JP2016530242A - アザインドール化合物、その合成、および同化合物の使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
R1は、水素、フッ素、臭素、-OCH3およびメチルより選択され;
R2は、水素またはメチルであり;
R3は、水素またはメチルであり;
Xは、NまたはCR4であり;
R4は、水素、フッ素および-OCH3より選択され;
R5は、水素、フッ素、-CF3および-CNより選択され;
Yは、NまたはCR6であり;
R6は、水素またはメチルであり;
Zは、NまたはCR7であり;
R7は、水素、フッ素、-OCH3、-OCHF2、-OCH2CF3および-N(CH3)2より選択され;
R8は、水素、フッ素、メチルおよび-OCH3より選択され;
nは、1または2であり;
R9は、フッ素、シクロプロピル、-OCH3、-OH、-OCF3、-CHF2、-CH(F)CH3および-CH(OH)CH3より選択される]
で示される化合物、またはその医薬的に許容される塩を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、式(I)で示される化合物を提供する。
R1は、水素、フッ素、臭素、-OCH3およびメチルより選択され;
R2は、水素またはメチルであり;
R3は、水素またはメチルであり;
Xは、NまたはCR4であり;
R4は、水素、フッ素および-OCH3より選択され;
R5は、水素、フッ素、-CF3および-CNより選択され;
Yは、NまたはCR6であり;
R6は、水素またはメチルであり;
Zは、NまたはCR7であり;
R7は、水素、フッ素、-OCH3、-OCHF2、-OCH2CF3および-N(CH3)2より選択され;
R8は、水素、フッ素、メチルおよび-OCH3より選択され;
nは、1または2であり;
R9は、フッ素、シクロプロピル、-OCH3、-OH、-OCF3、-CHF2、-CH(F)CH3および-CH(OH)CH3より選択される]
で示される化合物、またはその医薬的に許容される塩を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、式(I)で示される化合物またはその医薬的に許容される塩、および医薬的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、結核またはマイコバクテリウム感染症の処置に用いるための、式(I)で示される化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。
本明細書に記載の化合物は、単一の治療として適用されても、あるいは1以上の他の物質および/または処置を含んでもよい。該共処置(co-treatment)は、処置の個々の要素の、同時、連続または別投与によって達成し得る。投与が連続または別々である場合、2番目の要素を投与する遅れは組み合わせの有益な効果を失うようになってはならない。適切な分類および物質は、マイコバクテリウム感染症および/または結核の処置に有用である1以上の抗細菌剤を含み、例えば、リファンピシン、イソニアジド、ピリジナミド(pyrizinamide)、エタンブトール、キノロン(例えば、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシンおよびガチフロキサシン)、アミノグリコシド(例えば、ストレプトマイシン、カナマイシンおよびアミカシン)、ポリペプチド(例えば、カプレオマイシン、バイオマイシンおよびエンビオマイシン)、リファブチン、クラリスロマイシン、リネゾリド、チオアセタゾン、チオリダジン、アルギニン、ビタミンDおよびR207910が挙げられる。
クロマトグラフィーおよび出発物質のすべての無水の溶媒、試薬グレードの溶媒は、シグマ・アルドリッチ・ケミカル社およびフィッシャー・サイエンティフィック社から購入した。水を蒸留し、Milli-Q水システム(ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ州)により精製した。化合物の精製の一般的な方法としては、グレース精製システム(Grace Purification systems)社より購入したシリカカートリッジの使用が挙げられる。反応を、プレコートしたMerck 60 F254シリカゲルプレート上でTLCにより追跡し、UVライト(254 nm)を用いて可視化した。すべての化合物を、純度についてはHPLCにより分析し、ブルカー製の300 MHz NMRおよび/またはブルカー製の400 MHz NMR分光計を用いて1H NMRにより同定した。化学シフトを、対応するスペクトル;クロロホルム δ 7.26、メタノール δ 3.31、DMSO-d6 δ 3.33における残留溶媒ピークと比較してppm(δ)で説明し、そして結合定数(J)を、ヘルツ(Hz)(ここで、s = 一重線、bs = ブロード一重線、d = 二重線、dd = 二重線の二重線、bd = ブロード二重線、ddd = 二重線の二重線の二重線、t = 三重線、tt = 三重線の三重線、q = 四重線、m = 多重線である)で説明し、そしてACD NMRデータ処理ソフトウェアを用いて解析した。マススペクトルの値を、m/zとして説明する。他に断らない限りすべての反応を窒素下で実施した。溶媒をロータリーエバポレーターで真空下除去した。
図16(a)を参照。1-(1-(2,6-ジフルオロフェニル)エチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (0.090 g、0.30 mmol)、2-フルオロエタンアミン (0.019 g、0.30 mmol) およびトリエチルアミン (0.166 mL、1.19 mmol) を、DCM (15 mL) にN2下入れ、撹拌した。5分後、1-プロパンホスホン酸環状無水物 (0.379 g、1.19 mmol) を加えた。得られた反応物を室温で40分間撹拌した。LCMS分析は必要とする生成物の形成を示した。反応物をDCMおよび水で希釈した。DCM層を抽出し、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。精製をウォーターズ製のRPシステムで行い、生成物1-(1-(2,6-ジフルオロフェニル)エチル)-N-(2-フルオロエチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (0.040 g、38.7%) を固体として得た。ES+MS m/z:348.40. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.05 (d, J=6.97 Hz, 3 H) 3.67 (q, J=5.21 Hz, 1 H) 3.71 - 3.82 (m, 1 H) 4.49 (t, J=4.90 Hz, 1 H) 4.65 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 6.22 (q, J=7.16 Hz, 1 H) 7.13 (t, J=8.57 Hz, 2 H) 7.29 (dd, J=8.48, 4.71 Hz, 1 H) 7.34 - 7.52 (m, 1 H) 7.80 (d, J=8.29 Hz, 1 H) 8.41 (s, 1 H) 8.50 (d, J=4.71 Hz, 1 H) 8.92 (t, J=5.75 Hz, 1 H).
図16(b)を参照。1-(5-フルオロ-2-メトキシベンジル)-7-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (0.22 g、0.000699モル) のジクロロメタン (10 mL) 中の撹拌溶液に、2-フルオロエタン-1-アミン (0.06 g、0.000836モル)、トリエチルアミン (0.29 ml、0.002モル) およびT3P (1.32 ml、0.002モル) を加え、混合物を16時間室温で撹拌した。反応混合物を水へ注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層を水、食塩水で洗浄し、溶媒を減圧下エバポレートした。粗製物を、ヘキサン中の50%酢酸エチルを用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、N-(シクロプロピルメチル)-1-(5-フルオロ-2-メトキシベンジル)-7-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミドをオフホワイト固体として得た。収率24%. ES+MS m/z:368. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm:0.22-0.24 (m, 2H), 0.48-0.50 (m, 2H), 1.05-1.09 (m, 1H), 2.44 (s, 3H), 3.28 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 3.86 (s, 3H), 5.63 (s, 2H), 5.97-6.00 (m, 1H), 7.03-7.04 (m, 1H), 7.12-7.14 (m, 2H), 8.22 (s, 1H), 8.37 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 9.01 (t, 1H, J = 5.6 Hz).
図16(c)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (250 mg、0.84 mmol) を、窒素源に接続されている空気冷却器を備える100 mlの1口フラスコに入れた。DCM (10 mL) を加え、懸濁液を得た。トリエチルアミン (1.162 mL、8.38 mmol) を加え、透明な溶液を得た。1-プロパンホスホン酸環状無水物 (1.497 mL、2.51 mmol) を加え、続いて2-フルオロエタンアミン ヒドロクロリド (83 mg、0.84 mmol) を加えた。反応塊を室温で一晩撹拌し、懸濁液が見られた。反応の完結後、DCMで希釈し、水を加え、DCM層を分離し、食塩水溶液で洗浄した。DCM層を硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートし、化合物をカラムクロマトグラフィーにより精製した。収率52%. ES+MS m/z:344(M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.25 (s, 20 H) 3.67 (d, J=5.46 Hz, 7 H) 3.77 (d, J=5.46 Hz, 7 H) 4.50 (t, J=4.90 Hz, 7 H) 4.66 (t, J=4.99 Hz, 7 H) 5.69 (s, 13 H) 7.26 (dd, J=8.29, 4.71 Hz, 7 H) 7.94 (d, J=8.48 Hz, 7 H) 8.28 (s, 7 H) 8.41 (s, 6 H) 8.49 (d, J=4.52 Hz, 7 H) 8.95 (t, J=5.84 Hz, 7 H).
図16(b)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (200 mg、0.67 mmol) を、DCM (10 mL) に入れた。1-プロパンホスホン酸環状無水物 (427 mg、1.34 mmol) を加え、続いてトリエチルアミン (339 mg、3.35 mmol) およびシクロプロピルメタンアミン (95 mg、1.34 mmol) を加えた。反応塊を室温で一晩撹拌した。反応の完結後、水を加え、DCMで抽出した。有機層を水および食塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層をエバポレートして、残渣を得て、これをカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋な化合物を得た。収率74%. ES+MS m/z:352.38(M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.02 (q, J=4.58 Hz, 2 H) 0.18 - 0.31 (m, 2 H) 0.83 (t, J=6.88 Hz, 1 H) 2.00 (s, 3 H) 2.98 - 3.11 (m, 3 H) 3.69 (s, 3 H) 5.43 (s, 2 H) 7.00 (dd, J=8.29, 4.71 Hz, 1 H) 7.68 (dd, J=8.29, 1.13 Hz, 1 H) 7.98 (s, 1 H) 8.17 (s, 1 H) 8.24 (dd, J=4.71, 1.13 Hz, 1 H) 8.55 (t, J=5.75 Hz, 1 H).
