JP2016519120A - 凝固因子タンパク質に対する免疫寛容を誘導するための組成物 - Google Patents

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Abstract

本明細書で提供されるのは、凝固因子タンパク質の寛容を誘導するための複合体であり、ここで該複合体は凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体およびシグレックリガンドを含む。該複合体を含む医薬組成物、方法およびキットも提供される。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年４月２８日出願の米国仮出願第６１／８１６，７９０号の権利を主張し、該仮出願は参照することによりその全体が本明細書で援用される。
電子的提出物の参照による援用
その全体を本明細書の一部として援用するのは、本明細書に添付して同時に提出するコンピュータ読取可能な配列表であり次のように特定される：２０１４年３月２５日作成の「配列表ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名されたファイル（９０，２５２バイトＡＳＣＩＩ（テキスト））。
凝固因子補充療法の発達は、血友病等の血液凝固障害を有する多数の個体の生活を一変させてきた。血友病は、血液凝固を制御する身体の能力を損なう、遺伝性の遺伝子疾患の一群である。血友病の患者は、効率的な血液凝固に必要である、適度な量の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質を産生しない。重度の血友病患者においては軽い傷でさえも、数日または数週間と続く血液をもたらし得て、完全な回復がされえず、関節および他の器官に対する衰弱させる恒久的損傷、ならびに若死にの可能性をもたらす。血友病Ａは、最も頻度の高い遺伝性凝固障害であり、男性５０００人当たり１人の推定発現率を有する。それは、血液凝固の内因系の重要な要素である、ＦＶＩＩＩの欠失または構造的欠陥に起因する。血友病Ａの現行の治療には、ヒトＦＶＩＩＩの静脈注射が含まれる。ヒトＦＶＩＩＩは、約３００ｋＤの一本鎖分子として組換えで生産されている。それは、構造ドメインＡ１‐Ａ２‐Ｂ‐Ａ３‐Ｃ１‐Ｃ２からなる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２９：１１‐２２（２００３））。前駆物質は、ゴルジ装置において２００ｋＤ（重）および８０ｋＤ（軽）の二本のポリペプチド鎖にプロセシングされ、二本の鎖は金属イオンにより結合されている（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３５２（１９８８）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：２９７９（１９８６））。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ、９０ｋＤのＡ１‐Ａｓ重鎖プラス８０ｋＤの軽鎖）もまた血友病Ａの補充療法として効果的であることが示されたので、ＦＶＩＩＩのＢドメインは不要と思われる。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列は、Ｂドメインの１４個のアミノ酸以外のすべての欠失を含む。
血友病Ａ患者は、現在は要求に応じてＦＶＩＩＩの静脈投与により治療され、または予防的治療として週に数回投与されている。予防的治療のために週に三回、ＦＶＩＩＩの１５〜２５ＩＵ／体重ｋｇが与えられる。それは、患者において絶えず求められ。男性における短い半減期のためにＦＶＩＩＩは、頻繁に投与されなければならない。完全長タンパク質に対する３００ｋＤ以上の大きなサイズにもかかわらず、ＦＶＩＩＩはヒトにおいてわずか約１１時間という半減期しか有さない。（Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ ａｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４１：１‐１６（２００４））。
治療の重大な制限は、患者の免疫系が外因的に投与されたＦＶＩＩＩに対する抗体を発生する可能性である（Ｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ８：１‐１１（２００２））。阻害抗体の主要エピトープは、Ａ２ドメイン内の残基４８４‐５０８に、Ａ３ドメイン内の残基１８１１‐１８１８に、およびＣ２ドメイン内に位置する。残念ながら抗体の発生が、多数の患者における補充療法としてのＦＶＩＩＩの使用を妨げている。
補充療法を効果的にするために、いかなる望ましくない免疫応答をも防ぐことが極めて重要である。望ましくない免疫応答を防止または除去するための方法、特にバイオ療法に対しては多数の欠点がある。望ましくない免疫応答に関する現在の治療は、感染への感受性を増加させ得る、例えば化学抑制剤またはＢ細胞枯渇療法（ＲＥＦＳ）等の広域免疫抑制をしばしば含む。
従って当該技術分野において、患者における凝固因子バイオ治療剤に対する抗体応答を防止し、寛容性を誘導し得る組成物および方法に対する必要性が残っている。
本実施形態は、ＦＶＩＩＩ等の血液凝固因子の、望ましくない抗体免疫反応を防止または減少し、および免疫寛容を誘導するための組成物および方法を提供する。
一態様において凝固因子タンパク質の寛容を誘導するための複合体が提供され、ここで該複合体は凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体およびシグレックリガンドを含む。いくつかの実施形態においてシグレックリガンドは、抑制型シグレックに対するリガンドである。いくつかの実施形態においてシグレックリガンドは、シグレック‐１（ＣＤ１６９）、シグレック‐２（ＣＤ２２）、シグレック‐３（ＣＤ３３）、シグレック‐４（ＭＡＧ）、シグレック‐５、シグレック‐６、シグレック‐７、シグレック‐８、シグレック‐９、シグレック‐１０、シグレック‐１１およびシグレック‐１２より選択されるシグレックに結合する。いくかの実施形態においてシグレックは、Ｂリンパ球の表面に発現される。いくかの実施形態においてシグレックリガンドは、Ｂ細胞シグレック‐２（ＣＤ２２）リガンドである。いくかの実施形態においてシグレックリガンドは、シグレックＧ／１０リガンドである。いくつかの実施形態において凝固因子タンパク質は、シグレック‐２リガンド等のリガンドに、直接的または間接的に共有結合または非共有結合により結合されている。
他の態様において、被験者における寛容を誘導するために効果的な量の複合体を含む医薬組成物が提供される。
他の態様において、被験者における凝固因子タンパク質に対する寛容を誘導する方法が提供され、該方法は、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体およびシグレックリガンドを含む、効果的な量の複合体を被験者に投与することを含む。
いくつかの実施形態において複合体は、リポソーム等の小粒子をさらに含み、ならびに凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体およびシグレックリガンドがリポソームの表面に提示される。いくつかの実施形態において、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくはその変異体およびシグレックリガンドは、小粒子により結合される。
いくつかの実施形態においてシグレックリガンドは、９‐Ｎ‐ビフェニルカルボキシル‐ＮｅｕＡｃα２‐６Ｇａｌ〜１‐４ＧｌｃＮＡｃ（６´‐ＢＰＣＮｅｕＡｃ）、ＮｅｕＡｃａ２‐６Ｇａｌ〜１‐４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕＡｃａ２‐６Ｇａｌ〜１‐４（６‐スルホ）ＧｌｃＮＡｃおよびその組み合せから成る群より選択されるグリカンである。
いくつかの実施形態において凝固因子タンパク質は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、および第ＸＩ因子およびその組み合せから成る群より選択される。
前述の実施形態の一般的な説明および以下の詳細な説明の双方は典型的なものであり、従って実施形態の範囲を制限しないことを了解されたい。
当業者は、以下に記載する図面が説明の目的のためだけであることを理解されよう。図面は、決して本教示の範囲を制限するものではない。
抗原およびＣＤ２２リガンドを提示するリポソームによる寛容の誘導。ａ、免疫原性および免疫原性リポソームの概略図。ｂ、本研究において使用したＣＤ２２リガンドの化学構造。ｃおよびｄ、Ｔ細胞非依存性（ＮＰ；パネルｃ）およびＴ細胞依存性抗原（ＨＥＬ；パネルｄ）に対するＣＤ２２依存的寛容誘導。ＷＴまたはＣＤ２２ＫＯマウスを示す通り０日目に処理し（白矢印）、１５および３０日目に免疫原性リポソームにより負荷した（黒矢印）。データは、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．（平均値の標準誤差）を表す（ｎ＝８〜１０）。ｅ、寛容原性リポソーム上のＢＰＡＮｅｕＧｃおよびＮｅｕＧｃの力価測定。力価を免疫原性リポソームによる二回の負荷後に定量した（ｎ＝４）。ｆ、マウスを付加に呼応して異なる時間にＨＥＬに対し寛容化し、力価を免疫原性リポソームによる負荷の二週間後におよび無感作のマウスの免疫化と比較して定量した（ｎ＝４）。データは、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す（ｎ＝４）。 寛容原性リポソームは、ＢＣＲシグナル伝達を強く阻害しアポトーシスを生じる。ａ、示したリポソームにより刺激されたＩｇＭＨＥＬＢ細胞におけるカルシウム流動。ｂ、示したリポソームによる刺激の２４時間後のＩｇＭＨＥＬＢ細胞のＣＤ８６のアップレギュレーション。ｂ、示したリポソームによる刺激の三日後のＣＴＶ標識ＩｇＭＨＥＬＢ細胞のインビトロでの増殖。ｄ、示したリポソームにより２４時間処理されたＩｇＭＨＥＬＢ細胞のアネキシンＶ対ＰＩ染色。データは、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を示す（ｎ＝３）。ｅ、示したリポソームによる刺激の４日後の養子移入ＣＦＳＥ標識ＩｇＭＨＥＬＢ細胞のインビボでの増殖。ｆ、示したリポソームによる免疫化の１２日後に宿主マウスの脾臓に残存する養子移入したＬｙ５ａ＋ＩｇＭＨＥＬＢ細胞数の分析。定量値は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を示す（ｎ＝４）。 ＣＤ２２依存性寛容原性サーキットは、Ａｋｔ生存経路を阻害し、ＦｏｘＯ１の細胞核輸入を駆動する。ａ、示したリポソームまたは対照としてのＰＢＳによる細胞刺激の３０分後のＷＴおよびＣＤ２２ＫＯ ＩｇＭＨＥＬＢ細胞におけるＢＣＲシグナル伝達成分のウェスタンブロット分析。寛容原性リポソームは、すべての主要なＢＣＲシグナル伝達経路のシグナル伝達成分のリン酸化を阻害し、ＷＴ Ｂ細胞におけるＡｋｔおよびＦｏｘＯ１の低リン酸化を誘導するが、ＣＤ２２欠失ＩｇＭＨＥＬＢ細胞においては誘導しない。ｂ、示したリポソームにより２時間刺激したＩｇＭＨＥＬＢ細胞の共焦点顕微鏡観察。細胞を抗ＦｏｘＯ１、ファロイジンおよびＤＡＰＩにより染色した。挿入写真は、三倍の拡大での代表的な細胞である。 強いＴ細胞依存性抗原に対するマウスの抗原特異的寛容化。ａ〜ｂ、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、リポソーム（パネルａ）または可溶性負荷（パネルｂ）に対するＨＥＬの寛容化。ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＯＶＡの寛容化。ｄ、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＭＯＧの寛容化。ｅ、Ｂａｌｂ／ｃにおけるＦＶＩＩＩの寛容化。ｆ、寛容化は抗原特異的である。ＨＥＬまたはＯＶＡに対し寛容化されたＢａｌｂ／ｃマウスは、他の抗原に対して正常な応答を有する。マウスを示した条件により０日目に免疫化し、１５日目に免疫原性リポソームにより負荷し、ならびに２週間後の２９日目に力価を定量した。すべてのデータは、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を示す（ｎ＝４）。 ＦＶＩＩＩに対する免疫寛容化は、ＦＶＩＩＩ欠失マウスにおける出血を阻止する。ａ、記載の通り、ＷＴまたはＦＶＩＩＩ欠失マウスに０日目および１５日目に投与した。３０日目にマウスを５０Ｕ／ｋｇの組換型ヒトＦＶＩＩＩ（ｒｈＦＶＩＩＩ）または生理的食塩水で再構成した。寛容原性リポソームにより処理したＦＶＩＩＩ欠失マウスは、初期に免疫原性リポソームで処理されたマウスよりも、尾切断に続く２０分間に渡る血液が顕著に少なかった。出血保護パーセント（破線）は、ＷＴ Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける平均プラス３ＳＤ（標準偏差）によって定義される＜９．９μｌ／ｇの血液を示す。ｂ、三つの再構成群におけるＦＶＩＩＩ力価は、出血阻止は抗ＦＶＩＩＩ抗体の顕著な減少を伴うことを証明する。データは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す。有意水準を確立するためにスチューデントの両側ｔ検定を使用した；統計的有意差（ｎ．ｓ．）は、０．０５を超えるＰ値において認められない。 ＣＤ２２媒介寛容原性サーキットは、ヒトナイーブおよびヒトメモリーＢ細胞の双方において操作的である。ａ、抗ＣＤ２２またはアイソタイプの対照抗体（灰色）によるヒトナイーブ（ＣＤ１９＋ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋ＣＤ２７−；赤色）およびヒトメモリーＢ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭ−ＩｇＤ−ＣＤ２７−；青色）の染色。ｂ、高親和性ヒトＣＤ２２リガンドＢＰＣＮｅｕＡｃの構造。ｃ‐ｅ、ヒトナイーブおよびヒトメモリーＢ細胞の活性化は、カルシウム流動（パネルｃ）、ＢＣＲシグナル伝達成分のウェスタンブロット分析（パネルｄ）、およびＣＤ８６アップレギュレーション（パネルｅ）により判断される通り、リポソーム上の同種抗原（それぞれ抗ＩｇＭまたは抗ＩｇＧ）を有するＢＰＣＮｅｕＡｃの共存によって阻害される。ｆ、同種抗原およびＣＤ２２リガンドを提示するリポソームは、ヒトナイーブおよびヒトメモリーＢ細胞双方の生存率を減少させる。データは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す（ｎ＝３）。有意水準を確立するためにスチューデントの両側ｔ検定を使用した。
バイオ医薬品、特にポリペプチド剤を利用する治療の成功には、被験者の免疫系がバイオ治療薬の活性を妨害または阻害しないことが必要とされる。抗薬物抗体（ＡＤＡ）は、バイオ医薬品に関する重大な問題と認識されていて、しかも治療薬自体の免疫原性を最小化する対策が施された後も引き続き問題であった。この問題は、血液凝固障害を有する患者に提供されるバイオ医薬品の凝固因子にとって特に切迫したものであり得るが、そこでは損傷に続く血液失血を止めるためにバイオ医薬品が決定的であるからである。本明細書で記載するのは、凝固因子バイオ治療薬に対する抗原特異的寛容を誘導するための組成物および方法である。該組成物は、一または複数のシグレックリガンドに結合された、一または複数の凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体を含む。実施形態がどのように働くのかに関する理論に縛られるものではないが、寛容原性サーキットは、シグレックおよびＢ細胞受容体が凝固因子タンパク質およびシグレックリガンドを含む複合体と共に免疫シナプス中で並置されるときに、Ｂ細胞中で誘導される。
凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する寛容が血友病マウスモデルにおいて誘導され、阻害抗体の形成を防止し、引き続く負荷の際の出血を防止するためのＦＶＩＩＩの投与を可能とすることが本明細書において明らかにされる。同様に、Ｂ細胞受容体とＣＤ２２の強制ライゲーションがＢ細胞受容体シグナル伝達を停止し、マウスおよびヒトＢ細胞の双方においてアポトーシスを誘導することも本明細書において明らかにされる。同様に、寛容原性サーキットがナイーブおよびメモリーコンパートメントの双方内のヒト一次Ｂ細胞において操作的であるということも明らかにされ、それは、ポリペプチドＴ細胞依存性抗原に対する抗原特異的寛容を誘導するためにＣＤ２２およびＢ細胞受容体を会合するアプローチが、ヒトにおける既存欠陥を防止するだけでなく除去することにも適用できることを示唆する。
本明細書を説明する目的で、以下の定義が適用され、適当と認められる場合は、単数形で用いられる用語にはまた複数形が含まれるものとし、逆も同様である。以下に示すいずれかの定義が、参照することにより本明細書で援用されるいずれかの文書を含む、いずれかの他の文書におけるその語の使用法と矛盾する場合には、別段の意味が明確に意図れていない限り（例えば、用語が初めて用いられている文書中で）、以下に示す定義が常に本明細書およびその関連する請求項を説明する目的を統制する。「または（ｏｒ）」の使用は、特に明記しない限り「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。本明細書での「一（ａ）」の使用は、特に明記しない限りまたは「一または複数」の使用が明らかに不適当でない限り、「一または複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は置き換え可能であり、制限的であることを意図しない。さらに一または複数の実施形態に関する記載が用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用するところでは、当業者は、いくつかの特定の場合には実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ ｏｒ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）が専門用語「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および／または「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を使用して代わりに記載され得ることを理解するであろう。
別段の記載がない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、これらの実施形態が関連する当業者によって通常に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、多数の使用される用語の一般的な定義に関する技術の一つを提供する：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（アカデミックプレス科学・技術辞典），Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ．（編）），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ ｅｄ．（初版），１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（オクスフォード生化学・分子生物学辞典），Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．（編）），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄ．（改訂版），２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（化学百科事典），Ｋｕｍａｒ（Ｅｄ．（編）），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（微生物・分子生物学辞典），Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．（編）），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ(３ｒｄ ｅｄ．（第三版），２００２)；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（化学辞典），Ｈｕｎｔ（Ｅｄ．（編）），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ ｅｄ．（初版），１９９９）；Ｄｉｃｔｏｎａｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（医薬品辞典），Ｎａｈｌｅｒ（Ｅｄ．（編）），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ‐Ｖｅｒｌａｇ Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（有機化学辞典），Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｎａｎｄａｎｄ（Ｅｄｓ．（編）），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；およびＡ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（生物学辞典）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐａｐｅｒｂａｃｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（オクスフォード・ペーパーバック図書）），Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．（編）），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ ｅｄ．（第４版），２０００）。特別に実施形態に適用するときのこれらの用語のいくつかのさらなる説明は、本明細書で提供する。
本実施形態は、望ましくない抗体免疫応答を防止または低減し、ＦＶＩＩＩ等の血液凝固因子タンパク質の免疫寛容を誘導するための組成物および方法を提供する。
いくつかの実施形態において提供されるのは、凝固因子の寛容を誘導するための複合体であり、ここで該複合体は凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体およびシグレックリガンドを含む。いくつかの実施形態において提供されるのは、被験者において寛容を誘導するために効果的な量の複合体を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、被験者は血液凝固障害を有していて凝固因子補充療法を施されている。
いくつかの実施形態においてさらに提供されるのは、被験者において凝固因子タンパク質に対する寛容を誘導する方法であり、ここで該方法は、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体およびシグレックリガンドを含む複合体の効果的な量を被験者に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、被験者は出血性障害に罹患している。いくつかの実施形態において、被験者は凝固因子補充療法を受けている。いくつかの実施形態において出血性障害は、血友病Ａ、血友病Ｂ、第Ｘ因子欠失病およびローゼンタール症候群（血友病Ｃとしても知られる）から成る群より選択される。
いくつかの実施形態において、複合体の凝固因子部分とシグレックリガンド部分を隔てている距離は、免疫シナプスにおけるシグレックおよびＢ細胞受容体の強制ライゲーションおよび並置をもたらす、Ｂ細胞への効果的な提示を可能にする。
本明細書で用いる場合、免疫寛容（または単に「寛容」）とは、それによって免疫系が抗原を攻撃しないプロセスである。それは三つの型で生じる：中枢性寛容、末梢性寛容および後天的寛容である。寛容は「自然」または「自己寛容」のいずれかであり得て、ここで身体は自己抗原に対する免疫応答を開始せず、すなわち「寛容を誘導し」、ここで抗原に対する寛容は免疫系を操作することによって作成され得る。寛容が誘導されるとき、身体は抗原に対する免疫応答を起こし得ない。
寛容および寛容誘導の機構は複雑であり良く理解されていない。当該技術分野において周知である通り（Ｂａｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，３０ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５６６‐５７４，２０１０を参照されたい）、寛容の発生おける既知の可変要素には、抗原が存在するときのＢ細胞の分化段階、抗原型、およびサイトカインおよび補因子の産生におけるＴ細胞および他の白血球の関与が含まれる。従ってＢ細胞活性化の抑制は、免疫寛容と同一視され得ない。例えば、Ｂ細胞活性化はＢＣＲにＣＤ２２を架橋することによって阻害され得る一方で、Ｂ細胞の選択的サイレンシングは寛容の誘導を示さない。例えば、Ｎｉｋｏｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｒｅｖ．９：７７５‐７７９（２０１０）；Ｍｉｈａｙｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１２３‐１３０（２００９）；およびＣｏｕｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６：２５００‐２５０５（２００９）を参照されたい。
複合体
本明細書で用いる場合、用語「複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」とは、一または複数のシグレックリガンドが一または複数の凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体に結合されている複合体を表す。凝固因子タンパク質とシグレックリガンドは、共有結合性または非共有結合性相互作用によって、直接的にまたは間接的に結合され得る。いくつかの実施形態においてシグレックリガンドは、適切な結合化学作用により凝固因子に直接的に結合される。
シグレックリガンドと凝固因子タンパク質の複合は、当該技術分野において周知の方法に従って実施され得る。例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ（タンパク質複合と架橋の化学），Ｓｈａｎ Ｗｏｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９１）；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（バイオ複合技術），２ｎｄ ｅｄ．（第２版），Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２００８）を参照されたい。いくつかの実施形態においてシグレックリガンドは、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体に直接的に結合されている。いくつかの実施形態において、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体は、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体上での一または複数の既存の炭水化物への結合によって、シグレックリガンドに直接的に結合されている。
いくつかの実施形態において一または複数のシアル酸残基は、シグレックリガンドが結合される前に、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体から除去される。いくつかの実施形態においてシグレックリガンドは、等モル比で凝固因子ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントもしくは変異体に結合され得る。いくつかの実施形態において、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体に対するシグレックリガンドの比は、１：１、２：１、５：１、１０：１、１５：１、２５：１、３５：１、５０：１、７５：１、１００：１、２００：１、２５０：１、５００：１または１０００：１である。一実施形態において、凝固因子タンパク質または抗原性フラグメントまたはその変異体に対するシグレックリガンドの比は５０：１ないし１００：１である。
いくつかの実施形態においてシグレックリガンドは、凝固因子タンパク質または抗原性フラグメントまたは変異体、例えばＦＶＩＩＩのいずれかのドメイン上の、いずれかの利用可能なまたは操作されたシステインに直接結合される。
いくつかの実施形態において、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体およびシグレッグリガンドは、生理学的に許容可能なリンカー分子よって結合される。生理学的許容可能なリンカー分子には、例えば、水溶性溶液または懸濁液に可溶であり、シグレックリガンド‐凝固因子タンパク質複合体の薬剤的に効果的な量での哺乳動物への投与に際して副作用等の悪い影響がないポリマーが含まれる。本実施形態により使用される生理学的に許容可能なリンカーに特別な制限はない。いくつかの実施形態においてリンカーは、１から約５００の反復単位を有することによって典型的に特徴づけられる。このようなポリマーの例には、制限されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールおよびプロピレングリコール等の共重合体、等のポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（糖）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ‐アクリロイルモルフォリン）および前記のいずれかの組み合せが含まれる。
生理学的に許容可能なリンカーは、特別の構造に制限されず、直線型（例えば、アルコキシＰＥＧまたは二機能性ＰＥＧ）、分岐型またはマルチアーム型（例えば、フォーク型ＰＥＧまたはポリオールコアに結合したＰＥＧ）、樹枝状または分解性結合を有するものであり得る。さらにリンカーの内部構造は、あらゆるパターンを用いて構築され得て、ホモポリマー、交互重合体、ランダム重合体、ブロック共重合体、交互三重合体、ランダム三重合体およびブロック三重合体から成る群より選択され得る。これらのリンカーにはまた、ポリ（アルキレンオキサイド）ポリマー、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ‐アラニン）、例えばカルボキシメチルセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸およびキチン、およびポリ（メタ）クリレートも含まれる。
