JP2016529232A - サイトカインアンタゴニストの標的化 - Google Patents

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Abstract

本発明は、サイトカインアンタゴニストと、標的部分、好ましくは抗体または抗体様分子とを含む融合タンパク質に関する。好ましい実施形態では、サイトカインアンタゴニストは、受容体と結合するが、受容体シグナル伝達を誘導しない、改変されたサイトカインである。本発明は、更に癌、及び免疫関連疾患または炎症関連疾患の治療に使用するための、本発明の融合タンパク質に関する。

Description

本発明は、サイトカインアンタゴニストと、標的部分、好ましくは抗体または抗体様分子とを含む融合タンパク質に関する。好ましい実施形態では、サイトカインアンタゴニストは、受容体と結合するが、受容体シグナル伝達を誘導しない、改変されたサイトカインである。本発明は、更に癌の治療において使用し、または自己免疫疾患の治療において使用するための、本発明の融合タンパク質に関する。
サイトカインは、微生物侵入及び腫瘍形成に対する防御機構の重要なメディエータである。しかし、多くの自己免疫疾患で特徴的に観察されるように、制御されない炎症及び組織障害において最高に達し得る過剰な活性を防止するために、サイトカインの産生及び活性は、しっかりと制御されなければならない。
リウマチ性関節炎は、ＴＮＦα、ＩＬ−１、及びＩＬ−６が、リンパ球及び進行性の関節破壊を媒介する他のタイプの白血球の補充において突出した役割を果たす自己免疫疾患の典型例である。ＴＮＦ阻害剤は、リウマチ性関節炎を有する多くの患者の症状を軽減し、疾病の進行を遅らせ、生活の質を改善することがわかっている（Ｍｏｒｅｌａｎｄ，２００９）。同様に、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３を中和するｍＡｂ（ウステキヌマブ）が乾癬の有望な治療法を提供し（Ｅｌｌｉｏｔｔら、２００９）、リウマチ性関節炎の治療用に２００１年にＦＤＡに初めて認可された、組換え型ヒトＩＬ−１受容体アンタゴニスト（アナキンラ、Ｋｉｎｅｒｅｔ（商標））は、多くのＩＬ−１媒介性自己炎症性疾患の治療のための有望な薬剤である（Ｇｏｌｄｂａｃｈ−Ｍａｎｓｋｙ，２００９）。
いくつかの系統の証拠が、形質細胞様樹状細胞によるＩ型インターフェロンの過剰産生が、全身性エリテマトーデス、皮膚、腎臓、筋骨格、血液組織に影響を及ぼす多系統自己免疫疾患、シェーグレン症候群、人口の１〜３％に影響する涙及び唾液を産生する腺の破壊を特徴とする疾患を含む、いくつかの自己免疫疾患の主な病因であるという考えを裏付けている。実際に、天然のＩＦＮ産生が正しく制御されないと、その後の長期のＩ型ＩＦＮの暴露により、全身性自己免疫疾患の発症を促進する自己抗体の産生が推進される（Ｋｉｅｆｅｒら、２０１２）。したがって、Ｉ型ＩＦＮを標的とする新規な治療法が開発されてきた。例えば、ＩＦＮαを中和する２種のモノクローナル抗体（シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）及びロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ））は現在臨床試験中であり（ＭｃＢｒｉｄｅら、２０１２；Ｍｅｒｒｉｌｌら、２０１１）、Ｉ型ＩＦＮアンタゴニストも設計されている（Ｐａｎら、２００８）（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５６３６６）。
ＩＬ１７Ａは、サイトカインのＩＬ１７ファミリーのうちの最も特徴的なメンバーである。この多面発現性サイトカインは、ＩＬ１７ＲＡ及びＩＬ１７ＲＣサブユニットから構成される受容体と相互作用する。ＩＬ１７ＲＡ鎖は、造血細胞、免疫細胞、上皮細胞、内皮細胞を含む細胞型、並びに繊維芽細胞に広範に発現している。ＩＬ１７Ａは、通常は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−２１及びＴＧＦβを含むサイトカインのサブセットによる活性化により、Ｔｈ１７細胞により産生され、自然免疫応答及び適応免疫応答の橋渡しをするのに役立つ初期の炎症性シグナルを伝達する。ＩＬ１７は好中球の有力な活性化因子であり、種々の細胞外病原体に対する免疫防御において重要な役割を果たしている。ＩＬ１７Ａが自己免疫病態を促進することも十分に証明されている（Ｇａｆｆｅｎ，２００９；Ｓｈｅｎ及びＧａｆｆｅｎ，２００８）。ブロダルマブ、セクキヌマブ及びイクセキズマブは、乾癬及びクローン病のような自己免疫疾患の治療のためにＩＬ１７Ａ／ＩＬ１７Ｒの連関（ａｘｉｓ）を標的とする。全ては、感染のリスクを高めることを含む有害な副作用を与える可能性がある（Ｈｕｅｂｅｒら、２０１２；Ｓｐｕｌｓ及びＨｏｏｆｔ，２０１２）。したがって、気道上皮（喘息）、星状細胞（多発性硬化症）、滑膜細胞及び単球／マクロファージ（リウマチ性関節炎）またはケラチノサイト（乾癬）等の選択された細胞型に対するＩＬ１７Ａアンタゴニストの特異的標的化は、ＩＬ１７の機能を完全に拮抗するよりも有意な利点を与える。
ＩＬ１α及びＩＬβは、ＩＬ１サイトカインファミリーの基礎を築いたメンバーである。両者とも多面発現性であり、ＩＬ−１受容体Ｉ型（ＩＬ−１ＲＩ）及びＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）から構成される、広範に発現する受容体複合体を介して機能する。このＩＬ−１連関の過剰活性化は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アテローム硬化症及びアルツハイマー病を含む、多くのヒトの病態と関連している。樹状細胞、マクロファージ及び好中球等の自然免疫細胞、また、未感作細胞、Ｔｈ１７及びＣＤ８＋Ｔ細胞、並びにＢ細胞を含む適応免疫応答に関与する細胞を含む、多くの異なる系統の免疫細胞はＩＬ−１により活性化される（Ｓｉｍｓ及びＳｍｉｔｈ，２０１０において概説）。組換え型ヒトＩＬ−１ＲＡ（ＩＬ１受容体アンタゴニスト、別名、アナキンラ）はリウマチ性関節炎を治療するために使用することができ、広範囲の自己炎症性疾患における使用について評価されている（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，２０１１）。しかし、アナキンラを用いた長期治療の主な副作用の１つは、感染症の発症が増加することである。したがって、（免疫）細胞のサブセットのみによるＩＬ−１活性の選択的拮抗は、より安全な代替え手段を提供する可能性がある。病原体に対する宿主防御に影響を及ぼすことなく、炎症性疾患の治療のために、Ｔ細胞コンパートメントの上のその活動を無傷のままにして、選択された生来の免疫細胞に及ぼすＩＬ−１の機能を標的とする阻害がまだ有効性を示す可能性があると想定することができる。
