BR112016001122B1 - Proteína de fusão compreendendo um antagonista de interferon e uma fração de direcionamento - Google Patents

Abstract

DIRECIONAMENTO DE ANTAGONISTAS DE CITOCINAS A presente invenção refere- se a uma proteína de fusão, compreendendo um antagonista de citocina e uma fração de direcionamento, de preferência, um anticorpo ou molécula do tipo anticorpo. Numa modalidade preferida, o antagonista de citocina é uma citocina modificada que se liga ao receptor, mas não induz a sinalização do receptor. A invenção refere-se ainda a uma proteína de fusão de acordo com a invenção para a utilização no tratamento de câncer e distúrbios imunitários ou inflamatórios relacionados.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão que compreende um antagonista de citocina e uma fração de direcionamento, preferencialmente um anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo. Em uma modalidade preferencial, o antagonista de citocina é uma citocina modificada que se liga ao receptor, mas não induz a sinalização do receptor. A invenção refere-se ainda a uma proteína de fusão, de acordo com a invenção, para uso no tratamento de câncer ou para uso no tratamento de doenças autoimunes.

[0002] As citocinas são mediadores críticos dos mecanismos de defesa contra a invasão microbiana e tumorigênese. No entanto, sua produção e atividades devem ser fortemente reguladas para impedir a atividade excessiva que pode culminar na inflamação descontrolada e lesão tecidual, como observado de forma característica em diversas doenças autoimunes.

[0003] A artrite reumatoide é o exemplo clássico de uma doença autoimune, onde TNFα, IL-1 e IL-6 desempenham um papel proeminente no recrutamento de linfócitos e outros tipos de leucócitos que medeiam uma destruição progressiva das articulações. Foi mostrado que inibidores de TNF diminuem os sintomas, retardam a progressão da doença, e melhoram a qualidade de vida para muitos pacientes com artrite reumatoide (Moreland, 2009). Da mesma forma, um mAb que neutraliza IL-12 e IL-23 (ustekinumab) fornece uma terapia potencial para a psoríase (Elliott et al., 2009) e um antagonista do receptor da IL-1 humana recombinante, (anakinra, Kineret™), primeiramente aprovado pelo FDA em 2001 para o tratamento de artrite reumatoide, é um agente promissor para o tratamento de muitas doenças autoinflamatórias mediadas por IL-1 (Goldbach-Mansky, 2009).

[0004] Várias linhas de evidências apoiam a noção de que a superprodução de interferon do tipo I por células dendríticas plasmacitoides é a patogênese primária de várias doenças autoimunes, incluindo lúpus eritematoso sistêmico, uma doença autoimune multissistêmica que afeta a pele, rins, tecidos musculoesquelético e hematológico, e síndrome de Sjogren, uma doença caracterizada pela destruição de glândulas produtoras de lágrimas e saliva q que impacta 1-3% da população humana. De fato, se a produção de IFN natural não é regulada adequadamente, a exposição prolongada de IFN do tipo I resultante pode conduzir a produção de autoanticorpo que promove o início da doença autoimune sistêmica (Kiefer et al., 2012). Nesse sentido, novas terapêuticas que se direcionam ao IFN do tipo I foram desenvolvidas. Por exemplo, dois anticorpos monoclonais que neutralizam IFNα (Sifalimumab e Rontalizumab) estão atualmente em ensaios clínicos (McBride et al., 2012; Merrill et al., 2011) e um antagonista de IFN do tipo I também foi projetado (Pan et al., 2008), (PCT/US2009/056366).