図17(a)を参照。50 mLの丸底フラスコにおいてN-(2-フルオロエチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (0.1 g、0.48 mmol) を、DMF (10 mL) に入れ、無色の懸濁液を得た。反応混合物を0℃まで冷却し、炭酸カリウム (0.200 g、1.45 mmol) および2-(ブロモメチル)-3,4-ジフルオロ-1-メトキシベンゼン (0.114 g、0.48 mmol) を加え、その後反応物(RM)を80℃で4時間撹拌した。反応をLCMSにより追跡した。DMFを真空下濃縮し、水を加え、DCMで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、エバポレートして、粗生成物を得た。粗製物を逆相分取HPLCシステムで精製して、1-(2,3-ジフルオロ-6-メトキシベンジル)-N-(2-フルオロエチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (0.060 g、34.2%) を得た。ES+MS m/z: 364(M+1) 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHZ):δ ppm 8.90 (br. s., 1 H), 8.50 (d, J=4.3 Hz, 1 H), 8.02 - 8.15 (m, 2 H), 7.30 - 7.52 (m, 2 H), 6.92 (d, J=8.7 Hz, 1 H), 5.53 (s, 2 H), 4.63 (t, J=4.4 Hz, 1 H), 4.47 (t, J=4.8 Hz, 1 H), 3.86 (s, 3 H), 3.74 (d, J=5.3 Hz, 1 H), 3.65 (d, J=5.3 Hz, 1 H).
図17(b)を参照。1-((5-フルオロ-2-メトキシピリジン-3-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (100 mg、0.33 mmol) を、ジクロロメタン (15 mL) に入れ、懸濁液を得た。トリエチルアミン (230 mL、1.66 mmol) を加え、透明な溶液を得た。1-プロパンホスホン酸環状無水物 (198 mL、0.66 mmol) を加え、室温で5分間撹拌した。2-メトキシエタンアミン (74.8 mg、1.00 mmol) を加え、反応塊を室温で2時間撹拌した。反応の完結後、反応塊をDCMで希釈し、水、食塩水溶液で洗浄した。DCM層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートして、粗製化合物を得た。該化合物を、メタノールおよびジクロロメタンを溶離剤として用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。収率63%. ES+MS m/z:359.1(M+1). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.44 - 3.52 (m, 2 H) 3.56 (q, J=5.46 Hz, 2 H) 3.89 (s, 3 H) 5.47 (s, 2 H) 7.31 (dd, J=8.20, 4.73 Hz, 1 H) 7.46 (dd, J=8.20, 2.84 Hz, 1 H) 8.09 - 8.22 (m, 2 H) 8.31 (s, 1 H) 8.51 (dd, J=4.73, 0.95 Hz, 1 H) 8.85 (t, J=5.52 Hz, 1 H).
図17(c)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (200 mg、0.67 mmol) を、DCM (10 mL) に入れ、懸濁液を得た。トリエチルアミン (0.929 mL、6.70 mmol) を加え、透明な溶液を得た。1-プロパンホスホン酸環状無水物 (1.197 mL、2.01 mmol) を加え、室温で5分間撹拌した。2-メトキシエタンアミン (151 mg、2.01 mmol) を加え、室温で一晩撹拌した。反応の完結後、反応塊をDCMで希釈し、水、食塩水溶液で洗浄し、その後エバポレートして、粗製化合物を得た。該化合物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。収率90%. ES+MS m/z:356.2(M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.24 (s, 3 H) 3.30 (s, 3 H) 3.43 - 3.63 (m, 4 H) 3.93 (s, 3 H) 5.68 (s, 2 H) 7.24 (dd, J=8.29, 4.71 Hz, 1 H) 7.92 (dd, J=8.38, 1.22 Hz, 1 H) 8.25 (s, 1 H) 8.41 (s, 1 H) 8.48 (dd, J=4.71, 1.13 Hz, 1 H) 8.85 (t, J=5.65 Hz, 1 H).
図17(d)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (0.190 gm、0.61 mmol) および2-フルオロエタンアミン (0.077 g、1.22 mmol)、TEA (0.254 mL、1.83 mmol) を加えた。3分後、1-プロパンホスホン酸環状無水物 (0.484 g、1.52 mmol) を加えた。得られた反応混合物を室温で50分間撹拌した。LCMS分析は必要とする生成物の形成を確認した。反応物をDCMおよび水で希釈した。DCM層を抽出し、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。精製をウォーターズ製のRPシステムで行い、生成物N-(2-フルオロエチル)-1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (0.090 g、41.4%) を得た。ES+MS m/z:358.36. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.17 - 2.30 (3, 3 H) 2.40 (s, 3 H) 3.59 - 3.73 (m, 1 H) 3.73 - 3.83 (m, 1 H) 3.94 (s, 3 H) 4.50 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 4.66 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 5.64 (s, 2 H) 7.76 (s, 1 H) 8.15 (s, 1 H) 8.35 (s, 1 H) 8.42 (s, 1 H) 8.87 (t, J=5.84 Hz, 1 H).
図18(a)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (1 g、3.35 mmol) を、DCM (20 mL) に入れ、懸濁液を得た。トリエチルアミン (1.394 mL、10.06 mmol) を加え、続いて1-プロパンホスホン酸環状無水物 (3.991 mL、6.70 mmol) を加えた。反応塊を室温で5分間撹拌した。エタノールアミン (6.02 mL、10.06 mmol) を加え、室温で2時間撹拌した。反応の完結後、DCMで希釈し、その後水および食塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、乾燥し、エバポレートし、粗製化合物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。収率45%. ES+MS m/z:342(M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.24 (s, 3 H) 3.37 - 3.64 (m, 4 H) 3.94 (s, 3 H) 4.80 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 5.67 (s, 2 H) 7.24 (dd, J=8.29, 4.52 Hz, 1 H) 7.92 (d, J=8.10 Hz, 1 H) 8.23 (s, 1 H) 8.41 (s, 1 H) 8.47 (d, J=4.52 Hz, 1 H) 8.85 (t, J=5.37 Hz, 1 H).
図18(b)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (0.100 g、0.32 mmol) およびシクロプロピルメタンアミン (0.046 g、0.64 mmol)、TEA (0.134 mL、0.96 mmol) を加えた。3分後、1-プロパンホスホン酸環状無水物 (0.255 g、0.80 mmol) を加えた。得られた反応混合物を室温で50分間撹拌した。LCMS分析は必要とする生成物の形成を示した。反応物をDCMおよび水で希釈した。DCM層を抽出し、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。精製をウォーターズ製のRPシステムで行い、生成物N-(シクロプロピルメチル)-1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (0.045 g、38.5%) を得た。ES+MS m/z:366.44. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.21 - 0.33 (m, 2H) 0.41 - 0.56 (m, 2 H) 1.08 (m, J=6.97 Hz, 1 H) 2.24 (s, 3 H) 2.40 (s, 3 H) 3.26 (d., 2 H) 3.94 (s, 3 H) 5.63 (s, 2 H) 7.75 (s, 1 H) 8.11 (s, 1 H) 8.35 (s, 1 H) 8.42 (s, 1H) 8.74 (t, J=5.65 Hz, 1 H).
図18(c)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (0.100 g、0.32 mmol) および2-メトキシエタンアミン (0.048 g、0.64 mmol)、TEA (0.134 mL、0.96 mmol) を加えた。3分後、1-プロパンホスホン酸環状無水物 (0.255 g、0.80 mmol) を加えた。得られた反応混合物を室温で50分間撹拌した。LCMS分析は必要とする生成物の形成を示した。反応物をDCMおよび水で希釈した。DCM層を抽出し、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。精製をウォーターズ製のRPシステムで行い、生成物1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-N-(2-メトキシエチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (0.045 g、38.0%) を得た。ES+MS m/z:370.21. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.17 - 2.28 (s , 3H) 2.40 (s, 3 H) 3.30 (s, 13 H) 3.50 (d, J=4.52 Hz, 2 H) 3.55 (t, J=5.18 Hz, 2 H) 3.94 (s, 3 H) 5.63 (s, 2 H) 7.74 (s, 1 H) 8.12 (s, 1 H) 8.34 (s, 1 H) 8.42(s, 1 H) 8.78 (t, J=5.46 Hz, 1H).
図18(d)を参照。1-((3-メチル-4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)ピリジン-2-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (100 mg、0.27 mmol) を、DCM (10 mL) に入れ、透明な溶液を得た。トリエチルアミン (0.190 mL、1.37 mmol) を加え、続いて酢酸エチル中の1-プロパンホスホン酸環状無水物の溶液 (0.326 mL、0.55 mmol) を加え、反応塊を5分間撹拌した。2-フルオロエチルアミン ヒドロクロリド (54.5 mg、0.55 mmol) を加え、反応塊を3時間撹拌した。反応の完結後、DCMで希釈し、その後水および食塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、乾燥し、エバポレートし、粗製化合物を、メタノールおよびジクロロメタンを溶離剤として用いるシリカゲルクロマトグラフィーより精製した。収率49%. ES+MS m/z:411(M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.25 (s, 3 H) 3.67 (q, J=5.21 Hz, 1 H) 3.76 (q, J=5.21 Hz, 1 H) 4.50 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 4.66 (t, J=4.90 Hz, 1 H) 4.90 (q, J=8.85 Hz, 2 H) 5.68 (s, 2 H) 7.06 (d, J=5.84 Hz, 1 H) 7.24 (dd, J=8.38, 4.62 Hz, 1 H) 7.93 (d, J=7.35 Hz, 1 H) 8.17 (d, J=5.65 Hz, 1 H) 8.24 (s, 1 H) 8.48 (d, J=3.77 Hz, 1 H) 8.94 (t, J=5.75 Hz, 1 H).