ＩＬ−７関連サイトカインＴＳＬＰ（胸腺間質性リンパ球新生因子）はＴｈ２応答促進の関連で最も研究されているが、ＴＳＬＰが種々の免疫細胞型及び非免疫細胞型において機能していることは今や明らかである（Ｒｏａｎら，２０１２において概説）。その受容体はＩＬ−７、及びＣＲＬＦ２としても知られている広範に発現しているＴＳＬＰＲαと共有するＩＬ−７Ｒαからなる（Ｐａｎｄｅｙら、２０００）。ＴＳＬＰは、樹状細胞、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、肥満細胞、好酸球及び好塩基球を含む、いくつかの異なる細胞型で作用することにより、Ｔｈ２型炎症を促進する。ＴＳＬＰは、蠕虫、寄生虫に対する宿主の防御を補助するが、アレルギー性炎症には寄与することができず、ＴＳＬＰを拮抗することがアレルギー性疾患の治療として提案された。逆に、ＴＳＬＰは、炎症性腸疾患等のＴｈ１及びＴｈ１７応答を悪化させることにより推進される炎症性疾患において保護的役割を果たし得る（Ｈｅ及びＧｅｈａ，２０１０及びＲｏａｎら、２０１２において概説）。最近、ＴＳＬＰＲα内の変異が、予後不良の白血病を含む癌と関連していること（Ｈａｒｖｅｙら、２０１０；Ｙｏｄａら、２０１０；Ｅｎｓｏｒら、２０１１）、並びにＴＳＬＰの濃度が乳癌の進行（Ｏｌｋｈａｎｕｄら、２０１１）及び膵臓癌における生存期間の低下（Ｄｅ Ｍｏｎｔｅら、２０１１）と関連していることがわかった。したがって、選択された腫瘍細胞型に対するＴＳＬＰアンタゴニストの選択的標的化は選択的な抗腫瘍手段を提供することができ、選択された免疫細胞の標的とされた拮抗作用による追加の調節は、このような手段を更に最適化するために使用することができる。同様のアプローチは、非悪性疾患のためにも取り組むことができる。
サイトカインの作用を中和することを目的とする治療手段の主な問題は、サイトカインアンタゴニストが、自己免疫疾患または自己炎症性疾患の発症に特異的に関与する細胞または組織を標的としないことである。例えば、Ｉ型ＩＦＮがウイルス感染の制御において、また特に癌細胞の増殖を制御する免疫応答を確立するための必須のタンパク質のファミリーであるので、モノクローナル抗体またはＩＦＮ受容体アンタゴニストによるＩ型ＩＦＮ活性の長期の全身的中和が、ウイルス感染の感受性及び腫瘍成長に関する重要なリスクを有していることは容易に予測することができる（Ｇａｊｅｗｓｋｉら、２０１２）。同様に、ＩＬ−１活性の全身での中和が、免疫応答の際の抗原−細胞障害性Ｔ細胞の増殖、エフェクター機能、組織局在性、及びメモリー応答に影響することが予想される（Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎら、２０１３）
意外にも、本発明者らは、標的細胞のサブセットに対してサイトカインアンタゴニストを特異的に標的化することにより、全身にサイトカインアンタゴニストを適用する際のマイナスの副作用のない治療効果に達することが可能になることを見出した。本発明は、所与の細胞表面マーカーを発現する特異的細胞型に対するＩ型ＩＦＮアンタゴニストの作用を標的とすることにより例証される。このような方法は、十分に反応する他の細胞及び器官を残し、自己免疫疾患の発症に不届きにも関与する細胞のサブセットにおける内在性のＩＦＮの作用を特異的に阻害する、標的化ＩＦＮアンタゴニストの設計及び構築に適用される。
まだ承認されていないが、腫瘍退縮ウイルスの臨床試験が進行中である（Ｒｕｓｓｅｌｌら、２０１２）。腫瘍退縮ウイルスは、正常な細胞内インターフェロン媒介性抗ウイルス反応に対する感受性を設計することにより、しばしば正常組織において弱力化された複製能を有するように設計される。例は、インターフェロンβをコードする腫瘍縮退性水疱性口内炎ウイルスである（Ｎａｉｋら、２０１２）。このようなウイルスの治療効果は、多くの腫瘍細胞によって示されるＩＦＮ応答の欠陥の結果であると予想される。しかし、ＩＦＮ応答に影響する腫瘍の遺伝的多様性は非常に可変であり、ウイルス媒介性腫瘍溶解の効果を低下させる（Ｎａｉｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２００９）。したがって、腫瘍細胞内でＩＦＮ応答を特異的に阻害することにより、腫瘍標的ＩＦＮアンタゴニストは、腫瘍退縮ウイルスによる腫瘍細胞の特異的破壊を可能にする。
本発明の第一の態様は、サイトカインアンタゴニストと、抗体または抗体様分子からなる標的部分とを含む融合タンパク質である。本明細書で用いられるサイトカインアンタゴニストは、可溶性受容体、サイトカイン結合抗体または変異体サイトカインを含むがこれらに限定されない、当業者に公知のあらゆるサイトカインアンタゴニストであってもよい。好ましくは、前記サイトカインアンタゴニストは変異体サイトカインであり、より好ましくは、受容体と結合するが、サイトカインシグナル伝達を誘導しないか、弱いサイトカインシグナル伝達しか誘導しない変異体である。好ましくは、受容体に対する変異体の親和力は、野生型のサイトカインのものと同等であり、より好ましくは高い親和力を有し；好ましくは変異体により誘導されるシグナル伝達は野生型のシグナル伝達の２０％未満であり、より好ましくは野生型のシグナル伝達の１０％未満であり、より好ましくは５％未満であり、より好ましくは１％未満である。最も好ましくは、変異体サイトカインの結合は、検出可能なシグナル伝達を生じない。このような変異体は、サイトカインシグナル伝達の競合的阻害剤として作用し得る。本明細書で用いられる抗体または抗体様分子は、特に他の分子と結合するように設計されたタンパク質であり、好ましくは特異的結合ドメインを含むタンパク質性分子である。