[5] IL17A é o melhor membro caracterizado da família da IL17 de citocinas. Esta citocina pleiotrópica interage com um receptor composto por subunidades de IL17RA e IL17RC. A cadeia de IL17RA é expressa de forma ubíqua, incluindo tipos celulares hematopoiéticos, imunes, epiteliais, endoteliais, bem como fibroblastos. IL17A é normalmente produzida pelas células Th17 após a ativação de um subconjunto de citocinas, incluindo IL- 1, IL-6, IL-21 e TGFβ, e propaga sinais inflamatórios antecipados que servem para criar respostas imunes inatas e adaptativas. IL17 é um potente ativador de neutrófilos e desempenha um papel importante na defesa imune contra vários patógenos extracelulares. Também está bem estabelecido que a IL17A promove patologias autoimunes (Gaffen, 2009; Shen & Gaffen, 2008). Brodalumab, Secukinumab e Ixekizumab se direcionam ao eixo da IL17A/IL17R para o tratamento de doenças autoimunes, tais como psoríase e doença de Crohn. Todos podem infligir efeitos colaterais adversos, incluindo maior risco de infecções (Hueber et al. 2012; Spuls & Hooft, 2012). O direcionamento específico de antagonistas da IL17A a tipos celulares selecionados, tais como epitélio das vias aéreas (asma), astrócitos (esclerose múltipla), sinoviócitos e monócitos/macrófagos (artrite reumatoide) ou queratinócitos (psoríase), pode, portanto, oferecer uma vantagem significativa sobre a função completa da IL17 de antagonização.

[6] IL1α e ILβ são os membros fundadores da família da citocina IL1. Ambos são pleiotrópicos e funcionam através de um complexo de receptor expresso de forma ubíqua composto pelo tipo I do receptor da IL-1 (IL-1RI) e proteína acessória do receptor da IL-1 (IL-1RAcP). A superativação deste eixo da IL-1 está associada a muitas patologias humanas, incluindo artrite reumatoide (RA), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, doenças inflamatórias do intestino, esclerose múltipla, aterosclerose e doença de Alzheimer. Muitas células imunes de diferentes linhagens são ativadas pela IL-1, incluindo células imunes inatas, tais como células dendríticas, macrófagos e neutrófilos, e também células envolvidas na resposta imune adaptativa, incluindo células virgens, Th17 e T CD8+, e células B (revisto em Sims e Smith, 2010). A IL-1RA humana recombinante (antagonista do receptor da IL1, mais conhecido como anakinra) pode ser usada para tratar a artrite reumatoide e está sendo avaliada para uso em um amplo espectro de doenças autoinflamatórias (Dinarello, 2011). Um dos maiores efeitos colaterais do tratamento prolongado com anakinra é, entretanto, a maior ocorrência de infecções. A antagonização seletiva da atividade da IL-1 em apenas um subconjunto de células (imunes) pode, portanto, oferecer uma alternativa segura. Pode-se considerar que a inibição direcionada da ação da IL-1 sobre células imunes inatas selecionadas, deixando sua atividade no compartimento de células T intacta, pode ainda mostrar eficácia para o tratamento de doenças inflamatórias, sem afetar a defesa do hospedeiro contra patógenos.

[7] Embora a citocina relacionada à IL-7 TSLP (linfopoietina estromal tímica) seja melhor estudada o contexto da promoção de respostas de Th2, está claro agora que ela funciona em vários tipos celulares imunes e não- imunes (revisto em Roan et al., 2012). Seu receptor é composto pela IL- 7Rα, que é compartilhada com a IL-7, e a TSLPRα amplamente expressa, também conhecida como CRLF2 (Pandey et al., 2000). A TSLP promove a inflamação do tipo Th2 pela ativação de vários tipos celulares distintos, incluindo células dendríticas, células T CD4 e CD8, células B, células NKT, mastócitos, eosinófilos e basófilos. Ela apoia a defesa do hospedeiro contra parasitas helmintos, mas pode contribuir para a inflamação alérgica, e a TSLP de antagonização foi sugerida como um tratamento para doenças alérgicas. Por outro lado, a TSLP pode ter um papel protetor em doenças inflamatórias conduzidas pelas respostas exacerbadas de Th1 e Th17, tais como a Doença Inflamatória Intestinal (revisto em He e Geha, 2010 e Roan et al., 2012). Descobriu-se recentemente que mutações na TSLPRα estão associadas a câncer, incluindo leucemias com mau prognóstico (Harvey et al., 2010; Yoda et al., 2010; Ensor et al., 2011), e os níveis de TSLP estão correlacionados à progressão do câncer de mama (Olkhanud et al., 2011) e menor sobrevida no câncer pancreático (De Monte et al., 2011). O direcionamento seletivo de antagonistas de TSLP a tipos celulares de tumor selecionados pode, portanto, oferecer uma estratégia antitumoral seletiva, e a modulação adicional pelo antagonismo direcionado de células imunes selecionadas pode ser usada para otimizar ainda mais essa estratégia. Abordagens semelhantes também poderiam ser experimentadas para doenças não-malignas.