図19(a)を参照。1-((2-メトキシ-5-(トリフルオロメチル)ピリジン-3-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (60 mg、0.177 mmol) のジクロロメタン (5 mL) 中の撹拌溶液に、2-フルオロエタン-1-アミン ヒドロクロリド (26 mg、0.26 mmol)、トリエチルアミン (0.053 g、0.531 mmol) およびT3P (0.33 g、0.531 mmol) を加え、反応混合物を16時間室温で撹拌した。その後反応混合物を水へ注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層を水、食塩水で洗浄し、溶媒を減圧下エバポレートした。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、N-(2-フルオロエチル)-1-((2-メトキシ-5-(トリフルオロメチル)ピリジン-3-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミドを白色固体として得た。収率:15 mg. (22.3%). ES+MS m/z:397. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ ppm 3.66-3.70 (m, 2H),3.72-3.76 (m, 2H), 4.00 (s, 3H), 4.50-4.52 (m, 2H), 4.62-4.64 (m, 2H), 5.76 (s, 2H), 7.30-7.33 (m, 1H), 7.92 (s, 1H), 8.11 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.32 (s, 1H), 8.50-8.52 (m, 1H), 8.66-8.67 (m, 1H), 8.94 (t, 1H, J = 5.6 Hz).
図19(b)を参照。1-((5-シアノ-2-メトキシ ピリジン-3-イル) メチル)-1H-ピロロ[3,2-b] ピリジン-3-カルボン酸 (0.10 gm、0.32 mmol) のDCM中の溶液に、TEA (0.98 g、0.135 ml、0.97 mmol)、2-フルオロエタン-1-アミン ヒドロクロリド (0.095 g、0.97 mmol) およびT3P (0.308 g、0.97 mmol) を加えた。反応混合物を室温で12時間撹拌した。水を反応混合物に加え、DCMで抽出した。合わせた有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、1-((5-ヤノ-2-メトキシピリジン-3-イル)メチル)-N-(2-フルオロエチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミドの生成物を固体として得た (17 mg、14.9%)。ES+MS m/z:354. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ 8.95 (t, J = 5.80 Hz, 1H), 8.66 (d, J = 2.04 Hz, 1H), 8.51 (d, J = 4.08 Hz, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.11 (d, J = 8.40 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 1.92 Hz, 1H), 7.30-7.33 (m, 1H), 5.49 (s, 2H), 5.30 (t, J = 5.00 Hz, 1H), 4.51 (t, J = 4.96 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.72-3.76 (m, 1H), 3.66-3.70 (m, 1H).
図19(c)を参照。1-((5-フルオロ-2-メトキシピリジン-3-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (60 mg、0.19 mmol) および2-フルオロエタンアミン (21.60 mg、0.34 mmol)、TEA (0.080 mL、0.57 mmol) を加えた。3分後、1-プロパンホスホン酸環状無水物 (151 mg、0.48 mmol) を加えた。得られた反応混合物を室温で50分間撹拌した。LCMS分析は必要とする生成物の形成を示した。反応物をDCMおよび水で希釈した。DCM層を抽出し、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。精製をウォーターズ製のRPシステムで行い、生成物1-((5-フルオロ-2-メトキシピリジン-3-イル)メチル)-N-(2-フルオロエチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (25.00 mg、36.5%) を得た。ES+MS m/z:361.33. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.44 (s, 3 H) 3.65 (d, J=5.27 Hz, 1 H) 3.75 (d, J=5.27 Hz, 1 H) 3.90 (s, 3 H) 4.49 (t, J=4.99 Hz, 1H) 4.64 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 5.42 (s, 2 H) 7.36 (dd, J=8.29, 3.01 Hz, 1 H) 7.93 (s, 1H) 8.12 (d, J=3.01 Hz, 1 H) 8.23 (s, 1H) 8.38 (s, 5 H) 8.88 (t, J=5.65 Hz, 1 H).
図19(d)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (100 mg、0.32 mmol) を、ジクロロメタン (10 mL) に入れ、懸濁液を得た。トリエチルアミン (0.133 mL、0.96 mmol) を加え、続いて1-プロパンホスホン酸環状無水物 (0.381 mL、0.64 mmol) を加えた。反応塊を室温で5分間撹拌した。(R)-2-フルオロプロパン-1-アミン (49.4 mg、0.64 mmol) を加え、室温で一晩撹拌した。反応の完結後、反応塊をDCMで希釈し、水および食塩水溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートし、粗製化合物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。収率75%. ES+MS m/z:373.2 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.25 - 1.42 (m, 4 H) 2.24 (s, 3 H) 2.40 (s, 3 H) 3.42 - 3.81 (m, 2 H) 3.94 (s, 3 H) 4.65 - 4.85 (m, 1 H) 4.93 (td, J=6.50, 3.39 Hz, 1 H) 5.64 (s, 2 H) 7.76 (s, 1 H) 8.16 (s, 1 H) 8.29 - 8.47 (m, 2 H) 8.91 (t, J=6.03 Hz, 1 H).
図20(a)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (75 mg、0.24 mmol) を、ジクロロメタン (10 mL) に入れ、懸濁液を得た。トリエチルアミン (0.0669 mL、0.48 mmol) を加え、続いて1-プロパンホスホン酸環状無水物 (0.286 mL、0.48 mmol) を加えた。反応塊を室温で5分間撹拌した。エタノールアミン (0.029 mL、0.48 mmol) を加え、室温で一晩撹拌した。反応の完結後、反応塊をDCMで希釈し、水および食塩水溶液で洗浄した。DCM層を硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートして、粗製化合物を得て、これをカラムクロマトグラフィーにより精製した。収率52.7%. ES+MS m/z:356.4(M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.23 (s, 3 H) 2.39 (s, 3 H) 3.39 - 3.65 (m, 4 H) 3.93 (s, 3 H) 4.84 (t, J=5.09 Hz, 1 H) 5.63 (s, 2 H) 7.74 (s, 1 H) 8.12 (s, 1 H) 8.33 (s, 1 H) 8.41 (s, 1 H) 8.80 (t, J=5.65 Hz, 1 H).
図20(b)を参照。メチル 1-((5-フルオロ-2-メトキシ-6-メチルピリジン-3-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (0.15 g、0.47 mmol) のジクロロメタン (10 mL) 中の撹拌溶液に、2-フルオロエタン-1-アミン ヒドロクロリド (71 mg、0.71 mmol)、トリエチルアミン (0.142 g、1.41 mmol) およびT3P (0.9 g、1.41 mmol) を加え、混合物を16時間室温で撹拌した。その後反応混合物を水へ注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、1-((5-フルオロ-2-メトキシ-6-メチルピリジン-3-イル)メチル)-N-(2-フルオロエチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミドを白色固体として得た。収率:30 mg (18%). ES+MS m/z:361(M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ ppm 2.31 (d, 3H, J = 2.9 Hz), 3.64-3.68 (m, 2H), 3.71-3.75 (m, 2H), 3.85 (s, 3H), 4.49-4.51 (m, 2H), 4.61-4.63 (m, 2H), 5.41 (s, 2H), 7.28-7.32 (m, 1H), 7.45 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 8.08-8.11 (m, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.49-8.50 (m, 1H), 8.92 (t, 1H, J = 5.8 Hz).
図20(c)を参照。6-フルオロ-1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (20 mg、0.06 mmol) および2-フルオロエタンアミン (7.18 mg、0.11 mmol)、TEA (0.026 mL、0.19 mmol) を加えた。3分後、1-プロパンホスホン酸環状無水物 (50.3 mg、0.16 mmol) を加えた。得られた反応混合物を室温で50分間撹拌した。LCMS分析は必要とする生成物の形成を示した。反応物をDCMおよび水で希釈した。DCM層を抽出し、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。精製をウォーターズ製のRPシステムで行い、生成物6-フルオロ-N-(2-フルオロエチル)-1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (20.00 mg、88%) を得た。ES+MS m/z:362. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.24 (s, 3 H) 3.57 - 3.70 (q, 1 H) 3.70 - 3.80 (q, 1 H) 3.94 (s, 3 H) 4.43 - 4.58 (t, 1 H) 4.66 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 5.68 (s, 2 H) 8.03 (dd, J=9.89, 2.54 Hz, 1 H) 8.29 (s, 6 H) 8.40 (s, 1 H) 8.53 (t, J=2.07 Hz, 1 H) 8.71 (t, J=5.84 Hz, 1 H).
図20(d)を参照。6-ブロモ-1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (0.13 g、0.34 mmol) のジクロロメタン (10 mL) 中の撹拌溶液に、2-フルオロエタン-1-アミン (0.06 g、0.68 mmol)、トリエチルアミン (0.1 g、1.02 mmol) およびT3P (0.32 g、1.02 mmol) を加え、混合物を室温で16時間撹拌した。その後反応混合物を水へ注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、その後分取(PREP)精製して、6-ブロモ-N-(2-フルオロエチル)-1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミドを白色固体として得た。収率:25 mg (17%). ES+MS m/z:424.2(M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ ppm 2.24 (s, 3H), 3.68 (bs, 1H), 3.75 (bs, 1H), 4.51 (bs, 1H), 4.64 (bs, 1H), 5.70 (s, 2H), 8.28 (s, 1H), 8.39 (d, 1H, J = 10.9 Hz), 8.58 (s, 1H), 8.64 (bs, 2H).