非限定的例としては、前記抗体または抗体様分子は、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら、１９９４）、ラクダ重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、新規抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）、アフィボディ（Ｎｙｇｒｅｎら、２００８）、アルファボディ（ＷＯ２０１００６６７４０）、設計アンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎｓ）（Ｓｔｕｍｐｐら、２００８）、アンチカリン（Ｓｋｅｒｒａら、２００８）、ノッチン（Ｋｏｌｍａｒら、２００８）及び設計されたＣＨ２ドメイン（ナノ抗体；Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，２００９）であってもよい。本明細書で用いられる場合、定義は抗体のＦｃテイル（結合ドメインを含まない）を除外する。好ましくは、前記抗体または抗体様分子は１本のポリペプチド鎖からなり、より好ましくは、前記抗体は翻訳後に修飾されていないものである。本明細書で用いられる場合、翻訳後修飾は、タンパク質合成の間、またはその後に生細胞により実施される修飾を示すが、例えば、ペグ化等（これに限定されない）の分離されたタンパク質において実施される修飾、好ましくは化学的修飾は除外する。より好ましくは、前記抗体または抗体様分子は、抗体由来の相補性決定領域を含む。最も好ましくは、前記標的抗体または抗体様分子はナノボディである。
好ましくは、前記サイトカインアンタゴニストと前記標的部分とはリンカー、好ましくはＧＧＳリンカーにより連結している。好ましくは、前記ＧＧＳリンカーは、少なくとも５個のＧＧＳリピート、より好ましくは少なくとも１０個のＧＧＳリピート、より好ましくは少なくとも１５個のＧＧＳリピート、最も好ましくは少なくとも２０個のＧＧＳリピートを含む。
好ましい実施形態では、本発明のサイトカインアンタゴニストはインターフェロンアンタゴニストであり、より好ましくは、それはＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ変異体である。他の好ましい実施形態では、本発明のサイトカインアンタゴニストは、ＩＬ１７ファミリーのサイトカインのアンタゴニスト、好ましくはＩＬ１７Ａアンタゴニストである。更に他の好ましい実施形態では、本発明のサイトカインアンタゴニストは、ＩＬ１サイトカインファミリーのアンタゴニスト、好ましくはＩＬ１αまたはＩＬβアンタゴニストである。更に他の好ましい実施形態では、本発明のサイトカインアンタゴニストはＴＳＬＰアンタゴニストである。
好ましい一実施形態では、抗体または抗体様分子は、癌細胞マーカーを対象とする。癌細胞マーカーは当業者に公知であり、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＡＧＳ１６、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＧＰＮＭＢ及びＰＭＳＡが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、前記癌マーカーはＣＤ２０またはＨＥＲ２である。他の好ましい実施形態では、抗体または抗体様分子は、免疫細胞、好ましくは炎症性サイトカイン産生免疫細胞上のマーカーを対象とする。本明細書で用いられる場合、免疫細胞は免疫系に属する細胞であり、単球、樹状細胞及びＴ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、前記免疫細胞は炎症促進性サイトカイン産生細胞である。
炎症性サイトカイン産生細胞のマーカーは当業者に公知であり、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２６、シアロアドヘシン及びｆｌｔ３受容体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の他の態様は、癌の治療に使用するための、本発明の融合タンパク質である。本発明の更に他の態様は、自己免疫疾患の治療に使用するための、本発明の融合タンパク質である。
本発明の他の態様は、（ｉ）癌を患っている患者の癌の種類、及び癌細胞の適切な標的マーカー（１種または複数種）を決定すること、（ｉｉ）本発明の、サイトカインアンタゴニストと、抗体または抗体様分子からなる標的部分とを含む融合タンパク質を、場合によっては適切な賦形剤とともに治療を必要とする前記患者に与えることを含む、癌の治療方法である。工程（ｉｉ）の標的部分が工程（ｉ）で同定した標的マーカーを対象とするであろうことは当業者に明白である。可能な癌細胞マーカーは当業者に公知であり、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＡＧＳ１６、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＧＰＮＭＢ及びＰＭＳＡが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の更に他の態様は、（ｉ）自己免疫疾患を患っている患者において、免疫細胞の適切な標的マーカーを決定すること、（ｉｉ）本発明の、サイトカインアンタゴニストと、抗体または抗体様分子からなる標的部分とを含む融合タンパク質を、場合によっては適切な賦形剤とともに治療を必要とする前記患者に与えることを含む、自己免疫疾患の治療方法である。本明細書で用いられる場合、免疫細胞としては、樹状細胞、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、肥満細胞、好酸球、及び好塩基球が挙げられるが、これらに限定されない。