[8] O problema principal com as abordagens terapêuticas com o objetivo de neutralizar as ações das citocinas é que os antagonistas das citocinas não são direcionados às células ou aos tecidos que estão especificamente envolvidos no início das doenças autoimunes ou autoinflamatórias. Por exemplo, é facilmente previsível que uma neutralização sistêmica a longo prazo da atividade do IFN do tipo I por um anticorpo monoclonal ou um antagonista do receptor de IFN carregam um importante risco em termos de suscetibilidade à infecção viral e de desenvolvimento de tumores uma vez que o IFN do tipo I é uma família de proteínas essenciais no controle de infecções virais e para o estabelecimento de respostas imunes, particularmente aquelas que controlam o crescimento de células cancerosas (Gajewski et al., 2012). Da mesma forma, espera-se que uma neutralização sistêmica da atividade da IL-1 tenha impacto na expansão, função efetora, localização do tecido, e resposta de memória de células T citotóxicas para antígeno durante as respostas imunes (Ben-Sasson et al., 2013).

[9] Surpreendentemente, descobrimos que o direcionamento específico do antagonista de citocina a um subconjunto de células alvos permite a obtenção do efeito terapêutico, sem ter os efeitos colaterais negativos da aplicação do antagonista de citocina sistêmico. A invenção é exemplificada pelo direcionamento da ação de um antagonista de IFN do tipo I a tipos celulares específicos que expressam um determinado marcador de superfície celular. Esse método é aplicado no projeto e construção de um antagonista de IFN direcionado que inibe a ação do IFN endógeno especificamente no subconjunto de células culposamente envolvido no início de doenças autoimunes, deixando as outras células e órgãos totalmente responsivos.

[10] Embora ainda não aprovados, vírus oncolíticos estão avançando em ensaios clínicos (Russell et al., 2012). Os vírus oncolíticos são frequentemente projetados para ter capacidade de replicação atenuada em tecidos normais pela engenharia de sua sensibilidade às respostas antivirais celulares normais mediadas por interferon. Um exemplo é um vírus oncolítico da estomatite vesicular que codifica o interferon β (Naik et al., 2012). O efeito terapêutico desses vírus é esperado como sendo uma consequência do defeito da resposta do IFN exibido por muitas células tumorais. No entanto, a heterogeneidade genética dos tumores que impactam a resposta do IFN é altamente variável e prejudica a eficácia da lise do tumor mediada por vírus (Naik e Russell, 2009). Portanto, ao inibir a resposta do IFN especificamente nas células tumorais, um antagonista do IFN direcionado ao tumor permitiria a destruição específica das células tumorais por um vírus oncolítico.

[11] Um primeiro aspecto da invenção é uma proteína de fusão que compreende um antagonista de citocina e uma fração de direcionamento consistindo num anticorpo ou numa molécula semelhante a anticorpo. Um antagonista de citocina, como usado aqui, pode ser qualquer antagonista de citocina conhecido aos versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a, um receptor solúvel, um anticorpo de ligação a citocina ou uma citocina mutante. Preferencialmente, o referido antagonista de citocina é uma citocina mutante, ainda mais preferencialmente, um mutante que se liga ao receptor, mas não induz ou induz apenas fracamente a sinalização de citocina. Preferencialmente, a afinidade do mutante pelo receptor é comparável àquela da citocina do tipo selvagem, ainda mais preferível, ele tem uma maior afinidade; preferencialmente, a sinalização induzida pelo mutante é menor que 20% daquela do tipo selvagem, ainda mais preferencialmente, menor que 10% daquela do tipo selvagem, ainda mais preferencialmente, menor que 5%, ainda mais preferencialmente, menor que 1%. Mais preferencialmente, a ligação da citocina mutante não resulta em sinalização detectável. Esse mutante pode agir como um inibidor competitivo da sinalização da citocina. Um anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo, como usado aqui, é uma proteína especificamente projetada para ligar outra molécula, preferencialmente uma molécula proteinácea, e que compreende os domínios de ligação específicos. Como um exemplo não limitante, o referido anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo pode ser um anticorpo de cadeia pesada (hcAb), anticorpo de domínio único (sdAb), minicorpo (minibody) (Tramontano et al., 1994), o domínio variável do anticorpo de cadeia pesada de camelídeo (VHH), o domínio variável do novo receptor de antígeno (VNAR), affibody (Nygren et al., 2008), alphabody (WO2010066740), domínio de repetição de anquirina projetado (DARPins) (Stumpp et al., 2008), anticalina (Skerra et al., 2008), knottin (Kolmar et al., 2008) e domínio CH2 projetado (nanoantibodies; Dimitrov, 2009). A definição, como usada aqui, exclui a cauda Fc (sem os domínios de ligação) de um anticorpo. Preferencialmente, o referido anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo consiste numa cadeia polipeptídica única, ainda mais preferencialmente, o referido anticorpo não é modificado após a tradução. Modificação pós-traducional, como usado aqui, indica as modificações carregadas pela célula viva durante ou após a síntese proteica, mas exclui modificações, preferencialmente modificações químicas, carregadas na proteína isolada, tais como, mas não limitadas a, peguilação. Ainda mais preferencialmente, o referido anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo compreende as regiões determinantes de complementariedade derivadas de um anticorpo. Mais preferencialmente, o referido anticorpo de direcionamento, ou molécula semelhante a anticorpo, é um nanocorpo (nanobody).