いくつかの実施形態においてシグレックリガンドは、生理学的に許容可能なリンカー、例えば、ＰＥＧおよび／または分岐型ＰＥＧに結合されていて、しかも生理学的に許容可能なリンカーは、それ自体が凝固因子タンパク質または抗原性フラグメントまたは変異体、例えばＦＶＩＩＩに直接的に結合されている。いくつかの実施形態において生理学的に許容可能なリンカーは、いずれかのドメイン上の既存の一または複数の炭水化物に直接的に、凝固因子タンパク質または抗原性フラグメントまたは変異体に結合され得る。いくつかの実施形態において生理学的に許容可能なリンカーは、いずれかのドメイン上のいずれかの利用可能なまたは操作されたシステインに直接的に、凝固因子タンパク質または抗原性フラグメントまたは変異体に結合され得る。いくつかの実施形態において生理学的に許容可能なリンカーは、いずれかのドメイン上のいずれかのアミノ酸に直接的に、凝固因子タンパク質または抗原性フラグメントまたは変異体に結合され得る。
一実施形態において生理学的に許容可能なリンカーは、ＰＥＧおよびその誘導体である。ＰＥＧの側鎖は、直線型、分岐型、フォーク型であり得て、またはマルチアーム型から成り得る。本実施形態により使用されるＰＥＧに特別の制限は存在しない。いくつかの実施形態においてＰＥＧは、１，０００〜２０，０００の範囲の分子量を有する。いくかの実施形態において有用なＰＥＧ分子は、例えば、ＷＯ ０３／０４０２１１；米国特許第６，５６６，５０６号；米国特許第６，８６４，３５０号；および米国特許第６，４５５，６３９号に開示されており、それらは参照することにより本明細書で援用される。他の実施形態において生理学的に許容可能なリンカーは、ポリシアル酸（ＰＳＡ）および／またはその誘導体である。ＰＳＡは、既知の方法と技術を使用して凝固因子タンパク質に結合され得る（例えば、米国特許第４，３５６，１７０号を参照されたいが、それは参照することにより本明細書で援用される）。
一の実施形態において生理学的に許容可能なリンカーは、天然に存在する多糖類、天然に存在する多糖類の誘導体、または天然に存在する多糖類の誘導体である。いくつかの実施形態において化合物の多糖類部分は、ポリマー鎖中に５個以上、典型的には少なくとも１０個以上、および他の実施形態においては少なくとも２０個ないし５０個のシアル酸残基を有する。いくつかの実施形態において多糖類化合物は、合計で５００個までの糖残基を有し得る。いくつかの実施形態において化合物中の糖残基のすべては、シアル酸残基である。糖単位は、他の官能基、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基または硫酸基、またはその組み合せ等を含み得る。これらの官能基は天然に存在する糖化合物に存在し得えて、または誘導多糖類類化合物に導入し得る。
凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体は、当業者に既知の種々の技術のいずれかによって、多糖類化合物に共有結合的に結合され得る。例には、凝固因子タンパク質または多糖類のいずれかのカルボキシル基と他方のアミノ基の間のペプチド結合による結合、または一方のカルボキシル基と他方のヒドロキシル基の間のエステル結合が含まれる。代わりにシッフ塩基が、一方のアミノ基と他方のアルデヒド基の間で形成され得る。結合の他の機構は、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。種々の例が米国特許第５，８４６，９５１号で特定されていて、それは参照することにより援用される。
本明細書で用いる場合、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体が、一または複数の生理学的に許容可能なリンカー分子に結合されているという言及には、いずれかの適当な化学結合、例えば、共有結合またはイオン性、疎水性、親和性、生体親和性等の比共有結合等が含まれる。リンカーはまた、二機能性試薬の使用によっておよびスペーサ―アームによりタンパク質と共役され得る。さらにリンカー分子は、親和性相互作用によって凝固因子タンパク質に共役され得る。例えば、凝固因子タンパク質はビオチン標識され得て、ならびにアビジンまたはストレプアビジンが結合されたポリマーは、凝固因子タンパク質に結合され得る。
リンカーは、同様に、酵素的方法、例えば、米国特許第６，３７９，９３３号に教示されるポリグリコシルトランスフェラーゼによる糖類の転移、または米国特許公開第２００４０１３２６４０号Ａ１に教示されるグリコＰＥＧ化等によって、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体に結合され得て、その教示のすべては参照することにより本明細書で援用される。
一実施形態において生理学的に許容可能なリンカーは、ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体であり、それは当該技術分野において既知のいずれかの戦略および方法によって凝固因子タンパク質に共有結合されている。いくつかの実施形態において、修飾戦略は、リジン基のアミノ基による少なくとも一つのリンカー分子の結合、炭水化物側鎖による少なくとも一つのリンカー分子の結合、スルフヒドリル基による少なくとも一つのリンカー分子の結合、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基による少なくとも一つのリンカー分子の結合、ならびにヒドロキシル基の少なくとも一つのリンカー分子の結合ならびにＮ‐末端の少なくとも一つのリンカー分子の結合である。
他の実施形態において凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体はまた、その炭水化物残基により少なくとも一つのリンカー分子に結合し得る。いくつかの実施形態においてこれは、例えば、ＮａＩＯ４等による炭水化物側鎖の穏やかな酸化によって実施され得て、アルデヒド機能の形成およびその後のＰＥＧ‐ヒドラジド等のＰＥＧへの結合を形成する。
他の実施形態は、スルフヒドリル基による凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体への、少なくとも一つのリンカー分子の結合を提供する。遊離ＳＨ基は、例えば、ＰＥＧマレイミドによって修飾され得て安定した硫化物を形成する。システイン残基のＰＥＧ化はまた、例えば、ＰＥＧ‐ビニルスルホン、ＰＥＧ‐ヨードアセトアミド、またはＰＥＧ‐オルソピリジルジスルフィドを使用して実施され得る。
いくつかの実施形態において、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体のシステイン（システイン変異体を含む）の生理学的に許容可能なリンカー、例えばＰＥＧまたはシグレックリガンドへの結合は、以下の通り実施されうる。例えば、ＦＶＩＩＩ分子は特定部位（例えば、残基１８０４）に導入されたシステインを有し得て、このＦＶＩＩＩは、２０ｍＭ ＭＯＰＳ／２０ｍＭ ＣａＣｌ２／１００ｐｐｍ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ７中で新たに調製される、１２０ｕｌのＴＣＥＰ原液（２５ｍＭ）を１２ｍＬの第ＶＩＩＩ因子（０．１５ｍｇ／ｍＬ）に、０．２５ｍＭの終濃度をあたえるように添加することによって、ＴＣＥＰにより還元される。試料を混合せずにＲＴで１時間インキュベートし、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用してＴＣＥＰを除去する。複合化の前にＦＶＩＩＩ試料を４℃で一晩インキュベートし、ＴＣＥＰによって還元されていたタンパク質のジスルフィド結合の再構成を可能とする。リガンドのマレイミド活性型をＦＶＩＩＩと混合し、４℃でロッカー上５時間インキュベートする（緩やかに混合）。複合化されたＦＶＩＩＩを未反応のリガンドから精製する。例えば、カチオン交換クロマトグラフィーを使用して、そこでは複合体を、４０％緩衝液Ｅ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ／１０ｍＭ ＣａＣｌ２／１００ｐｐｍ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．０）と６０％緩衝液Ｆ（緩衝液Ｅプラス６００ｍＭ ＮａＣｌ）のグラジエント、０．５ｍＬ／分の流速で溶出し得る。ショ糖血漿を溶出プールに溶解し１％の終濃度とし、タンパク質を−８０℃に保存し得る。
いくつかの実施形態において、リンカー（ＰＥＧ等）またはシグレックリガンドの凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体（ＦＶＩＩＩ等）への酵素的複合糖質化は、以下の通り実施され得る。シアル酸リガンド分子のＦＶＩＩＩ等の糖タンパク質上の天然のＮ‐グリカンへの酵素的結合は、三段階のプロセスで実施され得る。最初に糖タンパク質を、緩衝液、１０ｍＭ Ｈｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０中でシアリダーゼとのインキュベーションによって脱シアル化する。それからＣＭＰ‐シアル酸‐Ｇｌｙ‐リガンドを、シアル酸リガンドの転移を触媒するために、反応に適した比でＳＴ３ＧａｌＩＩＩと共に添加する。室温での１８〜２４時間のインキュベーション後に、残存するガラクトースをモル過剰のＣＭＰ‐シアル酸の添加によって、シアル酸によりキャッピングする。続いて複合糖質を、複合化レベルに従って未反応の反応物または画分から精製し得る（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーによる）。適切な活性の複合体を含む画分をプールし、２０ｍＭ ＭＯＰＳ／１０ｍＭ ＣａＣｌ２／１００ｐｐｍ Ｔｗｅｅｎ８０、１％ ショ糖 １％、ｐＨ７．０に緩衝液交換し、−８０℃に保存し得る。
いくつかの実施形態において複合体は、小粒子、例えば、金属を含むナノ粒子、ポリマーのナノ粒子、脂質を含むナノ粒子、リポソームまたは固体脂質ナノ粒子等を含む。いくつかの実施形態において小粒子は、シグレックリガンドおよび凝固因子タンパク質を間接的に連結するのに役立ち、リンパ球Ｂ細胞上の免疫シナプスにおけるそれらの並置およびシグレックおよびＢ細胞受容体の結合を促進する。いくつかの実施形態において小粒子上にあるシグレックリガンドは、Ｂ細胞表面上に発現されるシグレックを特異的に認識する糖鎖リガンド（ｇｌｙａｎ ｌｉｇａｎｄ）である。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞表面上で発現されるシグレックは、ＣＤ２２および／またはシグレックＧ／１０である。リポソーム等の小粒子への結合は、直接的または間接的であり得て、本質的に共役結合的または非共役結合的である。いくつかの実施形態において、シグレックリガンドおよび凝固因子タンパク質は、それらが小粒子の外表面上に提示されるように小粒子に結合されている。いくつかの実施形態においてシグレックリガンドおよび凝固因子タンパク質は、一つのリポソームの同じ分子に結合している。他の実施形態においてシグレックリガンドおよび凝固因子タンパク質は、一つのリポソーム上の異なる分子に結合している。
いくつかの実施形態において小粒子は、１ないし６００ｎｍの間の平均粒径を有する。いくつかの実施形態において小粒子は、１ないし５００ｎｍの間、１ないし４００ｎｍの間、１ないし３００ｎｍの間、１ないし２００ｎｍ、１ないし１５０ｎｍの間または１０ないし１００ｎｍの間の平均粒径を有する。いくつかの実施形態において小粒子の約９０％は、上記の範囲に入る粒径を有する。いくつかの実施形態において小粒子の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％は、上記の範囲に入る粒径を有する。本明細書で用いる場合、「約」は±１０％を意味する。
いくつかの実施形態においてリポソームは、典型的には親水性領域と疎水性領域を含む両親媒性分子の凝集によって得られる、水溶性粒子の多孔質構造である。リポソームの成分は、いずれかの両親媒性分子によって形成された閉じたミセルである一方、いくつかの実施形態において該成分は脂質を含み、二層構造を形成する。いくつかの実施形態においてリポソームの成分は、半流動性の、約１０ないし約２００ナノメーターの間の径の超微細な小胞である。リポソームの構造は特に制限されず、したがってユニラメラおよびマルチラメラ等のいずれかのリポソームであり得る。溶液がリポソームの内部に封入されるので、水に加えて緩衝液および生理的食塩水およびその他を使用することが可能である。
いくつかの実施形態においてリポソームは、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびポリエチレングリコール‐ジステアロイルホスホエタノールアミン（ＰＥＧ‐ＤＳＰＥ）等のリン脂質を含む。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）およびジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、スフィンゴ糖脂質およびグリセロ糖脂質を含む、他のリン脂質もまた、本実施形態のリポソームの調製において使用し得る。これらのリン脂質は、単独でまたは二以上の組み合せまたは脂質誘導体との組み合せでリポソームの作成に使用され得て、ここでコレステロール等の非極性物質またはポチエチレングリコール等の水溶性ポリマーが脂質に結合されている。
リポソームは、当該技術分野において周知の方法に従って調製され得る。例えば、リポソーム表面上へのシグレックリガンドおよび凝固因子の取り込みは、通常行われている手法のいずれかによって達成され得る。シグレックリガンドおよび凝固因子タンパク質を有するリポソームナノ粒子を産生する詳細な手法はまた、本明細書の実施例において例示される。いくつかの実施形態において複合体は、リポソームおよび組み込まれた糖鎖リガンド（例えば、ＢＰＡＮｅｕＧｃ）および第ＶＩＩＩ因子等の特異的な凝固因子タンパク質を含む。本明細書に例示する方法および手法に加えて、リポソームを調製するために当業者によって通常使用される種々の方法もまた、本実施形態において採用される。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１５：４７７８‐８６，２０１０：およびＬｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（リポソーム技術），ｖｏｌ．１，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（第２版）（ｂｙ Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｔｏｋｙｏ），Ｃｈａｐｔｅｒ ４（第４章），ｐｐ６７‐８０，Ｃｈａｐｔｅｒ １０（第１０章），ｐｐ１６７‐１８４およびＣｈａｐｔｅｒ １７（第１７章），ｐｐ２６１‐２７６（１９９３））に記載された方法が使用され得る。より具体的に適した方法には、制限されるものではないが、超音波法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、カルシウム融合法、凍結乾燥法および逆相蒸散法が含まれる。
凝固因子タンパク質
本明細書で用いる場合、「凝固因子タンパク質」とは、凝固カスケードに関与し、圧倒的に凝血促進活性を有するタンパク質を表す。凝固因子は当該技術分野において周知であり、制限するものではないが、凝固因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ，ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩおよびＸＩＩＩを含む。いくつかの実施形態において凝固因子は、血漿から濃縮され得て、または組換えで産生され得る。いくつかの実施形態において凝固因子は、天然の構成と異なるアミノ酸構成を有する。いくつかの実施形態において凝固因子は、補充療法のために投与されるならば治療的に有用であるような十分な凝血促進活性を有する。一実施形態において凝固因子は、制限するものではないが、血漿由来のＦＶＩＩＩ濃縮物または組換えで産生されるＦＶＩＩＩ等の機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド、または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）である。
本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって互いに直鎖状に結合した二以上のアミノ酸を含む、いずれかのペプチドまたはタンパク質を表す。この用語は、当該技術分野において通常には例えば、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる単鎖、およびその中には多数の種類が存在する、当該技術分野において一般的にタンパク質と呼ばれるより長い鎖の双方を表す。タンパク質は一または複数のポリペプチド鎖を含み得る。ポリペプチドは、２０個の通常天然型アミノ酸と称される２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得ること、および末端アミノ酸を含む多数のアミノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾等のナチュラル・プロセスによっても、また当該技術分野で周知の化学修飾技術によっても所定のポリペプチド中で修飾され得ること、が理解されよう。修飾には例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ‐リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋形成、シスチン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ‐カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化等のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性アミノ酸付加およびユビキチン化が含まれ得る。このような修飾は、当業者に周知である。いくつかの特に一般的な修飾、例えば、グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ‐カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ‐リボシル化は、最も基本的な教科書、例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ‐‐ＳＴＲＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＴＥＲＴＩＥＳ（タンパク質‐構造および分子的特性），２ｎｄ Ｅｄ．（第２版），Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチド中のどこでも生じ得る。実際に、共有結合修飾によるポリペプチドにおけるアミノ基またはカルボキシル基、または双方の封鎖は、天然型および合成ポリペプチドにおいて一般的であり、このような修飾は本実施形態のポリペプチドにも同様に存在し得る。ペプチドの翻訳後修飾の間に、ＮＨ２‐末端のメチオニン残基が除去され得る。従ってこれらの実施形態は、実施形態のタンパク質のメチオニンを含むおよびメチオニンを含まないアミノ末端変異体の使用を検討する。ポリペプチドにおいて生じる修飾は、しばしばポリペプチドの作り方の機能である。宿主におけるクローン化遺伝子の発現によって作成されたポリペプチドについては、例えば、修飾の性質と範囲は、宿主細胞の翻訳後修飾能およびポリペプチドのアミノ酸配列に存在する修飾シグナルによって大部分決定される。例えば、周知の通りグリコシル化は、例えば大腸菌等の細菌宿主においてはめったに生じない。従ってグリコシル化が望ましいときは、ポリペプチドはグリコシル化する宿主、一般的に真核細胞において発現すべきである。同じ型の修飾が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じ程度または様々な程度で存在し得ることが理解されよう。また所定のポリペプチドは、多数の種類の修飾を含み得る。一般的に、本明細書で用いる場合、用語・ポリペプチドは、このような全ての修飾、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現することによって合成されたポリペプチドに存在する修飾を含む。
いくつかの実施形態において凝固因子タンパク質は、組換えタンパク質、天然タンパク質または合成タンパク質であり得る。一定の実施形態において、それは組換えタンパク質である。いくつかの実施形態において被験者は、被験者における補充療法において使用される凝固因子タンパク質と同一のアミノ酸配列を有する、凝固因子タンパク質、変異体または抗原性フラグメントを含む複合体を投与される。
いくつかの実施形態において凝固因子は、哺乳動物起源である。いくつかの実施形態において凝固因子タンパク質は、ヒト、非ヒト霊長目動物、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ウサギおよびサルから成る群より選択される起源を有する。一実施形態において、凝固因子タンパク質はヒトタンパク質である。
一実施形態において凝固因子タンパク質は、ヒト組換え型ＦＶＩＩＩまたはその抗原性フラグメントもしくは変異体である。
他の実施形態において凝固因子タンパク質は、製品コージネイト（ＫＯＧＥＮＡＴＥ）のアミノ酸配列に基づく完全長組換え型ＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態において凝固因子タンパク質は、配列番号１、配列番号２およびその組み合せから成る群より選択される。
他の実施形態において凝固因子タンパク質は、Ｂドメイン欠失組換え型ＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態においてＢドメイン欠失組換え型ＦＶＩＩＩは、配列番号５、配列番号６およびその組合せから成る群より選択される。
他の実施形態において凝固因子タンパク質は、自然界に見出されるいずれかのヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸配列に基づく完全長組換え型ＦＶＩＩＩである。
いくつかの実施形態において凝固因子タンパク質は、補充療法において使用されるいずれかのＦＶＩＩＩ製品である。
他の実施形態において凝固因子タンパク質は、Ｂドメインが完全にまたは部分的に欠失しているいずれかのヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列に基づく、Ｂ欠失組換え型ＦＶＩＩＩである。複合体はまた、凝固因子タンパク質の変異体も含み得る。本明細書で用いる場合、タンパク質に適用されるとき用語「変異体」は、基準タンパク質と異なるタンパク質である。この意味での変異体の例を以下に記載し、本開示の他の箇所でより詳細に記載する。一般的にタンパク質に関して相違の程度は、基準および変異体の配列が総合的に極めて類似し、多くの領域で同一であるように制限され得る。変異体および基準タンパク質は、いずれかの組み合せで存在し得る、一または複数の置換、付加、欠失、融合および切断により、アミノ酸配列において異なり得る。変異体はまた、基準配列と同一のアミノ酸配列を有し得るが、グリコシル化またはＰＥＧ化等の一または複数の翻訳後修飾に関する相違点を示すタンパク質を含み得る。
いくつかの実施形態において凝固因子タンパク質は、例えば、半減期または安定性を改善するために一または複数の生体適合性ポリマーによる連結によって修飾された変異体である。適した生体適合性ポリマーには、ポリアルキレンオキサイド、例えば、制限されるものではないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、コロミン酸または他の炭水化物に基づくポリマー等、アミノ酸のポリマー、ビオチン誘導体、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン‐無水マレイン酸共重合体、ポリスチレン‐無水マレイン酸共重合体、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ヘパリン、アルブミン、セルロース、キトサン加水分解物、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプン等のデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物、他のバイオポリマーおよびそのいずれかの等価物が含まれる。一実施形態においてポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＦ）である。他の実施形態においてポリマーは、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。他の有用なポリアルキレングリコール化合物は、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリブチレングリコール（ＰＢＧ）、ＰＥＧ‐グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ‐ＰＥＧ）、ＰＥＧ‐オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ‐ＰＥＧ）、分岐型ポリエチレングリコール、直線状ポリエチレングリコール、フォーク型ポリエチレングリコールおよびマルチアーム型または「超分岐型」ポリエチレングリコール（スターＰＥＧ）である。
本明細書で用いる場合、「ＰＥＧ」および「ポリエチレングリコール」は置き換え可能であり、いずれかの水溶性のポリ（エチレンオキシド）を含む。典型的には、実施形態に従う使用のためのＰＥＧは、次の「‐‐（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ‐‐」の構造を含み、ここで（ｎ）は２ないし４０００である。本明細書で用いる場合、ＰＥＧにはまた、末端の酸素が置換されているかどうかに依存して、「‐‐ＣＨ２ＣＨ２‐‐Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ‐‐ＣＨ２ＣＨ２‐‐」および「‐‐（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ‐‐」も含まれる。明細書および請求項を通じて、用語「ＰＥＧ」には、制限されるものではないが、ヒドロキシルまたはＣ１‐２０アルコキシ基等の種々の末端基または「エンドキャッピング」基を有する構造が含まれることを忘れてはならない。用語「ＰＥＧ」はまた、過半数のすなわち５０％を超える‐‐ＯＣＨ２ＣＨ２‐‐の反復サブユニットを含むポリマーを意味する。特定の形態に関しては、ＰＥＧはいずれかの数の種々の分子量、ならびに分岐型、直線状、フォーク型および多機能性等の構造または幾何学的配置を取り得る。ＰＥＧ化とは、それによってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がタンパク質等の分子に共有結合的に結合されるプロセスである。いくつかの実施形態においてＰＥＧ化は、投与後のタンパク質の半減期を増強する。いくつかの実施形態において凝固因子は、ＰＥＧに結合されている。一実施形態において、凝固因子はＦＶＩＩＩであり、１）ＦＶＩＩＩのいずれかのドメイン上の一または複数の既存の炭水化物に直接的に；２）ＦＶＩＩＩのいずれかのドメイン上のいずれかの利用可能なまたは操作されたシステインに直接的に；３）ＦＶＩＩＩ上のいずれかの他のアミノ酸に；４）そのいずれかの組み合せにより、ＰＥＧに結合されている。
いくつかの実施形態において凝固因子タンパク質またはその変異体もしくは抗原性フラグメントは、所定部位で変異を受けることが出来、次にその部位で生体適合性ポリマーに共有結合的に連結され得る。凝固因子に生体適合性ポリマーを連結する方法は、例えば、米国出願公開第２００６／０１１５８７６号に見出すことが出来、参照することにより本明細書でその全体が援用される。本実施形態の複合体において使用され得る生体適合性ポリマーは、上記のいずれかのポリマーであり得る。生体適合性ポリマーは、薬物動態学的における望ましい改善を提供するように選択され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ポリマーの固有性、大きさおよび構造は、活性の許容不可能な減少することなく、ポリペプチドの循環半減期を改善するように、またはポリペプチドの抗原性を減少させるように選択される。いくつかの実施形態において、ポリマーはＰＥＧを含み、いくつかの実施形態においてポリマーはその分子量の少なくとも５０％をＰＥＧとして有する。一実施形態においてポリマーは、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリルオキシおよび置換アリルオキシ等のエンドキャッピング部分により末端をキャッピングされたポリエチレングリコールである。一実施形態においてポリマーは、メトキシポリエチレングリコールを含む。他の実施形態においてポリマーは、３ｋＤから１００ｋＤ、５ｋＤから６４ｋＤまたは５ｋＤから４３ｋＤの範囲の径を有するメトキシポリエチレングリコールを含む。
いくつかの実施形態において、生体適合性ポリマーは反応性部分を有する。例えば、一実施形態においてポリマーは、ポリペプチド上の遊離システインと反応し得るスルフヒドリル反応性部分を有し、共有結合を形成し得る。このようなスルフヒドリル反応性部分には、チオール、トリフレート、トシレート、アジリジン、オキシラン、Ｓ‐ピリジルまたはマレイミド部分が含まれる。いくつかの実施形態において反応性部分は、マレイミド部分である。一実施形態において、ポリマーは直線状であり、一方の末端にスルフヒドリル（メトキシ等）に対し反応性の強くない「キャップ」を、かつ他方の末端にはスルフヒドリル反応性部分を有する。一実施形態において複合体は、ＰＥＧ‐マレイミドを含み、５ｋＤから６４ｋＤの粒径範囲を有する。
凝固因子ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントもしくは変異体をコードするヌクレオチド配列の部位特異的な突然変異は、当該技術分野において既知のいずれかの方法によって生じ得る。いくつかの方法には、ポリマーの共有結合のために選択される部位における、システインコドンを誘導するための突然変異誘発が含まれる。これは、市販の部位特異的突然変異誘発キット、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ部位特異的突然変異誘発キットｎｏ．Ｋ１６００‐１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎＴａｙｌｏｒ部位特異的突然変異誘発システムｎｏ．１２３９７０１４、Ｐｒｏｍｅｇａ Ａｌｅｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ ＩＩインビトロ突然変異誘発システムキットｎｏ．Ｑ６２１０またはＴａｋａｒａ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＡ ＰＣＲ突然変異誘発キットｎｏ．ＴＡＫ ＲＲ０１６等を使用して達成され得る。