図21(a)を参照。6-メチル-1-((3-メチル-4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)ピリジン-2-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b] ピリジン-3-カルボン酸 (111 mg、0.29 mmol) をジクロロメタン (10 mL) に入れた。トリエチルアミン (0.204 mL、1.46 mmol) を加え、透明な溶液を得た。1-プロパンホスホン酸環状無水物 (0.348 mL、0.59 mmol) を加え、室温で5分間撹拌した。2-フルオロエチルアミン ヒドロクロリド (87 mg、0.88 mmol) を加え、室温で一晩撹拌した。反応の完結後、反応塊をジクロロメタンで希釈し、水、食塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートして、粗製化合物を得た。該化合物を、メタノールおよびジクロロメタンを溶離剤として用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。収率44.3%. ES+MS m/z:425.2(M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.24 (s, 3 H) 2.39 (s, 3 H) 3.66 (q, J=5.21 Hz, 1 H) 3.75 (q, J=5.15 Hz, 1 H) 4.49 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 4.65 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 4.90 (q, J=8.85 Hz, 2 H) 5.63 (s, 2 H) 7.07 (d, J=5.65 Hz, 1 H) 7.76 (s, 1 H) 8.11 (s, 1 H) 8.17 (d, J=5.65 Hz, 1 H) 8.34 (s, 1 H) 8.88 (t, J=5.84 Hz, 1 H).
図21(b)を参照。25 mL耐熱バイアル中を1-((2-メトキシ-5-(トリフルオロメチル)ピリジン-3-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (100 mg、0.27 mmol) で満たし、HATU (125 mg、0.33 mmol) をNMP (4 mL) に入れ、10分間室温で撹拌した。その後(S)-2-フルオロプロパン-1-アミン ヒドロクロリド (37.3 mg、0.33 mmol) およびトリエチルアミン (0.114 mL、0.82 mmol) を加え、1時間室温で撹拌した。LCMSが反応の完結を示した。反応混合物を水へ注ぎ、クロロホルムで抽出した。有機層を乾燥し、濃縮し、粗製物を逆相精製に付した。純粋なフラクションを濃縮して、(S)-N-(2-フルオロプロピル)-1-((2-メトキシ-5-(トリフルオロメチル)ピリジン-3-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (82 mg、70.6%) を固体として得た。ES+MS m/z:425(M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.15 - 1.44 (m, 3 H) 2.44 (s, 3 H) 3.39 - 3.79 (m, 2 H) 3.98 (s, 3 H) 4.75 (td, J=6.50, 3.39 Hz, 1 H) 4.92 (td, J=6.50, 3.20 Hz, 1 H) 5.48 (s, 2 H) 7.81 (d, J=2.26 Hz, 1 H) 7.91 - 8.03 (m, 1 H) 8.25 (s, 1 H) 8.34 - 8.42 (m, 1 H) 8.53 - 8.62 (m, 1 H) 8.90 (t, J=5.93 Hz, 1 H).
図21(c)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (40 mg、0.13 mmol) を、窒素源に接続されている空気冷却器を備える50 mlの1口フラスコに入れた。NMP (3 ml、31.17 mmol) を加え、溶液を得た。トリエチルアミン (0.056 ml、0.40 mmol) を加え、続いて2-(トリフルオロメトキシ)エタンアミン ヒドロクロリド (44.4 mg、0.27 mmol) を加えた。反応塊を室温で5分間撹拌した。HATU (61.2 mg、0.16 mmol) を加え、室温で30分間撹拌した。反応の完結後、数滴のメタノールを加え、透明な溶液を逆相HPLC精製に付し、1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-N-(2-(トリフルオロメトキシ)エチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (15.00 mg、27.3%) を得た。ES+MS m/z:410 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.25 (s, 3 H) 3.68 - 3.80 (m, 2 H) 3.93 (s, 3 H) 4.24 (t, J=5.27 Hz, 2 H) 5.69 (s, 2 H) 7.26 (dd, J=8.29, 4.71 Hz, 1 H) 7.94 (d, J=7.35 Hz, 1 H) 8.28 (s, 1 H) 8.38 - 8.54 (m, 2 H) 8.96 (s, 1 H).
図21(d)を参照。1-((5-フルオロ-2-メトキシピリジン-3-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (147 mg、0.47 mmol) を、窒素源に接続されている空気冷却器を備える50 mlの1口フラスコに入れた。NMP (3 ml、31.17 mmol) を加え、懸濁液を得た。HATU (213 mg、0.56 mmol) を加え、続いて(S)-2-フルオロプロパン-1-アミン (71.9 mg、0.93 mmol) を加えた。反応塊を室温で5分間撹拌した。トリエチルアミン (0.195 ml、1.40 mmol) を加え、室温で10分間撹拌した。
化合物-1 (5 g、0.042 mol) の濃H2SO4 (50 mL) 中の溶液に、濃HNO3 (3 mL、0.063モル) を-10℃で加えた。この温度で反応混合物を5時間撹拌した。その後混合物を氷冷水 (100 mL) へ注ぎ、NaOH水溶液 (10%) で中和し、酢酸エチル (2 x 100 mL) で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、溶媒を減圧下エバポレートして、3-ニトロ-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン (25b、3 g、43.4%) を得た。
3-ニトロ-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン (25b) (0.5 g、3.04 mmol) およびK2CO3 (0.5 g、9.12 mmol) のDMF (10 mL) 中の撹拌懸濁液に、4-(クロロメチル)-6-メトキシ-5-メチルピリミジン (0.7 g、6.09 mmol) を加え、得られた混合物を16時間室温で撹拌した。その後反応混合物を水 (50 mL) へ注ぎ、ジクロロメタン (2 x 50 mL) で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、溶媒を減圧下エバポレートして、1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-3-ニトロ-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン (25c) [300 mg (33%)] を淡黄色固体として得た。
1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-3-ニトロ-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン (0.15 g、0.58 mmol) のエタノール (5 mL) 中の溶液に、Pd/C (0.03 g) を加えた。反応混合物をバルーン圧下16時間室温で水素化した。溶媒をろ過し、減圧下エバポレートして、1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-アミン (25d、0.1 g、74%) を得た。
1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-アミン (25d) (0.1 g、0.37 mmol) のジクロロメタン (10 mL) 中の撹拌溶液に、トリエチルアミン (0.15 mL、1.11 mmol)、T3P (0.35 g、1.11 mmol) および2-シクロプロピル酢酸 (0.037 g、0.37 mmol) を加え、混合物を16時間室温で撹拌した。その後反応混合物を水 (20 mL) へ注ぎ、ジクロロメタン (2 x 50 mL) で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、溶媒を減圧下エバポレートした。粗生成物を、ヘキサン中の50%酢酸エチルを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、2-シクロプロピル-N-(1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-イル)アセトアミドをオフホワイト固体として得た;収率:25 mg (19%). ES+MS m/z:352 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ ppm 2.25 (s,3H), 3.67-3.69 (m, 1H), 3.73-3.76 (m, 1H), 4.50-4.52 (m, 1H), 4.62-4.64 (m, 1H), 5.49 (s, 2H), 6.94-6.96 (m, 3H), 7.27-7.30 (m, 1H), 8.08 (d, J = 8.2 Hz), 8.45 (s, 1H), 8.50 (d, J = 3.88 Hz), 8.92 (t, J = 5.6 Hz).
図23(a)を参照。25 mLサーマル・バイアル中を1-((5-フルオロ-2,6-ジメチルピリジン-3-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (100 mg、0.32 mmol) で満たし、HATU (146 mg、0.38 mmol) をNMP (4 mL) に入れ、10分間室温で撹拌した。その後2-フルオロエタンアミン (20.13 mg、0.32 mmol) およびトリエチルアミン (133 mL、0.96 mmol) を加え、1時間室温で撹拌した。LCMSが反応の完結を示した。反応混合物を水へ注ぎ、クロロホルムで抽出した。有機層を乾燥し、濃縮し、粗製物を逆相精製に付した。純粋なフラクションを濃縮して、1-((5-フルオロ-2,6-ジメチルピリジン-3-イル)メチル)-N-(2-フルオロエチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (75 mg、65.6%) を固体として得た。ES+MS m/z:359(M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.37 (d, J=2.64 Hz, 3 H) 2.42 (s, 6 H) 3.66 (d, J=5.46 Hz, 1 H) 3.75 (d, J=5.27 Hz, 1 H) 4.49 (t, J=4.90 Hz, 1 H) 4.65 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 5.52 (s, 2 H) 6.85 (d, J=10.17 Hz, 1 H) 7.86 (s, 1 H) 8.15 (s, 1 H) 8.34 - 8.46 (m, 1 H) 8.89 (t, J=5.84 Hz, 1 H).
図23(b)を参照。6-メチル-1-((3-メチル-4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)ピリジン-2-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (55 mg、0.14 mmol) およびNMP (13.95μl、0.14 mmol) を、窒素源に接続されている空気冷却器を備える50 mlの1口フラスコに入れた。HATU (66.2 mg、0.17 mmol) を加え、懸濁液を得た。エタノールアミン (17.50μl、0.29 mmol) を加え、続いてトリエチルアミン (60.6μl、0.43 mmol) を加えた。反応塊を室温で5分間撹拌した。LCMSが反応の完結を示した。粗製化合物をギルソン製の分取HPLCにより精製して、純粋なN-(2-ヒドロキシエチル)-6-メチル-1-((3-メチル-4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)ピリジン-2-イル)メチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (15.00 mg、24.49%) を得た。ES+MS m/z:423 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.23 (s, 3 H) 2.39 (s, 3 H) 3.45 (br. s., 2H) 3.53 (br. s., 2 H) 4.83 (s, 1 H) 4.90 (d, J=9.04 Hz, 2 H) 5.62 (s, 2 H) 7.06 (d,J=5.65 Hz, 1 H) 7.75 (s, 1 H) 8.07 (s, 1 H) 8.17 (d, J=5.09 Hz, 1 H) 8.32 (s, 1H) 8.79 (s, 1 H).