図１は、ナノボディ−ｈＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ融合タンパク質の構造要素を表す図である。 図２は、４−１１−ｈＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ融合タンパク質の存在下または非存在下（未処理）に、ＨＬ１１６細胞（Ａ）及びＨＬ１１６−ｍＬＲ１０細胞（Ｂ）において１０ｐＭのｈＩＦＮα２により誘導されたルシフェラーゼ活性の定量を示す図である。 図３は、４−１１−ｈＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ融合タンパク質の存在下または非存在下（未処理）に、ＨＬ１１６細胞（Ａ）及びＨＬ１１６−ｍＬＲ１０細胞（Ｂ）において１ｐＭのＩＦＮβにより誘導されたルシフェラーゼ活性の定量を示す図である。 図４は、ＣＤ２０標的ＩＦＮアンタゴニストの存在下に、未処理（左側のパネル）、５０ｐＭのｈＩＦＮα２による処理（中央）、または５０ｐＭのｈＩＦＮα２による処理により残留したＣＤ１９陽性及び陰性のヒトＰＢＭＣ内のｐＹ７０１−ＳＴＡＴ１のＦＡＣＳ分析を示す図である。 図５は、以下の成分により処理したＤａｕｄｉ細胞培養物の濃度を示す図である。 Ａ：未処理 Ｂ：２ｐＭのｈＩＦＮα２． Ｃ：２ｐＭのｈＩＦＮα２＋１μｇ／ｍｌの２ＨＣＤ２５−２０ｘＧＧＳ−ｈＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ Ｄ：２ｐＭのｈＩＦＮα２＋０．１μｇ／ｍｌの２ＨＣＤ２５−２０ｘＧＧＳ−ｈＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ Ｅ：２ｐＭのｈＩＦＮα２＋３μｇ／ｍｌの２ＨＣＤ２５−２０ｘＧＧＳ−ｈＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ−Ｒ１４９Ａ Ｆ：２ｐＭのｈＩＦＮα２＋１μｇ／ｍｌの２ＨＣＤ２５−２０ｘＧＧＳ−ｈＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ−Ｒ１４９Ａ Ｇ：２ｐＭのｈＩＦＮα２＋３μｇ／ｍｌの２ＨＣＤ２５−２０ｘＧＧＳ−ｈＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ−Ｌ１５３Ａ Ｈ：２ｐＭのｈＩＦＮα２＋１μｇ／ｍｌの２ＨＣＤ２５−２０ｘＧＧＳ−ｈＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ−Ｌ１５３Ａ
実施例における材料及び方法
ナノボディ−ＩＦＮアンタゴニスト融合物の構築
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ−Ｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用し、ＩＦＮ−ＩＦＮＡＲ１結合を抑制し、ヒトＩＦＮα２の拮抗的挙動を付与する変異体Ｒ１２０Ｅ（Ｐａｎら、２００８）（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５６３６６）を、マウスレプチン受容体に対するナノボディとヒトＩＦＮα２との融合物である、ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−４．１１−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮα２構築物（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５０７８７）に導入した。
ナノボディ−ＩＦＮアンタゴニスト融合タンパク質の産生
Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞に、標準的なリポフェクタミン法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、タンパク質融合構築物をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、培養培地を収集し、−２０℃で保存した。
株化細胞
Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。ＨＬ１１６クローン（Ｕｚｅら、１９９４）は、ヒトＨＴ１０８０株化細胞に由来する。これは、ＩＦＮ誘導性６−１６プロモーターによって制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む。マウスレプチン受容体を発現する、得られたＨＬ１１６−ｍＬＲ１０クローンが記載されている（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５０７８７）。
ルシフェラーゼ活性の測定
拮抗的ＩＦＮ活性を、ＨＬ１１６細胞内及びｍＬＲを発現するＨＬ１１６−ｍＬＲ１０でＩＦＮα２またはＩＦＮβにより誘導されるルシフェラーゼ活性の阻害を定量することにより測定した。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）での非線形データ回帰を用いて算出した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ基質緩衝液（２０ｍＭトリシン、１．０７ｍＭ （ＭｇＣＯ３）４Ｍｇ（ＯＨ）２・５Ｈ２Ｏ、２．６７ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭジチオスレイトール、２７０μＭ補酵素Ａ、４７０μＭルシフェリン、５３０μＭ ＡＴＰ、最終ｐＨ ７．８）を使用し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０ルミノメーターで、ＩＦＮ刺激の６時間後に測定した。
実施例１：ナノボディ−ＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ融合タンパク質
マウスレプチン受容体に対するナノボディ４−１１を、材料及び方法に記載したようにしてＩＦＮα２変異体Ｒ１２０Ｅと融合した。図１は、マウスレプチン受容体に対するナノボディ４−１１及びヒトＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ（Ｐｉｅｈｌｅｒら、２０００におけるように番号付け）を用いて構築したナノボディ−ＩＦＮアンタゴニスト融合タンパク質の模式図を示す。
実施例２：ｍＬＲ発現細胞におけるＩＦＮα活性を標的とする阻害
親のＨＬ１１６細胞、及びマウスレプチン受容体を発現する誘導されたＨＬ１１６−ｍＬＲ１０細胞を、４−１１−ＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ融合タンパク質を発現するＨｅｋ ２９３Ｔ細胞による培養上清のいくつかの希釈物の存在下、１０ｐＭのＩＦＮα２で６時間処理した。両方の株化細胞で、１０ｐＭがＩＦＮα２のＥＣ５０に相当するので、１０ｐＭのＩＦＮα２の量を選択した。次いで、細胞を溶解し、ＩＦＮが誘発したルシフェラーゼ活性を定量した。試験を行った最も高い濃度で、４−１１−ＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ融合タンパク質は、非標的のＨＬ１１６細胞のＩＦＮα２作用を阻害することができなかった（図２Ａ）。これに対し、４−１１ナノボディの標的を発現するＨＬ１１６−ｍＬＲ１０細胞では、用量依存的阻害効果が明白である（図２Ｂ）。