いくつかの実施形態において生体適合性ポリマーを含む変異体は、最初にポリペプチドの表面上の一または複数のアミノ酸のコドンをシステインのコドンにより置換し、システイン変異体を組換え発現系において産生し、変異体をシステイン特異的ポリマー試薬と反応し、および変異体を精製することにより調製され得る。この系においてシステイン部位でのポリマーの付加は、ポリマー上でのマレイミドの活性機能により達成され得る。使用されるスルフヒドリル反応性ポリマーの量は、誘導体化されるべきシステインのモル量と少なくとも等モルであることが出来、もしくはいくつかの実施形態においては過剰である。いくつかの実施形態において、少なくとも５倍モル過剰のスルフヒドリル反応性ポリマーが使用され、または少なくとも１０倍過剰のこのようなポリマーが使用される。共有結合にとって有用な他の条件は、当業者の範囲内である。
いくつかの実施形態において変異体は、一または複数のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基により置換されているタンパク質を含み、ならびにこのように置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードされ得るかまたはコードされ得ないアミノ酸残基である。保存的置換とは、タンパク質中の所定のアミノ酸を似た特性の他のアミノ酸によって置換する置換である。いくつかの実施形態において変異体は、オリジナルな抗原に対し少なくとも約８０％の同一性を有する保存的置換であり、ならびに抗原性変異体の配列とオリジナルな抗原の配列の間の置換は保存的アミノ酸置換である。以下の置換は保存的アミノ酸置換であると考えられている：バリン、イソロイシンまたはロイシンはアラニンに置換される；リジン、グルタミンまたはアスパラギンはアルギニンに置換される；グルタミン、ヒスチジン、リジンまたはアルギニンはアスパラギンに置換される；グルタミン酸はアスパラギン酸に置換される；セリンはシステインに置換される；アスパラギンはグルタミンに置換される；アスパラギン酸はグルタミン酸に置換される；プロリンまたはアラニンはグリシンに置換される；アスパラギン、グルタミン、リジンまたはアルギニンはヒスチジンに置換される；ロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニンまたはノルロイシンはイソロイシンに置換される；ノルロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、アラニンまたはフェニルアラニンはロイシンに置換される；アルギニン、グルタミンまたはアスパラギンはリジンに置換される；ロイシン、フェニルアラニンまたはイソロイシンはメチオニンに置換される；ロイシン、バリン、イソロイシン、アラニンまたはチロシンはフェニルアラニンに置換される；アラニンはプロリンに置換される；スレオニンはセリンに置換される；セリンがはレオニンに置換される；チロシンまたはフェニルアラニンはトリプトファンに置換される；トリプトファン、フェニルアラニン、スレオニンまたはセリンはチロシンに置換される；トリプトファン、フェニルアラニン、スレオニンまたはセリンはチロシンに置換される；イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、アラニンまたはノルロイシンはバリンに置換される。いくつかの実施形態において変異体は、オリジナルな抗原に対し少なくとも約９０％の同一性を有する保存的変異体である。
いくつかの実施形態において変異体は、一または複数のアミノ酸残基が置換基を含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態において変異体は、一または複数の他の成分と融合したタンパク質を含む。いくつかの実施形態において変異体は、追加のアミノ酸が成熟タンパク質、例えば、リーダーまたは分泌配列または成熟タンパク質または成熟タンパク質配列の精製に用いられる配列、に融合されたタンパク質を含む。このような変異体は、本明細書の教示から当業者によって得られると考えられる。
いくつかの実施形態において変異体は、本来のタンパク質の少なくとも１００％の活性を有する。いくつかの実施形態において変異体は、本来の凝固因子タンパク質の少なくとも５０％の活性を有する。いくつかの実施形態において変異体は、本来の凝固因子タンパク質の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の活性を有する。
いくつかの実施形態において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または０個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失または付加される。いくつかの実施形態において凝固因子タンパク質は、サイレント置換、付加および欠失を含み、それらは凝固因子タンパク質の特性および活性を変化させない。
いくつかの実施形態において変異体は、一般的に基準配列に同一の少なくとも３０個の連続したアミノ酸または少なくとも５０〜１００個の連続したアミノ酸を含む、基準配列の部分を含む。
いくつかの実施形態においてタンパク質は、単離された形態として提供され、ならびにいくつかの実施形態においては、タンパク質の単離および精製に関する既知の方法および技術を使用して実質的均一性まで精製される。
実施形態の複合体はまた、凝固因子タンパク質の抗原性フラグメントも含み得る。この点に関して抗原性フラグメントは、前記の基準ポリペプチドおよびその変異体のアミノ酸配列の全てではないが一部と、完全に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、それは抗体応答を発生することができる。凝固因子タンパク質の抗原性フラグメントは、該タンパク質由来の少なくとも一つのエピトープを含む。
抗原性フラグメントは、いずれかの長さであり得るが、最も典型的には少なくとも約６個のアミノ酸、少なくとも約９個のアミノ酸、少なくとも約１２個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約３０個のアミノ酸、少なくとも約５０個のアミノ酸または少なくとも約１００個のアミノ酸である。より大きな抗原性フラグメントもまた考えられる。
このような抗原性フラグメントは、「独立している」、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部ではなくまたは融合しているかもしれず、またはそれらがその部分または領域を形成する、より大きなポリペプチド内部に含まれているかもしれない。より大きなポリペプチド内に含まれるとき、ここで論じるいくつかの実施形態におけるフラグメントは、単一の連続した領域を形成する。しかしながら、いくつかのフラグメントが単一のより大きなポリペプチド内に含まれ得る。例えば、いくつかの実施形態において本実施形態のポリペプチドの抗原性フラグメントは、宿主における発現のために設計され、抗原性フラグメントのアミノ末端に融合した異種性のプレおよび／またはプロポリペプチド領域および／またはフラグメントのカルボキシル末端に融合した追加の領域を有する、前駆体ポリペプチド内に含まれ得る。従って本明細書で意図する意味での一態様におけるフラグメントは、凝固因子タンパク質由来の融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の部分または複数の部分を表す。
実施形態の抗原性ポリペプチドフラグメントの代表的な例には、例えば、約５〜１５、１０〜２０、１５〜４０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８０、４１〜９０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜１１５、１００〜１２５、および１１０〜１４０個のアミノ酸長を有する該フラグメントが含まれる。
いくつかの実施形態においてポリペプチドは、組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターによりコードされた融合タンパク質の部分であり、該融合タンパク質のシグナルペプチドに対し異種性である。
いくつかの実施形態においてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態において抗原性フラグメントのアミノ酸配列は、オリジナルなタンパク質に対し少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有する。
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）
ＦＶＩＩは、肝臓におて合成されるビタミンＫ依存性血漿タンパク質であり、５３ｋＤａの分子量を有する一本鎖糖タンパク質として血液中に分泌される（Ｂｒｏｚｅ ＆ Ｍａｊｅｒｕｓ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ １９８０；２５５：１２４２‐１２４７（１９８０）。ＦＶＩＩチモーゲンは、単一サイト、Ｒ１５２‐Ｉ１５３におけるタンパク質切断によって活性型（ＦＶＩＩａ）に転換され、単一ジスルフィド架橋によって結合され二本鎖をもたらす。組織因子と複合したＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ複合体）は、第ＩＸ因子と第Ｘ因子の双方をその活性型に転換することが出来、その後迅速なトロンビン産生およびフィブリン形成をもたらす反応が続く（Ｏｓｔｅｒｕｄ ＆ Ｒａｐａｐｏｒｔ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９７７；７４：５２６０‐５２６４（１９７７））。
ヒトＦＶＩＩ（ｈＦＶＩＩ）をコードする遺伝子は、第１３番染色体の長腕３４‐長腕末端９（ｑ３４〜ｑｔｅｒ９）にマッピングされた（ｄｅ Ｇｒｏｕｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６６：２３０‐２３３（１９８４））。該遺伝子は９のエクソンを含み１２．８Ｋｂに及んでいる（Ｏ´Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：５１５８‐５１６２（１９８７））。ＦＶＩＩの遺伝子構成およびタンパク質構造は、他のビタミンＫ依存性凝血促進タンパク質のそれらと類似していて、シグナル配列をコードするエクソン１ａおよび１ｂ；プロペプチドおよびＧｌａドメインをコードするエクソン２；短い疎水性領域をコードするエクソン３；上皮成長因子様ドメインをコードするエクソン４および５；およびセリンプロテアーゼ触媒ドメインをコードするエクソン６から８を有する、（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８５； ２４： ３７３６‐３７５０）。組換えヒトＦＶＩＩａの市販製剤がＮＯＶＯＳＥＶＥＮとして販売されている。ＮＯＶＯＳＥＶＥＮは、血友病ＡまたはＢ患者における出血の発症の治療に適応される。
本実施形態に有用なＦＶＩＩ分子には、完全長タンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質のサブユニットまたはフラグメント、およびその変異体および抗原性フラグメントが含まれる。ＦＶＩＩへの言及は、このようなタンパク質の全ての可能な形態が含まれることを意味する。
いくつかの実施形態においてＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号９を含むが、対立遺伝子変異体も可能である。第ＶＩＩ因子、変異体、フラグメントおよび／または同物を作成するうえで実施形態において有用である方法は、例えば、以下の米国特許出願公開および米国特許：２０１３００８４２７４； ２０１３００１７１８４； ２０１２０３２１６０７； ２０１２０２６３７０１； ２０１２０２０８８６０； ２０１２０１７８６９３； ２０１２０１７１７６５；２０１２０１１５２０４；２０１２００８７９０８； ２０１２００６４０７５； ２０１２０００４１７６； ２０１２０００３２０６； ２０１１０２５０７０２； ２０１１００９７７５４； ２０１１００６４７１９； ２０１１００５９８９４； ２０１１００５９５１０； ２０１１００４６０６１； ２０１１００４５５３５； ２０１１００４００７３； ２０１１０００３３６３； ２０１００３３００５９； ２０１００３０３７８６； ２０１００２９４６７７； ２０１００２６０７４１； ２０１００１９７５９７； ２０１００１６６７３０； ２０１００１６６７２９； ２０１００１５８８９１； ２０１００１４５００９； ２０１００１２４５４７； ２０１００１２００９３； ２０１００１１３７４３； ２０１０００５６４５３； ２０１０００１５６８４； ２０１００００９３９６； ２００９０３１１２３９； ２００９０３０５９６７； ２００９０２９１８９０； ２００９０２８１０２２； ２００９０２６４５１１； ２００９０２６３８６６； ２００９０２３９７８８； ２００９０２２７５０４； ２００９０２２１４８４； ２００９０１８１８９５； ２００９０１６２８７１； ２００９０１３００８５： ２００９０１０４６６１； ２００９００９８１０３； ２００９００９３６１６； ２００９００９３４１０； ２００９００８７８６４； ２００９００７５８９５； ２００９００５５９４２； ２００９００４７７２３； ２００９００４３０８０； ２００９００４２７８４； ２００９００４１７４７； ２００９００２３６３５； ２００９００１７００７； ２００９００１１９９２； ２００８０３１８２７６； ２００８０３１２１６１； ２００８０２８６２５９； ２００８０２７４５３４； ２００８０２６８５２１； ２００８０２２７７１５； ２００８０２０６２２７； ２００８０２０６２２５； ２００８０１７５８７８； ２００８０１４５９１４； ２００８０１０２０６４； ２００８００７６７０２； ２００８００７５７１１； ２００８００７５７０９； ２００８００６９８１０； ２００８００５８２６６； ２００８００５８２５５； ２００８００５７０５９； ２００８００３９３７３； ２００８００１０６９３； ２００７０２４３５８８； ２００７０２１９１３５； ２００７０２０７９６０； ２００７０２０７９５６； ２００７０１９０５７４； ２００７０１４２６２５； ２００７０１４２２８０； ２００７０１２９２９８； ２００７０１２２８８４； ２００７００９９２２９； ２００７００４９５２３； ２００７００３７９６６； ２００７００２７０７７； ２００７００２１３３８； ２００６０２９３２４１； ２００６０２７６３９８； ２００６０２７６３７７； ２００６０２７０００２； ２００６０２７０００１； ２００６０２７００００； ２００６０２５８５８５； ２００６０２５２６９０； ２００６０２５２６８９； ２００６０２５２１２９； ２００６０２５２１２７； ２００６０２５２０３９； ２００６０２４０５２５； ２００６０２４０５２４； ２００６０２３４９３５； ２００６０２２８７８２； ２００６０２１１６２１； ２００６０２０５６４８； ２００６０２０５０３６； ２００６０１８３６８３； ２００６０１６６９１５； ２００６０１６６８８２； ２００６０１１１２８２； ２００６００６３７１４； ２００６００５２２８６； ２００６００４５８７９； ２００６００３０５３１； ２００６００２５３３６； ２００６００１９３３６； ２００６００１３８１２； ２００５０２６７０１４； ２００５０２６６００６； ２００５０２０４４１１； ２００５０２０４４０６； ２００５０２０２００２； ２００５０１１３５６５； ２００５００７５２８９； ２００５００３２６９０； ２００５００３２１０９； ２００４０２５８６９０； ２００４０２４８７９３； ２００４０１９７３７０； ２００４０１９２６０２； ２００４０１８６２７７； ２００４０１１７８６２； ２００４００８７４９８； ２００４００６３１８７； ２００４００４３９３３； ２００４００３７８９３； ２００４０００９９１８； ２００４０００９５４３； ２００４０００６０２０； ２００３０２１５４４７； ２００３０２０３８４５； ２００３０１７０８６３； ２００３０１５２５６７； ２００３０１３０１９１； ２００３０１２５２５６； ２００３０１２４６２２； ２００３０１２４１１８； ２００３０１１９７４３； ２００３０１１９７４１； ２００３０１１９７２３； ２００３０１１８５８２； ２００３０１１８５８０； ２００３０１１８５７４； ２００３０１０９４４６； ２００３０１０４９７８； ２００３０１００７４０； ２００３０１０００７５； ２００３００９６３３８； ２００３００７７２７１； ２００３００４４９０８； ２００３００４０４８０； ２００３０００３０９６； ２００２０１５１４７１； ２００２０１４２３１６； ２００２０１３７６７３； ２００２０１１０５５２； ２００１０００７９０１； ８，３３４，２７３； ８，３１８，９０４； ８，２９９，０２９； ８，０８４，５９１； ８，０５３，４１０； ８，０２６，２１４； ８，０２２，０３１； ８，００８，２５２； ７，９５１，９１０； ７，９４３，３３３； ７，８９２，８４２； ７，８７９，８０３； ７，８７１，９８５； ７，８６３，００９； ７，８２９，０９５； ７，８０３，５６９； ７，７９０，８５２； ７，７８６，０７０； ７，７５４，６８２； ７，７３２，４０５； ７，７００，７３３； ７，６２２，５５８； ７，５９８，０５６； ７，５１７，９７４； ７，５１１，０２４； ７，４４２，５２４； ７，４４２，５１４； ７，４２７，５９２； ７，４１９，８０３； ７，４１６，８６１； ７，４１６，８６０； ７，４１４，０２２； ７，３７１，５４３； ７，２９１，５８７； ７，２３５，６３８； ７，２０２，０６５； ７，１７６，２８８； ７，１５３，６７９； ７，１２５，８４６； ７，０７８，４７９； ７，０５２，８６８； ７，０２６，５２４； ６，９６０，６５７； ６，９１９，３１１； ６，９１１，３３４； ６，９１１，３２３； ６，９０５，６８３； ６，９０３，０６９； ６，８３５，８１７； ６，８３１，１６７； ６，８０６，０６３； ６，７７７，３９０； ６，６７７，４４０； ６，５７３，０５６； ６，５２８，２９９； ６，４７９，２４５； ６，３２９，１７６； ６，２６８，１６３； ６，１８３，７４３； ６，１６８，７８９； ６，０３９，９４４； ５，９９７，８６４； ５，９６８，７５９； ５，９６２，４１８； ５，９４８，７５９； ５，８７４，４０８； ５，８６１，３７４； ５，８５９，０１０； ５，８３３，９８２； ５，８２４，６３９； ５，８１７，７８８； ５，７８８，９６５； ５，７５０，３５８； ５，７４１，６５８； ５，７００，９１４； ５，４７２，８５０； ５，３４４，９１８； ５，２８８，６２９； ５，１９０，９１９； ４，７８４，９５０； ４，４５６，５９１ および ３，９６２，４２７において記載されており、それらは第ＶＩＩ因子、変異体、フラグメントおよび／または同物を作成する方法に関する範囲で、参照することにより本明細書で援用される。
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）
血液凝固因子ＦＶＩＩＩは、肝臓によって合成され血流中に放出される糖タンパク質である。分泌タンパク質としてＦＶＩＩＩは、翻訳過程の間にタンパク質分解切断されるシグナル配列を含む。１９個のアミノ酸のシグナル配列の除去後、分泌されたＦＶＩＩＩ産物の最初のアミノ酸はアラニンである。循環する血液中でＦＶＩＩＩは、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ、同様に第ＶＩＩＩ因子関連抗原として知られる）に結合し、安定した複合体を形成する。トロンビンによる活性化の際にＦＶＩＩＩは複合体から解離し、凝固カスケードにおける他の凝固因子と相互作用し、それが最終的に血栓の形成をもたらす。
ＦＶＩＩＩそれ自体は凝固を引き起こさないが、凝固カスケードにおいて必須の役割を果たす。凝固におけるＦＶＩＩＩの役割は、内因系ＦＸ活性化のための触媒補因子であるＦＶＩＩＩａに活性化されることである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２９：１１‐２２（２００３））。ＦＶＩＩＩは、トロンビンまたはＦＸａによってタンパク分解的に活性化され、それはＦＶＩＩＩをヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）から解離しおよびカスケードにおけるＦＶＩＩＩの凝固促進機能を活性化する。活性型においてＦＶＩＩＩａは、血液凝固の内因系経路中のＦＸ活性化酵素複合体のための補因子として機能し、血友病Ａの患者においてそれは減少するかまたは非機能的である。
いくつかの実施形態において本実施形態に有用なＦＶＩＩＩには、完全長ＦＶＩＩＩおよびいずれかの誘導体の、凝固因子ＦＩＸの活性化において補因子として作用する能力、およびＶＷＦと複合体を形成する能力、を含み生物学的に活性であるこれらの形態が含まれる。いくつかの実施形態において本実施形態に従って使用されるＦＶＩＩＩは、血漿由来ＦＶＩＩＩ（ｐｄＦＶＩＩＩ）またはその組換え型ＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）または生物学的に活性な誘導体であり得る。ｐｄＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩは、当該技術分野において既知のいずれかの方法によって産生され得る。ｐｄＦＶＩＩＩはいずれかの方法によって精製され得る。有用な一方法が米国特許第５，４７０，９５４号に記載されており、参照することにより本明細書で援用される。ｒＦＶＩＩＩタンパク質はいずれかの適切な方法によって調製され得る。このようなｒＦＶＩＩＩの例には、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（登録商標）およびＡｄｖａｔｅ（登録商標）が含まれ、双方ともＢａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造および販売されている；ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）、ＦＶＩＩＩのＢドメイン欠失型は、Ｗｙｅｔｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造および販売されている；およびＫＯＧＥＮＡＴＥは、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造および販売されている。方法およびｒＦＶＩＩＩの方法および例は、米国特許第４，７５７，００６号；４，９６５，１９９号；および５，６１８，７８８号に記載されており、参照することによりその全ては本明細書で援用される。寛容を誘導するために使用され得るＦＶＩＩＩの他の市販製剤には、Ａｌｐｈａｎａｔｅ（登録商標）、Ｂｉｏｃｌａｔｅ（登録商標）、Ｈｅｌｉｘａｔｅ（登録商標）ＦＳ、Ｈｅｍｏｆｉｌ（登録商標）Ｍ、Ｈｕｍａｔｅ‐Ｐ（登録商標）、Ｈｙａｔｅ Ｃ（登録商標）、Ｋｏａｔｅ（登録商標）‐ＤＶＩ、Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）ＦＳ、Ｍｏｎａｒｃ‐Ｍ（商標）、Ｍｏｎａｒｃ‐Ｍ（商標）、Ｍｏｎａｒｃ‐Ｍ（登録商標）およびＭｏｎｏｃｌａｔｅ‐Ｐ（登録商標）が含まれる。
いくつかの実施形態においてＦＶＩＩＩポリペプチドには、それらがヒトＦＶＩＩＩの機能的なセグメントおよび必須の、特徴的なヒトＦＶＩＩＩの機能活性を含む限りは、ＦＶＩＩＩの誘導体をもたらず対立遺伝子変異体、グリコシル化バージョン、修飾体およびフラグメントが含まれる。
いくつかの実施形態においてＦＶＩＩＩ分子には、完全長タンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質のサブユニットまたはフラグメント、およびその変異体および抗原性フラグメントが含まれる。ＦＶＩＩＩへの言及は、このようなタンパク質の全ての可能な形態を含むことを意味する。
いくつかの実施形態においてＦＶＩＩＩポリペプチドは、完全長ヒトＦＶＩＩＩを含む。いくつかの実施形態において完全長ＦＶＩＩＩは、配列番号１、配列番号２およびその組み合せから成る群より選択されるアミノ酸配列を含むが、対立遺伝子変異体も可能である。分泌されるタンパク質としてＦＶＩＩＩは、翻訳過程の間にタンパク質分解的に切断される一本鎖配列を含む。１９個のアミノ酸シグナル配列の除去後、分泌されるＦＶＩＩＩ産物の最初のアミノ酸はアラニンである。
いくつかの実施形態においてヒトＦＶＣＩＩＩは、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）である。本明細書で用いる場合、ＢＤＤは、ＦＶＩＩＩのＢドメインの１４個のアミノ酸を除いてすべての欠失を含むアミノ酸配列を有することによって特徴づけられる。Ｂドメインの最初の４個のアミノ酸（配列番号３）は、Ｂドメインの最後の１０個の残基（ＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ、配列番号４）に連結される。いくつかの実施形態においてＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、配列番号５および配列番号６およびその組み合せから成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。
第ＶＩＩＩ因子、変異体フラグメント、および／または実施形態において同物を作成する上で有用な方法は、例えば、以下の米国特許出願公開および米国特許： ２０１３００８５１１０； ２０１３００７２４３４； ２０１３００４０８８９； ２０１３００４０８８８； ２０１３００１７９９７； ２０１３００１２４４２； ２０１３０００５６５６； ２０１３０００４４６２； ２０１２０３２２７３７； ２０１２０３０８６４１； ２０１２０２７０２６６； ２０１２０２４５２８９； ２０１２０２４４５９７； ２０１２０２３２２５２； ２０１２０２２５８１９； ２０１２０１９０６２３； ２０１２０１７８６９２； ２０１２０１７８６９１； ２０１２０１４２５９４； ２０１２０１４２５９３； ２０１２００９３８４０； ２０１２００８３４４６； ２０１２００６５１３６； ２０１２００４５８１９； ２０１２００２８９００； ２０１１０２８６９８８； ２０１１０２６２４２４； ２０１１０２０６６５１； ２０１１０１８３９０７； ２０１１０１７８０１９； ２０１１０１６０４３５； ２０１１０１２４５６５； ２０１１０１１８１８８； ２０１１０１１２０２８； ２０１１０１１２０２７； ２０１１０１１２０２６； ２０１１０１１２０２５； ２０１１０１１２０２４； ２０１１０１１２０２３； ２０１１０１１２０２２； ２０１１００７７２０３； ２０１１００３９３０２； ２０１００３０５３０５； ２０１００２９２４４０； ２０１００２８４９７１； ２０１００２６１８７２； ２０１００２５６０６２； ２０１００２３３１１９； ２０１００２０４４５２； ２０１００１９７５７８； ２０１００１８３５５６； ２０１００１７３８３１； ２０１００１７３８３０； ２０１００１７２８９１； ２０１００１６８３９１； ２０１００１６８０１８； ２０１００１６７３９２； ２０１００１３０４２７； ２０１００１２５０４９； ２０１００１２０６８９； ２０１００１２００９４； ２０１００１１３３６５； ２０１００１１３３６４； ２０１００１１２６４１； ２０１０００９９１１３； ２０１００００３２５４； ２００９０３２５８８１； ２００９０３０５３４９； ２００９０２９７５０３； ２００９０２９７４９８； ２００９０２７５１４１； ２００９０２７１１６３； ２００９０２６３３８０； ２００９０２４７４５９； ２００９０２１５０７０； ２００９０２１５０２５； ２００９０２０８５１２； ２００９０２０３０７７； ２００９０１３００９４； ２００９０１１８１８５； ２００９０１１８１８４； ２００９００７６２３７； ２００９００４１７１４； ２００８０３１２１４３； ２００８０３００１７４； ２００８０２３４１９３； ２００８０２１９９８３； ２００８０２０６２５４； ２００８０１７６７９１； ２００８０１６００１５； ２００８００７６７０２； ２００８００７０２７５； ２００８００７０２５１； ２００８００５８５０４； ２００８００４４４３０； ２００７０２７５８８０； ２００７０２６５１９９； ２００７０２４４３０１； ２００７０２３２７８９； ２００７０２３２７８８； ２００７０２１５４７５； ２００７０１３５３４２； ２００７００６５４２５； ２００６０２９３５０５； ２００６０２９３２３８； ２００６０２７６３９８； ２００６０２３９９９８； ２００６０２３３７８６； ２００６０２０５６６１； ２００６０１９３８２９； ２００６０１６０９９４； ２００６００９９６８５； ２００６００５１３６７； ２００６００１４６８３； ２００５０２７６７８７； ２００５０２５６３０４； ２００５０２５６０３８； ２００５０２２９２６１； ２００５０１６５２２１； ２００５０１１８６８４； ２００５０１００９９０； ２００５００７９５８４； ２００５００７４８３６； ２００５００６０７７５； ２００５０００９１４８； ２００４０２４９１３４； ２００４０２４８７８５； ２００４０２３５７３４； ２００４０１９７８７５； ２００４０１９７３９０； ２００４０１６６１５０； ２００４０１４７４３６； ２００４０１２６７７４； ２００４０１２０９５１； ２００４０１１６３４５； ２００４００９２４４２； ２００４００８７７７６； ２００４００６２７５２； ２００４００３８３９６； ２００３０１９９４４４； ２００３０１６６５３６； ２００３０１６５８２２； ２００３０１４８９５３； ２００３０１４７９００； ２００３０１３４７７８； ２００３０１２９１７４； ２００３０１０６７９８； ２００３００９９６１８； ２００３００８３２５７； ２００３００７７７５２； ２００３００６８７８５； ２００２０１８２６８４； ２００２０１８２６７０； ２００２０１５９９７７； ２００２０１４６７２９； ２００２０１３２３０６； ２００２０１１５８３２； ２００２０１１５１５２； ２００２０１０２７３０； ２００２００６８３０３； ２００１００１０８１５； ８，３９９，６２０； ８，３７２，８００； ８，３４９，８００； ８，３３８，５７１； ８，３２９，８７１； ８，３０９，０８６； ８，２９３，２３４； ８，２８２，９２３； ８，２５２，２８７； ８，２４７，５３６； ８，２３６，５１８； ８，１９８，４２１； ８，１８８，２４６； ８，１８３，３４５； ８，１８３，３４４； ８，１７３，５９７； ８，１４３，３７８； ８，１３３，９７７； ８，１３３，８６５； ８，１１０，１９０； ８，０７６，２９２； ８，０７１，７２８； ８