図23(c)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (75 mg、0.24 mmol) を、サーマル・リアクターに入れた。DCM (5 mL) を加え、懸濁液を得た。トリエチルアミン (0.067 mL、0.48 mmol) を加え、続いて1-プロパンホスホン酸環状無水物 (0.286 mL、0.48 mmol) を加えた。(R)-1-アミノプロパン-2-オール (36.1 mg、0.48 mmol) を加え、室温でONの間撹拌した。反応の完結後、反応混合物を濃縮し、DCM:MeOHに溶解した。この粗製化合物を逆相精製に付し、(R)-N-(2-ヒドロキシプロピル)-1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (35.0 mg、39.5%) をオフホワイト固体として得た。ES+MS m/z:370 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.10 (d, J=5.84 Hz, 3 H) 2.24 (s, 3 H) 2.39 (s, 3 H) 3.16 - 3.29 (m, 1 H) 3.37 - 3.48 (m, 1 H) 3.77 (br. s., 1H) 3.93 (s, 3 H) 4.85 (d, J=4.33 Hz, 1 H) 5.63 (s, 2 H) 7.74 (s, 1 H) 8.12 (s, 1 H) 8.33 (s, 1 H) 8.41 (s, 1 H) 8.82 (br. s., 1 H).
図23(d)を参照。1-((6-(ジメチルアミノ)-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (75 mg、0.23 mmol) を、サーマル・リアクターに入れた。DCM (5 mL) を加え、懸濁液を得た。トリエチルアミン (0.064 mL、0.46 mmol) を加え、続いて1-プロパンホスホン酸環状無水物 (0.274 mL、0.46 mmol) を加えた。2-フルオロエタンアミン ヒドロクロリド (22.94 mg、0.23 mmol) を加え、室温でONの間撹拌した。反応の完結後、反応混合物を濃縮し、DCM:MeOHに溶解した。この粗製化合物を逆相精製に付した。最終化合物は1-((6-(ジメチルアミノ)-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-N-(2-フルオロエチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (12.00 mg、14.05%) を白色固体として得た。ES+MS m/z:371 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.27 (s, 3 H) 2.40 (s, 3 H) 2.95 (s, 6 H) 3.66 (d, J=5.46 Hz, 1 H) 3.75 (d, J=5.27 Hz, 1 H) 4.49 (t, J=4.99 Hz,1 H) 4.65 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 5.54 (s, 2 H) 7.75 (s, 1 H) 8.13 (s, 1 H) 8.22 (s, 1 H) 8.34 (s, 1 H) 8.88 (t, J=5.84 Hz, 1 H).
図24(a)を参照。1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (100 mg、0.32 mmol) を、サーマル・リアクターに入れた。DCM (3 mL) を加え、懸濁液を得た。トリエチルアミン (0.089 mL、0.64 mmol) を加え、続いて1-プロパンホスホン酸環状無水物 (0.381 mL、0.64 mmol) を加えた。2,2-ジフルオロエタンアミン (26.0 mg、0.32 mmol) を加え、室温でONの間撹拌した。反応の完結後、反応混合物を濃縮し、DCM:MeOHに溶解した。この粗製化合物を逆相精製に付し、N-(2,2-ジフルオロエチル)-1-((6-メトキシ-5-メチルピリミジン-4-イル)メチル)-6-メチル-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (20.00 mg、16.64%) をオフホワイト固体として得た。ES+MS m/z:376 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.24 (s, 4 H) 2.40 (s, 3 H) 3.77 - 3.89 (m, 2 H) 3.93 (s, 4 H) 5.65 (s, 2 H) 7.77 (s, 1 H) 8.20 (s, 1 H) 8.40 (s, 1 H) 8.36 (s, 1 H) 8.91 (br. s., 1 H).
図24(b)を参照。1-(2,4-ジメチルベンジル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (200 mg、0.71 mmol) を、窒素源に接続されている空気冷却器を備える100 mlの1口フラスコに入れた。CH2Cl2 (10 mL) を加え、透明な溶液を得た。トリエチルアミン (5 mL、35.87 mmol) を加え、続いて1-プロピルホスホン酸環状無水物 (2 mL、1.43 mmol) および2-フルオロエチルアミン ヒドロクロリド (142 mg、1.43 mmol) を加えた。反応塊を室温で一晩撹拌した。この粗製化合物を逆相精製に付し、1-(2,4-ジメチルベンジル)-N-(2-フルオロエチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (50.00 mg、22%) をオフホワイト固体として得た。ES+MS m/z:326 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.21 (s, 3 H) 2.24 (s, 3 H) 3.57 - 3.86 (m, 2 H) 4.50 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 4.66 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 5.41 - 5.60 (m, 2 H) 6.72 (d, J=7.72 Hz, 1 H) 6.94 (d, J=7.54 Hz, 1 H) 7.05 (s, 1 H) 7.28 (dd, J=8.29, 4.71 Hz, 1 H) 7.98 (dd, J=8.38, 1.04 Hz, 1 H) 8.13 (s, 1 H) 8.51 (dd, J=4.62, 1.04 Hz, 1 H) 8.94 (t, J=5.84 Hz, 1 H).
図24(c)を参照。50 mLの丸底フラスコ中で1-(2-フルオロ-6-メトキシベンジル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボン酸 (0.130 g、0.43 mmol)、シクロプロピルメタンアミン (0.040 g、0.56 mmol) およびTEA (0.181 mL、1.30 mmol) を、DCM (10 mL) にN2下入れた。これに1-プロパンホスホン酸環状無水物 (0.317 g、1.00 mmol) を加えた。得られた反応物を室温で50分間撹拌した。LCMS分析は必要とする生成物の形成を示した。反応物をDCMおよび水で希釈した。DCM層を抽出し、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。精製をウォーターズ製のRPシステムで行い、生成物N-(シクロプロピルメチル)-1-(2-フルオロ-6-メトキシベンジル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-カルボキサミド (0.060 g、39.2%) を得た。ES+MS m/z:354 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.24 (q, J=4.90 Hz, 2 H) 0.38 - 0.50 (m, 2 H) 1.03 (t, J=7.06 Hz, 1H) 3.25 (t, J=6.22 Hz, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 5.47 (s, 2 H) 6.83 - 6.99 (m, 2 H) 7.26 - 7.46 (m, 2 H) 8.02 (s, 1H) 8.07 (d, J=8.10 Hz, 1 H) 8.49 (d, J=3.96 Hz, 1 H) 8.75 (t, J=5.65 Hz, 1 H).
ES+MS m/z:376
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.18 - 2.31 (m, 3 H) 2.40(s, 3H) 3.84 - 3.97 (m, 5 H) 5.62 - 5.70 (m, 2 H) 6.01- 6.22 (tt,1 H) 7.78 (s, 1 H) 8.20 (s, 1 H) 8.38-8.41 (d, J=14.51 Hz, 2 H) 8.87 - 8.96 (m, 1 H).
ES+MS m/z:369
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.27 (s, 3 H) 2.40 (s, 3 H) 2.95 (s, 6 H) 3.41 - 3.58 (m, 4 H) 4.84 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 5.53 (s, 2 H) 7.73 (s, 1 H) 8.10 (s, 1 H) 8.22 (s, 1 H) 8.33 (s, 1 H) 8.80 (t, J=5.46 Hz, 1 H).
ES+MS m/z:392
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.32 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 3.46 (d, J=5.6 Hz, 2H), 3.56 (d, J=5.1 Hz, 2H), 5.75 (s, 2H), 4.83 (brs, 1H), 8.02 - 7.53 (m, 2H), 8.21 - 8.04 (m, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.81 (brs, 1H).
ES+MS m/z:374
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.14 - 2.32 (m, 3 H) 3.64 - 3.86 (m, 5 H) 3.94 (s, 3 H) 4.49 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 4.65 (t, J=4.90 Hz, 1 H) 5.64 (s, 2 H) 7.63 (d, J=2.45 Hz, 1 H) 8.07 (s, 1 H) 8.26 (d, J=2.45 Hz, 1 H) 8.43 (s, 1 H) 8.76 (t, J=5.93 Hz, 1 H).
ES+MS m/z:392
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.18 - 2.31 (m, 3 H) 3.77 - 3.97 (m, 8 H) 5.62 - 5.69 (m, 2 H) 6.00-6.38(tt, 1H) 7.64 (d, J=2.45 Hz, 1 H) 8.11 (s, 1 H) 8.27 (d, J=2.45 Hz, 1 H) 8.43 (s, 1 H) 8.74 - 8.84 (m, 1 H).
ES+MS m/z:372
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.23 (s, 3 H) 3.31 - 3.43 (m, 4 H) 3.81 (s, 3 H) 3.94 (s, 3 H) 4.83 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 5.63 (s, 2 H) 7.61 (d, J=2.45 Hz, 1 H) 8.03 (s, 1 H) 8.25 (d, J=2.45 Hz, 1 H) 8.43 (s, 1 H) 8.64 - 8.74 (m, 1 H).
ES+MS m/z:387
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.28 (s, 3H), 2.96 (s, 6H), 3.67 (q, J=5.2 Hz, 1H), 3.74 (q, J=5.4 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 4.51 (t, J=5.0 Hz, 1H), 4.63 (t, J=5.0 Hz, 1H), 5.55 (s, 2H), 7.62 (d, J=2.4 Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 8.27 - 8.25 (m, 2H), 8.77 (t, J=6.0 Hz, 1H).
ES+MS m/z:405
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.27 (s, 3H), 2.95 (s, 6H), 4.00 - 3.84 (m, 5H), 5.55 (s, 2H), 6.32 - 6.04 (m, 1H), 7.62 (d, J=2.3 Hz, 1H), 8.08 (s, 1H), 8.27 - 8.24 (m, 2H), 8.79 (t, J=6.0 Hz, 1H).