[12] Preferencialmente, o referido antagonista de citocina e a referida fração de direcionamento são conectados por um ligante, preferencialmente, um ligante GGS. Preferencialmente, o referido ligante GGS contém pelo menos 5 repetições GGS, mais preferencialmente pelo menos 10 repetições GGS, ainda mais preferencialmente pelo menos 15 repetições GGS, mais preferencialmente pelo menos 20 repetições GGS.

[13] Numa modalidade preferida, o antagonista de citocina de acordo com a invenção é um antagonista do interferon; ainda mais preferencialmente, é um IFNα2-R120E mutante. Numa outra modalidade preferida, o antagonista de citocina de acordo com a invenção é um antagonista de uma citocina da família IL17, de preferência um antagonista IL17A. Em ainda outra modalidade preferida, o antagonista de citocina de acordo com a invenção é um antagonista da família das citocinas IL-1, de um modo preferido um antagonista de IL1α ou ILβ. Em ainda outra modalidade preferida, o antagonista de citocina de acordo com a invenção é um antagonista de TSLP.

[14] Numa modalidade preferida, um anticorpo ou molécula do tipo anticorpo é direcionado contra um marcador de células cancerosas. Marcadores de celulares cancerosas são conhecidos pela pessoa versada na técnica e incluem, mas não estão limitados a, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD56, CD70, CD74, CD138, AGS16, HER2, MUC1, GPNMB e PMSA. Preferencialmente, o referido marcador de câncer é CD20 ou HER2.

[15] Numa outra modalidade preferida, o anticorpo ou molécula do tipo anticorpo é direcionado contra um marcador numa célula imune, de preferência uma produção de citocina inflamatória de células imunes. Uma célula imune, tal como se utiliza aqui, é uma célula que pertence ao sistema imune, incluindo mas não se limitando a, monócitos, células dendríticas e células T. De preferência, a referida célula imune é uma célula pró- inflamatória de produção de citocina.

[16] Os marcadores de células produtoras de citocinas inflamatórias são conhecidas pela pessoa versada na técnica e incluem, mas não estão limitados a, CD4, CD11b, CD26, sialoadesina e receptor de flt3.

[17] Outro aspecto da invenção é uma proteína de fusão de acordo com a invenção para utilização no tratamento do câncer. Ainda um outro aspecto da invenção é uma proteína de fusão de acordo com a invenção para utilização no tratamento de doenças autoimunes.