実施例３：ｍＬＲ発現細胞におけるＩＦＮβ活性を標的とする阻害
ヒトＩ型ＩＦＮを構成するサブタイプの中で、ＩＦＮβが、ＩＦＮα／β受容体に対し最も高い親和力を示す。したがって、本発明者らは、４−１１−ＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ融合タンパク質もＩＦＮβの作用に対して拮抗的活性を発揮するかどうかの試験を行った。
親のＨＬ１１６細胞、及びマウスレプチン受容体を発現する誘導されたＨＬ１１６−ｍＬＲ１０細胞を、４−１１−ＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ融合タンパク質を発現するＨｅｋ ２９３Ｔ細胞による培養上清のいくつかの希釈物の存在下、１ｐＭのＩＦＮβで６時間処理した。両方の株化細胞で、１ｐＭがＩＦＮβのＥＣ５０に相当するので、１ｐＭのＩＦＮβの量を選択した。次いで、細胞を溶解し、ＩＦＮが誘発したルシフェラーゼ活性を定量した。試験を行った最も高い濃度で、４−１１−ＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ融合タンパク質は、非標的のＨＬ１１６細胞のＩＦＮα２作用を阻害することができなかった（図３Ａ）。これに対し、４−１１ナノボディの標的を発現するＨＬ１１６−ｍＬＲ１０細胞では、用量依存的阻害効果が明白である（図３Ｂ）。
実施例４：ヒトの全ＰＢＭＣ内のＢ−細胞におけるＩＦＮα２が誘発するＳＴＡＴ１リン酸化の特異的阻害
Ｉ型ＩＦＮアンタゴニストＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅを、ＧＧＳモチーフの２０リピートからなるリンカー配列を介して抗ヒトＣＤ２０ナノボディ２ＨＣＤ２５と融合した。融合タンパク質を大腸菌内で産生させ、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）は、ＣＤ１９の細胞表面発現を特徴とし得るＢ細胞の約４％を含むと予想される。循環するＢ細胞の大多数はＣＤ２０発現についても陽性である。フィコール勾配（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により、健常人ドナーの血液試料からＰＢＭＣを単離した。細胞を未処理のままにするか、１０μｇ／ｍｌの２ＨＣＤ２５ナノボディ−ＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ融合タンパク質の非存在下または存在下に、５０ｐＭのヒトＩＦＮα２と１５分間インキュベートした。次いで、細胞を固定し（ＢＤ Ｆｉｘ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ）、透過処理し（ＢＤ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ）、ＰＥ標識した抗ｐＳＴＡＴ１（ＢＤ＃６１２５６４）、及びＡＰＣ標識した抗ヒトＣＤ１９（ＢＤ ＃５５５４１５）で標識化した。ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏを用いてＦＡＣＳデータを得、ＣＤ１９陽性及び陰性細胞集団におけるｐＳＴＡＴ１と関連する蛍光について、Ｄｉｖａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ソフトウェアを用いて解析した。図４は、Ｂ細胞集団の大部分において、ＣＤ２０に対する特異的ナノボディに連結したＩＦＮアンタゴニストがＩＦＮ作用を特異的に阻害し、ＣＤ１９陰性細胞集団においてはＩＦＮ応答がそのままであることを示す。
実施例５：ＣＤ２０を標的とするＩ型ＩＦＮアンタゴニストはＩ型ＩＦＮの抗増殖性活性を阻害する
２ＨＣＤ２５ナノボディ及びＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅの融合タンパク質が、Ｂ細胞内で、ＩＦＮが誘導するＳＴＡＴ１リン酸化を特異的に阻害することが証明されたので、本発明者らは、それがＩ型ＩＦＮの抗増殖性活性を阻害し得るかどうかの試験を行った。更に、変異体Ｒ１２０Ｅの阻害と合わせ、ＩＦＮＡＲ２についてＩＦＮα２の親和力をそれぞれ１０倍及び１００倍低下させる、ＩＦＮ変異体Ｌ１５３Ａ及びＲ１４９Ａの効果を評価した。Ｄａｕｄｉ細胞は、ＣＤ２０を発現する、ヒトリンパ芽球様のＢ細胞である。Ｄａｕｄｉ細胞を、２．０×１０５細胞／ｍｌに播種し、未処理のままにするか、２ｐＭのＩＦＮα２のみの存在下、またはＣＤ２０標的ＩＦＮアンタゴニストとの組合せの存在下、７２時間培養した。次いで、それらの細胞を数え、ＩＦＮα２により誘導される増殖の阻害効果を評価した。図５は、ＣＤ２０標的ＩＦＮアンタゴニストが、ＩＦＮα２の抗増殖性活性を完全に阻害することを示す。また、ＩＦＮ−ＩＦＮＡＲ２の親和力を低下させると拮抗的活性が低下することも示され、これは、阻害効果が実際に標的アンタゴニストの結合のためであることを示している。
参考文献
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Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｍ．， Ｂｅｎｓｏｎ， Ｊ．， Ｂｌａｎｋ， Ｍ．， Ｂｒｏｄｍｅｒｋｅｌ， Ｃ．， Ｂａｋｅｒ， Ｄ．， Ｓｈａｒｐｌｅｓ， Ｋ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｚａｐａｒｙ， Ｐ． （２００９）． Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ： ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２／２３ｐ４０ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１８２， ９７−１１０．

