JP2016530303A - 生細胞内への分子の送達のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、細胞透過性ペプチドＴＡＴのエンドソーム溶解性ダイマーを使用した、生細胞への、タンパク質および細胞不浸透性小分子のサイトゾル送達に関する方法および組成物を提供する。別の態様では、本開示は、細胞内のエンドソーム浸透性を高めるための方法であって、細胞を本開示の化合物と接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞を、化合物のエンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年９月１０日に出願された仮出願第６１／８７６，００６号の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に明確に組み込まれる。

配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は、紙の写しの代わりにテキストフォーマットで提供され、本明細書により参照によって本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、５２６８３＿Ｓｅｑ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイル２ＫＢであり、２０１４年９月９日に作成され、本明細書の提出と共に、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより提出された。

政府実施権の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＮＩＨ助成金番号ＧＭ０８７２２７および助成金番号ＧＭ０８７９８１のもと、米国政府による支援によってなされた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。

本開示は、細胞生存率に対して実質的に悪影響を及ぼすことなく、細胞のエンドソーム浸透性を増大させるための、組成物および方法に関する。方法および組成物は、通常なら細胞不浸透性分子を細胞内に送達するのに有用である。

タンパク質形質導入戦略は、細胞プロセスの調査および操作に極めて有用である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでフルオロフォアにより修飾されかつ生細胞内に送達されたタンパク質は、例えば、イメージングの適用例で使用することができる。さらに、核磁気共鳴（ＮＭＲ）によるタンパク質構造のｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ決定が、同位体標識されたタンパク質を、生きているヒト細胞内に送達することによって実現された。さらに、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）またはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）でタグ付けすることによって細胞浸透性にされた転写因子が、ｅｘ ｖｉｖｏ組織再生適用例のための潜在的なツールとして出現した。例えば、１１Ｒまたは９Ｒで標識された転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４は、線維芽細胞を人工多能性幹細胞に再プログラム化する。ＰＴＤ ＴＡＴでタグ付けされた転写因子ＨｏｘＢ４も、ｉｎ ｖｉｔｒｏで造血幹細胞を拡張させかつおそらくは細胞移植手順の成功率を上昇させるのに使用することができる。これらのタンパク質送達手法は、タンパク質がおそらくは細胞のゲノムの完全性を変化させないので、かつそれらの活性がタンパク質分解によって失われるので、ＤＮＡをベースにした戦略よりも安全な代替例であると考えられる。したがってタンパク質で操作された細胞は、患者への移植後にがんを引き起こす可能性が低い。

これらの研究は、タンパク質形質導入技術により提供された独自の機会を示すが、現行のプロトコールはしばしば最適とはいえない。ＰＴＤタンパク質は、典型的には、細胞侵入の経路としてエンドサイトーシス経路を利用する。しかし、細胞によりエンドサイトーシスを受けたＰＴＤタンパク質の大部分は、典型的にはエンドソーム内に捕えられたままである。その結果、細胞のサイトゾルに到達するタンパク質のレベルは低く、実現される生物学的成果が不十分である。この問題に対して可能性ある解決策は、タンパク質がエンドサイトーシス経路から逃れる能力を増大させることである。これは、エンドソームを破壊する膜不安定化剤により可能である。したがって、エンドソーム溶解剤と目的のタンパク質とを組み合わせるプロトコールが試験されてきた。ｐＨ活性化配列で修飾されたＣＰＰは、例えば、シスまたはトランスのタンパク質の送達を改善することができる添加剤として報告されている。しかし、膜活性ペプチドの疎水性には問題があり、送達効率は低いままである。分岐状多量体ＣＰＰも、類似の手法で使用されてきた。３つのＴＡＴコピーを含有する分岐種は、高い効率で種々のカーゴのエンドソーム脱出を引き起こす。しかしこの場合、そのような試薬を発生させるのに必要とされる複雑な合成プロトコールは、不便である。さらに、送達の改善にも関わらず、これらの膜活性試薬に関する懸念とは細胞毒性である。エンドソーム膜に対するエンドソーム溶解剤の特異性は、明瞭には特徴付けられておらず、細胞の原形質膜の溶解がしばしば観察される。さらに、細胞生存率に影響を及ぼすことなく実現することができるエンドソーム漏出のレベルは、確立されてこなかった。

当技術分野における進歩にも関わらず、高効率でかつ標的細胞の生存率に与える影響が低い状態で、広く様々な分子および試薬を生細胞の内部に送達するのを容易にする、改善された方法および試薬が未だ求められている。特に、高効率、低毒性、および都合の良いプロトコールで、細胞に適用された分子および試薬のエンドソーム脱出を容易にする、方法および試薬が未だ求められている。本開示は、この必要性に対処し、これに関係したさらなる利点をもたらす。

この概要は、以下の詳細な説明でさらに記述される単純化された形で一通りの概念を導入するために、提供される。この概要は、請求項に記載された主題の重要な特徴を特定するものではなく、請求項に記載された主題の範囲を決定するのを助けるものとして使用されるものでもない。

一態様では、本開示は、式：
（式中：
Ｘは、連結部分であり、
Ｙは、疎水性部分に共有結合したアミノ酸残基であり、
Ｚは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分であり、ＣＰＰ部分は、正味の正電荷を有し、かつ５０％またはそれ超の残基がグアニジニウム基を有しているアミノ酸配列を有し、
ｍおよびｎは、独立して０または１である）
を有する化合物を提供する。

一部の実施形態では、ＣＰＰ部分は３から３０の間のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰ部分は、配列番号１に示される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰ部分は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、配列番号１でＸと指示される残基の１つ、２つ、もしくはそれ超、または全ては、アルギニン残基である。一部の実施形態では、ＣＰＰは、Ｃ末端端部にグリシン残基をさらに含む。一部の実施形態では、Ｃ末端は、アミド基を含有するように修飾される。一部の実施形態では、Ｚ^１のＣＰＰおよびＺ^２のＣＰＰは、互いに少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

一部の実施形態では、ｍおよびｎの少なくとも１つは１である。一部の実施形態では、疎水性部分は、Ｃ_６〜Ｃ_３０直鎖、分岐状、または環式基を含む。一部の実施形態では、直鎖、分岐状、または環式基は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を含む。一部の実施形態では、環式基は、単環、二環、または三環式である。一部の実施形態では、疎水性部分はローダミン基を含む。一部の実施形態では、ローダミン基はテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）である。一部の実施形態では、疎水性部分に共有結合したアミノ酸残基はリシン（Ｋ）である。

他の実施形態では、ｍおよびｎは０であり、Ｚ^１および／またはＺ^２は、疎水性部分に連結されたアミノ酸残基を含むＣＰＰである。さらなる実施形態では、疎水性部分に連結されたアミノ酸残基は、ＣＰＰアミノ酸配列中の、最もＮ末端側のリシン（Ｋ）残基である。

一部の実施形態では、Ｘはシステイン（Ｃ）残基である。一部の実施形態では、Ｘ^１およびＸ^２は、ジスルフィド結合により連結されたシステイン（Ｃ）残基である。

一部の実施形態では、Ｘ、Ｙ、および／またはＺはアミド結合により連結される。一部の実施形態では、Ｘ−Ｙ−Ｚの組合せは、３０個以下のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、化合物は、エンドソーム溶解を容易にすることが可能である。

別の態様では、本開示は、式：
Ｘ−Ｙ−Ｚ
（式中、
Ｘは、システイン（Ｃ）であり、
Ｙは、疎水性部分に共有結合したアミノ酸残基であり、
Ｚは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分であり、ＣＰＰ部分は、正味の正電荷を有し、かつ５０％またはそれ超の残基がグアニジニウム基を有しているアミノ酸配列を有し、
ＸおよびＹと、ＹおよびＺとは、アミド結合によって連結されている）
を有する組成物を提供する。

一部の実施形態では、化合物は、Ｎ末端システイン（Ｃ）残基間にジスルフィド結合を形成することによって、ホモダイマーを形成することが可能である。

一部の実施形態では、ＣＰＰ部分は、配列番号１に示される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、配列番号１でＸと指示される１つ、２つ、もしくはそれ超、または全ての残基は、アルギニン残基である。一部の実施形態では、ＣＰＰは、Ｃ末端端部にグリシン残基をさらに含む。一部の実施形態では、Ｃ末端は、アミド基を含有するように修飾される。

一部の実施形態では、Ｙはリシン（Ｋ）である。

一部の実施形態では、疎水性部分はローダミン基を含む。一部の実施形態では、ローダミン基はテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）である。

別の態様では、本開示は、細胞内のエンドソーム浸透性を高めるための方法であって、細胞を本開示の化合物と接触させることを含む方法を提供する。

一部の実施形態では、細胞を、化合物のエンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させる。一部の実施形態では、細胞を少なくとも１μＭの濃度の化合物と接触させる。一部の実施形態では、細胞を少なくとも５μＭの濃度の化合物と接触させる。一部の実施形態では、細胞は、アルブミンを欠いている培養物中にある。一部の実施形態では、方法は、細胞を細胞不浸透性分子と接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、生きている対象から得られ、ｅｘ ｖｉｖｏで化合物と接触させる。一部の実施形態では、細胞は、生きている対象内にあり、ｉｎ ｖｉｖｏで接触させる。さらなる実施形態では、細胞のエンドソーム浸透性を高めるのに有効な量の化合物を対象に投与することによって、細胞をｉｎ ｖｉｖｏで接触させる。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。

別の態様では、本開示は、細胞不浸透性分子を細胞のサイトゾルに送達する方法であって、細胞を本開示の化合物および細胞不浸透性分子と、エンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させることを含む方法を提供する。

一部の実施形態では、細胞を少なくとも１μＭの濃度の化合物と接触させる。一部の実施形態では、細胞不浸透性分子は、ペプチド、ポリペプチドおよび核酸を含むポリマー、または小分子医薬品である。一部の実施形態では、ポリペプチドは転写因子である。一部の実施形態では、細胞不浸透性分子は化合物に共有結合的に連結していない。一部の実施形態では、細胞不浸透性分子は正味の正電荷を有する。一部の実施形態では、細胞は、生きている対象から得られ、ｅｘ ｖｉｖｏで化合物および細胞不浸透性分子と接触する。一部の実施形態では、細胞は、生きている対象内にあり、ｉｎ ｖｉｖｏで化合物および細胞不浸透性分子と接触する。さらなる実施形態では、細胞不浸透性分子を細胞のサイトゾルに送達するのに有効な量の化合物を対象に投与することによって、細胞をｉｎ ｖｉｖｏで接触する。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。

別の態様では、本開示は、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞における多能性を誘導する方法であって、対象から得られた細胞を本開示の化合物および転写因子と、エンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させること、および細胞を培養して、細胞の多能性を得ることを含む方法を提供する。

一部の実施形態では、細胞は、対象中の体細胞組織から得られる。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、転写因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃの１つである。一部の実施形態では、方法は、多能性細胞またはその子孫細胞を対象に引き続き投与することをさらに含む。

別の態様では、本開示は、幹細胞をｅｘ ｖｉｖｏで拡張する方法であって、幹細胞を本開示の化合物および転写因子と、エンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させること、および細胞を培養して、細胞の拡張を得ることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、幹細胞は造血幹細胞である。一部の実施形態では、転写因子は、ＨｏｘＢ４、ＨｏｘＡ４／１０、Ｇａｔａ２、Ｇｆ１、ＡＭＬ１、ＪｕｎＢ、ＮＦ−Ｙ、Ｂｍｉ１Ｅｚｈ２、Ｄｍｎｔ３ａ、Ｃｂｘ７、ｐ１８、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ＰＴＥＮ、Ｍｙｃ、Ｆｂｘｗ７などからなる群から選択される。

前述の態様とこの開示の付随する利点の多くは、それらが、添付図面と併せて解釈されたときに下記の詳細な記述を参照することによってより良く理解されるようになるので、より容易に理解されることになる。

図１は、ＴＡＴ構築物の構造および予測質量を示す。

図２は、ジスルフィド結合の連結（矢印で示す）を組み込んだｄＴＡＴ構築物の構造および予測質量を示す。

図３は、ａｃＴＡＴ構築物の構造および予測質量を示す。

図４Ａ〜４Ｄは、生細胞でのｄＴＡＴのサイトゾル送達が効率的であり、そのモノマー対応物を凌ぐことを示す。（図４Ａ）生細胞におけるａｃＴＡＴおよびｄＴＡＴの細胞局在化。ＨｅＬａ細胞を、ａｃＴＡＴ（２０μＭ）またはｄＴＡＴ（５μＭ）のいずれかと共に１時間インキュベートし、洗浄し、１００×対物レンズでイメージングした。蛍光画像は、ｄＴＡＴと共にインキュベートした細胞に関してサイトゾル放出を示し、一方、ａｃＴＡＴは、エンドソーム捕捉を示す点状分布を示す。スケールバー、１０μｍ。点状ａｃＴＡＴ分布に類似した結果がＴＡＴに関して得られたことに留意されたい（最大１０μＭ；図示せず）。（図４Ｂ）ｄＴＡＴ蛍光が、ほぼ全ての細胞のサイトゾル内で観察される。５μＭ ｄＴＡＴと共に１時間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の反転させたモノクロ画像（黒＝蛍光シグナル、白＝シグナルなし）。ＳＹＴＯＸ（登録商標）ブルー（２μＭ）を、細胞死の指標として使用した。スケールバー、５０μｍ。（図４Ｃ）生きているＨｅＬａ細胞でのａｃＴＡＴ、ＴＡＴ、およびｄＴＡＴのサイトゾル送達効率。細胞を、ａｃＴＡＴ、ＴＡＴ、およびｄＴＡＴ（１〜２０μＭ）と共に１時間インキュベートした。検出可能なサイトゾルおよび核蛍光分布を持つ細胞の数をカウントし、試験をした各濃度ごとに、合計細胞数で割った（％）（１，０００細胞／実験、実験は３回行い、平均および対応する標準偏差を表す）。（図４Ｄ）ＨｅＬａ細胞でのｄＴＡＴの全体的な取込みは、培地中に存在するｄＴＡＴの濃度に対してほぼ直線的に応答する。細胞を、４８ウェルプレート上で成長させ、ｄＴＡＴ（１〜１０μＭ）と共に１時間インキュベートした。相対的な取込みを、細胞溶解産物のバルク蛍光を測定することによって定量的に評価し、方法で論じたように正規化した（３００，０００細胞／実験、実験は３回行い、平均／正規化および対応する標準偏差を表す）。 図４Ａ〜４Ｄは、生細胞でのｄＴＡＴのサイトゾル送達が効率的であり、そのモノマー対応物を凌ぐことを示す。（図４Ａ）生細胞におけるａｃＴＡＴおよびｄＴＡＴの細胞局在化。ＨｅＬａ細胞を、ａｃＴＡＴ（２０μＭ）またはｄＴＡＴ（５μＭ）のいずれかと共に１時間インキュベートし、洗浄し、１００×対物レンズでイメージングした。蛍光画像は、ｄＴＡＴと共にインキュベートした細胞に関してサイトゾル放出を示し、一方、ａｃＴＡＴは、エンドソーム捕捉を示す点状分布を示す。スケールバー、１０μｍ。点状ａｃＴＡＴ分布に類似した結果がＴＡＴに関して得られたことに留意されたい（最大１０μＭ；図示せず）。（図４Ｂ）ｄＴＡＴ蛍光が、ほぼ全ての細胞のサイトゾル内で観察される。５μＭ ｄＴＡＴと共に１時間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の反転させたモノクロ画像（黒＝蛍光シグナル、白＝シグナルなし）。ＳＹＴＯＸ（登録商標）ブルー（２μＭ）を、細胞死の指標として使用した。スケールバー、５０μｍ。（図４Ｃ）生きているＨｅＬａ細胞でのａｃＴＡＴ、ＴＡＴ、およびｄＴＡＴのサイトゾル送達効率。細胞を、ａｃＴＡＴ、ＴＡＴ、およびｄＴＡＴ（１〜２０μＭ）と共に１時間インキュベートした。検出可能なサイトゾルおよび核蛍光分布を持つ細胞の数をカウントし、試験をした各濃度ごとに、合計細胞数で割った（％）（１，０００細胞／実験、実験は３回行い、平均および対応する標準偏差を表す）。（図４Ｄ）ＨｅＬａ細胞でのｄＴＡＴの全体的な取込みは、培地中に存在するｄＴＡＴの濃度に対してほぼ直線的に応答する。細胞を、４８ウェルプレート上で成長させ、ｄＴＡＴ（１〜１０μＭ）と共に１時間インキュベートした。相対的な取込みを、細胞溶解産物のバルク蛍光を測定することによって定量的に評価し、方法で論じたように正規化した（３００，０００細胞／実験、実験は３回行い、平均／正規化および対応する標準偏差を表す）。

図５は、ａｃＴＡＴおよびｄＴＡＴの細胞局在化が、生細胞とのインキュベーション後に異なることを示す。２０μＭ ａｃＴＡＴ（左パネル）および５μＭ ｄＴＡＴ（右パネル）と共にインキュベートしたＨｅＬａ細胞の蛍光（上部パネル）および明視野画像（下部パネル）（１００×対物レンズを使用）。ａｃＴＡＴペプチドは蛍光点状分布を示し、一方、ｄＴＡＴは、サイトゾルおよび核蛍光分布を示す。明視野画像は、ペプチド送達後にＨｅＬａ細胞形態の変化を示さない。スケールバー、１０μｍ。

図６は、ｄＴＡＴのサイトゾルおよび核蛍光分布が、濃度依存性であることを示す。ＨｅＬａ細胞は、様々な濃度のｄＴＡＴ（１、２、２．５、２．２５、２．５、２．７５、３、４、５μＭ）と共にインキュベートした。細胞を洗浄しイメージングした。反転モノクロ画像（２０×対物レンズ）は、２〜５μＭの間のペプチドのサイトゾル送達における劇的な増大を示す。ここに示されていないが、各画像における細胞の数は、明視野イメージングによって決定されたものとほぼ同じである。蛍光点状分布を示す細胞は、これらのイメージング条件下で明瞭に見ることができない。１００×対物レンズを使用したこれらの細胞のさらなる分析は、エンドソームに捕えられたペプチドを表す蛍光点状分布を明瞭に示す。スケールバー、５０μｍ。