，０７１，７２７； ８，０７１，７２６； ８，０７１，７２５； ８，０７１，７２４； ８，０７１，０９４； ８，０６７，５４３； ８，０５８，２２６； ８，０５８，０１７； ８，０５３，５６１； ８，０３８，９９３； ８，００３，７６０； ７，９８５，８３９； ７，９８５，８３８； ７，９８２，０１０； ７，９８１，８６５； ７，９６０，１８２； ７，９３２，３５５； ７，８８４，０７５； ７，８６７，９７４； ７，８６３，４２１； ７，８５８，７４９； ７，８５５，２７４； ７，８２９，０８５； ７，８２０，７９６； ７，７９０，６８０； ７，７８５，５９４； ７，６９１，５６５； ７，６８３，１５８； ７，６７８，７６１； ７，６４５，８６０； ７，６３５，７６３； ７，６１５，６２２； ７，５８２，２９６； ７，５６０，１０７； ７，５４４，６６０； ７，５０７，５４０； ７，４５９，５３４； ７，４５９，５２５； ７，３５１，５７７； ７，２４７，７０７； ７，２１４，７８５； ７，２１１，５５９； ７，１９９，２２３； ７，１５７，２７７； ７，１４４，４８７； ７，１２２，６３４； ７，１１２，４３８； ７，０８７，７２３； ７，０４１，６３５； ７，０３３，７９１； ７，０１２，１３２； ６，９６７，２３９； ６，９３０，０８７； ６，８８７，８５２； ６，８６６，８４８； ６，８３８，４３７； ６，８００，４６１； ６，７８０，６１４； ６，７７０，７４４； ６，７５９，２１６； ６，６８３，１５９； ６，５９９，７２４； ６，５９３，２９４； ６，５８６，５７３； ６，５１８，４８２； ６，５１７，８３０； ６，４９２，１０５； ６，４５８，５６３； ６，３７６，４６３； ６，３５８，７０３； ６，３５５，４２２； ６，３４６，５１３； ６，３１６，２２６； ６，３０７，０３２； ６，２８４，８７１； ６，２７１，０２５； ６，２５５，５５４； ６，２５１，６３２； ６，２２１，３４９； ６，２００，５６０； ６，１９７，５２６； ６，１９１，２５６； ６，１８０，３７１； ６，１７１，８２５； ６，１４３，１７９； ６，０５７，１６４； ６，０３７，４５２； ６，００５，０８２； ５，９９８，５８９； ５，９９４，３１０； ５，９７２，８８５； ５，９６２，６５０； ５，９５２，１９８； ５，９２５，７３９； ５，９１９，９０８； ５，９１９，７６６； ５，８８８，９７４； ５，８８０，３２７； ５，８５９，２０４； ５，８３１，０２６； ５，８２４，７８０； ５，８０４，４２０； ５，７６３，４０１； ５，７４７，３３７； ５，７４４，４４６； ５，７３３，８７３； ５，７１４，５９０； ５，７０７，８３２； ５，６９３，４９９； ５，６８１，７４６； ５，６７９，７７６； ５，６７９，５４９； ５，６６８，１０８； ５，６６３，０６０； ５，６６１，００８； ５，６５９，０１７； ５，６３３，１５０； ５，６１８，７８９； ５，６１８，７８８； ５，６１０，２７８； ５，６０５，８８４； ５，５９７，７１１； ５，５８３，２０９； ５，５７６，２９１； ５，５６５，４２７； ５，５４３，５０２； ５，５４３，１４５； ５，５０６，１１２； ５，４７０，９５４； ５，４２４，４０１； ５，４２２，２５０； ５，４１０，０２２； ５，３９９，６７０； ５，３７１，１９５； ５，３６４，７７１； ５，３６２，８５４； ５，３５６，８７８； ５，３２８，６９４； ５，２８８，８５３； ５，２６０，２７４； ５，２５９，９５１； ５，２１４，０３３； ５，１７７，１９１； ５，１７１，８４４； ５，１１２，９５０； ５，１１０，９０７； ５，１０１，０１６； ５，０９１，３６３； ５，０４３，４２９； ５，０４３，４２８； ４，９８１，９５１； ４，９７０，３００； ４，９６５，１９９； ４，８８６，８７６； ４，８５７，６３５； ４，８４５，０７４； ４，８２２，８７２； ４，８１４，４３５； ４，７８９，７３３； ４，７６９，３３６； ４，６７５，３８５； ４，６５７，８９４； ４，６５０，８５８； ４，６４９，１３２； ４，５７８，２１８； ４，５５６，５５８； ＲＥ３２，０１１； ４，５２２，７５１； ４，４５６，５９０； ４，４４６，１３４； ４，４０６，８８６： ４，４０４，１３１； ４，３８７，０９２； ４，３８３，９８９； ４，３７０，２６４； ４，３６１，５０９； ４，３５９，４６３； ４，３４８，３８４； ４，３４８，３１５； ４，３０２，４４５； ４，２８９，６９１； ４，２５０，００８； ４，２３５，８８１； ４，２２１，７８０； ４，２０３，８９１； ４，１８８，３１８； ４，０９３，６０８； ４，０８５，０９５； ４，０６９，２１６；および４，０２７，０１３において記載されており、それらは第ＶＩＩＩ因子、変異体、フラグメントおよび／または同物を作成する方法に関する範囲で、参照することにより本明細書で援用される。
いくつかの実施形態においてＦＶＩＩＩは、ＰＥＧ等の生体適合性ポリマーにより修飾され得る。第ＶＩＩＩ因子のＰＥＧ化された形態は、ＷＯ ２００６／０５３２９９および米国特許出願公開第２００６０１１５８５７号において開示されていて、参照することにより本明細書で援用される。
ＦＶＩＩＩの以下に続く実施例においてＦＶＩＩＩ突然変異タンパク質は、当該技術分野の従来法に従って命名される。本明細書で用いる場合、「突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）」とは、タンパク質またはポリペプチドに実験室的に誘導された変異の結果として生じる遺伝子改変されたタンパク質である。変異体を命名するための慣習は、配列番号２に提供される、成熟した完全長第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列に基づいている。
慣習的であり本明細書で用いる通り、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩにおける変異アミノ酸に言及するとき、変異したアミノ酸は完全長ＦＶＩＩＩの配列における位置によって命名される。例えば、以下で述べるＰＥＧ６突然変異タンパク質は、リジン（Ｋ）を完全長配列における１８０８に類似する位置でシステイン（Ｃ）に変えるとの理由で、Ｋ１８０８Ｃと命名される。いくつかの実施形態において以下で述べる変異のために、システインが完全長ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩの指定された位置で天然アミノ酸を置換し、ＰＥＧ等の生体適合性ポリマーがシステイン残基に結合される。
ＰＥＧ等の生体適合ポリマーの共有結合のための所定の部位は、ＦＶＩＩＩ活性に関与しないまたはｖＷＦへの結合等のインビボでのＦＶＩＩＩを安定化する他の機構に関与する、ペプチドの表面に露出される部位から最良に選択される。このような部位はまた、ＦＶＩＩＩが不活性化されるまたは血中から排除される機構に関与することが知られている部位から最良に選択される。これらの部位の選択については、以下で詳細に述べる。いくつかの実施形態において部位には、（ａ）低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質、（ｂ）ヘパリン硫酸プロテオグリカン、（ｃ）低密度リポプロテイン受容体および／または（ｄ）第ＶＩＩＩ因子阻害抗体、のための結合部位内または近辺のアミノ酸が含まれる。「結合部位内または近辺の」によって、生体適合ポリマーの部位への共有結合が結合部位の立体障害をもたらすように、結合部位に十分近くにある残基を意味する。このような部位は、例えば、結合部位の２０オングストローム以内にあると見られる。
一実施形態において生体適合性ポリマーは、（ａ）上記で定義された第ＶＩＩＩ因子クリアランス受容体、（ｂ）第ＶＩＩＩ因子の分解が可能なプロテアーゼのための結合部位および／または（ｃ）第ＶＩＩＩ因子阻害抗体のための結合部位内または近辺のアミノ酸残基において機能性第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに共有結合される。プロテアーゼは、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）であり得る。他の実施形態において生体適合性ポリマーは、低密度リポプロテイン受容体関連タンパク質の該ポリペプチドへの結合が、それが複合化されないときの該ポリペプチドへの結合よりも少なくなるように、ならびにいくつかの実施形態においては二倍以上少なくなるように、機能性第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド上の所定の部位に共有結合される。一実施形態において生体適合性ポリマーは、ヘパリン硫酸プロテオグリカンの該ポリペプチドへの結合が、それが複合化されないときの該ポリペプチドへの結合よりも少なくなるように、ならびにいくつかの実施形態においては二倍以上少なくなくなるように、機能性第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド上の所定の部位に共有結合される。さらなる実施形態において生体適合ポリマーは、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体の該ポリペプチドへの結合が、それが複合化されないときの該ポリペプチドへの結合よりも少ないように、いくつかの実施形態においては、それが複合化されないとき該ポリペプチドへの結合が二倍以上少ないように、機能性第ＶＩＩＩ因子上の所定の部位に共有結合される。他の実施形態において生体適合ポリマーは、低密度リポプロテイン受容体の該ポリペチドへの結合が、それが複合化されないときの該ポリペプチドへの結合よりも少ないように、いくつかの実施形態においては二倍以上少なくなるように、機能性第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド上の所定の部位に共有結合される。他の実施形態において生体適合性ポリマーは、血漿プロテアーゼが、該ポリペプチドをそれが複合化されないときよりもより少なくしか分解しないように、機能性第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド上の所定の部位に共有結合される。さらなる実施形態において血漿プロテアーゼによる該ポリペプチドの分解は、同条件下で同期間にわたり測定されると、それが複合化されないときの分解よりも二倍以上少ない。
ＦＶＩＩＩに対するＬＲＰ、ＬＤＬ受容体またはＨＳＰＧの結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して定量し得る。例えば、ＦＶＩＩＩは、直接的にまたはＦＶＩＩＩ抗体により間接的にＢｉａｃｏｒｅセンサーチップに被覆され得て、種々の濃度のＬＲＰが相互作用のオン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）およびオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の双方を測定するためにチップ上を通過され得る（Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１１），ｐｐ．９３７０‐７）。二つの速度の比が親和性の尺度を与える。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化の際の親和性における２分の１、５分の１、１０分の１たは３０分の１の減少が望ましい。
プロテアーゼＡＰＣによるＦＶＩＩＩの分解は、当業者に既知のいずれの方法によって測定され得る。
一実施形態において生体適合性ポリマーは、ＦＶＩＩＩ（配列番号２）のアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４の一または複数において該ポリペプチドに共有結合される。他の実施形態において生体適合ポリマーは、第ＶＩＩＩ因子（配列番号２）のアミノ酸位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、および２２８４の一または複数において該ポリペプチドに共有結合され、しかも（１）複合体の低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質への結合は、非複合化ポリペプチドの低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質への結合よりも少ない；（２）複合体の低密度リポタンパク質受容体への結合は、非複合化ポリペプチドの低密度リポタンパク質受容体への結合よりも少ない；または（３）複合体の低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質および低密度リポタンパク質受容体の双方への結合は、非複合化ポリペプチドの低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質および低密度リポタンパク質受容体への結合よりも少ない。一実施形態においてＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩにおける残基１８０４は、システインに変異されてＰＥＧに複合化される。
さらなる実施形態において生体適合性ポリマーは、ＦＶＩＩＩ（配列番号２）のアミノ酸位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６および７１１の一または複数において該ポリペプチドに共有結合され、しかも複合体のヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合は、非複合化ポリペプチドのヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合よりも少ない。さらなる実施形態において生体適合性ポリマーは、第ＶＩＩＩ因子（配列番号２）のアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４の一または複数において該ポリペプチドに共有結合されて、該複合体は非複合化ポリペプチドよりも少ない第ＶＩＩＩ因子阻害抗体への結合性を有する。さらなる実施形態において生体適合性ポリマーは、第ＶＩＩＩ因子（配列番号２）のアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４の一または複数において、ならびにいくつかの実施形態においては、位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６および７１１の一または複数において該ポリペプチドに共有結合されていて、複合体は非複合化ポリペプチドよりも、第ＶＩＩＩ分解が可能な血漿プロテアーゼによるより少ない分解を受ける。いくつかの実施形態において血漿プロテアーゼは、活性化タンパク質Ｃである。
さらなる実施形態において生体適合ポリマーは、アミノ酸位置１２９、４９１、１８０４および／または１８０８において、ならびにいくつかの実施形態においては４９１または１８０８において、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子に共有結合される。さらなる実施形態において生体適合性ポリマーは、第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸位置１８０４において該ポリペプチドに結合され、ポリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態において生体適合性ポリマー結合のための一または複数の所定の部位は、部位特異的システイン変異によって制御される。
機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド上の一または複数の部位、いくつかの実施形態においては一または二の部位が、ポリマー結合のための所定の部位であり得る。特別な実施形態において該ポリペプチドは、モノＰＥＧ化またはジＰＥＧ化される。
実施形態はまた、複合体の調製方法にも関し、該方法は、所定の部位においてシステイン残基をコードする配列に置換するために、機能性第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を変異させ；システインが増加した突然変異タンパク質を産生するために、変異ヌクレオチド配列を発現させ；突然変異タンパク質を精製し；複合体が形成されるように、実質的に還元されたシステイン残基のみにおいてポリペプチドと反応するように活性化されていた生体適合性ポリマーと突然変異タンパク質を反応させ；ならびに複合体を精製することを含む。他の実施形態は：（ａ）部位特異的第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質を発現し、ここで該突然変異タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質の表面に露出されたアミノ酸残基のシステイン置換を有し、そのシステインはキャッピングされており；（ｂ）システイン突然変異タンパク質を穏やかに還元し、およびキャップを遊離する条件下でシステイン突然変異タンパク質を還元剤と接触させ；（ｃ）システイン突然変異タンパク質からキャップおよび還元剤を除去し；ならびに（ｄ）還元剤の除去後の少なくとも約５分間、およびいくつかの実施形態においては少なくとも１５分間、いくつかの実施形態においては少なくとも３０分間、ＰＥＧ化第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質が産生されるような条件下で、システイン突然変異タンパク質をスルフヒドリル結合部分を含むＰＥＧにより処理すること、を含む第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質の部位特異的ＰＥＧ化のための方法を提供する。ＰＥＧのスルフヒドリル結合部分は、チオール、トリフラート、トシラート、アジリジン、オキシラン、Ｓ‐ピリジルおよびマレイミド部分から成る群より選択され、いつくかの実施形態においてはマレイミドである。
一実施形態において当該方法は、一または複数のＢＤＤの表面アミノ酸をシステインで置換し、哺乳動物の発現系においてシステイン突然変異タンパク質を産生し、増殖培地由来のシステインによって発現の間キャッピングされていたシステインを還元し、ＢＤＤジスルフィドが再編することができるように還元剤を除去し、ならびにＰＥＧマレイミド等のシステイン特異的生体適合性ポリマー試薬と反応することを含む。このような試薬の例は、５、２２または４３ｋＤ等のＰＥＧサイズを有するＰＥＧマレイミドであり、それぞれカタログ番号、２Ｄ２Ｍ０Ｈ０１ ｍＰＥＧ‐ＭＡＬ ＭＷ ５，０００ Ｄａ、２Ｄ２Ｍ０Ｐ０１ ｍＰＥＧ‐ＭＡＬ ＭＷ ２０ｋＤ、２Ｄ３Ｘ０Ｐ０１ ｍＰＥＧ２‐ＭＡＬ ＭＷ ４０ ｋＤのもと、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｏｏｆ Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能であり、または１２または３３ ｋＤは、それぞれカタログ番号Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ‐１２０ＭＡおよびＳｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ‐３００ＭＡのもと、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ（日油株式会社）から入手可能である。ＰＥＧ化された産物は、未反応のＰＥＧを除去するためにイオン交換クロマトグラフィーを使用して、ならびに未反応のＢＤＤを除去するためにサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製される。この方法は、受容体介在性クリアランス、阻害抗体結合およびタンパク質分解性酵素による分解等のＦＶＩＩＩとの好ましくない相互作用を同定し、選択的に除去するために使用し得る。ＮｅｋｔａｒまたはＮＯＦによって５ ｋＤとして供給されたＰＥＧ試薬は出願人の実験室において６ ｋＤと分析され、および同様に線状の２０ ｋＤとして供給されたＰＥＧ試薬は２２ｋＤ、４０ｋＤとして供給されたものは４３ ｋＤと、ならびに６０ ｋＤとして供給されたものは出願人の実験室において６４ ｋＤと分析されたことが注目された。混乱を避けるために出願人は、本明細書での議論において、製造者が同定した通り５ｋＤと報告する、５ｋＤのＰＥＧを除き出願人の実験室で分析された分子量を使用する。
ＢＤＤの位置４９１および１８０８におけるシステイン変異（上で開示）に加えて、位置４８７、４９６、５０４、４６８、１８１０、１８１２、１８１３、１８１５、１７９５、１７９６、１８０３および１８０４が、ＰＥＧ化の際のＬＲＰ結合のブロックを潜在的に可能とするためにシステインに変異された。同様に、位置３７７、３７８および５５６が、ＰＥＧ化の際のＬＲＰおよびＨＳＰＧ双方の結合のブロックを可能とするためにシステインに変異された。本来のグリコシル化部位（４１、２３９および２１１８）およびＬＲＰ結合部位におけるＰＥＧ化と共にこれらの位置における大きなＰＥＧ（＞４０ｋＤ）による部位特異的ＰＥＧ化が、ＢＤＤの表面を完全に被い、ＢＤＤに対する新規なクリアランス機構を確定するように、位置８１、１２９、４２２、５２３、５７０、１８６４、１９１１、２０９１および２２８４が、ＢＤＤ上で等間隔となるように選択された。
一実施形態において細胞培養培地は、ジスルフィド結合を形成することによって突然変異タンパク質上のシステイン残基を「キャッピングする」システインを含む。複合体の調製において組換え系中で産生されたシステイン突然変異タンパク質は、培地由来のシステインによりキャッピングされ、システイン特異的なポリマー試薬を添加する前にキャップを遊離する穏やかな還元によって、このキャップは除去される。ＦＶＩＩＩの部位特異的変異のための当該技術分野において既知の他の方法もまた、当業者に明らかな通り使用され得る。
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）
第ＩＸ因子は、血液凝固カスケードにおいて必須である。身体中における第ＩＸ因子の欠乏は、血友病の一種（Ｂ型）を特徴付ける。この疾患の治療は、通常第ＩＸ因子の濃縮物であるヒト血漿タンパク質の静脈注入に限られている。市販の組換え製品が、商標Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標）のもとに市販されている。
有用なＦＩＸ分子には、完全長タンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質のサブユニットまたはフラグメントおよびその変異体および抗原性フラグメントが含まれる。ＦＩＸへの言及は、このようなタンパク質の潜在的な形態のすべてを含む。
いくつかの実施形態においてヒトＦＩＸの配列は、配列番号８を含むが、対立遺伝子変異体も可能である。第ＩＸ因子、変異体、フラグメントおよび／または同様にそれらの製作に有用な方法は、例えば、以下の米国特許出願公開および米国特許： ２０１３００９５５５５； ２０１２０３０８５４０； ２０１２０２６３７０３； ２０１２／０２７０３００； ２０１２０１７７６２５； ２０１２０１６４１３０； ２０１１０２４４５５０； ２０１１０２１７２８４； ２０１１０１８３９０６； ２０１１０１５４５１６； ２０１１０１３７０１１； ２０１１００４６０６０； ２０１００３３００６０； ２０１００３１６６２５； ２０１００２８４９７１； ２０１００２４９０３３； ２０１００１３７５１１； ２０１００１３０６８４； ２０１００１３０４２８； ２０１００１２０９８２； ２０１０００８１７９１； ２０１０００８１７１２； ２００９０２８０５５０； ２００９０２３９７９７； ２００９０２２１４９２； ２００９０１７６７０８； ２００９００８１８８； ２００８０３１８８５０； ２００８０３０５９９１； ２００８０２５５０２６； ２００８０２０７８９７； ２００８０１８８４１４； ２００８０１７６２８７； ２００８０１６７２１９； ２００８０１５３１５６； ２００８０１０２１１５； ２００８００７５７１１； ２００７０２４４０３６； ２００６０２８７２２８； ２００６０２１１６２１； ２００６００５２３０２； ２００６００４０８５６； ２００５０１００９８２； ２００４０２５４１０６； ２００４０１３３９３０； ２００４０１１０６７５； ２００４０１０６７７９； ２００３０２０３８４５； ２００２０１６６１３０； ２００２００３１７９９； ２００１００３１７２１； ８，４０４，８０９； ８，３９９，６３２； ８，３８３，３８８； ８．１９８，４２１； ８，１６８，４２５； ８，０３０，０６５； ７，８８８，３２１； ７，８８８，０６７； ７，７００，７３４； ７，５７９，４４４； ７，５７５，８９７； ７，４１９，９４８； ７，３７５，０８４； ７，１７９，６１７； ７，１２５，８４１； ６，６７０，１７６； ６，６２７，７３７； ６，５３１，２９８； ６，３７２，７１６； ６，３４４，５９６； ６，２８４，８７１； ６，２８０，７２９； ６，０６３，９０９； ６，０４６，３８０； ６，０４３，２１５； ６，０３７，４５２； ６，０３４，２２２； ５，９６９，０４０； ５，９１９．９０９； ５，９１９．９０８； ５，７７０，７００； ５，７１４，５８３； ５，６３９，８５７； ５，６２１，０３９； ５，６１４，５００； ５，５２１，０７０； ５，４５７，１８１； ５，４０９，９９０； ５，２８６，８４９； ５，２８１，６６１； ５，１７１，５６９； ５，０６１，７８９； ５，０５５，５５７； ４，７８６，７２６； ４，７７０，９９９；および４，０８１，４３２において記載されており、それらは第ＩＸ因子、変異体、フラグメントおよび／またはそれを作成する方法に関する範囲で、参照することにより本明細書で援用される。
第Ｘ因子（ＦＸ）
第Ｘ因子（ＦＸ）は、血液凝固において中心的役割を果たすビタミンＫ依存性の二本鎖糖タンパク質である。第Ｘ因子欠乏症は、人口５００，０００人中１人ないし１，０００，０００人中１人に影響を及ぼす稀な出血性障害である。それは、それぞれ血友病ＡおよびＢにおいて第ＶＩＩＩ因子欠乏および第ＩＸ因子欠乏によって起こされるものと類似した過剰な出血の傾向によって特徴づけられる。
有用なＦＸ分子には、完全長タンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質のサブユニットまたはフラグメント、ならびにその変異体および抗原性フラグメントが含まれる。ＦＸへの言及は、このようなタンパク質の潜在的な形態のすべてを含むことを意味する。
いくつかの実施形態においてＦＸポリペプチドは、配列番号１０を含むが、対立遺伝子変異体も可能である。第Ｘ因子、変異体、フラグメントおよび／または同様に有用なその作成方法は、例えば、下記の米国特許出願公開および米国特許： ２０１２０２３１５２３； ２０１２００３９８６３； ２０１１０２７５６６６； ２０１００２８５５６８； ２０１００２３３１４９； ２００９０１７５８２８； ２００９００５３１８５； ２００７０２０７９５３； ２００７００３２４２４； ２００６０１４８０３８； ２００５０１５３８８２； ２００３０２０７７９６； ２００３０１８１３８１； ２００３０１３８９１４； ８，２９３，８７４； ８，１７３，７７７； ８，１６８，７５３； ７，７２，３７１； ７，２２０，５６９； ７，１７９，８９０； ６，９５８，３２２； ６，９０５，８４６； ６，７８３，９５３； ６，５７３，０７１； ６，５６２，５９８； ６，１１７，８３６； ５，７９８，３３２；および４，５０１，７３１に記載されており、第Ｘ因子、変異体、フラグメントおよび／またはその作成方法に関するその開示の範囲において、参照することにより本明細書で援用される。
第ＸＩ因子（ＦＸＩ）
ヒト第ＸＩ因子は、約１６０，０００ダルトンの分子量を有する二本鎖の糖タンパク質である。二つの鎖は、約８０、０００ダルトンの分子量を有するジスルフィド結合した同一のポリペプチドである。第ＸＩ因子は、第ＸＩＩａ因子によって第ＸＩａ因子に活性化される。ヒト第ＸＩ因子のアミノ酸配列が決定されており（例えば、Ｆｕｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：２４１７‐２４２４（１９８６）を参照されたい）、配列番号７として提供される。ヒトにおいてＦＸＩの遺伝子は、第４染色体の先端部（４ｑ３５．２）に位置し、ゲノムＤＮＡの約２５ｋｂにわたり広がった１５のエクソンを含む（Ａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６：７２２１‐７２２８（１９８７）；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．５２：７７（１９８９））。いくつかの実施形態において、ヒトＦＸＩの配列は配列番号７である（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ０３９５１）。
第ＸＩ因子の活性化の間に内部のペプチド結合が、二つの鎖の各々において第ＸＩＩａ因子によって切断され、ジスルフィド結合により結合した二つの重鎖および二つの軽鎖から成るセリンプロテアーゼである活性化第ＸＩａ因子をもたらす。活性化第ＸＩ因子は、第ＩＸ因子を活性化することによって血液凝固の内因性経路の中期を引き起こす。本因子の欠損は、血液凝固異常であるローゼンタール症候群（血友病Ｃとしても知られる）を引き起こす。第ＸＩ因子タンパク質はＦ１１遺伝子によりコードされている。ＦＸＩはまた、凝固第ＸＩ因子または血漿トロンボプラスチン前駆体としても知られている。
第ＸＩＩａ因子による第ＸＩ因子の活性化のための切断部位は、各々のポリペプチド鎖におけるＡｒｇ‐３６９とＩｌｅ‐３７０の間の内部ペプチド結合である（Ｆｕｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：２４１７‐２４２４（１９８６））。第ＸＩａ因子の各重鎖（３６９個のアミノ酸）は、四つのアップルドメイン（Ａ１〜Ａ４と命名される）と称される９０〜９１個のアミノ酸のタンデムリピートプラス短い架橋ペプチドを含む（Ｆｕｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：２４１７‐２４２４（１９８６）；；Ｓｕｎ ｅｔａ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３６３７３‐３６３７８（１９９９））。第ＸＩａ因子の軽鎖（各２３８個のアミノ酸）は、セリンプロテアーゼのトリプシンファミリーに典型的である配列を有する酵素の触媒部分を含む（Ｆｕｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：２４１７‐２４２４（１９８６））。ＸＩａは、第ＸＩ因子Ａ３ドメインを要求する相互作用において、その基質である第ＩＸ因子をタンパク質分解的に切断する（Ｓｕｎ，Ｙ．，ａｎｄ Ｇａｉｌａｎｉ，Ｄ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２９０２３‐２９０２８（１９９６））。