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Ｈａｒｖｅｙ， Ｒ．Ｃ．， Ｍｕｌｌｉｇｈａｎ， Ｃ．Ｇ．， Ｃｈｅｎ， Ｉ．Ｍ．， Ｗｈａｒｔｏｎ， Ｗ．， Ｍｉｋｈａｉｌ， Ｆ．Ｍ．， Ｃａｒｒｏｌｌ， Ａ．Ｊ．， Ｋａｎｇ， Ｈ．， Ｌｉｕ， Ｗ．， Ｄｏｂｂｉｎ， Ｋ．Ｋ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｍ．Ａ．， Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｗ．Ｌ．， Ｄｅｖｉｄａｓ， Ｍ．， Ｂｏｗｍａｎ， Ｗ．Ｐ．， Ｃａｍｉｔｔａ， Ｂ．Ｍ．， Ｒｅａｍａｎ， Ｇ．Ｈ．， Ｈｕｎｇｅｒ， Ｓ．Ｐ．， Ｄｏｗｎｉｎｇ， Ｊ．Ｒ． ａｎｄ Ｗｉｌｌｍａｎ， Ｃ．Ｌ． （２０１０）． Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＣＲＬＦ２ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＪＡＫ ｋｉｎａｓｅｓ， ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＫＺＦ１， Ｈｉｓｐａｎｉｃ／Ｌａｔｉｎｏ ｅｔｈｎｉｃｉｔｙ， ａｎｄ ａ ｐｏｏｒ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｂ−ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｂｌｏｏｄ １１５， ５３１２−５３２１．