ES+MS m/z:385
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.28 (s, 3H), 2.96 (s, 6H), 3.46 - 3.43 (m, 2H), 3.55-3.54 (m, 2H), 3.82 (s, 3H), 4.82 (br. s., 1H), 5.54 (s, 2H), 7.60 (d, J=2.4 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H), 8.37 - 8.17 (m, 2H), 8.69 (t, J=5.7 Hz, 1H).
ES+MS m/z:410
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.31 (s, 3H), 3.68-3.67 (m, 1H), 3.77 - 3.71 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 4.52 (t, J=4.9 Hz, 1H), 4.64 (t, J=4.9 Hz, 1H), 5.75 (s, 2H), 7.99-7.63 (m, 2H), 8.09 (s, 1H), 8.27 (d, J=2.2 Hz, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.78 (t, J=5.7 Hz, 1H).
ES+MS m/z:428
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.32 (s, 3H), 3.90 - 3.82 (m, 5H), 5.76 (s, 2H), 6.34 - 6.05 (m, 1H), 7.99-7.63 (m, 2H), 8.13 (s, 1H), 8.29 (d, J=2.4 Hz, 1H), 8.81 (t, J=6.2 Hz, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.81 (t, J=6.2 Hz, 1 H).
ES+MS m/z:408
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.30 (s, 3H), 3.46 - 3.42 (m, 2H), 3.56 - 3.52 (m, 2H), 3.82 (s, 3H) 4.81 (t, J=5.0 Hz, 1H), 5.73 (s, 2 H), 7.97-7.61 (m, 2H), 8.04 (s, 1H), 8.25 (d, J=2.3 Hz, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.69 (t, J=5.6 Hz, 1H).
ES+MS m/z:342
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.40 (d, J=0.94 Hz, 6 H) 2.58 (s, 4 H) 3.63 - 3.70 (m, 1 H) 3.75 (q, J=5.53 Hz, 1 H) 4.49 (t, J=4.99 Hz, 1 H) 4.65 (t, J=5.18 Hz, 1 H) 5.67 (s, 2 H) 7.75 - 7.79 (m, 1 H) 8.12 - 8.17 (m, 2 H) 8.33 - 8.37 (m, 1 H) 8.87 (t, J=5.93 Hz, 1 H).
ES+MS m/z:360
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.39 (s, 6 H) 2.58 (s, 3 H) 3.76 - 3.95 (m, 2 H) 5.68 (s, 2 H) 5.98 - 6.05 (m, 1 H) 6.15 - 6.22 (m, 1 H) 6.35 - 6.40 (m, 1H) 7.78 (s, 1 H) 8.14 (s, 1 H) 8.19 (s, 1 H) 8.36 (s, 1 H) 8.85 - 8.97 (m, 1 H).
MICの測定に用いたマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mtb)H37Rv ATCC 27294は、Jayaramら(2003)で報告されているとおり増殖させた。すべての実験で使用した接種源は、-70℃で保存している単一の種子ロットに由来する。要するにMtbを、ローラーボトルにおいて37℃で7〜10日間、0.2%グリセロール、0.05%ツイーン80(シグマ)、および10%アルブミンデキストロースカタラーゼ(ディフコ・ラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン州)を添加したミドルブロック7H9ブロス(以降の文書において7H9ブロスと呼ぶ)中において増殖させた。細胞を遠心分離により採取し、2回7H9ブロス中で洗浄し、新たな7H9ブロスに再懸濁した。0.5 mlのアリコートを分注し、種子ロットの懸濁液を-70℃に貯蔵した。-70℃で24時間後、1バイアルを解凍し、コロニー形成単位(CFU)の計数のためにプレート化した。すべての試験化合物のストックおよび希釈物をDMSO中で調製した。
このアッセイを、上記と同一手順を用いて行ったが、インキュベーション期間を2〜3週間に延長した。細胞増殖を濁度により測定し、非増殖を示す最小濃度をMICとして同定した。単剤耐性株とともに、代表的な耐性マーカー薬物が陽性コントロールとして含まれる。
異なる細菌株(スタフィロコッカス・アウレウスARC517、ストレプトコッカス・ニューモニエARC548、ヘモフィルス・インフルエンザエARC446、ヘモフィルス・インフルエンザエARC158、エシェリヒア・コリARC523、エシェリヒア・コリARC524、シュードモナス・エルギノーサARC545、P・エルギノーサARC546、クレブシエラ・ニューモニエARC1865、マイコバクテリウム・スメグマティス(Msm)ATCC607、Msm mc2155およびカンジダ・アルビカンスARC526)のMIC値を、臨床・検査標準協会(CLSI)ガイドライン(米国臨床検査標準委員会、2009)に従い、カチオン調整ミューラー・ヒントンブロス培地中の384ウェル型を用いて測定した。培地コントロール、培養物コントロールおよび適切な参照薬物コントロールが含まれる。増殖を、600nmでの吸光度を確認することにより観察する。最小発育阻害濃度(MIC)を、≧80%の増殖阻害を生じる濃度として見なした。
7H9ブロスにおける死滅動態アッセイを、ミドルブロック7H9培地を含む96ウェルプレートを用いて200μL容量中で行った。化合物の連続2倍段階希釈物をDMSO中でそれぞれ作成し、濃度は128〜0.25 mg/Lに及んだ。各々のこれら希釈物から、4μLを、約3 x 107 CFU/mLのMtb H37Rvを含む96ウェルプレート中のそれぞれのウェルに加えた。該プレートを37℃でインキュベートし、0、3、7、10、14日目にアリコートをミドルブロック7H9ブロスで希釈し、ミドルブロック7H11寒天平板にプレート化した。細菌コロニーを21〜28日後数えた。データを、各薬物処置についてのlog10CFUとして表す。
THP-1細胞(ATCC)を、2 mM L-グルタミンを添加した10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640(シグマ、セントルイス、ミズーリ州)を用いて、75cm2フラスコ中でコンフルエンスまで培養した。細胞を、5%CO2、95%空気の37℃のインキュベーター内でそれらが500,000 細胞/mLの密度に達するまで増殖させた。培養物からの、1〜2 x 105 細胞/mLの密度の細胞を、M・ツベルクローシスH37Rvに1:10(マクロファージ:細菌)の感染効率(MOI)で2時間37℃において感染させた(バッチ感染)。2時間後、細胞を2回予熱したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、細胞外細菌を除去し、その後コンプリートRPMI1640に再懸濁した。40 nM濃度のホルボールミリスタートアセテート(シグマ)を、細胞をマクロファージに分化させるために用い、96ウェルプレートに24時間37℃で接着させた。24時間後、様々な濃度の試験化合物を単層に加え、7日間インキュベートした。該マクロファージ単層を、顕微鏡下で定期的に観察し、薬物毒性による細胞形態学における逆転を観察した。薬物処置の開始時および処置後7日目において、単層を優しく洗浄し、0.04%SDSで溶解させ、ミドルブロック7H11寒天平板にプレート化した。細菌コロニーを21〜28日後数えた。データを、各薬物処置についてのlog10CFUとして表す。
M・ツベルクローシスH37Rv培養物を、少し改変を加えたWayne and Hayes (1996)に記載の低酸素条件に適応させる。要するに、Mtb細胞を、0.5の既定のヘッドスペース比(HSR)を用いて電磁ビーズを含むマッカートニーボトルにおいてデュボス・ツイーンブロス中で増殖させた。メチレンブルーを、レドックス指示薬(最終濃度1.5μg/mL)としてすべてのボトルに加え、酸素の喪失を追跡した。マッカートニーボトルを、37℃インキュベーター内の180rpmに設定したマグネチックスターラー上に置いた。メチレンブルー指示薬は、8日目から退色し始め、12日目に完全に色が抜けた。NRP Mtb細胞に対する様々な化合物の抗菌活性を、MIC測定の部で上述したとおりに培養を適用した14日目の低酸素状態を用いて、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて測定した。アッセイ全体を、低酸素チャンバー(デュプイ)中で低酸素の細胞を様々な濃度の化合物に7日間37℃で曝露することにより行った。嫌気性指示薬ストリップをチャンバー内に置き、全工程の間中酸素の除去を視覚的に確認した。細菌の計数を、ミドルブロック7H11寒天平板において行った。イソニアジドおよびニゲリシンを、アッセイにおけるコントロールとして用いた。イソニアジドは、完全なNRP状態を示す10μg/mL濃度の細菌CFUにおいてでさえ減少を示さなかった。データを、各薬物処置についてのlog10CFUとして表す。
化合物のインビトロにおける細胞毒性を、A549ヒト肺癌腫細胞に対してEakin et. al (2012)に記載のとおり測定した。要するに、A549細胞(ATCC)を、10%熱不活性化ウシ胎児血清(GIBCO-BRL)および1 mM L-グルタミン(GIBCO-BRL)を含むRPMI培地(GIBCO-BRL)中で〜1,000細胞/ウェルの密度で増殖させた。細胞を化合物とCO2雰囲気下37℃で72時間インキュベーションした後、細胞の生存性を、10μMのレサズリン溶液(シグマ)の添加後、蛍光(励起535 nm、発光590 nm)を蛍光光度計を用いて測ることにより測定した。増殖が50%まで阻害される濃度を、IC50値として見なした。