有用なＦＸＩ分子には、完全長タンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質のサブユニットまたはフラグメント、およびその変異体および抗原性フラグメントが含まれる。ＦＸＩへの言及には、このようなタンパク質のすべての可能な形態が含まれる。
いくつかの実施形態においてＦＸＩポリペプチドは、配列番号７を含むが、対立遺伝子変異体も可能である。第ＸＩ因子、変異体、フラグメントおよび／または同様に有用なその製造方法は、例えば、以下の米国特許出願公開および米国特許： ２０１２００８３５２２； ２０１１０１５９００６； ２０１１００２０３４９； ２０１００１４４６２０； ２０１０００６２５１２； ２００８００５８２６６； ２００７００２７０７７； ２００５０１８１９７８； ２００３００４０４８０および５，２５２，２１７に記載されており、第ＸＩ因子、変異体、フラグメントおよび／またはその製造方法に関する範囲において、参照することにより本明細書で援用される。
シグレッグリガンド
実施形態の通りに複合体は、シグレックリガンドを含む。シアル酸結合免疫グロブリン様レクチンの略であるシグレックは、細胞表面受容体であり、ならびに糖類を認識する免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバ―である。免疫グロブリンドメインを使用して炭水化物を認識するその能力は、それらをＩ‐型（Ｉｇ‐型）レクチンの一群に配置する。シグレックは、シアル酸および種々の数のＣ２型Ｉｇ（ＩｇＣ２）ドメインと結合するＮ末端Ｖ様免疫グロブリン（ＩｇＶ）ドメインを含む、膜貫通型タンパク質である。最初に記載されたシグレックは、マクロファージ上のレクチン様接着分子であるシアロアドヘシン（リグレック‐１／ＣＤ１６９）である。他のシグレックは、ＣＤ２２（シグレック‐２）およびシグレック‐Ｇ／１０（すなわち、ヒトシグレック‐１０およびマウスシグレック‐Ｇ）、これらは、Ｂ細胞上で発現され、その接着および活性化を制御するうえで重要な役割を有する、ＣＤ３３（シグレック‐３）およびミエリン会合糖タンパク質（ＭＡＧ／シグレック‐４）を含み、後にこのファミリーに追加された。いくつかの追加のシグレック（シグレック５〜１２）がヒトにおいて同定されて、構造的にＣＤ３３に高度に類似しているので、その結果集合的に「ＣＤ３３関連シグレック」と称されている。これらのシグレックは、ヒトＮＫ細胞、Ｂ細胞および／または単球細胞上で発現される。ＣＤ３３‐関連シグレックのすべては、その細胞質側末端に二つの保存的免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）様モチーフを有し、細胞の活性化におけるその関与を示唆する。シグレックに関する詳細な記載は、参考文献、例えば、Ｃｒｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：２５５‐６６，２００７；Ｃｒｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：１３７‐４５，２００１；Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ １０：５５５‐５６６，２００６；およびＨｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６９５‐７０４，２００７において提供される。
シグレックの糖鎖リガンドは、特に一または複数のシグレックを認識する化合物を表し、単糖残基のホモポリマーまたはヘテロポリマーを含む。糖鎖配列に加えてシグレック糖鎖リガンドはまた、リンカーにより糖鎖に連結されたＰＥＧ化脂質部分も含み得る。種々のシグレック糖鎖リガンドの例は、文献、例えば、米国特許第８，３５７，６７１号；およびＢｌｉｘｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０：６６８０‐１（２００８）等に報告されており、リガンドおよび合成方法に関する開示の範囲において参照することにより本明細書で援用される。
いくつかの実施形態においてシグレックリガンドは、抑制型シグレックに対するリガンドである。いくつかの実施形態においてシグレックリガンドは、シグレック‐１（ＣＤ１６９）、シグレック‐２（ＣＤ２２）、シグレック‐３（ＣＤ３３）、シグレック‐４（ＭＡＧ）、シグレック‐５、シグレック‐６、シグレック‐７、シグレック‐８、シグレック‐９、シグレック‐Ｇ／１０、シグレック‐１１およびシグレック‐１２から選択されるシグレックに結合する。いくつかの実施形態においてシグレックは、Ｂリンパ球の表面上で発現される。いくつかの実施形態においてシグレックリガンドは、シグレック‐Ｇ／１０リガンドである。
いくつかの実施形態において適切なシグレックリガンドには、Ｂリンパ球上に見出されるシグレック‐２（ＣＤ２２）に対するリガンドが含まれる。いくつかの実施形態においてリガンドは、糖鎖リガンドである。リガンドは、ＣＤ２２（シグレック‐２）を認識する天然リガンドまたは合成リガンドであり得る。いくつかの種由来のＣＤ２２が当該技術分野で知られている。例えば、ヒトＣＤ２２に関するアミノ酸配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースにおける登録番号ＮＰ ００１７６２（ｇｉ：４５０２６５１）で開示されており、同様にＷＯ ２００７／０５６５２５で入手可能である。マウスＣＤ２２もまた、当該技術分野、例えば、Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：２６４１‐９，１９９２；およびＬａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３３６８‐７６，１９９５において特性づけられている。ＣＤ２２以外にシグレック‐Ｇ／１０が、Ｂ細胞の表面上で発現されるもう一つのシグレックである。ヒトシグレック‐１０およびその相同分子種（オルソログ）であるシグレック‐Ｇは、当該技術分野において双方とも周知であり良く特性づけられている。例えば、Ｍｕｎｄａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５５：４８９‐４９７，２００１；Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：６０８３‐９６，２００１；Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６９５‐７０４，２００７；およびＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：５５７‐６１，２００９を参照されたい。
シグレックの種々のリガンドが知られており、本実施形態の実施のために適している。例えば、米国特許第８，３５７，６７１号；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１５：４７７８‐８６（２０１０）；Ｂｌｉｘｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｒｎ．Ｓｏｃ．１３０：６６８０‐１（２００８）；Ｋｕｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．４：４２（２００７）；およびＫｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３２２００‐７（２００７）を参照されたいが、これらはリガンドおよび合成方法の開示の範囲において参照することにより本明細書で援用される。
例えば、ＮｅｕＡｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ、またはＮｅｕＡｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４（６‐スルホ）ＧｌｃＮＡｃ等のヒトＣＤ２２の天然リガンドは、ヒトＢ細胞に対する凝固因子タンパク質を標的とするために使用し得る。加えて改善された活性を有するいくつかの合成ＣＤ２２リガンドもまた利用可能であり、例えば、９‐Ｎ‐ビフェニルカルボキシル‐ＮｅｕＡｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ（６´‐ＢＰＣＮｅｕＡｃ）および９‐Ｎ‐ビフェニルカルボキシル‐ＮｅｕＡｃα２‐３Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ（３´‐ＢＰＣＮｅｕＡｃ）等である。ヒトＣＤ２２に対するより特異的な糖鎖リガンドが、当該技術分野、例えば、Ｂｌｉｘｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｒｎ．Ｓｏｃ．１３０：６６８０‐１，２００８；およびＰａｕｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ２００７／０５６５２５等に記載されている。同様にマウスＣＤ２２に対する多数の糖鎖リガンドが文献中に報告されている。例には、ＮｅｕＧｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ（ＮｅｕＧｃ）、９‐Ｎ‐ビフェニルアセチル‐ＮｅｕＧｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ（ＢＰＡＮｅｕＧｃ）およびＮｅｕＧｃα２‐３Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃが含まれる。これらのＣＤ２２リガンドのいくつかは、シグレック‐Ｇ／１０に結合可能であることも知られている。本明細書で例示される天然および合成シグレックリガンド以外に、実施形態の実施において例示されるこれらのいずれの糖鎖リガンドの、誘導体またはアナログ化合物もまた用いることが可能である。
用語「アナログ」または「誘導体」は、既知のシグレックリガンドに構造的に類似するが、基準分子の特異的な置換基を代わりの置換基により置換することによって、標的化方式および制御方式で修飾されている分子を表すために本明細書で使用される。基準分子と比較してアナログには、当業者によって同様の、類似のまたは改善された有用性が予想されるであろう。改善された特色を有する既知の化合物の変異体を同定するためのアナログの合成およびスクリーニングは、薬化学において周知の研究方法である。
方法
本実施形態は、凝固因子に対する望ましくない免疫応答を抑制するための、および／または免疫寛容を誘導するための方法および治療目的の使用を提供する。本明細書記載の複合体は、望ましくない免疫応答または免疫活性化に関連するまたは介在される、種々の障害を治療または防止するために使用され得る。治療を必要とする被験者におけるＢ細胞に対する凝固因子タンパク質を標的とすることによって、複合体は寛容を誘導するために適している。
一実施形態において、凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体およびＢ細胞シグレックリガンドを含む複合体の有効量を被験者に投与することを含む、被験者において凝固因子タンパク質に対する寛容を誘導する方法が提供される。
いくつかの実施形態において複合体の組み合せが被験者に投与され得て、ここで該複合体は凝固因子タンパク質、その抗原性フラグメントもしくは変異体の混合物を含む。
一実施形態において該組み合せは、例えば、複数の異なる市販ＦＶＩＩＩ製品を含む、複数のＦＶＩＩＩタンパク質を含む。
他の実施形態において該組み合わせは、一または複数の異なる市販のＦＶＩＩＩ製品および一または複数のＢＤＤ ＦＶＩＩＩを含む。
他の実施形態において該複合体は、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸおよびＦＸＩの一または複数を含む。
複合体の投与経路に特別な制限はなく、一実施形態において複合体は、静脈注射、筋肉内注射または腹腔内注射等の注入によって投与され得る。
本明細書に記載の通り、凝固因子タンパク質に対する寛容を誘導する方法は、出血性障害を治療するために凝固因子タンパク質の有効量がバイオ治療として投与される、出血性障害を治療する方法の前、最中および／または後に実施され得る。いくつかの実施形態において治療される被験者は、インビボで短縮されたＦＶＩＩＩの半減期、変更されたＦＶＩＩＩの結合性、ＦＶＩＩＩの遺伝的欠陥および／または減少したＦＶＩＩＩの発現を有する。一実施形態において出血性障害は血友病である。
本実施形態はまた、治療を必要とする被験者に１）本実施形態の有効量の複合体および２）有効量の凝固因子を投与する事を含む、血友病等の出血性障害を治療する方法も提供する。いくつかの実施形態において段階２）で使用されるのと同じ凝固因子が、段階１）において使用される複合体を作成するために使用され、その結果投与される凝固因子に対し寛容が特異的に作成される。
一実施形態において複合体は、投与されるときに凝固因子タンパク質に対する寛容を誘導し抗体の発生を防止するために、凝固因子タンパク質の前に患者に投与される。
いくつかの実施形態において複合体は、補充療法中の被験者における、凝固因子タンパク質に対する抗体の検出後に被験者に投与される。いくつかの実施形態において凝固因子タンパク質は、複合体を使用して寛容が達成された後に引き続き投与される。
いくつかの実施形態において複合体は、凝固因子タンパク質が投与される約３０日前に投与される。いくつかの実施形態において複合体は、凝固因子タンパク質が投与される約２５日、２０日、１５日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日または１日前に投与される。いくつかの実施形態において複合体は、凝固因子タンパク質と同日に投与される。いくつかの実施形態において複合体は、凝固因子タンパク質が投与される約３０日、２５日、２０日、１５日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日または１日後に投与される。用語「被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物等の哺乳動物として分類されるいずれかの動物を表す。非ヒト動物の例には、イヌ、ネコ、畜牛、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、等が含まれる。特に断りの無い限り用語「患者」または「被験者」は、本明細書では同じ意味で使用される。いくつかの実施形態において被験者はヒトである。
治療または寛容誘導を必要とする被験者には、既に疾患または障害に掛かっている被験者ならびに出血性障害を発症するリスクにある被験者が含まれる。いくつかの実施形態において被験者は、バイオ治療の凝固因子タンパク質に対する陽性の抗体反応を示した。
本明細書記載の複合体は、単独でまたは医薬組成物の成分として投与され得る。本実施形態の医薬組成物は、少なくとも一つの薬剤的に許容可能な担体と製剤化された複合体の有効量を含む。本実施形態の医薬組成物は、薬学の技術分野において周知のいずれかの方法によって調製され投与され得る。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ‘ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃｓ（グッドマン・ギルマン「治療の薬理学的基礎」），Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ（編），ＭｃＧｒａｗ‐Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（１０ｔｈ ｅｄ．（第１０版），２００１）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（レミントン「薬学の科学と実践」），Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．（編），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０ｔｈ ｅｄ．（第２０版），２００３）；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（医薬品の剤形およびドラッグデリバリーシステム），Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．（編）），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（７ｔｈ ｅｄ．（第７版），１９９９）等を参照されたい。加えて本実施形態の医薬組成物はまた、他の医療的に有用な薬剤または生物学的製剤を含むように製剤化され得る。
いくつかの実施形態において複合体は、インビボでの適応に使用される。これらの適応において本明細書記載の複合体は、当該技術分野において既に十分に確立されたプロトコルに従って、治療を必要とする被験者に投与され得る。複合体は、単独でまたは適切な医薬組成物中で担体と組み合わせて投与されうる。典型的には複合体の治療的有効量が、薬剤的に許容可能な担体と組み合わされる。薬剤的に許容可能な担体は、当該技術分野において既知のまたは確立されたいずれかの担体である。代表的な薬剤的に許容可能な担体には、パイロジェン除去滅菌水およびパイロジェン除去滅菌生理的食塩水が含まれる。本実施形態のために使用され得る薬剤的に許容可能な担体の他の形態には、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、吸収剤、促進剤、保湿剤、吸収体、滑沢剤、充填剤、増量剤、水分付与剤、保存剤、安定剤、乳剤、可溶化剤、浸透圧を制御する塩、緩衝液等の希釈剤および製剤の使用形態に依存して通常使用される賦形剤が含まれる。これらは、もたらされる製剤の単位用量に依存して任意に選択され、使用される。
複合体の有効量は、被験者が患っている出血性障害、他の被験者の既知の因子、例えば、年齢、体重、等に依存して変動するので、各症例ごとに経験的に決定されなければならない。この経験的な決定は、日常的な実験によって成され得る。いくつかの実施形態においてリポソーム成分は、送達される抗原と比べて約２００：１（ｗ／ｗ）、例えば、１００〜３００：１（ｗ／ｗ）の比で使用され得る。いくつかの実施形態においてリポソーム組成物の典型的な薬用量は、用量当たり約５〜１００ｍｇ、例えば用量当たり１０ｍｇである。
インビボでの適応のために複合体は、例えば、経口、非経口または吸入等の通例の投与経路によって患者に投与され得る。以下の実施例において示す通り、抗原およびシグレックリガンドを同時に提示するリポソームは、静脈注射によって患者に投与され得る。いくつかの実施形態においてリポソーム複合体は、経脈管的に被験者に投与され得る。血管内投与に有用なリポソームは、小さなユニラメラ状リポソームであり得て、またはＰＥＧ‐２０００を含むリポソームであり得る。組成物が非経口的に投与されるとき、薬剤の形態には、静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射および腹腔内注射に使用される注射用剤（液体剤、懸濁剤）、液剤、懸濁剤、乳剤および滴下剤が含まれる。
いくつかの他の実施形態において複合体は、経口的に被験者に投与される。これらの実施形態において薬剤形態には、固形剤、例えば、錠剤、被覆錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤および丸剤等、液体製剤、例えば、液剤（例えば、点眼液、点鼻薬）、懸濁剤、乳剤およびシロップ等、吸入剤、例えば、エアゾール剤等の吸入剤、アトマイザーおよびネブライザー、ならびにリポソーム含有製剤が含まれる。さらにいくつかの他の実施形態において複合体は、被験者の気管および／または肺を標的とするために患者の呼吸器に吸引によって投与される。これらの実施形態において市販のネブライザーが、リポソーム複合体の薬用量を送達するためにエアゾールの形態で使用され得る。
本実施形態は、本実施形態の方法を実行するための医薬配合物（例えば、キット）をさらに提供する。いくつかの実施形態においてキットは、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＸ、ＦＸおよびＦＸＩを含む、本実施形態の一または複数の複合体を含む。いくつかの実施形態においてキットは、管理用抗体、抗体検出試薬および精製抗原を含む、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ，ＦＶＩＸ、ＦＸおよびＦＸＩの一または複数に対する被験者の抗体を検出するための試薬をさらに含む。いくつかの実施形態においてキットは、ＦＶＩＩ，ＦＶＩＩＩ，ＦＶＩＸ、ＦＸおよびＦＸＩを含む、被験者に投与し得る一または複数のバイオ治療薬を含む。いくつかの実施形態において複合体は、医薬組成物中に含まれる。いくつかの実施形態においてキットは、薬剤の投与および／または被験者における抗体検出試験のための取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態においてキット中の取扱い説明書は、一般的に所期の使用法に対する用量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。キットの容器は、一回分の単位、バルク包装体（例えばマルチドーズ包装体）または一回分のサブ単位であり得る。本実施形態のキット中に供給される取り扱い説明書は、典型的にはラベルまたは能書き（例えば、キット中に含まれる紙）上の文書による指示書であるが、機械で読み取れる取扱い説明書(例えば、磁気記憶ディスクまたは光収納ディスク)もまた許容可能である。
いくつかの実施形態においてキットは、特異的な凝固因子ポリペプチドおよびシグレックリガンドを含む、複合体を産生するための材料を含む。一般的にこれらのキットは、それからリポソーム組成物または免疫複合体が作成され得る、一または複数の抗原および一または複数のシグレックリガンドの分離した容器を含む。組成物を作成するための追加の試薬、例えば、リポソームを作成するための試薬等もまたキット中に提供され得る。シグレックリガンドおよび抗原は、いくつかの実施形態において、供給されたシグレックリガンドおよび抗原と他の試薬との混合の際に、複合体の形成を可能とする形態で供給される。
本実施形態は、本明細書で特定の実施例および実施形態に関連して記載されているが、当業者は、すべての関連する特許法に準拠するために、種々の実施例および実施形態が結び付けられること（例えば、特定の実施例に記載の方法は、このようなことがそれへの言及において明示的に記載されていないとしても、実施形態の特定の態様およびその運用を記載するために使用され得る）を了解するであろう。
本教示の態様は、以下の実施例を考慮すればよりよく理解され得ようが、実施例は決して本教示の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
実施例１
シグレックリガンドを有する寛容原性リポソーム。
Ｔ細胞依存性抗原に対する寛容を誘導するために、ＣＤ２２をＢ細胞上の免疫シナプスにリクルートすることの可能性を検討するために、多用途のプラットホームが必要とされた。タンパク質および糖鎖リガンドを脂質に共有結合するために存在し膜の中に組み込むための、その検証されたインビボでの使用および頑強な方法のゆえに、リポソームのナノ粒子を選択した（Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１５，４７７８‐４７８６（２０１０）；Ｌｏｕｇｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３２，２５‐３５（１９９０）；Ｓｈｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５０，１０１‐１０６（１９８３））。従って、抗原単独(免疫原)または抗原およびＣＤ２２リガンド（寛容原；図１ａ）のいずれかを提示するリポソームを構築した。初期段階の研究において高親和性シグレックリガンド、ＢＰＣＮｅｕＧｃ（ＢＰＡＮｅｕＧｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ；図１ｂ）を使用したが、それはその天然リガンド（ＮｅｕＧｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ；図１ｂ）よりも２００倍高い親和性でマウスＣＤ２２に結合し、シグレック‐Ｇ１５、１９とわずかな交差反応性しか有さない。
このプラットホームを、ポリアクリルアミドポリマーにテザリングした同じ抗原にによる初期段階の研究に類似する実験において、Ｔ細胞非依存性抗原ニトロフェノール（ＮＰ）を使用して検証した。寛容原性リポソームを注射されたマウスは、抗ＮＰ応答における劇的な減少を示し（ＩｇＭおよびＩｇＧアイソタイプの双方）、免疫原性リポソームによるその後の二つの負荷に対し応答することができなかった（図１ｃ）。対照的に寛容原性リポソームにより処理されたＣＤ２２ＫＯマウスは、その後の負荷の際にＮＰに対する免疫寛容化を示さなかった；従ってＮＰに対する寛容は、ＷＴマウスにおいてＣＤ２２依存的に誘導された。
次にニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）を提示する寛容原性および免疫原性リポソームを、Ｔ細胞依存性抗原に対する寛容を誘導する能力を検討するために処方した。同じ実験計画を使用して寛容原性リポソームは、ＨＥＬに対するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの頑強な寛容をＣＤ２２依存的に誘導した（図２ｄ）。ＨＥＬに対する寛容化実験を、種々の量のＢＰＡＮｅｕＧｃまたはＮｅｕＧｃのいずれかで処方したリポソームにより繰り返した。免疫原性リポソームによる１５日および３０日の二つの負荷を含む４４日の実験の最後において、両リガンドに対する抗体産生に関する用量依存的効果が明らかであった（図２ｅ）。二つのリガンドの間のＥＣ５０における二桁の差異は、ＣＤ２２１９に対するそれらの既知の親和性と一致する。ＨＥＬに対する完全な寛容化は、発達させるために２週間を必要とし、４か月にわたってゆっくりと失われた（図２ｆ）。寛容における喪失の動力学は、新規に生じたＢ細胞が抗ＨＥＬ応答を再確立することを示唆する。
実施例２
寛容原性リポソームはアポトーシスを誘導する。
次に寛容誘導の機構を、ＭＤ４マウス２０由来のＨＥＬ反応性（ＩｇＭＨＥＬ）遺伝子導入Ｂ細胞を使用して検討した。ＨＥＬおよびＢＰＡＮｅｕＧｃを提示するリポソームは、カルシウム流動、ＣＤ８６アップレグレーションおよび増殖から判断して、ＨＥＬのみを提示するリポソームと比較してインビトロでのＩｇＭＨＥＬ Ｂ細胞の活性化を完全に抑制した（図２ａ‐ｃ）。ＣＤ２２ＫＯ遺伝子背景のＩｇＭＨＥＬＢ細胞の使用は、Ｂ細胞活性化のすべての三つの読み取りにおいて、阻害が完全にＣＤ２２依存的であることを明らかにした（図２ａ）。リガンドまたは抗原のいずれかを単独で提示するリポソームの混合物は、阻害をもたらさなかったので、阻害は同一のリポソーム上でのリガンドおよび抗原の双方の提示を必要とした（図２ａ）。増殖アッセイにおいて（図２ｃ）寛容原性リポソームで処理された細胞は、未刺激細胞と比較して数が減少していた。生細胞のパーセント（アネキシンＶ‐ＰＩ‐）を分析して、寛容原性リポソームが時間依存的に生細胞数の顕著な減少を引き起こすことを明らかにした（図２ｄ）。Ｔ細胞ヘルプを模倣するための抗ＣＤ４０を有する培養細胞は、細胞死を遅らせたが、阻止しなかった。ＣＤ２２リガンドを単独で提示するリポソームは、寛容原性リポソームの効果を再現しなかったことが注目される。
次に同様の実験を、リポソームによる免疫化後に宿主マウスに養子導入されたＩｇＭＨＥＬ Ｂ細胞の運命を検討するためにインビボで行った。免疫化４日後に、寛容原性リポソームにより免疫化されたマウス由来のＩｇＭＨＥＬ Ｂ細胞は、ごくわずかしか増殖せず、対象と比較して数が減少していた（図２ｅ）。１２日後にＩｇＭＨＥＬ細胞（Ｌｙ５ａ＋ＩｇＭａ＋）は、裸のリポソームを受けたマウスと比較して９５％以上枯渇していた（図２ｆ）。これらのインビボでの効果もまたＣＤ２２依存的であった。
実施例３
ＢＣＲシグナル伝達に及ぼす寛容原性リポソームの影響
ＩｇＭＨＥＬ Ｂ細胞におけるＢＣＲシグナル伝達を、リポソームによる刺激後の数時点においてウェスタンブロットにより分析した（図３ａ）。寛容原性リポソームは、分析された四つすべてのＩＴＩＭ上でのＣＤ２２の強いリン酸化を起こし、それは免疫シナプス内でのＣＤ２２およびＢＣＲの物理的連結と一致する。逆に多数の近位（ＳｙｋおよびＣＤ１９）および遠位の（ｐ３８、Ｅｒｋ、ＪＮＫ、Ａｋｔ、ＧＳＫ３β、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３ａ、ＢＩＭ）ＢＣＲ信号伝達成分のリン酸化は、免疫原性リポソームと比較して寛容原性リポソームによって３および３０分の時点の双方において強く阻害された。著しく対照的に、シグナル伝達成分の同等の強いリン酸化が、ＣＤ２２を欠くＩｇＭＨＥＬ細胞において免疫原性および寛容原性リポソームにより認められた。
影響を受けたシグナル伝達成分の中で、寛容原性リポソームが未刺激（休止）Ｂ細胞と比較して、Ａｋｔ生存経路中の成分の低リン酸化を誘導したことは驚くべきことである。ＡｋｔがＴｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３部位の双方において低リン酸化されたと同時に、Ａｋｔの下流標的、例えば、ＧＳＫ３βおよびＦｏｘＯ１／ＦｏｘＯ３ａ等もまた低リン酸化された。転写因子のフォークヘッドファミリーのＡｋｔ介在性リン酸化が細胞部位２１を制御することを考えて、ＦｏｘＯ１およびＦｏｘ３ａ双方の細胞染色を分析するために共焦点顕微鏡を使用した（図３ｂ）。ＦｏｘＯ１およびＦｏｘＯ３ａの核染色が、休止ＩｇＭＨＥＬ Ｂ細胞または免疫原性リポソームにより活性化された細胞において明白に存在しない一方で、寛容原性リポソームにより処理された細胞の強い核染色が存在した。ＦｏｘＯ１およびＦｏｘＯ３ａは、Ｂ細胞２１における細胞周期阻害およびアポトーシスに関与する遺伝子の転写を制御するので、これらの結果は寛容原性リポソームによるアポトーシスの誘導と一致する。
実施例４
強いＴ細胞依存性抗原に対する寛容
寛容原性リポソームが強いＴ細胞依存性抗原に対する寛容を誘導するために使用し得るかどうかを検討するために、タンパク質のいくつかの組み合せ、ならびに強いＴ細胞ヘルプを提供することが知られているマウス株を検討した。より高度の免疫原性系における寛容の研究のために、リポソーム製剤をＣＤ２２介在性寛容が最大化するように最適化した。これには、リポソーム上のＨＥＬ量を変化すること、および注入されるリポソーム量を滴定することが含まれた。最適化条件を使用し、初期の寛容化段階における１０００分の１の抗原の使用に達することにより、リポソームＨＥＬによるその後の負荷に対する強固な寛容化がＢａｌｂ／ｃマウスにおいて達成された（図４ａ）。特に、負荷の段階で免疫原性リポソームの代わりに可溶性抗原を使用したときも、寛容化は完全であった（図４ｂ）。最適化条件の制御下に、ＯＶＡ、ミエリンオリゴデンドロサイト、糖タンパク質（ＭＯＧ）およびＦＶＩＩＩに対する寛容化も同様に達成した（図４ｃ‐ｅ）。所期の抗原に向けての寛容化の特異性を評価するために、異なる抗原に対する寛容化マウスの応答を検討した。ＨＥＬまたはＯＶＡに対し寛容化されたマウスは、他の抗原に対し変わらぬ応答を有することが見出だされた（図４ｆ）。寛容化されたマウス由来の養子導入された脾臓細胞は、宿主マウスにおけるその抗原に対する抗体応答を抑制しないので、寛容化はサプレッサー細胞の誘導に関与するようには思われない。