Ｈｅ， Ｒ． ａｎｄ Ｇｅｈａ， Ｒ．Ｓ． （２０１０）． Ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ （２０１０） １１８３， １３−２４．

Ｈｕｅｂｅｒ， Ｗ．， Ｓａｎｄｓ， Ｂ．Ｅ．， Ｌｅｗｉｔｚｋｙ， Ｓ．， Ｖａｎｄｅｍｅｕｌｅｂｒｏｅｃｋｅ， Ｍ．， Ｒｅｉｎｉｓｃｈ， Ｗ．， Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｐ．Ｄ．， Ｗｅｈｋａｍｐ， Ｊ．， Ｆｅａｇａｎ， Ｂ．Ｇ．， Ｙａｏ， Ｍ．Ｄ．， Ｋａｒｃｚｅｗｓｋｉ， Ｍ．， Ｋａｒｃｚｅｗｓｋｉ， Ｊ．， Ｐｅｚｏｕｓ， Ｎ．， Ｂｅｋ， Ｓ．， Ｂｒｕｉｎ， Ｇ．， Ｍｅｌｌｇａｒｄ， Ｂ．， Ｂｅｒｇｅｒ， Ｃ．， Ｌｏｎｄｅｉ， Ｍ．， Ｂｅｒｔｏｌｉｎｏ， Ａ．Ｐ．， Ｔｏｕｇａｓ， Ｇ． ａｎｄ Ｔｒａｖｉｓ Ｓ．Ｐ． （２０１２）． Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ， ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｆｏｒ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｔｏ ｓｅｖｅｒｅ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ， ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ． Ｇｕｔ ６１， １６９３−１７００．