図７Ａ〜７Ｂは、後根神経節Ｆ１１（ＤＲＧ−Ｆ１１）神経細胞におけるｄＴＡＴ送達の蛍光画像を示す。ｄＴＡＴ（５μＭ）との１時間のインキュベーション後、２０×（図７Ａ）および１００×（図７Ｂ）対物レンズでイメージングを行った。

図８Ａ〜８Ｃは、ｄＴＡＴがエンドソーム脱出を媒介することを示す。（図８Ａ）ｄＴＡＴの細胞分布に対するエンドサイトーシス阻害剤の作用。ＨｅＬａ細胞を、５０μＭアミロライドまたは２００ｎＭバフィロマイシンでそれぞれ３０および２０分間、前処置し、洗浄し、５μＭ ｄＴＡＴおよび阻害剤と共にインキュベートした。両方の阻害剤は、細胞のサイトゾルおよび核への送達を遮断した。蛍光イメージングは、バフィロマイシンの存在下、ＴＭＲの点状分布を示す（１，０００細胞／実験、実験は３回行い、平均および対応する標準偏差を表す）。スケールバー、１０μｍ。（図８Ｂ）ｄＴＡＴは、エンドソーム内に捕えられた分子のサイトゾル放出を引き起こす。実験ステップの概略図を示す（上部）。まず、細胞を５μＭ ＤＥＡＣ−Ｋ９と共に１時間インキュベートし、洗浄した。反転モノクロ画像は、ＤＥＡＣ−Ｋ９単独と共にインキュベートした後の蛍光点状分布を示す。次いで同じ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴと共に１時間インキュベートした。画像は、サイトゾルおよび核へのＤＥＡＣ−Ｋ９の再分布を示す（バフィロマイシンにより阻害）。スケールバー、１０μｍ。（図８Ｃ）ｄＴＡＴのエンドソーム溶解活性は、高度に効率的である。ＳＮＡＰＨ２Ｂを発現するＨｅＬａ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴおよび５μＭ ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８と共にインキュベートした。蛍光画像は、核におけるＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の蓄積を示す。緑色シグナルの分析は、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の５０％から９０％がエンドソームを逃したことを示す。小さいパネルは、ＴＭＲのサイトゾルおよび核蛍光を示す。スケールバー、１０μｍ。 図８Ａ〜８Ｃは、ｄＴＡＴがエンドソーム脱出を媒介することを示す。（図８Ａ）ｄＴＡＴの細胞分布に対するエンドサイトーシス阻害剤の作用。ＨｅＬａ細胞を、５０μＭアミロライドまたは２００ｎＭバフィロマイシンでそれぞれ３０および２０分間、前処置し、洗浄し、５μＭ ｄＴＡＴおよび阻害剤と共にインキュベートした。両方の阻害剤は、細胞のサイトゾルおよび核への送達を遮断した。蛍光イメージングは、バフィロマイシンの存在下、ＴＭＲの点状分布を示す（１，０００細胞／実験、実験は３回行い、平均および対応する標準偏差を表す）。スケールバー、１０μｍ。（図８Ｂ）ｄＴＡＴは、エンドソーム内に捕えられた分子のサイトゾル放出を引き起こす。実験ステップの概略図を示す（上部）。まず、細胞を５μＭ ＤＥＡＣ−Ｋ９と共に１時間インキュベートし、洗浄した。反転モノクロ画像は、ＤＥＡＣ−Ｋ９単独と共にインキュベートした後の蛍光点状分布を示す。次いで同じ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴと共に１時間インキュベートした。画像は、サイトゾルおよび核へのＤＥＡＣ−Ｋ９の再分布を示す（バフィロマイシンにより阻害）。スケールバー、１０μｍ。（図８Ｃ）ｄＴＡＴのエンドソーム溶解活性は、高度に効率的である。ＳＮＡＰＨ２Ｂを発現するＨｅＬａ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴおよび５μＭ ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８と共にインキュベートした。蛍光画像は、核におけるＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の蓄積を示す。緑色シグナルの分析は、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の５０％から９０％がエンドソームを逃したことを示す。小さいパネルは、ＴＭＲのサイトゾルおよび核蛍光を示す。スケールバー、１０μｍ。 図８Ａ〜８Ｃは、ｄＴＡＴがエンドソーム脱出を媒介することを示す。（図８Ａ）ｄＴＡＴの細胞分布に対するエンドサイトーシス阻害剤の作用。ＨｅＬａ細胞を、５０μＭアミロライドまたは２００ｎＭバフィロマイシンでそれぞれ３０および２０分間、前処置し、洗浄し、５μＭ ｄＴＡＴおよび阻害剤と共にインキュベートした。両方の阻害剤は、細胞のサイトゾルおよび核への送達を遮断した。蛍光イメージングは、バフィロマイシンの存在下、ＴＭＲの点状分布を示す（１，０００細胞／実験、実験は３回行い、平均および対応する標準偏差を表す）。スケールバー、１０μｍ。（図８Ｂ）ｄＴＡＴは、エンドソーム内に捕えられた分子のサイトゾル放出を引き起こす。実験ステップの概略図を示す（上部）。まず、細胞を５μＭ ＤＥＡＣ−Ｋ９と共に１時間インキュベートし、洗浄した。反転モノクロ画像は、ＤＥＡＣ−Ｋ９単独と共にインキュベートした後の蛍光点状分布を示す。次いで同じ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴと共に１時間インキュベートした。画像は、サイトゾルおよび核へのＤＥＡＣ−Ｋ９の再分布を示す（バフィロマイシンにより阻害）。スケールバー、１０μｍ。（図８Ｃ）ｄＴＡＴのエンドソーム溶解活性は、高度に効率的である。ＳＮＡＰＨ２Ｂを発現するＨｅＬａ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴおよび５μＭ ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８と共にインキュベートした。蛍光画像は、核におけるＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の蓄積を示す。緑色シグナルの分析は、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の５０％から９０％がエンドソームを逃したことを示す。小さいパネルは、ＴＭＲのサイトゾルおよび核蛍光を示す。スケールバー、１０μｍ。

図９は、ＤＥＡＣ−Ｋ９の構造および予測質量を示す。

図１０Ａ〜１０Ｄは、ｄＴＡＴ媒介型送達が、細胞の生存および増殖に影響を及ぼさないことを示す。（図１０Ａ）ｄＴＡＴは、細胞形態に影響を及ぼさない。ＣＯＬＯ ３１６細胞を、５μＭ ｄＴＡＴと共に１時間インキュベートし、インキュベーションの１および２４時間後にイメージングした。（図１０Ｂ）ｄＴＡＴは、効率的なエンドソーム脱出が実現される条件下、細胞に対して毒性ではない。ＨｅＬａ細胞を、１〜１０μＭ ｄＴＡＴと共に１時間インキュベートした。細胞生存率を、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ排除アッセイによって、インキュベーションの１、２４、および４８時間後に評価した（１，０００細胞／実験、実験は３回行い、平均および標準偏差を表す）。スケールバー、１０μｍ。（図１０Ｃ）ｄＴＡＴは、細胞増殖に影響を及ぼさない。ＨｅＬａ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴと共に１時間インキュベートし、または未処置のままにした。増殖を、インキュベーション後３６時間まで、ＭＴＴアッセイを使用して評価した（１５０，０００細胞／実験、実験は３回行い、平均および標準偏差を表す）。（図１０Ｄ）サイトゾルｄＴＡＴを含有する細胞が分裂する。ＨｅＬａ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴと共に１時間インキュベートした。インキュベーション後（ｔ＝０時間）、蛍光画像（左パネル）およびコマ撮りを獲得した。明視野画像は、蛍光サイトゾル分布を示す細胞の分裂事象を示す。スケールバー、１０μｍ。

図１１は、神経細胞系Ｎｅｕｒｏ−２ａ（左パネル）および原発性ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）（右パネル）との１時間のインキュベーション後の、ｄＴＡＴの細胞局在化を示す。細胞を、ｄＴＡＴと共にインキュベートし、洗浄し、１００×対物レンズでイメージングした。蛍光画像は、ｄＴＡＴと共にインキュベートした細胞に関するサイトゾル放出を示す。ＳＹＴＯＸ（登録商標）ブルー（２μＭ）の排除を使用して、イメージングされた細胞が、損なわれた原形質膜（図示せず）を持たないことを決定した。スケールバー、１０μｍ。

図１２は、ｄＴＡＴで処置された細胞が、未処置の細胞と同一の速度で増殖することを示す。ＨｅＬａ、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、およびＨＤＦ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴと共に１時間インキュベートし、または未処置のままにした。増殖を、インキュベーション後３６時間まで、ＭＴＴアッセイを使用して評価した（１５０，０００細胞／実験、実験は３回行い、平均および標準偏差を表す）。

図１３は、ｄＴＡＴ媒介型エンドソーム脱出を、繰り返すことができることを示す。ＨｅＬａ細胞を、ｄＴＡＴ（５μＭ）およびＤＥＡＣ−Ｋ９（５μＭ）と共に１時間、同時インキュベートした（ステップ１）（両方の列）。洗浄後、ｄＴＡＴ（５μＭ）およびＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８（５μＭ）を、バフィロマイシン（２００ｎＭ）の存在下（下列）または存在しない状態で（上列）同時インキュベートした（ステップ３）。スケールバー、１０μｍ。

図１４Ａ〜１４Ｂは、ｄＴＡＴが、生細胞内で同時に２つのカーゴの送達を媒介することを示す。（図１４Ａ）ＳＮＡＰ−Ｈ２Ｂを発現するＨｅＬａ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴ、５μＭ ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８、および５μＭ ＤＥＡＣ−Ｋ９と共にインキュベートした。蛍光画像（ＲＧＢおよび反転モノクロ）は、ｄＴＡＴ（蛍光、左上パネル）、ＤＥＡＣ−Ｋ９（蛍光、右上パネル）、およびＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８（蛍光、中上パネル）のサイトゾルおよび核局在化を示す。さらに、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅシグナルは、図８Ｃに示されるように核内に蓄積された。（図１４Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴ、５μＭ ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８、および５μＭ ＤＥＡＣ−Ｋ９と共にインキュベートした。蛍光および反転モノクロ画像は、ｄＴＡＴ（蛍光、左上パネル）、ＤＥＡＣ−Ｋ９（蛍光、右上パネル）、およびＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８（蛍光、中上パネル）の、サイトゾルおよび核蛍光局在化を示す。スケールバー、１０μｍ。 図１４Ａ〜１４Ｂは、ｄＴＡＴが、生細胞内で同時に２つのカーゴの送達を媒介することを示す。（図１４Ａ）ＳＮＡＰ−Ｈ２Ｂを発現するＨｅＬａ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴ、５μＭ ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８、および５μＭ ＤＥＡＣ−Ｋ９と共にインキュベートした。蛍光画像（ＲＧＢおよび反転モノクロ）は、ｄＴＡＴ（蛍光、左上パネル）、ＤＥＡＣ−Ｋ９（蛍光、右上パネル）、およびＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８（蛍光、中上パネル）のサイトゾルおよび核局在化を示す。さらに、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅシグナルは、図８Ｃに示されるように核内に蓄積された。（図１４Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、５μＭ ｄＴＡＴ、５μＭ ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８、および５μＭ ＤＥＡＣ−Ｋ９と共にインキュベートした。蛍光および反転モノクロ画像は、ｄＴＡＴ（蛍光、左上パネル）、ＤＥＡＣ−Ｋ９（蛍光、右上パネル）、およびＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８（蛍光、中上パネル）の、サイトゾルおよび核蛍光局在化を示す。スケールバー、１０μｍ。

図１５は、ｄＴＡＴの投与が細胞内で強力な転写応答を誘発せず、細胞がｄＴＡＴサイトゾル透過から迅速に回復することを示す。全ゲノムマイクロアレイ解析を、５μＭ ｄＴＡＴで１時間処置した細胞に対して行って、転写パターンが影響を受けたか否かを決定した。解析は、ｄＴＡＴ処置の直後、１時間後、または２４時間後に行った。プロットは、処置された試料対未処置の試料（同じインキュベーションステップだがペプチドは用いない）の、マイクロアレイ強度値を示す。直線は、２倍強度の変化のカットオフを表す。

図１６Ａ〜１６Ｃは、ｄＴＡＴを使用した、トランスでの無傷の機能性タンパク質の送達を示す。（図１６Ａ）無傷のＥＧＦＰを、生細胞内に送達することができる。ＨｅＬａ細胞を、ＥＧＦＰ（１０μＭ）およびｄＴＡＴ（５μＭ）と共に同時インキュベートした。蛍光画像は、ＥＧＦＰの均質なサイトゾル分布を示す。スケールバー、（１００×対物レンズ：１０μｍ、２０×対物レンズ：１００μｍ。（図１６Ｂ）ＴＸＴ−ＣｒｅのｄＴＡＴ媒介型送達は、ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ配列の上流にｅｇｆｐ遺伝子を持つベクターを含有する細胞内でのＥＧＦＰの発現を改善する。ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ配列の上流にｅｇｆｐ遺伝子を含有するｐＣＡＬＮＬ−ＧＦＰプラスミドをトランスフェクトしたＨｅＬａを、ＴＡＴ−Ｃｒｅ（１μＭ）の存在下、ＴＡＴ（５μＭ）またはｄＴＡＴ（５μＭ）のいずれかと共に１時間インキュベートした。ＴＡＴ−Ｃｒｅ（１μＭ）は、比較のために単独でも細胞と共にインキュベートした。ｄＴＡＴの添加は、ＥＧＦＰ^＋細胞の数を増加させ（４７％）（ＴＡＴ−Ｃｒｅ単独、２．６％）、細胞内のＴＡＴ−Ｃｒｅを送達するその能力は、ＴＡＴの場合（４．８％）を凌いだ。画像中の細胞の数は、明視野顕微鏡法により評価したものとほぼ同じであった（１，０００細胞／実験、実験は３回行い、平均および標準偏差を表す）。スケールバー、１００μＭ。（図１６Ｃ）抗体のｄＴＡＴ媒介型送達。ＨｅＬａ細胞を、ＦＩＴＣ−抗ＡＴＰ５Ａ（２０μｇ／ｍＬ）およびｄＴＡＴ（５μＭ）と共に、３７℃で１時間、同時インキュベートした。ＦＩＴＣ−抗ＡＴＰ５Ａは、細胞のサイトゾルに送達され、管状ミトコンドリアを染色する（強力な染色、ズームイン画像ではより明瞭に見える）。スケールバー、１００×対物レンズ：１０μｍ、ズームイン画像：２μＭ。

図１７は、異なる細胞系への、無傷のＥＧＦＰのｄＴＡＴ媒介型送達を示す。ＨｅＬａ（上部パネル）およびＮＩＨ ３Ｔ３（下部パネル）細胞を、ＥＧＦＰ（１０μＭ）およびｄＴＡＴ（５μＭ）と共に１時間インキュベートし、洗浄し、イメージングした。画像は、ＨｅＬａおよびＮＩＨ ３Ｔ３細胞におけるＥＧＦＰの、均質なサイトゾル蛍光分布を示す。スケールバー、１０μｍ。

図１８Ａ〜１８Ｃは、ｄＴＡＴおよびＥＧＦＰが、同時インキュベートしたときに相互作用しないことを示す。（図１８Ａ）ＥＧＦＰ（１μＭ）（ドナーＦＲＥＴ対）の蛍光放出スペクトル（ＥＧＦＰ、Ｅｘ／Ｅｍ ４８８／５０８ｎｍ）は、４８８ｎｍで励起した。スペクトルは、５１０ｎｍ付近で強力な放出ピークを示し、５４８ｎｍ付近で小さいショルダーピークを示す。（図１８Ｂ）ＥＧＦＰ（１μＭ）およびｄＴＡＴ（５μＭ）（アクセプターＦＲＥＴ対）の溶液の蛍光放出スペクトル（ＴＭＲ、Ｅｘ／Ｅｍ ５５６／５８０ｎｍ）は、４８８ｎｍで励起した。スペクトルは、強力な放出ピークを５１０ｎｍ付近で示し、小さいショルダーピークを５４８ｎｍ付近で示す。ＥＧＦＰ蛍光スペクトルに対するＴＭＲの寄与（クロスオーバー蛍光）は、４８８ｎｍで励起されたｄＴＡＴ（５μＭ）の溶液の蛍光放出を測定することによって決定した（図示せず）。ＥＧＦＰおよびｄＴＡＴを含む溶液のスペクトルは、ＥＧＦＰ単独のスペクトル（ＴＭＲ蛍光クロスオーバーシグナルが差し引かれた）とほぼ同一である。（図１８Ｃ）ライゲーションされたＥＧＦＰ−ＣＫ（ＴＭＲ）の蛍光放出スペクトル。発現タンパク質ライゲーションを使用して、記述されるようにＥＧＦＰをＣＫ（ＴＭＲ）に化学的にライゲーションすることによりＥＧＦＰ−ＣＫ（ＴＭＲ）を生成した。ＥＧＦＰ−ＣＫ（ＴＭＲ）を、ＦＲＥＴシグナルに関する陽性対照として使用した。４８８ｎｍで励起後、５６０〜６３０ｎｍの間の蛍光の劇的な増大が観察され（蛍光最大値 約５８０ｎｍ）、これはフルオロフォア同士が非常に近接していることに起因したＦＲＥＴシグナルを示している。蛍光強度のこの増大は、パートｂ）のスペクトルでは観察されなかった（ＥＧＦＰとｄＴＡＴとの相互作用がないことを示す）。全ての試料の放出を、５００から６５０ｎｍまで走査した。