実施例５
血友病マウスにおける出血の保護。
マウスをヒトＦＶＩＩＩ因子に対し寛容化するための条件を確立した後に、この寛容化方法をＦＶＩＩＩ ＫＯマウスにおいて適応したが、それは血友病Ａのモデルとして役立った。免疫原性リポソームを０日および１５日に与えられたＦＶＩＩＩ ＫＯマウスは、３０日にｒｈＶＩＩＩにより再構成されなかったが（図５ａ）、その理由は、該マウスが尾部切断実験において、再構成されなかったＦＶＩＩＩ ＫＯマウスと同じ程度に出血したからである。これに反して免疫原性リポソームによる負荷に続いて寛容原性リポソームを与えられたマウスは、尾部切断実験において、再構成された対照マウスと統計的に区別できないレベルまでに出血を保護された。この研究のマウス中の抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルは、出血アッセイの結果と相関した；免疫原性リポソームによる負荷の前に寛容原性リポソームにより最初に処理されたマウスは、対照マウスと比較して統計的に優位な抗ＦＶＩＩＩ抗体の増加を生じなかった（図５ｂ）。対照的に免疫原性リポソームを二度与えられたマウスは、高レベルの抗ＦＶＩＩＩ抗体を有した。従って抗体応答を抑制するためにＣＤ２２を関与させることは、バイオ製剤ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体形成を抑制する効果的な方法であり、それは再構成療法の有効性を維持する。
実施例６
ＣＤ２２介在性寛容原性サーキットはヒトナイーブ細胞およびヒトメモリー細胞において操作可能である。
ＣＤ２２が本リポソームプラットホームを使用して、ヒトＢ細胞において寛容原性サーキットを誘導することが可能であるかどうかを検討するために、異なる抗原特異性を有するＢ細胞を刺激するための方法が必要であった。これを達成するために、ナイーブまたはメモリーＢ細胞それぞれを刺激するための代替抗原として作用するように、抗ＩｇＭまたは抗ＩｇＧ Ｆａｂフラグメントをリポソームに結合した。さらに、マウスおよびヒトＣＤ２２は異なるリガンドの好みを有するので、異なるＣＤ２２リガンドが必要とされた。幸いにも、ＢＰＣＮｅｕＡＣ（ＢＰＡＮｅｕＧｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ；図６ａ）と称する、ヒトＣＤ２２の高親和性リガンドが開発された。抗ＩｇＭおよび抗ＩｇＧリポソームは、カルシウム流動により判断してナイーブ細胞（ＣＤ２７−ＣＤ３８ｌｏｗ）およびメモリー（ＩｇＭ‐ＩｇＤ‐）Ｂ細胞コンパートメントそれぞれにおける、ヒト末梢血から単離された精製したＢ細胞の頑強なＢ細胞活性を誘導した（図６ｂ）。対照的にこれらのリポソーム上でのヒトＣＤ２２リガンドの存在は、Ｂ細胞活性化を強く抑制した。同様にＢＣＲシグナル伝達の強い抑制がまた、ウェスタンブロット分析（図６ｃ）およびＣＤ８６アップレギュレーション（図６ｄ）において観察された。寛容原性がまた一次ヒトＢ細胞の生存能力を減少させるかを判定するために、リポソームを細胞と共に２４時間インキュベートし、細胞の生存能をアネキシンＶおよびＰＩ染色によって分析した。生細胞数（アネキシンＶ‐ＰＩ‐）は、抗ＣＤ４０の存在下においてさえ、ＢＰＣＮｅｕＡｃを提示する抗ＩｇＭおよび抗ＩｇＧリポソームそれぞれとインキュベートされたナイーブ細胞およびメモリーＢ細胞において減少した（図６ｅ）。メモリーＢ細胞において観察されたより著名な効果は、Ｂ細胞活性化の他の読取において観察されるより強い抑制と一致しており（図６ｂ〜ｄ）、メモリー細胞はナイーブＢ細胞よりも中程度に低いレベルのＣＤ２２を発現するので特に興味深い（図６ｆ）。
実施例７
実施例１から６記載の実験を行うために以下の材料および方法を使用した。
動物実験：ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュート（ＴＳＲＩ）動物実験委員会が、マウスが関与するすべての実験手順を承認した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪをバックグラウンドとするＣＤ２２ＫＯおよびシグレック‐ＧＫＯマウスを、それぞれＬ．Ｎｉｔｃｈｋｅ（エルランゲン大学）およびＹ．Ｌｉｕ（ミシガン大学）から入手した。ダブルノックアウト（ＣＤ２２ＫＯ／シグレック‐ＧＫＯ；ＤＫＯ）マウスを、発明者らの実験室で先立って作り出した。ＩｇＭＨＥＬ（遺伝子背景Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を発現するＷＴ ＭＤ４トランスジェニックマウス２０を、ジャクソン研究所から入手した。ＭＤ４マウスをシグレックＫＯ株（ＣＤ２２ＫＯ、シグレック‐ＧＫＯおよびＣＤ２２ＫＯ／シグレックＧＫＯ）と交雑し、その後Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ｌｙ５ａマウスと交雑した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを遺伝的背景としｍＨＥＬ（ＫＬＫ４）４３を発現するマウスをＣ．Ｘｉａｏ（ザ・スクリップ・リサーチ・インスティテュート）から入手し、ＳＴ６Ｇａｌ１‐欠失マウス４４と交雑した。Ｃ５６ＢＬ／６Ｊを遺伝子背景としｍＯＶＡ４５を発現するマウスを、ジャクソン研究所から入手した。ＢａｌｂＣを遺伝子背景とするＦＶＩＩＩ欠失マウスを、Ｄａｖｉｄ Ｌｉｌｌｉｃｒａｐ（クイーンズ大学）から譲り受けた。ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢａｌｂ／ｃマウスを、ＴＳＲＩのげっ歯類繁殖コロニー（ｔｈｅ ＴＳＲＩ ｒｏｄｅｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｃｏｌｏｎｙ）から入手した。
ヒトＢ細胞の単離： ヒト被験者が関与する手順は、ＴＳＲＩ治験審査委員会の審査および承認を受けた。正常な血液は、ＴＳＲＩの正常な献血サービス（ＴＳＲＩ‘ｓ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅ）から入手した。ヘパリン処理した血液から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離するために、該血液を最初にＨＢＳＳにより２倍に希釈した。希釈した血液（３５ｍＬ）をｆｉｃｏｌｌｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｔｅ）の上部で層にして４００ｒｃｆ（相対遠心力）で４０分間遠心分離した。バフィ―コート（白血球膜）を単離しＨＢＳＳにより４倍に希釈して遠心した（３００ｒｃｆで１０分間）。Ｂ細胞をネガティブセレクション（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって精製し、典型的には９９％純粋であった（ＣＤ１９＋）。ＢＣＲシグナル伝達成分のウェスタンブロット分析のために、精製したＢ細胞をナイーブ（ＣＤ３‐ＣＤ２７‐）またはアイソタイプスイッチ・メモリー（ＣＤ３‐ＩｇＭ‐ＩｇＤ‐）Ｂ細胞のいずれかにさらに分別した。
免疫化および採血： 全血（５０μＬ）を、ヘパリン処理したキャピラリ―チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してマウスの後眼窩出血から採血した。血清を収集するために、血液を遠心分離した（１７，０００ｒｃｆ、１分間）。血清は、直ちにＥＬＩＳＡに使用するかまたは−２０℃に保存した。一回の凍結融解サイクルは、抗体価の定量に最小の影響しか与えないことが見出だされた。リポソームおよび細胞を、２００μＬの容量で側尾静脈経由で送達した。可溶性（非リポソーム）抗原による負荷が関与する研究については、マウスにＨＢＳＳに溶解した２００μｇのＨＥＬを注射し腹腔内に送達、または１μｇのＦＶＩＩＩを静脈内に送達した。
ＦＶＩＩＩ欠失マウスにおける出血アッセイ：マウスを尾切断（ｔａｉｌ ｃｕｔ）の１時間前に、２００μＬのヒト組換えＦＶＩＩＩ（ｒｈＦＶＩＩＩ；Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｂａｙｅｒ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ））または生理的食塩水により再構成した。ｒｈＦＶＩＩＩを製造者の取扱い説明書に従い、滅菌生理的食塩水に溶解し希釈して、後眼窩静脈注射を使用して５０Ｕ／Ｋｇで投与した。一時間後にマウスに麻酔をかけ、尾の末梢部分を直径１．５ｍｍに切断し、所定の容量の生理的食塩水に２０分間浸漬した。この段階の間、生理的食塩溶液を３７℃に維持した。生理的食塩溶液中のヘモグロビン濃度を、２％酢酸による赤血球溶血後に測定し、４０５ｎｍでの吸収により定量化した。既知の標準に対するヘモグロビン濃度をマウス体重グラム当たりの失血を計算するために使用し、正常マウスに対するヘマトクリット値を４６％と仮定してμＬ／ｇとして表した。２００μＬの生理的食塩水を注射したＷＴ Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける失血を対照とした。マウスは、失血がＷＴ Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて観察された平均失血プラス三標準偏差未満であれば保護されたと考えられた。
フローサイトメトリー（流動細胞分析法）： 二色フローサイトメトリーをＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ）で行った。三色以上を使用するときは、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を使用した。フローサイトメトリーのための標識抗体をＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した。いずれの場合も、死細胞を１μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムによりゲートアウト（除外）した。
Ｂ細胞の精製： Ｂ細胞を、製造者のプロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に従って磁気ビーズを使用して、ネガティブ選択により精製した。単離細胞の純度は、通常≧９９％であった。
Ｂ細胞の蛍光標識： 精製したＩｇＭＨＥＬ Ｂ細胞（１０×１０６細胞／ｍｌ）を、ＨＢＳＳ中のＣＦＳＥ（６μＭ）またはＣＴＶ（１．５μＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかにより室温で７分間、２分ごとに混合して蛍光標識した。反応を、３％のＦＢＳを含むＨＢＳＳの添加によって停止し遠心分離した（２７０ｒｃｆ、７分間）。細胞を、適切な緩衝液に再懸濁し再び遠心分離し、その後細胞をアッセイ緩衝液中に適切な濃度で再懸濁した。
インビトロでのＢ細胞アッセイ： 精製したＩｇＭＨＥＬ Ｂ細胞を、アッセイを始める前に培地（ＲＰＭＩ、３％ ＦＣＳ、Ｐｅｎ／Ｓｒｅｐ）中で１時間インキュベートした。細胞を（０．２×１０６）、Ｕ字形底の９６ウェルカルチャープレート（Ｆａｌｃｏｎ）にまいた。リポソーム（脂質終濃度５μＭ）を添加し、細胞を３７℃で種々の時間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリーによって分析するために、細胞を最初に遠心分離し（２７０ｒｃｆ、７分間）、その後ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＨＢＳＳ）の５０μＬにおける適切な抗体とのインキュベーションを行った。氷上での染色３０〜６０分間後に、細胞を２２０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で一回洗浄し、最終的にフローサイトメトリーにより分析する前に１μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含むＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。このプロトコルに対する一つの例外は、アネキシンＶ染色であったが、該染色については製造者（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって供給される緩衝液中で行った。
インビボでのB細胞増殖アッセイ： ＣＦＳＥ標識ＩｇＭＨＥＬ細胞を、ＨＢＳＳ中に１０×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、尾静脈経由で２００μＬ（２×１０６細胞）を宿主マウスに注入した。翌日（２４時間）、尾静脈経由でリポソームを注入した。４日後にＬｙ５ａ＋ＩｇＭａ＋Ｂ細胞のＣＦＳＥ染色を分析するために、宿主マウスの脾臓を収集した。リポソームによる免疫化の１２日後に宿主マウスに残存するＩｇＭＨＥＬ Ｂ細胞数を分析するために、ＩｇＭＨＥＬ Ｂ細胞はＣＦＳＥ標識しなかった。
カルシウム流動： 精製したＢ細胞を１５×１０６細胞／ｍＬで、１％ ＦＣＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび１μＭ Ｉｎｄｏ‐１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ培地に再懸濁した。細胞を３７℃のウォーターバス中で３０分間インキュベートした。このインキュベーション期間に続いて、５倍量の同じ緩衝液（Ｉｎｄｏ‐１無添加）を添加し、細胞を遠心分離した（２７０ｒｃｆ、７分間）。ヒトＢ細胞が関与する実験について、細胞を３％ ＦＣＳを含むＨＢＳＳ中、氷上で２０分間染色した。ヒトナイーブＢ細胞を検討するうえで、いずれの汚染Ｔ細胞ならびに汚染メモリーＢ細胞をもゲートアウトするために、ヒトナイーブＢ細胞をＣＤ３およびＣＤ２７により染色した。ヒトナメモリーＢ細胞を検討するうえで、いかなるＴ細胞汚染ならびにナイーブＢ細胞のコンタミネーションもゲートアウトするために、ヒトメモリーＢ細胞をＣＤ３、ＩｇＭおよびＩｇＤにより染色した。細胞を洗浄し、遠心しならびに２×１０６細胞／ｍＬの濃度で、１％ ＦＳＣ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＨＢＳＳに再懸濁した。細胞を氷上で保存し、一定分量（０．５ｍＬ；１×１０６細胞）を、カルシウム流動を測定する前に３７℃で５分間加温した。細胞をリポソーム（５〜５０μＭの範囲）で刺激し、Ｉｎｄｏ‐１の蛍光をフローサイトメトリー（５００〜１０００イベント数／秒）によって３〜６分間モニターした。バックグラウンドを確立するために１０秒を確保した後は、常に刺激を行った。アッセイの間、チューブを３７℃に保つためにウォータージャケットを使用した。データを、動態力学機能（ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を使用してＦｌｏｗＪｏにより分析し、データをガウス平滑化による平均強度としてプロットする。
ＥＬＩＳＡ： Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｐｌａｔｅ（９６ウェル；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、ＰＢＳ中１０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で関連するタンパク質の５０μＬ／ウェルにより被覆し、４℃で一晩放置した。抗ＮＰ抗体を検査するために、ＰＢＳ中のＮＰ４‐７‐ＢＳＡ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。翌日、プレートをＴＢＳ‐Ｔ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水ブロック）中で２回洗浄し、１００μＬのアッセイ希釈液（１％ ＢＳＡ添加ＴＢＳ‐Ｔ）によりＲＴで１時間ブロックした。プレートの洗浄を、プレート全体を洗浄緩衝液の深皿に適切な回数浸漬することによって行った。血清を最初に２０〜１０，０００倍の間に希釈し、それからＥＬＩＳＡプレート上で２〜３倍の段階希釈８回により希釈した。プレートを血清と共に（５０μＬ／ウェル）３７℃で１時間インキュベートし、その後プレートをＴＢＳ‐Ｔ中で４回洗浄した。ＨＲＰ標識二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をアッセイ希釈液中で２０００倍に希釈し、５０μＬを各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベーション後、プレートをＴＢＳ‐Ｔ中で５回洗浄した。プレートを現像するために、７５μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を添加した。プレートをＲＴで１５分間インキュベートし、それから反応を停止するために２Ｎ硫酸を添加した。プレートを、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎｍで読み取った。力価は、エンドポイント力価として定義したが、それはバックグラウンドの２倍の吸光度を生じる血清の希釈倍数であった。
ウェスタンブロット： 精製ＩｇＭＨＥＬ Ｂ細胞（３０×１０６／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を、細胞を刺激する前に３７℃で１時間、培地中で（ＲＰＭＩ、３％ＦＣＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）インキュベートした。リポソーム（脂質終濃度５ μｇ／ｍＬＭ）を細胞に添加し、３７℃で３または３０分間インキュベーション後に、細胞を短時間遠心し（１３，０００ｒｃｆ、８秒）、１ｍｌの冷ＰＢＳ中で洗浄し、２度目の遠心をして氷上で３０分間、２８０μＬの溶解緩衝液中（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００、１０ｍ ＮａＦ、２ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、プロテアーゼインヒビター・カクテル（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ７．５）で溶解した。細胞残差を遠心分離（１３，０００ｒｃｆ、５分間、４℃）によって除去し、細胞溶解液のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって標定した。１００ｍＭ ＤＴＴを含むＳＤＳ‐ＰＡＧＥ添加緩衝液を溶解液に添加し、試料を７５℃で１５分間加熱した。試料を１５０Ｖで６０〜９０分間、４〜１３％の勾配ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を泳動させ、ニトロセルロースに転写した（３０Ｖ、２時間）。膜をＴＢＳ‐Ｔ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ‐２０）に溶解した５％ 脱脂粉乳中、ＲＴで１時間ブロックし、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ‐Ｔ中、４℃で一晩、一次抗体により探査した。一次抗を、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手し、１：１０００の希釈倍率で使用した。リン酸化特異的ＣＤ２２抗体はＭ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ（東京大学）から譲り受けた。翌日、膜を４ｘ５分間洗浄し、その後に１％ ＢＳＡを含むＴＢＳ‐Ｔにより３０分間のブロッキングを続けた。膜を、ＴＢＳ‐Ｔ＋１％ ＢＳＡに溶解したＨＲＰ標識二次抗体（希釈倍率１：１０，０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、ＲＴで１時間インキュベートした。４回洗浄後にブロットを現像溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と２分間インキュベートし、フィルムに曝した。顕微鏡観察：精製したＩｇＭＨＥＬ Ｂ細胞を、細胞を刺激する前に１時間、３７℃で培地（ＲＰＭＩ、３％ ＦＣＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅ添加）中でインキュベートした。細胞を、刺激を２時間行った以外は、ウェスタンブロット分析と同様に刺激した。リポソームによる刺激の後に、細胞を穏やかにペレット化し（０．５ｒｃｆ、３分）、１ｍｌの冷ＰＢＳ中で洗浄し、再び穏やかに遠心した。細胞を固定するために、ペレットを１ｍＬの冷４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に再懸濁し、４℃で１０分間回転した。細胞を穏やかに遠心分離し、ペレットを２００μＬのＰＢＳに再懸濁し、５０μＬの再懸濁細胞（約３×１０６細胞）をポリリジンスライド（Ｆｉｓｈｅｒ）上に散布した。溶液を乾燥後に、過剰のＰＦＡを除去するためにスライドをＰＢＳでさらに三回洗浄した。細胞を５％ Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ １００によりＲＴで５分間透過処理し、その後５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）によりＲＴで３０分間ブロッキングした。スライドを、０．０１％ ＴＸ‐１００を含む１％ ＮＧＳ溶液中、１：８０の濃度で抗ＦｏｘＯ１または抗ＦｏｘＯ３ａ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、４℃で一晩探索した。翌日、スライドをＰＢＳにより三回洗浄し、１％ ＮＧＳ中、Ａｌｅｘ５５５標識ファロイジン（希釈倍数１：４０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒にＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ウサギ（希釈倍数１：１０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により探索した。ＰＢＳによる三回洗浄後にスライドをＤＡＰＩ溶液と短時間インキュベートし、Ｐｒｏｌｏｎｇ褪色防止用封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマウントした。細胞の撮像は、Ｚｅｉｓｓの共焦点顕微鏡により行った。
タンパク質‐脂質の複合化： タンパク質を、他の人による記載と類似する手順でマレイミドの化学的性質を使用して、ＰＥＧ化されたジステアロイルグリセロホスホエタノールアミン（ＰＥＧ‐ＤＳＰＥ）に複合化した（Ｌｏｕｇｈｒｅｙ，Ｈ．Ｃ．，Ｃｈｏｉ，Ｌ．Ｓ．，Ｃｕｌｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．＆ Ｂａｌｌｙ，Ｍ．Ｂ．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｐｒｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（タンパク質をリポソームにカップリングするための最適化手順）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３２，２５‐３５（１９９０））。最初に、リジン残基を修飾するヘテロ二官能性クロスリンカーであるＮ‐スクシイミジル３‐（２‐ピリジルジチオ）‐プロピオン酸エステル（ＳＰＤＰ；Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、チオール基をタンパク質上に導入した。約５モル当量のＳＰＤＰ（ＤＭＳＯに新たに溶解）を、１〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質溶液（ＰＢＳ溶液）に添加した。反応液をＲＴで１時間穏やかに揺り動かし、それからいずれの沈殿物をも除去するために遠心分離した。未反応のＳＰＤＰを除去ために、タンパク質をセファデックスＧ‐５０カラムで脱塩した。脱塩されたタンパク質を、２‐ピリジルジスルフィド基を脱保護しそれによって遊離のチオールを発生させるために、２５ｍＭ ＤＴＴ（ＲＴで１０分間）により処理した。反応の間に放出されるピリジン２‐チオール脱離基の量を、３４３ｎｍでの吸光度（消衰計数７５５０Ｍ−１ｃｍ−１）を測定することによって定量し、該測定は、それをタンパク質の濃度と比較することで、リンカーによるタンパク質の修飾の範囲を計算するために使用することができた。タンパク質を、過剰のＤＴＴを除去するためにセファデックスＧ‐５０カラムで再び脱塩した。チオール誘導体化タンパク質（１０〜５０μＭの範囲）を、マレイミド‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥ（２００μＭ；ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ）と窒素下、ＲＴで一晩直ちに反応させた。脂質‐修飾されたタンパク質はミセルであり、セファデックスＧ‐１００カラムで未修飾タンパク質から容易に精製され得た。所望の脂質‐修飾されたタンパク質は、ボイドボリュームに溶出し、タンパク質濃度を２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によって定量し、それから４℃で保存した。タンパク質が脂質によって修飾されたことを検証するために、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥを使用した。タンパク質の脂質‐修飾は、ゲル上の見かけのＭＷの増加によりすぐ明となった（図Ｓ２ｃ）。この反応条件を使用して、タンパク質を１ないし３の脂質により修飾した。
糖‐脂質複合化： 高親和性マウスＣＤ２２リガンド（ＢＰＡＮｅｕＧｃ）およびヒトＣＤ２２リガンド（ＢＰＣＮｅｕＡｃ）を、従前の記載の通り、９‐Ｎ‐ビフェニルアセチル‐ＮｅｕＧｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ‐β‐エチルアミンまたは９‐Ｎ‐ビフェニルカルボキシル‐ＮｅｕＡｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ‐β‐エチルアミンそれぞれをＮＨＳ‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥ（ＮＯＦ）にカップリングすることによってＰＥＧ‐ＤＳＰＥに結合した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１５：４７７８‐４７８６（２０１０））。
ＮＰ‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥの合成： ４‐ヒドロキシ‐３‐ニトロフェニルアセチル‐Ｏ‐スクシンイミド（１．５ｍｇ、０．００５０ ｍｍｏｌ、２．８当量）およびアミン‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥ（５．０ｍｇ、０．００１８ ｍｍｏｌ；ＮＯＦ）を、１０モル当量のＮ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（３．１μＬ、０．０１８ｍｍｏｌ、１０当量）を含む０．５ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解した。ＲＴで三時間後に、溶媒を減圧下で蒸発させ、残存する固形残差を、超音波の助けを借りてｄｄＨ２Ｏ（脱イオン蒸留水）（２ｍｌ）に再懸濁した。懸濁液を、１０ｋＤａの分子量カットオフ値を有する透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ｄｄＨ２Ｏに対して連続三回透析した。それから透析した試料をタールコーチングしたバイアル中で凍結乾燥し、ふわふわした軽い黄色バウダーを得た。ＤＭＳＯにおける１Ｈ ＮＭＲ分光法により、ニトロフェノール基由来の芳香族部分プロトンとステアロイル資質の末端メチル基それぞれの予想された比（１：２）を確認した。
リポソーム： すべてのリポソームは、６０：３５：５のモル比のジアステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ）およびＰＥＧ化脂質から構成された。ＰＥＧ化脂質の総モル％を、常に５％に保持した；この５％は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００）‐ジステアロイルホスホエタノールアミン（ＰＥＧ‐ＤＳＰＥ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ＢＰＡＮｅｕＧｃ‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥ、ＢＰＣＮｅｕＡｃ‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥ、ＮＰ‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥまたはタンパク質‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥの適切な組み合せから構成されていた。リポソームをアセンブルするために、新たに溶解されたＤＳＰＣおよびコレステロールの適切な量を窒素ガス気流下で蒸発させた。ＤＭＳＯストック由来のＢＰＡＮｅｕＧｃ‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥ、ＢＰＣＮｅｕＡｃ‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥ、ＮＰ‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥの一定分量（ａｌｉｑｕｏｔ）を乾燥した脂質に添加し、この混合物を凍結乾燥した。乾燥脂質をＰＢＳ中で水和して、超音波処理の各回の間に数分の猶予をもたせ、最小限３０秒間五回、激しく超音波処理した。タンパク質‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥを水和の時に添加した。リポソーム上のタンパク質のモル％は、発明者らの検討において０．００３３〜０．３３％で変動した。リポソームの総濃度を、脂質のモル濃度によって定義し、リポソームを典型的には１〜１０ｍＭの範囲で水和した。リポソームを、携帯ミニ押出装置（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、最小限２０回、８００ｎｍ、１００ｎｍおよび最後に１００ｎｍのフィルタに通した。押出は４０〜４５℃で行った。リポソームの直径をゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定し、大体１００〜１３０±３０ｎｍの範囲であることが見出だされた。タンパク質‐ＰＥＧ２０００‐ＤＳＰＥのリポソームの中への混入は、リポソームの粒径に影響を与えなかった。