Ｋｉｅｆｅｒ， Ｋ．， Ｏｒｏｐａｌｌｏ， Ｍ．Ａ．， Ｃａｎｃｒｏ， Ｍ．Ｐ．， ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｋ−Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ， Ａ． （２０１２）． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂ ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９０， ４９８−５０４．

Ｋｏｌｍａｒ， Ｈ． （２００８） Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｋｎｏｔ ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎｓ． ＦＥＢＳ Ｊ． ２７５， ２６８４−２６９０．

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Ｐａｎｄｅｙ， Ａ．， Ｏｚａｋｉ， Ｋ．， Ｂａｕｍａｎｎ， Ｈ．， Ｌｅｖｉｎ， Ｓ．Ｄ．， Ｐｕｅｌ， Ａ．， Ｆａｒｒ， Ａ．Ｇ．， Ｚｉｅｇｌｅｒ， Ｓ．Ｆ．， Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｗ．Ｊ． ａｎｄ Ｌｏｄｉｓｈ， Ｈ．Ｆ． （２０００）． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １， ５９−６４．

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Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ， Ａ．， Ｂｉａｎｃｈｉ， Ｅ．， Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ， Ｓ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｆ．， Ｐｅｓｓｉ， Ａ ａｎｄ Ｓｏｌｌａｚｚｏ， Ｍ． （１９９４） Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉｂｏｄｙ： ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ７， ９−２４．

Ｕｚｅ， Ｇ．， Ｄｉ Ｍａｒｃｏ， Ｓ．， Ｍｏｕｃｈｅｌ−Ｖｉｅｌｈ， Ｅ．， Ｍｏｎｎｅｒｏｎ， Ｄ．， Ｂａｎｄｕ， Ｍ．Ｔ．， Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ａ．， Ｄｏｒｑｕｅｓ， Ａ．， Ｌｕｔｆａｌｌａ， Ｇ．， ａｎｄ Ｍｏｇｅｎｓｅｎ， Ｋ．Ｅ． （１９９４）． Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｌｐｈａ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４３， ２４５−２５７．

Ｙｏｄａ， Ａ．， Ｙｏｄａ， Ｙ．， Ｃｈｉａｒｅｔｔｉ， Ｓ．， Ｂａｒ−Ｎａｔａｎ， Ｍ．， Ｍａｎｉ， Ｋ．， Ｒｏｄｉｇ， Ｓ．Ｊ．， Ｗｅｓｔ， Ｎ．， Ｘｉａｏ， Ｙ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ， Ｃ．， Ｓａｔｔｌｅｒ， Ｍ．， Ｋｕｔｏｋ， Ｊ．Ｌ．， ＤｅＡｎｇｅｌｏ， Ｄ．Ｊ．， Ｗａｄｌｅｉｇｈ， Ｍ．， Ｐｉｃｉｏｃｃｈｉ， Ａ．， Ｄａｌ Ｃｉｎ， Ｐ．， Ｂｒａｄｎｅｒ， Ｊ．Ｅ．， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｊ．Ｄ．， Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｋ．Ｃ．， Ｓｔｏｎｅ， Ｒ．Ｍ．， Ｒｉｔｚ， Ｊ．， Ｆｏａ， Ｒ．， Ａｓｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｆｒａｎｋ， Ｄ．Ａ．， Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ， Ｄ．Ｍ． （２０１０）． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ＣＲＬＦ２ ｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｂ−ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７， ２５２−２５７

Claims (13)

  1. サイトカインアンタゴニストと、抗体または抗体様分子からなる標的部分とを含む融合タンパク質。
  2. 前記サイトカインアンタゴニストが変異体サイトカインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記標的部分がナノボディである、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記サイトカインアンタゴニストがインターフェロンアンタゴニストである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  5. 前記インターフェロンアンタゴニストがＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ変異体である、請求項４に記載の融合タンパク質。
  6. 前記標的部分が、特に癌細胞のマーカーを標的とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記標的部分が、特に免疫細胞のマーカーを標的とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  8. 癌の治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  9. 自己免疫疾患の治療に使用するための、請求項１〜５及び７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  10. 前記標的部分が、特に癌細胞のマーカーを標的とする、請求項８に記載の癌の治療に使用するための融合タンパク質
  11. 前記サイトカインアンタゴニストがＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ変異体である、請求項１０に記載の癌の治療に使用するための融合タンパク質。
  12. 前記標的部分が、特に免疫細胞のマーカーを標的とする、請求項９に記載の自己免疫疾患の治療に使用するための融合タンパク質。
  13. 前記サイトカインアンタゴニストがＩＦＮα２−Ｒ１２０Ｅ変異体である、請求項１２に記載の自己免疫疾患の治療に使用するための融合タンパク質。
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