターを産生することに依存しないことを確認するために、ＧＡＬＶ−ＭＬＶ（エンベロープ糖タンパク質ＧＡＬＶでシュードタイプ化されたＭＬＶガンマレトロウイルス）を産生しているＰＧ１３−ＭＦＧ−ＧＦＰ細胞系で弱酸性ｐＨの効果を評価した（Merten 2004）。本来のＰＧ１３細胞系は、ＭＬＶウイルスのパッケージングシステム（ｐＬＧＰＳ）及びＧＡＬＶエンベロープ糖タンパク質をコードする構築物（ｐＭＯＶ−ＧＡＬＶ）を安定的にトランスフェクトされたマウス線維芽細胞系（ＮＩＨ−３Ｔ３）である（Miller et al. 1991）。レトロウイルスＧＡＬＶ−ＭＬＶシュードタイプを構成的産生するために、ＭＬＶのＬＴＲプロモーターの制御下に置かれたＧＦＰタンパク質をコードする伝達プラスミド（ｐＭＦＧ−ＧＦＰ）をＰＧ１３系に安定的に導入した。並行して産生された細胞培養物において、ｐＨ７．２又はｐＨ６に緩衝化されたＤＭＥＭ中でＰＧ１３−ＭＦＧ−ＧＦＰ細胞をインキュベートし、２４〜４８時間後に、採集された上清中の感染性粒子の含量を評価した。図３は、ＧＡＬＶ−ＭＬＶ粒子の産生が弱酸性ｐＨで有意に増加することを示す。この結果は、提唱された産生プロセスがＨＥＫ２９３Ｔ系などのヒト細胞系に限らないこと、及び本プロセスがレンチウイルスベクターの産生に特に適応している上に、本発明の手順により他のエンベロープウイルスがより効率的に産生され得るので、レンチウイルス属のベクターの産生に限定されないことを示していることから、特に興味深い。

複数の凍結／解凍サイクルに曝露されたＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ粒子の安定性
採集されたレンチウイルスベクターの上清は、一般的に精製前に−８０℃で保存される。凍結又は解凍手順中に弱酸性ｐＨ条件がビリオンの不活性化を増加させるという有害作用を有すると想定される可能性もあろう。したがって、ＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ粒子の上清を１又は２回の凍結／解凍サイクルに供し、感染力価を各解凍段階で決定した（図４ａ）。図４ｂは、弱酸性条件が粒子の感染性に影響しないことを示す。１回のサイクルに比べた２回の凍結／解凍サイクル後の感染力価の平均減少は、７．２及びｐＨ６の両方でわずか５％である。したがって、レンチウイルスベクターを弱酸性条件下で凍結した場合に感染性は変化しない。

ＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ粒子を温度３７℃に長期曝露する影響
レンチウイルスのトランスダクション中に、標的細胞（本発明者らの場合は哺乳動物細胞）を温度３７℃で培養する。したがって、本発明者らは、レンチウイルスベクターを弱酸性ｐＨで産生することが、温度３７℃への多少の長期曝露後にその安定性に有害作用を有したかどうかを判定しようと試みた。このために、ｐＨ７．２又はｐＨ６で産生されたＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターの上清が入った凍結チューブを３７℃で０〜４日間インキュベートし、感染性の減少動態を追跡した。図５ａに示すように、ｐＨ７．２で産生されたＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクター及びｐＨ６で産生されたベクターの両方について、３７℃への長期曝露後に感染力価は大きく減少するが、この減少の傾きは、ｐＨ６で産生されたＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターの方が顕著ではない。結果として得られた、ｐＨ６で産生されたＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターの半減期は、ｐＨ７で産生されたＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターで観察された半減期の２倍である（１日に対して約２日、図５ｂ参照）。興味深いことに、この実験から、ＧＡＬＶＴＲ−ＬＶベクターの粗上清が閉鎖環境（チューブのスクリューキャップを閉じてある）中で温度３７℃でかなり抵抗性である（半減期１〜２日）ことが示された。わずか６時間の半減期を示す、細胞培養物での安定性とこれを対照されたく（Strang et al. 2004）、このことは、３７℃の細胞培養物中でのレンチウイルスベクターの安定性を評価する場合、酸化ストレスなどの温度以外のパラメーターも考慮しなければならないことを示唆している。