ＭＯＧのクローニング、発現および精製： ラットミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を、以下のプライマー：５‘‐ＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＣＡＧＴＴＣＡＴＡＧＴＧＡＴＡＧＧＧ‐３’（配列番号１１）および５‘‐ＧＣＡＧＡＣＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＣ‐３’（配列番号１２）を使用してラット脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｚｙａｇｅｎ）からクローン化したが、ここで下線を引いた文字はそれぞれＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を表す。Ｃ末端Ｈｉｓ６（ヘキサヒスチジン）‐タグを有するタンパク質を発現するために、ＰＣＲ産物をｐＥＴ２３ａに連結した。タンパク質の発現および精製を、従前の記載通りに行った（Ｃｈａｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ Ｅ‐ｃｏｌｉ（生きている大腸菌における動力学的タンパク質発現のモニタリング）．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｔｓ ｂｙ ｌａｚｅｒ ｔｗｅｅｚｅｒｓ ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｏｓｃｏｐｙ（レーザーピンセットラマン分光による微生物ケルト）．Ｇｙｔｏｍ Ｐａｒｔ Ａ ７１Ａ，４６８‐４７４（２００７））。
統計分析： 不対両側スチューデント検定を使用して、統計的有意差を決定した。
実施例８
第ＶＩＩＩ因子‐ＰＥＧ複合体の生成
ＦＶＩＩＩの構造活性関係分析。ＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、生物学的反応に関与する多くの異なる部位を有する、非常に大きな複合分子である。薬物動態特性を改善するためにそれらを共有結合的に修飾しようとする従前の試みは、雑多な結果であった。分子を特異的に突然変異し、それからポリマーを部位特異的に添加することは、驚くべきことであった。さらに改善された薬物動態特性および保持され活性の結果もまた、非特異的付加および低減した活性を生じる過去のポリマー複合体に関する問題を考えれば、驚くべきものであった。
一実施形態において、ＰＥＧ‐マレイミド等のシステイン特異的リガンドを使用する部位特異的突然変異誘発が提供される。非変異ＢＤＤは、ＰＥＧ‐マレイミドと反応するために利用可能ないかなるシステインも有さないので、変異したシステイン部位だけがＰＥＧ化の部位となる。より具体的には、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは１９個のシステインを有し、その中の１６個はジスルフィドを形成し、その他の３個は遊離システインである（ＭｃＭｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．４，ｐｐ．７４０‐７４６）。ＢＤＤの構造モデルは、すべて３個の遊離システインは埋没していることを示唆する（Ｓｔｏｌｉｏｖａ‐ＭｃＰｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｂｌｏｏｄ ９９，ｐｐ．１２１５‐１２２３）。酸化されたシステインは、ＰＥＧ‐マレイミドによってＰＥＧ化され得ないので、ＢＤＤにおいてジスルフィドを形成する１６個のシステインは、最初に還元されることなしにはＰＥＧ化され得ない。ＢＤＤの構造モデルに基づけば、ＢＤＤ中の３個の遊離のシステインは、これらのシステインをＰＥＧ試薬に露出するように、最初にタンパク質を変性することなしにはＰＥＧ化され得ない。従って、未変性のシステイン残基におけるＰＥＧ化によって、ＢＤＤの特異的なＰＥＧ化を達成することは、ＢＤＤの構造を劇的に変化させることなしには実行可能とは思われず、該変化はＢＤＤの機能を破壊する可能性が最も高い。
完全長ＦＶＩＩＩのＢドメイン内の４個のシステインの酸化還元状態は知られていない。Ｂドメイン内の４個のシステインのＰＥＧ化は、それらがジスルフィドを形成せず、表面に露出されていれば可能かもしれない。しかしながら、完全長ＦＶＩＩＩおよびＢＤＤはインビボにおいて類似する薬物動態（ＰＫ）特性および類似する半減期を有するので（Ｇｒｕｐｐｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ９，ｐｐ．２５１‐２６０）、ＰＥＧが期せずしてまた非Ｂドメイン領域を保護するのでなければ、ＢドメインのＰＥＧ化は改善された血漿半減期をもたらしそうにもない。
第ＶＩＩＩ因子活性を保持し薬物動態を改善するであろう、ポリマー結合のためのＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド上の所定の部位を決定するために、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩに基づいて下記の指針が提供される。修飾は、クリアランス、不活性化およびＬＲＰ、ＨＳＰＧ、ＡＰＣ等の免疫原性機構、および阻害抗体結合部位を標的とすべきである。Ｓｔｏｉｌｏｖａ‐ＭｃＰｈｉｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ ９９（４），ｐｐ．１２１５‐２３は、ＢＤＤの構造を示す。例えば半減期を延長するすために、単一のＰＥＧを、Ａ２の残基４８４‐５０９およびＡ３の残基１８１１‐１８１８のＬＲＰ結合部位、またはその近辺の特異的部位に導入し得る。これらの部位におけるサイズの大きなＰＥＧの導入は、ＦＶＩＩＩのＬＲＰ結合能を破壊させ、ＦＶＩＩＩの循環からのクリアランスを減少させるにちがいない。同様に、活性に顕著な影響を与えることなしに半減期を延ばすために、ＰＥＧを残基１６４８において導入し得ると考えられており、それは完全長分子中のＢドメインとＡ３ドメインの分岐点にあり、ＢＤＤのＡ２とＡ３ドメインの間の１４‐アミノ酸リンカーＩにある（ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ １４‐ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｌｉｎｋｅｒ Ｉ ｔｈｅ ＢＤＤ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ａ２ ａｎｄ Ａ３ ｄｏｍａｉｎｓ）。
ＰＥＧ化の特異性は、ＰＥＧマレイミド等のシステイン特異的ＰＥＧ試薬により、導入されたシステインの部位特異的ＰＥＧ化を伴う、組換えＤＮＡ突然変異誘発技術を使用して、単一のシステイン残基をＡ２またはＡ３ドメインに操作することによって達成され得る。４８４‐５０９および１８１１‐１８１８におけるＰＥＧ化のもう一つの優位性は、これらの二つのエピトープが患者における抑制抗原部位の三主要クラスの二つを表すことである。改善された循環半減期および免疫原性応答の減少の最大効果を達成するために、Ａ２およびＡ３の双方のＬＲＰ結合部を、ジＰＥＧ化産物をもたらすようにＰＥＧ化し得る。１８１１‐１８１８領域内でのＰＥＧ化は、この領域がまたＦＩＸ結合にも関与するので、活性の顕著なをもたらし得ることに留意されたい。５５８‐５６５内での部位特異的ＰＥＧ化は、ＨＳＰＧ結合を消失させるであろうが、この領域はＦＩＸにも結合するので、同様に活性を減少し得る。
ＦＶＩＩＩの新規なクリアランス機構を同定するために、追加の表面部位をＰＥＧ化し得る。Ａ２ドメインのＰＥＧ化は、Ａ２ドメインが活性化の際にＦＶＩＩＩから解離し、そのより小さい粒径のために恐らくＦＶＩＩＩ分子の残りよりも迅速に循環から除去されるという、追加の優位性を提供し得る。これに反してＰＥＧ化Ａ２は、腎クリアランスを免れるのに十分なほど大きく、ＦＶＩＩＩの残りと匹敵する血漿半減期を有し、従ってインビボで活性化方ＦＶＩＩＩを再構成し得る。
Ａ２およびＡ３領域におけるＰＥＧ化部位の同定。
推定上のＡ２ ＬＲＰ結合領域におけるまたはその近辺における５個の位置（ＰＥＧ１〜５位置に対応するＹ４８７、Ｌ４９１、Ｋ４９６、Ｌ５０４およびＱ４６８）を、高い表面露出およびそれらのＣβに対するＣαの軌道の外向きの方向に基づいて、部位特異的ＰＥＧ化の例として選択した。さらにこれらの残基は、分子の三次元構造において互いにほぼ等距離にあり、その結果、それらはまとまってこの全体の領域を表し得る。推定上のＡ３ ＬＲＰ結合領域におけるまたはその近辺における８個の位置（ＰＥＧ６〜１４に対応する１８０８、１８１０、１８１２、１８１３、１８１５、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４）を、部位特異的ＰＥＧ化の例として選択した。ＰＥＧ６（Ｋ１８０８）は、１８１１‐１８１８および１８１０において天然のＮ結合型グリコシル化部位に隣接している。位置１８１０におけるＰＥＧ化（ＰＥＧ７）は、糖をＰＥＧに置換する。ＰＥＧ位置Ｔ１８１２における変異はまた、グリコシル化部位を破壊する。ＰＥＧ９の位置（Ｋ１８１３）は内側を向いていると予測されたが、構造モデルが正しくない場合に備えて選択した。ＰＥＧ１０（Ｙ１８１５）は、ＬＲＰ結合ループ内のかさ高い疎水性アミノ酸であり、疎水性タンパク質が典型的にはタンパク質‐タンパク質相互作用の中心に見出されるので、重要な相互作用残基であり得る。１８１１‐１８１８領域はＬＲＰおよびＦＩＸ結合の双方に関与すると報告されてきたので、このループ内でのＰＥＧ化は減少した活性をもたらすだろうと考えられた。このようにＰＥＧ１１‐ＰＥＧ１４（１７９５、１７９６、１８０３、１８０４）は、１８１１‐１８１８の近辺にあるように設計されたが、異なるＰＥＧサイズによりＬＲＰおよびＦＩＸ結合を解離し得るように、ループ内にあるようには設計されなかった。
双方のＬＲＰ結合部位を同時にブロックするために、例えばＰＥＧ２およびＰＥＧ６位置における二重ＰＥＧ化、を作成し得る。
５５８‐５６５領域は、ＨＳＰＧおよびＦＩＸの双方に結合することが示されているので、この領域内ではどの部位をも設計しなかった。代わりに、ＰＥＧ１５‐ＰＥＧ１７（３７７、３７８および５５６）を、結合したＰＥＧがそれらの間の相互作用および破壊可能な相互作用の双方を妨げるように、Ａ２ ＬＲＰおよびＨＳＰＧ結合領域の間において設計した。表面が露出し外向きを指している追加の部位をまた、ＬＲＰおよびＨＰＳＧ結合領域の内部または近辺で選択し得た。新規のクリアランス機構を同定するために、ＦＶＩＩＩを系統的にＰＥＧ化し得る。ＰＥＧ１‐１７に加えて、三つの他の天然のグリコシル化部位、すなわちＰＥＧ１８‐２０に対応するＮ４１、Ｎ２３９およびＮ２１１８を、それらが表面を露出しているはずなので、ＰＥＧ化のためのテザリング点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）として使用し得る。ＰＥＧ２、ＰＥＧ６のＣβ原子から半径２０オングストローム内の表面範囲、および４個のグリコシル化部位を、ｖＷＦ、ＦＩＸ、ＦＸ、リン脂質およびトロンビンのための機能的な相互作用部位に加えて、ＢＤＤモデル上にマッピングした。
次にＹ８１、Ｆ１２９、Ｋ４２２、Ｋ５２３、Ｋ５７０Ｎ１８６４、Ｔ１９１１、Ｑ２０９１およびＱ２２８４に対応するＰＥＧ２１‐２９を、それらの各Ｃβ原子から２０オングストロームの半径により残りのほとんど全体のＢＤＤ表面をカバーする能力に基づいて、選択した。これらの位置はまた、それらが完全に露出し、外側に向いていて、起こりうる間違ったジスルフィド形成を最小限にするように天然システインから遠くにあるという理由で選択した。２０オングストロームの半径を選択したのは、６４ｋＤの分岐型ＰＥＧ等の大きなＰＥＧは、約２０オングストロームの半径の範囲をカバーする潜在能力を有すると予想されるからである。ＰＥＧ２およびＰＥＧ６およびグリコシル化部位ＰＥＧ１８、１９および２０と共にＰＥＧ２１‐２９のＰＥＧ化は、ほぼ全体のＦＶＩＩＩの非機能的表面を保護するらしい。
改善されたＰＫ特性、より優れた安定性または低減された免疫原性等の向上した特性をもたらすＰＥＧ化位置を、最大限に向上した特性を有するマルチＰＥＧ化産物を作成するために組み合せ得る。ＰＥＧ３０およびＰＥＧ３１を、Ａ２およびＡ３ドメインにおいてそれぞれ露出したジスルフィドを除去することによって設計した。ＰＥＧ３０、すなわちＣ６３０Ａは、ＰＥＧ化のためにそのジスルフィド・パートナーであるＣ７１１を遊離するはずである。同様に、ＰＥＧ３１、Ｃ１８９９ＡはＣ１９０３がＰＥＧ化されるのを可能にするはずである。
突然変異誘発。ＦＶＩＩＩの部位特異的ＰＥＧ化のための基質を、ＰＥＧ化のために選択した部位においてシステインコドンを導入することによって作成し得る。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キットを、すべてのＰＥＧ変異体を作成するために使用した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．のＳｔｒａｇａｇｅｎｅキット２００５２３）。ｃＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ．ＴＭ部位特異的突然変異誘発法を、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ．ＲＴＭ．ＤＮＡポリメラーゼおよび温度サイクラ―を使用して実施する。所望の変異を含む二つの相補性オリゴヌクレオチドプライマーを、プライマーを置換しないＰｆｕ Ｔｕｒｂｏを使用して伸長する。野生型ＦＶＩＩＩ遺伝子を含むｄｓＤＮＡを鋳型として使用する。複数の伸長サイクル後に産物を、メチル化ＤＮＡに特異的である、ＤｐｎＩエンドヌクレアーゼにより消化する。変異を含む新たに合成されたＤＮＡはメチル化されないが、一方で親の野生型ＤＮＡはメチル化される。次に消化したＤＮＡを、ＸＬ‐１Ｂｌｕｅスーパーコンピテンスセルを遺伝子導入するために使用する。
突然変異誘発の効率は、ほとんど８０％である。突然変異誘発反応を、ｐＳＫ２０７＋ＢＤＤ Ｃ２．６またはｐＳＫ２０７＋ＢＤＤのいずれかにおいて実施した。成功した突然変異誘発をＤＮＡ配列決定によって確認し、変異を含む適切なフラグメントを、哺乳動物発現ベクターｐＳＳ２０７＋ＢＤＤ中のＦＶＩＩＩ主鎖の中に転移した。転移後に、すべての変異を再び配列で確認した。Ａ３突然変異タンパク質ＰＥＧ６、７、８、９および１０について、突然変異誘発をベクターｐＳＫ２０７＋ＢＤＤ Ｃ２．６において行った。配列決定によって確認した後に、変異体フラグメント、Ｋｐｎｌ／ＰｍｅをｐＳＫ２０７＋ＢＤＤにサブクローニングした。次にＢＤＤ突然変異タンパク質を、ｐＳＳ２０７＋ＢＤＤ発現ベクターにサブクローニングした。Ａ３突然変異タンパク質ＰＥＧ１１、１２、１３、１４について、突然変異誘発をベクターｐＳＫ２０７＋ＢＤＤにおいて直接行い、次に配列を確認した変異体ＢＤＤをｐＳＳ２０７＋ＢＤＤにおいてサブクローニングした。Ａ２突然変異タンパク質のＰＥＧ１、２、３、４、５について、突然変異誘発をｐＳＫ２０７＋ＢＤＤ Ｃ２．６ベクターにおいて行った。配列を確認した変異体をｐＳＫ２０７＋ＢＤＤ、次にｐＳＳ２０７＋ＢＤＤにおいてサブクローニングした。
突然変異誘発に使用したプライマー（センス鎖のみ）を各々の反応について収載する。
ＰＥＧ１， Ｙ４８７Ｃ： ＣＡＴＧＴＣＣＧＴＣＣＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＣＣＡ（配列番号１３）
ＰＥＧ２、 Ｌ４９１Ｃ： ＴＴＧＴＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＴＡＡＡＡＣ（配列番号１４）
ＰＥＧ３、 Ｋ４９６Ｃ： ＴＴＡＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＴＡＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣ（配列番号１５）
ＰＥＧ４、 Ｌ５０４Ｃ： ＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＣ（配列番号１６）
ＰＥＧ５、 Ｑ４６８Ｃ； ＧＡＴＴＡＴＡＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴＧＣＧＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＡＴ（配列番号１７）
ＰＥＧ６、 Ｋ１８０８Ｃ： ＴＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＣ（配列番号１８）
ＰＥＧ７、 Ｎ１８１０Ｃ： ＡＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴＴＧＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＣＴＴＡＣ（配列番号１９）
ＰＥＧ８、 Ｔ１８１２Ｃ： ＧＴＣＡＡＧＣＣＴＡＡＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＡ（配列番号２０）
ＰＥＧ９、 Ｋ１８１３Ｃ： ＣＡＡＧＣＣＴＡＡＴＧＡＡＡＣＣＴＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＧ（配列番号２１）
ＰＥＧ１０、 Ｙ１８１５Ｃ： ＣＴＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＣＴＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＧＴＧＣＡＡＣ（配列番号２２）
ＰＥＧ１１、 Ｄ１７９５Ｃ： ＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号２３）
ＰＥＧ１２、 Ｑ１７９６Ｃ： ＴＣＴＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣＡＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡ（配列番号２４）
ＰＥＧ１３、 Ｒ１８０３Ｃ：ＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴ（配列番号２５）
ＰＥＧ１４、 Ｋ１８０４Ｃ： ＧＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＴＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴ（配列番号２６）
ＰＥＧ１５、 Ｋ３７７Ｃ： ＣＧＣＴＣＡＧＴＴＧＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＴＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＧＧ（配列番号２７）
ＰＥＧ１６、 Ｈ３７８Ｃ： ＴＣＡＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＧＧＧＴＡ（配列番号２８）
ＰＥＧ１７、 Ｋ５５６Ｃ： ＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＴＡＧＡＴＣＡＡ（配列番号２９）
ＰＥＧ１８、 Ｎ４１Ｃ： ＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＡＣ（配列番号３０）
ＰＥＧ１９、 Ｎ２３９Ｃ： ＧＴＣＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＴＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴ（配列番号３１）
ＰＥＧ２０、 Ｎ２１１８Ｃ： ＣＡＧＡＣＴＴＡＴＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＡＣＣＴＴＡ（配列番号３２）
ＰＥＧ２１、 Ｙ８１Ｃ： ＡＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＴＴＧＴＧＡＴＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＴ（配列番号３３）
ＰＥＧ２２、 Ｆ１２９Ｃ： ＧＡＡＧＡＴＧＡＴＡＡＡＧＴＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴ（配列番号３４）
ＰＥＧ２３、 Ｋ４２２Ｃ： ＣＡＧＣＧＧＡＴＴＧＧＴＡＧＧＴＧＴＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＴＣＣＧＡ（配列番号３５）
ＰＥＧ２４、 Ｋ５２３Ｃ： ＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣＣＡＡＣＴＴＧＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣ（配列番号３６）
ＰＥＧ２５、 Ｋ５７０Ｃ： ＣＡＧＡＴＡＡＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号３７）
ＰＥＧ２６、 Ｎ１８６４Ｃ： ＣＡＣＡＣＴＡＡＣＡＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡ（配列番号３８）
ＰＥＧ２７、 Ｔ１９１１Ｃ， ＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＣＴＧＣＴＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＴＴＡＴ（配列番号３９）
ＰＥＧ２８、 Ｑ２０９１Ｃ：ＡＣＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣ（配列番号４０）
ＰＥＧ２９、 Ｑ２２８４Ｃ： ＡＡＡＧＴＡＡＡＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＣＴＣＣ（配列番号４１）
ＰＥＧ３０、 Ｃ６３０Ａ： ＴＴＧＣＡＧＴＴＧＴＣＡＧＴＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＡ（配列番号４２）
ＰＥＧ３１、 Ｃ１８９９Ａ： ＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＣＧＣＴＡＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＡＴ（配列番号４３）
突然変異タンパク質の発現。ハイグロマイシンＢに対する耐性を与えるベクターへの挿入の後に、ＰＥＧ突然変異タンパク質を、製造者の取扱い説明書に従って２９３Ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．Ｃａｔ＃１２３４７‐０１９）と複合したＨＫＢ１１細胞に遺伝子導入した（米国特許第６，１３６，５９９号）。遺伝子導入三日後におけるＦＶＩＩＩの発現を、Ｃｏａｔｅｓｔ発色アッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏｒｐ． Ｃａｔ＃８２１０３３、実施例１２の発色アッセイを参照されたい）によって評価した。次に遺伝子導入された細胞を、５％ＦＢＳにより補充した増殖培地中で５０．ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ．ｇ／ｍｌのＨｙｇ Ｂによる選択圧下に放置した。Ｈｙｇ Ｂ耐性のコロニーが出現したとき、該コロニーを手作業で選び、Ｃｏａｔｅｓｔ発色アッセイによってＦＶＩＩＩ発現に関してスクリーニングした。次にＦＶＩＩＩを発現する安定な細胞を、ＨＰＰＳ補充を含む培地に順応させた。細胞を増殖し、１×１０６細胞／ｍｌで新鮮な培地の入った振盪フラスコに接種した。３日後に収集した組織培養液（ＴＣＦ）を、ＦＶＩＩＩ ＢＤＤ突然変異タンパク質の精製に使用した。ＴＣＦのＦＶＩＩＩ活性をＣｏａｔｅｓｔにより測定した。
突然変異タンパク質の精製。分泌されたＦＶＩＩＩ突然変異タンパク質を含む細胞培養上清を収集する際に、いかなる残余細胞をも除去するために、上清を０．２ミクロンの膜を通して濾過する。次に上清を、限外濾過または陰イオン交換のいずれかによって濃縮する。次に上清をイムノアフィニティーカラムに適用し、そこで細胞培養培地成分および大部分の宿主細胞タンパク質夾雑物を除去する。次にイムノアフィニティーカラム溶出液を、ショ糖を含む処方緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）へのダイアフィルトレーションによって緩衝液交換し、そして凍結する。モノクローナルＦＶＩＩＩ抗体カラムに渡る（ａｃｒｒｏｓ）タンパク質の収量および回収を、発色アッセイによって評価した。クロマトグラフィー実行された（ｒｕｎ）負荷物、素通り画分、種々の溶出画分、条片（ｓｔｒｉｐ）およびダイアフィルターされた溶出液の試料は、ＦＶＩＩＩ活性に関して分析した。
ＰＥＧ化。未変性の完全長ＦＶＩＩＩまたはＢＤＤを、１００倍以上過剰なＰＥＧ：タンパク質比での還元および変性無しで、システイン特異的ＰＥＧによってＰＥＧ化することはできず（データ未記載）、すべての未変性のシステインがＦＶＩＩＩ内でジスルフィドを形成しまたは埋没しているというＢＤＤ構造モデルに基づいた仮定を裏付けている。上記の標準的なプロトコルを使用して発現され精製されたＦＶＩＩＩシステイン突然変異タンパク質を、システイン特異的ＰＥＧマレイミド試薬によりＰＥＧ化し得なかったのは、おそらく導入されたＦＶＩＩＩシステインが細胞増殖培地に存在するシステインおよびβ‐メルカプトエタノール等のスフヒドリル基との反応によって「キャッピングされている」からである。この問題はもしかすると、培養培地からシステインおよびβ‐メルカプトエタノールを除去することによって解決され得るが、しかしこれはより低下したＦＶＩＩＩ産生をもたらし、細胞により遊離されたスルフヒドリルの、導入されたＦＶＩＩＩシステインのブロッキングを防止しないであろう。
他の態様において、ＦＶＩＩＩの部位特異的ＰＥＧ化を可能とする三段階の方法を開発した。段階１において、約１μＭの精製ＦＶＩＩＩシステイン突然変異タンパク質を、「キャップ」を放出するように、約０．７ｍＭトリス（２‐カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）または０．０７ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤により４℃で３０分間穏やかに還元する。第二段階において、導入したシステインを遊離し還元された状態にしながらＦＶＩＩＩジスルフィドが再構成し得るように、スピンカラム（ＢｉｏＲａｄ）を通して試料を移動させる等のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、還元剤を「キャップ」と共に除去する。段階３において、還元剤の除去から少なくとも３０分後に、遊離型ＦＶＩＩＩシステイン突然変異タンパク質を、サイズが５〜６４ｋＤ（Ｎｅｋｔａｒ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓおよびＮ．Ｏ．Ｆ．Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の範囲の、少なくとも１０倍モル過剰のＰＥＧマレイミドにより、４℃で少なくとも１時間処理する。この方法は、異なる個体により繰り返される多数の反応に対する極めて再現性のよいデータを有する、非常に一貫した産物特性をもたらす。
ＴＣＥＰの除去に対するスピンカラム法は、測定可能でないのでゲル濾過脱塩クロマトグラフィーを選択した。しかしながら、ＴＣＥＰ添加試料を使用してこの方法を試験した際に、ＴＣＥＰが測定可能なレベルでカラムのボイド容量に溶出し、その低分子量の分子から予測される塩画分には溶出しないことが明らかにされた。ウェスタンブロットアッセイは、おそらくはＴＣＥＰの不完全な除去による、意義深い背景のＰＥＧ化を示した。その一方で別の実験は、Ｃ７Ｆ７精製材料を、塩勾配と組み合わせた陰イオン交換クロマトグラフィー担体を使用して、他のタンパク質夾雑物から顕著にさらに精製し得ることを明らかにした。そこで上記の通りＴＣＥＰによりＣ７Ｆ７材料を還元し、次に材料を陰イオン交換カラムで処理することとした。電荷差のためにＦＶＩＩＩタンパク質は保持されるが、一方でＴＣＥＰはカラムを素通りし保持されないであろう。同時に塩勾配溶出の間にＦＶＩＩＩタンパク質は、大部分の残余するタンパク質夾雑物から離れて精製されるであろう。これは、後に生じるＰＥＧ化が、より純粋な出発材料により理論的により均一であるであろうことを意味した。しかしなが、ＴＣＥＰ添加試料の試験の際に、勾配においてＦＶＩＩＩと共に溶出する、測定し得るレベルのＴＣＥＰが見出されることが明らかにされた。それ故に、これらの二つの段階が順に使用されるときに、ＴＣＥＰの完全な除去および非特異的ＰＥＧ化の排除をもたらすように、ゲル濾過脱塩クロマトグラフィーを陰イオン交換クロマトグラフィーの後に実行することを決定した。
ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによるＰＥＧ化分析。ＰＥＧ化された産物を、６％トリスグリシン還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での電気泳動によって分析し得る。電気泳動後にゲルを、すべてのタンパク質を同定するためにクーマシーブルーにより染色し得て、またはＦＶＩＩＩの異なる領域上のＰＥＧ化パターンを同定するために標準的なウェスタンブロットプロトコルにかけ得る。それぞれＦＶＩＩＩ重鎖のＣ末端領域またはＶＩＩＩ軽鎖のＮ末端領域に対し産生された、マウスモノクローナルＲ８Ｂ１２またはＣ７Ｆ７抗体によるブロットの染色は、それぞれの鎖のＰＥＧ化を同定するはずである。ＦＶＩＩＩの４８４‐５０９領域に対する４１３抗体による染色は、ＰＥＧ化がＰＥＧ１‐４等の突然変異タンパク質に対し本当に部位特異的であるか否かを決定し得る。同様に、ＦＶＩＩＩの１８０１‐１８２３領域を認識するＣＬＢ‐ＣＡｇ Ａ抗体による染色は、ＰＥＧ化がＰＥＧ６‐１０等の突然変異タンパク質に対し部位特的であるかどうかを決定し得る。
ＰＥＧ２（Ｌ４９１Ｃ）ＰＥＧ化は、軽鎖より重鎖に対し特に４８４‐５０９領域に対し選択的であることが明らかにされ、一方でＰＥＧ６（Ｋ１８０８Ｃ）は、重鎖より軽鎖に対し選択的であることが明にされた。