図１９Ａ〜１９Ｂは、ＦＩＴＣ−抗ＡＴＰ５ａ抗体が、ｄＴＡＴ媒介型送達後に生細胞で発現した蛍光標識済みミトコンドリアタンパク質と同時局在化することを示す。（図１９Ａ）ＴａｇＣＦＰ−ｍｉｔｏを発現する細胞（左）を、ＦＩＴＣおよびＣＦＰフィルターを使用してイメージングした。管状ミトコンドリアは、ＣＦＰチャネルでのみ明瞭に観察された。別の実験では、ｄＴＡＴ（５μＭ）およびＦＩＴＣ−抗ＡＴＰ５Ａ（２０μｇ／ｍＬ）を、ＴａｇＣＦＰ−ｍｉｔｏを発現する細胞と共に１時間インキュベートした。反転モノクロ画像は、ＦＩＴＣ−抗ＡＴＰ５Ａ（ＦＩＴＣチャネル）およびＴａｇＣＦＰ−ｍｉｔｏ（ＣＦＰチャネル）の同時局在化を示す。スケールバー、２μｍ。（図１９Ｂ）ミトコンドリア染色がＦＩＴＣ−抗ＡＴＰ５Ａに特異的であることを確認するために、細胞内エピトープを含まない抗体、ＦＩＴＣ−抗ＩｇＧをｄＴＡＴと共に送達した。ＦＩＴＣ−抗ＩｇＧ（２０μｇ／ｍＬ）およびｄＴＡＴ（５μＭ）を、細胞と共に１時間インキュベートした。反転モノクロ画像は、均質なサイトゾル蛍光分布を示す（上部）。対照的に、ＦＩＴＣ−抗ＡＴＰ５Ａと共にインキュベートした細胞は、管状構造で蛍光を示す（下部）。スケールバー、ズームイン画像：２μｍ、１００×対物レンズ：１０μｍ。

図２０Ａ〜２０Ｃは、ｄＴＡＴ媒介型送達が改善され、ＨｏｘＢ４転写活性の制御が可能になることを示す。（図２０Ａ）ＨｏｘＢ４およびＴＡＴ−ＨｏｘＢ４のｄＴＡＴ媒介型送達は、ＨｏｘＢ４依存性プロモーターの下でのルシフェラーゼレポーターの発現を改善する。ルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトしたＮＩＨ ３Ｔ３を、ｄＴＡＴ（３μＭ）の存在下または存在しない状態で、ＨｏｘＢ４またはＴＡＴ−ＨｏｘＢ４（２００ｎＭ）のいずれかと共に１．５時間インキュベートした。ｄＴＡＴの添加は、Ｈｏｘｂ４およびＴＡＴ−Ｈｏｘｂ４で得られたルシフェラーゼ誘導で、それぞれ５３．１倍および３０７．４倍の増大をもたらす。ＴＡＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ（２００ｎＭ）および／またはｄＴＡＴ（３μＭ）とのインキュベーションは、陰性対照として働く（４００，０００細胞／実験、実験は２回行い、平均および標準偏差を表す）。（図２０Ｂ）生細胞のサイトゾルおよび核に送達されたＤＥＡＣ−Ｋ９の量は、滴定することができる。ＨｅＬａ細胞を、ｄＴＡＴ（５μＭ）および増加する量のＤＥＡＣ−Ｋ９（１、２．５、５、１０、２０μＭ）と共にインキュベートした。サイトゾル放出を示す細胞の蛍光強度を、顕微鏡法によって評価し（擬似カラーを使用した蛍光シグナル表示、カラースケール：青＝最低強度、赤＝最高強度）、細胞溶解産物のバルク蛍光と比較した。両方の解析において、細胞の蛍光強度は、培地中のＤＥＡＣ−Ｋ９の濃度に直線的に応答する（顕微鏡：１，０００細胞／実験、蛍光光度計：３００，０００細胞／実験；実験は３回行い、平均および標準偏差を表す）。スケールバー、１０μｍ。（図２０Ｃ）ＨｏｘＢ４のｄＴＡＴ媒介型送達によるルシフェラーゼ発現の誘導は、制御することができる。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、ＨｏｘＢ４（２５〜２００ｎＭ）およびｄＴＡＴ（３μＭ）と共に同時インキュベートし、ルシフェラーゼ誘導を、（ａ）で記述したように測定した（４００，０００細胞／実験、実験は２回行い、平均および標準偏差を表す）。 図２０Ａ〜２０Ｃは、ｄＴＡＴ媒介型送達が改善され、ＨｏｘＢ４転写活性の制御が可能になることを示す。（図２０Ａ）ＨｏｘＢ４およびＴＡＴ−ＨｏｘＢ４のｄＴＡＴ媒介型送達は、ＨｏｘＢ４依存性プロモーターの下でのルシフェラーゼレポーターの発現を改善する。ルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトしたＮＩＨ ３Ｔ３を、ｄＴＡＴ（３μＭ）の存在下または存在しない状態で、ＨｏｘＢ４またはＴＡＴ−ＨｏｘＢ４（２００ｎＭ）のいずれかと共に１．５時間インキュベートした。ｄＴＡＴの添加は、Ｈｏｘｂ４およびＴＡＴ−Ｈｏｘｂ４で得られたルシフェラーゼ誘導で、それぞれ５３．１倍および３０７．４倍の増大をもたらす。ＴＡＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ（２００ｎＭ）および／またはｄＴＡＴ（３μＭ）とのインキュベーションは、陰性対照として働く（４００，０００細胞／実験、実験は２回行い、平均および標準偏差を表す）。（図２０Ｂ）生細胞のサイトゾルおよび核に送達されたＤＥＡＣ−Ｋ９の量は、滴定することができる。ＨｅＬａ細胞を、ｄＴＡＴ（５μＭ）および増加する量のＤＥＡＣ−Ｋ９（１、２．５、５、１０、２０μＭ）と共にインキュベートした。サイトゾル放出を示す細胞の蛍光強度を、顕微鏡法によって評価し（擬似カラーを使用した蛍光シグナル表示、カラースケール：青＝最低強度、赤＝最高強度）、細胞溶解産物のバルク蛍光と比較した。両方の解析において、細胞の蛍光強度は、培地中のＤＥＡＣ−Ｋ９の濃度に直線的に応答する（顕微鏡：１，０００細胞／実験、蛍光光度計：３００，０００細胞／実験；実験は３回行い、平均および標準偏差を表す）。スケールバー、１０μｍ。（図２０Ｃ）ＨｏｘＢ４のｄＴＡＴ媒介型送達によるルシフェラーゼ発現の誘導は、制御することができる。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、ＨｏｘＢ４（２５〜２００ｎＭ）およびｄＴＡＴ（３μＭ）と共に同時インキュベートし、ルシフェラーゼ誘導を、（ａ）で記述したように測定した（４００，０００細胞／実験、実験は２回行い、平均および標準偏差を表す）。 図２０Ａ〜２０Ｃは、ｄＴＡＴ媒介型送達が改善され、ＨｏｘＢ４転写活性の制御が可能になることを示す。（図２０Ａ）ＨｏｘＢ４およびＴＡＴ−ＨｏｘＢ４のｄＴＡＴ媒介型送達は、ＨｏｘＢ４依存性プロモーターの下でのルシフェラーゼレポーターの発現を改善する。ルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトしたＮＩＨ ３Ｔ３を、ｄＴＡＴ（３μＭ）の存在下または存在しない状態で、ＨｏｘＢ４またはＴＡＴ−ＨｏｘＢ４（２００ｎＭ）のいずれかと共に１．５時間インキュベートした。ｄＴＡＴの添加は、Ｈｏｘｂ４およびＴＡＴ−Ｈｏｘｂ４で得られたルシフェラーゼ誘導で、それぞれ５３．１倍および３０７．４倍の増大をもたらす。ＴＡＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ（２００ｎＭ）および／またはｄＴＡＴ（３μＭ）とのインキュベーションは、陰性対照として働く（４００，０００細胞／実験、実験は２回行い、平均および標準偏差を表す）。（図２０Ｂ）生細胞のサイトゾルおよび核に送達されたＤＥＡＣ−Ｋ９の量は、滴定することができる。ＨｅＬａ細胞を、ｄＴＡＴ（５μＭ）および増加する量のＤＥＡＣ−Ｋ９（１、２．５、５、１０、２０μＭ）と共にインキュベートした。サイトゾル放出を示す細胞の蛍光強度を、顕微鏡法によって評価し（擬似カラーを使用した蛍光シグナル表示、カラースケール：青＝最低強度、赤＝最高強度）、細胞溶解産物のバルク蛍光と比較した。両方の解析において、細胞の蛍光強度は、培地中のＤＥＡＣ−Ｋ９の濃度に直線的に応答する（顕微鏡：１，０００細胞／実験、蛍光光度計：３００，０００細胞／実験；実験は３回行い、平均および標準偏差を表す）。スケールバー、１０μｍ。（図２０Ｃ）ＨｏｘＢ４のｄＴＡＴ媒介型送達によるルシフェラーゼ発現の誘導は、制御することができる。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、ＨｏｘＢ４（２５〜２００ｎＭ）およびｄＴＡＴ（３μＭ）と共に同時インキュベートし、ルシフェラーゼ誘導を、（ａ）で記述したように測定した（４００，０００細胞／実験、実験は２回行い、平均および標準偏差を表す）。

図２１は、「非還元性ｄＴＡＴダイマー」（ｎｒｄＴＡＴ）構築物の構造および予測質量を示す。

図２２Ａ〜２２Ｂは、生細胞へのｎｒｄＴＡＴのサイトゾル送達を示す。ＨｅＬａ細胞を、２．５〜５μＭ ｎｒｄＴＡＴ（図２２Ａ）および５〜１０μＭ ｎｒｄｆＴＡＴ（図２２Ｂ）と共に１時間インキュベートした。明視野画像（左パネル）、モノクロ蛍光画像（中心パネル；白＝蛍光シグナル、黒＝シグナルなし）；および細胞死の指標として使用されたＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ（２μＭ）による細胞生存率（右パネル）。データは、両方の濃度での、ＨｅＬａ細胞へのｎｒｄｆＴＡＴのサイトゾル送達を示す。スケールバー、５０μｍ（反転モノクロ２０×画像）。

図２３は、培地中に存在するペプチドの濃度の関数として、ＨｅＬａ細胞へのペプチドの取込みを示す。ＨｅＬａ細胞による３種のペプチドの取込みを、濃度（μＭ）の関数として測定した。細胞を、ａｃＴＡＴ（５〜２５μＭ）、ＴＡＴ（５〜２５μＭ）、またはｄＴＡＴ（１〜１０μＭ）のいずれかと共にインキュベートし、９６ウェルプレート上の細胞溶解産物のバルク蛍光を、プレートリーダーを使用して測定した。各試料の蛍光を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイにより決定されるように、細胞溶解産物中の総タンパク質含量に対して正規化した。データは、ｄＴＡＴと共にインキュベートされた細胞の蛍光取込みの、直線的増大を示す。この実験で使用された溶解緩衝液は、２ｍＭ ＤＴＴを含有する。ｄＴＡＴは、この処置によりモノマーＴＡＴに還元される。その結果、ｄＴＡＴの正規化された蛍光を２で割って（ｄＴＡＴ／２）、ｄＴＡＴの取込みとＴＡＴの取込みとを比較した（ｄＴＡＴの１分子のシグナルは、このアッセイで内部移行したＴＡＴの分子の場合の２倍のシグナルを与える）。

高分子送達戦略は、典型的には、細胞侵入の経路としてエンドサイトーシス経路を利用する。しかし、エンドソームの捕捉は、高分子が細胞のサイトゾル空間を透過する効率を厳しく制限する。エンドソーム脱出を増強させる戦略は、エンドソーム膜に関するエンドソーム溶解剤の特異性の欠如により、細胞毒性の増加をしばしばもたらす。この開示は、ＨＩＶトランス活性化転写活性化因子または転写のトランス活性化因子のドメイン（本明細書では、「ＴＡＴ ＣＰＰドメイン」と呼ぶ）などの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）のダイマー化が、特に高い効率でエンドソームから脱出することにより、生細胞を透過するという驚くべき発見について記述する。本明細書で使用される細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）およびタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）という用語は、様々な分子カーゴの細胞取込みを促進させるペプチドとして同義で使用することができ、したがってこれらの用語は、様々なシスまたはトランスカーゴの細胞内送達を促進させることができるペプチドを指す。エンドソーム漏出を媒介することにより、ＣＰＰダイマーは、単純な同時インキュベーション手順の後に、培養された細胞への小分子、ペプチド、およびタンパク質の送達を容易にする。以下に、より詳細に記述するように、ダイマー化合物への２つのＴＡＴ ＣＰＰドメインの組込みは、極度の効率でかつ細胞の生存率および増殖に悪影響を及ぼすことなく、生細胞へのタンパク質および小分子の送達を容易にする新規な試薬（ｄＴＡＴ）をもたらした。新規なｄＴＡＴ化合物に関係した追加の驚くべき利点についても記述する。例えば、サイトゾル送達は、培養物中のほとんどの細胞で、いくつかの異なる細胞系で、および無傷のエンドソーム内に捕えられたままの比較的少量の材料のみで実現された。送達は、ｄＴＡＴと標的カーゴとの結合相互作用を必要とせず、多数の分子種を一度に送達することができ、送達は、同じ細胞内で繰り返すことができた。注目すべきことに、ｄＴＡＴ媒介型送達は、細胞の生存率および増殖に目立って影響を及ぼすことはなかった。ｄＴＡＴ媒介型送達を、ＨｏｘＢ４、造血幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ拡張に関して治療可能性を持つ転写因子でさらに評価した。特に、インキュベーション培地へのｄＴＡＴの添加は、ルシフェラーゼレポーターの誘導を、ＨｏｘＢ４単独での処置により得られた場合よりも２４倍増大させ、ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４（ＴＡＴに融合したタンパク質構築物）単独で得られた場合よりも６１倍増大させた。最後に、ＨｏｘＢ４の転写活性も、細胞外に投与されたタンパク質の量を単純に変化させることによって、精密に制御することができる。全体として、本明細書に記述されるように、本発明者らは、新規なｄＴＡＴ試薬などの新規なＣＰＰダイマーをベースにしたこの新しい送達戦略が、様々な適用例の中でもとりわけ細胞ベースのアッセイ、細胞イメージングの適用例、細胞のｅｘ ｖｉｖｏ操作および再プログラミングならびに治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ投与に、極めて有用であることを実証した。

前述の内容によれば、一態様では、本開示は式（Ｉ）：
を有する化合物を提供する。

式（Ｉ）により表される化合物において、Ｘは連結部分であり、Ｙは、疎水性部分に共有結合したアミノ酸残基であり、Ｚは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分である。上付き表示（即ち、^１および^２）は、それによって指示される様々な副成分が同一である必要はなく、任意選択で変形例を包含できることを示すことが理解されよう。例えば、Ｚ^１およびＺ^２は、それぞれがＣＰＰ部分の要件を満たす限り、同一のまたは異なるＣＰＰ部分であり得る。指示された上付きがない副成分に関して本明細書に提示される任意の記述は、副成分の一般的なカテゴリーを指し、化合物中の１つまたは両方の特定の副成分に特に適用することができる。下付き表示ｍおよびｎは、独立して０または１であり、それぞれ特定の副成分の不在または存在を示す。一部の実施形態では、ｍおよびｎの少なくとも１つは１である。一部の実施形態では、ｍおよびｎの１つだけが１である。一部の実施形態では、ｍおよびｎは共に１である。以下に、より詳細に記述される、一部の特定の実施形態では、ｍおよびｎは共に０である。ｍおよび／またはｎが０である任意の実施形態では、対応するＸおよびＺ副成分が、Ｙ副成分が全く介在することなく直接連結されることが理解されよう。本明細書に記述される化合物を、本明細書では代わりに、ダイマー化合物、エンドソーム溶解性化合物、または本開示の化合物と呼ぶことができる。

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分は３から３０の間のアミノ酸を有する。

本明細書で使用される「ペプチド」または「ポリペプチド」は、アミド結合によって一緒に接合された、２つまたはそれ超のアミノ酸のポリマーを指す（即ち、「ペプチド結合」）。ペプチドは、典型的には５０までのまたは５０を含むアミノ酸を含み、直鎖状または環式であり得る。本明細書で使用される「アミノ酸」は、タンパク質中に見出される２０の天然に生ずるアミノ酸、天然に生ずるアミノ酸のＤ−立体異性体（例えば、Ｄ−トレオニン）、非天然アミノ酸（例えば、天然に生ずるアミノ酸に比べて変種の側鎖を持つ合成アミノ酸）、および化学的に修飾されたアミノ酸のいずれかを指す。アミノ酸のこれらのタイプのそれぞれは、相互に排他的ではない。α−アミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、水素原子、および「側鎖」と呼ばれる特有の基が結合される、炭素原子を含む。天然に生ずるアミノ酸の側鎖は、当技術分野で周知であり、例えば、水素（例えば、グリシンのように）、アルキル（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンのように）、置換アルキル（例えば、トレオニン、セリン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、およびリシンのように）、アリールアルキル（例えば、フェニルアラニンおよびトリプトファンのように）、置換アリールアルキル（例えば、チロシンのように）、およびヘテロアリールアルキル（例えば、ヒスチジンのように）を含む。

下記の略称が、２０の天然に生ずるアミノ酸に使用される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。

アミノ酸、より詳細にはそれらの側鎖は周知であり、それらの化学的特性（複数可）によって特徴付けることができる。例えば、アミノ酸側鎖は、正に帯電し、負に帯電し、または中性であってもよい。溶液のｐＨは、当業者に公知のように、ある側鎖の帯電性に影響を及ぼす。正に帯電し得る側鎖の非限定的な例には、ヒスチジン、アルギニン、およびリシンが含まれる。負に帯電し得る側鎖の非限定的な例には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。中性として特徴付けられてもよい側鎖の非限定的な例には、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、プロリン、およびトリプトファンが含まれる。

アミノ酸は、それらの側鎖の極性によって特徴付けられてもよい。典型的には無極性側鎖よりも親水性である極性側鎖には、例えば、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、およびグルタミンのものが含まれる。典型的には極性側鎖よりも疎水性である無極性側鎖には、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンのものが含まれる。側鎖の原子電気陰性決定および三次元構造評価を含めた当技術分野で公知の従来の技法を使用して、側鎖の極性を決定してもよい。各アミノ酸のオクタノール／水の分配係数を比較するなど、当技術分野で公知の従来の技法を使用して、側鎖の疎水性／親水性を比較してもよい。