[18] Outro aspecto da invenção é um método para tratar o câncer, que compreende (i) a determinação do tipo de câncer e o(s) marcador(es) de direcionamento adequado(s) para as células de câncer em um paciente que sofre de câncer (ii) fornecendo ao referido paciente com necessidade de tratamento de uma proteína de fusão que compreende um antagonista de citocina e uma fração de direcionamento que consiste num anticorpo ou uma molécula do tipo anticorpo de acordo com a invenção, eventualmente com um excipiente adequado. É óbvio para a pessoa versada na técnica que a fração de direcionamento do passo (ii) irá ser direcionada para o marcador de direcionamento identificado no passo (i). Possíveis marcadores de celulares cancerosas são conhecidos pela pessoa versada na técnica e incluem, mas não estão limitados a, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD56, CD70, CD74, CD138, AGS16, HER2, MUC1, GPNMB e PMSA.

[19] Ainda um outro aspecto da invenção é um método de tratar uma doença autoimune, compreendendo: (i) a determinação em um paciente que sofre de uma doença autoimune o(s) marcador(es) de direcionamento adequado(s) para as células imunes (ii) fornecendo ao referido paciente com necessidade do tratamento de uma proteína de fusão que compreende um antagonista de citocina e uma fração de direcionamento que consiste num anticorpo ou uma molécula do tipo anticorpo de acordo com a invenção, eventualmente com um excipiente adequado. As células imunes, tal como utilizado aqui, incluem, mas não estão limitados a células dendríticas, células T CD4 e CD8, células B, células NKT, mastócitos, eosinófilos e basófilos. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[20] Figura 1: Representação dos elementos estruturais da proteína de fusão de nanocorpo-hIFNα2-R120E.

[21] Figura 2: Quantificação da atividade de luciferase induzida por 10 pM hIFNα2 na presença ou ausência (não tratada) da proteína de fusão 4-11-hIFNα2-R120E nas células HL116 (A) e HL116-mLR10 (B).

[22] Figura 3: Quantificação da atividade de luciferase induzida por 1 pM IFNβ na presença ou ausência (não tratada) da proteína de fusão 4-11- hIFNα2-R120E nas células HL116 (A) e HL116-mLR10 (B).

[23] Figura 4: Análise de FACS de pY701-STAT1 em PBMC humanas CD19 positivas e negativas não tratadas (painel da esquerda), tratadas com 50 pM de hIFNα2 (centro) ou com 50 pM de hIFNα2 na presença do antagonista de IFN direcionado por CD20.

[24] Figura 5: Densidade das culturas de células de Daudi tratadas pelos seguintes componentes:

[25] A: Não-tratadas

[26] B: hIFNα2. 2 pM

[27] C: hIFNα2. 2 pM + 2HCD25-20xGGS-hIFNα2-R120E. 1μg/ml

[28] D: hIFNα2. 2 pM + 2HCD25-20xGGS-hIFNα2-R120E. 0,1μg/ml

[29] E: hIFNα2. 2 pM + 2HCD25-20xGGS-hIFNα2-R120E-R149A. 3μg/ml

[30] F: hIFNα2. 2 pM + 2HCD25-20xGGS-hIFNα2-R120E-R149A. 1μg/ml

[31] G: hIFNα2. 2 pM + 2HCD25-20xGGS-hIFNα2-R120E-L153A. 3μg/ml

[32] H: hIFNα2. 2 pM + 2HCD25-20xGGS-hIFNα2-R120E-L153A. 1μg/ml

EXEMPLOS Materiais & Métodos para os exemplos Construção de fusão do antagonista de Nanocorpo-IFN.

[33] Usando o Kit QuikChange II-E Site-Directed Mutagenesis (Agilent), a mutação de R120E que anula a ligação de IFN-IFNAR1 e confere um comportamento antagonístico de IFNα2 humano (Pan et al., 2008), (PCT/US2009/056366), foi introduzida na construção de pMET7 SIgK-HA-4,11-His-PAS-ybbr-IFNα2 (PCT/EP2013/050787), que é uma fusão entre um nanocorpo contra o receptor de leptina de murino e o IFNα2 humano.

Produção da proteína de fusão do antagonista de IFN-nanocorpo

[34] Células 293T HEK foram transfectadas com as construções de proteína de fusão utilizando o método padrão de lipofetamina (Invitrogen). 48 horas após a transfecção os meios de cultura foram colhidos e armazenados a -20°C.