トロンビン切断およびウェスタンブロットによるＰＥＧ化分析。ＰＥＧ化された産物を、トロンビン（４０ＩＵ／μｇ ＦＶＩＩＩ）により３７℃で３０分間処理し得る。使用されるトロンビンはまた、夾雑物としてＡＰＣも含む。トロンビン切断は、重鎖由来の５０ｋＤのＡ１および４３ｋＤのＡ２ドメインを生じ得るが、一方でＡＰＣ切断は、Ａ２ドメインを２１および２２ｋＤのフラグメントにさらに開裂し得る。重鎖のＣ末端を認識するＲ８Ｂ１２抗体による染色は、無傷のＡ２ドメインおよび２１ｋＤのＣ末端フラグメント（ＦＶＩＩＩ ５６２‐７４０）だけを同定し得る。従って、ＰＥＧ２のＰＥＧ化が位置４９１に特異的であるならば、４３ｋＤのＡ２ドメインはＰＥＧ化され、２１ｋＤのＣ末端フラグメントはＰＥＧ化されないはずである。このことは実際に、２２ｋＤのＰＥＧ化されたＰＥＧ２についてのウェスタンブロットにより裏付けられた。従って消去法によってＰＥＧ２のＰＥＧ化は、Ａ２ドメインのＮ末端２２ｋＤのフラグメント（ＦＶＩＩＩ３７３‐５６１）に局在していた。ＰＥＧマレイミドは、ｐＨ６．８でシステインに対し完全に選択的であり、しかも３７３‐５６１内の未変性のＦＶＩＩＩシステインだけが５２８と５５４の間の埋没したジスルフィド由来であるので、ＰＥＧ２は位置４９１に導入されたシステイン上でＰＥＧ化される可能性が高い。ＦＶＩＩＩ重鎖Ｎ末端抗体による、トロンビン処理されたＰＥＧ化ＰＥＧ２のウェスタン染色は、Ａ１ドメインのＰＥＧ化を示さなかった（データ未掲載）。トロンビン切断法を使用したＰＥＧ２の選択的ＰＥＧ化を、５、１２、３３および４３ｋＤのＰＥＧについて確認した（データ未掲載）。ＰＥＧ化された野生型完全長ＦＶＩＩＩのトロンビン切断は、ＢドメインだけがＰＥＧ化されることを示す。
ヨウ素染色によるＰＥＧ化分析。新たに作られたクーマシーブルーおよびウェスタン染色上のバンドが実際にＰＥＧ化されたバンドであることを確認するために、ＰＥＧに特異的であるヨウ化バリウム染色を使用した。ＰＥＧ化されたＰＥＧ２を６％トリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で移動させ、Ｒ８Ｂ１２重鎖抗体またはヨウ化バリウム溶液によって染色した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍ Ｄｅｖ Ｔｃｈｎｏｌ．１９９９ ４：２６９‐２７５）。ＰＥＧ化されたバンドは、それらの位置を調整するための分子量マーカーを使用することによって、二つの染色物の間で一致し、従ってＦＶＩＩＩ重鎖のＰＥＧ化を裏付けた。
ＭＡＬＤＩ‐質量分析法によるＰＥＧ化分析。重鎖中のＡ２ドメインのＰＥＧ化を確認するために、ｒＦＶＩＩＩ試料を、ＰＥＧ化の前後にマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により分析した。試料を、３０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中のシナピン酸マトリックスを有するＭＡＬＤＩターゲットプレート上で混合し結晶化させた。次に試料を、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ‐ＰＲＯ分光計においてポジティブ線形モードにより分析した。結果は、ＰＥＧ２の軽鎖が８３ｋＤを中心とし、重鎖（ＨＣ）が８９ｋＤを中心とすることを示した。ＰＥＧ化された試料のために取得したスペクトルは、ＨＣピークの低下および１１１ｋＤを中心とする新規なピークが形成することを示した。これは重鎖のＰＥＧ化を裏付ける。ＰＥＧ化された軽鎖（１０５ｋＤにおける）は、検出限界を超えては認められなかった。
次に試料を双方とも、トロンビン２０単位／ＦＶＩＩＩ ｍｇにおいて３７℃で３０分間トロンビン消化に供し、その後アミノ酸分析（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）によってＦＶＩＩＩ濃度を定量した。重鎖は４６ｋＤ（Ａ１）のＮ末端画分と４３ｋＤ（Ａ２）の画分に切断された。ＰＥＧ化された試料に対し取得されたＭＡＬＤＩスペクトルは、ＰＥＧ化Ａ２ドメインに起因する、４３ｋＤのピークのおよび新規の６５ｋＤのピークの生成を示す。ＬＣのＰＥＧ化は、検出限界を超えては再び認められない。これらの結果は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインのＰＥＧ化を再び裏付ける。同じ分析をＰＥＧ化されたＰＥＧ６に適用して、軽鎖Ａ３Ｃ１Ｃ２フラグメントのＰＥＧ化を確証した。
活性測定
凝固アッセイ。ＦＶＩＩＩ：Ｃ凝固試験法は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に基づく一段階アッセイである。ＦＶＩＩＩは、第ＩＸａ因子、カルシウムおよびリン脂質の存在下に、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への酵素的変換において補因子として作用する。このアッセイにおいては、希釈された試験試料を、ＦＶＩＩＩ欠失血漿基質およびａＰＴＴ試薬の混合物と共に３７℃でインキュベートする。塩化カルシウムをインキュベートした混合液に添加し、凝固を開始させる。血餅を形成するのに要する時間（秒）とＦＶＩＩＩ：Ｃの濃度の対数の間には逆比例関係が存在する。未知の試料に対する活性レベルは、試験材料の種々の希釈液の凝固時間を、既知の活性の標準材料の一連の希釈液から構築される曲線と比較することによって内挿し、ｍＬ当たりの国際単位（ＩＵ／ｍＬ）で報告する。
発色アッセイ。発色アッセイ法は、色の強度がＦＶＩＩＩ活性に比例する連続する二つの段階から構成される。第一段階において、第Ｘ因子は、至適量のカルシウムイオンおよびリン脂質の存在下において、その補因子であるＦＶＩＩＩａを有するＦＩＸａによってＦＸａに活性化される。第Ｘ因子の活性化速度がＦＶＩＩＩの量にのみ依存するように、過剰量の第Ｘ因子が存在する。第二段階において、第Ｘａ因子が発色基質を加水分解して発色団を産生し、色強度を４０５ｎｍで側光的に読み取る。未知試料の力価を算出し、アッセイの妥当性を傾斜比統計法により検討する。活性をｍＬ当たりの国際単位（ＩＵ／ｍＬ）で報告する。
１８１１‐１８１８ループはＦＩＸへの結合に関与するが、しかしこのループ内部の個々の部位の重要性は特定されていない。ＰＥＧ７‐１０突然変異タンパク質は、本来のＦＶＩＩＩに比較してほぼ同一の発色比活性を示す。
全抗原ＥＬＩＳＡ（ＴＡＥ）。ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体により被覆された、マイクロタイタープレートにＦＶＩＩＩを捕捉する。結合したＦＶＩＩＩを、ビオチン標識ｒＦＶＩＩＩポリクローナル抗体およびストレプトアビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体により検出する。ペルオキシダーゼ‐ストレプトアビジン複合体は、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質の添加の際に発色反応を生じる。４パラメータ適合モデルを使用して、試料濃度を標準曲線から内挿する。
ｖＷＦ結合ＥＬＩＳＡ。ＦＶＩＩＩを、溶液中で重症の血友病血漿中のｖＷｆに結合させる。次にＦＶＩＩＩ‐ｖＷｆ複合体を、ｖＷｆ特異的モノクローナル抗体により被覆したマイクロタイタープレート上で捕捉する。ｖＷｆに結合したＦＶＩＩＩを、ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体およびホールラディッシュ・ペルオキシダーゼ抗ウサギ複合体により検出する。ペルオキダーゼ結合抗体複合体（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ‐ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）は、基質の添加の際に発色反応を生じる。試料濃度を、４パラメータ適合モデルを使用して標準曲線から内挿する。ＦＶＩＩＩ結合の結果を、μｇ／ｍＬで報告する。ＰＥＧ化の際に活性のいずれに関する顕著な影響も存在せず、それはＢドメインにおけるＰＥＧ化と一致するであろう。
イオン交換クロマトグラフィーによるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの精製。ＰＥＧ化されたＦＶＩＩＩを陰イオン交換カラムまたは陽イオン交換カラムに適用し、ここでタンパク質はカラムに結合するが、一方でいかなる過剰の遊離ＰＥＧ試薬も結合せず素通り画分中に除去される。次にＰＥＧ突然変異タンパク質を塩化ナトリウム勾配によりカラムから溶出する。ヨウ化バリウムで染色された、負荷物、素通り画分および勾配画分の４〜１２％Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓゲルを使用して、カラム溶出画分がＰＥＧ化突然変異タンパク質を有することを確証した。
サイズ排除クロマトグラフィーによるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの精製。ＰＥＧ２突然変異タンパク質の大部分を含有する陰イオン交換画分をプールし、限外濾過により濃縮し、次にサイズ排除カラムに適用する。次に処方緩衝液を使用してカラムを溶出する。ＰＥＧがタンパク質に結合しているかどうかに依存するタンパク質のサイズおよび形態の差異の故に、このカラムはＰＥＧ化ＰＥＧ２突然変異タンパク質をＰＥＧ化されていないいかなる残りのＰＥＧ２の突然変異タンパク質からも分離する。ＰＥＧ化突然変異タンパク質ＦＶＩＩＩフラクションを、最大のＦＶＩＩＩ活性を有することに基づきプールし、次にその後の動物実験および分子のキャラクタリゼーションのために凍結する。
低いＰＥＧ化効率、すなわち５０％未満を示すＰＥＧ６等の突然変異タンパク質について、高純度のモノＰＥＧ化産物をもたらすための最も効果的な精製スキームは、陽イオン交換クロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーの組み合せを使用することである。例えばＰＥＧ６について、陽イオン交換クロマトグラフィーは、ＰＥＧ化ＰＥＧ６（より早い溶出画分）を未ＰＥＧ化ＰＥＧ６（より遅い溶出画分）の大部分から精製する。次にサイズ排除クロマトグラフィーは、ＰＥＧ化タンパク質（より早い溶出画分）を未ＰＥＧ化タンパク質（より遅い溶出画分）の残余物から精製する（ｐｏｌｉｓｈ）。
活性に及ぼすＰＥＧサイズの影響。ＰＥＧサイズがＰＥＧ化の際のＦＶＩＩＩの凝固および発色活性の双方に影響を有するかどうかを試験するために、精製した完全長ＦＶＩＩＩ、ＰＥＧ２、ＰＥＧ６およびＰＥＧ１４をＴＣＥＰにより還元し、その後還元剤の除去および対照緩衝液または６ｋＤないし６４ｋＤの範囲のＰＥＧとの反応と続けた。過剰のＰＥＧまたは未ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの除去無しで、生じたＰＥＧ化ＦＶＩＩＩを直接アッセイした。対照実験は、過剰のＰＥＧがＦＶＩＩＩ活性に影響を有さないことを明らかにした。
ＢＤＤのＰＥＧ２、ＰＥＧ６またはＰＥＧ１４位置におけるＡ２またはＡ３ドメイン内でのＰＥＧ化は、ＰＥＧサイズが６ｋＤを超えて増加するとき、凝固活性の劇的な喪失をもたらす。しかしながら、完全長ＦＶＩＩＩの本来のＢドメインのシステインにおけるＢドメイン内でのＰＥＧ化は、凝固活性に何ら影響を及ぼさなかった。興味深いことに発色活性は、すべてのＰＥＧ化構築物に関して影響されない。これはアッセイの差異によるのかもしれない。小さな発色性ペプチド基質は、凝固アッセイにおいて使用されるより大きなタンパク質基質よりもＰＥＧ化ＦＶＩＩ／ＦＩＸ／ＦＸ複合体により容易に近づくことが可能である。あるいはＰＥＧは、突然変異タンパク質の活性に影響し得る。これは二段階の発色アッセイよりも一段階の凝固アッセイによってより容易に検出されるであろう。
ＰＥＧ２、６および１４の凝固活性へのＰＥＧの影響の観測結果を確証するために、いくつかのＰＥＧ化構築物を過剰のＰＥＧおよび未ＰＥＧ化物から精製した。ＰＥＧは発色活性に関しいかなる影響もおよぼさないので、凝固活性に対する発色活性の比率は、凝固活性に関するＰＥＧの相対的影響についての良好な評価値である。ＰＥＧ２等の一定の位置におけるより大きなＰＥＧおよびＰＥＧ２＋６構築物の場合のような多数のＰＥＧは、凝固活性のより大きな喪失を誘発する。
ウサギＰＫ研究。ＦＶＩＩＩの薬物動態学（ＰＫ）に関するＰＥＧ化の影響を理解するために、いくつかの種においてＰＫ研究を実施した。研究のためにＮＺＷ ＳＰＦウサギを使用した：雌１０匹、群当たりウサギ５匹、２群（ＰＥＧ２ ＦＶＩＩＩおよび２２ｋＤのＰＥＧ化ＰＥＧ２）。試料を、１００ ＩＵ／ｍＬ（発色単位）の終濃度で滅菌ＰＢＳに希釈した。各ウサギに耳介静脈（ｍａｒｇｉｎａｌ ｅａｒ ｖｅｉｎ）経由で、希釈試験物質の１ ｍｌ／ｋｇ（１００ ＩＵ／ｋｇ）の用量または対照物質を投与した。注射後の種々の時間に、投与後の所定の時点において血液試料（１ｍｌ）を中央耳動脈から１ｍｌの注射器（１００μＬの３．８％クエン酸ナトリウムを装填）に採取した。投与されたヒトＦＶＩＩＩを特異的に捕捉するために、血漿試料を９６ウェルプレート上に被覆されたＲ８Ｂ１２重鎖抗体とインキュベートした。捕捉されたＦＶＩＩＩの活性を発色アッセイによって測定した。またＰＥＧ化ＰＥＧ２およびＰＥＧ化６をＢＤＤと比較したが、ＰＥＧ化突然変異タンパク質は、ＢＤＤと比較して血漿回収率における改善を示した。ＰＥＧ化野生型完全長ＦＶＩＩＩは、多くの改善を示すように見えなかった。
マウスＰＫ研究。二番目の種として、正常ＩＣＲマウスまたは血友病のＦＶＩＩＩ欠失ＩＣＲマス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎ．Ｙ．）をＰＫ研究において使用した。本研究のために、正常マウスを時点ごとに群当たり５匹使用した。試験材料を処方緩衝液中に、２５ＩＵ／ｍＬの目標最終濃度まで希釈した。各マウスに尾静脈経由で希釈した試験材料の４ｍＬ／ｋｇ（総容量約０．１ｍＬ）を投与し得る。血液試料（正常または血友病マウスの研究に対し、それぞれ０．４５または０．３ｍＬ）を、指示時点において下大静脈から１ｍＬの注射器（正常または血友病マウスの研究に対し、それぞれ３．８％クエン酸ナトリウムの５０または３０μＬを装填）中に採取した（試料当たり動物一匹）。血漿試料を上記の発色アッセイを使用して、ＦＶＩＩＩ濃度についてアッセイする。ＰＥＧ化ＰＥＧ６は、ＢＤＤまたはＰＥＧ６と比較してより高い血漿回収率を示す。ＰＥＧ化ＰＥＧ２は、ＢＤＤと比較してより高い血漿回収率を示す。
血友病マウス（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子回収率。血友病マウス（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子回収率のヒストグラムは、血友病マウスアッセイにおけるＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子の二種の半減期の薬物動態学的（ＰＫ）評価を示す。このアッセイは、ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子およびＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子のＰＥＧ２＋６二重ＰＥＧ化変異体（および本明細書の他の箇所で、ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子のＬ４９１Ｃ、Ｋ１８０８Ｃ二重変異体として同定される）の双方の血漿濃度を、マウスモデルにおける静脈投与後の三時点において測定するように設計された。０．８および４時間の双方の時点におけるＰＫ評価は同等であったが、１６時間の評価は特に注目すべきである。１６時間において、未ＰＥＧ化分子と比較して約４倍（４００％）の二重ＰＥＧ化ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子変異体（ＰＥＧ２＋６）が、投与１６時間後のマウス血漿中に残存した。
腎裂傷モデル。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ突然変異タンパク質が、血友病マウスにおける出血を止めるうえで有効であるかどうかを究明するために、腎裂傷モデルを用いた。血友病マウス（破壊ＦＶＩＩＩ遺伝子を有するＣ５７／ＢＬ６）をイソフルラン下で麻酔にかけ、秤量した。下大静脈を露出し、生理的食塩水またはＦＶＩＩＩのいずれかの１００ｕｌを、３１ゲージ針を使用して注入した。注射針を注意深く抜き取り、出血を防ぐために３０〜４５秒間注射部位に圧力をかけた。二分後に右腎臓を露出し、鉗子の間で縦軸方向に保持した。＃１５の解剖用メスを使用して、腎臓を水平に３ｍｍの深さまで切断した。均一な損傷の深さを保証するために、腎臓を中央部で軽く保持し鉗子の両側上に同等の組織を露出した。腎臓の露出した表面を鉗子の深さまで切断した。上記の通り血液喪失を定量した。異なる用量のＦＶＩＩＩをマウスに試験し、腎臓出血に関するＦＶＩＩＩの用量応答関係を特性化した。ＰＥＧ化ＰＥＧ２は、マウス腎損傷後の血液の喪失の減少においてＢＤＤに匹敵する力価を示す。従ってＰＥＧ化ＰＥＧ２の凝固活性はＢＤＤの該活性よりも低いが、この腎裂傷モデルは、インビボでのＰＥＧ化ＰＥＧ２の効力がＢＤＤと比較して測定できるほどには減少しなかったことを示し、発色アッセイデータと一致した。
抗体阻害アッセイ。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の高分子量ポリマーを特異的に位置４９１に付加することは（すなわちＰＥＧ２）、ｍＡＢ ４１３への結合および感受性を減少させるはずであり、多数の患者が同じｍＡＢ ４１３エピトープに対する阻害抗体を発現するので、拡大解釈すると患者の阻害抗体の大部分に対する結合および感受性を減少させるはずである。これを試験するために、量を増加させたｍＡＢ ４１３をＢＤＤまたは４３ｋＤ ＰＥＧ化ＰＥＧ２の非飽和量（０．００３ ＩＵ／ｍＬ）とインキュベートし、発色アッセイにおいて機能的活性の試験をした。非阻害抗体であるＲ８Ｂ１２、およびＣ２ドメインを標的とする阻害酵素であるＥＳＨ４を対照として使用した。ＰＥＧ化ＰＥＧ２は実際に、ｍＡＢ ４１３阻害に対しＢＤＤよりも抵抗性があり、位置４９１の近辺に結合しない対照抗体の存在下において類似の阻害パターンを示す。さらにｍＡＢ ４１３阻害に対するＰＥＧの保護効果は、ＰＥＧサイズに依存し、より大きなＰＥＧほどより強力な効果を有する。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩが患者由来の阻害抗体に対しより抵抗性であるかどうかを試験するために、ＦＶＩＩＩに対する阻害物質を発現した血友病Ａ患者由来の血漿のパネルの存在下で発色活性を測定した。試験した８人の患者血漿の中で、４人の患者血漿において４３ｋＤ ＰＥＧ化ＰＥＧ２は、ＢＤＤよりも患者の血漿阻害に対し抵抗性であった。例えば、ＰＥＧ化ＰＥＧ２、ＰＥＧ６またはＰＥＧ＋６は、一人の患者血漿においてＢＤＤよりも高い残存活性を示したが、他の血漿では示さなかった。ジＰＥＧ化ＰＥＧ２＋６は、モノＰＥＧ化ＰＥＧ２またはＰＥＧ６よりも抵抗性であると思われる。これらの結果は、ＰＥＧ化ＰＥＧ突然変異タンパク質が、ＦＶＩＩＩに対する阻害物質を発現する患者を治療するうえでより効果的であり得ることを示唆する。
高処理ＰＥＧ化スクリーニング。特定のＰＥＧ突然変異タンパク質のＰＥＧ化効率は予測不可能であり、それは特にＢＤＤの直接的な構造情報がないからである。例えば、ＢＤＤの構造モデルに基づけば、ＰＥＧ４およびＰＥＧ５のＰＥＧ化効率は、ＰＥＧ２およびＰＥＧ１５の該効率と類似して非常に高いはずだと予想されるであろうが、それはすべての三つの位置は構造によれば表面が露出し外に向かっているからである。従って系統的なＰＥＧ化により新規なクリアランス機構を探索するためにＰＥＧを使用することは、多数の突然変異タンパク質をスクリーニングすることを必要とする。
多数のＰＥＧ突然変異タンパク質を迅速にスクリーニングするために、一過的に遺伝子導入された突然変異タンパク質由来のＰＥＧ化産物のＰＥＧ化効率および機能的活性を試験し得る、新規の高処理法が開発された。０．１〜０．２ＩＵ／ｍＬ位い低いＦＶＩＩＩ発色値を有するわずか５〜１０ｍＬの一過的に発現されたＰＥＧ突然変異タンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ‐ｃｅｎｔｒａ Ｕｌｔｒａ ｄｅｖｉｃｅ ＭＷＣＯ ３０Ｋを使用して約５０倍に濃縮し、その結果ＦＶＩＩＩの濃度は、抗体のＦＶＩＩＩに対する相互作用の親和性範囲に近い１ｎＭより上に達する。濃縮されたＰＥＧ突然変異タンパク質（約３００ｕＬ）を約３０ｕＬのＣ７Ｆ７ ＦＶＩＩＩ抗体樹脂と４℃で一晩インキュベートし、洗浄し、溶出し、透析し並びに還元する。還元剤を除去し、還元されたＰＥＧ突然変異タンパク質をＰＥＧ化し、上記の通りウェスタン分析で移動させる。一過的に発現されたＰＥＧ突然変異タンパク質のＰＥＧ化相対効率は、精製されたＰＥＧ突然変異タンパク質の該効率と厳密に整合する。
この方法によって１ないし２か月内に、数十個のＰＥＧ突然変異タンパク質をスクリーニングし得る。例えば、ＰＥＧ１４（Ｋ１８０４Ｃ ＢＤＤ）は、１２ｋＤのＰＥＧによる少なくとも約８０％の軽鎖のＰＥＧ化を有し、重鎖のＰＥＧ化は有さず（データ未掲載）、それは軽鎖上に位置するＫ１８０４Ｃ突然変異と一致した。Ｋ１８０４とＫ１８０８（ＰＥＧ６位置）の間のＣ．ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ．からＣ．ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ．への距離は、ＢＤＤ構造に基づくとたった８．４オングストロームであり、この位置における４３ｋＤのＰＥＧの導入が、より高ＰＥＧ化収率の優位性を有する、３３ｋＤのＰＥＧ化ＰＥＧ６と類似するＰＫにおける改善を有することを示唆する。重鎖中にシステインを有するあらゆる突然変異タンパク質が重鎖上のみでＰＥＧ化され、一方で軽鎖中にシステインを有するあらゆる突然変異が軽鎖上でＰＥＧ化されるという点で、ＰＥＧ化は、システイン突然変異が導入された特定のＦＶＩＩＩ鎖に対して高度に選択的であった。突然変異タンパク質番号２ないし３１は、収載された位置における本来のアミノ酸をシステインで置換するＢＤＤのシステイン突然変異を表す。ＰＥＧ２＋６は、位置４９１および１８０８がシステインにより置換されたＢＤＤの二重突然変異タンパク質である。Ａ１およびＡ２、（および完全長ＦＶＩＩＩであるＫＧ‐２に関してはＢドメイン）は重鎖に属し、一方、Ａ３、Ｃ１およびＣ２は軽鎖に属する。ＰＥＧ化産物をＳＤＳ ＰＡＧＥ上で移動し、ＰＥＧ化されたバンドを未ＰＥＧ化バンドと比較することによってＰＥＧ化効率を評価した：＋＋＋ＰＥＧ化収率＞約８０％、＋＋収率約３０〜７０％、＋収率約１０〜３０％および収率＜約１０％。
還元されたＰＥＧ突然変異タンパク質の質量分析。ＰＥＧ突然変異タンパク質または完全長ＦＶＩＩＩの直接的ＰＥＧ化を妨げる「キャップ」の正体を決定するために、ＰＥＧ２＋１４を６７ｕＭないし６７０ｕＭの範囲の濃度のＴＣＥＰにより還元した。ＰＥＧ化の収率は、増加するＴＣＥＰの量に比例して増加した。同一の試料をまた、ＰＥＧ化の前に質量分析法によって分析した。直接的に研究し得るタンパク質ドメインを得るために、試料を２０単位／ｍｇ ＦＶＩＩＩの比率でトロンビンにより３７℃で３０分間消化した。トロンビン切断は、残基３７２ないし７４０を含み占有されたグリコシル化部位を含まないＡ２フラグメントを生じる。消化された試料をＣ４逆相液体クロマトグラフィー系に注入し、カラムからの溶出液をエレクトスプレイインタフェイスにより四重極飛行時間型質量分析装置に直接導入した。タンパク質の無傷の質量値を提供するために、Ａ２ドメインに相当するクロマトグラフィーのピーク下の質量スペクトルを、畳み込みを解いて得た（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）。還元の前に、ＰＥＧ２＋１４のＡ２ドメインは、理論的に予測されるよりも１１８ダルトン大きな質量をもたらす。ＴＣＥＰ濃度が増加するにつれ、Ａ２ドメインの予測された正確な質量を有する新規なピークが出現する。この新規なピークの割合は、ＴＣＥＰ濃度が増加するにつれ増加する。１１８ダルトンの差異は、シスチン（１１９Ｄａ）とのジスルフィド形成による残基Ｃｙｓ４９１におけるシステイン化および装置の精度によって説明され得る。従ってこれは、ＰＥＧ突然変異タンパク質がシステインによってキャッピングされ、それが直接的なＰＥＧ化を妨げることを示す。
実施例９
各凝固因子分子に結合するリガンド数定量のためのプロトコル。タカラのＤＭＢ標識キットであるシアル酸蛍光標識キット（Ｃａｔ＃４４００）を使用するシアル酸含量の定量は、シアロ糖複合体の定量的および高感度分析用である。１，２‐ジアミノ‐４，５‐メチレンオキシベンゼン（ＤＭＢ）を使用するこのＨＰＬＣに基づくシアル酸蛍光標識技術は、簡便で高度に感度の高い定量法である。この方法において遊離シアル酸は、ＤＭＢによる標識後に逆相ＨＰＬＣ（ＣｌｙｃｏｓｅｐＲ、Ｇｌｙｋｏ製、＃１‐４７２７）によって分析される。
実験手順：
１．ＤＢＭ標識：
試料５〜５０μｇをエッペンドルフチューブにピペットで取り、高速真空で完全に乾燥し、次にチューブに２Ｍ酢酸５００ｕｌを添加し、２時間８０℃加熱遮断する。反応後に高速真空を使用して、酸処理した試料を完全に乾燥する。
ＤＭＢ試薬の作成；各反応管はＤＭＢ２００ｕｌを必要とする。
試薬Ｂ １部 ８０ｕｌ
試薬Ａ ５部 ４００ｕｌ
水 ４部 ３２０ｕｌ
反応を以下の通り調整する：
酢酸 ＤＭＢ試薬
試料 １０ｕｌ １９０ｕｌ
ブランク １０ｕｌ １９０ｕｌ
標準（１００ｕＭ） １０ｕｌ １０ｕｌ １８０ｕｌ
（注：２Ｍ酢酸の作成：１１４ｕｌをＨＰＬＣ水中で最終１ｍｌにする）
十分に混合し、２．５時間５０℃加熱遮断する。
等量のＨＰＬＣ用氷水（すなわちＨ２Ｏ ２００ｕｌ）を添加して反応を停止させ、エッペンドルフチューブを氷上に置いて反応を終了させる。同日にＨＰＬＣを実施する。
２．ＨＰＬＣ分析：アイソクラティック
カラム：Ｇｌｙｋｏ製ＧｌｙｃｏＳｅｐＲ、Ｃａｔ＃１‐４７２７
溶媒：アセトニトリル／メタノール／水＝９／７／８４
流速：１ｍｌ／分
検出：蛍光検出器：Ｅｘ ３１０ｎｍ、Ｅｍ ４４８ｎｍ
ＤＭＢ標識シアル酸のピークは、通常６〜７分において現れる。シアル酸を定量するために、試料のピーク面積を標準のシアル酸のピーク面積と比較した。
本明細書で用いるセクションの表題は、構成の目的だけのためであり、決して記載事項を制限するものと解釈されてはならない。
本教示が種々の実施形態と共に記載されるとはいえ、本教示がこのような実施形態に制限されることを意図するものではない。対照的に本教示は、当業者によって了解される通り種々の代替物、改善物および同等物を包含する。

Claims (21)

  1. 凝固因子タンパク質の寛容を誘導するための複合体であって、ここで該複合体が凝固因子タンパク質またはその抗原性フラグメントもしくは変異体およびＢ細胞シグレックリガンドを含み、ここで凝固因子タンパク質が所定部位において突然変異され、その部位において生体適合性ポリマーに共有結合されている前記の複合体。
  2. 該凝固因子タンパク質が直接的にシグレックリガンドに結合されている、請求項１の複合体。
  3. 該凝固因子タンパク質が間接的にシグレックリガンドに結合されている、請求項１〜２のいずれかの複合体。
  4. 該複合体がリポソームを含む、請求項１〜３のいずれかの複合体。
  5. 複合体の凝固因子タンパク質とシグレックリガンドを隔てている距離が、免疫シナプスにおけるシグレックおよびＢ細胞受容体の強制ライゲーションおよび並置をもたらす、Ｂ細胞への効果的な提示を可能にする、請求項１〜４のいずれかの複合体。
  6. 凝固因子タンパク質が第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、および第ＸＩ因子ならびにその組み合せから成る群より選択される、請求項１〜５のいずれかの複合体。
  7. シグレックリガンドが９‐Ｎ‐ビフェニルカルボキシル‐ＮｅｕＡｃａ２‐６Ｇａｌ〜１‐４ＧｌｃＮＡｃ（６´‐ＢＰＣＮｅｕＡｃ）、ＮｅｕＡｃａ２‐６Ｇａｌ〜１‐４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕＡｃａ２‐６Ｇａｌ〜１‐４（６‐スルホ）ＧｌｃＮＡｃおよびその組み合せから成る群より選択されるグリカンである、請求項１〜６のいずれかの複合体。
  8. 請求項１〜７のいずれかの複合体の有効量を含む医薬組成物。
  9. 被験者において凝固因子タンパク質に対する寛容を誘導する方法であって、請求項１〜７のいずれかの複合体の有効量を被験者に投与することを含む前記の方法。
  10. 被験者がヒトである、請求項９の方法。
  11. 該被験者が補充治療を受けておりかつ凝固因子タンパク質に対する抗体について陽性である、請求項１０の方法。
  12. 請求項１〜７の複合体を含むキット。
  13. 該凝固因子タンパク質がＦＶＩＩＩでありかつ生体適合ポリマーがＦＶＩＩＩのアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４の一または複数に共有結合している、請求項１の複合体。
  14. 該凝固因子タンパク質がＦＶＩＩＩでありかつ生体適合ポリマーがＦＶＩＩＩのアミノ酸位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１および２２８４の一または複数に共有結合している、請求項１の複合体。
  15. 該凝固因子タンパク質がＦＶＩＩＩでありかつ生体適合ポリマーがＦＶＩＩＩのアミノ酸位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６および７１１の一または複数に共有結合している、請求項１の複合体。
  16. 該凝固因子タンパク質がＦＶＩＩＩでありかつ生体適合ポリマーがＦＶＩＩＩのアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４の一または複数に共有結合している、請求項１の複合体。
  17. 凝固因子タンパク質がＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子である、請求項１の複合体。
  18. 生体適合性ポリマーがアミノ酸位置１２９、４９１、１８０４および／または１８０８においてＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩに共有結合している、請求項１７の複合体。
  19. 該凝固因子タンパク質が完全長ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩでありかつ生体適合性ポリマーがアミノ酸位置１８０４においてＦＶＩＩＩに結合しておりかつポリエチレングリコールを含む、請求項１の複合体。
  20. 治療を必要とする被験者に対し１）請求項１〜７または１３〜１９のいずれかの複合体の有効量および２）凝固因子の有効量を投与することを含む、出血性障害を治療する方法。
  21. アミノ酸位置がシステインに突然変異されている、請求項１３〜１９のいずれかの複合体。
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