本明細書で使用される「化学的に修飾されたアミノ酸」は、その側鎖が化学的に修飾されているアミノ酸を指す。例えば、側鎖は、フルオロフォアまたは放射標識など、シグナル伝達部分を含むように修飾されていてもよい。側鎖は、チオール、カルボン酸、またはアミノ基など、新しい官能基を含むように修飾されていてもよい。翻訳後に修飾されたアミノ酸も、化学的に修飾されたアミノ酸の定義に含まれる。

一部の実施形態では、ＣＰＰは正味の正電荷を有する。
一部の実施形態では、ＣＰＰは、アミノ酸残基の５０％またはそれ超が側鎖にグアニジニウム基を有しているアミノ酸配列を有する。例えば、アミノ酸配列は、そのアミノ酸の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは全て、またはその中の任意の導出可能な範囲が、側鎖にグアニジニウム基を有するものを、有することができる。グアニジニウム基は、式（ＩＩ）：
−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ_２ ^＋）−ＮＨ_２ 式（ＩＩ）
によって表される。

一部の実施形態では、グアニジニウム基を有するアミノ酸の１つまたは複数は、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）残基である。当技術分野で理解されるように、Ａｒｇ残基は、３炭素脂肪族直鎖を持つ側鎖を有し、その遠位端はグアニジニウム基でキャップされている。一部の実施形態では、グアニジニウム基を有するアミノ酸の１つまたは複数は、Ａｒｇの類似体であり、側鎖は何らかの手法で修飾されまたは合成によって異なっている。そのような修飾は、天然に生ずるＡｒｇに対する、側鎖での炭素の付加または欠失を含むことができ、その結果、グアニジニウム基でキャップされた、より長いまたはより短い側鎖が得られる。さらに側鎖は、分岐構造またはその他の官能基を含有するように修飾することができる。一部の実施形態では、グアニジニウム基は分岐構造内に存在することができる。一部の実施形態では、アミノ酸残基は、複数のグアニジニウム基を含むことができる。Ａｒｇ類似体の発生は、天然に生ずるＡｒｇに、意図される修飾を導入すること、および１つまたは複数のグアニジニウム基を含有する合成アミノ酸をｄｅ ｎｏｖｏで発生させることを含む、公知の技法により実現することができる。

一部の実施形態では、式（Ｉ）中のＺにより表されるＣＰＰ部分は、配列ＸＫＫＸＸＱＸＸＸ（配列番号１）に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその中に含まれる任意の範囲もしくはパーセンテージの同一性を有するアミノ酸配列を含む。配列番号１に現れる各表示Ｘは、独立して、上述のようにアルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）または天然に生じない残基であってアグアニジニウム基を持つものを指すことに留意されたい。一部の実施形態では、ＣＰＰは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、Ｃ末端端部に追加のグリシンを持つ、配列番号１に示されるアミノ酸を含み、またはそのようなアミノ酸からなる。一部の実施形態では、ＣＰＰ部分は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる。これらの実施形態のいずれかでは、配列番号１中のＸ表示の１つ、２つ、もしくはそれ超、または全ては、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）残基を指す。一部の実施形態では、Ｚ^１のＣＰＰ配列およびＺ^２のＣＰＰ配列は、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはその中に含まれる任意の範囲もしくはパーセンテージ互いに同一である、アミノ酸配列を有する。

本明細書で使用される、「パーセント同一性」または「パーセント同一である」を示す用語は、最大パーセント同一性を実現するために、候補および対象配列をアライメントした後の、指定された分子（配列番号１など）のアミノ酸配列と同一である、ポリペプチド配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。例えば、２つのタンパク質配列同士のパーセンテージ同一性は、National Center for Biotechnology Information（NCBI）、U.S. National Library of Medicine、8600 Rockville Pike、Bethesda、MD 20894、U.S.Aのウェブサイトでｂｌ２ｓｅｑインターフェースを使用した２つの配列のペアワイズ比較によって決定することができる。ｂｌ２ｓｅｑインターフェースは、Tatiana, A.ら、「Blast 2 Sequences-A New Tool for Comparing Protein and Nucleotide Sequences」、FEMS Microbiol. Lett. １７４巻：２４７〜２５０頁（１９９９年）により記述されるＢＬＡＳＴツールを使用した配列アライメントを可能にする。下記のアライメントパラメーターを使用することができる：マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープンペナルティ＝１１；ギャップ延長ペナルティ＝１；ギャップｘ＿ドロップオフ＝５０；エクスペクト＝１０．０；ワードサイズ＝３；およびフィルター＝オフ。

上述のように、式（Ｉ）によって表される化合物の一部の実施形態では、ｍおよびｎの少なくとも１つは１である。したがって一部の実施形態では、化合物は、式（Ｉ）中のＹにより表されるように、疎水性部分に共有結合した少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。任意の特定の理論に拘泥するものではないが、ダイマー化合物中のＹ位置（複数可）にある１つまたは複数の疎水性部分の存在は、ＣＰＰドメイン（複数可）のアミノ末端に親油性ウォール−ヘッドを生成すると考えられる。このウォール−ヘッドは、エンドソーム膜に関してダイマー化合物全体のより高い親和性をもたらし易く、ダイマー化合物中のＣＰＰドメインのエンドソーム溶解活性を容易にする。

一部の実施形態では、疎水性部分は、６から４０個の間の炭素原子を含む。一部の実施形態では、疎水性部分は、直鎖、分岐状、または環式基を含む。一部の実施形態では、環式基は、単環、二環、もしくは三環式基であり、またはこれらの基を含む。

一部の実施形態では、疎水性部分は、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、および硫黄（Ｓ）から選択される１つまたは複数のヘテロ原子をさらに含む。

例示的な非限定的疎水性部分は：芳香族分子（例えば、キサンテン、アントラセン、およびインドールなど）、アミノ酸（例えば、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシン残基など）、フルオロフォア、親油性分子、および脂肪族分子（例えば、脂肪酸など）などを含む。一部の実施形態では、疎水性部分は親油性である。

特定の実施形態では、疎水性部分は、ローダミン基またはその誘導体を含む。ローダミン基は、蛍光を発するその能力に起因して、色素として一般に使用される関連ある化合物のファミリーを含む。コアローダミン構造は、式（ＩＩＩ）：
によって表される。

ローダミンおよびその誘導体は、その正電荷に起因して水に可溶であることが、一般に公知である（多くの誘導体は、塩の形態で提供される）。この溶解性にも関わらず、ローダミンおよびその誘導体は、芳香族コアによりこれらの化合物に与えられた疎水性および親油性により、「疎水性部分」のあるタイプまたは部分として本明細書では含まれる。

一部の実施形態では、疎水性部分はローダミン誘導体を含む。一部の実施形態では、ローダミン誘導体は、式（ＩＶ）：
によって表される、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）である。

一部の実施形態では、ＴＭＲは、化合物のアミノ酸残基への結合を容易にするための５（６）−カルボキシＴＭＲである。疎水性部分に共有結合したアミノ酸残基は、そのような結合を受け易い上述のアミノ酸のいずれかであり得る。一部の実施形態では、より詳細に以下に記述されるように、アミノ酸はリシン（Ｌｙｓ；Ｋ）である。

上述のように、ある特定の実施形態では、ｍおよびｎは共に０である。そのような実施形態では、化合物は、本明細書に記述されるような少なくとも１つの疎水性部分を依然として含む。しかし、ＣＰＰのアミノ酸とは全く異なるアミノ酸に共有結合する代わりに、少なくとも１つの疎水性部分は、２つのＣＰＰ配列の少なくとも１つの内部のアミノ酸の少なくとも１つに共有結合する。これらの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸（疎水性部分に結合した）は、化合物のＸ副成分に近接していない（即ち、結合していない）末端に比べ、化合物のＸ副成分に近接した（即ち、結合された）末端により近い少なくとも１つのＣＰＰ配列内の位置に位置付けられることが好ましい。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸（疎水性部分に結合した）は、化合物のＸ副成分に近接した（即ち、結合された）末端位置でありまたはこの末端位置の１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基の位置の内部にあるＣＰＰ配列内の位置に位置付けられる。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸（疎水性部分に結合した）は、ＣＰＰアミノ酸配列中の最もＮ末端側にあるリシン残基である。

Ｘによって、式（Ｉ）で表されるように、連結部分は、本明細書に記述されるように、それぞれがＣＰＰ部分および疎水性部分を含む２つのモノマー単位を接合するのに有用な、安定な連結を容易にすることができる任意の化学的部分であり得る。一部の実施形態では、式（Ｉ）で表されるＸ^１−Ｘ^２は、単一連結構造を表す。一部の実施形態では、Ｘ^１およびＸ^２はそれぞれ、組み合わせると２つのモノマー単位の間に安定な連結を形成することが可能な、特徴的でありかつ任意選択で異なる部分を表す。一部の実施形態では、安定な連結は、複数の副成分の間の１つまたは複数の共有結合であり得る。他の実施形態では、安定な連結はイオン結合であり得る。

式（Ｉ）中のＸによって表される、連結部分の例示的な非限定的な例は、アミノ酸残基システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）であり、これは別のシステイン残基とジスルフィド結合を形成することが可能である。したがって一実施形態では、Ｘ^１およびＸ^２は共に、ジスルフィド結合によって相互に連結するシステイン残基である。別の例示的な例では、Ｘ^１およびＸ^２のうち一方はビオチン分子であり、Ｘ^１およびＸ^２のうち他方は、アビジン、ストレプトアビジン、およびニュートラアビジンなど、ビオチンに特異的に結合する部分である。当技術分野で容易に理解されるように、ビオチンおよびその特的結合パートナー、例えばアビジン、ストレプトアビジン、およびニュートラアビジンなどは、共有結合の強度に近い強力な非共有結合を形成する。

連結部分によって提供されたモノマー単位同士の連結は、永続的である必要はないことが理解されよう。代わりに、連結は、エンドソーム獲得中およびサイトゾルへのエンドソーム脱出中にダイマー構造全体が維持されるよう、十分安定しているべきである。その後、連結はもはや必要ではないと考えられ、場合によっては、好ましくは破壊されて細胞生存率を保持する。例えば、以下に記述されるように、例示的なｄＴＡＴダイマー構築物は、２つのモノマー単位間のジスルフィド結合によって維持される。図２を参照されたい。この実施形態では、ジスルフィド結合をサイトゾル内で切断することができ、その結果、後で比較的低い（または存在しない）膜破壊活性を有するモノマー単位になる。

あるいは、モノマー単位間の連結は、非還元性連結であり得る。２つのＴＡＴモノマー間に非還元性連結を持つ例示的な構築物は、図２１に示されており、以下に、より詳細に記述されるように、ｄＴＡＴの細胞浸透機能を保持することが示された。これは、ｄＴＡＴダイマー構築物を支持する特異的連結を、機能性に悪影響を及ぼすことなしに修飾しまたは置き換えることができることを実証する。

一部の実施形態では、式（Ｉ）で表されるような化合物の副成分Ｘ、Ｙ、および／またはＺ（例えば、Ｘ^１、Ｙ^１、および／またはＺ^１）は、アミド結合によって連結される。例えば、一部の実施形態では、Ｘ^１、Ｙ^１、および／もしくはＺ^１（ならびに／またはＸ^２、Ｙ^２、および／もしくはＺ^２）のそれぞれは少なくとも１つのアミノ酸を含み、Ｘ^１、Ｙ^１、および／もしくはＺ^１（ならびに／またはＸ^２、Ｙ^２、および／もしくはＺ^２）のそれぞれからの少なくとも１つのアミノ酸は、アミド結合によって連結される。一部の実施形態では、Ｘ^１、Ｙ^１、および／もしくはＺ^１（ならびに／またはＸ^２、Ｙ^２、およびＺ^２）の２つだけがアミド結合によって連結される。一部の実施形態では、Ｘ^１、Ｙ^１、およびＺ^１（ならびに／またはＸ^２、Ｙ^２、およびＺ^２）の全てがアミド結合によって連結される。一部の実施形態では、式（Ｉ）で表されるＸ、Ｙ、および／またはＺの副成分（例えば、Ｘ^１、Ｙ^１、および／またはＺ^１）は、介在する副成分によって間接的に連結される。副成分は、介在アミノ酸であり得、したがってアミド結合によってＸ、Ｙ、および／またはＺ副成分に連結することができる。

一部の実施形態では、式（Ｉ）で表される化合物のモノマーサブユニットとしてのＸ−Ｙ−Ｚの組合せ、即ち、Ｘ^１−Ｙ^１−Ｚ^１および／またはＸ^２−Ｙ^２−Ｚ^２は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５個のアミノ酸残基を含む。

以下に、より詳細に記述するように、図１に示されかつモノマーＸ−Ｙ−Ｚにより式（Ｉ）の文脈において表されるような十分な濃度のモノマーＴＡＴ（ＴＡＴ）の投与は、細胞に十分な濃度で投与され、その結果、いくらかサイトゾル蛍光がもたらされる。これは、十分な濃度では、ＴＡＴモノマー化合物が、エンドサイトーシス中にある程度の自己ダイマー化を可能にすることを示す。エンドソーム獲得中にエンドソーム内で自己組織化することができるモノマーは、エンドサイトーシスにより膜活性化合物にダイマー化することのみによる、非特異的膜相互作用のさらなる低減など、いくつかの潜在的な利益をもたらす。

したがって別の態様では、本開示は、式Ｘ−Ｙ−Ｚを有する化合物を提供し、式中、Ｘはシステイン残基であり、Ｙは、疎水性部分に共有結合したアミノ酸残基であり、Ｚは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分である。ＣＰＰ部分は、正味の正電荷を有し、かつ５０％またはそれ超の残基がグアニジニウム基を有しているアミノ酸配列を有する。好ましくは、ＸおよびＹ副成分とＹおよびＺ副成分は、アミド基により連結される。上記態様の化合物の場合のように、本明細書に記述される化合物は、代わりに、モノマー化合物、エンドソーム溶解性化合物、または本開示の化合物と呼ぶことができる。

この態様の化合物は、２つの化合物のＮ末端システイン残基間にジスルフィド結合を形成することによって、ホモダイマーを形成することが可能である。

ＣＰＰは上述されている。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分は３から３０の間のアミノ酸を有する。特定の実施形態では、グアニジニウム基を有する残基は、独立して、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）アミノ酸残基、または合成による天然に生じないアミノ酸、例えば合成Ａｒｇ類似体であり得る。

一部の実施形態では、ＣＰＰは、上述の配列番号１に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそこに含まれる任意の範囲もしくはパーセンテージの同一性を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＣＰＰは配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、Ｃ末端端部に追加のグリシンを持つ、配列番号１に示されるアミノ酸を含みまたはそのようなアミノ酸からなる。一部の実施形態では、ＣＰＰ部分は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、Ｙはリシン残基（Ｌｙｓ；Ｋ）である。

疎水性部分は上述されている。一部の特定の実施形態では、疎水性部分は、Ｃ６〜Ｃ３０直鎖、分岐状、または環式基を含む。一部の実施形態では、環式基は、単環、二環、もしくは三環式基であり、またはこれらの基を含む。一部の実施形態では、疎水性部分は、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、および硫黄（Ｓ）から選択される１つまたは複数のヘテロ原子をさらに含む。一部の実施形態では、疎水性部分は、ローダミンまたはローダミン誘導体を含む。一部の実施形態では、ローダミン誘導体は、式（ＩＶ）によって表されるテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）である。

一部の実施形態では、Ｘ−Ｙ−Ｚの組合せは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５個のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、表されるＸ、Ｙ、および／またはＺ副成分は、介在する副成分によって間接的に連結される。副成分は、介在アミノ酸であり得、したがってアミド結合によりＸ、Ｙ、および／またはＺ副成分に連結することができる。

別の態様では、本開示は、細胞内のエンドソーム浸透性を高める方法であって、本明細書で上述したように細胞を本開示の化合物と接触させることを含む方法を提供する。

この態様では、細胞を、細胞不浸透性分子のエンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させる。例えば、細胞は、細胞生存率を助長する、したがって動作可能なエンドサイトーシス経路を細胞が維持するのに十分な、当技術分野で公知の培養条件で維持することができる。一部の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。さらなる実施形態では、細胞は、ある特定の場合には記述される化合物の活性を低減させることができる、アルブミンを欠いている培地中で、ｉｎ ｖｉｖｏで培養される。他の実施形態では、細胞は、生きている対象から得られ、ｅｘ ｖｉｖｏで接触する。そのような実施形態では、公知の培養技法は、ある期間にわたって細胞をｅｘ ｖｉｖｏで維持するのに適用することができる。一部の実施形態では、以下に記述されるように、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで生きている対象内にあり、エンドソーム溶解性化合物が対象に投与される。

一部の実施形態では、細胞を少なくとも０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、またはそれよりも高い濃度のエンドソーム溶解性化合物と接触させる。濃度という用語は、細胞の局所環境の体積に対して決定することができる。例えば、濃度は、細胞と接触している細胞培養培地の体積に関して決定することができる。

一部の実施形態では、方法は、細胞を細胞不浸透性分子と接触させることをさらに含む。細胞不浸透性分子は、通常は助けなしで細胞膜を貫通せず、好ましくはサイトゾル内に導入されたときまたは導入された後に細胞に対して意図される作用を誘発する、化学剤である。唯一の理論上の制約は、分子がエンドサイトーシスを受けることが可能でなければならないことであり、これはあるサイズの制約を課すものである。細胞不浸透性分子の例示的な、非限定的な例には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（例えば、約５０を超えるアミノ酸のポリペプチド）、核酸、その他のポリマー、および医薬組成物などが含まれる。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は転写因子である。例示的な転写因子について、以下に、より詳細に論じる。