Linhas celulares

[35] Células 293T HEK foram cultivados em DMEM suplementado com 10% de FCS. O clone HL116 (Uze et al., 1994) é derivado a partir da linha celular HT1080 humana. Ela contém o gene luciferase de pirilampo controlado pelo promotor 6-16 de IFN induzível. O clone de HL116-mLR10 derivado que expressa o receptor de leptina de murídeo foi descrito (PCT/EP2013/050787).

Medição das atividades de luciferase

[36] Atividades antagonistas de IFN foram medidas pela quantificação da inibição da atividade de luciferase induzida em células HL116 e na HL116-mLR10 expressando o mLR por IFNα2 ou IFNβ. Os valores de IC50 foram calculados usando regressão não linear de dados com o software Prism (GraphPad). Atividades de luciferase foram determinadas com um luminómetro Berthold Centro LB960 utilizando um tampão de substrato de luciferase (Tricina de 20 mM, 1,07 mM, (MgCO3)4Mg(OH)2^5H2O, 2,67 mM de MgSO4^7H2O, EDTA de 0,1 mM, 33,3 mM de ditiotreitol, 270 μM de coenzima A, luciferina de 470 μM , 530 μM de ATP, pH final de 7,8) 6 hr após estimulação de IFN.

Exemplo 1: A proteína de fusão de nanocorpo-IFNα2-R120E.

[37] O nanocorpo 4-11, direcionado contra o receptor de leptina de murino foi fundido com o IFNα2 R120E mutante, tal como descrito nos materiais e métodos

[38] A Figura 1 mostra uma representação esquemática da proteína de fusão de IFN-antagonista de nanocorpo construído com o nanocorpo 411 contra o receptor de leptina murina e a IFNα2-R120E humana (numeração como em Piehler et al., 2000).

Exemplo 2: Inibição direcionada da atividade de IFNα nas células que expressam mLR

[39] As células HL116 parentais e as células HL116-mLR10 derivados que expressam o receptor de leptina de rato foram tratadas durante 6 horas com 10 pM IFNα2 na presença de várias diluições de meio de cultura condicionado por células 293T Hek que expressam a proteína de fusão 4-11-IFNα2-R120E. A dose de 10 pM IFNα2 foi escolhida porque ela corresponde a IFNα2 CE50 em ambas as linhas celulares. As células foram em seguida lisadas e a atividade da luciferase induzida por IFN foi quantificada. Na concentração mais elevada testada, a proteína de fusão 4- 11-IFNα2-R120E foi incapaz de inibir a ação de IFNα2 nas células HL116 não direcionadas (Figura 2A). Em contraste, o seu efeito de inibição dependente da dose é claro nas células HL116-mLR10 que expressam o alvo do nanocorpo 4-11 (Figura 2B).

Exemplo 3: Inibição direcionada da atividade de IFNβ nas células que expressam mLR

[40] Entre os subtipos que constituem o IFN do tipo I humano, o IFNβ apresenta a afinidade mais elevada para o receptor IFNα/β. Nós, portanto, testamos se a proteína de fusão 4-11-IFNα2-R120E exerce também uma atividade antagonista contra a ação de IFNβ.

[41] As células HL116 parentais e as células HL116-mLR10 derivados que expressam o receptor de leptina de rato foram tratadas durante 6 horas com 1 pM IFNβ na presença de várias diluições de meio de cultura condicionado por células 293T Hek que expressam a proteína de fusão 4-11-IFNα2-R120E. A dose de 1 pM IFNβ foi escolhida porque ela corresponde ao IFNβ CE50 em ambas as linhas celulares. As células foram em seguida lisadas e a atividade da luciferase induzida por IFN foi quantificada. Na maior concentração testada, a proteína de fusão 4-11- IFNα2-R120E foi incapaz de inibir a ação de IFNα2 nas células HL116 não direcionadas (Figura 3A). Em contraste, o seu efeito de inibição dependente da dose é claro nas células HL116-mLR10 que expressam o alvo do nanocorpo 4-11 (Figura 3B).

Exemplo 4: A inibição específica da fosforilação de STAT1 induzida por IFNα2 em células B dentro de PBMC humano inteiro

[42] O antagonista de IFN do tipo I IFNα2-R120E foi fundido com o nanocorpo CD20 anti-humano 2HCD25 através de uma sequência ligante, feito com 20 repetições de GGS motivo. A proteína de fusão foi produzida em E. coli e purificada por meio de cromatografia de Afinidade de Metal Imobilizado (IMAC).