弱酸性ｐＨで培養されたＨＥＫ２９３Ｔ産生細胞におけるｐ５５ｇａｇの細胞内発現レベルの調節
上清ＧＡＬＶＴＲ−ＬＶ中から採集されたＨＩＶ−１のｐ２４タンパク質の量は、弱酸性条件下で改善する（図１ｂ及び１ｄ）。したがって、本発明者らは、この増加が産生細胞中のＨＩＶ−１のｐ５５ｇａｇ前駆タンパク質の細胞内発現レベルにおける増加の結果であり得るかどうかを判定しようと試みた。図６ａにおいて、イムノブロット実験から、ｐＨ７．２に比べてｐＨ６でｐ５５ｇａｇの細胞内発現が増加し、平均１６０％の過剰発現であることが示されている（図６ｂ）。ｐ５５ｇａｇの細胞内過剰発現とレンチウイルス上清中のｐ２４タンパク質の量の増加とのこの正の相関関係は、弱酸性条件が、ウイルス成分の最適な発現にとって、より好都合な環境を生成することを示唆している。

参考文献
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Claims (15)

1. エンベロープウイルスを産生する宿主細胞が弱酸性培地中で培養されることを特徴とする、エンベロープウイルスを産生するためのプロセス。
2. 培地のｐＨが５．８から６．２の間に含まれ、より詳細にはｐＨが約６である、請求項２記載のプロセス。
3. エンベロープウイルスが、場合によりシュードタイプ化されたレトロウイルスである、請求項１〜２のいずれか一項記載のプロセス。
4. エンベロープウイルスが、場合によりシュードタイプ化されたレンチウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項記載のプロセス。
5. レトロウイルスが、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質又はＧＡＬＶエンベロープタンパク質より選択されるエンベロープタンパク質でシュードタイプ化されている、請求項４記載のプロセス。
6. レンチウイルスが、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質又はＧＡＬＶＴＲエンベロープタンパク質より選択されるエンベロープタンパク質でシュードタイプ化されている、請求項５記載のプロセス。
7. 宿主細胞が、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、Ｔｅ６７１、ＣＥＭ、ＮＩＨ−３Ｔ３、Ｍｐｆ又はＤ１７細胞より選択される、請求項１〜６のいずれか一項記載のプロセス。
8. − 前記エンベロープベクターを産生するために必要なエレメントをコードする１つ以上のプラスミドによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクトする段階；
   − ｐＨが約６の適切な培地中で前記細胞を培養する段階；
   − 培養上清中のエンベロープウイルスを採集する段階
   を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載のプロセス。
9. １つのプラスミドが、レンチウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子を含む発現カセットを有し、１つのプラスミドが、レンチウイルスｒｅｖ遺伝子を含む発現カセットを有し、１つの伝達プラスミドが、レンチウイルスのＬＴＲ−５’とＬＴＲ−３’との間に含まれる関心対象の導入遺伝子の発現カセットを含み、１つのプラスミドが、エンベロープ糖タンパク質の発現カセットを有する、４つのプラスミドにより細胞がトランスフェクトされる、レンチウイルスを産生するための請求項８記載のプロセス。
10. 弱酸性培地、又は培地のｐＨを弱酸性値にするために有用な１つ以上の溶液を伴う前記培地を含むキットであって、さらに：
    （ａ）エンベロープウイルスを産生するために適切な１つ以上のプラスミド；及び／又は
    （ｂ）前記ウイルスを産生するために適切な細胞
    を含む、請求項１〜９のいずれか一項記載のプロセスを適用するためのキット。
11. 請求項１〜１１のいずれか一項記載のエンベロープウイルスを産生するためのプロセスを適用するための説明書をさらに含む、請求項１０記載のキット。
12. （ｉ）請求項１〜９のいずれか一項記載のプロセスを適用するための手段及び（ｉｉ）該プロセスを適用するために従うべき説明書を含む、前記プロセスを適用するためのキット。
13. 中に含まれる手段が、以下の手段：
    （ａ）エンベロープウイルスを産生するために適切な１つ以上のプラスミド；
    （ｂ）前記ウイルスを産生するために適切な細胞；及び
    （ｃ）弱酸性培地、又は培地のｐＨを弱酸性値にするために有用な１つ以上の溶液を伴う培地
    の１つ以上より選択される、請求項１２記載のキット。
14. 手段（ａ）及び（ｂ）、（ａ）及び（ｃ）、（ｂ）及び（ｃ）又は（ａ）及び（ｂ）及び（ｃ）を含む、請求項１３記載のキット。
15. 培地のｐＨを弱酸性値にするために有用な１つ以上の溶液を伴う前記培地を含む、請求項１〜９のいずれか一項記載のプロセスを適用するためのキット。