一部の実施形態では、細胞不浸透性分子は、共有結合によってまたはその他の手法で化合物に連結またはコンジュゲートされる。しかし、他の実施形態では、細胞不浸透性分子は、化合物に連結されずコンジュゲートされない。例えば、以下に、より詳細に記述されるように、ｄＴＡＴに連結されなかった転写因子および色素を含む様々な細胞不浸透性分子は、ｄＴＡＴと協調的であるがそれに連結もコンジュゲートもされない状態で投与された場合、様々な細胞のサイトゾルに首尾良く送達された。ある潜在的な利点は、このことによって、「カーゴ」細胞不浸透性分子の濃度または量を、本開示のエンドソーム溶解性化合物とは独立して容易に調整できるようになることである。

以下に記述されるように、ｄＴＡＴ化合物は正味の正電荷を有する。反対の電荷がないと、細胞不浸透性分子はエンドソーム溶解性化合物（以下に記述されるｄＴＡＴなど）と相互作用しなくなり、したがってそのエンドソーム溶解特性の妨害が回避されるという、理論構成がなされる。したがって、一部の実施形態では、細胞不浸透性分子は正味の正電荷を有する。しかし、他の実施形態では、細胞不浸透性分子は正味の負電荷を有することができる。これらの実施形態では、細胞不浸透性分子は、細胞不浸透性分子の負電荷を有効に遮蔽する追加の一般に公知の試薬を持つ細胞に接触することができる。この電荷遮蔽は、細胞不浸透性分子と本開示の化合物との有害な相互作用が少しでも存在する場合にはその有害な相互作用を回避する。例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランなどの化学物質、またはカチオン性脂質ベース試薬は、ＤＮＡ分子の周りに、より静電気的に中性の環境を生成するのに使用でき、したがってＤＮＡの負電荷の影響を改善することが公知である。例示的なカチオン性脂質は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）である。

以下で実証されるようにかつ図１４に示されるように、ｄＴＡＴ化合物は、ＤＥＡＣ−Ｋ９およびＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の同時送達を容易にした。したがって、一部の実施形態では、方法は、細胞を複数の異なる細胞不浸透性分子と接触させることを含む。

以下に実証されるように、エンドソーム溶解剤および細胞不浸透性分子の投与は、細胞生存率に害を及ぼすことなく多数回繰り返すことができる。したがって、一部の実施形態では、方法は、細胞をエンドソーム溶解性化合物および１種または複数の細胞不浸透性分子と接触させる第１の場合に続き、細胞をエンドソーム溶解性化合物および１種または複数の細胞不浸透性分子と一度に接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、接触させるステップは、１、２、３、４、５回、またはそれ超、繰り返され、その度に、おそらくは同じまたは異なる細胞不浸透性分子と接触させる。

一部の実施形態では、細胞は、生きている対象から得られ、ｅｘ ｖｉｖｏで本開示のエンドソーム溶解性化合物および細胞不浸透性分子と接触する。例えば、対象から得られた細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで、多能性を容易にすることが公知の任意の転写因子などの化合物および薬剤と接触させることができる。多能性の必須の程度に到達したら、細胞またはその子孫を、元の対象またはそれを必要とする別の対象に投与することができる。別の実施形態では、細胞またはその子孫は、本開示の化合物との追加の接触を含むことができる公知の方法により、さらに分化する。次いで分化した細胞（複数可）は、元の対象またはそれを必要とする異なる個体に投与することができる。

上述のように、方法の一部の実施形態は、細胞をｉｎ ｖｉｖｏで本開示のエンドソーム溶解性化合物と接触させることを包含する。さらなる実施形態では、細胞を治療の必要性に対処する有効量の細胞不浸透性分子とも接触させる。一部の実施形態では、エンドソーム溶解性化合物および／または細胞不浸透性分子は、対象の身体中の１種または複数の特定の細胞または細胞型を標的とする。これは、目的の細胞を特異的に標的とするよう設計製作された、リポソーム、ナノ粒子、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）などの様々な十分認識された送達ビヒクルを使用して実現することができる。例えば、細胞は、粒子標的を受け易い公知の表面レセプターを持つ、異常またはがん性細胞であり得る。粒子は、細胞の死を引き起こすエンドソーム溶解性化合物を送達することができる（細胞不浸透性剤と一緒に）。別の例では、細胞は、例えば組織または細胞集団を再生させるために必要な子孫細胞への幹細胞の分化を誘導する、エンドソーム溶解性化合物（細胞不浸透性剤と一緒に）で標的とされる幹細胞である。

対象は、任意の動物、例えば哺乳動物、爬虫類、節足動物、および軟体動物などであり得る。一部の実施形態では、哺乳動物対象は、霊長類（サル、類人猿、およびヒトを含む）、げっ歯類（マウス、ラット、およびモルモットなどを含む）、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、およびブタなどである。

したがって、関連する態様では、本開示は、細胞不浸透性分子を細胞のサイトゾルに送達する方法であって、細胞を本明細書で上述したようなエンドソーム溶解性化合物、および細胞不浸透性分子と、エンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させることを含む方法も提供する。

別の態様では、本開示は、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞における多能性を誘導する方法を提供する。方法は、ｉ）対象から得られた細胞を本明細書で上述したようなエンドソーム溶解性化合物および転写因子と、エンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させること、およびｉｉ）細胞を培養して、細胞の多能性を得ることを含む。

本明細書で使用される「多能的な」および「多能性」という用語は、複数の異なる細胞型に発達する細胞の能力または潜在性を指すのに使用される。使用されるとき、この用語は、全能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞（間葉細胞を含む）、および少能性細胞など、幹細胞の全てのカテゴリーを含むものとする。多くの技法は、目的の異なる細胞型に有用な前駆体である細胞が得られるように、遺伝子操作を通して体細胞から多能性を誘導することが知られていることが理解されよう。

多能性を促進させるのにこの態様で有用である公知の転写因子の例示的な、非限定的な例には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃなどが含まれる。

この態様の方法は、細胞に悪影響を及ぼすことのない適切な転写因子の効率的な送達によって、多能性を誘導するという利点をもたらす。記述されるように、送達は、繰り返すことができ、複数の異なる細胞不浸透性分子に適用することができる。次いで多能性細胞を、元の原対象またはそれを必要とする別の対象に、投与することができる。代替の実施形態では、多能性細胞を、任意の好ましい細胞型にさらに分化させる。ｅｘ ｖｉｖｏ培養物中の多能性細胞を分化させる方法は、当技術分野では公知であり、本開示のエンドソーム溶解性化合物のさらなる投与を含むことができる。分化した細胞は、培養で維持することができ、かつ／または元の原対象もしくは別の対象に、例えば適切な治療または研究目的で投与することができる。

別の態様では、本開示は、幹細胞をｅｘ ｖｉｖｏで拡張する方法を提供する。方法は、ｉ）幹細胞を本開示のエンドソーム溶解性化合物および転写因子と、エンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させること、およびｉｉ）細胞を培養して、細胞の拡張を得ることを含む。

本明細書で使用される「幹細胞を拡張する」という用語は、初期フィーダー幹細胞（１つまたは複数）からの細胞集団を増やすことを指し、ここで拡張された集団の要素は、多能性の必須の程度など、初期フィーダー細胞（１つまたは複数）の特性を保持している。拡張技法は、細胞の成長および分裂に適切な培養環境を提供することを含む。この環境は、培地、栄養補助剤、成長足場、および試薬の組合せを含むことができ、健康なフィーダー集団または馴化培地の必要性を含んでいてもいなくてもよい。拡張された幹細胞は、中核研究などの目的で、薬物スクリーニングツールとして治療上有益または有用である。例えば、拡張された造血幹細胞は、血球の様々な分化系列を持つ骨髄および血液を再配置する試みにおいて、切除型骨髄がん療法を受けた対象に投与することができる。

一部の実施形態では、幹細胞は造血幹細胞である。

一部の実施形態では、転写因子ＨｏｘＢ４、ＨｏｘＡ４／１０、Ｇａｔａ２、Ｇｆ１、ＡＭＬ１、ＪｕｎＢ、ＮＦ−Ｙ、Ｂｍｉ１Ｅｚｈ２、Ｄｍｎｔ３ａ、Ｃｂｘ７、ｐ１８、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ＰＴＥＮ、Ｍｙｃ、およびＦｂｘｗ７などである。

本開示の任意の態様で提供された任意の実施形態、特徴、要素、定義、または概略的記述は、明確に述べていない限り、制限することなく本開示の任意の他の態様に適用できることが理解されよう。したがって、本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法、薬剤、または組成物に関して実施することができ、その逆も同様である。さらに、本発明の薬剤および組成物を使用して、本発明の方法を実現することができる。

「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、本明細書で「含む（comprising）」という用語と併せて使用する場合、「１つ（one）」を意味することができるが、「１つまたは複数（one or more）」、「少なくとも１つ（at least one）」、および「１つまたは１つ超（one or more than one）」の意味とも一致する。

本出願の全体を通して、「約」という用語は、値がデバイスに関する誤差の固有のばらつきを含むことを示すのに使用され、方法は、値または研究対象間に存在するばらつきを決定するのに用いられる。

「含む（comprise）」、「有する（have）」、および「含む（include）」という用語は、開放型連結動詞である。「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含む（includes）」、および「含む（including）」など、これらの動詞の１つまたは複数の任意の形または時制も開放型である。例えば、１つまたは複数のステップを「含む（comprises）」、「有する（has）」、または「含む（includes）」任意の方法は、それらの１つまたは複数のステップのみを保有することに限定されず、その他の列挙されていないステップも包含する。

「含む（comprising）」の代わりにまたはそれに加えて、本明細書の任意の実施形態は、「からなる（consisting of）」を挙げることができる。「からなる（consisting of）」という移行句は、請求項で指定されないどのような要素、ステップ、成分も除外する。

本明細書に引用される刊行物および参考文献と、それらが引用されている論文は、その全体が参照により本明細書に特に組み込まれる。

下記は、新規なＴＡＴダイマー（ｄＴＡＴ）が意外にもエンドソーム漏出を媒介し、かつ単純な同時インキュベーション手順によって、培養した細胞への小分子、ペプチド、およびタンパク質の効率的な送達を容易にするという発見の記述である。ｄＴＡＴは、２つのＴＡＴペプチド間でのジスルフィド架橋の生成によって形成された。サイトゾル送達は、細胞の生存率または増殖に影響を及ぼすことなく実現された。多数の分子を同時に送達し、同じ細胞への送達は、効力を失うことなく繰り返し行われた。全体として、以下の記述は、細胞ベースのアッセイ、細胞イメージングの適用例、細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの操作および再プログラミング、ならびにその他の適用例に、極めて有用な新しい送達戦略を確立する。この記述は、本明細書に開示される主題を例示する目的で提供され、限定しようとするものではない。
結果
ＴＡＴのジスルフィド結合されたダイマーは、モノマー対応物よりも効率的に細胞のサイトゾルを透過する

配列ＸＫＫＸＸＱＸＸＸを持つＨＩＶトランス活性化転写活性化因子のドメインから誘導されたＣＰＰ（配列番号１参照、Ｘで指示される全ての残基はアルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）であり；本明細書では「ＴＡＴ ＣＰＰドメイン」と呼ぶ）を、ダイマー送達ビヒクルの設計用鋳型として使用した。Ｃ末端グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）を、合成の目的でＣＰＰドメインに添加して、固相ペプチド合成中の樹脂への結合によるラセミ化を防止した。しかし、Ｃ末端グリシンは、ＴＡＴ ＣＰＰドメインの機能性において役割を有すると考えられておらず、これを以下に実証する。最後にＣ末端アミド（Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ_２）を組み込んで、脱プロトン化されたときに、Ｃ末端で典型的なカルボキシルにより提供されるいかなる追加の電荷も回避した。フルオロフォアのテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）で修飾されたリシンを、蛍光イメージングのために導入し、システインをＴＡＴのＮ末端に付加して、ジスルフィド結合形成によるダイマー化を可能にした（図１）。ジスルフィド結合は、エンドソーム内では比較的安定であるが、還元するサイトゾルへの侵入によって切断される。したがって、ダイマーＴＡＴ構築物（図２）は安定であり、エンドソーム内ではエンドソーム溶解性であるが、サイトゾルに侵入するとモノマー性になりかつその膜破壊活性を失うと考えられる。モノマー生成物、ＣＫ（ＴＭＲ）−ＴＡＴを、還元モノマーとして精製した。本明細書で使用される「ＴＡＴ」という用語は、他に指示しない限り、ＴＡＴ ＣＰＰドメインではなくモノマー生成物（即ち、ＣＫ（ＴＭＲ）−ＴＡＴ）を指す。酸素化培地中のインキュベーションおよびＴＡＴの遊離システインチオールの酸化は、ダイマー（ＣＫ（ＴＭＲ）ＴＡＴ）_２（本明細書では、「ダイマー性ＴＡＴ」または「ｄＴＡＴ」と呼ぶ）を発生させ、各モノマー性ＴＡＴ単位は、末端シトシン残基の間でジスルフィド結合を介して連結される。ＴＡＴおよびｄＴＡＴは、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳスペクトル解析によって特徴付けた。精製されたＣＫ（ε−ＮＨ−ＴＭＲ）ＴＡＴ（ＴＡＴ）は、１４．２分の滞留時間（ｒｔ）を示した（ＴＡＴ、予測質量＝２０３９．１６、観察された質量＝２０４０．６６）。ｄＴＡＴは、酸素化緩衝液中で一晩ＴＡＴをインキュベートすることによって得られた。ＨＰＬＣ精製後、ｄＴＡＴは、滞留時間（ｒｔ）２２．７分で単一ピークを示した（ｄＴＡＴ、予測質量＝４０７６．３０、観察された質量：Ｍ＋１／１Ｈ^＋＝４０８４．２１Ｄａ、Ｍ＋２／２Ｈ^＋＝２０４１．３２）。純粋なｄＴＡＴを、水に溶かしたＴＣＥＰ（５０ｍＭ）の溶液と混合し、１５分間反応させた。ＨＰＬＣクロマトグラムは、ｒｔ＝１４．３分でピークを示し、純粋なＴＡＴの滞留時間（図示せず）と同一であった。あるいは、ＴＡＴのチオール（即ち、ＣＫ（ＴＭＲ）ＴＡＴ）をアセトアミド化してペプチドを得（本明細書では「ａｃＴＡＴ」と呼ぶ）、これはダイマー化することができない（図３）。ａｃＴＡＴを、純粋なａｃＴＡＴのＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル解析によって特徴付けた（ｒｔ＝８．９３分）（予測質量：２０９６．１８、観察された質量：２０９６．３１）（図示せず）。

ＴＡＴ、ｄＴＡＴ、およびａｃＴＡＴペプチドを、いくつかの細胞系と共に１時間インキュベートし、内部移行を蛍光顕微鏡法によって評価した。図４Ａ〜４Ｄは、エンドソーム内のペプチドの蓄積と一致する、点状分布で局在化したａｃＴＡＴ（１〜２０μＭ）を示す。対照的に、ｄＴＡＴの蛍光シグナルは、点状であり（２μＭよりも低い）またはサイトゾルおよび核内に分布した（５μＭよりも高い）。図５も参照されたい。興味深いことに、拡散蛍光分布を持つ細胞の数は、ｄＴＡＴの２から５μＭの間で劇的に増加した（図４Ｃおよび図６）。しかし、溶解産物のバルク蛍光によって測定された、細胞内（サイトゾル＋エンドソーム）のｄＴＡＴの全体の量は、細胞外に投与されたｄＴＡＴの濃度にほぼ直線状に相関した（図４Ｄ）。これらのデータは、ｄＴＡＴがエンドサイトーシスを受け、閾値濃度よりも高くなると細胞のサイトゾル内に脱出することを実証する。ｄＴＡＴのサイトゾル送達は、ＨｅＬａ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＨａＣａＴ、およびＣＯＬＯ ３１６細胞で実現した。簡単に述べると、生細胞のサイトゾルおよび核へのｄＴＡＴの送達は、多数の細胞系で実現された。細胞系ＨｅＬａ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＣＯＬＯ ３１６、およびＨａＣａＴを、５μＭ ｄＴＡＴと共に１時間インキュベートし、洗浄し、イメージングした。検出された蛍光シグナルは、細胞のサイトゾルおよび核内にあった。イメージング後、細胞を、５％ＣＯ_２を含有する加湿雰囲気中で２４時間、３７℃でインキュベートし、洗浄し、再びイメージングした。細胞形態は、２４時間後変化しなかった。細胞生存率を、細胞不浸透性核染色ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｂｌｕｅの排除によって、１時間および２４時間の両方の時点で評価した。２４時間の時点でのＴＭＲ蛍光は、おそらくペプチドの細胞内分解により（図示せず）、１時間の時点で得られた場合とは異なっていた。全ての場合で、細胞はＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｂｌｕｅで染色されず、これはそれらの原形質膜が損なわれておらずかつ細胞が生きていることを示した。ａｃＴＡＴと同様に、ＴＡＴは、最大１０μＭでエンドソーム内に局在化した。しかし、２０μＭで、多くの細胞はサイトゾル蛍光を示し、これはＴＡＴが、おそらくはｉｎ ｓｉｔｕでのダイマー化によってｄＴＡＴの活性の一部を再現することを示している。簡単に述べると、生細胞とのインキュベーション後のＴＡＴ細胞の局在化は、細胞外培地でのその濃度に依存するように見えた。反転モノクロ（黒＝蛍光シグナル、白＝シグナルなし）蛍光画像は、１０または２０μＭのＴＡＴと共に１時間インキュベートされたＨｅＬａ細胞で作製された。ＴＡＴは、１０μＭ ＴＡＴで、蛍光で点状分布を示し、一方、２０μＭ ＴＡＴは、サイトゾルおよび核蛍光分布を示す細胞集団の有意な増大を示した（図示せず）。
ｄＴＡＴは、通常はトランスフェクションに耐性のある細胞のサイトゾルを透過する

後根神経節Ｆ１１（ＤＲＧ−Ｆ１１）神経細胞は、トランスフェクトするのが難しいことがよく知られている。ｄＴＡＴ曝露をＤＲＧ−Ｆ１１細胞で試験して、トランスフェクションの難しさがｄＴＡＴに対する障壁を課しているか否かを決定した。ＤＲＧ−Ｆ１１細胞を、ｄＴＡＴ（５μＭ）と共に１時間インキュベートした。イメージングを２０×（図１８Ａ）および１００×（図１８Ａ）対物レンズで行ったが、これらはｄＴＡＴがＤＲＧ−Ｆ１１細胞のサイトゾルを透過することを示す。
ｄＴＡＴは、エンドサイトーシスとその後に続くエンドソーム脱出により細胞を透過する