耐性異体株の発現および耐性の頻度
自然発生耐性変異体を、1段階選択法を用いて化合物31および32に対して作成した。要するに、Mtb H37Rvの中対数期培養物を遠心分離し、100倍濃縮し、〜1010 CFU/mLの細菌数を得た。細菌培養物の様々な希釈物を、化合物を含むプレート上にプレート化した(MIC濃度の4倍、8倍および16倍に対応する濃度)。細菌培養物の適切な希釈物をまた、薬物を含まないミドルブロック7H11寒天にプレート化し、培養物上の細菌数を数えた。プレートを4週間37℃でインキュベートし、薬物を含まないプレートにおけるCFUを数えた。薬物を含むプレートを6週間まで37℃でインキュベートし、自然発生耐性コロニーの最終的な数を確認した。耐性の自然発生割合を、薬物を含むプレート(所与の濃度)上のコロニー数を薬物を含まないプレート上の推定生細菌の総数で割ることにより計算した。耐性コロニーを、ランダムに薬物を含むプレートから採取し、コンプリート7H9ブロスにおいて増殖させ、特定の化合物および作用の異なるメカニズムを有する他の標準的なTB薬に対する耐性濃度を測定した。
全ゲノム配列決定のための全DNAを、標準的なフェノール-クロロホルム法を用いて耐性なMtb細胞から抽出した。生成量を、キュービット2.0(Qubit 2.0)蛍光光度計でdsDNA広範囲アッセイキットを用いて定量した(ライフ・テクノロジーズ、グランドアイランド、ニューヨーク州)。ライブラリー作製を、ネクステラ(Nextera)XT DNAサンプル調製キットおよびネクステラXTインデックスプライマー(イルミナ)、サンディエゴ、カリフォルニア州)を用いて行った。推奨手順に次の例外を加えて従った:DNAの高開始濃度を用い、そして最後のライブラリー標準化工程をqPCRライブラリー定量化に有利なるように省いた。qPCRを、バイオラッド製のCFX96サイクラーで、カパ・バイオシステムズ(ウーバン、マサチューセッツ州)製のライブラリー定量化キット(KK4824)を用いて行った。標準濃度の4 nMに希釈したライブラリーと2.5μlの各検体(8〜12検体に応じて)を合わせ、1N NaOH(最終濃度0.1N NaOH)で5分間変性させた。十分な検体を600μlに希釈して、15〜20 pmolの多重検体を得た。検体を、イルミナ製のMiSeq V2機で2X150のペアエンド・シングル・インデックス・リードとして配列決定した。すべての配列決定は、〜50倍の範囲を対象とした。
アザインドール化合物のPKを、マウス(健常なマウスおよび感染マウス)およびラットにおいて行った。マウスを化合物投与の2時間前に100 mg/kgのABTで前処理した。健常なマウスからのPKデータを、有効性試験のための投与計画を設計するのに用い、一方感染マウスからの情報を、PK-PD分析のために用いた。
化合物および参照薬物を、0.5%HPMC(ヒドロキシプロピルメチルセルロース)および0.1%ツイーン80の懸濁液中で製剤化した。BALB/cマウス(3匹のマウス/群)は、強制経口投与により50、100および200 mg/kgで投与された。薬物動態を、感染マウスにおいて投与の24日目に行った(Rennard, 1986)。血液検体を、化合物投与0.5、1.5、3、5、7および24時間後において各マウスから採取した。約30μLの血液検体を、逐次サンプリングによりすべての群から伏在静脈よりヘパリンリチウムでコーティングしたマイクロベットCB300(登録商標)(ザルスタット、独国)チューブに採取し、血漿(10μL)を遠心分離の後に調製した。血漿検体を、-20℃でLC-MS/MSを用いる分析まで貯蔵した。
0.5%HPMCおよび0.1%ツイーン80の懸濁液で製剤化された100 mg/kg化合物の単回経口投与量を投与した後、ELFのPKを、以前に記載されているとおり(Solapure et. al, 2013)健常なマウス(3匹のマウス/群)で行った。投与0.5、1.5、3、5、7、17および24時間後、マウスをイソフランを用いて安楽死させ、血液を後眼窩静脈叢の穿刺により採取した。気管支肺胞洗浄(BAL)を、0.7 mLの氷冷PBSを用いて気管支切開後行った。尿素測定キット、DIUR-500(バイオアッセイ・システムス、米国)を、血漿およびBAL検体中の尿素測定のために用いた。ELFの量を、Marry et. al, 2011に記載されているとおり、BAL中の尿素濃度を血漿のもので標準化した後に計算した。血漿およびBAL検体を、-20℃でLC-MS/MSを用いる分析まで貯蔵した。
各化合物の1mg/mLのストック溶液を、ジメチルスルホキシド(DMSO)中で調製し、アセトニトリルで2倍希釈した。16点の検定曲線を各検体について利用し、標準曲線は0.001〜40μg/mLに及んだ。血漿/BAL検体を、内部標準(250 ng/mL)としてカルバマゼピンを含む冷却したアセトニトリル(1:10 v/v)を加えることにより沈殿させた。検体をボルテックスし、4000 rpmで30分間10℃において遠心分離した。得られた上清を、移動相(0.1%ギ酸を含む水中の50%アセトニトリル)と混合した。10μLの検体を、三連四重極質量分析計(ウォーターズ製-ACQUTY-TQD;MS/MS)に接続した液体クロマトグラフィーシステム(ウォーターズ製-ACQUTY UPLC)上に注入した。検体を陽イオンモードで取得して、多重反応モニタリング(MRM)により検出した。検体の濃度を、ピーク面積比に対する検体の既知濃度(検体/内部標準ピークの応答)をプロットすることにより得られる標準曲線から測定した。
血漿濃度-時間関係のPK分析を、ウィンノンリン・フェニックスソフトウェア(バージョン6.2;ファーサイト、米国)で行った。ノンコンパートメント分析プログラム、モデル200を、PKパラメーターを計算するために用いた。血漿中の最高薬物濃度(Cmax)、Cmaxまでの時間(Tmax)、排泄半減期(t1/2)、および0から無限までのAUC(AUC0-∞)を評価した。AUCは、台形公式(リニアアップ−ログダウン(linear up and log down))を用いて計算され、AUC0-∞の値は、推定されるAUCが元の値の20%以上でないときのみ考慮された。末端の傾斜における3個のサンプルポイントの最小値を、半減期を計算するのを評価するために用いた。
BAL検体中のELFの量を、BALおよび血漿中の尿素濃度の比を掛けたBALの量として記載のとおり計算した(Solapure et. al, 2013; Marry et. al, 2011)。ELF中の化合物濃度を、BAL検体中の濃度にBAL量のELF量に対する比を掛けることにより計算した。血漿およびELF中のAUC0-∞を、ノンコンパートメント分析のウィンノンリン・フェニックス(バージョン6.2;ファーサイト、米国)により計算した。遊離血漿のAUCを、各時間ポイントの濃度に血漿中の遊離フラクションを掛けた後計算した。肺ELF浸透率を、同じ時間間隔中の遊離血漿/全血漿においてELF中AUC0-∞の遊離AUC0-∞に対する比として計算した。単回投与量の投与後に健常なマウスで測定したこの比を、感染マウスにおける多回投与の有効性試験の間一定のままと見なした。ウィンノンリンでの少量検体分析を、AUC評価に関連する標準誤差(SE)を評価するために用いた。
マイコバクテリウム・ツベルクローシス感染の接種源:
Mtb H37Rv(ATCC27294)(標準的な抗マイコバクテリア剤すべてに感受性である)を、上記のとおり増殖させた。7〜10日後、細胞を遠心分離により採取し、7H9ブロス中で2回洗浄し、新たな7H9ブロス中に再懸濁させた。1 mLのアリコートを分注し、-70℃で貯蔵した。該冷凍したストックを動物感染の日に解凍し、接種源として用いた。
すべての動物実験試験計画書および使用法は、動物倫理委員会(Institutional Animal ethics committee、IAEC)より承認され、動物実験管理監督委員会(Committee for the Purpose of Control and Supervision、CPCSEA)(インドの監督機関)に登録された。雄のBALB/cマウスはRCC(ハイデラバード)より、ラットはバイオニーズ(Bioneeds)(バンガロール、インド国)より購入した。マウスおよびラット(6〜8週)8匹を、ケージ当たり3または4匹の群にランダムに割り当て、試験を開始する前に1週間順応のために飼った。動物を、12時間の昼夜のサイクルの標準条件下で飼育した。飼料(ニュートリラボ(Nutrilab)(登録商標))および水は自由に給された。感染マウスを、バイオセーフティーレベル3(BSL-3)の設備中の個々に喚起されているケージ(アレンタウン・テクノロジーズ(Allentown Technologies)、米国)で飼育した。感染マウスにおける薬物動態のための投与および血液サンプリングを含むすべての手順を、厳格な生物学的封じ込め下で行った。
マウスおよびラットを、改良したマディソン(Madison)エアロゾル装置を用いる吸入方法によりM・ツベルクローシスに感染させた(Jayaram et. al. 2003)。急性感染モデルを、マウスにおいて〜104 CFU/肺を注入する高用量のエアロゾル感染により確立し、薬物処置は感染後3日目に開始した(Schroeder et. al, 2003; Jayaram et al. 2003)。その一方、慢性感染モデル(マウスおよびラット)(Schroeder et. al, 2003; Jayaram et al. 2003;Kumar et al. 2014)を、〜50〜100細菌/肺を送達する低用量のMtbのエアロゾル感染で発現させ、薬物処置は感染後28日目に開始した。薬物処置の開始時に肺に存在する細菌数を測定した。処置の最後にマウスを安楽死させ、肺を無菌で取り除き、3.0 mLのゲル状の生理食塩水中でウィートン(Wheaton)製のテフロン・ガラス組織グラインダーを用いて均質にした。肺ホモジネートを10倍工程で段階希釈し、10%ADC添加ミドルブロック7H11寒天平板にプレート化した。プレートを37℃5%CO2で3週間インキュベートして、単離したコロニーを得た。
感染マウスを、化合物投与の2時間前に100 mg/kgのアミノベンゾトリアゾール(ABT)の毎日の経口投与で前処置し、P450代謝酵素を遮断した。アザインドール化合物3および4を、0.5%(w/v)HPMCおよび0.1%ツイーン80(シグマケミカル、米国)の懸濁液で製剤化し、強制経口投与により送達した。急性マウスモデルにおいて、動物は、50、100 mg/kgの化合物3および4、ならびに陽性コントロールとして3 mg/kgのイソニアジドを投与された。慢性モデルにおいて、30および100 mg/kg用量の化合物3および4を用いた。10 mg/kgのリファンピシンを参照薬物コントロールとして用いた。ABT有りおよび無しの2つの独立したビヒクルコントロール群を、Mtb感染におけるABTの何らかの副作用を除外するために用いた。すべての薬物および試験化合物を、4週間、1週間当たり6/7日投与する形式で経口投与した。投与期間が完了した48時間後、動物をCO2で安楽死させ、肺を無菌で取り除き、上記のとおりプレート化した後CFUを数えた。