[43] As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) são esperados para conter ~4% de células-B, que podem ser caracterizadas pela expressão de CD19 na superfície celular. A grande maioria das células B em circulação são também positivas para a expressão de CD20.

[44] As PBMC foram isoladas sobre gradiente de Ficoll (Histopaque- 1077, Sigma-Aldrich) a partir de amostras de sangue de doadores saudáveis. As células foram deixadas sem tratamento ou foram incubadas durante 15 minutos com 50 pM de IFNα2 humano na ausência ou na presença de 10μg/ml do nanocorpo 2HCD25 - proteína de fusão-IFNa2- R120E.

[45] As células foram então fixadas (BD Fix Tampão I), permeabilizadas (BD Perm Tampão III) e marcadas com anti pSTAT1 marcado com PE (BD # 612564) e CD19 humano anti com marcado APC (BD # 555415). Dados de FACS foram adquiridos utilizando um BD FACS Canto e analisados utilizando o software Diva (BD Biosciences) para a fluorescência associada a pSTAT1 nas populações de células CD19 positivas e negativas.

[46] A Figura 4 mostra que o antagonista de IFN ligado ao nanocorpo específico para CD20 inibe a ação de IFN especificamente na maior parte da população de células B, deixando intacta a resposta de IFN na população de células CD19 negativas.

Exemplo 5: O antagonista de IFN do tipo I direcionado por CD20 inibe a atividade antiproliferativa de IFN do tipo I.

[47] Tendo estabelecido que a proteína de fusão do nanocorpo 2HCD25 e IFNα2-R120E inibe especificamente a fosforilação de STAT1 induzida por IFN nas células-B, nós testamos se pode inibir a atividade antiproliferativa do IFN do tipo I. Além disso, avaliou-se o efeito das mutações IFN L153A e R149A que diminuem a afinidade de IFNα2 para IFNAR2 por um fator de 10 e 100, respectivamente, em combinação com a mutação de inibição de R120E.

[48] Células de Daudi são uma linha de células B de linfoblastóides humanos que expressam CD20. Células de Daudi foram semeadas a 2,0x105 células/ml e foram deixadas sem tratamento ou cultivadas durante 72 h na presença de apenas 2 pM IFNα2 ou em combinação com vários antagonistas de IFN direcionado por CD20. Elas foram, em seguida, contadas para estimar a eficácia da inibição da proliferação induzida por IFNα2. A Figura 5 mostra que o antagonista de IFN direcionado por CD20 inibe totalmente a atividade antiproliferativa de IFNα2. Ela também mostra que a diminuição da afinidade de IFN-IFNAR2 diminui a atividade antagonista, comprovando que o efeito inibidor é, na verdade, devido à ligação do antagonista direcionado. REFERÊNCIAS Ben-Sasson, S.Z., Hogg, A., Hu-Li, J., Wingfield, P., Chen, X., Crank, M., Caucheteux, S., Ratner-Hurevich, M., Berzofsky, J.A., Nir-Paz, R., et al. (2013). 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Claims (8)

1. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende um antagonista de interferon e uma fração de direcionamento, em que: o antagonista de interferon é um IFNα2 humano compreendendo uma mutação R120E; e a fração de direcionamento consiste em um anticorpo ou uma molécula do tipo anticorpo que fornece direcionamento específico da célula da atividade antagonística.

2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida fração de direcionamento compreende um domínio variável do anticorpo de cadeia pesada (VHH).

3. Proteína de fusão, de acordo coma reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida fração de direcionamento é especificamente direcionada para um marcador de uma célula cancerosa.

4. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a referida fração de direcionamento é especificamente direcionada para um marcador de uma célula imune.

5. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que referida fração de direcionamento é especificamente direcionada para CD20.

6. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende um antagonista de citocina e uma fração de direcionamento, em que: o antagonista de citocina compreende um IFNα2-R120E humano; e a fração de direcionamento compreende um domínio variável do anticorpo de cadeia pesada (VHH) especificamente direcionado para CD20.

7. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ligante conectando o antagonista de interferon e a fração de direcionamento.

8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que é para utilização no tratamento de uma doença autoimune.