エンドソーム脱出がｄＴＡＴの送達に関わっているか否かを試験するために、アミロライド、マクロピノサイトーシス阻害剤、およびバフィロマイシン、エンドソーム酸性化の阻害剤の影響について評価した。図８Ａは、アミロライドおよびバフィロマイシンがｄＴＡＴのサイトゾル送達を阻害したことを示し、これは、ｄＴＡＴが、細胞のサイトゾルに侵入する前にエンドサイトーシス経路内を移行することを示唆している。これらの結果を確認するために、細胞を、エンドソーム内に蓄積されるＤＥＡＣ−Ｋ９、蛍光ポリリシンペプチド（図９参照）と共にインキュベートした。次いで細胞を洗浄し、ｄＴＡＴと共にインキュベートした（図８Ｂ）。蛍光の点状分布のみが、ＤＥＡＣ−Ｋ９単独と共にインキュベートした細胞で観察されたが、ｄＴＡＴを引き続き添加すると、サイトゾルおよび核の全体にわたってＤＥＡＣシグナルの再分布がもたらされた。しかしこの再分布は、バフィロマイシンによって阻害された。これらのデータは、ｄＴＡＴが、ＤＥＡＣ−Ｋ９を既に含有するエンドソーム内に蓄積され、かつｄＴＡＴが、ＤＥＡＣ−Ｋ９の放出を伴うような方法でエンドソームから脱出することを実証する。これらのデータの全体は、ｄＴＡＴが、エンドサイトーシスの後にエンドサイトーシス経路からの脱出を含む２ステッププロセスで細胞を透過することを実証する。
ｄＴＡＴ媒介型エンドソーム漏出は効率的である

上記にて実証されたように、ｄＴＡＴのサイトゾル分布は、ａｃＴＡＴまたはＴＡＴで観察できるものよりも著しく効率的なエンドソーム脱出プロセスを示す。しかしｄＴＡＴのサイトゾル蛍光は、エンドソーム内に残存するシグナルをおそらくは不明瞭にする。そのような仮説のシナリオの下で、ｄＴＡＴエンドソーム脱出は、実際にそうであるよりも劇的に見えるようである。ｄＴＡＴがエンドソーム漏出を媒介する効率をより精密に確立するために、ｄＴＡＴを、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８、ＳＮＡＰタンパク質融合タグと反応することができる細胞不浸透性の緑色フルオロフォアと共に、同時インキュベートした（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sun, X.ら、「Development of SNAP-Tag Fluorogenic Probes for Wash-Free Fluorescence Imaging」、Chembiochem: a European Journal of Chemical Biology １２巻：２２１７〜２２２６頁（２０１７）参照）。実験は、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８が送達後に細胞の核を標識し得るように、ＳＮＡＰ−Ｈ２Ｂヒストン構築物を発現する細胞で行った。ｄＴＡＴおよびＳＮＡＰ Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８と共にインキュベートされた細胞は、核染色を示し（図８Ｃ）、一方、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８のみと共にインキュベートされた細胞は示さなかった。簡単に述べると、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８は、エンドサイトーシスを介して細胞に侵入することが示された。ＨｅＬａ細胞を、５μＭ ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８と共に１時間インキュベートし、洗浄し、イメージングした。反転モノクロ画像は、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８からの点状蛍光分布を示した。ＨｅＬａ細胞を、５μＭ ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８および２．５μＭ ｄＴＡＴ（ｄＴＡＴインキュベーションが著しいサイトゾル放出をもたらさない濃度）と共に１時間インキュベートし、洗浄し、イメージングした。反転モノクロ画像は、ここでも、エンドサイト小器官でのＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の蓄積（点状分布）、およびＴＭＲシグナルによる同時局在化を示した。明視野画像は、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８および／またはｄＴＡＴの取込み後（図示せず）にＨｅＬａ細胞形態が変化しないことを示した。これらのデータは、検出された蛍光が細胞内であることをさらに確認する。さらに、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８は送達後に核内に蓄積されるので、サイトゾル蛍光は失われ、エンドソーム内に残存する蛍光分子の量がより明瞭に明らかにされる。図８Ｃで強調されるように、明るく標識された核を持つ細胞は、数個のぼんやりとしたエンドソームしか含有していなかった。ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８蛍光は、ＳＮＡＰ融合タグと反応する前に消光する（８０％）ことに留意すべきである。消光を考慮した場合、蛍光シグナルの解析は、細胞における蛍光脱出エンドソームの５０％から９０％の間がイメージングされたことを示した（１００個のトランスフェクトされた細胞が解析された）。
ｄＴＡＴ媒介型サイトゾル送達は、細胞生存率、細胞増殖、およびｄＴＡＴにより使用されるエンドサイトーシス経路に影響を及ぼさない

ｄＴＡＴ媒介型エンドソーム脱出は非常に効率的であるので、懸念は、ｄＴＡＴが、仮定として、細胞生理学に悪影響を及ぼす可能性があるということである。この課題に対処するために、ｄＴＡＴに関連した毒性を、ＨｅＬａ細胞とのインキュベーション後、１、２４、および４８時間で確立した。意外にも、死細胞の割合は、ほぼ全ての細胞において効率的なサイトゾル透過を実現するのに十分な濃度、５μＭ ｄＴＡＴで、５％よりも低かった（図１０Ｂ）。ｄＴＡＴで処置した細胞の形態も、未処置の細胞の場合と同一であった（図１０Ａ）（ＴＭＲシグナルの分布は、おそらくはペプチド分解により２４時間後には異なる）。さらに図１０Ｃは、ｄＴＡＴ（５μＭ）で処置したＨｅＬａ細胞が、未処置の細胞と同じ速度で成長することを示す。最後に、効率的なｄＴＡＴエンドソーム脱出を示すサイトゾル蛍光シグナルを含有する細胞は、顕微鏡法により、分裂することが観察された（図１０Ｄ）。これらのデータの全体は、細胞がｄＴＡＴ透過を生き残りかつ正常に成長することを実証する。

この実証された、細胞形態および増殖への悪影響がほとんどない状態が、ＨｅＬａ細胞に限定されるか否かを決定するために、類似のアッセイをその他の細胞型で行った。図１１は、神経細胞系Ｎｅｕｒｏ−２ａ（左パネル）および原発性ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）（右パネル）との１時間のインキュベーション後のｄＴＡＴの細胞局在化を示す。細胞を、ｄＴＡＴと共にインキュベートし、洗浄し、１００×対物レンズでイメージングした。蛍光画像は、ｄＴＡＴと共にインキュベートされた細胞に関するサイトゾル放出を示す。ＳＹＴＯＸ（登録）ブルー（２μＭ）の排除を使用して、イメージングされた細胞が、損なわれた原形質膜を持たないことを決定した。図１２は、処置されたおよび未処置のＨｅＬａ、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、およびＨＤＦ細胞の増殖速度（ＭＴＴアッセイでの吸光度）をグラフで示す。各細胞型ごとの、処置されたおよび未処置の細胞は、経時的にほぼ同一の増殖パターンを示した。

ｄＴＡＴが、送達ステップ中に多くのエンドソームを乱す場合、エンドサイトーシストラフィッキングは、仮定として、ペプチドインキュベーション後に悪影響を受ける可能性がある細胞プロセスであると考えられる。例えば、ｄＴＡＴがエンドサイトーシス経路を劇的に妨げる場合、それは仮定として、初期処置の後には分子を首尾よく送達し得るが、繰り返されるｄＴＡＴインキュベーションにより第２の分子を送達できないと考えられる。この考えを試験するために、２つの異なる分子（ＤＥＡＣ−Ｋ９およびＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８）の段階的な送達について評価した。細胞を、まずｄＴＡＴ（５μＭ）およびＤＥＡＣ−Ｋ９（５μＭ）と共に１時間インキュベートした。予測されるように、このインキュベーションは、ｄＴＡＴおよびＤＥＡＣ−Ｋ９の両方のサイトゾル分布をもたらした（データは示さず）。２０分後、細胞をｄＴＡＴ（５μＭ）およびＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８（５μＭ）と共に１時間インキュベートした。意外にも、この多段階プロトコールで処置した細胞は、ＤＥＡＣ−Ｋ９およびＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の両方のサイトゾルおよび核蛍光を示した（図１３）。重要なことは、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の送達が、多段階送達プロトコール中に、ｄＴＡＴが存在しない状態で生じなかったことである。簡単に述べると、ＨｅＬａ細胞をまず５μＭ ｄＴＡＴおよび５μＭ ＤＥＡＣ−Ｋ９と共に１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、５μＭ ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８と共に１時間インキュベートし、イメージングした。反転モノクロ画像は、ＴＭＲおよびＤＥＡＣのサイトゾルおよび核局在化を示した。しかし、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８は、蛍光点状分布を示した（図示せず）。さらに、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の送達は、バフィロマイシンによって阻害され、これは第２の送達ステップもｄＴＡＴのエンドソーム溶解活性によって媒介されるという考えと一致する（図１３）。さらに、試験されたＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８の蛍光は、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８が、未処置の細胞に送達され（１ステップ送達）またはＤＥＡＣ−Ｋ９と同時に送達された場合に得られたものと同等であった（図１４Ａ〜１４Ｂ）。併せると、これらの結果は、ｄＴＡＴ媒介型送達を繰り返すことができるということを確立する。これは即ち、ｄＴＡＴによって用いられたエンドサイトーシス経路が、ｄＴＡＴエンドソーム脱出後に劇的に損なわれないということを確立する。
ｄＴＡＴは、細胞内で強力な転写応答を誘発しない

細胞に対するｄＴＡＴ曝露の影響をより良く決定するために、全ゲノムマイクロアレイ解析を、５μＭ ｄＴＡＴで１時間処置した細胞で行って、転写パターンが影響を受けるか否かを決定した。解析は、ｄＴＡＴ処置の直後、１時間後、または２４時間後に行った。図１５は、プロットが、処置した試料対未処置の（同じインキュベーションステップだがペプチドは用いない）試料のマイクロアレイ強度値を表すことを示す。直線は、２倍強度の変化のカットオフを表す。これらのデータは、ｄＴＡＴへの曝露が、全ゲノムスケール上で最小限の転写擾乱を引き起こすことを示す。
ｄＴＡＴは、タンパク質を、トランス状態で生細胞のサイトゾルおよび核に送達する

ｄＴＡＴ、ＤＥＡＣ−Ｋ９、およびＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８は、比較的小さい分子である。したがって、ｄＴＡＴ媒介型エンドソーム漏出が大きいタンパク質を細胞のサイトゾルに送達できるか否かについて対処した。このアッセイでは、ＥＧＦＰ（２６ｋＤａ）をモデルとして選択したが、それはこのタンパク質が、適正に折り畳まれた場合にのみ蛍光を発するからである。ＥＧＦＰおよびｄＴＡＴを細胞と共に１時間インキュベートし、タンパク質分布を蛍光によって試験した。その他の細胞不浸透性分子で観察されたように、ＥＧＦＰは、観察可能な毒性なしに細胞の９０％超でサイトゾルおよび核内に分布された（ＨｅＬａまたはＮＩＨ ３Ｔ３細胞において；図１６Ａおよび図１７参照）。タンパク質分解は送達中に生じ得るが、このアッセイは、折り畳まれたタンパク質の集団が送達されるということを確立する。さらに、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイは、ｄＴＡＴがＥＧＦＰに結合しないということを確立した（図１８Ａ〜１８Ｃ）。これらの結果は、ｄＴＡＴとタンパク質との相互作用が送達に必要ではないことを示唆する。

機能性タンパク質がｄＴＡＴとのインキュベーション後に細胞を透過できることをさらに確認するために、Ｃｒｅリコンビナーゼの送達を試験した。このアッセイでは、Ｃｒｅが、レポータープラスミドのｅｇｆｐ遺伝子の上流でｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ配列の組換えを誘導する。したがって、レポータープラスミドをトランスフェクトした細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼが細胞を透過しかつＳＴＯＰシグナル配列を切り取ったときに、ＥＧＦＰを発現する（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wadia, J.S.ら、「Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis」、Nat Med １０巻：３１０〜３１５頁（２００４年）参照）。図１６Ｂで示されるように、ＴＡＴ−Ｃｒｅ（１μＭ）およびｄＴＡＴ（５μＭ）で処置した細胞は、ＥＧＦＰを発現させた。さらに、ＥＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージは、ＴＡＴの存在下またはＴＡＴ−Ｃｒｅを単独でインキュベーションした場合（＜５％）よりも、ｄＴＡＴの存在下で大きかった（４７％）。次に、ＦＩＴＣ−抗ＡＴＰ５Ａ、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼのアルファサブユニットを認識する蛍光標識された抗体について、試験をした。図１６Ｃに示されるように、ＦＩＴＣ−抗ＡＴＰ５Ａ（２０μｇ／ｍＬ）およびｄＴＡＴ（５μＭ）で処置された生細胞は、緑色蛍光管状構造を含有していた。青色蛍光ミトコンドリアマーカーｐＴａｇＣＦＰ−ｍｉｔｏとの同時局在化は、これらの構造がミトコンドリアであることを確認した（図１９Ａ）。最後に、ＦＩＴＣ−抗ＩｇＧ、ミトコンドリアを標的としない抗体で処置した細胞は、同じ管状構造を提示しなかった（図１９Ｂ）。併せると、これらの実験は、ｄＴＡＴが機能性抗体を生細胞に送達できることを確認する。

次に、治療上重要な転写因子ＨｏｘＢ４の送達について試験した。ＨｏｘＢ４は、それのみでまたはＰＤＴ ＴＡＴに融合したときに細胞を透過することができ、転写を活性化することができる。したがって、ｄＴＡＴは、サイトゾル送達を促進させることによって、タンパク質の転写活性を高めることができるか否かが決定された。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞に、ＨｏｘＢ４誘導性プロモーターの下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するベクターをトランスフェクトし、内部対照としてβ−ガラクトシダーゼレポーターをトランスフェクトした。細胞を、ｄＴＡＴが存在しない状態または存在下で、ＨｏｘＢ４またはＴＡＴ−ＨｏｘＢ４と共に１．５時間インキュベートした。次いで細胞を溶解し、ルシフェラーゼ発現を、β−ガラクトシダーゼ活性に正規化された細胞溶解産物のルミネッセンスを測定することによって評価した。図２０Ａは、ＨｏｘＢ４およびＴＡＴ−ＨｏｘＢ４（２００ｎＭ）のみが、これらのタンパク質で処置しなかった細胞から得られた活性よりも、ルシフェラーゼ活性のそれぞれ２．２および５．０倍の増大を誘導したことを示す。これらの値は、先に公開された報告と一致する。対照的に、ｄＴＡＴ（３μＭ）の添加は、それぞれ５３．１および３０７．４のルシフェラーゼ誘導をもたらした。したがってルシフェラーゼ誘導は、ＨｏｘＢ４の場合にｄＴＡＴの存在下で２４倍増大し、ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４の場合は６１倍増大した。ｄＴＡＴ単独も、ＴＡＴ−ｍＣｈｅｒｒｙと共にインキュベートしたｄＴＡＴも、ルシフェラーゼの誘導をもたらさなかったが、これはルシフェラーゼ発現がＨｏｘＢ４の存在に依存することを示している。ＨｏｘＢ４の転写出力を増大させることには価値があるが、高レベルのＨｏｘＢ４発現は、抗増殖および形質転換作用をもたらすことができる。したがって、細胞内のＨｏｘＢ４のレベルおよび活性を精密に制御することは、所望の生物学的成果を実現するのに重要である。ｄＴＡＴは、本発明者らのアッセイにおいて、同時インキュベーションで使用される分子とは独立して働くようであるので、ｄＴＡＴ濃度を一定に維持しながら培地中のタンパク質濃度を変化させることによって、細胞を透過するタンパク質の量を滴定することが可能であり得ると仮定された。このシナリオの下、エンドソーム脱出の効率は影響を受けないままであるべきだが、エンドソームから放出された材料の量は変わるべきである。ＤＥＡＣ−Ｋ９による初期実験は、細胞内に送達された蛍光ペプチドの量を、このプロトコールを使用して滴定することができることを示した（図２０Ｂ）。これらの結果と一致して、ルシフェラーゼ誘導は、培地中のＨｏｘＢ４の濃度に対して直線的に応答した（図２０Ｃ）。併せるとこれらの結果は、改善された送達が、細胞外に投与されたタンパク質の生物学的活性の増加をもたらし、かつ送達された分子の活性を精密に調節できることを示す。
ｄＴＡＴにおける各ＴＡＴモノマー間の構造連結を、細胞透過活性に影響を及ぼすことなく変化させることができる

ｄＴＡＴをそのダイマー形態で保持するジスルフィド連結の関連性を決定するために、代替のダイマーＴＡＴ構築物を構築した。詳細には、ジスルフィド結合リンカーが非還元性リンカーで置換されたダイマーＴＡＴ構築物（ｎｒｄＴＡＴ）を構築した。この特定のｎｒｄＴＡＴ構築物の構造および予測質量を、図２１に示す。ｄＴＡＴにおける各ＴＡＴモノマーの間の構造連結は、細胞透過活性に影響を及ぼすことなく変化させることができる。ｒｄＴＡＴ構築物を、より詳細に上述したように、全体的な細胞透過活性に関して試験をした。ＨｅＬａ細胞を、５μＭおよび１０μＭ ｎｒｄＴＡＴと共に１時間インキュベートした。図２２Ａおよび２２Ｂは、それぞれの明視野画像（左パネル）、モノクロ蛍光画像（中心パネル；白＝蛍光シグナル、黒＝シグナルなし）；および細胞死の指標として使用したＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ（２μＭ）による細胞生存率（右パネル）を示す。これらのデータは、細胞生物学に悪影響を及ぼすことのない、両方の濃度での、ＨｅＬａ細胞へのｎｒｄＴＡＴの効率的なサイトゾル送達を示す。したがって、ダイマー構築物においてＴＡＴペプチドを連結するリンカーは、ジスルフィドリンカーである必要はなく、むしろ、上述の細胞透過活性を保持しながら種々の機能性を組み込むように変化させることができる。
考察