アザインドール化合物8、17、30および34を、0.5%(w/v)HPMCおよび0.1%ツイーン80(シグマケミカル、米国)の懸濁液で製剤化し、強制経口投与により送達した。慢性ラットモデルにおいて、動物は、30、100 mg/kgの化合物8、17、30および34を投与された。10 mg/kgのリファンピシンを参照薬物コントロールとして用いた。すべての薬物および試験化合物を、4週間、1週間当たり6/7日投与する形式で経口投与した。投与期間が完了した48時間後、動物をCO2で安楽死させ、肺を無菌で取り除き、上記のとおりプレート化した後CFUを数えた。
プレート化することから得られたコロニー数を、Log10(X+1)(式中、xは所与の検体に存在する生菌の総数に等しい)に変換した。プリズムソフトウェアバージョン4(グラフ・パッド・ソフトウェア、サンディエゴ、カリフォルニア州)を、薬力学的効果をプロットするために用いた。ダネットの多重比較検定を、処置マウス対未処置マウスにおける肺CFUでの統計的差異を識別するために用いた。
0.1Mリン酸緩衝液、pH 7.4における化合物の溶解度を記載のとおり測定し、グリブリドをアッセイにおけるQCスタンダードとして用いた。要するに、化合物をACN/水(40:60)で所望の濃度に希釈し、検体をジェネバックを用いて4時間乾燥し、続いて800μlの緩衝液を加えた。化合物を含むプレートを、24時間25℃で750rpmのエッペンドルフ・サーモミクスRにおいて撹拌した。最後に化合物濃度を、UVおよびMS分析を用いて評価した。
タンパク結合を、平衡透析法技術を用いて測定した。化合物を10%血漿に加えて、20μMの濃度を得て、等張な緩衝液で18時間37℃で透析した。血漿および緩衝液を、一般的なLCUVMSを用いて分析し、化合物に対する第1の見かけの結合定数を得た。その後該結合定数を、100%の血漿における遊離%を測定するために用いた。
1μM化合物を、1 mg/mLのミクロソーム(20 mg/mlタンパク質濃度でHLM/MLMをプールする)と、2 mM NADPH溶液を含む166μLの緩衝液(100 mMリン酸緩衝液、pH 7.4)中において37℃でインキュベートした。20μLのインキュベーション混合物を、4倍量の冷却したアセトニトリルにより異なる時間ポイント、すなわち0、2、5、10、20および30分において新たな96ウェルプレート中でクエンチした。クエンチしたプレートを、4000rpmで15分間遠心分離した。30μLの上清を、水中の50%アセトニトリルで300μLまで希釈し、基質の枯渇を、LC-MS/MSを用いて分析した。
凍結保存した肝細胞の生存性を、トリパンブルーを用いて測定し、該細胞濃度を106細胞/mLに緩衝液(KHB緩衝液)で調節した。1μM化合物(アセトニトリル中;0.01%DMSO)を、500μLの肝細胞(100万細胞/mL)でNUNCプレート中でインキュベートした。反応を、異なる時間ポイント(0、5、15、30、60、90および120分)において3倍量の冷却したアセトニトリルの100μLを反応混合物へ添加することにより停止させ、4℃で15分間遠心分離した。上清を、LC-MS/MSを用いて基質の枯渇について分析した。
振とうフラスコ原理に基づくオクタノール-水分配係数(Log D)を、次のとおり測定した。用いた水溶液は、10 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4である。DMSOに溶解した20μLの10 mM化合物をガラスバイアルプレートに取った。DMSOを、ジェネバックを用いて 除去した。435μLのオクタノールを、トムテック(Tomtec)を用いて加え、5分間溶解するまで撹拌した。さらに混合を反転により5時間25℃で行い、続いて30分間3000 RPMで遠心分離した。水層およびオクタノール層両方のLC/UV/APPI/MS定量を行った。LogD値は次の式に従い決定した。
該方法は、-2〜5に及ぶlogDに対して有効としている。
化合物を、電位型員チャネルにおいて電気生理学的ミディアムスループットのイオンワークスTM(IonWorksTM)デバイスを用いて試験した。イオンワークスTMの稼働に関する詳細な方法は、公表されている(Schroeder 2013)。実験を行うために、イオンワークスTM機器の「セル」の位置におけるボート(boat)に、細胞懸濁液を投入し、96ウェルのPBS目的プレートを「プレート1」の位置に設置した。384ウェルのパッチプレートTM(PatchPlateTM)を、イオンワークスTMプレナムに設置し、プレナムクランプを用いて位置に保持させた。この時点から実験の進行は自動化され、最終的に試験化合物についての非累積的な濃度効果曲線が記録される。
本明細書に記載の化合物は、Mtbおよびマイコバクテリウム・スメグマティス(Msm)に殺菌的であるが、広域スペクトル病原体に対して活性を示さず、それ故に優れた標的病原体特異性を示唆する(表2、図25)。一連の化合物は、Mtbの薬物感受性および単剤耐性な臨床分離株についてのMICを保持しており(表3、図26)、薬物感受性およびMDR TB治療の可能性を示唆する。該化合物は、複製されるMtbに対して時間依存性死滅動態を示し、MICの1〜4倍の濃度において10日目までにコロニー形成単位(CFU)で〜4log10の減少を伴う(図1)。該化合物はまた、細胞内Mtbに活性であり、Mtbに感染させたTHP1細胞においてMICより1〜4倍高い濃度でCFUで〜1log10の減少を伴う(図2)。複製された細菌におけるそれらの潜在的な活性に加えて、一連の分子のサブセットは、低酸素条件下で複製されないMtbに対して適度な活性(WayneのモデルにおいてHBCとして測定される殺菌性)を示し、化合物3によって代表される(表4)。一連の化合物は、処置の72時間後A549のヒト肺腺癌上皮細胞株において非細胞毒性であると分かった(MMIC >100μM、表4)。最高の32μMにおける化合物曝露の7日後、>95%のTHP-1マクロファージ生存性がまた観察された(表4)。
ND:未測定;a 化合物5(n=2);b ラットIVPKについての化合物6(n=2);すべての化合物について(n=2)
*ヒト(Hu)PPB遊離%に基づいて計算した;ELF浸透率を95%信頼区間において計算した
a 化合物3(n=2);b 化合物4(n=1)
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Claims (20)
- 式(I):
R1は、水素、フッ素、臭素、-OCH3およびメチルより選択され;
R2は、水素またはメチルであり;
R3は、水素またはメチルであり;
Xは、NまたはCR4であり;
R4は、水素、フッ素および-OCH3より選択され;
R5は、水素、フッ素、-CF3および-CNより選択され;
Yは、NまたはCR6であり;
R6は、水素またはメチルであり;
Zは、NまたはCR7であり;
R7は、水素、フッ素、-OCH3、-OCHF2、-OCH2CF3、および-N(CH3)2より選択され;
R8は、水素、フッ素、メチルおよび-OCH3より選択され;
nは、1または2であり;
R9は、フッ素、シクロプロピル、-OCH3、-OH、-OCF3、-CHF2、-CH(F)CH3および-CH(OH)CH3より選択される]
で示される化合物、またはその医薬的に許容される塩。 - 請求項1に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩、および医薬的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
- 請求項2に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩、および医薬的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
- 結核またはマイコバクテリウム感染症の処置に用いるための、請求項1に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
- 結核またはマイコバクテリウム感染症の処置に用いるための、請求項2に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
- 結核またはマイコバクテリウム感染症の処置のための薬剤の製造に用いるための、請求項1に記載の化合物。
- 結核またはマイコバクテリウム感染症の処置のための薬剤の製造に用いるための、請求項2に記載の化合物。
- 治療上有効な量の請求項1に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、結核またはマイコバクテリウム感染症を処置する方法。
- 治療上有効な量の請求項2に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、結核またはマイコバクテリウム感染症を処置する方法。
- 結核またはマイコバクテリウム感染症の処置に用いるための、請求項1に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物。
- 結核またはマイコバクテリウム感染症の処置に用いるための、請求項2に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物。
- DprE1の阻害に用いるための、請求項1に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
- DprE1の阻害に用いるための、請求項2に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
- DprE1を阻害するための薬剤の製造に用いるための、請求項1に記載の化合物。
- DprE1を阻害するための薬剤の製造に用いるための、請求項2に記載の化合物。
- 治療上有効な量の請求項1に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を投与することを含む、DprE1を阻害する方法。
- 治療上有効な量の請求項2に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を投与することを含む、DprE1を阻害する方法。
- DprE1を阻害するための、請求項1に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物。
- DprE1を阻害するための、請求項2に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物。
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