ｄＴＡＴは、生細胞のサイトゾルまたは核に、タンパク質、ペプチド、または小分子を送達するのに著しく効率的である。特に、ｄＴＡＴは、エンドソーム内に捕えられた分子の放出を媒介する。送達は、サイトゾルに到達する材料の量が十分であり、エンドソーム内に捕えられたままの材料の量が比較的少ないので、またサイトゾル送達が試料中に存在するほとんどの細胞で生ずるので、効率的である。エンドソーム脱出は、エンドソーム内でｄＴＡＴが閾値濃度に到達すると、ほとんどの細胞で生ずるようである。重要なのは、内部移行したモノマーペプチドの量がこの閾値レベルよりも高い場合であっても、ａｃＴＡＴが、エンドソーム脱出を実現しないことである（図２３）。したがってこれらの結果は、ｄＴＡＴが、そのモノマー対応物よりも本質的にエンドソーム溶解性であることを示唆している。

ｄＴＡＴ媒介型送達の注目すべき態様は、観察された効率的なエンドソーム脱出に関連した驚くほど低い毒性である。対照的に、光誘導性エンドソーム溶解は、細胞のサイトゾル内へのカルシウムの高速放出を引き起こすことにより、極めて毒性が高いことが示された。したがって、ｄＴＡＴのエンドソーム溶解活性から同様の作用が予測できた。さらに、エンドソームおよびリソソームプロテアーゼの放出と同様にエンドソーム漏出を伴うことが予測される膜損傷は、毒性に寄与する可能性がある。さらに、５μＭ、細胞の９５％超でサイトゾル送達が観察される濃度で、ｄＴＡＴは、細胞生存率に著しく影響を及ぼさない。さらに、ｄＴＡＴ媒介型送達は、増殖に悪影響を及ぼさず、これは細胞が生存可能なだけではなく比較的健康であることも示している。さらにこれらの作用は、標準的なトランスフェクション技法に対してよく知られるように耐性がある細胞も含め、様々な個別の細胞型に関して観察される。

ｄＴＡＴは、多様な構造および性質を示す細胞不浸透性分子を送達する。ｄＴＡＴのようなＤＥＡＣ−Ｋ９は、高度に正に帯電し、Ｃｒｅ（９．４）およびＨｏｘＢ４（９．８）のｐＩも、ｄＴＡＴとの好ましい静電気的相互作用を示唆しない。ＥＧＦＰ、より低いｐＩ（６．２）を持つタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｄＴＡＴとは著しく相互作用するものではない。したがってｄＴＡＴは、細胞外またはエンドソームの管腔内で試験された分子と著しく相互作用しないようである。

本明細書で使用される同時インキュベーションフォーマットは、いくつかのカーゴをインキュベートしかつ一度に送達するのを可能にする。あるいは送達は、連続ステップで行うことができる。ｄＴＡＴ媒介型送達は、複雑な試料調製を必要とせず、ＳＮＡＰ−ｓｕｒｆａｃｅ ４８８またはＦＩＴＣ−抗ＡＴＰ５Ａの送達により具体化されたように、イメージングの適用例に理想的に適している。さらに、同時インキュベーションは、ｄＴＡＴの濃度とは独立して標的分子の濃度を変える機会も提供する。これらのアッセイにおいて、ｄＴＡＴの濃度は、ほとんどの細胞におけるエンドソーム放出の高い効率を維持するために、例えば一定に保持された（即ち、５μＭ）。培地中のＤＥＡＣ−Ｋ９またはＨｏｘＢ４の濃度を変えることによって、サイトゾルに送達された材料の量と生物学的出力とのそれぞれを滴定することができた。この手法はおそらく、生物学的物質のｉｎ ｖｉｖｏ送達には最適でないが、組織培養および細胞のｅｘ ｖｉｖｏ操作の文脈においていくつかの利点をもたらす。レトロウイルス送達後のＨｏｘＢ４の連続過発現は、造血幹細胞拡張の促進に加え、悪性形質転換をもたらし、増殖を低減させ、またはアポトーシスに対して細胞を感作させることもできる。これらの種々の成果は、ＨｏｘＢ４用量依存性である。ｄＴＡＴ媒介型送達は、ＨｏｘＢ４レベルおよび活性を精密に制御させることによって、この問題に対する解決策を提供することができた。これは、ＤＮＡベースの手法に関連した遺伝子操作の欠如と一緒になって、細胞療法の手法を患者に対してより安全にするのに寄与することができた。

材料および方法
ペプチド設計、合成、および精製
全てのペプチドを、標準的なＦｍｏｃプロトコールを使用したＳＰＰＳによって、ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）において、組織内で合成した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を使用してペプチドを組み立てた。反応を、撹拌が得られるように乾燥Ｎ_２の流れを使用して、室温でＳＰＰＳ容器内で実施した。Ｆｍｏｃ脱保護は、ピペリジンをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）（２０％、１０ｍＬ）に加えたものを、Ｆｍｏｃ−ペプチド樹脂（０．３０ｍｍｏｌ）に添加することによって行った。脱保護反応は、１×５分および１×１５分にわたり実施し、これらの反応の間には洗浄ステップを設けた。アミノ酸結合反応は、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（１．２ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）（０．４４ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（０．５１ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦに加えた混合物と共に４時間実施した。反応の終了後、樹脂をＤＭＦおよびジクロロメタン（ＤＣＭ）（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で洗浄した。ＤＥＡＣ−Ｋ９の場合、ＤＥＡＣ、ＨＢＴＵ、およびＤＩＥＡ（ペプチドに対して４、３．９、および１０当量）をＤＭＦに加えた混合物を使用して、９番目のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを結合させた後に、ＤＥＡＣフルオロフォア（ＡｎａＳｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）をペプチドのＮ末端に結合させた。反応は、撹拌が得られるように乾燥Ｎ_２の流れを使用して一晩実施した。ＣＫ（ε−ＮＨ−ＴＭＲ）ＴＡＴ（ＴＡＴ）の場合、ＣＫ（ε−ＮＨ−Ｍｔｔ）ＴＡＴ上のＬｙｓのε−アミノ基にあるＭｔｔ保護基を、２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Ｆｉｓｈｅｒ）および２％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）（Ｓｉｇｍａ）をＤＣＭに加えたもので切断し、樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦで洗浄した。ＴＭＲ、ＨＢＴＵ、およびＤＩＥＡ（ペプチドに対して４、３．９、および１０当量）をＤＭＦに加えた混合物を樹脂に添加し、反応を、撹拌が得られるように乾燥Ｎ_２を使用して一晩実施した。Ｆｍｏｃ脱保護およびペプチド組立ての後、樹脂をＤＣＭで洗浄し、真空乾燥した。次いで樹脂を、２．５％Ｈ_２Ｏ、２．５％ＴＩＳ、および２．５％エタンジチオール（ＥＤＴ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴＦＡで、室温で３時間処置して、全体的な脱保護と樹脂からの切断とを実現した。粗製ペプチド生成物を沈殿させ、冷無水Ｅｔ_２Ｏ（Ｆｉｓｈｅｒ）で洗浄した。沈殿物を水中に再懸濁し、凍結乾燥した。次いで得られた生成物を、０．１％水性ＴＦＡ／アセトニトリルに再懸濁した。ペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより分析し精製した。ＨＰＬＣ分析は、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １２００シリーズ機器および分析Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム（５μｍ、４×１５０ｍｍ）で行った。流量は１ｍＬ／分であり、検出は２１４ｎｍおよび５５０ｎｍで行った。半分取ＨＰＬＣを、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ １０×２５０ｍｍカラムで行った。流量は４ｍＬ／分であり、検出は２１４ｎｍおよび５５０ｎｍで行った。全ての実験操作は、０．１％水性ＴＦＡ（溶媒Ａ）、および９０％アセトニトリル、９．９％の水、および０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）の線形勾配を使用した。ペプチドの正しい同一性を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ／Ｋｒａｔｏｓ機器（ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ、島津製作所、京都）で行ったＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより確認した。ＴＡＴ、予測質量：２０３９．１６、観察された質量：２０４０．６６。ＤＥＡＣ−Ｋ９、予測質量：１４１２．９７、観察された質量：１４１５．５９。
アセトアミド化Ｃ（Ｓ−ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２）Ｋ（ε−ＮＨ−ＴＭＲ）ＴＡＴの合成

Ｃ（Ｓ−ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２）Ｋ（ε−ＮＨ−ＴＭＲ）ＴＡＴは、ＣＫ（ε−ＮＨ−ＴＭＲ）ＴＡＴ（１４８μｇ、０．０７４μｍｏｌ）を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５に加えたものに、ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）（０．２７５ｍｇ、１．４９μｍｏｌ）を添加した後に形成された。反応を、Ｎ_２の雰囲気下で行い、分析逆相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによってモニターした。生成物を、分析逆相ＨＰＬＣを使用して精製した。予測質量：２０９６．１８、観察された質量：２０９６．３１。
ＣＫ（ＴＭＲ）ＴＡＴ（ＴＡＴ）のダイマー化によるｄＴＡＴの発生

ｄＴＡＴは、（０．３ｍｇ、１．５×１０^−４ｍｍｏｌ）ＴＡＴを、通気したリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（５ｍＬ）に溶解することによって形成した。緩衝液に溶解した酸素は、ペプチド上のチオール基を酸化するように働き、ジスルフィド結合を形成する。反応は、一晩反応させ、分析逆相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによってモニターした。生成物を、分析逆相ＨＰＬＣを使用して精製した。予測質量：４０７６．３０、観察された質量：４０８４．２１。
ＴＡＴ−Ｃｒｅ、ＴＡＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｏｘＢ４、およびＴＡＴ−ＨｏｘＢ４のクローニング、過発現、および精製

ＨｉｓタグＴＡＴ−ＮＬＳ−Ｃｒｅ（ＴＡＴ−Ｃｒｅ）タンパク質をコードするｐＴｒｉＥｘ−ＨＴＮＣプラスミドを、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。次いでＴＡＴ−Ｃｒｅ遺伝子をｐＴＸＢ１ベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に導入して形質転換した。タンパク質は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Peitz, M.ら、「Ability of the hydrophobic FGF and basic TAT peptides to promote cellular uptake of recombinant Cre recombinase: A tool for efficient genetic engineering of mammalian genomes」、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America ９９巻：４４８９〜４４９４頁（２００２年）に記述されるように、発現し精製した。簡単に述べると、ＴＡＴ−Ｃｒｅを、３７℃で３時間、１ｍＭ ＩＰＴＧにより発現させた。次いでＴＡＴ−Ｃｒｅを、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）およびカチオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して、均質化するように精製した。ｐＴＸＢ１−ＴＡＴ−ｍＣｈｅｒｒｙは、ＴＡＴ ＤＮＡ配列をｐＴＸＢ１−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドに挿入することによって得た。ＮｄｅＩ部位を含有する、ＴＡＴ配列をコードする配列５’−ＴＡＴ ＧＧＧ ＴＣＧ ＴＡＡ ＡＡＡ ＡＣＧ ＴＣＧ ＴＣＡ ＧＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＧＧ ＴＣＡ−３’（配列番号２）および３’−ＡＣＣ ＣＡＧ ＣＡＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＴＣＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＴＡＴ−５’（配列番号３）（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を持つオリゴヌクレオチドをアニールして、ｄｓＤＮＡを発生させた。ｐＴＸＢ１−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを、ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で切断し、ＴＡＴ ｄｓＤＮＡにライゲーションした。ｐＴＸＢ１−ＴＡＴ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入して形質転換し、タンパク質発現を、１ｍＭ ＩＰＴＧにより、１６℃で２４時間誘導した。細胞を収集し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）および２００ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶解緩衝液に再懸濁した。超音波処理および１５Ｋ ＲＰＭで１時間の高速遠心分離による細胞溶解の後、可溶性画分を、キチン樹脂（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）にアプライし、溶解緩衝液で予備平衡させ、４℃で一晩インキュベートした（タンパク質は、Ｃ末端インテイン−キチン結合ドメイン精製タグを含有する）。樹脂を、１０カラム体積の溶解緩衝液で洗浄した。タンパク質は、１００ｍＭ ２−メルカプトエタンスルホン酸が補われた１カラム体積の切断緩衝液と共に、ビーズを４℃で２４時間インキュベートすることによって、樹脂から切断された。タンパク質を、カチオン交換クロマトグラフィーを使用してさらに精製した。ｐＴＡＴ−ＨＡ−ＨｏｘＢ４ベクターは、Ｇ．Ｓａｕｖａｇｅａｕ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａから豊富に提供された。Ｈｉｓ_（６）−ＨｏｘＢ４は、ＨｏｘＢ４遺伝子をｐＥＴ−２８ａにクローニングすることによって生成された。簡単に述べると、ＨｏｘＢ４ ｃＤＮＡは、５’および３’末端にそれぞれＮｄｅＩ ＆ ＸｈｏＩ部位を導入するように設計されたプライマーを使用することによって、最初にｐＴＡＴ−ＨＡ−ＨＯＸＢ４から増幅させた（５’−ＧＧＣ ＡＴＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＧＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＴＣ ＡＡＣ ＴＣＡ−３’（配列番号４）；５’−ＧＧＴ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＧＡ ＧＣＴ ＡＧＡ ＧＣＧ ＣＧＣ ＧＧＧ Ｇ−３’）（配列番号５）（ＩＤＴ）。次いでＰＣＲ断片を、６ｘＨｉｓタグベクターｐＥＴ−２８ａの対応するＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入した。読み枠の忠実度を、配列決定によって確認した。ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４およびＨｏｘＢ４の両方の精製に関する手順は類似しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれるKrosl, Jら、「In vitro expansion of hematopoietic stem cells by recombinant TAT-HOXB4 protein」、Nat Med ９巻：１４２８〜１４３２頁（２００３年）に既に記述されている。簡単に述べると、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をｐＴＡＴ−ＨＡＨｏｘＢ４またはｐＥＴ２８ａ−ＨｏｘＢ４のいずれかで形質転換し、３７℃で５時間、１ｍＭ ＩＰＴＧにより誘導した。ペレット化細胞を、緩衝液Ａ（８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中での超音波処理によって溶解させた。次いで高速遠心分離（１４Ｋ ＲＰＭ、２２℃で３０分）を介して得られた溶解産物を、１０ｍＭイミダゾールに調整し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズと共に室温で６０分間インキュベートした。次いでニッケルビーズを、２０ｍＭおよび４０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａで洗浄して、非特異的生成物の存在を全て排除し、結合されたタンパク質を引き続き、緩衝液Ａ中、１００ｍＭおよび２５０ｍＭのイミダゾールで溶離した。目的のタンパク質（即ち、ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４またはＨｏｘＢ４）を含有するイミダゾールの両方の濃縮物からの溶離物を、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラムに、４℃で、緩衝液Ｂ（４Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）中に投入し、単一ステップによりＦＰＬＣ上、４℃で、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて溶離した。両方のタンパク質を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で希釈することにより即座に脱塩し、１０Ｋ ＭＷＣＯを持つ遠心分離フィルターユニット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して濃縮し、一定分量を採取し、−８０℃でフラッシュ凍結した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して決定した。
生細胞内のペプチドの送達

種々の細胞系（ＨｅＬａ、ＨａＣａｔ、ＮＩＨ ３Ｔ３）からの生細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｆｉｓｈｅｒ）が補われたＤｕｌｂｅｃｃｏ最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｆｉｓｈｅｒ）で成長させ、５％ＣＯ_２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で保持した。次いで細胞を、８ウェルディッシュに播き、細胞が４８時間後に８０％〜９０％密集するようにした。各ウェルを、ＰＢＳと、アミノ酸システインを含有しないＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地（還元しないＬ−１５、ｎｒＬ−１５）とで３回洗浄した。インキュベーションに使用される培地（ｎｒＬ−１５）は、ｄＴＡＴのジスルフィド結合の還元を回避するために、システインを欠いている。次いで細胞を、異なる濃度のａｃＴＡＴ、ＴＡＴ、またはｄＴＡＴと共に、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳおよびｎｒＬ−１５で３回洗浄し、３７℃で維持される加熱ステージを供えた倒立型落射蛍光顕微鏡（Ｍｏｄｅｌ ＩＸ８１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）に配置した。画像を、Ｒｏｌｅｒａ−ＭＧＩ Ｐｌｕｓ背面照射ＥＭＣＣＤカメラ（Ｑｉｍａｇｉｎｇ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＢＣ、カナダ）を使用して収集した。画像は、明視野イメージングおよび３つの標準蛍光フィルターセット：ＣＦＰ（Ｅｘ＝４３６±１０ｎｍ／Ｅｍ＝４８０±２０ｎｍ）、ＲＦＰ（Ｅｘ＝５６０±２０ｎｍ／Ｅｍ＝６３０±３５ｎｍ）、およびＦＩＴＣ（Ｅｘ＝４８８±１０ｎｍ／Ｅｍ＝５２０±２０ｎｍ）を使用して、獲得した。種々の細胞の蛍光強度を、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ ４．２ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）で測定し、平均蛍光強度を各条件ごとに決定した。ＴＭＲなどのフルオロフォアで標識されたＣＰＰが、膜を感光性にしかつ光照射によってエンドソーム漏出を引き起こすことができることは、既に報告されている。参照によりその全体がそれぞれ本明細書組み込まれるSrinivasan, D.ら、「Conjugation to the cell-penetrating peptide TAT potentiates the photodynamic effect of carboxytetramethylrhodamine」、PloS one 6:e17732（２０１１年）、およびMuthukrishnan, N.ら、「Synergy Between Cell-Penetrating Peptides and Singlet Oxygen Generators Leads to Efficient Photolysis of Membranes」、Photochemistry and Photobiology ８９巻：６２５〜６３０頁（２０１２年）を参照されたい。エンドソーム内に捕えられたｄＴＡＴの露光（例えば、２μＭでのインキュベーション後）も、エンドソーム漏出を引き起こすことができる（図示せず）。しかし、いくつかの証拠は、光が、本明細書で報告されたｄＴＡＴの活性において著しい役割を演じないことを示す。まず、全ての送達実験は、最小限の光照射の条件下で行った（ぼんやりとした赤色光の暗室）。蛍光イメージングが必要とされる場合、プローブ（例えば、ＳＮＡＰ ｓｕｒｆａｃｅ ４８８、ＥＧＦＰ）を、ｄＴＡＴの前にイメージングし、それによって、エンドソーム放出に対する光の可能性ある作用を最小限に抑える。ＣｒｅおよびＨｏｘｂ４を用いて行われた実験では、細胞をイメージングせず、光に曝さない（Ｈｏｘｂ４では全く行わず、Ｃｒｅの場合はインキュベーションの１２時間後）。さらに、光誘導性エンドソーム漏出を観察するのに必要とされる光の線量は、典型的にはイメージングに使用される場合の１０から２０倍多い。
ｄＴＡＴとの同時インキュベーションによる、生細胞内での小分子、ペプチド、およびタンパク質の送達

先のセクションで記述したように、ＨｅＬａ細胞を８ウェルディッシュに播き、成長させ洗浄した。次いで細胞を、５μＭ送達ペプチドと共にかつカーゴと共に、対応する濃度で１時間、３７℃で同時インキュベートした。細胞を、ＰＢＳおよびｎｒＬ−１５で３回洗浄し、顕微鏡に配置した。画像を、先に記述したように獲得した。ＳＮＡＰ−Ｈ２ＢおよびＴａｇＣＦＰ−ｍｉｔｏのトランスフェクションおよび発現では、プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬とｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地中で混合し、室温で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ複合体を、８ウェルディッシュ上に予め播かれたＨｅＬａ細胞（８０％集密）に添加し、細胞を３７℃で２４時間保持した。２４時間後、ウェルをＰＢＳおよびｎｒＬ−１５で３回洗浄し、その後、ＳＮＡＰ−Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）４８８またはＦＩＴＣ−抗ＡＴＰ５Ａを使用して送達実験を行った。
細胞内でのペプチド取込みの定量的決定

上述のように、ＨｅＬａ細胞を４８ウェルディッシュに播き、成長させ洗浄した。ペプチド取込み実験では、各ウェルを様々な濃度のａｃＴＡＴ、ＴＡＴ、またはｄＴＡＴ（範囲：５〜２５μＭペプチド濃度）と共に１時間インキュベートした。滴定実験では、細胞をｄＴＡＴ（５μＭ）および様々な濃度のＤＥＡＣ−Ｋ９（範囲：１〜２０μＭ）と共にインキュベートした。次いで細胞をＰＢＳおよびｎｒＬ−１５で洗浄し、イメージングした。各条件ごとに多数の画像を得、加工した。細胞を溶解するために、ｎｒＬ−１５をウェルから除去し、合計で１００μＬのＨｅＬａ細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を、細胞と共に５分間インキュベートした。細胞を溶解し、ディッシュから擦り取り、１．５ｍＬの微小遠心管にピペット分取した。細胞溶解産物を、１３．２Ｋ ＲＰＭで２５分間遠心分離した。取込み実験では、各条件から上澄み７０μｌを収集し、９６ウェルプレートに置いた。細胞溶解産物からの蛍光は、蛍光モジュールを備えたプレートリーダーを使用して測定した（Ｅｘ＝５２５、Ｅｍ＝５８０〜６４０ｎｍ）（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ、ＷＩ）。滴定実験では、上澄み８０μＬを希釈して合計体積１００μＬにし、バルク蛍光を、ＳＬＭ−８０００Ｃ蛍光光度計（Ｅｘ＝４３５ｎｍ、Ｅｍ＝４６５〜４７５ｎｍ）（ＳＬＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂａｔｈ、ＵＫ）を使用して測定した。蛍光放出を平均し、記録した。データは、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して、各ウェルでの総タンパク質濃度に対して正規化した。９６ウェルプレートを使用して、各細胞溶解産物１０μＬを、１×タンパク質アッセイ試薬２００μＬに添加し、室温で３０分間インキュベートした。６００ｎｍでの吸光度を、プレートリーダーを使用して測定した。測定を３回繰り返した。
ルシフェラーゼレポーターを使用した、ＴＡＴおよびｄＴＡＴによるＴＡＴ−ＨｏｘＢ４ ＆ ＨｏｘＢ４送達の定量分析

以下の研究で使用されるネズミ線維芽細胞系（ＮＩＨ−３Ｔ３、Ｅ２Ａ−ＰＢＸベクターを安定にトランスフェクトした）、ルシフェラーゼレポーターベクター、ｐＭＬ（５ｘＨＯＸ／ＰＢＸ；ＨＯＸＢ４およびＰＢＸに対する結合部位を持つプロモーターを含有する）、およびβ−ｇａｌ内部対照ベクターは、Ｐ．Ｚａｎｄｓｔｒａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）により善意で提供された。細胞を、最初に、１０％ＦＢＳが補われたＤＭＥＭ中、５％ＣＯ_２と共に３７℃で、１００ｍｍディッシュで培養した。しかし実験の目的で、細胞を、２４時間にわたり、５〜６×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播いた。その後、細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、０．８μｇ／ｍＬのｐＭＬ（５ｘＨＯＸ／ＰＢＸ）およびβ−ｇａｌ内部対照ベクターを同時トランスフェクトした。トランスフェクション後１２時間で、細胞を洗浄し、ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４またはＨｏｘＢ４（共に、他に注記しない限り２００ｎＭ；以下参照）と共に、ｎｒＬ−１５中ＴＡＴまたはｄＴＡＴを用いてまたは用いずに、９０分間インキュベートした。また一部の細胞は、ＴＡＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ（２００ｎＭ）と共に、ペプチドを用いてまたは用いずにインキュベートした。インキュベーション後、レポーター溶解緩衝液（ＲＬＢ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）に関する製造業者のプロトコールに従って、全ての細胞をＰＢＳで洗浄し溶解させた。滴定実験では、ＨｏｘＢ４濃度を変えたこと以外（２５、５０、１００、１５０、および２００ｎＭ）、同じプロトコールに従った。ルシフェラーゼレポーター活性を定量するために、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μＬを細胞溶解産物２０μＬに添加し、生物発光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＬ照度計（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して直ぐに測定した。トランスフェクション効率を測定する目的で、β−ｇａｌアッセイ緩衝液１８０μＬを、９６ウェルプレートで細胞溶解産物２０μＬと混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。β−ｇａｌアッセイ緩衝液は、７５％の０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、２４％のｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（０．１Ｍリン酸ナトリウム中４ｍｇ／ｍＬの濃度で作製されたＯＮＰＧ）（Ｓｉｇｍａ）、および１％の１００倍溶液（１０％の１Ｍ塩化マグネシウム溶液、３２％のβ−メルカプトエタノール、および５８％の蒸留水）から構成される。次いで吸光度を、プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。この研究で使用するペプチドにコンジュゲートされた発色団（ＴＭＲ）の吸収スペクトルは、β−ｇａｌの場合と重なるので、ペプチドを含有する細胞溶解産物２０μＬも溶解緩衝液１８０μＬで希釈し、４５０ｎｍで得られた吸光度値を、β−ｇａｌ吸光度値の場合から差し引いた。全ての試料のルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼ活性とβ−ｇａｌ活性との比として決定し、ルシフェラーゼ活性の倍数増加は、各試料のルシフェラーゼ活性を、トランスフェクトされたがタンパク質は送達されていない細胞の場合に対して正規化することによって確立した。
細胞生存率アッセイ

損なわれた原形質膜を有する細胞を決定するために、細胞をＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（場合によっては、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｂｌｕｅ）およびＨｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で処置した。ＳＹＴＯＸ（登録商標）色素は細胞不浸透性であり、損なわれた原形質膜を持つ細胞のＤＮＡを染色する。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素は細胞浸透性であり、全ての細胞のＤＮＡを染色する。画像を、緑色および青色フィルターを使用して獲得した。緑色および青色画像を使用して、青色または緑色に染色された核を持つ細胞をカウントした。画像Ｊを使用して、死（緑色）および合計の細胞（青色）をカウントした。細胞毒性を、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ陽性細胞／細胞の合計数の比から決定した。ＭＴＴ−アッセイを行って、細胞増殖に対するペプチドの影響を決定した。上述のように、細胞を６ウェルディッシュに播き、成長させ洗浄した。ディッシュからの１つのウェルを、５μＭ ｄＴＡＴと共に３７℃で１時間インキュベートした。第２のウェルは未処置のままにし、対照として働かせた。細胞を、ＰＢＳおよびｎｒＬ−１５で３回洗浄した。細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ ２００μＬを含有する９６ウェル皿に播いた。次いで細胞を、１２時間にわたりディッシュの底部に接着させた。次いでＭＴＴアッセイを、特定の時点で行って、細胞増殖を測定した。ＤＭＥＭを除去し、ｎｒＬ−１５ １００μＬで置き換え、１２ｍＭ ＭＴＴ原液１０μＬをウェルに添加した。９６ウェルディッシュを３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、１０ｍＭ ＳＤＳ−ＨＣｌ溶液１００μＬを、各ウェルに添加した。溶液を、ピペットを上下動させることによって完全に混合し、１３時間インキュベートした。インキュベーション後、各試料を混合し、６００ｎｍでの吸光度を測定した。対照は、１０μＬ ＭＴＴが、ｎｒＬ−１５のみ１００μＬ（細胞なし）に添加されている、陰性対照を含んでいた。送達ペプチドで処置されたがＭＴＴが添加されていない細胞からなる第２の対照を添加して、測定された吸光度からＴＭＲの寄与率を差し引いた。陰性対照の吸光度を、全ての試料から差し引いた。
ｄＴＡＴおよびカーゴの相互作用の決定

蛍光放出スペクトルを、フェニックスパッケージ（ＩＳＳ、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、ＩＬ）およびＶｉｎｃｉ ｖ．１．６ ＰＣソフトウェア（ＩＳＳ）でアップグレードされたＳＬＭ−８０００Ｃ蛍光光度計を使用して得た。実験は、石英キュベットを使用して室温で実施した。試料を４８８ｎｍ（スリット幅＝１ｍｍ）で励起し、蛍光放出を５００から６５０ｎｍまで走査した（スリット幅＝１ｍｍ）。全ての試料（ＥＧＦＰ（１μＭ）およびｄＴＡＴ（５μＭ））を、ｎｒＬ−１５を使用して調製した。

例示的実施形態について図示し記述してきたが、本開示の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解されよう。
排他的性質または特権が主張されている本発明の実施形態は、下記の通り定義される。

Claims (54)

1. 式：
   （式中、
   Ｘは、連結部分であり、
   Ｙは、疎水性部分に共有結合したアミノ酸残基であり、
   Ｚは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分であり、該ＣＰＰ部分は、正味の正電荷を有し、かつ５０％またはそれ超の残基がグアニジニウム基を有しているアミノ酸配列を有し、
   ｍおよびｎは、独立して０または１である）
   を有する化合物。
2. 前記ＣＰＰ部分が、３から３０の間のアミノ酸を含む、請求項１に記載の化合物。
3. 前記ＣＰＰ部分が、配列番号１に示される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の化合物。
4. 前記ＣＰＰ部分が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の化合物。
5. ｍおよびｎの少なくとも１つが１である、請求項１に記載の化合物。
6. 前記疎水性部分が、Ｃ_６〜Ｃ_３０直鎖、分岐状、または環式基を含む、請求項５に記載の化合物。
7. 前記基が、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を含む、請求項６に記載の化合物。
8. 前記環式基が、単環、二環、または三環式である、請求項６に記載の化合物。
9. 前記疎水性部分がローダミン基を含む、請求項６に記載の化合物。
10. 前記ローダミン基がテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）である、請求項９に記載の化合物。
11. 前記アミノ酸残基がリシン（Ｋ）である、請求項５に記載の化合物。
12. ｍおよびｎが０であり、Ｚ^１および／またはＺ^２が、疎水性部分に連結されたアミノ酸残基を含むＣＰＰである、請求項１に記載の化合物。
13. 前記アミノ酸残基が、ＣＰＰアミノ酸配列中の最もＮ末端側にあるリシン（Ｋ）残基である、請求項１２に記載の化合物。
14. Ｘがシステイン（Ｃ）残基である、請求項１に記載の化合物。
15. Ｘ^１およびＸ^２が、ジスルフィド結合により連結されたシステイン（Ｃ）残基である、請求項１４に記載の化合物。
16. Ｘ、Ｙ、および／またはＺが、アミド結合により連結される、請求項１に記載の化合物。
17. Ｚ^１のＣＰＰおよびＺ^２のＣＰＰが、互いに少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の化合物。
18. Ｘ−Ｙ−Ｚの組合せが、３０個以下のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の化合物。
19. エンドソーム溶解を容易にすることが可能である、請求項１に記載の化合物。
20. 式：
    Ｘ−Ｙ−Ｚ
    （式中、
    Ｘは、システイン（Ｃ）であり、
    Ｙは、疎水性部分に共有結合したアミノ酸残基であり、
    Ｚは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分であり、前記ＣＰＰ部分は、正味の正電荷を有し、かつ５０％またはそれ超の残基がグアニジニウム基を有しているアミノ酸配列を有し、
    ＸおよびＹと、ＹおよびＺとは、アミド結合によって連結されている）
    を有する組成物。
21. 前記ＣＰＰ部分が、配列番号１に示される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の組成物。
22. 前記ＣＰＰ部分が、配列番号１に示される配列を持つアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の化合物。
23. Ｙがリシン（Ｋ）である、請求項２０に記載の化合物。
24. 前記疎水性部分がローダミン基を含む、請求項２０に記載の化合物。
25. 前記ローダミン基がテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）である、請求項２４に記載の化合物。
26. Ｎ末端システイン（Ｃ）残基間でのジスルフィド結合の形成によって、ホモダイマーを形成することが可能である、請求項２０に記載の化合物。
27. 細胞内のエンドソーム浸透性を高める方法であって、細胞を請求項１または請求項２０に記載の化合物と接触させることを含む方法。
28. 前記細胞を、前記化合物のエンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させる、請求項２７に記載の方法。
29. 前記細胞を少なくとも１μＭの濃度の前記化合物と接触させる、請求項２７に記載の方法。
30. 前記細胞を少なくとも５μＭの濃度の前記化合物と接触させる、請求項２９に記載の方法。
31. 前記細胞が、アルブミンを欠いている培養物中にある、請求項２７に記載の方法。
32. 前記細胞を細胞不浸透性分子と接触させることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
33. 前記細胞が、生きている対象から得られ、ｅｘ ｖｉｖｏで前記化合物と接触させる、請求項２７に記載の方法。
34. 前記細胞が、生きている対象内にあり、ｉｎ ｖｉｖｏで接触させる、請求項２７に記載の方法。
35. 前記細胞の前記エンドソーム浸透性を高めるのに有効な量の前記化合物を前記対象に投与することによって、前記細胞をｉｎ ｖｉｖｏで接触させる、請求項３４に記載の方法。
36. 前記対象が哺乳動物である、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
37. 細胞不浸透性分子を細胞のサイトゾルに送達する方法であって、細胞を請求項１または請求項２０に記載の化合物および細胞不浸透性分子と、エンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させることを含む方法。
38. 前記細胞を少なくとも１μＭの濃度の化合物と接触させる、請求項３７に記載の方法。
39. 前記細胞不浸透性分子が、ペプチド、ポリペプチドおよび核酸を含むポリマー、または小分子医薬品である、請求項３７に記載の方法。
40. 前記ポリペプチドが転写因子である、請求項３９に記載の方法。
41. 前記細胞不浸透性分子が、前記化合物に共有結合的に連結していない、請求項３７に記載の方法。
42. 前記細胞不浸透性分子が正味の正電荷を有する、請求項３７に記載の方法。
43. 前記細胞が、生きている対象から得られ、ｅｘ ｖｉｖｏで前記化合物および細胞不浸透性分子と接触させられる、請求項３７に記載の方法。
44. 前記細胞が、生きている対象内にあり、ｉｎ ｖｉｖｏで前記化合物および細胞不浸透性分子と接触させられる、請求項３７に記載の方法。
45. 細胞不浸透性分子を前記細胞の前記サイトゾルに送達するのに有効な量の前記化合物を前記対象に投与することによって、前記細胞をｉｎ ｖｉｖｏで接触させる、請求項４４に記載の方法。
46. 前記対象が哺乳動物である、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
47. ｅｘ ｖｉｖｏで細胞における多能性を誘導する方法であって、対象から得られた細胞を請求項１または請求項２０に記載の化合物および転写因子と、エンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させることと、前記細胞を培養して前記細胞の多能性を得ることとを含む方法。
48. 前記細胞が、前記対象中の体細胞組織から得られる、請求項４７に記載の方法。
49. 前記対象が哺乳動物である、請求項４７に記載の方法。
50. 前記転写因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃの１つである、請求項４７に記載の方法。
51. 多能性細胞またはその子孫細胞を、前記対象に引き続き投与することをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
52. 幹細胞をｅｘ ｖｉｖｏで拡張する方法であって、幹細胞を請求項１または請求項２０に記載の化合物および転写因子と、エンドサイトーシスを可能にするのに十分な条件下で接触させることと、前記細胞を培養して前記細胞の拡張を得ることとを含む方法。
53. 前記幹細胞が造血幹細胞である、請求項５２に記載の方法。
54. 前記転写因子が、ＨｏｘＢ４、ＨｏｘＡ４／１０、Ｇａｔａ２、Ｇｆ１、ＡＭＬ１、ＪｕｎＢ、ＮＦ−Ｙ、Ｂｍｉ１Ｅｚｈ２、Ｄｍｎｔ３ａ、Ｃｂｘ７、ｐ１８、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ＰＴＥＮ、Ｍｙｃ、Ｆｂｘｗ７などからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。